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El advenimiento de la microscopía óptica produjo una revoluciónen las ciencias naturales, con su mayor impacto en el estudio delos seres vivos. La capacidad de distinguir las mínimas unidadesde la vida reveló la presencia de grupos de organismosinsospechados hasta entonces y comenzó a mostrar las increíblesformas de reproducirse y dispersarse de estos. La observación delos tejidos vegetales en siglo XVII por Robert Hooke (1635­1703)mostró que estos están constituidos por unidades discretas yrepetitivas a las que se llamó células (por cellula, diminutivo latinode cella, "celda"). Las primeras evidencias sobre la reproducciónde las células plantearon grandes cambios de paradigmas aniveles tanto prácticos filosóficos. Comenzó a discutirse que si lavida sólo provenía de la vida o si una célula podía aparecer porgeneración espontánea o si se requería una célula predecesorapara originarla, siendo esta última idea corroborada porcientíficos como Lazzaro Spallanzani (1729­1799) y Louis Pasteur(1822­1895).

En el campo de las ciencias de la salud, se iniciaría unarevolución que terminaría explicando muchas de las preguntasde larga data, como la causa del contagio de las enfermedades.Fueron en particular los micólogos algunos de los primeros enverificar la naturaleza "microorganísmica" de algunas patologíasde las plantas, tal vez dada la coincidencia espacial y temporaldel auge de estos desarrollos científicos y las grandes pestes quediezmaron las vides en Europa. Con la observación de lasestructuras de dispersión de Plasmopara viticola y otrospatógenos vegetales, se comenzaron a reconocer los ciclos devida y se propusieron las formas de evitar el contagio, ademásdel primer antifúngico, conocido como "caldo bordelés",inventado por Pierre Alexis Millardet (1838­1902) a fines del sigloXIX. Entre los jóvenes que se formaron en el estudio de esaspatologías de la vid, se encontraba un joven italiano al que casi

TEORÍA

por Francisco KuharAlejandro Sequeira

fkuhar@gmail.com

Dr. Francisco Kuhar: es micólogo einvestigador en el IMBIV (UNC­

CONICET), curador de la colección dehongos del Museo Botánico de

Córdoba y co­fundador de Hongos deArgentina.

Alejandro Sequeira: es investigadorcon formación biológica y un vasto

conocimiento de los hongos delUruguay, además de autor y editor de

varios libros y guías de campo.

Los hongos al microscopio

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todos conocemos: Carlos Spegazzini (1858­1926),que a la edad de 21 años ya se encontraba en elcono sur describiendo su primer macrohongo:Agaricus platensis (hoy situado en el géneroOudemansiella) y no pararía hasta completar sumonumental obra que incluye miles de nuevasespecies de esa zona. Vemos así como la tareaque nos ocupa es herencia directa de losprimeros microscopistas. Por supuesto, elconocimiento de los hongos ya existía. Laobservación a "ojo desnudo" era suficiente paradistinguir qué hongos comer y cuáles no. La formadel esporoma, la disposición del tejido fértil, loscolores y texturas, e incluso la observaciónmacroscópica de las esporas en masa (Figuras 1 y2), había dado lugar a las primeras clasificacionesformales del reino de los hongos, pero eladvenimiento de la microscopía reveló un mundode caracteres nuevos que dio lugar a unarevolución en el estudio e identificación de loshongos.

¿Cuáles son los caracteres que observaremos almicroscopio? Las esporas suelen ser decisivas a lahora de las determinaciones en conjunto con los

esporangios (basidios –Figura 3­ o ascos), perotambién tenemos que poner atención a lasestructuras estériles que los acompañan en elhimenio (superficie fértil): los cistidios (Figura 4), enel caso de los basidiomicetos, y las paráfisis en losascomicetos. En el caso de los hongos en polvera,en los que no distinguimos un himenio organizado,observaremos las hifas del capilicio, queconforman el pseudotejido que dio origen a lasesporas (la gleba). Luego es importante observarlas hifas somáticas para ver si poseen fíbulas o no,y el patrón de ramificación. En muchos hongos,en especial en los políporos y corticioides existendiversos tipos de hifas: además de las hifasgenerativas, tabicadas, ramificadas y fibuladas,existen hifas con pocos septos, paredes gruesas yque pueden estar ramificadas o formar largossegmentos sin ramificación. En el primer caso lasllamaremos ligadoras, y en el segundo,esqueletales. Los basidiomas que posean un solotipo de hifas serán monomíticos, los que poseandos serán dimíticos, y en caso de tener tres, serántrimíticos. Es de especial importancia en loshongos de sombrero, diferenciar los tipos de"pileipellis", es decir, la estructura de la cutículadel píleo (Figura de portada). Esta puede mostrarhifas paralelas y reptantes (cutis), estar formadapor una capa de elementos globosos (epitelio) omostrar hifas más o menos perpendiculares a lasuperficie (tricodermis) entre otrasconfiguraciones más raras.

Pero volvamos a las técnicas: a pesar de que laspreparaciones que hacemos los micólogos suelenser extremadamente simples en comparacióncon las de la histología o patología animal, nosson pocos los implementos ni frasquitos conlíquidos que tenemos que tener a nuestroalcance al sentarnos frente al microscopio.

En primer lugar, trabajamos en general concortes. Esto se debe a que la microscopía ópticatradicional funciona con luz transmitida, es decir,

Figura 1: Esporada de Gymnopilus junonius. El color castaño delas esporas en masa es característico de varias familias dehongos, entre ellas, Cortinariaceae y Strophariaceae, a la quepertenece este género.

Figura 2: Esporada de Clorophyllum molybdites. La coloraciónverde nos permite identificar a esta especie tóxica, que aprimera vista se podría confundir con algunos hongoscomestibles como Chlorophyllum (Macrolepiota) rhacodes.

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la luz que llega a nuestros ojos es la que logróatravesar la muestra. Por el contrario, al utilizar la"lupa" o estereoscopio, vemos la luz reflejada, yno es necesario cortar las estructuras para dejarlapasar. Entonces, nuestra primera herramienta esla de cortar, y casi todos los micólogos que seprecien de serlo, prefieren la tradicional hoja deafeitar.

Manos a la obra: dada la naturaleza elástica,gelatinosa o cartilaginosa de la mayoría de loshongos, la menor presión produciría unadeformación que dificultaría el corte, por lo quees más fácil contar con material desecado.

La desecación, además de facilitar el corte, es elmétodo más común con el que se preservan loshongos, ya que permite que se mantengandurante mucho tiempo prácticamenteinalterados. Para secarlos correctamente, lo máscomún es exponerlos a una fuente de aire tibio,aunque en lugares con baja humedad, bastacon dejarlos expuestos unos días al aire.Comenzamos haciendo un corte neto que dejeexpuesta una superficie o borde recto. Acontinuación, a simple vista o con el auxilio de lalupa binocular, intentamos hacer finas seccionesdel borde expuesto a fines de lograr una tandelgada, que la claridad pueda traslucir por ella.Las secciones van a caer sobre una superficielimpia o van a quedar pegadas a la hoja deafeitar. Antes de tocarlas colocamos una gota delíquido en el portaobjetos, ya que si colocamos ellíquido sobre las secciones, corremos el riesgo decontaminar el frasco con esporas. Podemos mojarla punta de una aguja en ese líquido y al tocar lassecciones delgadas, las podremos recoger yllevar al portaobjetos. Luego solo queda cubrir lagota con el cubreobjetos, secar el líquidoexcedente, y proceder a observar. Lo que nadieha dicho aún, es de qué líquidos se trata.

Uno de los reactivos más utilizados es el hidróxidode potasio (KOH) o de sodio (NaOH),generalmente al 3 o 5 %, (Tabla 1). La razón por laque usamos esta solución, es su capacidad de"mojar", dado que muchos hongos tienenestructuras "hidrofóbicas" (que repelen el agua)por estar cubiertas de ceras o lípidos semejantes.Es tan larga la tradición de uso de hidróxido depotasio en particular (más que el de sodio), quesiempre que indicamos las medidas o color de lasesporas en una descripción, lo haremosobservándolas en este reactivo para estar segurosde verlas tal como las vieron Fries, Bresadola,Spegazzini, o quien sea que las hubiera descripto.

Al proceder a observar, sabemos que nosenfrentamos con el problema de la distanciafocal: a mayor aumento, menos distancia entre lalente y el objeto a enfocar. Tal es así, que alquerer aumentar mil veces, la lente objetivo

Tabla 1: Medios de montaje más utilizados para la confeccióny preservación de los preparados de microscopía óptica. Esimportante recordar que tanto el hidróxido de potasio comoel lactofenol son irritantes y hay que utilizarlos con ciertaprecaución.

Figura 3: Los basidios son las células que producen las esporassexuales en los basidiomicetos. En este caso vemos un basidiode Descolea brunnea con solo dos esterigmas (proyeccionescelulares cónicas), uno de los cuales aún lleva unabasiodiospora castaña. La barra nos sirve como referencia detamaño.

Figura 4: Cistidios de Tormentella sp. Observados con unmicroscopio de interferencia diferencial. Este tipo demicroscopio óptico permite ver las estructuras en altocontraste sin necesidad de teñirlas.

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terminaría por rozar el cubreobjetos. Para ellocolocamos una gota de otro líquido sobre elpreparado: el famoso aceite de inmersión. Setrata de una sustancia que no corroe loscomponentes de la óptica, y que permitecambiar el ángulo de difracción de la luz demanera tal que podamos alcanzar los milaumentos sin llegar a tocar el preparado con laóptica, que quedan unidos por la gota de aceite.Hay casos en los que necesitamos guardar elpreparado por unos días. Entonces recurrimos alácido láctico, que no se evapora, o mejor aún, allactofenol, que preservará durante muchotiempo la muestra por ser un potente fijador queno permite el crecimiento de microorganismos.Aquí tendremos que recordar que el KOH sueleestar contaminado con carbonatos y estos van areaccionar con el láctico o el lactofenol (Tabla 1),llenando el preparado de espuma de dióxido decarbono. Si el preparado ya contenía KOH yqueremos preservarlo, la mejor opción seráagregar una gota de glicerina sobre en elportaobjetos en contacto con la preparación, ypor el otro lado de la misma, extraeremos el KOHcon un papel absorbente. En caso de quererguardar el preparado por mucho tiempo,simplemente le pintamos un reborde esmaltepara uñas que haga las veces de marco y noolvidamos jamás rotular el preparado.

Otro grupo de sustancias a las que sin dudarecurriremos son los colorantes (Tabla 2): Entre losmás utilizados se encuentran la floxina, quesimplemente aumenta el contraste y nos permitevisualizar las estructuras más hialinas delpreparado. Otro muy común es el rojo Congo,que tiene una gran afinidad por las paredescelulares. Cuando una estructura se tiña másintensamente con este compuesto que lascircundantes, la describiremos como "congófila".Dado que este colorante no discrimina entreparedes celulares fúngicas y vegetales, enpreparados que necesitemos distinguirlaspreferiremos el azul de algodón, del cual losmicólogos suelen decir que "solo tiñe hongo", conlas ventajas adicionales de que no requiere unpaso previo por KOH ya que es mojante por sí

mismo, y además contiene lactofenol, sirviendocomo medio preservante por mucho tiempo. Siuna estructura absorbe este colorante con mayoravidez que el resto del material fúngico, lallamaremos "cianófila".

Las reacciones metacromáticas (Tabla 3) son degran ayuda para distinguir grupos de hongos: setrata de preparados en los que se forma un colornuevo al entrar en contacto un reactivo con elmaterial fúngico: el KOH puede hacer virar atonos azulados a las esporas de algunasThelephoraceae permitiéndonos distinguir entreespecies. Cuando torna dorados a los cistidios, seles dirá "crisocistidios", y si termina por disolverlos,les diremos "liocistidios". Pero el reactivometacromático que nunca puede faltar a ningúnmicólogo es el famoso Melzer. Este se componede una base que es mojante y preservante, perosu principio activo es el iodo: al igual que lo hacecon el almidón el iodo le da una coloraciónviolácea intensa a muchas estructuras fúngicas alas que llamaremos "amiloides" (parecidas alalmidón).

Veremos que las esporas de muchas Mycenareaccionan de manera muy suave y pareja alMelzer, y mucho más intensamente en algunasAmanita, mientras que en los Russulales o en lasMelanoleuca será la ornamentación quientomará la metacromasia, y de manera muchomás intensa. También azulearán los ascos de lasPezizales, y el aparato apical de muchosascomycetes, pero frente a otras estructuras, enlugar de dar una coloración violáceo­azulada,obtendremos una rojiza, en la que se conocecomo reacción "dextrinoide". Se trata de una delas reacciones de rutina que se aplican alcontenido estomacal de alguien de quien sesospecha ha consumido la mortal Amanitaphalloides, ya que su gran amiloidía las hará

Tabla 2: Colorantes de uso común en el laboratorio demicología. Al igual que la mayoría de los colorantes, exhibencierto grado de toxicidad y pueden ser cancerígenos a largoplazo, por lo que hay que evitar ingerirlos o aspirarlos.

Tabla 3: Reacciones de modificación de estructura y cambiode color (metacromáticas) que nos ayudan a identificar a loshongos. El reactivo de Melzer contiene hidrato de cloral, quees irritante y narcótico y por esto tiene que ser manejado concuidado, al igual que los demás medios.

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Bibliografía recomendada:

Alexopoulos, C. J. (1979). Introducción a la Micología. BuenosAires: EUDEBA.

Kuhar, F., Castiglia, V. y Papinutti, L. (2013). Reino Fungi:morfologías y estructuras de los hongos. Revista BoletínBiológica, 28, 11­18.

Kuhar, J. F., Castiglia, V. C. y Papinutti, V. L. (2012). Los hongosen el laboratorio: de la naturaleza al cultivo axénico. RevistaBoletín Biológica, 27, 5­8.

evidentes aunque estén mezcladas con todo elbolo alimentario. Solo una precaución esnecesaria: no aplicar el reactivo de Melzer almaterial que ya se trató con KOH, ya que estoalteraría los resultados de la reacción.

Además de sus esporas con ornamentacionesamiloides, muchas Russulales presentan hifasgloeopleuras o sulfocistidios. Para verlas, unareacción más compleja es necesaria: la llamada"sulfovainillina". Aquí agregaremos ácido sulfúricoa vainillina en cristal o un fenol semejante, lasmezclaremos con una aguja, y de inmediatopondremos el tejido bajo aumento, paraconstatar el contraste aumentado de estasestructuras. Allí es donde hay que tomar el datocon rapidez, ya que todo el preparado terminarápor sucumbir ante el ataque del ácido sulfúrico.

Muchas otras técnicas se aplican en lamicroscopía óptica y el tema no queda agotadoen esta breve introducción. Algunas

consideraciones finales conciernen a lapreservación de los ejemplares originales o"vouchers". Cuando hacemos preparaciones ydescripciones basadas en las mismas, es muyimportante que el preparado quede rotulado ylas imágenes archivadas con un nombre que nospermita referirlas al material original. Hasta el díade hoy no se consideran válidas las descripcionesde especies para las cuales no se ha depositadoese espécimen llamado "Tipo" sobre el cualtrabajarán futuros científicos que quierancontinuar con nuestro trabajo. Ese material serásecado a temperaturas menores a 50 grados afines de preservar su ADN y quedará archivadoen instituciones que sean capaces de ponerlas alalcance de científicos de todo el mundo. De estamanera nos aseguramos que el tiempo invertidoen las preparaciones y observación microscópicano sean en vano y que puedan llegar aconvertirse en un aporte para la ciencia y elfantástico reino de los hongos.

Glosario

Basidiomas: Estructuras reproductivas sexuales de loshongos basidiomicetos, comúnmente conocidas comosus "cuerpos fructíferos".

Capilicio: conjunto de hifas (filamentos) queconforman la masa reproductiva sexual de los hongosen polvera.

Cistidios: elementos estériles (no reproductivos)microscópicos presentes en las superficiesreproductivas sexuales de los hongos basidiomicetos.

Corticioides: Hongos cuya superficie reproductivasexual es lisa. Suelen producir sus esporas debajo demadera en descomposición.

Esporada: depósito de esporas que se logradepositando el basidioma fresco sobre una superficielisa para observar el color de las esporas en masa.

Fíbula: puente que comunica dos células adyacentesde los hongos basidiomicetos y permite la correctadistribución de los núcleos provenientes de losprogenitores.

Gloeopleuras: Hifas con pocos septos y contenidooleoso y recorrido serpenteante.

Himenio: superficie organizada donde se producen lasesporas sexuales de muchos hongos.

Paráfisis: elementos estériles (no reproductivos)microscópicos presentes en las superficiesreproductivas sexuales de los hongos ascomicetos.

Pezizales: orden de hongos pertenecientes a la clasede los ascomycetos y cuyas fructificaciones (ascomas)se asemejan a platos, colmenillas o trufas.

Políporos: hongos pertenecientes a la clase de losbasidiomicetos cuya superficie reproductiva seorganiza en poros. Muchos de los hongos en repisapertenecen a este grupo.

Sulfocistidios: cistidios que se tiñen con una técnicaespecial llamada sulfovainillina.

La Fundación Hongos de Argentina es unproyecto de difusión del conocimiento del reino

de los hongos, y la divulgación de los estudiosmicológicos para todos los interesados.

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