El objetivo de nuestro trabajo era de determinar los efectos de
la tensin oxidativa sobre el proceso de neuro degeneration en la
sustancia negra , y evaluar la oxidacin de dopamina en el plasma
que usa una tcnica de voltamperometra cclica (CV) . Tambin hemos
estudiado la correlacin entre los aumentos de niveles de especie de
dopamina oxidados con la severidad de lpido-peroxidation en el
plasma. Sesenta y cuatro ratas de macho Wistar fueron divididas en
cuatro grupos experimentales y recibidas el aire (el Grupo I, el
control) o el ozono (0.25 ppm) diariamente por la inhalacin para 4
h para 15 (el Grupo II), 30 (el Grupo III), y 60 (el Grupo IV) das.
Los sesos fueron procesados para la posicin inmunohistoqumica de
dopamina y p53 en la sustancia negra . El plasma tranquilo de estos
animales fue probado para productos de dopamina oxidados que usan
CV y los niveles de lpido-peroxidation fueron medidos. Nuestros
resultados indican que la exposicin crnica a O3 bajo causas medicas
el nmero de neuronas Dopaminrgico disminuy, y aumentos de clulas
p53-immunoreactiva hasta 30 das; que era una funcin del tiempo de
exposicin al ozono. Estrs oxidativo produce un aumento
significativo de los niveles de las quinonas de dopamina (DAQs) que
tuvo correlacin bien (la r = 0.962) con perxidos de lpido en el
plasma durante el perodo de estudio. Estos resultados sugieren que
DAQ pudiera ser un indicador confiable, perifrico oxidante la
sustancia nigra el dao en el cerebro.Introduccin La dopamina (DA)
es un catecolamina, que juega un papel importante en el sistema
nervioso central de mamferos (CNS) como un neurotransmisor, y est
presente en cantidades mayores que otros neurotransmisores. Bajo
los niveles de estriado DA han sido encontrados en pacientes con la
enfermedad de Parkinson (Wightman et al., 1988). El metabolismo
normal de dopamina implica muchas reacciones de oxidacin, que
producen daos en el metabolismo capaz de causar el dao de clula
(Hermida-Ameijeiras et al., 2004). En un estado de redox
equilibrado, la oxidacin DA es la parte del metabolismo normal.
Cuando un desequilibrio de reduccin de oxidacin existe, la oxidacin
de aumentos de DA dar lugar a quinonas de dopamina (DAQs). Ellos
pueden reaccionar con cistena y producir residuos cysteinyl;
aquellos son capaces de inhibir la funcin de muchas protenas
(Ramsden et al., 2001). Hay pruebas que una permeabilidad aumentada
" la barrera de cerebro de sangre " ocurri en varias condiciones
experimentales y patolgicas, como en el proceso de neuroinflamacion
o enfermedades neurodegenerativas, que ocurre acompaado por
aumentos de la especie de oxgeno reactivo (ROS) (Schreibelt et al.,
2007; Carvey et al., 2005; Zlokovic, 2008). Por lo tanto, la
dopamina oxidada puede cruzar la barrera cerebral de sangre (BBB) y
circularse en el plasma (Carvey et al., 2005).Dosis de ozono bajas
son usadas como un modelo no invasivo para causar la tensin de
oxidativa (Rivas-Arancibia et al., 1998). Este estado de
oxidativa-tensin produce un aumento de niveles de
lpido-peroxidation en estructuras diferentes cerebrales
(Rivas-Arancibia et al., 2000). Dopaminergico la muerte neuronal es
una parte fundamental de este proceso neurodegenerativo cuando un
animal es expuesto 4 horas por da durante al menos 1 mes al ozono
(Pereyra-Mu~noz et al., 2006).Como el DA rpidamente es oxidado,
tcnicas electroqumicas han sido exploradas para su anlisis en
parachoques y medios de comunicacin controlados, pero la oxidacin
DA ha sido investigada en sistemas biolgicos. (Guan-Sonido metlico
et al., 2004, 2007; Ramesh et al., 2004; Aguilar et al., 2004;
Patel et al., 2005). Usamos un mtodo basado en la voltamperometra
cclica (CV) que nos permite para medir el DAQS en el plasma y
correlacionar esto con el dao progresivo en el substantia nigra
causado porel estrs oxidativo .Nuestro objetivo era determinar si
el estado de oxidative-tensin causado por la exposicin crnica baja
O3, causa el proceso progresivo neurodegenerativo en el substantia
nigra y el aumento de metabolismo oxidado de dopamina en el
plasma.Materiales y mtodos Animales y cuidado animal Sesenta y
cuatro ratas de macho Wistar que pesan 250-300 g individualmente
fueron almacenadas en cajas acrlicas con el alimento ad libitum
(NutriCubo, Purina, EE.UU.) y guardadas en un espacio aire limpio.
Ambos el control y trat ratas fueron mantenidos en una temperatura
y la humedad control y fue matada conforme al Instituto Nacional de
Directrices de Salud para el Tratamiento animal.Procedimiento
general Las ratas al azar fueron divididas en cuatro grupos
experimentales (la n = 16). El grupo 1 fue compuesto de animales
expuso diariamente a una corriente de aire sin O3 por 4 h y los
grupos 2, 3, y 4 eran animales expuestos para 15, 30, y 60 das a
O3. La exposicin al ozono fue hecha diariamente para 4 h en una
dosis de 0.25ppm (similar hasta un da de alta contaminacin en
Ciudad de Mxico) (Rivas-Arancibia et al., 2010).Dos horas despus de
la ltima exposicin para limpiar el aire O3, plasma de seis animales
de cada grupo fue obtenido de sangre de corazn para niveles de
lpido-peroxidation (LPO). Cuatro animales de cada grupo
profundamente fueron anestesiados con el sodio pentobarbital (50
mg/kg ip; Sedalpharma, Edo. de Mxico, Mxico) e inundado
transcardial con paraformaldehdo del 4 % (Sigma-Aldrich Chemie,
Alemania) en parachoques de fosfato 0.1M (J.T. Panadero, NJ) (PB,
Tecsiquim; pH 7.4). Los sesos fueron aadidos con el formaldehdo del
10 % (J.T. Panadero, EE.UU.) para 24 h e integrado en parafina (Mc
Cormick, San Louis, MO, EE.UU.). Las rebanadas sagitales del
cerebro que contiene el substantia nigra fueron cortadas en 5 ' el
lunes amicrotome (el americano ptico) y montadas sobre
diapositivas. De cada grupo rebanadas sagitales cerebrales que
contienen el substantia nigra fueron procesadas por
inmunohistoqumica para DA y p53. Adems, seis animales de cada grupo
profundamente fueron anestesiados y una muestra de sangre fue
obtenida, que la muestra era entonces centrifugeda y 1.5mL del
plasma inmediatamente fue estudiado por CV Exposicin de 03Los
animales fueron guardados diarios para 4 h en una cmara con un
difusor, unidos a un flujo variable O3 el generador (5 L/s). El
ozono fue generado en un tubo por el cual una corriente de voltaje
alto se circulado, que caus la conversin de oxgeno en O3. Los
niveles de produccin de ozono eran proporcionales a la intensidad
corriente y al flujo de aire. Un Ozono PCI y el Monitor de Sistema
de control fueron usados medir la concentracin O3 dentro de la
cmara en todas partes del experimento.
Ensayo de Lpido-peroxidacin (LPO) Los niveles de LPO fueron
cuantificados usando un Ensaye de k LPO el equipo (Kamiya la Compaa
Biomdica). Despus de la ltima exposicin a O3, seis animales de cada
grupo profundamente fueron anestesiados, matados por la
decapitacin, y su plasma fue obtenido. Los reactivo de enzima
(ascorbic oxidase y lipoprotein lipase) fueron aadidos. La mezcla
fue incubada para 5min en 35? C y el reactivo chromogen
(10-n-methylcarbamoyl-3,7-dimethylamine-10-h-phenothiazide) fue
aadido. La mezcla de pasar fue incubada durante 10 minuto en 30? C.
El absorbancewasthen moderado en 675nmin un espectrofotmetro
(Jenway 355). Una curva de calibracin de dos puntos fue hecha
usando la salina en blanco (0 nmol/mL) y 50 nmol/mL cumene
hydroperoxidase el estndar provedo del equipo.Los resultados fueron
calculados usando la ecuacin, cuya gama lineal para este ensaye
estaba entre 2.0 nmol/mL y 300 nmol/mL, LPO [nmol/mL] = [(Es - Eb)
50 / (Estd - Eb)], donde Es es la muestra absorbance, Eb es
absorbance en blanco, y Estd es el cumene absorbance (50
nmol/mL)
Immunohistochemistry for DA and P53Las secciones sagitales de
cada cerebro que contiene el substantia nigra tenan la parafina
quitada, se trat con un retiro de parafina y la solucin de
recuperacin de calor (Biocare Mdico), e introdujo en una olla a
presin elctrica (Decloacking la Cmara, Biocare Mdico) por 5min.
Despus del lavado con el agua destilada y tratamiento con perxido
de hidrgeno (diluido 1:5; el Pescador Cientfico) para 5min, las
secciones fueron aclaradas otra vez con el agua destilada y
tratadas con un reactivo obstructor (el Francotirador De fondo,
4plus el Componente de Deteccin, Biocare Mdico) para 10 minuto.
Ellos entonces fueron lavados con el parachoques de salina de
fosfato 0.1M (PBS), el pH 7.4 (Merck), e incubados para 12 h en 4?
C con Anti-DA (conejo purificado polyclonal anticuerpo, diluido
1:500, Chemicon) o p53 (conejo purificado polyclonal anticuerpo,
diluido 1:200, Biocare). Las secciones fueron aclaradas con PBS y
tratadas con el anticuerpo biotinylated secundario (el Eslabn
Universal, Biocare Mdico) para 1 h. Despus del lavado con PBS, trat
con streptavidinenzyme conjuga (4plus el componente de deteccin,
streptavidin-hrp, Biocare Mdico) durante 30 minuto, y lavado otra
vez con PBS, el anticuerpo atado fue visualizado usando
3,3-diaminobenzidine (APLICAR el Equipo de Sustrato, ScyTek) como
el cromgeneo. Las rebanadas fueron lavadas en el agua destilada y
contramanchadas con la solucin hematoxylin-parachoques. Secciones
representativas cerebrales de cada grupo fueron procesadas en la
paralela despus de la cubierta de ellos con Permount coverslips y
las secciones fueron examinadas con un olimpo BX41 el Microscopio y
fotografiadas con una Evolucin-QImagin el Equipo de Cmara Digital
(MediaCybernetics).
Numero de neuronas en la sustancia nigra Cuatro animales de cada
grupo experimental fueron analizados. El nmero de clulas
immunoreactivas en el substantia nigra fue contado, usando cuatro
secciones representativas cerebrales de cada animal de cada grupo y
para cada anticuerpo. El nmero total de clulas immunoreactivas por
campo microscpico en 40 la amplificacin (cada campo microscpico
tena un rea de 30,000 ' M2) fue contado, analizado para cada grupo,
y el nmero de clulas fue calculado.Voltamperometra cclica (CV)Las
Medidas de voltamperometra cclicas fueron hechas usando un
Controlado por ordenador personal BAS el Epsiln terminal de trabajo
electroqumico (el Oeste Lafayette, Indianapolis, EE.UU.), unidos a
un soporte de clula c-3 con una configuracin de tres electrodos,
que consisti en un carbn vidrioso (GC) (BAS modelan MF-2012, = 3mm)
como el electrodo trabajador, un AgCl-Ag 3M KCl (BAS modela
MW-2063) como el electrodo de referencia, y un cable platino como
un electrodo auxiliar (BAS modela MW-1032), todos ellos del Oeste
Lafayette, Indianapolis, EE.UU.. OriginPro 7.0 software fue usado
para la transformacin de la seal inicial y para obtener los
primeros derivados de las seales de voltamperometra. Todos los
potenciales fueron corregidos comparados al electrodo normal de
hidrgeno (NHE). Los animales profundamente fueron anestesiados y
una muestra de sangre fue recogida directa del ventrculo izquierdo.
El plasma (1.5 mL) fue puesto en una clula de volumen baja, que fue
purgada con el nitrgeno (la alta pureza Extrema, Praxair) para
eliminar el oxgeno antes de la adquisicin de datos. El voltagrama
fue registrado entre-1.3v y 1.7V en una tarifa de exploracin de
0.1Vs-1. La ventana completa plasma electroqumica era-1.6v a 1.7 V.
Todas las medidas fueron hechas en la temperatura ambiente. El
electrodo vidrioso de carbn fue pulido a mano con un pao de
pulimento liso con alumina ( = 0.05 ' m; LECO, San Joseph, MO,
EE.UU.), sonicated en el agua destilada durante 2-4 minuto, y luego
secado con acetona (Buehler, Fanfarronada de Lago, Il, EE.UU.)
antes de cada medida. Determinar las caractersticas voltametricas
del sistema biolgico no afectado por tensin de oxidativa, el CV del
plasma de sangre obtenido de ratas no expuestas a O3 fue registrado
en la temperatura ambiente con un carbn vidrioso como el electrodo
trabajador. Estas curvas fueron usadas como el control y las
comparaciones subsecuentes estaban basadas en estos
resultados.Mtodos estadsticosLos datos del nivel de lpido
peroxidation y cambios del nmero de clulas immunoreactivas dentro
del substantia nigra como una funcin del tiempo de exposicin al
ozono fueron analizados por una prueba de Kruskal-Wallis y la
Prueba de u de Mann-Whitney. La voltamperometra cclica y los datos
del nivel de lpido peroxidation fueron analizados por la estadstica
no paramtrica. Para facilitar el anlisis de los datos de la
voltamperometra cclica, los datos matemticamente fueron tratados
para obtener el primer derivado de los picos de ctodo. Esto permite
a la ampliacin y la definicin las ondas que de otra manera
claramente no pueden ser observadas en un experimento de
voltammogram tpico. Los valores del primer derivado de cada grupo
fueron expresados como medianas y analizados estadsticamente usando
Kruskal-Wallis no paramtrico y la Prueba de u de Mann-Whitney . Una
correlacin de Lanza entonces fue calculada para obtener el nivel de
correlacin de los niveles de especie DA-oxidized contra niveles
LPO.
Resultados En el anlisis de niveles LPO plasma, encontramos los
aumentos de 59.31.2 nmol/mL, 69.31.5 nmol/mL, y 78.330.4 nmol/mL
como una funcin del tiempo de exposicin al ozono (15, 30, y 60
das), comparado al grupo de control, que tena un nivel de LPO de
47.370.63 nmol/mL (el Higo 1). La prueba de Kruskall-Wallis mostr
diferencias significativas entre los grupos en los niveles del
plasma LPO (P
