CARRERA DE ESPECIALIZACION EN CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIALBIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

FCEyNFCEyN--INTIINTI

Materia de Especialización CEBI_E13Materia de Especialización CEBI_E13Técnicas de formulación y

estabilización de biomateriales

Docente a cargo: Pilar BueraColaboradores: Florencia Mazzobre, Patricio Santagapita

Desarrollo del curso

Lunes 24/10 18-20 Teórica. Aspectos básicos de las formulaciones para conservación de biomoléculas y microorganismos. Transiciones de fase y estado. Problemas 1 a 3.

Lunes 31/10 20-22 Metodología para la caracterización de las transiciones. Procesos de congelación. Problemas 4 a 6.

Martes 08/11 18-22 TP DSC; Problemas 7 a 10.

Teo: Liofilización. Problemas 11 y 12.Teo: Liofilización. Problemas 11 y 12.

Martes 15/11 18-22 Demostraciones prácticas RMN y encapsulación.

Secado por aspersión. Isotermas de sorción de agua. Problemas 13 a 18.

Lunes 21/11 18-22 Estabilidad/reacciones de deterioro. Problemas 19 a 22.

Lunes 05/12 18-20 Examen

•Aspectos básicos de las formulaciones paraconservación de biomoléculas y microorganismos.

Teórica 1.

conservación de biomoléculas y microorganismos.

•Transiciones de fase y estado.

Aspectos

Ciencia dePolímeros

Estabilidad de biomoléculas

Ciencia de Materiales

AspectosEstructuralesbiomoléculas

Aplicaciones

Medicina Biotecnología

embriones

enzimascélulas

Tecnología

Farmacia

Biología

anticuerposliposomas

hormonas

Objetivo Objetivo

obtener biomoléculas conservables a biomoléculas conservables a largo plazo, con actividad recuperable.largo plazo, con actividad recuperable.

Para ello:�deben estar inhibidas las reacciones químicas y biológicas que son responsables de la degradación.�Debe conservarse la estructura física y funcionalidad

Mapa de estabilidad y aW

Opciones:

Congelación�Congelación

�Deshidratación

Pero…Pero…Qué pasa si las biomoléculas quedan Qué pasa si las biomoléculas quedan en ambientes restringidos de agua?en ambientes restringidos de agua?

Puntos críticos:Puntos críticos:

•Membranas celulares

•Proteínas

En ambientes de humedad restringida las biomoléculas sufren estrés causado por sufren estrés causado por alteraciones en sus interacciones con el agua.agua.

La estructura y funcionalidad de biopolímeros está determinada en gran parte por su afinidad por el agua.

También el agua juega un papel decisivo en las También el agua juega un papel decisivo en las estructuras celulares.

Los cambios en el estado físico del agua provocan alteraciones con distinto grado de irreversibilidad.

-El agua y la vida: mecanismos de protección en organismos vivientes en condiciones extremas de humedad y condiciones extremas de humedad y temperatura.

Cómo se busca la solución?Cómo se busca la solución?

1. Planteando cómo resuelve la 1. Planteando cómo resuelve la naturaleza el mantenimiento de la vida naturaleza el mantenimiento de la vida en condiciones extremas? en condiciones extremas? en condiciones extremas? en condiciones extremas?

•Muy altas o muy bajas temperaturas

•Muy altas o muy bajas presiones

•Deshidratación

Los organismos que viven bajo condiciones des estrés hídrico o térmico tienen su bioquímica adaptada, o bien tienen los mecanismos que les permiten sobrevivir en estado de latencia hasta que las condiciones ambientales sean favorables:ambientales sean favorables:

Extremófilos

Criptobiotes

Anhidrobiotes

α, α -trehalosa

O

H

HO

H

HO

H

OHHH

OH

O

H

OH

H

OH

H

HO H

OH

H

O

Tardigrade 500mmTardigrade 500mm

α, α -trehalosa

Células de levadura Células de levadura 3 ~ 8mm 3 ~ 8mm

Artemia salinaArtemia salina 0.1cm 0.1cm

O

H

HO

H

HO

H

O

OHHH

OH

H

H

HO H

H OHO

OH

OH

SacarosaPlantas de la resurrecciónPlantas de la resurrección

Polen Polen

Plantas de la resurrección

Anhidrobiosis

resurrección

Ej.Selaginella lepidophylla

O

OCH2

OHOH

OH OH

OH

OH

CH2

OH

rafinosa

OCH2

OCH2OHOH

OH

OH

O

O

OCH2OH

OHOH

OH OH

OH

OH

CH2

OH

O

CH2

β -fructofuranósidosrafinosa

β-fructofuranósidos

SemillasSemillas

OH OH

sacarosa

O

O

O

CH2OH

OHOH

OHOH

OH

OHCH2OH

α,α- trehalosa

α-glucopiranósido

sacarosa

Lecciones de la Naturaleza:Lecciones de la Naturaleza:

Solutos que acumulan organismos Solutos que acumulan organismos

resistentes a la deshidrataciónresistentes a la deshidratación

� Proteínas

� Sales/aminoácidos

Contribuyen al ajuste osmótico

Estabilización de

proteínas y membranas

aminoácidos

� Azúcares

Puentes de H

Medios de alta viscosidad

Capturan radicales libres

VidVidriosrios

Protector de Protector de proteínasproteínas

Protector de Protector de proteínasproteínas

Protector de Protector de membranasmembranasProtector de Protector de membranasmembranas

w.o. T, 200Cw.o. T, 52C

Efecto de trehalosa sobre membranas biológicas- Altas T

Pereira et al. Biophys J 2004

w.o. T, 200C

+ T 1M, 200C + T 2M, 200C

Totalmentehidratado

Parcialmentedeshidratado

Deshidratadodeshidratado

Deshidratado

Totalmentehidratado

Parcialmentedeshidratado Deshidratado

Solutos protectores de biomoléculas

•Sacarosa.

•Manitol.

Lactosa.•Lactosa.

•Trehalosa.

•Sorbitol.

Propiedades estabilizantes de azúcares amorfos..

Inhibición de reacciones químicas

Medios de alta viscosidad

Vidrio

}Protección de proteínas

Protección de membranas

Capacidad de interactuar por puentes H

No cristalino (vítreo o sobreenfriado)

}

Pasos para el desarrollo de sistemas de biomoléculas estables:

• Formulación

• Operación y control de proceso

• Evaluación de la calidad

• Estimación de la estabilidad

Principales aspectos:

•Características de los comp. activos del producto(proteínas, enzimas, pigmentos, membranas, microorganismos, etc.)

•Características de componentes del medio buffers(biopolímeros, azúcares, sales, buffers)

•Proceso, equipos

•Acondicionamiento final de producto

•Estabilidad

Requerimientos:Requerimientos:

Las biomoléculas lábiles y estructuras deben ser :

• preservadas durante el proceso.

• preservadas durante su posterior almacenamiento.

• su actividad recuperable al rehidratar o descongelar.

Aspectos a considerar:

•Mecanismos involucrados

•Relación vitrificación estabilidad

Las Las transiciones de fase y estadotransiciones de fase y estado de las de las biomoléculas afectan su funcionalidad biomoléculas afectan su funcionalidad y pueden servir como índice para y pueden servir como índice para predecir estabilidadpredecir estabilidadpredecir estabilidadpredecir estabilidad

Esencialmente corresponden a:Esencialmente corresponden a:

VitrificaciónVitrificación

Transiciones entálpicasTransiciones entálpicas

VitrificaciónVitrificación

La estabilidad de muchas La estabilidad de muchas biomoléculasbiomoléculasen medios congelados o deshidratados en medios congelados o deshidratados se logra mediante la formación de se logra mediante la formación de se logra mediante la formación de se logra mediante la formación de vidrios.vidrios.

Matriz

Interacciones

Agua

Biomoléculas

Vitrificación.Vitrificación.

Los sólidos amorfos son materiales Los sólidos amorfos son materiales

��metameta--estables estables con con

��alta viscosidadalta viscosidad y y

��baja movilidad molecularbaja movilidad molecular, ,

��existen en un estado de existen en un estado de nono--equilibrioequilibrio

��Muchos cambios químicos y estructurales Muchos cambios químicos y estructurales

ocurren muy lentamente en los sistemas ocurren muy lentamente en los sistemas

vítreos, y no se perciben en marcos de vítreos, y no se perciben en marcos de

tiempo prácticos. tiempo prácticos.

vidriosvidrios

SiO2 en su estado cristalino: cuarzo

cristalcristal

Vidrio (amorfo)

Demasiado quebradizo y muy alta Tm

Vidrio común

El estudio de los El estudio de los vidriosvidrios se se realizó inicialmente en sólidos realizó inicialmente en sólidos inorgánicos, y se desarrolló en inorgánicos, y se desarrolló en ciencia de polímeros, pero ciencia de polímeros, pero sustancias como azúcares sustancias como azúcares sustancias como azúcares sustancias como azúcares pueden generar estructuras pueden generar estructuras vítreas y están ampliamente vítreas y están ampliamente relacionados con la estabilidad relacionados con la estabilidad de biomoléculas.de biomoléculas.

��El cambio en el estado físico que sufre un El cambio en el estado físico que sufre un

material material amorfo vítreoamorfo vítreo al pasar al estado de al pasar al estado de

líquido sobreenfriadolíquido sobreenfriado se conoce comose conoce como

transición vítreatransición vítrea..

��Esta transformación ocurre a cierta Esta transformación ocurre a cierta ��Esta transformación ocurre a cierta Esta transformación ocurre a cierta

temperatura,temperatura, temperatura de transición temperatura de transición

vítrea (Tvítrea (Tgg),), que depende del contenido de agua que depende del contenido de agua

y de las características de cada sistema. y de las características de cada sistema.

Los vidrios dejan de comportarse como sólidos amorfos cuando la temperaturasupera el valor de TTgg, temperatura detransición vítrea.

En este punto pierden la rigidez que los En este punto pierden la rigidez que los caracteriza y se tornan flexibles o gomosos.

En sistemas biológicos se le atribuye a este cambio efectos nocivos sobre su conservabilidad.

control Almacenada a T>Tg

Colapso estructural por Colapso estructural por almacenamiento de muestras de almacenamiento de muestras de maltosa liofilizadas a temperaturas maltosa liofilizadas a temperaturas superiores a su Tsuperiores a su Tgg..

Los diagramas temperatura/composición permiten mostrar la influencia de los solutos en las transiciones de fase del agua.

Por simplicidad solo se muestran los cambios de fase sólido/líquido, que son los que interesan en la fase sólido/líquido, que son los que interesan en la liofilización.

Hay que considerar 2 casos:

•Sistemas en equilibrioen equilibrio con formación de eutéctico.

•Sistemas que forman vidriosforman vidrios fuera del equilibrio.

Caso 1.Caso 1. Sistemas en equilibrio termodinámico que forman eutécticos. Ej.: sales, manitol

A

D

C

Tm

Tms

Reid, 2006

D

B

E La línea DBE determina la menor temperatura a la cual puede existir líquido

Tm es la temperatura de fusión/cristalización de agua pura (0°C) y Tms es la temperatura de crist/fusión de soluto puro.

A medida que se agrega agua al soluto o A medida que se agrega agua al soluto o soluto al agua, las correspondientes temperaturas de fusión disminuyen (curvas AB y CB).

La curva CB corresponde a la de solubilidad.

Al enfriar una solución inicialmente a la temperatura TT y composición CC22 , en forma lenta para permanecer en permanecer en equilibrioequilibrio, disminuye la temperatura y no hay cambio de fase, permaneciendo líquida hasta TT11 que es la temperatura de cristalización correspondiente a esa composición. Se forman los primeros cristales de hielo.

T

T1

solución

Solución

Al seguir enfriando hay menos agua en la solución, que se U

Solución

+ soluto Solución

+ hielo

solución, que se concentra. En el punto UU tenemos un mezcla de cristales de hielo y una solución de comp. C3

U

Si consideramos ahora una solución de composición CC33 a la temperatura TT, podemos ver que es necesario enfriarla hasta TT22

para que se formen los primeros cristales de hielo. En este punto la solución no congelada de CC33 será idéntica a la de CC22

enfriada hasta TT22. La diferencia entre ambas es la cantidad de hielo formado.

T

T

solución

Solución

Cuanto más Cuanto más concentrada es concentrada es T2

T

Solución

+ soluto Solución

+ hielo

concentrada es concentrada es la solución la solución inicial, menos inicial, menos cantidad de cantidad de hielo presente.hielo presente.

Reid, 2006

La realidad:La realidad:

Muchas veces el equilibrio termodinámico no se alcanza en escalas de tiempo compatibles con los experimentos, y los solutos no cristalizan, dando lugar a una cristalizan, dando lugar a una prolongación de la curva ABAB.

En cierto punto, alcanzamos una T y conc. de soluto donde la cristalización de hielo está cinéticamente impedida, y corresponde a la intersección con la curva del vidrio.

A

B

Reid, 2006

Reid, 2006

��En los procesos de deshidratación o En los procesos de deshidratación o

congelación se pueden generar sistemas congelación se pueden generar sistemas

vítreos. vítreos.

Sólidos amorfos y estado vítreo

��La fusión de sólidos cristalinos, seguido La fusión de sólidos cristalinos, seguido

por un enfriamiento rápido también por un enfriamiento rápido también

genera estructuras vítreas. genera estructuras vítreas.

Esquema de la formación de Esquema de la formación de sólidos amorfos o cristalinossólidos amorfos o cristalinos1. Durante la congelación1. Durante la congelación

aguasoluto

Congelado rápido

matriz amorfa

Congelado lento

hielo

Esquema de la formación de Esquema de la formación de sólidos amorfos o cristalinossólidos amorfos o cristalinos2. Durante la deshidratación2. Durante la deshidratación

aguasoluto

Deshidratación rápida

Deshidratación lenta

Cristales de soluto

matriz amorfa

Tem

pera

ture

4

150

100

50

0

Diagrama de estado

Tem

pera

ture

W0.25 0.5 0.75 1

2

0

-50

-100

-150

0

CompuestoCompuesto TTgg (C)(C)

TriosasTriosas

GlicerolGlicerol --9393

PentosasPentosas

RibosaRibosa --1010

XilosaXilosa --1010

ArabinosaArabinosa --22

HexosasHexosas

FructosaFructosa 1313

GlucosaGlucosa 3939

ManitolManitol 3030

Temperaturas de transición vítrea de compuestos secos.

ManitolManitol 3030

SorbitolSorbitol --33

DisacáridosDisacáridos

SacarosaSacarosa 7070

TrehalosaTrehalosa 106106

MaltosaMaltosa 8787

TrisacáridosTrisacáridos

RafinosaRafinosa 109109

MaltotriosaMaltotriosa 100100

TetrasacáridosTetrasacáridos

EstaquiosaEstaquiosa 132132

•Metodología para la caracterización de las

Teórica 2.

•Metodología para la caracterización de lastransiciones.

•Procesos de congelación.

Determinación de las temperaturas de transición de fase y estado

Propiedades térmicas

DTA

DSC

TGA

Propiedades eléctricas

Propiedades mecánicas

MS

DMA

DMTA

Propiedades espectroscópicas

RMN

IR

Raman

RSE

Propiedades eléctricas

DETA

DEA

Conductividad

Técnicas microscópicas y

análisis de imágenes

DSC Differential Scanning Calorimetry

Horno

Determinación de las Determinación de las temperaturas de transición temperaturas de transición

Sensores

Referencia

Muestra

DSC Differential Scanning Calorimetry

Flujo de calor hacia la referenciaTm TR

TC

Flujo de calorhacia la muestra

Tm = Temperatura de la muestraTR = Temperatura de la referenciaTC = Temperatura de la celda

Tm - TR = dT

TC

Sensor-vista superiorsuperior

Tanque de N2 (g)

caudalímetro

Tanque de N2 (l)

DSC

TRANSICIÓNTRANSICIÓNVíTREAVíTREA

Región vítrea Formación de

cristales

Transiciones de fase de un sólido amorfo

CalorimetríaCalorimetría diferencialdiferencial dede barridobarrido:: TermogramaTermograma típicotípico dede ununazúcarazúcar liofilizadoliofilizado (adaptado(adaptado dede Roos,Roos, 19921992))..

Región sobreenfriada

Fusión de

cristales

Temperatura/tiempo

Determinación de la Determinación de la temperatura de transición temperatura de transición

vítrea por DSCvítrea por DSC

∆cp

Τg onset

Τg midpointF

lujo

exo

térm

ico

de c

alor

Temperatura

Τg endsset

Flu

jo e

xoté

rmic

o de

cal

or

��Efecto del agua:Efecto del agua:

Variación de Variación de TTgg en función en función del contenido del contenido de agua para de agua para de agua para de agua para glucosa y glucosa y maltosa.maltosa.

�� Transición vítrea de mezclasTransición vítrea de mezclas

Además del agua, otros compuestos miscibles Además del agua, otros compuestos miscibles modifican la Tmodifican la Tgg de un dado componente de un dado componente

�� Transición vítrea de mezclasTransición vítrea de mezclas

Ecuación de Ecuación de Gordon y Taylor:Gordon y Taylor: Relaciona TRelaciona Tgg de mezclas de mezclas

binarias con la fracción en masa y la Tbinarias con la fracción en masa y la Tgg de los componentes de los componentes

individuales. individuales.

21

2211

wkw

TwkTw

gmezclaggT ⋅+

⋅⋅+⋅=TTgg mezclamezcla == TTgg observadoobservado parapara unauna mezclamezcla binariabinaria

ww11 yy ww22 == fracciónfracción enen masamasa dede loslos componentescomponentes purospuros

TTgg11 yy TTgg22 == TTgg dede loslos componentescomponentes purospuros

kk == constanteconstante (representa(representa lala fuerzafuerza dede interaccióninteracción entreentre loslos

componentescomponentes deldel sistema)sistema)..

Transiciones entálpicasTransiciones entálpicas

Agua, azúcares, lípidos Fusión Cristalización

polioles,polioles,

Almidón gelatinización retrogradación

Proteínas desnaturalización agregación

DSC Differential Scanning Calorimetry

mW

-2

0

1

2 Exot.

Deflección inicial

Area = calor involucrado

Flujo de calor (dh/dt) =

TS - TR

dU/S

-6

-4

min

C130 132 134 136 138 140 142 144

0 1 2 3 4 5 6 7

Endot.

Ejemplos. 1. Desnaturalización de proteínas

Integral -92.73 mJ normalis. -17.17 Jg^-1

Spelt

exo Vegetable Proteins (1) 13.03.1998 10:14:32

Integral -28.76 mJ normalis. -4.23 Jg^-1

Soybean

Lupines

WheatmW

2

°C50 60 70 80 90 100DEMO Version SystemeRTAMETTLER TOLEDO S

2. Gelatinización de almidón

Integral -36.31 mJ normalized -7.52 Jg^-1Peak 69.61 °C

Corn

Rice

exo Gelatinization of Starch (7) 13.03.1998 10:12:38

Wheat

Potato

Rice

mW

2

°C40 50 60 70 80DEMO Version SystemeRTAMETTLER TOLEDO S

3. Fusión/crist. de lípidos

Diagrama de estado de semillas de nim (neem o lila india)

Sacandé y col., 2002

Técnicas complementarias:Técnicas complementarias:Microscopía Microscopía

Microestructura de Microestructura de sistemas amorfossistemas amorfos

Heating and Freezing stage

Videocamera

Platina térmica

50µm

AUTO SEQUENTIAL SWITCHING UNIT

Temperaturecontrol system

N tank2Optical microscope

Clausse, 2006Clausse, 2006

Platina térmica Sistema de control de temperatura

Tanque de N2 L

-100

0

100

200

300H

eat f

low

(m

W)

Exo

ther

mic

+20°C

Fre

ezin

g

-17°C-20°C

Unfrozenwater

Ice

� �

Termogramas de agua (DSC)

-300

-200

-100

-60 -40 -20 0 20 40Temperature (°C)

Hea

t flo

w (

mW

)

En

do

ther

mic

Icemelting

-1°C +4°C

Clausse, 2006Clausse, 2006

masa = 28 mg; energía de congelación: 66.06 Cal/g ; energía de fusión: 78.45 Cal/g

Micrografías de soluciones de NaCl (180x)

Clausse, 2006Clausse, 2006

Rayos X

Para analizar cristalinidad o amorficidad

Técnicas complementarias:Técnicas complementarias:

Todos los solutos forman vidrios?

Dulcitol

(galacti-tol)

Sorbitol

Manitol

solución cristal solución cristal

cc

vv

cc

No deben modificar su conformación al cristalizar

Iditol

Maltitol

Conformaciones moleculares de polioles

vv

vv

Manitol y dulcitol, que tienen mayor tendencia a cristalizar, tienen mayores

temperaturas de fusión y mayores ∆Hf

0

20

40

60

80

Tem

pera

ture

(

°C) Tm

Ts

solution

Maximum

100

120

G

B

A

D

F

Vitrificación Vitrificación por por

-140

-120

-100

-80

-60

-40

-20

0 0.2 0.4 60 80 100

Solid mass fraction (%)

Tem

pera

ture

(

Tg cg'

ice+glass

glass

Tg'

V

Maximum ice crystallization rate

ice + freeze-concentrated solutionC

BE

ce

por por congelación congelación rápida o rápida o secadosecado

�� Cuando el agua se encuentra formando parte de una Cuando el agua se encuentra formando parte de una mezcla binaria con un soluto es importante mezcla binaria con un soluto es importante determinar cuáles son las fases presentes en función determinar cuáles son las fases presentes en función de la composición, temperatura o de la presión.de la composición, temperatura o de la presión.

�� Además de las condiciones de equilibrio que Además de las condiciones de equilibrio que proveen los diagramas de fase, los proveen los diagramas de fase, los diagramas de diagramas de

Diagramas de estado suplementadosDiagramas de estado suplementados

proveen los diagramas de fase, los proveen los diagramas de fase, los diagramas de diagramas de estado suplementadosestado suplementados incorporan la curva de incorporan la curva de temperatura de transición vítrea. Proveen temperatura de transición vítrea. Proveen información acerca de condiciones de no equilibrio y información acerca de condiciones de no equilibrio y estados de equilibrio metaestable y, por lo tanto, estados de equilibrio metaestable y, por lo tanto, incluyen la noción de tiempo completando así la incluyen la noción de tiempo completando así la información de los diagramas de fase. información de los diagramas de fase.

Estos diagramas son especialmente Estos diagramas son especialmente útiles para analizar la estabilidad en útiles para analizar la estabilidad en sistemas congelados, deshidratados o sistemas congelados, deshidratados o parcialmente deshidratados que no parcialmente deshidratados que no corresponden a estados de equilibrio corresponden a estados de equilibrio termodinámico.termodinámico.termodinámico.termodinámico.

Diagrama de estado suplementado para Diagrama de estado suplementado para un sistema binario.un sistema binario.

Líquido sobreenfriado

Solución

Hielo + solución

Tem

pera

tura

, °C

Concentración de soluto, %

•• Temperatura de transisición vítrea (TTemperatura de transisición vítrea (Tgg) ) •• Fusión de hielo (TFusión de hielo (Tmm) ) •• Solubilidad (TSolubilidad (Tmm

ss))

Dichas curvas definen regiones Dichas curvas definen regiones de estabilidad variable. de estabilidad variable.

(adaptado de Fennema, 1996).(adaptado de Fennema, 1996).

Hielo + líq. sobreenfriado Vidrio

Tem

pera

tura

,

��RegiónRegión comprendidacomprendida entreentre TTmm (equilibrio)(equilibrio) yy TTgg::

ElEl sistemasistema sese encuentra,encuentra, concon rarasraras excepciones,excepciones, enen

unun estadoestado dede nono equlilibrioequlilibrio.. LaLa curvacurva TTmm definedefine laslas

condicionescondiciones dondedonde elel solventesolvente (agua)(agua) puedepuede

cristalizarcristalizar.. SiSi lala concentraciónconcentración dede solutosoluto superasupera lalacristalizarcristalizar.. SiSi lala concentraciónconcentración dede solutosoluto superasupera lala

concentraciónconcentración definidadefinida porpor elel puntopunto eutécticoeutéctico enen elel

diagramadiagrama dede fases,fases, puedepuede formarseformarse unun sólidosólido

eutécticoeutéctico (soluto(soluto yy solvente)solvente) oo bienbien elel solventesolvente

continúacontinúa cristalizandocristalizando enen unauna soluciónsolución

sobresaturadasobresaturada.. LaLa primeraprimera situaciónsituación ocurreocurre concon laslas

salessales mientrasmientras queque lala segundasegunda ocurreocurre comúnmentecomúnmente

concon azúcares,azúcares, polímerospolímeros yy compcomp.. polioxhidrílicospolioxhidrílicos..

ZonaZona metaestablemetaestable dondedonde puedepuede ocurrirocurrircristalizacióncristalización dede solutossolutos.. EnEn condicionescondiciones dedetemperaturatemperatura yy concentraciónconcentración cercanascercanas aa lala curvacurvadede solubilidad,solubilidad, lala velocidadvelocidad dede cristalizacióncristalizaciónaumentaaumenta concon lala sobresaturaciónsobresaturación.. SinSin embargo,embargo,cuandocuando elel sistemasistema sese acercaacerca aa lala curvacurva dede TTgg,, yayaseasea porpor concentraciónconcentración oo congelación,congelación, lala

RegiónRegión comprendidacomprendida entreentre laslascurvascurvas TmTmss yy TTgg::

seasea porpor concentraciónconcentración oo congelación,congelación, lalaviscosidadviscosidad aumentaaumenta drásticamentedrásticamente yy lala velocidadvelocidaddede cristalizacióncristalización disminuyedisminuye debidodebido aa limitacioneslimitacionesdifusionalesdifusionales.. AA TTgg,, laslas restriccionesrestricciones enen lalamovilidadmovilidad molecularmolecular deldel sistemasistema sonson talestales quequeimpidenimpiden lala cristalizacióncristalización enen escalasescalas dede tiempotiemporazonablesrazonables.. CabeCabe remarcarremarcar queque ésteéste eses unun estadoestadodinámicodinámico (restringido(restringido cinéticamente)cinéticamente) yy nono ununestadoestado dede equilibrioequilibrio..

�� RegiónRegión comprendidacomprendida debajodebajo dede lala curvacurva dede TTgg::

SiSi elel materialmaterial adquirióadquirió elel estadoestado vítreo,vítreo, enen

general,general, laslas reaccionesreacciones oo procesosprocesos queque dependendependen

dede lala transferenciatransferencia dede masamasa oo dede lala difusióndifusióndede lala transferenciatransferencia dede masamasa oo dede lala difusióndifusión

estánestán restringidosrestringidos yy sonson muymuy lentoslentos..

LaLa cristalización,cristalización, porpor ejej..,, nono ocurreocurre enen unauna

escalaescala dede tiempotiempo prácticapráctica..

NoNo eses unauna condicióncondición dede equilibrioequilibrio sinosino unun estadoestado

metaestablemetaestable..

CongelaciónCongelación

Efecto de la Efecto de la Efecto de la Efecto de la velocidad de velocidad de enfriamientoenfriamiento

Control de la cristalización.

Variables extrínsecas

1. Velocidad de cristalización

2. Temperatura mínima alcanzada

Control de la cristalización:

Variables intrínsecas (Composición)

a) Presencia de agentes nucleantes:

Ejs. IAg; bacterias.Ejs. IAg; bacterias.

b) Modificación del crecimiento de los cristales de hielo:

Péptidos anticongelantes (en realidad inhiben el crecimiento de los cristales): peces antárticos.

Presencia de biopolímeros: gomas

Presencia de sales

La fuerza impulsora para los procesos de cristalización es la diferencia en potencial químico entre la fase solución y el sólido cristalino.

Puede expresarse como la diferencia de concentración respecto a la de saturación, o como la diferencia de temperatura entre el sistema que cristaliza y su punto de fusión.

Formación de hielo: La línea que se extiende desdeel punto eutéctico (TE) a Tg’, representa condicionesde no equilibrio. Si el sistema se almacena a:

CongelaciónFormas de congelación y cantidad de

hielo formado

de no equilibrio. Si el sistema se almacena a:

T > TE ⇒ fusión del hielo

T < Tg’ ⇒ sistema altamente viscoso, movilidadmolecular muy reducida, limitaciones difusionalesque impiden la cristalización de agua.

Máxima formación de hielo ⇒ congelación lenta a temperaturas entre TE y Tg’.

Formación de hielo en soluciones 60% de azúcares.Formación de hielo en soluciones 60% de azúcares.

(A)(A)Enfriamiento previo a Enfriamiento previo a --100100°°C a 30C a 30°°C/min. Se observa C/min. Se observa formación de hielo al calentar (5formación de hielo al calentar (5°°C/min) por encima de Tg.C/min) por encima de Tg.

(B)(B) Enfriamiento a Enfriamiento a --100100°°C, mantenimiento 15 min a C, mantenimiento 15 min a --4848°°C, reC, re--enfriamiento a enfriamiento a --100100°°C, para máxima formación de hielo.C, para máxima formación de hielo.

Cambios inducidos en las biomoléculaspor la congelaciónpor la congelación

Estrés Respuesta celular

Reducción de T Cambios de fase de lípidos de membrana

Aumento de la conc. de soluto

Encogimiento osmótico

Aumento de fza iónica. Efectos directos en membranas, solubilización de proteínas de membrana

Deshidratación Desestabilización de bicapas lipídicas

Precipitación de sales y formación de eutécticos

variable

Formation de burbujas de gas

Daño mecánico a membranas/citoesqueleto

Aumento de viscosidad Los procesos difusivos (ósmosis) se limitan

Cambios de pH Desnaturalización de proteínas etc.

Las células se comprimen

Daños en membranas

Efecto de distintos crioprotectores en la estabilidad de LDH en congelado/descongelado

Comparación daño por cong./descong (tramado) con liofilizado (sólido). PFK con aditivos 0,5M

Velocidades de congelación:

Lenta: ≤ 1 °C/min

Rápida ≥ 100°C/minRápida ≥ 100°C/min

La temperatura crítica que usualmente tiene efacto sobre la supervivencia de organismos vivientes es -40°C.

Los procedimientos desarrollados para la preservación de organismos por congelación o secado son aún altamente empíricos.

La presencia de cierto contenido de agua y el La presencia de cierto contenido de agua y el mantenimiento de un rango de temperaturas es un requerimiento para organismos vivientes.

Cuando a dos tipos de células distintas se aplica la misma velocidad de congelación, se obtienen diferentes niveles de congelación intracelular.

En células de levadura permanece una En células de levadura permanece una significativa cantidad de agua a velocidades > 10°C/min.

En glóbulos rojos, un aumento similar de agau remanente en las células se observa cuando la velocidad es > 1000°C/min.

Consecuencias de la congelación de sistemas biológicos.

Consecuencias de la congelación de sistemas biológicos.

La supervivencia de células de Saccharomyces cerevisiae luego de congelar y descongelar es máxima para una velocidad de congelación de 1 a 10°C/min.1 a 10°C/min.

La existencia de este óptimo se debe a dos fenómenos:

Efectos mecánicos

Efectos de los solutos

Efectos mecánicos

Congelación extracelular

•Cuando una suspensión de células se somete a enfriamiento lento, la cristalización de hielo comienza en el medio externo y su interior se comienza en el medio externo y su interior se mantiene en estado sobre-enfriado hasta ~ -10°C.

•En ese rango de T el agua sobre-enfriada tiene mayor presión de vapor que el hielo, y el agua intracelular se expele, causando deshidratación progresiva de las células.

Efectos mecánicos

•El agua que sale de las células congela en el exterior al encontrarse con cristales ya formados.

•Si el enfriamiento es lento, el sistema se equilibra con la expulsión de agua y las células se equilibra con la expulsión de agua y las células se encogen por pérdida de agua intracelular, cuya concentración de solutos aumenta.

•

aguahielo

Causa de daño por congelación intracelular

hielo hielo

Cell

waterExtracell.

ice

Sistemas congelados Sistemas congelados

Mecánicos

Químicos

Cambios de pH

Aumento de fuerza

Daño por congelación intracelular

ice iceice iceSupercooled cytoplasm

Dependientes de la velocidad

Aumento de fuerza iónmica.

Efectos mecánicos

Congelación intracelular

•De un enfriamiento rápido, resulta cristalización intracelular, como resultado de la nucleación con hielo que proviene del exterior a través de ductos en las membranas.

•A su vez, si el enfriamiento es muy rápido, los cristales son pequeños y si es ultra-rápido ocurre vitrificación.

•Si se debe evitar el crecimiento de cristales, el descongelado debe ser muy rápido también.

Efectos mecánicos

•El enfriamiento muy rápido lleva a alta supervivencia, si está seguido de un descongelado rápido.

•Pero si el descongelado no puede ser lo •Pero si el descongelado no puede ser lo suficientemente rápido, es mejor congelar más lentamente ya que la deshidratación de las células limita el desarrollo de cristales intracelulares.

•La velocidad de congelación que causa congelaciónintra y extracelular depende de la velocidad de movimiento del agua de adentro hacia afuera.

•Las condiciones de congelación que provocancristalización intracelular causan disminución de viabilidad.

Tanto plantas como animales tienen mecanismos para evitar la cristalización de hielo.

Los tres principales mecanismos son:

Sistemas congelados

Los tres principales mecanismos son:

•Formación de vidrios.

•Cristalización extracelular.

•Proteínas anticongelantes.

Congelaciónlenta

Congelaciónrápida

Can

tidad

de

hiel

o fo

rmad

o, %

Congelación rápidaCongelación rápida (ej. con nitrógeno líquido): (ej. con nitrógeno líquido): Previene la cristalización de hielo y por lo tanto se Previene la cristalización de hielo y por lo tanto se obtiene un sistema amorfo con un valor de Tobtiene un sistema amorfo con un valor de Tgg

(menor que T(menor que Tgg’) que será dependiente de la cantidad ’) que será dependiente de la cantidad de agua asociada a la fase amorfade agua asociada a la fase amorfa..

Congelación lenta:Congelación lenta: Favorece la formación de hielo, Favorece la formación de hielo, que será máxima a Tque será máxima a Tgg’ < T’ < T<< TTE, E,

Tiempo

Can

tidad

de

hiel

o fo

rmad

o, %

CCgg’, T’, Tgg’:’:

Punto en el diagrama de estado definido por la Punto en el diagrama de estado definido por la intersección de las curvas de fusión y de Tintersección de las curvas de fusión y de Tgg. . Corresponde a una concentración de Corresponde a una concentración de soluto/temperatura a la cual la cristalización de soluto/temperatura a la cual la cristalización de agua está inhibida cinéticamente.agua está inhibida cinéticamente.

CrioconcentraciónCrioconcentración

CCgg’ ’ es la concentración correspondiente a la matriz es la concentración correspondiente a la matriz máximamente concentrada por formación de máximamente concentrada por formación de hielo: a Chielo: a Cgg’ se alcanza la mínima cantidad de agua ’ se alcanza la mínima cantidad de agua asociada a la fase amorfa que se puede alcanzar asociada a la fase amorfa que se puede alcanzar por crioconcentración. por crioconcentración.

TTgg’ ’ es la temperatura de transición vítrea es la temperatura de transición vítrea correspondiente a esa matriz. correspondiente a esa matriz.

Caraterísticas de TCaraterísticas de Tgg’ :’ :

•• El valor es independiente de la concentración El valor es independiente de la concentración inicial, sólo depende de la composición o tipo de inicial, sólo depende de la composición o tipo de soluto. Por lo tanto, cada sistema tendrá su soluto. Por lo tanto, cada sistema tendrá su diagrama de estado característico que diferirá diagrama de estado característico que diferirá cuantitativamente pero no cualitativamente del cuantitativamente pero no cualitativamente del diagrama mostrado en la Figura anterior. diagrama mostrado en la Figura anterior.

•• Se determina generalmente por DSC a partir de Se determina generalmente por DSC a partir de soluciones que fueron almacenadas en soluciones que fueron almacenadas en condiciones de máxima formación de hielo. condiciones de máxima formación de hielo.

•• Conocer el valor de TConocer el valor de Tgg’ es importante para ’ es importante para evaluar la estabilidad de productos congelados (los evaluar la estabilidad de productos congelados (los cuales a Tcuales a Tgg’ son estables a la cristalización de ’ son estables a la cristalización de agua por largos períodos de tiempo). agua por largos períodos de tiempo).

CompuestoCompuesto T’T’gg ((°°C)C)

PentosasPentosas

RibosaRibosa --4848

XilosaXilosa --4747

HexosasHexosas

FructosaFructosa --4242

GlucosaGlucosa --4343

ManitolManitol --4040

Temperaturas de transición vítrea de carbohidratos máximamente concentrados. DisacáridosDisacáridos

SacarosaSacarosa --3232

TrehalosaTrehalosa --3030

LactosaLactosa --2828

TrisacáridosTrisacáridos

RafinosaRafinosa --2626

TetrasacáridosTetrasacáridos

EstaquiosaEstaquiosa --2424

MaltohexaosaMaltohexaosa --1515

CiclodextrinaCiclodextrina --99

concentrados.

• Gráfico ∆H de fusión vs. Cont. de agua.

Extrapolando hasta ∆H =0 se obtiene el cont. de agua de la matriz concentrada.

Determinación de la matriz máximamente concentrada (Tg’/cg’)

• A partir de los termogramas, disminuyendo el contenido de agua hasta que no aparezca agua congelable.

• Luego de efectuar una serie de templados, determinando la Tg de la matriz concnetrada y calculando su contenido de agua por Gordon y Taylor.

Muchas sales forman soluciones sobresaturadas durante el enfriamiento y eventualmente vitrifican. Durante la descongelación muestran una transición vítrea y luego cristalización del eutéctico.

Las soluciones binariasbinarias agua-sal tienden a Las soluciones binariasbinarias agua-sal tienden a formar eutécticos pero las mezclas ternariasmezclas ternarias de dos sales (por ej., mezcla de fosfatos) y agua generalmente vitrifican.

La formación de eutécticos parciales puede estar entonces acompañada de importantes cambios de pH.

Formación de vidrio y separación de fases eutéctica en soluciones de sal

Sal Sal TTgg’ T’ Tee

NaCl.2H2O <-60 -21.7

NaHCO3 -52 -4

Tris base -55 -4

Glicina -70 -4Glicina -70 -4

β-Ala -65 -14

CaCl2 -95 -52

NaCit -41 --

KCit -62 --

NaAc -64 --

KAc -76 --

Influencia de la velocidad de congelación sobre la Influencia de la velocidad de congelación sobre la morfología de los cristales en la muestra congeladamorfología de los cristales en la muestra congelada

LentoLento RápidoRápido

hielohieloSólidos en la matriz no Sólidos en la matriz no congeladacongelada

Posibles estrategias para evitar daños por hielo.

1.Vitrificación (N líquido o solutos agregados)1.Vitrificación (N líquido o solutos agregados)

2. Aumento de la velocidad de nucleación extracelular INAsINAs

3. Inhibición del crecimiento de cristales AFPAFP

Son lipoproteínas de cerca de 30 kD que reducen el grado de sobreenfriamiento.

Ice nucleating Agents Ice nucleating Agents (INAs)(INAs)

Proveen estructuras parecidas al hielo que sirven de molde.

Colorado potato beetle

Termogramas de agua pura y agua con agentes nucleantes (AgI o bacterias).

Ice nucleating bacteria from insects (Pseudomona syringae and Erwinia herbicola)

Muchos sistemas biológicos promueven nucleación heterogénea por medio de agentes nucleantes de hielo (INAs). Estos agentes nuclean hielo entre las células. Pueden reducir el sobreenfriamiento hasta 1°C.

Agentes nucleantes de hielo

Pueden reducir el sobreenfriamiento hasta 1°C.

INAs adaptativos: son generalmente proteínas con PM hasta 30000. Los aminoácidos se encuentran ordenados de tal forma que forman un molde para el hielo. Se forma una capa de hielo en la superficie de los INAs. Sin embargo, esto no llevará al crecimiento de cristales si no alcanzan un tamaño mayor que r*

Proteinas anticongelantes AFP

En condiciones de baja temperatura muchas plantas producen crioprotectores muchas plantas producen crioprotectores coligativos, como prolina o sacarosa.

En otras, ocurren cambios en proteínas y lípidos de membranas.

Unas pocas plantas son capaces de producir AFP que las protegen de los efectos negativos de la congelación.

AFPAFP

Se identificaron en peces antárticos pero luego se encontraron en microorganismos, insectos, microorganismos, insectos, plantas y nematodos.

(2,600 - 33,000 Daltons)

Actúan evitando el crecimiento de los cristales de hielo (bajo efecto sobre propiedades coligativas).

Antarctic Notothenoid

Mecanismo

Las AFP inhiben el crecimiento de hielo por adsorción-inhibición. Se adsorben específicamente a los planos de crecimiento de hielo evitando la de crecimiento de hielo evitando la propagación. Se comportan como “agentes inhibidores de hielo estructurales”

Hexagonal ice grown Hexagonal ice grown in aqueous solution

(flat disc)

Ice crystal grown in AFP solution

(bipyramidal)

ice-binding site

Type III antifreeze protein (AFP) linked through its N-terminus to the C-terminus of green fluorescence protein (GFP).

Pertaya et al., 2007

AFPAFP--GFP on the surface of ice crystalsGFP on the surface of ice crystals

Pertaya et al., 2007

J Phys: Cond Matter

INAs Sobre-enfriamiento Tn

Tiempo de congelación

Caracterización de los efectos

Costos de energía

Tamaño de los cristales

Caracterización de los efectos

AFPs Sobre-enfriamiento

temperatura de congelación

Inhiben crecimiento de los cristales, modifican la morfología del hielo

Tamaño de los cristales,

Rate

INAS

Overall crystallization

Rate

TemperatureTgTm

Rate

AFPOverall crystallization

Rate

TemperatureTgTm

Rate

AFPINAS

Overall crystallization

Rate

TemperatureTgTm

Tem

pera

ture

4

150

100

50

Control cinético de la cristalización de solutos

y agua

Tem

pera

ture

W0.25 0.5 0.75 1

2

0

-50

-100

-150

0

Modificación de los diagramas de estado por cambios en la formulación