-
ESTRATEGIAS PARA MODIFICAR PROTENAS
Protenas de uso industrial
-
Modificaciones de protenas de uso industrial
-Estabilidad
-Solubilidad
-Propiedades catalticasSelectividad de sustratoInhibicin
sustrato/producto
Modificaciones de protenas
ADN
-
Estrategias
Mutagnesis al azar (evolucin directa):-clulas
hipermutadoras-mutgenos qumicos o fsicos-PCR en condiciones
propensas a cometer errores-DNA shuflling
Mutagnesis dirigida (diseo racional):-PCR-Sitio dirigida
Mutagnesis al azar: clulas hipermutadoras
-
Escherichia coli XL1-Red: tasa de mutacin 5.000 veces mayormutD
(3 exonucleasa, subunidad proffreading)mutS (reparacin de errores
replicativos)mutT (hidrlisis de 8-oxodGTP)
Mutagnesis al azar: clulas hipermutadoras
Mutagnesis al azar: clulas hipermutadoras
-
Mutagnesis al azar: clulas hipermutadoras
Target de mutacin: opern de metabolizacin de
prolina
Screening:E. coli CSH (proBA) auxtrofa de prolina en medio con
prolina como fuente de carbono
Mutagnesis al azar: mutgenos qumicos o fsicos
Incorporan al ADN por replicacin: anlogos de bases
Reaccionan con el ADN
-
Mutagnesis al azar: mutgenos qumicos o fsicos
in vitro in vivo
Tratamiento con mutgeno:-difunde dentro de la clula-Modificacin
que inactiva o activa
Mutagnesis al azar: error prone PCR
Imbalance del pool de nucletidosIncluir anlodos de
nucletidosCambiar las concentraciones de los cationes
divalentes
-
Comparacin tcnicas de mutagnesis al azar
1-Taq Pol, [dCTP, dTTP], [Mg2+], [Mn2+]
2- Taq Pol, oxo-dGTP o dPTP
3- Mutazyme: mezcla de ADN polimerasas propensas a cometer
errores
Screening:Inactivacin de LacZ (prdida de actividad
galactosida
NH2OH-HCL: Hidroxilamina in vitro
hidroxila C en dsDNA: aparea con A generando GCAT
Comparacin tcnicas de mutagnesis al azar
Cada tcnica produce distintos espectro de mutaciones:
-
Mutagnesis al azar: DNA shuffling
Mutagnesis al azar: DNA shuffling
-
Mutagnesis al azar: DNA shuffling
1. PCR mutagnico de GroEL-GroES
2. DNA shuffling
3. Screening visual:Plegamiento correcto de GFP in vivo. GFP se
pliega incorrectamente cuando se sobreexpresa en E. coli. GroEL/S
asiste un correcto plegamiento.
Mutagnesis al azar: DNA shuffling
GroES
GroEL
-
Mutagnesis al azar vs dirigida
Sin datos de la secuencia,
estructura y funcin
Se muta el gen completo
Mutaciones silenciosas (sin
efecto), que inactivan
protenas o beneficiosas
Screening eficiente
Previo conocimiento de la secuencia, estructura o funcin
Se muta aminocidos particulares
No hace falta hacer screening de libreras
Mutagnesis dirigida: modificacin basada en secuencia
Alineamiento de secuencias: residuos conservados importantes
para la funcin
-
Estructura: RMN o Rayos X o Modelado molecular (anlisis del
efecto de la modificacin)
Mutagnesis dirigida: modificacin basada en estructura
HotSpot Wizard server y 3DM database: combinan datos de bancos
de secuencias y estructura junto con datos funcionales.
Mutagnesis dirigida: modificacin basada en secuencia
-
Mutagnesis dirigida: PCR
Mutagnesis dirigida: PCR
2 reacciones de PCR independientes (2 set de primers)
Purificar y mezclar los 2 productos de PCR
Desnaturalizar/renaturalizar
Extension 3 y PCR utilizando los primer externos conTaq
Polimerasa
-
Mutagnesis dirigida: PCR
Mutagnesis dirigida: sito dirigida
