0EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Y ANTIFNGICA DELACEITE ESENCIAL DE ORGANO SILVESTRE (Lippia origanoides Kunth)

DEL ALTO PATA

DIANA PANTOJA DAZALORENA SANTACRUZ CHAZATAR.

UNIVERSIDAD DE NARIOFACULTAD DE INGENIERIA AGROINDUSTRIALPROGRAMA DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

SAN JUAN DE PASTO2011

1EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Y ANTIFNGICA DELACEITE ESENCIAL DE ORGANO SILVESTRE (Lippia origanoides Kunth)

DEL ALTO PATA

DIANA PANTOJA DAZALORENA SANTACRUZ CHAZATAR.

Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al ttulo deIngeniero Agroindustrial.

Director: Ing. Oscar Arango Bedoya. Msc.Codirector: Dr. Andrs Hurtado Benavides.

UNIVERSIDAD DE NARIOFACULTAD DE INGENIERIA AGROINDUSTRIALPROGRAMA DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

SAN JUAN DE PASTO2011

2NOTA DE ACEPTACION

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

__________________________________Dr. Andrs Hurtado Benavides.

__________________________________Dr. Claudia Salazar Gonzalez.

__________________________________Dr. Oswaldo Osorio Mora.

San Juan de Pasto, 10 de Diciembre de 2010.

3Dedicatoria

A Dios, por darme las fuerzas necesarias para luchar da tras da, por llenar mi vidasiempre de mil bendiciones y guiar mi camino, a la virgencita por ser mi compaeraincondicional.

A mis papitos, Campo y Cristina no tengo palabras para agradecerles todo los que hanhecho por m, al igual que a mi hermana Diana que es mi ejemplo a seguir LOSAMO!!!!

Al resto de mi familia que siempre me han apoyado y confiado en mi.

A Diana agradecerle por todos los momentos que hemos pasado juntas y nos han hechoconsolidar una amistad que espero que dure para siempre.

Lorena Santacruz Chazatar

Al Seor Creador del cielo y de la tierra, a Jesucristo mi Salvador y al Espritu Santo miConsolador, que son uno y me han permitido ser uno con ellos: Gracias, muchas graciaspor la obra que haces en mi vida, por ser mi Padre, mi maestro, mi hemano; te amoprofundamente y quiero amarte ms como T lo mereces. Seor, Dios mo, en ti heconfiado, por tu gracia he llegado hasta aqu y contigo han sern todos mis das comolo han sido hasta hoy. Cuan hermoso eres Seor!Gracias Seor, por todas las personas que has puesto para mi bendicin como muestrade tu amor; por mis padres, Carlos y Fabiola, Jaime mi mejor amigo, mi compaera yamiga Lorena, y la gran familia en Cristo que me has entregado; pido que los guardes,protejas y bendigas sus vidas en abundancia.

Al nico y sabio Dios, sea gloriamediante Jesucristo para siempre.

Amn. Rom. 16.27.

Diana Pantoja Daza.

4AGRADECIMIENTOS

De manera muy sincera queremos expresar nuestros agradecimientos al profesorOscar Arango por su dedicacin y apoyo en la direccin de esta investigacin.

Al profesor Andrs Hurtado por su oportuna colaboracin.

A nuestros jurados Oswaldo Osorio y Claudia Salazar por sus recomendaciones yopiniones en el desarrollo del trabajo.

Al grupo de investigacin Tecnologa Emergentes en Agroindustria (TEA) pordarnos la oportunidad de realizar esta investigacin.

Al personal de los laboratorios y planta pilot de la Universidad de Nario, por suayuda, apoyo, y consejos. Un especial agradecimiento a Alexander Pantoja por suincondicional ayuda.

5TABLA DE CONTENIDO

pg.

INTRODUCCIN 19

1. DESCRIPCIN DEL PROBLEMA 21

2. JUSTIFICACIN 23

3. OBJETIVOS 25

3.1 OBJETIVO GENERAL 253.2 OBJETIVOS ESPECFICOS 25

4. MARCO TERICO Y ESTADO DEL ARTE 26

4.1 El organo 264.1.1 Caractersticas Generales 264.1.2 Taxonoma de Lippia origanoides Kunth 264.1.3 Produccin Nacional e Internacional de organo 264.1.4 Composicin y usos potenciales 27

4.2 Mtodos de determinacin de la actividad antioxidante 294.2.1 Mtodos de captura de radicales 29

4.3 La actividad antioxidante en aceites esenciales 31

4.4 Mtodos de determinacin de la actividad antifngica 34

4.5 La actividad antimicrobiana de los aceites esenciales 35

4.6 Fitopatgeno Phytophthora infestans 374.6.1 Taxonoma y clasificacin de Phytophthora infestans 37

5. DISEO METODOLGICO 40

5.1 Material vegetal 40

65.2 Proceso de extraccin 41

5.3 Evaluacin de la actividad antioxidante 415.3.1 Ensayo de DPPH 415.3.2 Ensayo del ABTS+ 43

5.4 Evaluacin actividad antimicrobiana 445.4.1 Obtencin del patgeno 445.4.2 Preparacin del medio de cultivo 445.4.3 Inoculacin en el medio de cultivo 455.4.4 Incubacin del microorganismo 45

5.5 Diseo experimental 45

5.6 Anlisis estadstico 47

6. RESULTADOS Y DISCUSIN 48

6.1 Extraccin del Aceite 486.1.1 Anlisis cromatogrfico 48

6.2 Evaluacin de la actividad antioxidante 526.2.1 Ensayo DPPH 526.2.1.1 Ensayo DPPH con aceite esencial de organo Lippia origanoidesKunth 52

6.2.1.2 Evaluacin de la capacidad de captura radical DPPH de losantioxidantes convencionales cido ascrbico, BHT y BHA y comparacincon la del aceite esencial Lippia origanoides Kunth

62

6.2.1.2.1 Ensayo de DPPH con cido ascrbico 626.2.1.2.2 Ensayo de DPPH con BHT 656.2.1.2.3 Ensayo de DPPH con BHA 686.2.2 Ensayo ABTS+ 756.2.2.1 Ensayo de ABTS+ con aceite esencial de organo Lippiaoriganoides Kunth 77

6.2.2.2 Evaluacin de la capacidad de captura radical ABTS+ de losantioxidantes convencionales cido ascrbico, BHT y BHA y comparacincon la del aceite esencial Lippia origanoides Kunth

84

6.2.2.2.1 Ensayo de ABTS+ con cido ascrbico 846.2.2.2.2 Ensayo de ABTS+ con BHT 886.2.2.2.3 Ensayo de ABTS+ con BHA 91

6.3 Evaluacin de la capacidad antimicrobiana del aceite de organo 99

77. CONCLUSIONES 106

8. RECOMENDACIONES 107

BIBLIOGRAFA 108

ANEXOS 118

8LISTA DE CUADROS

pg.

Cuadro 1 Tratamientos evaluados para la determinacin de actividadantifngica 46

Cuadro 2 Escala de sensibilidad propuesta por Shattock 47

Cuadro 3 Condiciones de extraccin del aceite esencial de organo yrendimiento obtenido 48

Cuadro 4 Composicin del aceite esencial de organo (Lippiaoriganoides Kunth) extrado por arrastre con vapor 49

Cuadro 5 Valores de absorbancia para diferentes concentraciones deDPPH 53

Cuadro 6 Porcentaje de DPPH remanente a diferentesconcentraciones de aceite esencial de organo 55

Cuadro 7 Porcentaje de inhibicin a diferentes concentraciones deaceite esencial de organo en el tiempo estacionario 58

Cuadro 8 Segunda prueba porcentaje de DPPH remanente adiferentes concentraciones de aceite esencial de organo 60

Cuadro 9 Segunda prueba porcentaje de Inhibicin a diferentesconcentraciones de aceite esencial de organo en el tiempoestacionario 61

Cuadro 10 Porcentaje de DPPH remanente a diferentesconcentraciones de cido ascrbico 63

Cuadro 11 Porcentaje de inhibicin a diferentes concentraciones decido ascrbico en el tiempo estacionario 64

Cuadro 12 Porcentaje de DPPH remanente a diferentesconcentraciones de BHT 66

Cuadro 13 Porcentaje de Inhibicin para diferentes concentraciones deBHT 67

9Cuadro 14 Porcentaje de DPPH remanente a diferentesconcentraciones BHA 68

Cuadro 15 Porcentaje de Inhibicin a diferentes concentraciones deBHA 70

Cuadro 16 Comparacin de la actividad antioxidante del aceite deorgano frente al cido ascrbico, BHT y BHA 70

Cuadro 17 Comparacin de la actividad antioxidante del aceiteesencial de organo frente a otros antioxidantes convencionales 72

Cuadro 18 Resultados de la prueba ABTS+ con patrones de Trolox 76

Cuadro 19 Prueba de ABTS+ para el aceite de organo (minuto 1 dereaccin) 77

Cuadro 20 Porcentaje de inhibicin de ABTS+ con aceite de organo(minuto 1 de reaccin) 78

Cuadro 21 Prueba de ABTS+ para el aceite de organo (minuto 7 dereaccin). 79

Cuadro 22 Porcentaje de inhibicin del radical ABTS+ con diferentesconcentraciones de aceite de organo (minuto 7 de la reaccin) 80

Cuadro 23 Segunda prueba de ABTS+ para el aceite de organo(minuto 1 de reaccin) 81

Cuadro 24 Segunda prueba porcentaje de inhibicin de ABTS+ conaceite de organo (minuto 1de reaccin) 82

Cuadro 25 Segunda prueba de ABTS+ para el aceite de organo(minuto 7 de reaccin) 83

Cuadro 26 Porcentaje de inhibicin de ABTS+ con aceite de organo(minuto 7 de reaccin) 83

Cuadro 27 Ensayo de ABTS+ con cido ascrbico (minuto 1dereaccin) 85

Cuadro 28 Porcentaje de inhibicin de ABTS+ con cido ascrbico(minuto 1 de reaccin) 85

Cuadro 29 Ensayo de ABTS+ con cido ascrbico (minuto 7 dereaccin) 86

10

Cuadro 30 Porcentaje de inhibicin de ABTS+ con cido ascrbico(minuto 7 de reaccin) 87

Cuadro 31 Comparacin de resultados TEAC 88

Cuadro 32 Ensayo de ABTS+ con BHT (minuto 1 de reaccin) 88

Cuadro 33 Porcentaje de inhibicin de ABTS+ con BHT (minuto 1 dereaccin) 89

Cuadro 34 Ensayo de ABTS+ con BHT (minuto 7 de reaccin) 90

Cuadro 35 Porcentaje de inhibicin de ABTS+ con BHT (minuto 7 dereaccin) 91

Cuadro 36 Ensayo de ABTS+ con BHA (minuto 1 de reaccin) 91

Cuadro 37 Porcentaje de inhibicin de ABTS+ con BHA (minuto 1 dereaccin) 92

Cuadro 38 Ensayo de ABTS+ con BHA (minuto 7 de reaccin) 93

Cuadro 39 Porcentaje de inhibicin de ABTS+ con BHA (minuto 7 dereaccin) 94

Cuadro 40 Resumen de resultados del ensayo de ABTS+ (minuto 7de reaccin) 94

Cuadro 41 Ensayos de emulsificacin del aceite de organo conTween 20 99

Cuadro 42 Concentracin de aceite y cantidad de Tween 20 utilizadosen el ensayo 1 100

Cuadro 43 Resultados de crecimiento de P. infestans obtenidos en elensayo 1 100

Cuadro 44 Concentracin de aceite y cantidad de Tween 20 utilizadosen el ensayo 2 102

11

LISTA DE FIGURAS

pg.

Figura 1 Estructura qumica de los principales componentes delorgano 28

Figura 2 Reaccin de reduccin de DPPH, (Radical ,-difenil--picrilhidracilo) 30

Figura 3 Equipo de extraccin por arrastre con vapor a nivel de plantapiloto 41

Figura 4 Ecuacin molecular de DPPH 41

Figura 5 Ecuacin molecular del ABTS+ 43

Figura 6 Perfil cromatogrfico del aceite esencial de organo 49

Figura 7 Frmula estructural de timol 52

Figura 8 Recta de calibracin de DPPH 53

Figura 9 Porcentaje de DPPH remanente respecto al tiempo paradiferentes concentraciones de aceite esencial de organo 54

Figura 10 Porcentaje de DPPH remanente en funcin de lasconcentraciones de aceite de organo evaluadas 55

Figura 11 Cambio colorimtrico del DPPH, a diferentesconcentraciones de aceite de organo 56

Figura 12 Porcentaje de inhibicin con relacin al tiempo paradiferentes concentraciones de aceite esencial de organo 57

Figura 13 Porcentaje de inhibicin de radicales DPPH con relacin a laconcentracin de aceite esencial de organo 58

Figura 14 Segunda prueba porcentaje de DPPH remanente respecto altiempo para diferentes concentraciones de aceite esencial de organo 59

12

Figura 15 Segunda prueba porcentaje de DPPH remanente conrelacin a la concentracin de aceite esencial de organo 60

Figura 16 Segunda prueba porcentaje de inhibicin frente al tiempopara diferentes concentraciones de aceite de organo 61

Figura 17 Segunda prueba porcentaje de inhibicin respecto a laconcentracin de aceite esencial de organo 61

Figura 18 Porcentaje de DPPH remanente frente al tiempo paradiferentes concentraciones de cido ascrbico (mg/mL) 62

Figura 19 Porcentaje de DPPH remanente frente a lasconcentraciones de cido ascrbico evaluadas (mg/mL) 63

Figura 20 Porcentaje de inhibicin frente al tiempo para diferentesconcentraciones de cido ascrbico (mg/mL) 64

Figura 21 Porcentaje de inhibicin para las concentraciones de cidoascrbico evaluadas (mg/mL) 65

Figura 22 Porcentaje de DPPH remanente respecto al tiempo paradiferentes concentraciones de BHT (mg/mL) 65

Figura 23 Porcentaje de DPPH remanente frente a las concentracionesde BHT evaluadas (mg/mL) 66

Figura 24 Porcentaje de inhibicin frente al tiempo para diferentesconcentraciones de BHT (mg/mL) 67

Figura 25 Porcentaje de inhibicin para diferentes concentraciones deBHT (mg/mL) 68

Figura 26 Porcentaje de DPPH remanente respecto al tiempo paradiferentes concentraciones de BHA (mg/mL) 68

Figura 27 Porcentaje de DPPH remanente con relacin a lasconcentraciones de BHA evaluadas (mg/mL) 69

Figura 28 Porcentaje de inhibicin respecto a la concentracin de BHA(mg/mL) 69.

13

Figura 29 Comparacin de la actividad antioxidante del aceite esencialde organo frente a otros antioxidantes convencionales (efecto de 5ppm) 70

Figura 30 Comparacin de la actividad antioxidante del aceite esencialde organo frente a otros antioxidantes convencionales medida enporcentaje de inhibicin 73

Figura 31 Comparacin de la actividad antioxidante del aceite esencialde organo frente a otros antioxidantes convencionales medida enporcentaje de inhibicin 74

Figura 32 Comparacin de la actividad antioxidante del aceite esencialde organo frente a otros antioxidantes convencionales medida enporcentaje de inhibicin (tiempo 20min) 75

Figura 33 Curva de calibracin Trolox 76

Figura 34 Porcentaje de inhibicin de ABTS+ con Trolox 77

Figura 35 Prueba de ABTS+ para el aceite de organo (minuto 1 dereaccin) 78

Figura 36 Porcentaje de inhibicin de ABTS+ con diferentesconcentraciones de aceite de organo (minuto 1 de reaccin) 78

Figura 37 Prueba de ABTS+ para el aceite de organo (minuto 7 dereaccin) 79

Figura 38 Porcentaje de inihibicin del radical ABTS+ con diferentesconcentraciones de aceite de organo (minuto 7 de la reaccin) 80

Figura 39 Segunda prueba de ABTS+ para el aceite de organo(minuto 1 de reaccin) 81

Figura 40 Segunda prueba porcentaje de inhibicin de ABTS+ conaceite de organo (minuto 1de reaccin) 82

Figura 41 Segunda prueba de ABTS+ para el aceite de organo(minuto 7 de reaccin) 83

14

Figura 42 Porcentaje de inhibicin de ABTS+ al minuto 7 condiferentes concentraciones de aceite de organo 84

Figura 43 Ensayo de ABTS+ con cido ascrbico (minuto 1 dereaccin) 85

Figura 44 Porcentaje de inhibicin de ABTS+ con cido ascrbico(minuto 1 de reaccin) 86

Figura 45 Ensayo de ABTS+ con cido ascrbico (minuto 7 dereaccin) 87

Figura 46 Porcentaje de inhibicin de ABTS+ con cido ascrbico(minuto 7 de reaccin) 87

Figura 47 Ensayo de ABTS+ con BHT (minuto 1 de reaccin) 89

Figura 48 Porcentaje de inhibicin de ABTS+ con BHT (minuto 1 dereaccin) 89

Figura 49 Ensayo de ABTS+ con BHT (minuto 7 de reaccin) 90

Figura 50 Porcentaje de inhibicin de ABTS+ con BHT (minuto 7 dereaccin) 91

Figura 51 Porcentaje de inhibicin de ABTS+ con BHA (minuto 1 dereaccin) 92

Figura 52 Porcentaje de inhibicin de ABTS+ con BHA (minuto 1 dereaccin) 92

Figura 53 Ensayo de ABTS+ con BHA (minuto 7 de reaccin) 93

Figura 54 Porcentaje de inhibicin de ABTS+ con BHA (minuto 7 dereaccin) 94

Figura 55 Resumen de resultados del ensayo de ABTS+ (minuto 1 dereaccin) 95

Figura 56 Resumen de resultados del ensayo de ABTS+ (minuto 7 dereaccin) 95

15

Figura 57 Valores de TAA para los antioxidantes de estudio (minuto 1de reaccin) 96

Figura 58 Valores de TAA para los antioxidantes de estudio (minuto 7de reaccin) 96

Figura 59 Prueba de Tukey para porcentaje de crecimiento respecto alproducto (prueba de Tukey con 95% de nivel de confianza) 100

Figura 60 Cajas Petri sembradas con P. infestans y aceite esencial deorgano 100

Figura 61 Cajas Petri sembradas con P. infestans y Ridomil 100

Figura 62 Cajas Petri sembradas con P. infestans y Tween 20 100

Figura 63 Porcentaje de inhibicin P. infestans respecto al logaritmonatural de la concentracin de AEO 102

Figura 64 Porcentaje de crecimiento de P. infestans con relacin allogaritmo natural de la concentracin de Ridomil 103

16

LISTA DE ANEXOS

pg.

Anexo A Primer ensayo de DPPH con aceite de organo 118

Anexo B Segundo ensayo de DPPH con aceite de organo 120

Anexo C Ensayo de DPPH con cido ascrbico 124

Anexo D Ensayo de DPPH con BHT 134

Anexo E Ensayo de DPPH con BHA 136

Anexo F Diseo experimental para datos de porcentaje de crecimientode P. infestans en cada tratamiento 138

17

RESUMENEl aceite esencial de organo esta constituido en su gran mayora por compuestos

fenlicos como el timol, capaz de ser usado como antioxidante y antifngico en el control

de distintos patgenos que atacan innumerables cultivos. Se valor la actividad

antioxidante mediante el ensayo DPPH y ABTS+, comparada con antioxidantes

convencionales: cido ascrbico, BHT y BHA. Para el ensayo de DPPH en valores de

EC50 (mL SE/mL DPPH) iniciando por el mejor, resulta: cido ascrbico 2,15*10-3, BHT

1,328, BHA 0,254 y aceite de organo 5,583. Sin embargo, dentro de la reaccin el efecto

que produce una misma concentracin de cada antioxidante genera un porcentaje de

inhibicin que varia el orden de actividad antioxidante as: cido ascrbico>aceite de

organo>BHT>BHA. Usando el ensayo ABTS+ se obtienen valores de TEAC (mg

Trolox/mL SE) al minuto 7 en el siguiente orden: cido ascrbico 0,175, aceite de organo

0,330, BHA 0,476 y BHT 0,679; y el TAA en orden descendente es: cido ascrbico>

BHA>aceite de organo>BHT. En sntesis, el aceite de organo muestra una alta

actividad antioxidante que supera al BHT y BHA, lo cual se debe a su composicin rica en

timol (73%) y la accin sinrgica de sus compuestos fenlicos, por tanto, se hace

susceptible para emplearse en la conservacin de alimentos o en dietas alimentarias de

animales. Asi mismo se evalu la actividad antifngica in vitro de este aceite sobre la

gota o tizn tardo causado por el patgeno Phytophthora infestans, el cual se constituye

en el agente fitopatolgico ms perjudicial de la papa en las zonas hmedas del mundo.

La evaluacin se realiz empleando el mtodo de dilucin en agar tomate, se utiliz un

diseo irrestrictamente al azar (DIA) con arreglo factorial con dos factores el factor A

correspondi al producto (aceite esencial de organo y Ridomil) y el factor B

correspondi a las concentraciones (10, 50, 100, 150, 200, 250 g.mL-1). Los resultados

obtenidos evidencian que al aceite esencial de organo silvestre (L. origanoides Kunth)

tiene un efecto inhibidor muy importante contra el fitopatgeno P. infestans, ya que desde

la dosis mnima probada de 10 g.mL-1 se present un porcentaje de inhibicin de 41,6%

en el desarrollo del patgeno y a partir de una concentracin de 150 g.mL-1 se inhibi

completamente su crecimiento, por lo cual se considera que es la concentracin letal.

Palabras Claves: aceite esencial, Lippia origanoides Kunth, Actividad antioxidante,DPPH, ABTS+. Actividad antifngica, Phytophthora infestans.

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ABSTRACT

The essential oil of oregano is made up mostly of phenolic compoundssuch as thymol, can be used as an antioxidant and antifungal agents tocontrol many different pathogens that attack crops. Antioxidant activitywas assessed by testing DPPH and ABTS +, compared withjconventional antioxidants: ascorbic acid, BHT and BHA. To test DPPH in EC50 values (mL / mL DPPH ) starting with the best results: ascorbicacid 2.15 * 10-3 1.328 BHT, BHA and oregano oil 0.254 5.583. However,within the reaction effect of a same concentration of each antioxidantinhibition generates a percentage that varies the order of antioxidantactivity and ascorbic acid> oregano oil> BHT> BHA. Using the ABTS +assay values obtained TEAC (Trolox mg / mL SE) at minute 7 in thefollowing order: ascorbic acid 0.175, 0.330 oregano oil, BHA, BHT 0.476and 0.679, and the TAA in descending order are: acid ascorbic acid>BHA> oregano oil> BHT. In short, oregano oil shows high antioxidantactivity than BHT and BHA exceeds, which is due to its composition richin thymol (73%) and the synergistic action of phenolic compounds,therefore, is likely to be used in food storage or animal food diets.Likewise, we evaluated the in vitro antifungal activity of this oil on the"drop or late blight" caused by the pathogen Phytophthora infestans,which constitutes the most damaging agent phytopathological potato inthe humid areas of the world. The evaluation was done using the agardilution method tomato, we used an unrestricted random design (DIA)under factorial with two factors corresponded to the product factor A(essential oil of oregano and Ridomil ) and factor B corresponded toconcentrations (10, 50, 100, 150, 200, 250 g.mL-1). The results showthat the essential oil of wild oregano (L. origanoides Kunth) has a veryimportant inhibitor against the plant pathogen P. infestans, since from thelowest dose tested of 10 g.mL-1 presented a percentage of 41.6%inhibition of pathogen development and from a concentration of 150g.mL-1 was completely inhibited growth, thus it is considered lethalconcentration.

Keywords: essential oil, Lippia origanoides Kunth, Antioxidant activity,DPPH , ABTS +. Antifungal activity, Phytophthora infestans.

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INTRODUCCIN

En la actualidad se explora el uso y valoracin de los productos naturales, dondelas plantas juegan un papel importante como fuente de nuevos y variados agentesantimicticos, antioxidantes y bactericidas. Existen en el mercado compuestos queson extrados de partes o la totalidad de la planta por distintos mtodos, de loscuales se destacan los aceites esenciales, que contienen compuestos confracciones lquidas-voltiles que son las sustancias responsables del aroma de lasplantas, generalmente son mezclas complejas de hasta ms de 100 componentes.Se han realizado estudios que han demostrado que algunos aceites esencialesposeen ciertas caractersticas que los vuelven benficos para la salud. Los aceitesesenciales de plantas aromticas y medicinales presentan bioactividades notablesque atraen la atencin de qumicos de productos naturales y de importantessectores de la industria farmacutica.

Teniendo en cuenta que en el mundo se encuentran una gran variedad de plantasde las cuales se puedan extraer sus aceites, esta investigacin se enfoca en elestudio del aceite esencial de Lippia origanoides Kunth, el cual crece de formasilvestre en varias zonas de nuestro pas, esta especie pertenece a la familiaVerbencea, la cual se caracteriza por la gran variedad de usos que presentan susespecies, algunas de las cuales son de gran aplicacin en la farmacutica,alimentos, textiles y sobre todo, cosmtica y perfumera dado su alto contenido deaceites voltiles, de inters industrial.

Una aplicacin importante de los aceites esenciales es la relacionada con laactividad antioxidante, algunas investigaciones han confirmado que los alimentosricos en antioxidantes juegan un papel esencial en la prevencin de enfermedadesneurodegenerativas, cardiovasculares y cancergenas causadas por los radicaleslibres (Gerber et al., 2002; Kris-Etherton et al., 2002; Serafini et al., 2002), malescomo el de Parkinson y Alzheimer (Di Matteo et al., 2003), as como tambininflamaciones y problemas ocasionados por el envejecimiento celular (Ames et al.,1993).

La utilizacin de antioxidantes es necesaria para prevenir o retardar la oxidacinde sustratos susceptibles a ello y servir como preservantes de las caractersticasinternas de los alimentos, porque retardan el deterioro oxidativo de los aceites ygrasas responsables de los olores del enrranciamiento y del off-flavours (Correa,2006).

La actividad antioxidante de una sustancia est relacionada directamente con lacantidad de compuestos fenlicos presentes en ella (Garca et al., 2007), uno de los

20

compuestos es el timol, el cual constituye el componente mayoritario en el aceiteesencial del organo silvestre del Alto Pata. Tambin es conocido que loscompuestos fenlicos poseen actividad antifngica y antimicrobiana (Fleisher ySneer, 1982; Lawrence, 1984; Tucker y Maciarello, 1994).

La finalidad de este estudio fue evaluar la actividad antioxidante y antifngica delaceite esencial obtenido a partir del organo silvestre (L. origanoides Kunth) de laregin del Alto Pata. La actividad antioxidante se evalu in vitro mediante losensayos de DPPH (2,2-difenil-1-picrihidrazil) y ABTS+ (2,2-azinobis-3-etil-benzotiazolina-6-sulfnico) y la actividad antifngica se estudi tambin in vitroutilizando el mtodo de dilucin en agar, frente al fitopatgeno Phytophthorainfestans (Mont.) de Bary el cual afecta el cultivo de papa, un rengln importantede la agricultura del departamento de Nario.

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1. DESCRIPCIN DEL PROBLEMA

El aceite esencial de organo posee propiedades antioxidantes, antifngicas yantibacteriales, (Muoz et al., 2007). Lo anterior encamina las investigaciones atener resultados concluyentes acerca de estas actividades para contribuir en eldesarrollo de productos o a su dosificacin, que permita el aprovechamiento eficazdel aceite como preservante o aditivo nutracutico en la industria alimenticia.

Entre el norte del departamento de Nario y el sur del departamento del Cauca, seencuentra la regin del Alto Pata, donde existen serios problemas de degradacinde los recursos de suelo, agua y vegetacin, lo cual ha trado consecuencias devariada ndole: sociales, econmicas y ambientales. All, la naturaleza sobrepaslos lmites de autorregulacin (proceso conocido como 'resciliencia') y, como partede la degradacin se desarroll una nueva vegetacin propia de regiones enavanzado proceso de desertificacin (enclave subxeroftico). Adems, laprecipitacin es escasa y en algunos aos el fenmeno del Nio ha producidoeventos de sequa muy prolongados, ocasionando desplazamientos masivos de lapoblacin, principalmente hacia la carretera Panamericana, donde algunos se handedicado a mendigar y delinquir para poder sobrevivir.

Corpoica viene construyendo, junto con la comunidad, un programa de desarrollohumano endgeno y sostenible desde comienzos del ao 2005. La subregin sedividi en cuatro microregiones. Una de ellas se denomina 'Cordn Panamericano'e incluye los municipios de Mercaderes, Taminango y El Rosario, en los cualesmediante un proceso participativo, se logr organizar a la comunidad en laAsociacin Vencedores del Verano". En el Programa de desarrollo se plantea lageneracin de fuentes alternativas de ingresos a partir de productoscomercializables con mercado asegurado, basndose en especies vegetalespermanentes, adaptadas a las condiciones de sequa y propias de la biodiversidaddel Cordn Panamericano.

Una de estas especies es el organo silvestre o de monte, como ellosgeneralmente lo denominan, planta herbcea que crece espontneamente en lazona durante todo el ao, el propsito es adelantar proyectos para elaprovechamiento de esta planta, en este sentido estudiantes de la Universidad deNario, de la Facultad de Ingeniera Agroindustrial, trabajaron en la optimizacindel proceso de extraccin mediante la tcnica de arrastre con vapor de aceiteesencial de organo nativo del Alto Pata y determinaron el efecto de las

22

condiciones agroecolgicas en su composicin y rendimiento (Hurtado et al.,2008).

Con el aceite esencial de L. origanoides Kunth obtenido, este proyecto se enfocaen la evaluacin de sus propiedades, centrando la atencin en cuanto a lasactividades antioxidante y antifngica, sta ltima evaluada frente al patgenoPhytophthora infestans que ataca el cultivo de la papa.

Se hace importante determinar la viabilidad del uso del aceite esencial de organosilvestre del Alto Pata para inhibir el crecimiento del patgeno Phytophthorainfestans, ya que se constituye en una alternativa frente al uso de agroqumicos, loque a su vez representa una opcin de aprovechamiento agroindustrial de estaespecie; dicha capacidad se atribuye a que el aceite de organo poseecompuestos fenlicos tales como timol y carvacrol, los cuales tienen propiedadesantioxidantes y esto le confiere potencialidad para ser utilizado como aditivo en laconservacin de productos alimenticios (Arcila et al., 2004).

En este contexto con el presente proyecto se pretende responder a las siguientespreguntas:La actividad antioxidante del aceite esencial de las hojas de organo silvestre (L.origanoides Kunth) del Alto Pata es significativa para su posible utilizacin comoaditivo en la conservacin de productos alimenticios?El aceite esencial de organo silvestre (L. origanoides Kunth) del Alto Pataposee un buen efecto inhibitorio in vitro frente al crecimiento del fitopatgenoPhytophthora infestans causante de la gota de la papa?

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2. JUSTIFICACIN

La regin del Alto Pata es una zona socialmente deprimida con problemas desequia, donde crece de manera silvestre una especie de organo de la cual sepuede extraer un aceite esencial que tiene un gran potencial comercial porpresentar comprobados efectos antimicrobianos y antioxidantes.

Diversos estudios apuntan a la presencia de compuestos como timol y carvacrolpresentes en el aceite esencial de organo (L. origanoides Kunth) capaces de serusados como antioxidantes, antifngicos y antibactericidas. Actualmente se haaumentado el auge de los antioxidantes especialmente los de origen natural, yaque presentan menores efectos secundarios que los qumicos; es por esta raznque las investigaciones se han encaminado a evaluar esta capacidad de diferentesaceites esenciales para ser utilizados en la industria alimentaria.

La gota o tizn tardo causado por el patgeno Phytophthora infestans, seconstituye en el agente fitopatolgico ms perjudicial de la papa en las zonashmedas del mundo (PROINPA, 2006) y en Colombia, se reporta como el limitantede mayor incidencia en el cultivo (Lagos, 2002), debido principalmente acondiciones climticas favorables para el desarrollo del patgeno y a la siembra demateriales altamente susceptibles, como las variedades Diacol, Capiro, Parda,Pastusa, ICA, Nevada y Tuquerrea (Jaramillo, 2004). Otro autor seala que eluso de pesticidas es por tradicin la nica alternativa de control ante steproblema fitosanitario (Rodrguez, 1996), sin embargo, el uso excesivo trae comoconsecuencias problemas ambientales de diferente tipo.

Es importante la exploracin de nuevas alternativas de control de este patgenoya que afecta el cultivo ms importante de Nario disminuyendo los ingresos delos agricultores. Como posible solucin a esta problemtica algunasinvestigaciones han reconocido en los extractos de diferentes especies de plantas,su propiedad fungicida, entre ellos de destaca los extractos obtenidos a partir de laCrcuma longa L. que fue utilizado para el control de hongos fitopatgenos comoAlternaria brassicicola, Aspergillus flavipes, Aspergillus niger, Cladosporiumsphaerospermum y Fusarium oxysporum (Da Cunha, 2006).

La generacin de conocimientos acerca de la capacidad antioxidante yantimicrobiana frente Phytophthora infestans del aceite esencial de organosilvestre del Alto Pata, abrira la posibilidad para su comercializacin orientada ala industria de alimentos y al sector de insumos naturales para el sector agrcola,

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generando valor agregado a cultivos no tradicionales que representen una fuentealterna de ingresos para las familias de la regin del Alto Pata, contribuyendo a lareduccin de la problemtica social de pobreza, a la no generacin de los cultivosilcitos y al desarrollo regional.

Cabe mencionar que este trabajo de investigacin forma parte y da continuidad alproyecto general Utilizacin de Aceites Esenciales de Organo Silvestre del AltoPata como Aditivo Nutracutico en Sistemas de Alimentacin Animal, el cual fueaprobado por el Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural.

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3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GENERAL

Evaluar la actividad antioxidante y antifngica del aceite esencial de organosilvestre (Lippia origanoides Kunth) del Alto Pata.

3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

Evaluar la actividad antioxidante del aceite esencial de organo silvestre(Lippia origanoides Kunth) del Alto Pata mediante los mtodos DPPH yABTS+.

Evaluar mediante ensayos de DPPH y ABTS+ la capacidad de captura radicalde los antioxidantes convencionales cido ascrbico, BHA y BHT y compararlacon la del aceite esencial Lippia origanoides Kunth.

Evaluar la actividad antifngica in vitro del aceite esencial de organo silvestre(Lippia origanoides Kunth) del Alto Pata frente al fitopatgeno Phytophthorainfestans.

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4. MARCO TEORICO Y ESTADO DEL ARTE

4.1 EL ORGANO

4.1.1 Caractersticas generales. El organo (origanum vulgare) es una planta deEuropa y de Asia occidental. Su nombre, que deriva del griego, significa,"esplendor de la montaa".

Existen bsicamente dos tipos de organo: organo europeo (mejorana, organocomn, etc.) nativo de la regin mediterrnea y el organo americano (Suramricao Mxico) pertenecientes al gnero Lippia (L. origanoides, L. graveolens, entreotras), los cuales se destacan por su alto contenido de compuestos fenlicos (timoly carvacrol) (Goren, et al., 2003; Vernin et al., 2001). El gnero Lippia(Verbenaceae) incluye aproximadamente 200 especies de hierbas y arbustos. Lasespecies estn especialmente distribuidas en pases de Amrica Central (Mxico,Guatemala, Cuba) y Amrica del Sur (Venezuela, Brasil, Colombia). Muchas deellas son tradicionalmente utilizadas como remedio para afeccionesgastrointestinales y respiratorias, adems las hojas de la mayora de estasespecies son utilizadas como condimentos en la preparacin de alimentos.

El organo silvestre cuyo nombre cientfico es Lippia origanoides Kunth y quepertenece a la familia de las Verbenaceae, es un arbusto aromtico, con olor aorgano en la mayora de quimiotipos, ocasionalmente ctrico, artemisa de hasta3,5m alto, presenta hojas ovadas con el pice redondeado, flores blancas,pequeas y muy aromticas; el rendimiento de extraccin del AE segn DosSantos, es de 4,6% (p/p). Algunos de los sinnimos de esta especie botnica, son:Lippia berterii Spreng y Lantana origanoides H.B.K. (Celis et al., 2007).

4.1.2 Taxonoma de Lippia origanoides Kunth.Reino PlantaeDivisin MagnoliophytaClase MagnoliopsidaOrden LamialesFamilia VerbenaceaeGnero LippiaEspecie Lippia origanoides

4.1.3 Produccin Nacional e Internacional de organo. Los principalesproductores de organo son Turqua, Grecia e Israel, en Latinoamrica sobresalenChile y Per; Mxico a su vez presenta altos niveles de produccin del

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denominado "organo mexicano" (L. graveolens) que corresponde a un productocon unas caractersticas especificas y similares a las encontradas en Colombia.En cuanto a los importadores se destaca Estados Unidos con ms del 10% delvolumen total, seguido por la Unin Europea, especialmente Alemania, Italia,Francia y Espaa. En Sudamrica los principales importadores son Brasil,Uruguay y Argentina. Este panorama muestra el organo como condimento, perono en el papel de sus bio-componentes funcionales.

En nuestro pas, esta especie se encuentra en Cauca, Cundinamarca, Guajira,Magdalena, Santander y Norte de Santander, es un arbusto de hasta 3,5 m dealto; hojas ovaladas con el pice redondeado, mrgenes dentadas tanto por la hazcomo por el envs, pubescentes, con tricomas ferrugneos, de 3,5 a 5 cm de largo,1,5 a 2,3 cm de ancho; pecolo de 1-1,5 cm de largo; inflorescencias cortas,axilares, apretadas, con flores blancas, pequeas y muy aromticas (Garca,1992).

4.1.4 Composicin y usos potenciales. El uso ms comn de las especies deLippia es para el tratamiento de desrdenes respiratorios, con este fin la planta esusualmente preparada en forma de infusin. En Sur Amrica tambin esempleada como remedio para resfriados, gripe, bronquitis, tos y asma. Es el casode L. origanoides cuyas hojas son utilizadas como condimentos en la preparacinde alimentos, y en forma de infusin para el tratamiento de la diarrea, comoanalgsico, antiinflamatorio y antipirtico. (Morton, 1981). Se ha reportadopropiedades como antisptico, antioxidante, antimicrobial, antiviral, expectorantepulmonar, anti inflamatorio, analgsico y anestsico; antibitico natural, fungicida,antiespasmdico, anti parasitario, tonificante del sistema nervioso, tienepropiedades desinfectantes y cicatrizantes frente a infecciones drmicas, mejora ladigestin estimulando el flujo de bilis, antidiabtico, antdoto, fortalecedor delsistema inmunolgico. (Arcila et al., 2004).

L. origanoides Kunth, pertenece a la familia Verbencea, esta familia secaracteriza por la gran variabilidad de usos que presentan sus especies, algunasde las cuales son de gran aplicacin en la farmacutica, alimentos, textiles y sobretodo, cosmtica y perfumera debido a su alto contenido de aceites voltiles, deinters industrial. As mismo, se ha demostrado que los aceites esencialespresentes en L. origanoides, poseen actividad antimicrobial contra Escherichiacoli, Staphylococus aureus, Candida albicans y Candida tropicalis. Adems, lashojas de L. origanoides son usadas como sustituto del organo comn.

L. origanoides se conoce en Colombia como organo de monte y junto con otrasespecies de similar nominacin, varios autores han reportado un alto contenido de

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los monoterpenos timol y carvacrol (Montoya, 2007). Por lo menos 36 especiespertenecientes a diferentes gneros que son llamadas organo son usadas comocondimentos, la presencia del aceite esencial y su composicin en estas especiesdeterminan el aroma y el sabor de estos condimentos. De esta manera, lacomposicin qumica de los aceites esenciales es el criterio ms importante paraestablecer la cualidad de condimento de una especie y definir la calidad delmismo.

Existen diversos estudios sobre la composicin qumica del organo, usandoextractos acuosos y sus aceites esenciales. Se han identificado flavonoides comola apigenina y la luteolina, agliconas, alcoholes alifticos, compuestos terpnicos yderivados del fenilpropano. En el O. vulgare se han encontrado cidos coumrico,ferlico, cafico, r-hidroxibenzico y vainillnico. Los cidos ferlico, cafico, r-hidroxibenzico y vainillnico estn presentes en O. onites. Los aceites esencialesde especies de Lippia contienen limoneno, -cariofileno, -cimeno, canfor, linalol,-pineno y timol, los cules pueden variar de acuerdo al quimiotipo. La Fig. 1presenta las estructuras qumicas de algunos de los compuestos principalespresentes en el organo (Martnez, 2003).

Figura 1. Estructura qumica de los principales componentes del organo(Martnez, 2003).

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4.2 MTODOS DE DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE

Los antioxidantes son compuestos que pueden retrasar la oxidacin de lasmolculas al inhibir la propagacin de la reaccin en cadena oxidativa. La actividadantioxidativa de los compuestos fenlicos se debe a sus propiedades redox, quepueden jugar un importante rol en absorber y neutralizar radicales libres, apagandoradicales de oxgeno o descomponiendo perxidos.

Los antioxidantes de los alimentos pueden ser definidos como cualquier sustanciaque es capaz de aplazar, retardar o prevenir el desarrollo de ranciedad en elalimento u otro deterioro del flavor que se produzca como consecuencia de laoxidacin. Los antioxidantes retardan el desarrollo de flavores inadecuadosprolongando el periodo de induccin por lo que su adicin al final de este periodo noconsigue retardar el desarrollo del enranciamiento. (Pokorny et al., 2001).

Se distinguen dos tipos de antioxidantes:

Antioxidantes Sintticos: los ms usados, son los compuestos fenlicos como elhidroxianisol butilado (BHA), el hidroxitolueno butilado (BHT), la butilhidroquinonaterciaria (TBHU), y los steres del cido glico, como el galato de propilo (PG).Estos antioxidantes contienen sustituciones alqulicas para mejorar su solubilidad engrasas y aceites. De acuerdo a las normas de buenas prcticas de produccin eluso de stos cuatro antioxidantes sintticos esta limitado al 0,02% del contenido degrasa o aceite del alimento (Simic, 1981).

Antioxidantes Naturales: el uso emprico de los compuestos naturales comoantioxidantes es muy antiguo. La popularidad del ahumado y el especiado comomtodos caseros para la preservacin de carne, el pescado y otros alimentos ricosen grasa puede deberse, al menos en parte, al conocimiento de que estostratamientos poseen un efecto retardante sobre el enrranciamiento. Losantioxidantes naturales se encuentran presentes en prcticamente todas lasplantas, microorganismos, hongos, e incluso en los tejidos animales. La mayorason compuestos fenlicos entre los cuales los grupos principales son lostocoferoles, los flavonoides y los cidos fenlicos (Pokorny, 1999).

4.2.1 Mtodos de captura de radicales. La captura de radicales es el principalmecanismo de accin de antioxidantes en los alimentos, se han desarrolladomuchos mtodos en los que se mide la capacidad antioxidante a travs de lacaptura de los radicales libres sintticos en solventes orgnicos polares, por ejemplo

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metanol, a temperatura ambiente. Los radicales usados son del tipo 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) y (2,2-azinobis-3-etil-benzotiazolina-6-sulfnico) (ABTS+).

Ensayo de DPPH: se mide la captura de este radical a travs de la disminucin dela absorbancia, medida a 516 nm, que se produce por reduccin de un antioxidante(AH) o por reaccin con especies radicales (R) como se muestra a continuacin:(Brand- Williams et al., 1995)

DPPH+ AHDPPH-H + A (1)

DPPH+R DPPH-R (2)

Este mtodo es empleado para sustancias liposolubles o hidrosolubles. Cuando elradical DPPH es atrapado por un antioxidante a travs de donacin de un tomode hidrgeno, el radical se reduce, para formar la respectiva hidrazina, DPPHH; laabsortividad molar a 514 nm cambia de 9660 a 1640, y el color se torna de prpuraa amarillo, (Celis et al., 2007), dicha reduccin se ilustra en la Fig. 2.

Figura 2. Reaccin de reduccin de DPPH, (Radical ,-difenil-- picrilhidracilo).RH= Antioxidante.

Ensayo de ABTS+: el radical catinico de ABTS+ es ms reactivo que el radicalDPPH, por lo que la reaccin transcurre completamente en un minuto (Miller 1993).Desde que se describi por primera vez este mtodo, la forma en que se generan

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los radicales catinicos ha cambiado muchas veces. El mtodo ms recienteconsiste en el uso de persulfato potsico para oxidar el ABTS+ y su radicalcatinico (Pellegrini, 1999).

4.3 LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE EN ACEITES ESENCIALES

Las propiedades antioxidantes de una especie de planta pueden ser potencializadasa travs de la aplicacin de su extracto fenlico, asimismo de otras fracciones comode su oleorresina o su aceite esencial en productos farmacuticos, alimenticios ycosmticos (Correa, 2006).

Dado el aprovechamiento que se puede obtener de los antioxidantes, en los ltimosaos se han dirigido estudios en la bsqueda de antioxidantes naturales parareemplazar los sintticos y conociendo que la accin antioxidante se atribuye a larelacin entre timol y carvacrol, muchos estudios se han dirigido a ladeterminacin de la composicin qumica del gnero Thymus, Origanum, Satureja,Thymbra y Lippia, sabiendo que stos poseen en cantidades significativas stoscomponentes.

Revisando la literatura se ha encontrado diferentes estudios para determinar laactividad antioxidante de los aceites esenciales:

Un estudio realizado en mayo de 2007 en la Universidad Industrial de Santander,muestra que la composicin qumica del aceite esencial de Piper auritum Kunth,difundida en la Costa Colombiana, tiene safrol, 94,0% (hojas) y 90,3%(inflorescencias) y miristicina, 3,2% (hojas) y 5,8% (inflorescencias), se encontrque en comparacin con la vitamina C, este aceite esencial no es un buenantioxidante dada la no existencia de compuestos fenlicos y que su escasaactuacin se debe a la presencia de hidrgenos arlicos (Garca et al., 2007).

Para el caso del organo Tafur et al., concluyen que la accin antioxidante de estese debe a tres factores:1) La presencia de compuestos fenlicos como timol y carvacrol, que puedeejercer actividad similar al eugenol, BHA, BHT y vitamina E. sta es la causafundamental por la que el aceite esencial de organo presenta actividadantioxidante (Pokorny et al., 2001; Puertas et al., 2002; Brand- Williams et al.,1995).

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2) La presencia de hidrocarburos antioxidantes monoterpenos y/o sesquiterpenos,que tambin pueden actuar como antioxidantes; tambin se considera que losaceites esenciales que no contienen fenoles, presentan actividad antioxidante3) El efecto sinrgico entre los componentes del aceite esencial y el medio. Esdecir, que algunos compuestos que no presentan actividad antioxidante notoria, alser mezclados, pueden aumentar la capacidad de las molculas que s sonantioxidantes.

En este estudio los componentes mayoritarios presentes en el aceite esencial deOriganum vulgare L. fueron carvacrol (51,4%), p-cimeno (10,0%), trans--cariofileno (6,4%) y -bergamoteno (3,1%). (Tafurt et al., 2005)

En la Tercera Reunin Nacional Sobre Organo realizada en el 2007 en Mxico,se expuso un estudio acerca de la actividad antioxidante del aceite esencial deorgano mexicano (Lippia berlardieri Schauer) frente a las grasas; los resultadosarrojaron como conclusin que la muestra del aceite esencial con mayor cantidadde carvacrol tiene mejor actividad antioxidante que las otras muestras. Seconcluye que la concentracin del compuesto fenlico en el aceite esencial estdirectamente relacionada con su actividad antioxidante (Chaquilla et al., 2008).

En otro estudio se determin que la capacidad antioxidante de los aceitesesenciales de cuatro especies aromticas y medicinales con alto contenido detimol y carvacrol fue: organo cimarrn > tomillo > organo comn > organo decastilla. La capacidad antirradicalaria del aceite esencial de organo cimarrn fue2,4 veces mayor que la capacidad del aceite esencial de Tomillo. Los ensayostambin mostraron que la actividad antioxidante del aceite esencial de organocimarrn o silvestre es mayor a la capacidad antirradicalaria del antioxidantesinttico BHT (Muoz et al., 2007).

En otras especies diferentes al organo, por ejemplo el arrayn, se encontr quela actividad antioxidante de su aceite esencial era debida a la presencia degeraniol, siendo dicha actividad muy semejante a la de la vitamina C yproporcional a la concentracin del aceite esencial frente al DPPH (Carhuapomaet al., 2005).

Se ha evaluado la actividad antioxidante de aceites esenciales utilizando variosmtodos, algunos de los cuales se mencionan a continuacin:

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Evaluacin en sistemas alimenticios.En un estudio, presentado en la Tercera Reunin Nacional Sobre Organo (2007),se evalu la actividad antioxidante del organo mexicano (Lippia berlardieriSchauer) frente a las grasas. Se emplearon tres muestras diferentes del aceiteesencial y dos concentracin (0,15%-0,30%), en dos sistemas alimenticios: aceitede oliva y aceite de soya sin refinar, comparados con un negativo (sinantioxidante) y un positivo (BHT al 0,02%); luego la capacidad antioxidante semidi en valores de perxido y los cidos grasos libres en funcin del tiempo(Chaquilla et al., 2008).

Medicin del valor perxido.Se hizo una evaluacin acerca de la actividad del antioxidante de los residuos no-voltiles del aceite esencial de naranja, se midi el valor del perxido obtenidodespus calentar el aceite a 70 C durante 48 h, se aislaron seis compuestos y sepurificaron, cuatro de stos tenan actividad antioxidante: se identificaron tocoferoly tres flavonas metoxiladas usando los mtodos de espectroscopia. Este estudioconfirm que estos fragmentos no-voltiles de aceite esencial de naranjacontienen antioxidantes naturales diferentes (Vargas, 2009).

Cuantificacin de Hexanal.Otra forma de comprobar la actividad antioxidante es tomando como indicador elhexanal, compuesto voltil generado durante el deterioro oxidativo de los cidosgrasos insaturados. En 2005 se realiz una investigacin cuyo objetivo fue evaluarlas actividades antioxidantes in vitro de los aceites esenciales de Origanumvulgare L., Rosmarinus officinalis L. y Coriandrum sativum L. contra el deteriorooxidativo causado por radiacin UVA-VIS en emulsiones de Ag/Ac (margarina) yAc/Ag (aceite vegetal). El estudio mostr que el aceite de organo present mayorproteccin, seguido por los de cilantro y romero; as mismo que en la emulsin deAg/Ac el aceite esencial de organo exhibi mayor actividad antioxidante que lavitamina E para concentracin de 1, 10 y 20 g/Kg (Tafurt et al., 2005).

Mtodo de la oxidacin acoplada de -caroteno y cido linoleico.En el estudio acerca de la Actividad antioxidante de extractos de Origanunvulgare obtenido con dixido de carbono supercrtico, se utiliz este mtodo(Navarro Das et al., 2007). La emulsin se prepar con 2 g de -caroteno diluidoen 10 mL de cloroformo, despus se adicion 1ml de esta solucin a un frasco con20 mg de cido linoleico y 200 mg de Tween 40. Esta nueva solucin fueconcentrada con un rotaevaporador a vaco (50C, 1,2*10-2MPa) despus seremovi con cloroformo, 50 mL de agua destilada oxigenada fue adicionada alfrasco con vigorosa agitacin; la oxigenacin del agua destilada fue hecha con aireburbujeante constante durante 30 min.

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Se adicionaron 5 mL de la emulsin diluida para cada serie de tubos quecontienen 0,2 mL de la solucin etanlica antioxidante (7,5 mg de extracto/1mletanol). Los tubos fueron puestos en bao de agua (50C). La reaccin fuemonitoreada leyendo la absorbancia en espectrofotmetro en 0, 30, 60, 90, 120,150 y 180 minutos. La absorbancia leda fue hecha por triplicado usando unalongitud de onda de 470 nm. El cero fue ledo tomado inmediatamente despus dela adicin de la solucin antioxidante. Duplicados para todos las determinacionesfueron hechas. La actividad antioxidante fue calculada usando la ecuacin.

)3(010*1 00

tcc

tss

AbsAbsAbsAbsAA

Donde AA = Actividad Antioxidante (%)

0sAbs = Muestra de absorbancia al iniciar la reaccin (t=0)0cAbs = Control de Absorbancia al inicio de la reaccin (t=0).tsAbs = Muestra de la absorbancia de la reaccin en el tiempo.tcAbs = Control de absorbancia de la reaccin en el tiempo.

Existen diversidad de ensayos para determinar la actividad antioxidante, pero enocasiones la aplicacin de metodologas inadecuadas y la insuficiencia deconocimiento respecto a las propiedades antioxidativas que los test miden,comprometen la veracidad de la informacin respecto al potencial antioxidante dedeterminados compuestos (Correa, 2006).

4.4 MTODOS DE DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIFNGICA

Tcnica de difusin en agar.El mtodo consiste en aplicar una cantidad determinada del extracto en estudioen un disco de papel sobre la superficie de la placa donde se ha distribuido elinculo con el microorganismo sobre el que se quiere ver el poder antifngico. Porel gradiente de concentracin, el extracto difunde alrededor del disco. Lasensibilidad del microorganismo al extracto se relaciona con el tamao de la zonade inhibicin del crecimiento. Segn el dimetro del halo de inhibicin, losmicroorganismos se clasifican en: no sensibles (d < 8 mm), sensibles (9 mm < d 20 mm). (Roura, 2003).

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Mtodo de dilucin en medio de cultivo y en agar.El extracto se incorpora al medio con agar cuando an est lquido. Para lograr elrango de dilucin deseado se preparan una serie de placas con diferentesconcentraciones del extracto. Los resultados se expresan como ConcentracionesMnimas Inhibitorias (CMI) la cual se define como la menor concentracin delextracto que produce el 90% de reduccin en el crecimiento de las colonias. Si seusan medios lquidos, el procedimiento es el mismo, slo que se usan tubos deensayo para las diferentes diluciones (Roura, 2003).

4.5 LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS ACEITES ESENCIALES

En varias investigaciones se ha demostrado que los aceites esenciales poseenpropiedades antibacterianas, antimicticas, antiparasitarias e insecticidas. Algunosde los aceites esenciales que han sido ensayados en alimentos son: eucalipto(Eucalyptus), romero (Rosmarinus afficinalis), menta (Mentha piperita), rosamosqueta (Rosa moschata), trbol (Trifolium pratense), limn (Citrus limonum),organo (Origanum vulgare), etc.

A continuacin se muestran algunos de estos estudios de actividad antimicrobianacon diferentes tipos de aceite esencial.

Se evalu la actividad antimicrobiana de aceites esenciales de frutas verdes y lashojas de la variedad de hinojo Foeniculum vulgare Mill. subsp. Vulgare recogido enel Alentejo, la regin de vora. En este estudio, se realiz la extraccin del aceiteesencial por hidrodestilacin y su anlisis se llev a cabo por GC-FID y GC-MS.Fueron identificados como componentes mayoritarios anetol en el aceite de lashojas y frutos, y estragol -felandreno en las semillas. La actividad antimicrobianade los aceites fue evaluada contra las cepas de Staphylococcus aureus,Escherichia coli, Saccharomyces spp., Fusarium oxysporum y Penicillium sp. Losaceites esenciales mostraron actividad antimicrobiana contra Staphylococcus sppS. cerevisia y Fusarium oxysporum (Tinoco et al., 2006).

En otro estudio se evalu la actividad in vitro anti cndida y anti aspergillius deaceites esenciales de plantas de la familia piperaceae, los cuales mostraron unabuena capacidad de inhibicin de las cepas evaluadas (Mesa et al., 2007).

En cuanto a la actividad antifngica, existen diferentes aceites esenciales que hansido evaluados, se tiene el aceite esencial de canela (Cinnamomum zeylanicum

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Blume) y Organo (Origanum Vulgare L.) sobre Aspergillus flavus y la produccinde Aflatoxinas en nuez pecanera (Garca, et al., 2006); tambin esta el aceiteesencial de las hojas de Aloysia gratssima (Gilles y Hook) que fue evaluadocontra los fitopatgenos Colletotrchum gloeosporioides, Fusarium oxysporium yBotrytis cinerea, se encontr que era efectivo contra los dos ltimos fitopatgenos(Carvalho, 2005). Otro aceite esencial con gran capacidad antifngica es el deP.sanctifelisis proveniente de especies de organo Pipper, para C. krusei. (Mesa,et al., 2007); tambin se encuentra el aceite esencial de Tanaecium Nocturnum(Barb. Rodri.) Bur. y K. frente al Aspergillus flavus aislada desde nueces de Brasil(Bertholletia Excelsa) (Pimentel, 2007). El aceite esencial de Tomillo (Thymusvulgaris) y de limoncillo (Cymbopogon citratus) ha mostrado actividad contraColletotrichum acutatum. (Alzate, et al., 2008).

Adems de los aceites se encuentran extractos vegetales con gran actividadantifngica como el caso del extracto vegetal metanlico de mejorana (Origanummajorana L.), frente a Phytophthora infestans (Gamboa, 2002), el cual presentauna eficiente actividad fungistica.

Haciendo una referencia sobre los estudios realizados especficamente con elaceite esencial del organo se encuentra que:

Dos Santos et al., (2004) evaluaron los componentes antibacterianos yantifngicos del aceite esencial de Lippia origanoides HBK y analizaron suactividad frente a las bacterias gram-positivas Staphylococus aureus yStaphylococus aureus MRSA, la bacterias gram-negativa Escherichia coli y loshongos Candida albicans y Candida tropicalis, los resultados mostraron actividadantimicrobiana significativa contra todos los microorganismos evaluados (DosSantos et al., 2004).

En otro estudio se realiz una evaluacin in vitro de diferentes extractos deorgano sobre el crecimiento de Xanthomona campestris, Cladosporiumcladosporoide y Aspergillus niger, especies que atacan diversos cultivos dehortalizas, entre ellos al jitomate. Se observaron diferencias significativas entre losextractos utilizados como tratamientos, la inhibicin de los hongos Aspergillusniger y Cladosporium cladosporoide se evidenci por la reduccin del crecimientomicelial (Ku Ucan, 2008).

Oliveira, et al. (2005) realizaron un estudio del aceite esencial de Lippiaoriganoides HBK (Verbenaceae). Se analiz la composicin qumica del aceiteesencial de las hojas, por GC y GC / MS, el cual mostr un alto contenido demonoterpenos oxigenados (66,0%), carvacrol (38,6%) y timol (18,5%) como

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principales constituyentes. La actividad antimicrobiana de este aceite esencial sedetermin por el mtodo de difusin en placa, mostrando zonas de inhibicin muyimportantes para todos los microorganismos probados (Oliveira et al., 2005).

En otra investigacin se evaluaron los aceites esenciales obtenidos de hojas yflores de diferentes muestras de L. origanoides cultivadas en el Valle del Cauca,se les determin la capacidad in vitro para inhibir el crecimiento micelial y laformacin de esclerocios de S. cepivorum, patgeno causante de la pudricinblanca en cebolla. Todos los aceites evaluados mostraron efecto inhibitorio tantoen el crecimiento micelial como en la formacin de esclerocios en un rango de250-1350 L/L, sin embargo, aquellos obtenidos a partir del quimiotipo Ipresentaron el mayor poder inhibitorio en el crecimiento del micelio (CMI = 120L/L) y en la formacin de esclerocios. El estudio concluy que L. origanoidespuede usarse potencialmente para el control de la pudricin blanca en cebolla(lvarez et al., 2007).

4.6 FITOPATGENO Phytophthora infestans

El tizn tardo de la papa causado por Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, esuna de las enfermedades ms devastadoras de la papa a nivel mundial. En 1845caus en Irlanda la destruccin total de los campos de papa, que eran la principalfuente alimenticia de ese pas, produciendo la muerte de miles de personas y lamigracin de muchos sobrevivientes a otros lugares de Europa y Norte Amrica.(Prez et al., 2008).

4.6.1 Taxonoma y clasificacin Phytophthora infestans (Jaramillo, 2004).Reino Cromista (grupo stramenophyle)Phylum OomycotaClase OomyceteSubclase PerenosporomycetidaeOrden PhythialesFamilia PythiaceaeGenero PhytophthoraEspecie infestans

El desarrollo epidmico del tizn tardo, depende en gran parte del efecto quetiene la humedad relativa y la temperatura sobre las distintas etapas del ciclo devida de P. infestans. La germinacin de los esporangios se reproduce ahumedades relativas superiores al 90%, con una temperatura optima entre 10-15C, rango en el cual el fitopatgeno se desarrolla adecuadamente, esporula y

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libera las zoosporas, las cuales germinan y penetran en el tejido a travs deestomas, lenticelas y heridas, produciendo nuevamente la enfermedad (Agrios,2002).

Los primeros sntomas se presentan como manchas de color verde claro a oscuroen los bordes de las hojas inferiores. Estas manchas se extienden rpidamente,formando zonas pardas y atizonadas con bordes irregulares. En el envs de lashojas aparece la cenicilla vellosa, constituida por las hifas y los esporangios delpatgeno. Los foliolos afectados finalmente pierden consistencia y se necrosan.En condiciones de alta humedad y temperatura fra, las lesiones se expandenrpidamente, pudiendo afectar la totalidad de rganos areos de la planta,provocando una marchites progresiva (Torrez, 1997).

Los sntomas en los tallos infectados se caracterizan por las lesiones necrticasde color marrn oscuro generalmente ubicadas desde el tercio medio a la partesuperior de la planta, presentan consistencia vtrea, de tamao variable (hasta 10cm de largo). Como consecuencia, las hojas se enrollan, los tallos se tornanquebradizos y pueden romperse con la fuerza del viento o con el rozamiento delas mquinas o personas que transitan por el campo (Torrez, 1997; Prez yForbes, 2008).

Los tubrculos afectados muestran una pudricin de consistencia dura,externamente se observan lesiones descoloridas de forma y tamao variables, alcortar los tubrculos enfermos se observan manchas irregulares de color marrnclaro, de tamao y forma variables y de consistencia corchosa (Torrez, 1997).

Actualmente para el control de este patgeno se emplean fungicidas quenormalmente slo se utilizan de manera preventiva. En las variedadessusceptibles, a veces las aplicaciones de fungicidas pueden ser necesarias unavez a la semana. Metalaxyl, es un fungicida que se comercializa para su usocontra P. infestans, pero sufre problemas de resistencia grave cuando se utilizapor s solo, la presentacin comercial viene en mezcla con Mancozeb, el cual tieneactividad protectante en el manejo del patgeno. (Syngenta, S.A.)

Los biocidas y/o bioinsumos son productos de origen natural que se utilizan parael manejo y control de plagas y enfermedades en la agricultura orgnica. Estos seconsideran ambientalmente benignos porque se degradan rpidamente y su efectosobre los organismos benficos es menos perjudicial que el de productostradicionales (O'farril, 2004).

39

En la naturaleza existen una gama muy amplia de plantas que producen unadiversidad de metabolitos txicos, tal caracterstica les permite a stas plantasactuar como antagonistas de patgenos biticos y plagas. Su potencialantagonista se lo puede aprovechar mediante la preparacin de extractos oinfusiones a partir de sus tejidos con resultados promisorios en laboratorio einvernadero (Zabaleta, 2000; Frayre, 1993; Granada, 2002).

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5. DISEO METODOLOGICO

5.1 MATERIAL VEGETAL

La materia prima (hojas secas de organo) fue suministrada por la asociacinVencedores del Verano, que fue previamente capacitada para la colecta delmaterial biolgico. Se recogieron las hojas maduras de plantas de organosilvestre (L. origanoides Kunth), entre las hileras uno y diez contadas de abajohacia arriba, sin cortar la rama, con el objeto de no destruir la planta. Estas secolectaron en cuatro veredas (Alto del Mayo, San Juanito, El Cardo, Las Juntas-Viento Libre) del rea subxeroftica denominada Cordn Panamericano del AltoPata, ubicadas en los municipios de Taminango en el Norte del Departamento deNario y Mercaderes al sur de Cauca. La identificacin taxonmica de lasmuestras se realiz en el Herbario de la Universidad de Nario.

El material vegetal (solo hojas) fue pesado, separado de piedras, impurezas yotros elementos extraos y se dej secar a la sombra a temperatura ambiente porespacio de ocho das. Luego se tritur en un molino de martillos y se tamizutilizando una serie de tamices estndar.

Para satisfacer los requerimientos de buenas prcticas se mantuvo registros delorigen del material vegetal y se sigui las recomendaciones de la Gua Para laColecta de Materiales del Hbitat Natural, elaborada por Corpoica, la cual se uscomo base para una capacitacin realizada a los miembros de la citada asociacincon el fin de instruirlos en la tcnica de recoleccin del material vegetal.

Las observaciones realizadas en campo indican que se deben recoger las hojasde las diez primeras ramas del suelo hacia arriba, con el objeto de que no sedestruya la planta ni se deje el suelo al descubierto, impidiendo la exposicin deste a la intensa radiacin solar.

Se debe resaltar que se trata de plantas que crecen de forma silvestre y que noson sometidas a ningn tipo de prctica agronmica o de aplicacin deagroqumicos. Las hojas son cosechadas de plantas maduras en la pocaposterior al periodo de lluvias debido a que es en este momento donde las plantastienen mayor cantidad de hojas.

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5.2 PROCESO DE EXTRACCIN DE ACEITE

El proceso de extraccin del aceite esencial de las hojas de organo se realiz enla planta piloto de la Facultad de Ingeniera Agroindustrial utilizando la tcnica dearrastre con vapor, para lo cual se dispuso de un equipo de 80 litros de capacidadque consta de una canastilla para contener la muestra y un sistema de flautas enforma de cruz en la base a travs de las cuales fluye el vapor generado en unacaldera. El equipo de extraccin se muestra en la Fig. 3.

Figura 3. Equipo de extraccin por arrastre con vapor a nivel de planta piloto.

Una vez extrado el aceite esencial se deshidrat con Na2SO4 anhidro, se tomuna alcuota de 30 L y se diluy en 1 mL de diclorometano para el anlisiscromatogrfico.

5.3 EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE

La actividad antioxidante que posee el aceite esencial de L. origanoides Kunth seevalu mediante los mtodos espectrofotomtricos de DPPH y ABTS+. Laevaluacin por el mtodo de DPPH se realiz de acuerdo a la metodologadescrita por Cavero, S. (Cavero, 2003), y la evaluacin por el mtodo de ABTS+de acuerdo a la metodologa de Re, R. (Re et al., 1999).

5.3.1 Ensayo de DPPH. 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH), cuya estructuraqumica se muestra en la Fig. 4, con 95% de pureza.

Figura 4. Ecuacin molecular de DPPH.

Las medidas espectrofotomtricas se realizaron a temperatura ambiente en unespectrofotmetro Genesys 10 UV-VIS Scaning 335907. Para la medicin se

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usaron cubetas de 1 cm x 1 cm x 4,5 cm. La longitud de onda seleccionada fue516 nm. Diariamente, antes de cada medicin se equilibr el espectrofotmetrodurante 10 minutos. Para el blanco se utiliz etanol grado HPLC. Todas lasmediciones se realizaron por triplicado. Se utiliz, asimismo, una alcuota deDPPH sin muestra como control.

Para la preparacin de la solucin concentrada de DPPH se pesaron 0,014 g deDPPH y se disolvieron en 100 mL de etanol. Tras una agitacin de diez minutos,se tomaron 20 mL se enras hasta 100 mL en etanol y se agit de nuevo. Laconcentracin inicial de DPPH qued as aproximadamente en 7,1 x 10-5 M. Perola concentracin real en la reaccin se obtuvo de extrapolar la medida deabsorbancia en el espectrofotmetro cada da a tiempo 0 en la recta de calibradoque se menciona a continuacin. El valor extrapolado se constituye en CDPPH (t=0).Hasta el momento de su uso se guard en refrigeracin y protegido de la luz. Laduracin mxima de la solucin de DPPH fue de ocho horas.

Se prepararon diluciones con diferentes concentraciones de DPPH en etanol paraobtener una recta de calibrado. Con el aceite esencial de organo, se prepararondistintas concentraciones, desde 12,5l/mL hasta 200l/mL en medio de reaccinetanol HPLC, se agitaron hasta su perfecta disolucin. De la solucin de DPPH setomaron alcuotas de 3,0 mL y se dispusieron en las cubetas delespectrofotmetro. Sobre las cubetas se aadi 30 L de cada una de lasconcentraciones de la muestra se dejaron reaccionar, midiendo la absorbanciacada 5 minutos hasta la estabilizacin de la reaccin. El valor que se obtiene seextrapol en la recta de calibrado del DPPH, para obtener el equivalente a laconcentracin de DPPH a tiempo t, CDPPH (t=t).

El porcentaje de DPPH remanente (% DPPH rem) se obtuvo de la ecuacin quese muestra a continuacin:

)4(100*%)0(

)(

tDPPH

ttDPPHrem C

CDPPH

Se represent el porcentaje de DPPH remanente frente a concentracin delaceite en el medio de reaccin (mg/mL) y se determin la ecuacin de la rectaobtenida por el mtodo de regresin por mnimos cuadrados. En esta ecuacin elvalor correspondiente al 50% es la concentracin eficaz al 50% o EC50, que sedefine como la cantidad de antioxidante (mg/mL) necesario para reducir laconcentracin de DPPH a la mitad.

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Tambin se calcul el porcentaje de Inhibicin, segn la ecuacin (5), como sigue:

)5(100*%0

0

AAA

I t

Donde:Ao = Absorbancia en el tiempo 0At = Absorbancia despus de un periodo de tiempo en reposo.

Con la ecuacin encontrada en la representacin del porcentaje de inhibicinfrente a las concentraciones se calcul el valor IC50 que corresponde al valor de laconcentracin que inhibe el 50% del radical libre.

5.3.2 Ensayo de ABTS+. El (2,2-azinobis-3-etil-benzotiazolina-6-sulfnico)(ABTS+)

Figura 5. Ecuacin molecular del ABTS+.

Las medidas espectrofotomtricas se realizaron a temperatura ambiente en unespectrofotmetro Genesys 10 UV-VIS Scaning 335907. Para la medicin seusaron cubetas de 1 cm x 1 cm x 4,5 cm. La longitud de onda seleccionada fue734 nm. Diariamente, antes de cada medicin se equilibr el espectrofotmetrodurante 10 minutos. Para el blanco se utiliz etanol grado HPLC. Todas lasmediciones se realizaron por triplicado. Se utiliz, asimismo, una alcuota deABTS+ sin muestra como control.

En un tubo de ensayo se mezcl la solucin de ABTS+ 7 mM y persulfato depotasio 2,45 mM en proporciones 1:1 (v/v). La solucin de ABTS+ fue preparadadiluyendo la mezcla con etanol grado HPLC hasta alcanzar absorbancia 0,700+/-0,050 en una longitud de onda de 734 nm. La solucin fue almacenada en laoscuridad a temperatura ambiente durante 12-16 h antes de su uso.

La actividad antioxidante se expres en porcentaje de inhibicin, segn laecuacin (5).

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Otro indicador que se obtuvo es el TEAC (actividad antioxidante equivalente alTrolox, mM y mg/mL). ste se calcul tomando la curva de patrn Trolox, la cualse prepar con soluciones del patrn variando entre 0 y 2 mM; la dilucin de losradicales de ABTS+ en funcin de las concentraciones de Trolox sigue una curvalineal. El Trolox se caracteriza por ser un antioxidante primario, actuando en elbloqueo de los radicales libres por medio de la donacin del radical hidrogeno(Correa, 2006).

Entre los mtodos utilizados para determinar la actividad de un antioxidantebasados en la desactivacin de radicales libres, el ensayo de decoloracin delradical ABTS+ es uno de los ms aplicados, al considerarse un mtodo deelevada sensibilidad, prctico, rpido y muy estable. El tiempo de incubacin de lasolucin de ABTS+ con la muestra se suele situar entre 1 y 7 minutos. Losresultados obtenidos por algunos investigadores indican que la reaccin con elradical ABTS+ no se completa hasta pasado 1 minuto, y segn Re et al., (1999) eltiempo de 4 minutos es el ms apropiado. No obstante, Sellappan et al., (2002),sugieren tiempos de medida de 6 minutos para los patrones de referencia y de 7minutos para los compuestos puros, extractos de plantas o de alimentos.

5.4 EVALUACIN ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA

5.4.1 Obtencin del patgeno. El patgeno fue obtenido de aislamientos previosque se realizaron a las hojas de papa que se encontraban infectadas con P.infestans, para esto se realizaron cortes pequeos en las zonas visiblementeafectadas y posteriormente se realiz un lavado con hipoclorito y agua destilada;en cajas Petri de 9 cm se depositaron cuatro trozos de las hojas, para evitar elcrecimiento de bacterias que contaminen el medio de cultivo, se adicion a esteuna solucin de Rifampicina de 300 mg disuelta en 50 mL de etanol al 96%.Estas cajas se dejaron incubar durante tres das, posteriormente donde seobserv un posible crecimiento P. infestans se repic en otras cajas Petri con el finde obtener un cultivo puro.

5.4.2 Preparacin del medio de cultivo. El medio de cultivo se preparo utilizandolos siguientes compuestos.

- 0,25 gr de CaCO3- 9 gr de agar- 9 gr de azcar- 100 mL de jugo de tomate- 100 mL de extracto de arveja

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Se pes el agar, el azcar y el carbonato de calcio y se lo diluy en 300 mL deagua destilada se calent en bao mara hasta lograr que todos los compuestosestn homogneos, posteriormente se pes el extracto de arveja y el jugo detomate y se afor a 200 mL, en total se obtuvo 500 mL de medio de cultivo, el cualse esteriliz a 15 psi por 15 minutos en autoclave.

5.4.3 Inoculacin en el medio de cultivo. El medio de cultivo esterilizado sesirvi en las cajas Petri enmendado segn el caso: aceite esencial de organo yRidomil Gold MZ 68 WP (Metalaxyl + Mancozeb) en concentraciones de 10, 50,100, 150, 200 y 250 g.mL-1, se dej que el medio se solidificara y posteriormentese inocul con un disco de micelio 1,1 cm de dimetro del patgeno, el cual sesembr en el centro de cada caja; en el caso del tratamiento del aceite esencial deorgano se utiliz Tween 20 como agente emulsificante, tambin se realiz untratamiento nicamente con Tween 20 como testigo.

5.4.4 Incubacin del patgeno. Las placas sembradas fueron incubadas a18C, la temperatura ideal de crecimiento de este patgeno durante 8 das.Pasado este tiempo se realiz la evaluacin de los resultados de sensibilidad lacual se hizo en funcin del dimetro de inhibicin de acuerdo al parmetro deldiseo experimental que se describe a continuacin.

5.5 DISEO EXPERIMENTAL

Se utiliz un diseo irrestrictamente al azar (DIA) con arreglo factorial con dosfactores, el factor A corresponde al Producto (aceite esencial de organo yRidomil Gold -Metalaxyl-M 4% + Mancozeb 64%) y el factor B corresponde a lasconcentraciones (10, 50, 100, 150, 200, 250 g.mL-1).

Se tuvieron dos testigos, uno absoluto y otro aplicando Tween 20, se realizaroncinco repeticiones.

Se realizaron los siguientes tratamientos.

Cuadro 1. Tratamientos evaluados para la determinacin de actividad antifngica.

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Tratamientos Productos Concentracin (g.mL-1)1050

100150200

AMetalaxyl

+Mancozeb

2501050

100150200

BAceite

esencial deOrgano.

2501050

100150200

C Tween 20

250

D Testigoabsoluto 0

El comportamiento in vitro de los aislamientos, se determin, con relacin alcrecimiento radial de las colonias de P. infestans en los diferentes tratamientos. Sedetermin el porcentaje de crecimiento utilizando la relacin propuesta por Riveros(Riveros et al., 2003):

)6(100*1.1DMCA

cmDMCMPC

Donde: PC = porcentaje de crecimientoDMCM = dimetro medio colonia creciendo en tratamiento1,1 cm = dimetro del cilindro con micelioDMCA = dimetro medio colonia sin enmendar.

Finalmente se determin la sensibilidad de los aislamientos evaluados mediante laescala propuesta por Shattock (1988) que se presenta en la Cuadro 2.

Cuadro 2. Escala de sensibilidad propuesta por Shattock.

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Sensibles (S): Menor del 10% del crecimiento del testigoIntermedio (I): Entre 10 y 60% del crecimiento del testigoResistente (R): Mayor del 60% del crecimiento del testigo

5.6 ANLISIS ESTADSTICO

Para determinar la significancia estadstica de los tratamientos se utiliz la tcnicade anlisis de varianza (ANOVA) con un nivel de significancia del 5% (P = 0,05). Elanlisis de resultados fue realizado con apoyo de programa estadsticoSTATGRAPHICS Plus 5,0 (Statistical Graphics Corp.19942000).

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6. RESULTADOS Y DISCUSIN

6.1 EXTRACCIN DEL ACEITE ESENCIAL

Las condiciones de operacin del equipo de extraccin y el rendimiento obtenidose presentan en la Cuadro 3. El rendimiento se calcul a partir de la cantidad deaceite esencial obtenido por unidad msica de materia prima seca en trminosporcentuales (g de aceite/100 g de materia prima).

Cuadro 3. Condiciones de extraccin del aceite esencial de organo y rendimientoobtenido.

Tiempo (h) DensidadLecho (g/L)Presin devapor (psi)

Rendimiento% p/p

2,0 80,0 0,32 3,27

Con la extraccin por arrastre con vapor a nivel de planta piloto se obtuvo unrendimiento de 3,27% (p/p) de aceite esencial de organo extrado el 8 de Octubrede 2009, con el cual se realizaron todos los ensayos de esta investigacin.

6.1.1 Anlisis cromatogrfico. Para la identificacin de los compuestos delaceite esencial de organo se utiliz cromatografa de gases acoplada aespectrometra de masas (GC-FID). Los constituyentes del aceite se identificaroncon base en sus patrones de fragmentacin y sus ndices de retencin, utilizandoel ndice de Kovats segn la siguiente frmula:

)7(loglogloglog100

trntrNtrntrx

nNnIK

Donde: IK = ndice de Kovats.n = nmero de carbonos de la parafina anterior.N = nmero de carbonos de la parafina posterior.trx = tiempo de retencin del compuesto a identificar.trn = tiempo de retencin de la parafina anterior.trN = tiempo de retencin de la parafina posterior.

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Los ndices de Kovats se calculan teniendo en cuenta los tiempos de retencin deuna serie homloga de hidrocarburos desde C8 hasta C25, analizados en elcromatgrafo de gases bajo las mismas condiciones operacionales que los aceitesesenciales, empleando generalmente columnas con fases estacionarias polar yapolar (Celis et al., 2007).

El valor arrojado en la ecuacin para cada compuesto se lo compar con tablas dendice de Kovats estndar en la columna DB-5.

En la Fig. 6 se muestra el perfil cromatogrfico obtenido para la muestra de aceiteesencial de organo y en la Cuadro 4 la composicin con los porcentajes de rearelativa.

Figura 6. Perfil cromatogrfico del aceite esencial de organo.

Cuadro 4. Composicin del aceite esencial de organo (L. origanoides Kunth)extrado por arrastre con vapor.

N pico T. retencin % rea IK e Compuesto1 11,258 0,393 927 Tricicleno2 11,566 0,343 934 -pineno3 12,291 0,031 951 Canfeno4 13,549 0,049 977 -pineno

50

5 14,266 3,095 991 Mirceno6 14,899 0,339 1004 Etil hexanoato

Cuadro 4. (continuacin)

N pico T. retencin % rea IK e Compuesto7 15,424 1,141 1017 1,4-Cineole8 15,982 10,509 1031 -Cimeno9 16,257 0,142 1038 1,8Cineole10 16,707 0,077 1048 Fenil acetaldehdo11 17,324 2,914 1062 -Terpineno12 17,849 0,125 1073 -Cresol13 18,349 0,087 1084 Terpinoleno14 18,599 0,095 1089 Guaiacol15 19,090 0,411 1099 Etil Heptanoato16 24,290 0,862 1232 Citronolol17 27,757 73,698 1329 Timol18 28,906 0,882 1358 Eugenol19 31,456 1,829 1425 ionone20 31,740 0,072 1433 Cariofileno21 32,031 0,061 1442 Erucin22 32,248 0,746 1448 Acetona geranilo23 32,765 1,136 1463 -cariofileno24 33,59 0,242 1487 germacrenoD25 31,631 0,284 1430 (E) -bergamotene26 37,373 0,283 1587 Guaiol27 38,248 0,155 1572 Oxido de Cariofileno

En la Cuadro 4 se observa que los componentes mayoritarios presentes en elaceite esencial de organo utilizado en este estudio son en su orden: timol(73,698%), -cimeno (10,509%), mirceno (3,095%) y -terpineno (2,914%).

Como en la mayora de los metabolitos secundarios presentes en las plantas, seha demostrado que la composicin de los compuestos del aceite esencial delorgano se ve afectada por las condiciones edafolgicas y ambientalesexperimentadas durante el crecimiento de la planta, entre ellas las caractersticasdel suelo, duracin de la luz solar, temperatura, estrs de agua, etc., otro factordeterminante en la composicin de los metabolitos es la edad de la planta (DosSantos et al., 2004).

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Las variaciones en la composicin qumica de metabolitos secundarios en plantasde la misma especie, ha conducido a designar quimiotipos (chemotypes), as porejemplo Castaeda et al., (2007) estudiaron la composicin qumica de los aceitesesenciales de las hojas de 10 plantas aromticas colombianas, entre ellas L.origanoides, encontrando dos quimiotipos para el aceite esencial de esta especie.El quimiotipo A (tpico) cuyos componentes mayoritarios fueron: carvacrol (36,6%),-cimeno (14,0%), -terpineno (13,3%), timol (9,1%), y -terpineno (3,8%);mientras que, para el quimiotipo B (atpico) los componentes mayoritarios fueron:-cimeno (15,7%), trans--cariofileno (9,4%), -felandreno + -3-careno (8,7%),limoneno (6,9%) y -felandreno + eucaliptol (6,8%).

Celis et al., (2007), realizaron un estudio comparativo de la composicin yactividad biolgica de los aceites esenciales extrados de Lippia alba, Lippiaoriganoides y phyla (Lippia) dulcis, especies de la familia Verbenaceae,encontrando que el aceite de Lippia origanoides estaba constituido principalmentepor hidrocarburos monoterpnicos (37%) y monoterpenoides (56%), siendo timol(14,41%) y carvacrol (32,88%) los metabolitos ms abundantes, junto con susprecursores biosintticos p-cimeno (10,92%) y -terpineno (11,78%).

Oliveira et al. (2005), estudiaron la composicin del aceite esencial de hojas deLippia origanoides HBK (procedentes del norte de Brasil) extrada porhidrodestilacin, encontrando como componentes principales carvacrol (33,5-42,9%), -terpineno (8,0-10,5%), timol (5,1-8,4%), timol de metilo (6,1-8,7%) y -cimeno (11.9-15,8%).

Los resultados obtenidos en este estudio en cuanto a la composicin del aceiteesencial del organo silvestre del Alto Pata difieren de los quimiotipos reportadospor Castaeda et at., (2007) sin embargo coinciden con los reportados en eltrabajo de Ruiz et al., (2007), quienes analizaron los extractos de dos quimiotiposde Lippia origanoides, encontrando como componentes mayoritarios en elquimiotipo reportado como quimiotipo II, timol (56,3%), -cimeno (11,8%) y -terpineno (7,3%).

Como se mencion antes, estas diferencias en la composicin qumica de losaceites esenciales estn relacionadas con el estado y procedencia de la planta,las condiciones geobotnicas, y agrcolas de su cultivo, las condiciones climticas,as como tambin variables en el proceso de extraccin de los aceites.

Los compuestos fenlicos han sido foco de numerosos estudios por lasactividades antioxidante y antibacteriana que demuestran tener, y se ha

52

encontrado que, dada su estructura qumica, el timol es ms efectivo que elcarvacrol (Celis et al., 2007), lo que resalta el gran potencial de aprovechamientoindustrial que podra tener el aceite esencial del organo silvestre del Alto Pata,ya que su contenido de timol (73,69%) es mucho mayor que el encontrado enotros quimiotipos de la misma especie. En la Fig. 7 se presenta la estructuramolecular del timol.

Figura 7. Estructura molecular de timol (Celis et al., 2007).

6.2 EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE

6.2.1 Ensayo de DPPH.

6.2.1.1 Ensayo DPPH con aceite esencial de organo Lippia origanoidesKunth. Se trabaj la muestra de aceite de organo en las concentracionesdescritas en la seccin 5.3.1 de 12,5 200 L/mL y las muestras de cidoascrbico, BHT y BHA en concentraciones de 0,0085 0,102 mM, para hacer lascomparaciones respectivas. La razn por la cual se trabajaron los antioxidantesqumicos en menores concentraciones que las del aceite en estudio es porqueestos compuestos qumicos se conocen por su naturaleza antioxidante y no sehace necesario comprobar su poder, sino que se usan como parmetroscomparativos frente a la muestra de estudio para tener resultados concluyentesdel aceite de organo respecto a su actividad antioxidante.

Con el propsito de poder comparar los resultados de este trabajo con loobtenidos en otros similares, se decidi estandarizar las unidades, por tanto, todaslas concentraciones se trabajaron en mg/mL.

Se prepararon soluciones de DPPH a diferentes concentraciones desde 0 hasta0,025 mM y se midi la absorbancia de cada una de ellas a 516 nm en elespectrofotmetro. En la Fig. 8, se puede observar la representacin de laabsorbancia media de tres replicados frente a la concentracin, stos datos semuestran en la Cuadro 5; los resultados se ajustaron mediante el mtodo de

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mnimos cuadrados a una recta cuya ecuacin se us para obtener los valores dela concertacin de DPPH.

Cuadro 5. Valores de absorbancia para diferentes concentraciones de DPPH.CDPPH(mM)

CDPPH(mg/mL) Abs (516nm)

0,0 0,0 0,00,0025 9,858*E-4 0,02500,0050 1,971*E-3 0,05050,0075 2,957*E-3 0,07100,0100 3,943*E-3 0,09760,0175 6,900*E-3 0,16560,0250 9,858*E-3 0,2416

Figura 8. Recta de calibracin de DPPH.

Para la correccin de la absorbancia se prepararon las muestras en lasconcentraciones mencionadas, se tomaron 3 mL de cada disolucin y se hicieronreaccionar con 30 L de aceite de organo, a continuacin se dispusieron en lascubetas del espectrofotmetro y se midi la absorbancia cada 5 minutos hasta laestabilizacin de la reaccin. Tambin se tomaron 3 mL de la solucin de DPPH yse midi la absorbancia cada 5 minutos del mismo modo que la muestra comocontrol. Se observ que a lo largo del tiempo, la absorbancia inicial del DPPH nose mantena, sino que iba disminuyendo. Por esta razn a la absorbancia de lasmuestras a tiempo t se sum la absorbancia perdida por el DPPH control almismo tiempo t.

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La ecuacin presentada en la Fig. 8, es la relacin matemtica entre el valor deabsorbancia y la concentracin de DPPH en el medio, con esto se logrdeterminar por extrapolacin el valor de la concentracin de DPPH (mg/mL) acualquier valor de absorbancia ledo para la muestra evaluada. Entonces se tienela ecuacin de calibracin de DPPH: Abs516nm=24,298*CDPPH+0,007 (8)

La muestra se prepar en diferentes concentraciones 12.5, 50, 87.5, 125, 162.5 y200 L/mL; estos valores se trasformaron a mg/mL. Para ello se determin ladensidad del aceite de organo por picnometra, siendo el promedio de tresmediciones igual a 0,9546 g/mL; entonces las concentraciones anteriorescorresponden a: 11.93, 47.73, 83.52, 119.32, 155.12 y 190.91 mg/mL. (ANEXO A).

Para determinar la cintica de reaccin del aceite esencial de organo se tom elvalor promedio de la absorbancia de tres ensayos, se corrigi con el valor de laperdida de absorbancia del control y los resultados se extrapolaron en la recta decalibracin de DPPH, entonces se obtuvo la concentracin de DPPH en cadatiempo CDPPH (t=t). Posteriormente, aplicando la ecuacin (4) se obtuvo elporcentaje de DPPH remanente (%DPPH rem) el cual se grafic contra el tiempopara cada una de las concentraciones, para obtener la cintica de la reaccin,como se muestra en la siguiente Fig. 9.

Figura 9. Porcentaje de DPPH remanente respecto al tiempo para diferentesconcentraciones de aceite esencial de organo.

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En la Fig. 9 se observa que el aceite de organo presenta gran actividadantioxidante en los primeros 10 minutos de reaccin y que alcanza a estabilizarseentre los 15 y 20 minutos en las muestras mas concentradas y entre los 30 y 40minutos en las muestras menos concentradas; para todas las concentraciones seaprecia que aproximadamente a los 45 minutos la reaccin se ha estabilizado, portanto, se eligi este tiempo como punto final de la reaccin, es decir, como tiempoestacionario.

El porcentaje de radicales libres DPPH remanentes a los 45 minutos para cadauna de las concentraciones de aceite esencial probadas, (Cuadro 6) fuetransferido a un grfico de porcentaje de DPPH remanente en el medio dereaccin en funcin de la concertacin del aceite en tiempo estacionario, como semuestra en la Fig. 10.

Cuadro 6. Porcentaje de DPPH remanente a diferentes concentraciones deaceite esencial de organo.

Concentracinmg/mL % DPPHrem

11,9 21,2447,7 19,2683,5 16,81119,3 15,61155,1 12,46190,9 10,09

Figura 10. Porcentaje de DPPH remanente en funcin de las concentraciones deaceite de organo evaluadas.

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En la Fig. 10 se observa que la disminucin del porcentaje DPPH remanentesigue una tendencia lineal, y por regresin por mnimos cuadrados se obtiene unarecta cuya ecuacin es: %DPPHrem = -0,062*CAEO + 22,12 (R2=0.997), con laconcentracin aceite de organo expresada en mg/mL. De la ecuacin de la curva,se obtiene el valor EC50, el cual es la concentracin de aceite de organo quecorresponde con el 50% DPPH remanente, sin embargo, para este caso,matemticamente y grficamente no se pudo encontrar debido a que lasconcentraciones de aceite de organo empleadas mostraron una actividadantioxidante tan poderosa que, en todos los casos, el porcentaje de DPPHremanente fue menor al 25%, haciendo imposible encontrar el valor EC50 dentrodel intervalo de concentraciones probadas experimentalmente.

Se podra afirmar que la EC50 para el aceite esencial de organo silvestre del AltoPata, es decir, la cantidad de aceite esencial necesaria para reducir laconcentracin inicial de radical libre DPPH en un 50%, es inferior a 11,9 mg/mL.

Esta actividad antioxidante se refleja en el cambio de color del violeta quepresenta el DPPH al amarillo que representa la accin del antioxidante sobre elradical libre; en el ensayo del aceite, este suceso, fue evidente y proporcional a laconcentracin de la muestra como se muestra en la Fig. 11.

Figura 11. Cambio colorimtrico del DPPH, a diferentes concentraciones deaceite de organo.

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Trabajando con los mismos valores de absorbancia que permitieron elaborar laFig. 9 y Fig. 10, se elabor tambin la figura de porcentaje de inhibicin, segn laecuacin (5) como se muestra a continuacin.

Figura 12. Porcentaje de inhibicin con relacin al tiempo para diferentesconcentraciones de aceite esencial de organo.

La Fig. 12 muestra que se logra mayor capacidad de inhibicin en lasconcentraciones de AEO ms elevadas. Entonces, segn la Fig. 9 y Fig. 12 amayor concentracin de aceite de organo menor porcentaje de DPPHremanente y mayor porcentaje de inhibicin; en las concentraciones mas bajashay menor porcentaje de inhibicin y la reaccin tarda entre 5 y 15 minutos msque en las reacciones con mayor concentracin de AEO; no obstante, se alcanzanbuenos porcentajes de inhibicin.

La inhibicin de radicales libres DPPH con las concentraciones de AEOevaluadas (11,9 a 190,9 mg/mL) alcanz porcentajes entre 77,9% y 88,9%, entiempo estacionario, como se muestra con mayor claridad en la Cuadro 7 y la Fig.13.

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Cuadro 7. Porcentaje de inhibicin a diferentes concentraciones de aceite esencialde organo en el tiempo estacionario.

Concentracin mg/mL % I Ts11,9 77,96547,7 79,94483,5 82,292119,3 84,393155,1 86,572190,9 88,915

Figura 13.