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T é n i c a s h i s t o l ó g i c a s
5 . T I N C I O N E S G E N E R A L E S
La mayoría de los tejidos, sobre todo los de los animales, son incoloros y por ello necesitamos teñirlos para observar
sus características morfológicas. Las tinciones generales están basadas en el uso de colorantes, sustancias mediante las
cuales se consigue colorear a los tejidos. Los colorantes son normalmente hidrosolubles y se caracterizan por unirse a
ciertas moléculas presentes en los tejidos gracias a afinidades químicas. Se utilizan normalmente para teñir a las células y
componentes tisulares que van a ser observados con el microscopio óptico y por ello se realizan habitualmente sobre
secciones de tejido, siendo las más utilizadas las secciones obtenidas a partir de inclusiones en parafina u obtenidas en el
criostato. Los colorantes son los elementos principales de las tinciones generales. Son moléculas que poseen tres
componentes importantes: un esqueleto incoloro, que normalmente es un anillo aromático de benceno, al cual se le unen
dos tipos de radicales: uno que aporta el color, denominado cromóforo, y otro que posibilita la unión a elementos del tejido
denominado auxocromo. Al conjunto de estos tres elementos unidos en una molécula se denomina cromógeno.
Según la naturaleza química del cromóforo hay varios tipos de colorantes: nitrosos, ozoicos, derivados de la
antroquinona, derivados de la acridina, derivados de iminas quinónicas, derivados de diferrilmetano y triferrilmetano,
derviados del xanteno y derivados de las talocianinas.
Según la naturaleza química del radical auxocromo los colorantes se clasifican en:
Básicos: son sales en las que la base aporta el color, mientras que la parte ácida es incolora. Tienen apetencia por
sustancias ácidas del tejido como el ADN o ciertos componentes de la matriz extracelular como los glucosaminoglucanos.
Así, ponen de manifiesto el núcleo y el ARN, sobre todo el ARNr presente en los ribosomas por ser muy abundante, así
como ciertas matrices extracelulares ricas en componentes ácidos. Ejemplos de colorantes básicos son la tionina, safranina,
azul de toluidina, el azul de metileno o la hematoxilina
Ácidos: son sales con el anión coloreado y la base incolora. Tienen apetencia por sustancias básicas, sobre todo
estructuras proteicas localizadas en el citoplasma celular y también el colágeno de la matriz extracelular. Ejemplos de
colorantes ácidos son la fucsina ácida, verde rápido, naranja G o la eosina.
Neutros: poseen una porción ácida y otra básica, ambas con capacidad para aportar color. Por tanto un mismo
colorante puede teñir tanto las partes básicas como las ácidas de los tejidos. Por ejemplo, el eosinato de azul de metileno.
Indiferentes: realmente no se unen a elementos de los tejidos por afinidad química sino porque se disuelven en ellos.
Por ejemplo, el colorante sudán se disuelve en los lípidos y por tanto teñirá a las gotas de lípidos, especialmente en los
adipocitos.
En algunas ocasiones necesitamos resaltar elementos tisulares de manera específica y para ello usamos colorantes
que tienen apetencia por dichas estructuras. Por ejemplo, la tinción denominada azán contiene azocarmín y anilina-naranja-
ácido acético que tiñe los núcleos de rojo y sobre todo destaca el conectivo intensamente teñido de azul. Otra tinción
combinada es el tricrómio de Mallory que tiñe el colágeno de verde, las células musculares de rojo.
Cuando un colorante se une al tejido y refleja un color diferente al que tiene en solución se dice que ha ocurrido un
fenómeno de metacromasia. Esto se debe a que las propiedades de absorción de la luz del colorante cambian al unirse a
componentes celulares. Por ejemplo, el azul de toluidina se vulve púrpura cuando se une a ciertos gránulos de los
mastocitos. Cuando el colorante unido al tejido tiene el mismo color que en solución se denomina ortocromasia.
Tinción general. Una de las tinciones más comúnmente usada en histología es la hematoxilina-eosina sobre cortes de
parafina. Como vemos se usa un colorante básico y otro ácido para teñir de diferente color a las estructuras ácidas y
básicas de la célula. Antes de proceder a la tinción, si partimos de cortes de parafina, tenemos que llevar a cabo unos
tratamientos previos sobre las secciones como es el desaparafinado, puesto que estos cortes son hidrosolubles. Si partimos
de cortes de criostato esto no se lleva a cabo.
Sección de un glomérulo de un riñón de mamífero obtenida a partir de una inclusión en parafina y teñido con hematoxilina-eosina. Los núcleos aparecen de color violáceo (hemtoxilina) y el citoplasma de color rosado (eosina).
Pasos que se siguen durante una tinción general de hematoxilina-eosina. Los tiempos son aproximativos porque dependen del grosor de los cortes y de la concentración de los colorantes. El desparafinado permite eliminar el medio de inclusión, la parafina. El paso por agua de grifo es típico de la hematoxilena y se denomina diferenciación. Las sales del agua permiten obtener una coloración más violácea, en vez de púrpura. La deshidratación final es necesaria porque el medio de montaje no suele ser hidrosoluble. Estos medios de montaje no afectan al tejido, ni a los colorantes y tienen unas propiedades ópticas excelentes. Además, conservan las preparaciones durante años en buenas condiciones. Tras el montado y secado (evaporación del xileno), las secciones se puede observar con el microscopio óptico.
Tinción de semifinos. Cuando se procesa material para microscopía electrónica es necesario, a veces, hacerse una
idea de qué zona del tejido vamos a cortar. Téngase en cuenta que el área de una sección para observar con el microscopio
electrónico es muy pequeña. Además, el proceso de osmificación que ha de llevarse a cabo previamente a la inclusión
acarrea el oscurecimiento del tejido, con lo que dificulta aún más la orientación de la muestra. Por ello es frecuente hacer
secciones de 0.5 a 1 µm de grosor con el ultramicrotomo, para orientarnos en la muestra y seleccionar la zona a partir de la
cual haremos las secciones ultrafinas. Los semifinos suelen tener áreas más más grandes que las que posteriormente
vamos a usar para la obtención de las secciones ultrafinas. El colorante usado para teñir secciones semifinas es
normalmente el azul de toluidina, el cual puede infiltrase en la resina calentada en un plancha y llegar hasta el tejido.
Contraste de ultrafinos. El contraste no es estrictamente una tinción, puesto que no aporta color a la muestra, pero sí
es un proceso para poder observar los componentes ultraestructurales de la célula, por ese motivo lo incluimos en este
apartado. Aunque las secciones para microscopía electrónica se pueden observar directamente con el microscopio
electrónico se suelen tratar previamente con metales pesados en un proceso denominado contraste, obteniendo así una
imagen óptima de la ultraestructura celular. Téngase en cuenta que en la microscopía electrónica lo importante no es añadir
sustancias coloreadas sino moléculas que puedan interferir con el camino de los electrones emitidos por el microscopio y
que atraviesan la muestra. Los electrones que atraviesan la muestra inciden sobre una pantalla fosforescente que emitirá
destellos de luz cuando reciban el impacto de un electrón y permite observar las características del tejido. Los metales
pesados unidos al tejido impedirán que pasen los electrones y por tanto se verá una zona negra en la pantalla
fosforescente, mientras que en aquellas zonas de la célula donde no estén estos metales provocaraán áreas luminosas en
dicha pantalla. Por ello todas las imágenes originales de microscopía electrónica son en blanco y negro, aunque se puedan
colorear posteriormente con un ordenador.
TINCIONES HEMATOLÓGICAS
La realización de extensiones y tinciones es práctica habitual en el laboratorio. Pese a no realizarse a todas las muestras, al no ser considerado procedimiento de rutina, es necesario en aquellos casos en los que se detecte mediante análisis previos alguna alteración.
La correcta realización, así como una buena interpretación de lo observado, permite en muchos casos el diagnóstico de hematopatías.
1. INTRODUCCIÓN.
Las tinciones hematológicas son un conjunto de procesos que conducen a la coloración de las estructuras que componen las células sanguíneas. Esto tiene por objeto el aumentar el contraste entre esas estructuras y el medio que las rodea, y permite por tanto que las células sean visual izadas microscópicamente con mayor facilidad.
2. TIPOS DE TINCIONES.
Las tinciones hematológicas pueden clasificarse según distintos criterios:
Atendiendo al nivel de vitalidad de las células que se pretende colorear, se dividen en tinciones vitales y no vitales.
Atendiendo al momento en el que empezaron a ser utilizadas para el diagnóstico hematológico, se dividen en tinciones tradicionales y especiales.
2.1. TINCIONES VITALES Y NO VITALES.
Las tinciones vitales y supravitales son aquellas que se practican sobre células que están vivas.
Las tinciones vitales son aquellas que se efectúan sobre células que están vivas, mediante la introducción de un colorante en la circulación de un organismo vivo. Son colorantes vitales, por ejemplo, el verde Jano y el azul de metileno.
Las tinciones supravitales son aquellas que se realizan sobre células o tejidos vivos, pero que están aislados del organismo del que proceden. Las tinciones no vitales se realizan sobre células muertas. La coloración de células muertas requiere un proceso previo de fijación, que tiene por objeto el mantener inalterada su estructura y el adherirlas firmemente a la superficie del portaobjetos. La fijación puede realizarse mediante calor, aunque habitualmente se realiza con etanol o metanol.
2.2. TINCIONES TRADICIONALES Y ESPECIALES.
Tradicionalmente, las tinciones se han logrado mediante el uso de colorantes que con frecuencia derivan de la anilina (tinciones tradicionales o clásicas). Estos colorantes se reúnen en 4 grupos:
Colorantes ácidos: tienen una especial afinidad por las estructuras alcalinas de las células, como por ejemplo la hemoglobina. El principal de ellos es la eosina.
Colorantes básicos: tienen una especial afinidad por las estructuras ácidas de las células, como por ejemplo los ácidos nucleicos. Uno de ellos es el azul de metileno.
Colorantes neutros: son sales de un ácido y de una base coloreados. Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro. Uno de ellos es el eosinato de azul de metileno.
Colorantes indiferentes: son los que no tienen afinidad por estructuras ácidas o básicas. Son insolubles en el agua y tiñen a aquellas sustancias que tienen un poder de disolución superior al del líquido empleado para preparar la solución colorante. Uno de ellos es el Sudán III empleado para teñir las grasas.
También hay combinaciones de colorantes que dan lugar a tinciones polícromas. Una coloración es panóptica cuando se utilizan sucesivamente sustancias colorantes neutras y es pancrómica cuando se aplican todas las sustancias colorantes neutras juntas.
El primero que tuvo la idea de realizar una de estas combinaciones fue Romanowsky, y los colorantes hematológicos utilizados en la actualidad suelen derivar del que él preparó.
Los colorantes de tipo Romanowsky constan de un colorante ácido (eosina) y de colorantes básicos (tiacinas). Las tiacinas son el azul de metileno y sus derivados obtenidos por desmetilación oxidatiya (colorantes tipo azur).
Las tinciones realizadas con colorantes de tipo Romanowsky, que más frecuentemente se emplean en el diag-nóstico hematológico, son la de Wright y la de Giemsa (utilizada sola o en combinación con la de May-Grünwald).
También hay tinciones panópticas rápidas que producen una coloración fácil y rápida de las estructuras celulares. Las tinciones especiales sólo se usan en circunstancias específicas. Son de dos clases:
Tinciones fluorescentes: emplean colorantes (fluorocromos) que se fijan a las células y que, cuando son estimulados por una luz ultravioleta, emiten una radiación visible, de un color característico. Los fluorocromos más utilizados en esta clase de tinciones son el naranja de acridina y el rojo neutro.
Tinciones citoquimicas: demuestran la presencia, más o menos abundante, o la ausencia de deteminadas sustancias, localizadas en el interior de los gránulos citoplasmáticos de los leucocitos.
Sirven para reconocer células leucocitarias (normales o anómalas) y, por tanto, para diferenciar unas clases de leucemias de otras. Por ejemplo, un colorante preparado a base de diaminobenzidina y de agua oxigenada, descubre la presencia de peroxidasa endocelular, y por consiguiente permite atribuir el origen de unas células leucocitarias inmaduras a la línea granulocítica o a la monocítica.
3. DENOMINACIÓN DE LAS ESTRUCTURAS COLOREADAS.
Atendiendo a sus apetencias tintoriales, las estructuras celulares pueden nombrarse de las siguientes formas:
Estructuras acidófllas u oxifilas: son aquellas que fijan colorantes de naturaleza ácida.
Si el colorante ácido que captan es la eosina, se dice que son eosinófilas. Con las tinciones tradicionales adquieren un color rosado.
Estructuras basófllas: son aquellas que fijan colorantes de naturaleza alcalina.
Con las tinciones tradicionales adquieren un color azulado. Si se tiñen de lila o púrpura con colorantes de tipo azur, se llaman azurófllas.
4. CAUSAS DE ERROR EN LAS TINCIONES REALIZADAS A FROTIS SANGUÍNEOS.
Si la tinción de una extensión sanguínea es demasiado rosa, probablemente esto se deba a:
Un pH bajo del colorante.
Un tiempo de coloración insuficiente.
Un lavado excesivamente prolongado.
Si la tinción es demasiado azul, posiblemente, esto esté causado por: un grosor excesivo de la extensión, o un pH alto del colorante.
Una coloración excesivamente prolongada.
Un lavado insuficiente.
Si tras la tinción aparecen artefactos o/y precipitados en la extensión, probablemente esto se deba a:
Un empleo de portaobjetos sucios.
Una falta de filtración del colorante.
Una coloración excesivamente prolongada.
Un secado del colorante durante la tinción.
Un lavado insuficiente.
Muchos de estos errores pueden obviarse utilizando teñidores automáticos de las extensiones sanguíneas. Actualmente, no suelen emplearse en la práctica clínica.
5. TINCIÓN GIEMSA.
Las tinciones hematológicas tipo Romanowsky utilizan azul de metileno y sus productos de oxidación (azur A, azur B y azur C) como colorantes básicos, combinándolos con la eosina como colorante ácido.
De este modo, obtenemos una tinción diferencial, es decir, una tinción que es capaz de discriminar entre las distintas estructuras celulares según se tiñan éstas con el colorante ácido, con el básico o con la mezcla de ambos.
Según la proporción de azul de metileno y de eosina que compongan el colorante tendremos distintos métodos de tinción. Entre ellos, los más conocidos son el método de Giemsa, el de Wright, el de Leishman y el pan óptico de Pappenheim.
Metódica
Es un extracto de las técnicas de tinción hematológicas de la casa Panreac.
Fundamento
Utilizamos como colorante la mezcla de azul de metileno y eosina propuesta por Giemsa.
Material necesario
Microscopio óptico.
Portas bien limpios.
Cristalizador.
Puentes de tinción.
Pipetas Pasteur con chupete.
Frascos lavadores.
Tubos de ensayo.
Reactivos
Colorante en solución según Giemsa de Panreac.
Solución tampón pH 7,2 de Panreac.
Metanol.
Aceite de inmersión.
Muestra
Sangre capilar fresca o venosa anticoagulada. El anticoagulante de elección es la heparina o el EDTA, ya que el citrato sódico y el oxalato potásico pueden dar preparaciones defectuosas.
Técnica
Preparamos un frotis sanguíneo según la técnica descrita con anterioridad.
Colocamos el frotis sobre el puente de tinción, en el cristalizador y en posición horizontal.
Cubrimos el frotis con metanol durante 3 minutos. Escurrimos y lo dejamos secar al aire. Con esto procedemos a fijar el frotis.
Diluimos en un tubo de ensayo 0,2 ml de azur-eosina-azul de metileno según Giemsa con 2 ml de solución tampón pH 7,2. Es importante realizar esta dilución en el momento de la tinción, ya que el colorante precipita y no es válido para otro día.
Mezclamos suavemente en el tubo y con una pipeta Pasteur cubrimos el frotis con la dilución de colorante, dejándolo actuar durante 25 minutos.
Escurrimos y lavamos con agua del grifo. Posteriormente lavamos con tampón pH 7,2 hasta eliminar los restos del colorante. Dejamos escurrir y secamos en posición vertical.
Lectura de resultados
Una vez seca la tinción, echamos una gota de aceite de inmersión y examinamos al microscopio óptico con el objetivo de 100 x.
Los eritrocitos se tiñen de color rosa asalmonado y las plaquetas de color violeta.
Los neutrófilos presentan el núcleo de color azul violeta, el citoplasma rosa y la granulación de un color violeta rojizo.
6. TINCIÓN DE WRIGHT.
Metódica
Extracto de las técnicas de tinción hematológica de la casa Panreac.
Fundamento
El colorante utilizado es una solución de eosina y una mezcla de azul de metileno (del 50 al 75%) y azur B (del 10 al 25%) junto con otros derivados del alcohol metílico.
Dada la presencia de metanol en la composición del colorante, no es necesario un paso previo de fijación antes de la coloración.
Sólo si se van a guardar las extensiones sin teñir de un día para otro precederemos a su fijación para evitar el deterioro del frotis.
Material necesario
Microscopio óptico.
Cristalizador.
Puentes de tinción.
Pipetas Pasteur con chupete.
Frasco lavador.
Guantes.
Tubos de ensayo.
Reactivos
Solución de eosina-azul de metileno según Wright.
Solución tampón pH 7,2.
Aceite de inmersión.
Muestra
Sangre capilar fresca o venosa anticoagulada. Los anticoagulantes más adecuados son la heparina y el EDTA.
Técnica
Realizar un frotis sanguíneo muy fino. Dejar secar al aire.
Sobre la extensión colocada horizontalmente en el puente de tinción verter 1 ml de eosina-azul de metileno. Dejamos actuar un minuto y lavamos con solución tampón pH 7,2. Dejamos escurrir y secar en posición vertical.
Inmediatamente antes de su empleo y en un tubo de ensayo, diluimos 0,5 ml. de eosina-azul de metileno con 0,5 ml de solución tampón pH 7,2. Mezclamos bien y cubrimos con esta dilución la extensión. Teñimos durante 3-5 minutos y lavamos con agua del grifo. Volvemos a lavar con solución tampón pH 7,2. Dejamos escurrir y secar en posición vertical.
Lectura de resultados
Depositamos una gota de aceite de inmersión y observamos con el objetivo de 100 x.
Las células se observan coloreadas de la misma manera que con la tinción de Giemsa.
7. TINCIÓN PANÓPTICO RÁPIDO.
Metódica
Extracto de la técnica Panóptico rápido de la casa QCA.
Fundamento
Este método de tinción diferencial es un sistema que aúna la policromía y la calidad que proporcionan los métodos clásicos (Giemsa y Wright) con una gran rapidez de ejecución (15 segundos solamente).
Frente a las técnicas de tinción descritas anteriormente, donde el colorante se extendía sobre el frotis, ésta presenta la peculiaridad de ser un método de inmersión, donde el frotis se sumerge en la solución colorante durante un tiempo determinado.
Material necesario
Cubetas de Wertheim o similares.
Cestillo para portas.
Frasco lavador.
Reactivos
Solución nº 1: Solución alcohólica de triarilmetano.
Solución nº 2: Solución tamponada de xanteno.
Solución nº 3: Solución tamponada de tiazina.
Agua destilada.
Muestra
Frotis sanguíneo preparado recientemente y que se ha dejado secar al aire.
Técnica
En tres cubetas de Wertheim o similares se disponen los colorantes solución nº 1, nº 2 y nº 3.
Colocamos los frotis en el cestillo para portas y lo sumergimos en la cubeta con la solución nº 1 durante 1 segundo. Repetimos la inmersión cuatro veces (en total 5 segundos). Dejamos escurrir.
Sumergimos a continuación otras cinco veces, cada una de un segundo de duración, en la cubeta con la solución nº 2. Dejamos escurrir.
Finalmente, sumergimos otras cinco veces de un segundo cada una en la cubeta con la solución nº 3. Lavamos con agua destilada y dejamos secar.
Lectura de resultados
Depositamos una gota de aceite de inmersión sobre el frotis y observamos con el objetivo de 100 x.
Las coloraciones obtenidas en las células sanguíneas son similares a las de la tinción de Wright y Giemsa. Sin embargo, podemos variar la intensidad de la tinción modificando el número de inmersiones en los colorantes nº 2 y nº 3, según se desee destacar las tonalidades rosas o las azules.
Notas sobre el método
Las cubetas con las soluciones colorantes, especialmente la del nº 1, deberán guardarse siempre bien tapadas, con el fin de evitar una evaporación excesiva que podría inducir a desviaciones de color respecto a las tinciones habituales.
Antes de agotar el contenido de una cubeta, debemos ir adicionando una nueva cantidad de solución colorante para mantener, día a día, un nivel apropiado del mismo. De vez en cuando se debe renovar todo el contenido de la cubeta.
En aquellos laboratorios con pequeño número de fórmulas hemáticas, las cubetas de Wertheim pueden ser sustituidas ventajosamente por pequeños frascos de cristal con tapón a rosca.
