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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUCUMÁN
Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia
Tesis Doctoral
“Procesos de biodecoloración de efluentes
coloreados simulados y reales”
Lic. María del Milagro Rosales Soro
2018
UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUCUMÁN
Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia
HONORABLE CONSEJO DIRECTIVO
Mag. Adriana Correa Zeballos
Dr. Manuel Javier Aybar
Dra. Viviana Andrea Rapisarda
Bioq. Esp. Ana Verónica Oldano
Dra. Ana Lucrecia Iruzubieta Villagra
Dra. María Antonieta Gordillo
Bioq. Esp. Vanesa Estela Quiroga
Sr. Mario Rodríguez
Sr. Joaquín Hernán Vargas
Srta. Elizabeth Abigail Gutiérrez
Srta. Karen Nahir Ríos
DECANO
Dr. Edgardo Hugo Cutin
VICE-DECANA
Dra. Inés del Carmen Ramos
SECRETARIA DE ASUNTOS ACADEMICOS
Dra. Marta Elena Cecilia
JEFA DEL DEPARTAMENTO POSGRADO
Lic. Marta Inés Quinteros
DEPARTAMENTO DE POSGRADO
AUTORIDADES:
DIRECTOR:
Dr. Sergio Enrique Pasteris
CONSEJO TITULAR:
Dra. Inés del Carmen Ramos
Dra. María Carolina Navarro
Dra. María Cristina Gaudioso
Dra. Paula Andrea Vincent
Dra. María Cristina Rubio
Suplentes
Mag. María Graciela Benzal
Dra. Clara del Valle Silvia de Ruiz
Dra. María Inés Nieva Moreno
Dra. Claudia Alejandra Crespo
Dra. María Angélica Véliz
REPRESENTANTE DE POSGRADO
ANTE LA SECRETARÍA DE POSGRADO DE LA UNT
Dra. Paula Andrea Vincent
TRABAJO DE POSGRADO PARA LA OBTENCIÓN DEL
GRADO ACADÉMICO SUPERIOR DE DOCTORA EN
BIOQUIMICA
CARRERA DE DOCTORADO EN BIOQUIMICA
Acreditado y Categorizado A ante la
Comisión Nacional de Acreditación Universitaria (CONEAU)
Resolución nº: 732/00
Acreditado y Categorizado A ante la
Comisión Nacional de Acreditación Universitaria (CONEAU)
Resolución nº: 489-CONEAU-12
Director:
Dr. Manuel Javier Aybar
Comité Académico:
Dra. Aida Ben Altabef
Dra. Gladis Susana Álvarez
Dra. Inés del Carmen Ramos
Dra. Roxana Beatriz Medina
Dr. Raúl Armando Salomón
TRABAJO DE POSGRADO TITULADO:
“Procesos de biodecoloración de efluentes
coloreados simulados y reales”
TESISTA
Lic. María del Milagro Rosales Soro
DIRECTORA
Dra. Lucía I. Castellanos de Figueroa
CODIRECTOR
Dr. Hipólito F. Pajot
COMISION DE SUPERVISION:
Dra. Claudia S. Benimeli
Dra. María Cristina Rubio
Este trabajo de Tesis Doctoral se realizó en:
Planta Piloto de Procesos Industriales Microbiológicos
PROIMI-CONICET
Con el apoyo financiero de:
Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET)
Agencia Nacional de Promoción Científica y Técnica (ANPCyT)
Consejo de Investigaciones de la Universidad Nacional de Tucumán
(CIUNT)
Agradecimientos
A mi directora de tesis, Dra. Lucía Castellanos, por darme la posibilidad de llevar a
cabo mi tesis en PROIMI, por confiar en mí siempre y por todo el apoyo y dedicación
en estos cinco años.
A mi codirector, Dr. Hipólito Pajot, por toda la enseñanza y formación brindada
durante todo este tiempo lo cual hizo posible el desarrollo de un trabajo productivo.
Gracias por alentarme siempre, por transmitirme seguridad y confianza y
principalmente por la libertad brindada todo este tiempo. Siempre voy a estar muy
agradecida.
A las Dras. Claudia Benimeli y Cristina Rubio, miembros de la Comisión de
Supervisión de Tesis, por sus sugerencias y aportes durante cada reunión y por el
compromiso con mi trabajo de tesis.
Al Dr. Osvaldo Delgado, por su contribución para la realización de los últimos
ensayos de este trabajo.
A los investigadores del laboratorio 28, Silvana, Pablo y Carlos, muchas gracias por
todos los consejos que me brindaron, siempre me ayudaron mucho.
A Maruan, Leo y Ale que me ayudaron durante una etapa de este trabajo, muchas
gracias por la paciencia que me tuvieron y las ganas de trabajar.
A mis amigos y compañeros del laboratorio, Eli, Anahí, Elías, Caro, Vicu, Nati,
Pablo y a mis amigas de cafetín, por su predisposición en todo momento, por ayudarme
en todo y contenerme cuando más lo necesitaba. Aprendí lo valioso que es trabajar con
amigos.
Gracias a todo el personal de PROIMI, pasantes, becarios, técnicos e investigadores,
por la buena onda de todos los días. Especialmente gracias a Turi, Julia y Andrea.
A mi mamá y mis hermanos, por bancarme siempre, dándome fuerzas cuando más lo
necesitaba. Por su cariño de todos los días y por ser los pilares de mi vida.
Y a mi papá, esta tesis es mi regalo para vos. Gracias por enseñarme que en la vida
se puede conseguir todo con esfuerzo, por ser mi ejemplo a seguir, porque vos
enseñabas con el ejemplo y no con palabas. Te extraño todos los días de mi vida.
Resumen
Las industrias textiles consumen grandes cantidades de colorantes sintéticos y
generan importantes volúmenes de efluentes líquidos coloreados. Por otra parte, la
vinaza es el principal subproducto resultante de la obtención de bioetanol, un efluente
de color marrón intenso. El destino final de ambos efluentes son los cuerpos de agua,
los cuales causan el bloqueo de los procesos fotosintéticos en medios acuáticos,
produciendo un daño en el medio ambiente.
Con el fin de eliminar el efecto perjudicial de estos contaminantes se han utilizado
algunos tratamientos físicos y químicos, sin embargo, son generalmente costosos y
producen grandes cantidades de lodos y polución secundaria. Una alternativa es el
tratamiento biológico de estos efluentes. La biodecoloración utilizando
microorganismos con metabolismo oxidativo se considera promisoria ya que es
beneficiosa para el medio ambiente y permite evitar la formación de aminas aromáticas
cancerígenas a partir de los colorantes.
En este trabajo se evaluó el tratamiento de colorantes textiles, un efluente textil y de
vinaza por diferentes bioprocesos. En primer lugar, se utilizaron cultivos en medio
líquido de Trichosporon akiyoshidainum HP-2023 usando células en crecimiento en
suspensión. Los resultados observados fueron comparados con los obtenidos al utilizar
la levadura en crecimiento inmovilizada en perlas de alginato de calcio. Además, se
produjeron agregados enzimáticos reticulados (Cross-linked enzymes aggregates,
CLEAs) con actividad decolorante, a partir de cultivos de T. akiyoshidainum HP-2023
y Trametes sp. #5, aislado de un efluente textil.
Los tres tratamientos fueron efectivos tanto en la decoloración de colorantes textiles
como en la decoloración de vinaza de caña de azúcar. Así, la decoloración de
colorantes superó el 90% en 6 h de cultivo y la de vinaza alcanzó el 40% en 36 h. En
todos los casos se demostró una reducción significativa de la toxicidad de los efluentes
tratados. A su vez, los agregados enzimáticos con actividad lacasa demostraron ser
capaces de decolorar diferentes colorantes textiles y vinaza, pero en volúmenes
menores.
La decoloración de colorantes textiles y vinazas por células de T. akiyoshidainum
HP-2023 inmovilizadas en perlas de alginato de calcio fue el bioproceso más
prometedor, ya que
fue más rápido y permitió disminuir de manera más marcada la toxicidad inicial de los
efluentes. Se demostró además que el sistema puede ser reutilizado con éxito en cuatro
ciclos sucesivos, con una decoloración mayor al 90% para el colorante Negro Reactivo
5, una mezcla de cuatro colorantes azoicos y un efluente textil y una decoloración del
40% para el efluente vinaza.
El proceso fue escalado a volúmenes de 3 L, en biorreactores instrumentados, con
porcentajes y velocidades de decoloración similares a los registrados en ensayos en
lotes.
Los resultados obtenidos en este trabajo permiten proponer el uso de T.
akiyoshidainum HP 2023 inmovilizada en perlas de alginato de calcio para el
tratamiento eficiente de efluentes coloreados como una herramienta eco-amigable con
el fin de reducir el impacto ambiental negativo causado por los efluentes industriales
coloreados.
Palabras Claves: Biodecoloración, Colorantes textiles, Vinaza.
Abstract
The textile industries consume large quantities of synthetic dyes and generate great
volumes of colored liquid effluents. Another colored effluent is vinasse which is the
main product resulting from bioethanol production and possesses an intense dark brown
colour. The final destination of both effluents is water bodies, where cause the blockage
of photosynthetic processes in aquatic organisms, generating damage to the
environment.
In order to abolish the detrimental effect of these contaminants some physical and
chemical treatments have been used. Nevertheless, they are usually expensive and
generate large amounts of sludge and secondary pollution. Thus, biological treatments
have come to light as an alternative of the traditional approaches. Biodecolorization by
microorganisms with oxidative metabolism is especially promising since it is beneficial
for the environment and allows to avoid the formation of carcinogenic aromatic amines
from the dyes.
In this work, the treatment of textile dyes, textile effluent and vinasse was evaluated
by different bioprocesses. First, cultures in liquid medium of Trichosporon
akiyoshidainum HP-2023 were used as suspended growing cells. The observed results
were compared with those obtained by using the immobilized yeast in calcium alginate
beads. In addition, cross-linked enzymes aggregates (CLEAs) with decolorizing
activity were produced from cultures of T. akiyoshidainum HP-2023 and Trametes sp. #
5, isolated from a textile effluent.
All treatments showed to be effective in the decolorization of both textile dyes and
sugarcane vinasse. Textile dyes decolorization exceeded 90% in 6 h of cultivation and
vinasse decolorization reached 40% in 36 h. Moreover, a significant reduction in the
toxicity of the treated effluents was demonstrated when employing the different
strategies. In addition, enzymatic aggregates exhibiting laccase activity proved to be
able to decolorize different textile dyes and vinasse albeit using smaller volumes.
Decolorization of textile dyes and vinasse by immobilized T. akiyoshidainum HP-
2023 cells in calcium alginate beads depicted the most promising bioprocess, since it
was faster and allowed decreasing more noticeably the initial toxicity of the effluents.
Furthermore, it was demonstrated that the system can be successfully reused in four
successive cycles, getting decolorization values greater than 90% for the Reactive
2
Black 5 dye along with a mixture of four azo dyes and textile effluent and 40% for the
vinasse effluent.
The process was scaled to volumes up to 3 L, in instrumented bioreactors, reaching
percentages and decolorization speeds similar to those registered in batch essays.
The results herein obtained prompt the use of immobilized T. akiyoshidainum HP
2023 in calcium alginate beads for the efficient treatment of colored effluents as an eco-
friendly tool in order to reduce the negative environmental impact caused by colored
industrial effluents.
Keywords: Biodecolorization, Textile Dyes, Vinasse
INTRODUCCIÓN GENERAL 1
I.1 Contaminación ambiental: efluentes líquidos coloreados ................................. 1
I.2 Efluentes Textiles .................................................................................................. 2
I.2.1 Efectos ambientales de los efluentes textiles industriales ............................. 3
I.2.2 Características y composición de efluentes textiles ....................................... 4
I.2.3 Estadística de uso y liberación de efluentes textiles ...................................... 5
I.2.4 Colorantes ......................................................................................................... 6
I.3 Vinaza ................................................................................................................... 13
I.3.1 Bioetanol .......................................................................................................... 13
I.3.2 Caracterización y composición química de la vinaza ................................. 13
I.3.3 Efectos ambientales de la vinaza ................................................................... 15
I.3.4 Estadística de uso y liberación de vinazas. Legislación Ambiental ........... 15
I.3.5 Compuestos coloreados en vinazas ............................................................... 16
I.4 Mecanismos de remoción del color .................................................................... 17
I.4.1 Tratamientos físicos y químicos de remoción del color .............................. 18
I.4.2 Tratamientos biológicos de remoción del color ........................................... 20
Objetivo general .................................................................................................................. 23
Objetivos específicos ........................................................................................................... 23
CAPÍTULO I ...................................................................................................................... 24
Bioproceso 1: Cultivo de Trichosporon akiyoshidainum HP-2023 para la
decoloración de colorantes textiles y vinaza ..................................................................... 24
1.1 Introducción .................................................................................................................. 25
1.1.1 Decoloración de colorantes textiles mediada por levaduras ........................ 25
1.1.2 Decoloración de vinaza mediada por levaduras ........................................... 28
1.1.3 Enzimas involucradas en la decoloración de vinazas y colorantes textiles 28
1.1.3.1 Enzimas azoreductasas involucradas en la decoloración ........................ 29
1.1.3.2 Enzimas peroxidasas involucradas en la decoloración ............................ 29
1.1.3.3 Enzimas fenol oxidasas involucradas en la decoloración ........................ 30
1.2 Materiales y Métodos ................................................................................................... 32
1.2.1 Estrategia experimental .................................................................................. 32
1.2.2 Microorganismo ............................................................................................... 32
1.2.3 Medio de cultivo estándar optimizado para decoloración ........................... 33
1.2.4 Biomasa de Trichosporon akiyoshidainum HP-2023 ..................................... 33
1.2.5 Medios de cultivo y efluentes utilizados ......................................................... 33
1.2.5.1 Medio de cultivo con colorantes textiles ................................................... 33
1.2.5.2 Efluentes textiles ......................................................................................... 35
1.2.5.4 Vinaza de destilería de alcohol .................................................................. 36
1.2.6 Análisis físico-químico de los efluentes coloreados ....................................... 37
1.2.7 Ensayos en medio líquido: crecimiento y decoloración por células libres de
Trichosporon akiyoshidainum HP-2023 en crecimiento ........................................ 37
1.2.7.1 Decoloración ................................................................................................ 37
1.2.7.2 Determinación de aminas aromáticas totales (AAT) ............................... 38
1.2.7.3 Determinaciones enzimáticas ..................................................................... 38
1.2.8 Bioensayos de toxicidad................................................................................... 39
1.2.8.1 Verificación de la viabilidad de semillas ................................................... 40
1.2.8.2 Determinación de la toxicidad de efluentes y efluentes tratados ............ 40
1.2.9 Reutilización de las células libres de Trichosporon akiyoshidainum HP-2023
durante ciclos sucesivos de decoloración ................................................................ 40
1.2.10 Análisis estadístico ......................................................................................... 41
1.3 Resultados y discusión .................................................................................................. 42
1.3.1 Análisis físico-químico de los efluentes coloreados ....................................... 42
1.3.1.1 Efluente textil real y simulado ................................................................... 42
1.3.1.2 Vinaza .......................................................................................................... 44
1.3.2 Ensayos en medio líquido: crecimiento y decoloración por células libres de
Trichosporon akiyoshidainum HP-2023 en crecimiento ........................................ 46
1.3.2.1 Decoloración de NR5 y la mezcla de colorantes ....................................... 46
1.3.2.2 Decoloración del efluente textil real y simulado ...................................... 52
1.3.2.3 Decoloración de vinaza ............................................................................... 57
1.3.4 Conclusiones parciales .................................................................................... 61
CAPÍTULO II ..................................................................................................................... 62
Bioproceso 2: Inmovilización de Trichosporon akiyoshidainum HP-2023 en perlas
de alginato de calcio para la decoloración de colorantes textiles y vinaza .................... 62
2.1 Introducción .................................................................................................................. 63
2.1.1 Empleo de microorganismos inmovilizados como una alternativa al cultivo
con células libres en crecimiento ............................................................................. 63
2.1.1.1 Inmovilización por agregación celular ...................................................... 64
2.1.1.2 Inmovilización sobre superficies por adhesión ........................................ 64
2.1.1.3 Inmovilización por entrampamiento dentro de una matriz porosa ....... 65
2.2 Materiales y métodos .................................................................................................... 67
2.2.1 Estrategia experimental .................................................................................. 67
2.2.2 Microorganismo y condiciones de cultivo ..................................................... 67
2.2.3 Medios coloreados utilizados .......................................................................... 67
2.2.4 Biomasa de Trichosporon akiyoshidainum HP-2023 ..................................... 68
2.2.5 Método de inmovilización celular .................................................................. 68
2.2.6 Microscopía electrónica de barrido de las perlas de alginato de calcio ...... 68
2.2.7 Ensayos en medio líquido: decoloración por Trichosporon akiyoshidainum
HP-2023 inmovilizada en perlas de CaAlg ............................................................. 69
2.2.8 Determinaciones analíticas ............................................................................. 69
2.2.8.1 Decoloración ................................................................................................ 69
2.2.8.2 Determinación de la concentración de proteínas extracelulares ............ 69
2.2.8.3 Determinación de aminas aromáticas totales (AAT) ............................... 69
2.2.8.4 Determinaciones enzimáticas en medio líquido ....................................... 70
2.2.8.5 Bioensayos de toxicidad .............................................................................. 70
2.2.9 Efectos de diferentes parámetros sobre la decoloración de NR5 por células
Trichosporon akiyoshidainum HP-2023 inmovilizadas en perlas de CaAlg ........ 70
2.2.9.1 Evaluación del efecto de diferentes concentraciones iniciales de
alginato de sodio sobre la decoloración de NR5 .............................................................. 70
2.2.9.2 Evaluación del efecto de la proporción de volumen inicial de
perlas/volumen inicial de medio sobre la decoloración de NR5 ..................................... 70
2.2.9.3 Evaluación del efecto de diferentes velocidades de agitación sobre la
decoloración de NR5 ........................................................................................................... 71
2.2.9.4 Evaluación del efecto de diferentes concentraciones iniciales de NR5
sobre la decoloración .......................................................................................................... 71
2.2.10 Reutilización de las células de Trichosporon akiyoshidainum HP-2023
inmovilizadas en perlas de CaAlg durante ciclos sucesivos de decoloración ...... 72
2.2.10.1 Decoloración de NR5 durante ciclos sucesivos ....................................... 72
2.2.10.2 Decoloración de la mezcla de colorantes durante ciclos sucesivos ....... 73
2.2.10.3 Decoloración del efluente textil real durante ciclos sucesivos .............. 73
2.2.10.4 Decoloración de vinaza durante ciclos sucesivos ................................... 73
2.2.11 Análisis estadístico ......................................................................................... 73
2.3 Resultados y discusión .................................................................................................. 74
2.3.1 Microscopía electrónica de barrido las perlas de alginato de calcio ........... 74
2.3.2 Efectos de diferentes parámetros sobre la decoloración de NR5 por células
Trichosporon akiyoshidainum HP-2023 inmovilizada en perlas de CaAlg .......... 76
2.3.2.1 Evaluación del efecto de diferentes concentraciones iniciales de
alginato de sodio sobre la decoloración de NR5 .............................................................. 76
2.3.2.2 Evaluación del efecto de la proporción de volumen inicial de
perlas/volumen inicial de medio sobre la decoloración de NR5 ..................................... 78
2.3.2.3 Evaluación del efecto de diferentes velocidades de agitación sobre la
decoloración de NR5 ........................................................................................................... 80
2.3.2.4 Evaluación del efecto de diferentes concentraciones iniciales de NR5
sobre la decoloración .......................................................................................................... 81
2.3.3 Reutilización de las células de Trichosporon akiyoshidainum HP-2023
inmovilizadas en perlas de CaAlg durante sucesivos ciclos de decoloración ...... 83
2.3.3.1 Decoloración de NR5 durante ciclos sucesivos ......................................... 83
2.3.3.2 Decoloración de la mezcla de colorantes durante ciclos sucesivos ......... 88
2.3.3.3 Decoloración del efluente textil real durante ciclos sucesivos ................ 92
2.3.3.4 Decoloración del efluente vinaza durante ciclos sucesivos ...................... 95
2.4 Conclusiones parciales ............................................................................................... 100
CAPÍTULO III ................................................................................................................. 101
Bioproceso 3: Inmovilización enzimática mediante la formación de CLEAs para la
decoloración de colorantes textiles y vinaza ................................................................... 101
3.1 Introducción ................................................................................................................ 102
3.1.1 Empleo de enzimas inmovilizadas como una alternativa al cultivo con
células libres inmovilizadas ................................................................................... 102
3.1.2 CLEAs (cross-linked enzyme aggregates) ..................................................... 102
3.1.2.1 Optimización del proceso de formación de CLEAs ............................... 103
3.2 Materiales y métodos .................................................................................................. 105
3.2.1 Muestreo ......................................................................................................... 105
3.2.2 Aislamiento de microorganismos ................................................................. 106
3.2.3 Selección de microorganismos en medio sólido .......................................... 106
3.2.3.1 Determinaciones enzimáticas en medio sólido ....................................... 107
3.2.3.2 Decoloración en medio sólido .................................................................. 107
3.2.3.3 Determinaciones enzimáticas en medio líquido ..................................... 108
3.2.4 Identificación del aislamiento seleccionado ................................................. 108
3.2.4.1 Extracción de ADN genómico total ......................................................... 108
3.2.4.2 Amplificación y secuenciación del ADNr ............................................... 108
3.2.5 Perfil de actividad lacasa en medio sólido ................................................... 109
3.2.6 Producción de lacasas en cultivos sumergidos y en sustrato sólido .......... 110
3.2.6.1 Fermentación en cultivo sumergido ........................................................ 110
3.2.6.2 Fermentación en sustrato sólido .............................................................. 110
3.2.6.3 Caracterización del pH óptimo de acción de la actividad lacasa ......... 112
3.2.7 Formación de CLEAs .................................................................................... 112
3.2.7.1 Selección del precipitante ......................................................................... 112
3.2.7.2 Selección de las condiciones de entrecruzamiento ................................. 113
3.2.7.3 Microscopía electrónica de barrido de los CLEAs ................................ 114
3.2.7.4 Reutilización de los CLEAs: actividad lacasa ........................................ 114
3.2.7.5 Estabilidad de los CLEAs frente a desnaturalizantes químicos e
inactivación térmica ......................................................................................................... 114
3.3 Resultados y discusión ................................................................................................ 118
3.3.1 Aislamiento de microorganismos ................................................................. 118
3.3.2 Selección de microorganismos en medio sólido .......................................... 119
3.3.2.1 Determinaciones enzimáticas en medio sólido ....................................... 119
3.3.2.2 Decoloración en medio sólido .................................................................. 121
3.3.3 Determinaciones enzimáticas en medio líquido .......................................... 123
3.3.4 Identificación molecular del hongo filamentoso #5 .................................... 124
3.3.5 Perfil de actividad lacasa en medio sólido ................................................... 125
3.3.6 Producción de lacasas en cultivo sumergido y en sustrato sólido ............. 126
3.3.6.1 Caracterización del pH óptimo de acción de la actividad lacasa ......... 126
3.3.7 Formación de CLEAs .................................................................................... 128
3.3.7.1 Selección del precipitante ......................................................................... 128
3.3.7.2 Selección de las condiciones de entrecruzamiento ................................. 130
3.3.7.3 Microscopía electrónica de barrido de los CLEAs ................................ 132
3.3.7.4 Reutilización de los CLEAs: actividad lacasa ........................................ 133
3.3.7.5 Estabilidad de los CLEAs frente a desnaturalizantes químicos e
inactivación térmica ......................................................................................................... 134
3.3.7.6 Decoloración con CLEAs ......................................................................... 136
3.4 Conclusiones parciales ............................................................................................... 139
CAPÍTULO IV .................................................................................................................. 140
Escalamiento del bioproceso para la decoloración de NR5 .......................................... 140
4.1 Introducción ................................................................................................................ 141
4.1.1 Escalamiento a biorreactor ........................................................................... 141
4.1.1.1 Reactor de lecho empaquetado ................................................................ 142
4.1.1.2 Reactor de lecho fluidizado ...................................................................... 142
4.1.1.3 Reactor de tanque agitado ....................................................................... 143
4.1.1.4 Reactor de elevación por aire (airlift) ..................................................... 143
4.2 Materiales y métodos .................................................................................................. 145
4.2.1 Biomasa de T. akiyoshidainum HP-2023 ...................................................... 145
4.2.2 Método de inmovilización celular ................................................................ 145
4.2.4 Escalamiento a biorreactor airlift ................................................................ 145
4.2.5 Escalamiento a tanque agitado ..................................................................... 146
4.2.3 Decoloración de NR5 ..................................................................................... 146
4.3 Resultados y discusión ................................................................................................ 148
4.3.1 Escalamiento a biorreactor ........................................................................... 148
4.3.2 Biorreactor airlift ........................................................................................... 149
4.3.3 Biorreactor de tanque agitado ...................................................................... 150
4.4 Conclusiones parciales ..................................................................................... 152
Conclusiones finales .......................................................................................................... 154
Proyecciones ...................................................................................................................... 157
Bibliografía ........................................................................................................................ 159
Producción científica ........................................................................................................ 181
INTRODUCCIÓN GENERAL
1
INTRODUCCIÓN GENERAL
I.1 Contaminación ambiental: efluentes líquidos coloreados
Los efluentes industriales volcados al medio ambiente provocan diferentes impactos
sobre este en función de su naturaleza. En la Tierra se calcula que existe
aproximadamente 1.385.000.000 km3 de agua, de los cuales el 97,3% es salada y el
2,7% restante es dulce. Del total de agua dulce en el planeta, el 77% se encuentra
congelado en los polos y sólo el 23% está efectivamente disponible para nuestras
necesidades (Hounslow 2018). Algunas industrias se caracterizan por liberar grandes
cantidades de efluentes altamente coloreados al ambiente (Anjaneyulu y col., 2005;
Días y col., 2007) (Tabla 1).
El color muchas veces no es considerado una forma de contaminación a pesar de los
daños que provoca en el medio acuático. Los efluentes líquidos coloreados pueden
causar un daño irreparable en los cuerpos de agua debido a procesos de eutrofización de
los cauces o por la actividad tóxica y/o carcinogénica de los compuestos coloreados en
sí mismos. Además, estos efluentes pueden interrumpir los procesos fotosintéticos al
reducir la penetración de la luz visible en los cuerpos de agua (REPAMAR, 1997-98;
Yadav y Chandra 2019). Debido a esto, durante el tratamiento de un efluente coloreado
se debe prestar especial atención a la reducción o eliminación del color (Amaral y col.,
2014).
El color en los efluentes industriales está asociado principalmente a la presencia de
compuestos orgánicos con dobles enlaces conjugados, tales como los colorantes
sintéticos presentes en los efluentes textiles o bien a polímeros de alto peso molecular
como las melanoidinas presentes en las vinazas de destilerías de alcohol. Es por esto
que a pesar que ambos efluentes son de distinta naturaleza, los tratamientos aplicables
para su decoloración son similares. Una alternativa promisoria es el tratamiento
biológico empleando microorganismos con actividad ligninolítica (Lignina Peroxidasa,
Manganeso Peroxidasa, Peroxidasas Versátiles, Tirosinasas y Lacasas.) (Bilal y col.,
2017).
2
Tabla 1. Cantidad de efluentes generados por algunas industrias en m3 Ton-1 y
concentraciones de color (Unidades HAZEN) (modificada de Anjaneyulu y col., 2005)
I.2 Efluentes Textiles
Los colorantes sintéticos son muy utilizados en la industria textil, ya que presentan
numerosas ventajas sobre los colorantes naturales. Entre estas, se destacan la facilidad
de uso y la síntesis relativamente económica, así como también la estabilidad y la
variedad de colores disponibles (Saratale y col., 2009). La industria textil utiliza dos
tercios del mercado total de colorantes sintéticos a nivel mundial y por lo tanto es la
principal fuente emisora de colorantes al medio ambiente (Días y col., 2007).
Durante los procesos de tinción, entre el 2 y el 50% del colorante aplicado se pierde,
terminando en las aguas residuales que se liberan finalmente al medio ambiente (dos
Santos y col., 2007; Forgacs y col., 2004). Los colorantes son visibles en el agua aún en
concentraciones muy bajas (1 mg L-1 en algunos casos) (Stolz, 2001), por lo que
afectan la calidad estética y la transparencia de los cuerpos de agua, lo que conduce al
deterioro del medio ambiente (Wijetunga y col., 2010; Yadav y Chanda 2019).
Además, los colorantes presentes en estos efluentes o bien los productos de su
degradación, por ejemplo, aminas aromáticas, pueden ser tóxicos y/o mutagénicos
(Jayapal y col., 2018).
Los colorantes textiles fueron diseñados para ser estables frente a la luz, a agentes
químicos y a condiciones de lavado, razón por la cual su vida media en los cuerpos de
agua es de alrededor de 50 años, con el consiguiente riesgo de bioacumularse o
biomagnificarse en la cadena trófica. Como ejemplo puede citarse el colorante Azul
Reactivo 19, cuya vida media es de 46 años, a pH 7 y 25 °C (Hao y col., 2000).
Como se dijo anteriormente las industrias textiles consumen grandes cantidades de
agua potable, y en países donde la misma escasea, tales como India y China, este gran
3
consumo de agua se ha convertido en un problema realmente grave (Dos Santos y col.,
2007).
Las industrias textiles típicamente generan 100-150 m3 de efluente por Ton de
producto terminado, con un promedio de 100 Kg de demanda química de oxígeno
(DQO) por Ton de tela producida (Verma y col., 2012). Sin embargo, los métodos para
la reducción de la DQO en estos efluentes están bien establecidos. Por el contrario, la
eliminación del color es a menudo más complicada ya que los colorantes son
considerados compuestos xenobióticos y extremadamente recalcitrantes (Banat y col.,
1996; Pandey, 2007; Kurade y col., 2016).
I.2.1 Efectos ambientales de los efluentes textiles industriales
Los efluentes textiles que son volcados en los cuerpos de agua contienen una gran
cantidad de contaminantes que resultan perjudiciales para el medio ambiente si se
liberan sin el tratamiento adecuado. Estos efluentes pueden causar efectos nocivos tanto
directos como indirectos (Figura 1).
Entre los efectos indirectos se puede nombrar la toxicidad de los colorantes y sus
compuestos de degradación, los cuales generan un fuerte efecto inhibitorio en el
crecimiento de microalgas, plantas acuáticas, microorganismos, peces y mamíferos
(Figura 1) (Dasgupta y col., 2015). Muchos estudios han determinado que dichos
compuestos coloreados pueden sufrir modificaciones químicas, causar eutrofización,
impedir la re-oxigenación en las corrientes receptoras y tener una tendencia a secuestrar
iones metálicos acelerando su genotoxicidad y microtoxicidad (Khaled y col., 2009).
Entre los efectos directos se destacan problemas estéticos ocasionados por el cambio de
color del agua, la contaminación de aguas subterráneas debido a la filtración a través
del suelo y el bloqueo al paso de la luz visible lo que conduce a una disminución en la
concentración del oxígeno disuelto, debido a la restricción que esto ocasiona en la
fotosíntesis (Foo y Hameed, 2010; Yadav y Chandra 2016).
4
Figura 1. Esquema del efecto que causan los efluentes textiles en el medio ambiente
(modificado de Verma y col., 2012).
I.2.2 Características y composición de efluentes textiles
La composición de los efluentes textiles varía según el colorante empleado, las telas
tratadas y los diferentes procesos de tinción usados (Wijetunga y col., 2010).
Estos efluentes varían en color, tipo de colorantes empleados, demanda bioquímica
de oxígeno (DBO), DQO, pH, color, conductividad, etc., por lo que son muy difíciles
de caracterizar. Algunos valores de referencia se observan en la Tabla 2 (Ranganathan
y col., 2007; Khatri y col., 2015; Priya y Selvan 2017).
5
Tabla 2. Rango característico de parámetros físico-químicos en efluentes textiles
(modificado de Khatri y col. 2015; Priya y Selvan 2017).
Además, los efluentes generados durante la tinción de las fibras suelen incluir
hidróxido de sodio y almidón, empleados para fortalecerlas e incrementar la resistencia
a la tensión, el lustre, el brillo, la afinidad por el colorante, etc. Es por esto que dichas
sustancias, por lo general, forman parte de la composición de los efluentes textiles
simulados (O’Neill y col., 1999a y b).
I.2.3 Estadística de uso y liberación de efluentes textiles
En nuestro país aún no existen normativas nacionales referidas específicamente a la
coloración de efluentes, sin embargo, en países como India existen requisitos estrictos
para la descarga de las aguas residuales textiles (Tabla 3). Normalmente los estándares
de descarga de aguas residuales comprenden numerosos parámetros, debido a la
variación en las materias primas utilizadas, procesos y equipos utilizados.
6
Tabla 3. Parámetros permitidos para la descarga de efluentes textiles en India (Holkar
y col., 2016)
I.2.4 Colorantes
I.2.4.1 Historia
El color se define como una respuesta mental al estímulo que una radiación
luminosa visible produce en la retina. Se considera como un concepto psicofísico,
relacionado al mismo tiempo con la psicología del observador, la fisiología de la visión
y con la energía radiante espectral de una fuente luminosa (Adams, 1923).
Todos los compuestos orgánicos absorben energía electromagnética. Aquellos que
absorben energía cuya longitud de onda se encuentra entre 400 y 800 nm (espectro
visible), presentan un color visible. Las sustancias con color que añadidas a ciertos
productos sirven para darle, o color o teñirlas, se denominan colorantes.
Los colorantes naturales son aquellos que se extraen de fuentes primarias de la
naturaleza. Generalmente son polímeros con una amplia variedad de grupos funcionales
y estructuras químicas orgánicas complejas, como ciclos y grupos aromáticos (Han y
col., 2009).
El colorante textil de origen natural más empleado fue el índigo, que se obtiene de
diferentes fuentes. Por ejemplo, a partir de moluscos del género Murex (Murex
brandaris y Murex trunculus) o bien a partir de plantas, principalmente del género
Indigofera, familia de las Fabáceas. Otro colorante textil natural es el carmesí, obtenido
a partir de insectos como el Kermes vermilio. Este colorante fue muy utilizado por las
culturas Maya y Azteca. En la actualidad dicho colorante se produce a partir de
cochinillas originarias de México.
7
A partir de mediados del siglo XIX comenzó la historia de los colorantes sintéticos.
En 1856 William Henry Perkin, mientras intentaba sintetizar quinina, descubrió el
primer colorante sintético, la mauveína. Este pigmento obtenido por síntesis es un
derivado oxidado de la anilina, muy estable frente a condiciones de luz y lavado cuando
se lo emplea como colorante de seda.
En la actualidad, los colorantes sintéticos han reemplazado a los de origen natural en
prácticamente todas las áreas industriales, debido a que presentan una gran variedad de
colores y tonos brillantes, bajo costo de producción, además de su buena solubilidad,
resistencia a la luz solar, al contacto con el agua y al ataque de una variedad de
compuestos químicos (Saratale y col., 2011). Por todo esto resultan sumamente
atractivos para las industrias textiles, de cueros, imprenta y pinturas (Soon y Hameed,
2011).
I.2.4.2 Química de los colorantes
Los colorantes son sustancias orgánicas fluorescentes o de color intenso que
imparten color a una sustancia incolora, mediante una absorción selectiva de luz
(Mansour, 2018).
Aunque antigua, la teoría química del color, que divide la estructura de los
colorantes en grupos cromóforos, auxócromos e hipsocromos, es aún de gran ayuda.
Esta teoría establece que el elemento estructural responsable de la absorción de luz en
la molécula de colorante se denomina grupo cromóforo. Este es un sistema
deslocalizador de electrones con dobles enlaces conjugados. Los grupos cromóforos
más importantes son -C=C, -C=N-, -C=O, -N=N-, -NO2 y -NO.
Algunos grupos sustituyentes incrementan la afinidad del colorante por las fibras, o
bien actúan como dadores o aceptores de electrones, intensificando o modificando el
color del cromóforo por alteración de la energía del sistema electrónico. Estos
sustituyentes son llamados auxócromos. Los grupos auxócromos más importantes son:
hidroxilos y derivados (-OH; -RH), aminos y derivados (-NH2; -NHR; NHR2),
sulfonatos (-SO3H) y carboxilos (-COOH) (Van der Zee, 2002).
I.2.4.3 Clasificación de los colorantes
Se pueden distinguir entre 20 a 30 grupos de colorantes de acuerdo a la estructura
química del cromóforo. Entre ellos, los más importantes industrialmente son los
8
colorantes azoicos (monoazo, diazo, triazo, poliazo), antraquinónicos, ftalocianínicos y
triarilmetánicos (Christie, 2001; Holkar y col., 2016).
La mayoría de los colorantes comerciales se clasifican en términos del color,
estructura y aplicación en el Colour Index International (C.I.), publicado
periódicamente por la Society of Dyers and Colourist y la American Association of
Textile Chemists and Colorists. Esta lista sistemática de estructuras y nombres es el
libro de consulta para la clasificación de colorantes.
Hasta su última actualización, el C.I. lista 27.000 nombres comerciales y 13.000
estructuras diferentes. Cada estructura tiene un nombre genérico y un número C.I., este
número consta de cifras únicas y exclusivas de cada estructura. Suele ir acompañada de
un nombre compuesto por la acción del colorante, su color base y un número adicional.
Los números C.I. se agrupan en base a la naturaleza química de los colorantes (Tabla
4).
Tabla 4. Rango de números asignados en el Colour Index de acuerdo a la estructura
química
*C.I.: Colour Index
I.2.4.4 Toxicidad de los colorantes
Como se explicó anteriormente, los efluentes industriales que contienen colorantes
pueden ser tóxicos debido a la toxicidad de los mismos y de sus productos de
degradación. Por ejemplo, los colorantes reactivos son menos tóxicos para la vida
9
acuática que los colorantes ácidos, básicos y dispersos (Franciscon y col. 2009; Popli y
Patel 2015).
Se han utilizado diferentes bioindicadores para caracterizar la toxicidad de los
colorantes y sus productos de degradación, incluyendo organismos como Daphnia
magna, Vibro fischeri, Lactuca sativa o Selenastrum capricornutum. (Da Silva y col.,
2012). Por ejemplo, Da Silva y col. (2012) informaron sobre la toxicidad de un efluente
que contenía Rojo Congo mediante la prueba de ecotoxicidad con D. magna. El estudio
reveló que el efluente tratado presentó una mayor toxicidad que el efluente de partida.
Otro estudio llevado a cabo con algas determinó que la fotosíntesis (tomada como
medida del crecimiento) no fue inhibida con concentraciones de colorantes menores a 1
mg L-1. En estas condiciones los colorantes más tóxicos fueron los catiónicos (Van der
Zee, 2002). En cuanto a la toxicidad aguda en peces, solo el 2% sobre 3.000 colorantes
analizados tienen valores de concentración letal media (CL50) menores a 1 mg L-1. La
CL50 es la concentración de una sustancia capaz de matar la mitad de la población en
estudio, en un período especificado.
Según O’Neill y col. (1999b), los colorantes más tóxicos son los básicos,
especialmente aquellos de estructura triarilmetánicos. Los test de mortalidad en ratas
mostraron que solo un 1% de 4.461 colorantes comerciales tuvieron valores de CL50
menores a 250 mg Kg-1 de peso corporal (O’Neill y col., 1999b).
I.2.4.5 Colorantes azoicos
Los colorantes azoicos constituyen una de las clases más utilizada en la industria
textil, debido a su estabilidad química, su síntesis comparativamente más sencilla que la
de los otros tipos de colorantes y la amplia gama de colores disponibles (Lang y col.,
2013). Estos tintes pertenecen a la clase de compuestos aromáticos y heterocíclicos que
poseen al menos un enlace azoico (-N=N-) (Figura 2).
10
Figura 2. Estructura química de algunos colorantes azoicos
I.2.4.5.1 Toxicidad de colorantes azoicos
La toxicidad aguda de los colorantes azoicos, de acuerdo con los criterios de la
Unión Europea para la clasificación de sustancias peligrosas, es baja y los valores de
CL50 se encuentran entre los 250-2.000 mg Kg-1 de peso corporal.
No obstante, al romperse el enlace azoico, la degradación de colorantes azoicos
puede llevar a la producción de aminas aromáticas potencialmente tóxicas o
carcinogénicas. Además, se determinó que los mismos colorantes pueden reaccionar
dentro del cuerpo humano con fármacos como la aspirina, induciendo reacciones
alérgicas y asmáticas en personas sensibles (Sarıkaya y col., 2012).
En mamíferos la ruptura del enlace azoico se produce principalmente en las zonas
anaeróbicas del intestino inferior formando aminas aromáticas, aunque otros órganos,
como hígado y riñones, también pueden originar dichas aminas.
Después de su reducción en el intestino, las aminas son captadas por el torrente
sanguíneo y excretadas a través de la orina (Srinivasan y Bhargava, 2004). Así, el signo
típico de toxicidad aguda por aminas aromáticas es el cáncer, especialmente el de
vejiga (Tsuda y col., 2000). La toxicidad de las aminas está muy ligada a su estructura
11
química (Benigni y Passerin, 2002). Existe evidencia del poder carcinogénico de la 2-
naftilamina, sin embargo, la 1-naftilamina es mucho menos carcinogénica. Otro
determinante importante de la toxicidad de las aminas aromáticas es la naturaleza y
posición de sus sustituyentes. La sustitución con grupos nitro, metilo o metoxi, así
como con halógenos suelen aumentar su toxicidad. Mientras que la sustitución con
grupos sulfonatos o carboxilos tienen por lo general el efecto contrario (Chung y col.,
2000).
Por ejemplo, el colorante Rojo Ácido 18 no es mutagénico, mientras que el colorante
estructuralmente similar Rojo Ácido 26 es cancerígeno debido a la diferencia en la
posición del grupo sulfonato (Figura 3). El rojo de metilo (Rojo Ácido 2) (Figura 3) es
mutagénico, y la mayoría de los estudios de degradación microbiana revelan la
formación de N, N-dimetilfenilendiamina, una amina aromática tóxica y mutagénica
que permanece sin cambios en el medio de cultivo (Wong y Yuen, 1998; Sen y col.,
2016). Por lo tanto, para estudiar la viabilidad de cualquier proceso de biorremediación
de colorantes, es importante evaluar tanto la toxicidad de los efluentes como de los
metabolitos formados después del tratamiento.
12
Figura 3. Estructura química de colorantes azoicos
13
I.3 Vinaza
I.3.1 Bioetanol
La producción de etanol a partir de materiales agroindustriales, para su utilización
como combustible, aumentó en los últimos años debido al carácter no renovable de
estos últimos.
El etanol puede ser producido a partir de diversas materias primas con un alto
contenido de carbohidratos. Actualmente en Latinoamérica la mayor parte del bioetanol
se obtiene a partir del jugo o melaza de caña de azúcar (o una mezcla de ambos),
dependiendo de la planta procesadora. En destilerías autónomas, el alcohol obtenido
proviene de la fermentación del jugo de caña mientras que, en las plantas anexadas a un
ingenio azucarero, todo el jugo (o una gran parte del mismo) se deriva generalmente a
la producción de azúcar y la melaza resultante se emplea en la obtención de alcohol
(Moraes y col., 2015).
En Argentina el Gobierno Nacional sancionó la Ley 26.093 en 2006, denominada
“Régimen de Regulación y Promoción para la Producción y Uso Sustentables de
Biocombustibles” la cual establece que a partir del año 2010 las naftas y el gasoil de
consumo interno deben contener al menos un 5% de bioetanol y biodiesel,
respectivamente. En la actualidad dicho porcentaje de etanol en naftas aumentó a
valores cercanos al 10 %. En la provincia de Tucumán, según estimaciones recientes, se
producen anualmente alrededor de 130.000.000 L de alcohol anhidro (Consejo Federal
de inversiones www.cfired.org.ar/Default.aspx?nID=7783). La importancia real del
problema se aprecia si se estima que, por cada litro de alcohol producido, se obtienen
entre 8 y 15 L de vinaza (Mohana y col., 2009).
I.3.2 Caracterización y composición química de la vinaza
La vinaza es un efluente que se caracteriza por tener elevados valores de DBO y
DQO (entre 35.000-50.000 y 100.000-150.000 mg L-1, respectivamente), color marrón
oscuro, pH ácido, altas concentraciones de fosfatos y sólidos disueltos y un olor
desagradable (Ferreira y col., 2010). Está compuesta por un 92% de agua, 3% de
compuestos inorgánicos (potasio, calcio, sulfatos, cloruros, nitrógeno, fósforo, etc.), y
un 5% de compuestos orgánicos de variada composición, entre los que se incluyen
ácidos orgánicos, fenoles, furanos, etc. El volcado de este efluente a ríos o arroyos
genera una diminución en la concentración de oxígeno disuelto en el agua, debido a la
14
oxidación de los compuestos orgánicos, lo cual afecta seriamente al ecosistema (Alkan-
Ozkaynak y Karthikeyan, 2011).
La composición y características de las vinazas pueden variar dependiendo de la
materia prima utilizada en la producción de alcohol (jugo de caña, melaza, etc), de la
eficiencia de los procesos de fermentación y destilación, como así también de las
características inherentes al cultivo de la caña de azúcar, como variedad y maduración
(Fuess y col., 2018). En la Tabla 5 se presentan las principales características de
vinazas generadas a partir de melazas en destilerías de Brasil y Tucumán (Christofoletti
y col., 2013; Ahmed 2016; Valeiro y col., 2017; Vilar y col., 2018).
Tabla 5. Parámetros físicos-químicos de vinazas de Brasil y de Tucumán (adaptado de
España-Gamboa y col., 2012 y Comisión Provincial de Vinazas, 2009).
a Unidad es mg L-1, b % (p/p), * dd: datos no disponibles
Al igual que los efluentes textiles, las vinazas al ser volcadas en diferentes cuerpos
de agua, dañan el medio ambiente, principalmente debido a procesos de eutrofización
de los cauces y a la interrupción de los procesos fotosintéticos en el medio acuático,
como consecuencia de su intenso color marrón.
La descarga de vinazas en los suelos ocasiona un severo impacto ambiental debido a
la pérdida de alcalinidad e inhibición de su capacidad de germinación. Además, puede
15
interrumpir los ciclos biogeoquímicos de muchos elementos esenciales (Chandra y col.,
2018).
I.3.3 Efectos ambientales de la vinaza
El potencial contaminante de las vinazas es aproximadamente 100 veces mayor que
el de las aguas residuales domésticas, principalmente debido a su pH tan bajo (pH: 3,5–
5) y los elevados valores de DBO (excesiva carga orgánica), además de altas
concentraciones de sales y minerales (Mariano y col., 2009; España- Gamboa y col.,
2011).
Entre los efectos ambientales asociados con el vertido de vinazas se puede
mencionar:
I. Sobresalinización de suelos.
II. Sobrecarga orgánica, que conlleva a una disminución en la concentración de oxígeno
disuelto y por lo tanto en la actividad microbiana.
III. Sobrefertilización del suelo, que causa efectos secundarios como la
desestabilización de su estructura, así como la eutrofización de los cuerpos de agua por
escorrentías ricas en nutrientes.
IV. Contaminación con iones específicos (por ej. nitratos y cloruros) y metales tóxicos
(por ej. plomo, cobre y zinc).
V. Acidificación de los suelos y cuerpos de agua.
VI. Interferencia en el proceso de fotosíntesis, ya que el color y la turbidez de las
vinazas impide la penetración de la luz solar en los cuerpos de agua.
VII. Inhibición de la germinación de semillas, reducción del rendimiento de los cultivos
y generación de toxicidad en ambientes acuáticos.
I.3.4 Estadística de uso y liberación de vinazas. Legislación Ambiental
Se sabe que en el año 2013 la producción de las destilerías tucumanas fue de 306
millones de litros de bioetanol (Calzada y Rossi 2014) lo que habría generado alrededor
de 4 mil millones de litros de vinaza.
En Tucumán, la cuenca del río Salí-Dulce se encuentra contaminada a niveles
preocupantes debido a que se la utiliza como vertedero para estos efluentes. La
provincia de Santiago del Estero enfrentó graves daños ecológicos (contaminación de
las aguas y mortandad de peces en el Embalse de Río Hondo) debido a la presencia de
16
vinaza en dicho embalse. Desde el año 2009, la Secretearía de Estado de Medio
Ambiente de la provincia de Tucumán (SEMA) sanciona estas prácticas a través de su
resolución N° 030 y prohíbe explícitamente el volcado de los efluentes industriales sin
tratamiento previo de los mismos, posterior a su obtención
(http://www.sematucuman.gob.ar/web/index.php/31-
normativa/idga/idgapngclosrechidricos/153-iga-pgrh-resolucion030-sema).
I.3.5 Compuestos coloreados en vinazas
Una de las características particulares de las vinazas es su color café oscuro. Este
color se atribuye a la presencia de compuestos con diferentes pesos moleculares,
estructuras y propiedades. Estos compuestos se forman durante el proceso de
industrialización de la caña de azúcar, como resultado de reacciones de caramelización
de azucares, cambios de pH, efectos térmicos y reacciones entre compuestos amino y
carbohidratos (Coca y col., 2004). Los principales colorantes determinados en vinazas
de destilerías de alcohol son melanoidinas, caramelos, productos de degradación
alcalina (derivados del sobrecalentamiento de azucares a altas temperaturas) y
melaninas (Wilkie y col., 2000; España-Gamboa y col., 2011). La formación de
caramelos resulta de la serie de reacciones que ocurren en la deshidratación de los
carbohidratos y su polimerización a altas temperaturas catalizadas por compuestos
ácidos o básicos. Los caramelos no han demostrado tener actividad antimicrobiana, a
diferencia de las melanoidinas. Se ha demostrado que para diversos microorganismos,
una solución con una concentración de melanoidinas de 100
mg L-1 es equivalente a otra de oxitetraciclina con una concentración de 16 mg L-1, por
lo que en un tiempo se consideró a las vinazas como un recurso para el control de
organismos fitopatógenos. Desafortunadamente, este mismo efecto ha provocado
graves problemas de contaminación en el agua (Arimi y col., 2015).
Las melanoidinas son pigmentos que aportan en gran medida el color marrón intenso
en las vinazas. Su estructura varía ampliamente ya que van desde pequeñas moléculas
hasta largos polímeros. Se forman mediante reacciones de Maillard entre azúcares y
grupos amino presentes en los aminoácidos. A su vez, pueden contener moléculas
antioxidantes tóxicas para las poblaciones microbianas existentes en los reactores de
tratamiento de vinazas (Parnaudeau y col., 2008; Ghaly y col., 2014). En la Figura 4 se
observa la estructura de una melanoidina típica.
17
Figura 4. Estructura de una melanoidina producto de la reacción glucosa-glicina
Los compuestos fenólicos también confieren color a la vinaza. Estos compuestos se
liberan durante el procesamiento de la caña de azúcar a partir de la lignocelulosa. En las
vinazas se han detectado ácidos fenólicos, como ácido benzoico (principalmente su
derivado, el ácido gálico) y ácido cinámico (y sus derivados: ácido cumárico, cafeico,
clorogénico y ferúlico). El ácido benzoico, por ejemplo, inhibe el crecimiento de los
microorganismos tanto en tratamientos aeróbicos como anaeróbicos (Díaz y col., 2012).
I.4 Mecanismos de remoción del color
En el tratamiento de efluentes líquidos coloreados, como se mencionó anteriormente,
un objetivo importante es la reducción o eliminación del color, lo cual contribuye
enormemente en la disminución del impacto ambiental negativo sobre los ecosistemas
donde son vertidos (Santos y col., 2008; Gupta y col., 2017). Existen numerosos
procesos físicos, químicos y biológicos usados en el tratamiento de efluentes
coloreados (Forgacs y col., 2004; Eren 2012).
Se conocen varios factores que determinan la aplicabilidad de estas técnicas. Entre
estos, los más importantes son:
• El tipo de compuesto coloreado
• La composición del efluente
• La concentración y el costo de los reactivos químicos utilizados
18
• Los costos operativos (de energía y material)
• La disposición final de los desechos generados
Como regla general cada técnica tiene sus limitaciones y suele ser necesaria la
implementación de más de una para la decoloración completa de un efluente.
I.4.1 Tratamientos físicos y químicos de remoción del color
Las aguas residuales coloreadas se tratan generalmente por procesos físicos o
químicos (Tabla 6). Estos incluyen floculación combinada con flotación, floculación
con Fe(II)/Ca(OH)2, filtración con membrana, coagulación electrocinética, destrucción
electroquímica, intercambio iónico, irradiación, precipitación, ozonización y reacciones
de tipo Fenton, entre otros (Banat y col., 1996; Holkar y col., 2016).
Las principales desventajas de estos métodos son los altos costos y la generación de
contaminación secundaria (Ghaly y col., 2014). Además, generan grandes volúmenes
de lodo y por lo general requieren el agregado de aditivos químicos que son peligrosos
para el medio ambiente (Makertihartha y col., 2017). En la Tabla 6 se mencionan
algunos de estos métodos junto con las ventajas y desventajas de cada uno.
19
Tabla 6. Métodos físico-químicos para el tratamiento de compuestos coloreados:
ventajas y desventajas
20
I.4.2 Tratamientos biológicos de remoción del color
El término biorremediación abarca una amplia variedad de procesos como la
bioadsorción, la biodegradación (aerobia o anaerobia) y diferentes métodos
enzimáticos. Es una técnica atractiva y socialmente aceptada por ser un proceso
respetuoso con el medio ambiente, que genera menor producción de lodos y consume
menor cantidad de agua en comparación a varios métodos físicos/químicos (Hayat y
col., 2015).
Los procesos biológicos son generalmente afectados por factores como el modo de
operación del reactor (lote, lote alimentado, continuo), la temperatura del medio, el pH,
la concentración inicial de colorante/vinaza y la concentración de microorganismos,
además de la presencia de oxígeno en el sistema. Sobre la base del requerimiento de
oxígeno, los métodos biológicos se pueden clasificar en aeróbicos,
anaeróbicos/anóxicos o facultativos o una combinación de estos. La combinación de
métodos anaeróbicos y aeróbicos se implementan típicamente en la práctica real:
primero se utiliza un proceso anaeróbico para tratar la DQO y DBO de los efluentes y
luego un tratamiento aeróbico para eliminar el color residual (Wang y col., 2011; Punzi
y col., 2015)
I.4.2.1 Decoloración por bacterias
El estudio de bacterias que actúan en procesos de decoloración data de los años
1970. Bacillus subtilis fue la primera bacteria reportada en esta temática por Horitsu y
col. (1977). La decoloración bacteriana es normalmente más rápida en comparación
con los sistemas que emplean hongos filamentosos.
En general la decoloración de los colorantes por diferentes grupos de bacterias
ocurre en condiciones anaeróbicas, anaeróbicas y aeróbicas facultativas o aeróbicas. El
mecanismo de degradación bacteriana de los colorantes azoicos implica, por lo general,
la escisión reductiva de los enlaces azoicos (–N=N–) por enzimas con actividad
azorreductasa en condiciones anaeróbicas. Esta reducción da como resultado la
formación de soluciones incoloras que contienen aminas aromáticas potencialmente
peligrosas que pueden ser degradadas aeróbicamente en procesos posteriores (Van der
Zee y Villaverde, 2005; Joshi y col., 2008).
21
La reducción del enlace –N=N– con la consiguiente formación de aminas aromáticas
se representa en la siguiente ecuación:
R-N=N-R + 4e- + 4H+ → R-NH2 + R-NH2
En algunos casos la reducción del enlace azoico en condiciones anaeróbicas no es
específica, ya que se observa la decoloración de un amplio espectro de colorantes con
diversas estructuras. Sin embargo, la velocidad de decoloración depende tanto de la
fuente de carbono y energía como de la estructura del colorante. Así, la decoloración
anaeróbica puede considerarse como un proceso fortuito, donde los colorantes actúan
como receptores de electrones que son aportados por mediadores de la cadena
transportadora de electrones (Stolz, 2001; Lade y col., 2015; Singh y col., 2015).
La decoloración de vinazas de destilerías de alcohol empleando bacterias de los
géneros Bacillus, Lactobacillus y Pseudomonas ha sido investigada por diversos
autores (Nakajima-Kambe y col., 1999; Dahiya y col., 2001; Seruga y Krzywonos
2015; Krzywonos y col., 2017; Wilk y col., 2017).
La digestión anaeróbica con bacterias presenta ciertas ventajas, tales como la
generación de grandes cantidades de biogás, con formación de pocos lodos, un menor
requerimiento de nutrientes (en comparación con los tratamientos aeróbicos) y
reducciones drásticas de las cargas de DBO y DQO. Sin embargo, esta tecnología
presenta una serie de desventajas, asociadas a la estacionalidad de los efluentes, la
inestabilidad del proceso (aumentada por los prolongados tiempos de decoloración) y
una remoción incompleta del color. En el caso de vinazas, se debe a la presencia de
melanoidinas que no pueden degradarse en estas condiciones (España-Gamboa y col
2012; Moraes y col., 2015).
I.4.2.2 Decoloración por hongos filamentosos
Diversos hongos basidiomicetes y ascomicetes han sido utilizados en
biorremediación de efluentes textiles y vinazas debido a su capacidad para decolorar
colorantes y melanoidinas naturales y sintéticas (Agarwal y col., 2010; Pozdnyakova y
col., 2018).
22
Los hongos de la pudrición blanca o White Rot Fungi (WRF) constituyen un grupo
de microorganismos muy apropiados para ser empleados en el tratamiento de efluentes
y degradar diversos compuestos fenólicos (Strong y Burgess, 2008). Esta capacidad se
asocia principalmente a la síntesis y secreción de oxidorreductasas ligninolíticas de baja
especificidad, tales como lignina peroxidasa (LiP), Mn peroxidasa (MnP), o lacasa
(Lac). Este grupo ecofisiológico de hongos cuenta con un potencial intrínseco único
para biorremediar los compuestos coloreados presentes en los efluentes textiles y
vinazas, altamente resistentes a la degradación microbiana (Mohana y col., 2009).
La LiP cataliza la oxidación de compuestos aromáticos no fenólicos, mientras que
MnP y lacasa catalizan la oxidación de compuestos fenólicos (Ali, 2010). De esta
manera, se evita la formación de aminas aromáticas (Li y col., 2009). El WRF más
estudiado, Phanerochaete chrysosporum, mineraliza colorantes textiles y decolora
vinazas hasta en un 50% a través de la síntesis de enzimas que actúan en la degradación
de la lignina. Otros hongos tales como Trametes versicolor, Pleurotus ostreatus,
Bjerkandera fumosa y Thelephora sp., también decoloraron diversas clases de
colorantes y vinazas mediante mecanismos relacionados (Thakkar y col., 2006; Zhao y
col., 2009; España-Gamboa y col., 2015).
La degradación de compuestos aromáticos con hongos filamentosos comienza
cuando alguno de los nutrientes (principalmente C y N) se tornan limitantes
(metabolismo secundario) (Martorell 2014). Esto plantea un problema, ya que por un
lado las enzimas se expresan en condiciones de limitación de nutrientes y por otro,
estos nutrientes son necesarios para el crecimiento del hongo. Además, el
envejecimiento del micelio y el riesgo de contaminación por bacterias en condiciones
no estériles dificulta la utilización de los hongos de pudrición blanca en el tratamiento
de aguas residuales coloreadas (Yang, 2005; Mir-Tutusaus y col., 2018). Como fue
descripto por Martorell (2014), las levaduras poseen ciertas ventajas en comparación
con los hongos filamentosos ya que tienen un crecimiento unicelular más rápido,
pueden ser cultivadas fácilmente en medios económicos y soportan condiciones
ambientales más estrictas, como ser pH’s ácidos y altas concentraciones de sales (Días
y col., 2010).
23
Objetivo general
• Evaluar diferentes bioprocesos para el tratamiento de efluentes textiles simulados
y/o reales y vinazas, mediante el uso de levaduras u hongos filamentosos autóctonos
Objetivos específicos
• Caracterizar fisicoquímicamente efluentes coloreados industriales reales de la
provincia de Tucumán.
• Comparar la biodecoloración en efluentes textiles sintéticos con efluentes
industriales reales.
• Evaluar diferentes bioprocesos de tratamiento de efluentes líquidos coloreados:
➢ Determinar las capacidades de decoloración de levaduras autóctonas en
efluentes coloreados, en términos de la eficiencia, velocidad y capacidad de
eliminación de los colorantes de los mismos.
➢ Determinar la presencia de enzimas ligninolíticas extracelulares producidas
durante el tratamiento de efluentes, tales como peroxidasas, lacasas, tirosinasas
o manganeso-peroxidasas
➢ Medición de la toxicidad de efluentes y de efluentes tratados.
• Escalar el bioproceso, definiendo los sistemas de cultivo y las condiciones
ambientales óptimas para la operación del sistema a nivel de planta piloto
CAPÍTULO I
Bioproceso 1: Cultivo de
Trichosporon akiyoshidainum HP-
2023 para la decoloración de
colorantes textiles y vinaza
25
CAPÍTULO I
Bioproceso 1: Cultivo de Trichosporon akiyoshidainum HP-2023 para la
decoloración de colorantes textiles y vinaza
1.1 Introducción
1.1.1 Decoloración de colorantes textiles mediada por levaduras
Las levaduras exhiben ciertas características atractivas para la decoloración de
efluentes coloreados, ya que tienen un crecimiento unicelular más rápido, pueden ser
fácilmente cultivadas en medios económicos y soportan condiciones ambientales más
estrictas (Días y col., 2010).
Los mecanismos de decoloración de colorantes textiles por levaduras pueden
involucrar adsorción, degradación enzimática o una combinación de ambas (Safarikova
y col., 2005; Safarik y col., 2007, Martorell 2014) (Tabla 7). La adsorción de colorantes
está relacionada al pH del medio, así a pH ácido, la superficie del adsorbente se protona
y adquiere una carga neta positiva lo que aumenta la unión de colorantes aniónicos. Por
el contrario, con pH alcalino, la superficie queda con carga neta negativa y por ende
conduce a la adsorción de colorantes catiónicos. Por ejemplo, Trichosporon
akiyoshidainum HP-2023 adsorbe 60% de Azul Reactivo 221 y 90% de Rojo Reactivo
a pH 2,0; mientras que a pH 7,0 se logra una adsorción del 100% de Azul reactivo 221
(Pajot y col., 2007).
La degradación de colorantes involucra cambios en la estructura molecular de los
mismos y se puede llevar a cabo en condiciones aeróbicas o anaeróbicas (Waghmode y
col., 2011; Martorell 2016). En la Tabla 7 se presentan algunas levaduras utilizadas en
procesos de biodecoloración, junto a los colorantes empleados y los mecanismos
involucrados en el proceso.
Ciertas levaduras ascomicetáceas, como Debaryomyces polymorphus y Candida
tropicalis, decoloraron colorantes reactivos por bioadsorción o biodegradación (Solís y
col., 2012). Se ha reportado que la presencia de colorantes en el medio de cultivo
induce la producción de actividades oxidasa y reductasa en levaduras, tales como MnP,
Tyr (Halaburgi y col., 2011; Aghaie-Khouzani y col., 2012) y NADH-DCIP reductasa
(Waghmode y col., 2011; Solís y col., 2012). Se reportó también la decoloración de un
efluente textil por Galactomyces reessii a través de un mecanismo tal que induce
26
actividad ligninolítica (lacasa y MnP) (Wakil y col., 2017). A su vez, Wakil y col.
(2017) purificaron y caracterizaron la enzima lacasa de levaduras de los géneros
Kluyveromyces y Pichia. Es decir, que la actividad decolorante en levaduras mediante
degradación estaría relacionada a la actividad oxidorreductasa de las mismas (actividad
ligninolítica).
A pesar que se ha descripto la presencia de actividad ligninolítica en levaduras,
existe poca información sobre la presencia de dichas enzimas en levaduras
basidiomicetáceas con capacidad para decolorar, tal como lo hace el género
Trichosporon (Días y col., 2010).
Tabla 7. Levaduras con capacidad decolorante
27
28
1.1.2 Decoloración de vinaza mediada por levaduras
Con respecto a las vinazas, existe muy poca bibliografía respecto al uso de levaduras
en biorremediación de vinazas de destilerías de alcohol. Moriya y col. (1990) llevaron a
cabo un trabajo empleando levaduras floculantes, Hansenula fabianii (Cyberlindnera
fabianii) y H. anómala (Whickerhamomyces anomalus), para el tratamiento del licor de
remolacha azucarera y obtuvieron porcentajes de decoloración y de reducción de
carbono orgánico total de 25,9 y 28,5%, respectivamente.
Sirianuntapiboon y col. (2004) trabajaron en la decoloración de vinaza de destilería
de alcohol con Citeromyces sp. WR-43-6, y obtuvieron un máximo de rendimiento en
la decoloración de 68,91% durante 8 días de cultivo.
Aunque el sistema enzimático relacionado con la decoloración de vinazas con
levaduras aún no se ha descripto completamente parece estar muy relacionado con los
mecanismos ligninolíticos de los hongos de la podredumbre blanca (WRF), de manera
similar a lo que ocurre con los colorantes textiles (Santal y col., 2013). Uno de los
estudios enzimáticos más completos con respecto a la decoloración de melanoidinas
por Coriolus hirsutus implicó la participación de la enzima lacasa, las enzimas
peroxidasas (MnP y MIP) y el H2O2 extracelular producido (Santal y col., 2013).
Georgiou y col. (2016) estudiaron la decoloración de dos tipos de melanoidinas (de un
efluente simulado derivado de la condensación de glucosa y glicina y de un efluente de
melaza real, ambos concentrados en un 10% v/v) utilizando la enzima lacasa de T.
versicolor en su forma libre e inmovilizada, y obtuvieron porcentajes de remoción entre
25 y 50%.
1.1.3 Enzimas involucradas en la decoloración de vinazas y colorantes
textiles
En base a lo descripto previamente, a pesar que los colorantes textiles y
melanoidinas presentan estructuras químicas muy diversas, su degradación por
levaduras y hongos filamentosos se atribuye a la actividad ligninolítica de dichos
microorganismos. Esta actividad enzimática posee dos características importantes: es
una actividad oxidorreductasa y actúa sobre diferentes sustratos (Martorell 2014;
Gerorgiou y col., 2016). Estas enzimas actúan generando radicales libres altamente
reactivos que experimentan una compleja serie de reacciones de escisión espontáneas
que culminan con la ruptura de los enlaces de las moléculas coloreadas. En los procesos
29
de degradación de colorantes azoicos y melanoidinas, entre las enzimas
oxidorreductasas que intervienen se incluyen a: peroxidasas (lignina peroxidasa,
manganeso peroxidasa, peroxidasa independiente de manganeso), fenol oxidasas
(lacasas, tirosinasas, catecolasas) y reductasas (Saratale y col., 2011; Santal y col.,
2013; Georgiou y col., 2016.).
1.1.3.1 Enzimas azoreductasas involucradas en la decoloración
Las azoreductasas (EC 1.7.1.6) son un grupo de enzimas que han sido descriptas
principalmente en la degradación de colorantes azoicos. Estas enzimas catalizan la
ruptura del enlace azoico (-N=N-) por reducción, produciendo las respectivas aminas
aromáticas (productos incoloros) (Ramalho y col., 2004; Pandey y col., 2007; Martorell
2014). Según su mecanismo de acción las azo-reductasas se categorizan como
dependientes o independientes de flavina. Las dependientes de flavinas se clasifican en
base al cofactor que requieren, NADH, NADPH o FADH2, que actúan como dadores
de electrones (Mahmood y col., 2016).
Se demostró que la degradación de los colorantes por las azo reductasas es casi
exclusivamente de naturaleza anaeróbica (Chen y col., 2005). Estas reacciones
requieren la reducción de mediadores redox tales como la riboflavina, el dinucleótido
de flavina (FAD), mononucleótido de flavina (FMN), ácido antraquinona-2,6-
disulfónico (AQDS), ácido antraquinona-2-sulfónico (AQS), para catalizar las
reacciones enzimáticas (Imran y col., 2016a; Imran y col., 2016b). Generalmente el
oxígeno inhibe el mecanismo de reducción y oxida los mediadores redox por lo tanto se
bloquea el mecanismo de reacción (Pricelius y col., 2007; Sen y col., 2016).
1.1.3.2 Enzimas peroxidasas involucradas en la decoloración
Entre las peroxidasas (POX) ligninolíticas se incluyen las enzimas MnP, LiP y
peroxidasa independiente de manganeso (PiMn). Las peroxidasas (EC 1.11.1.x) son en
su mayoría hemoproteínas caracterizadas por la presencia de un grupo prostético hemo
en sus sitios activos. Estas enzimas catalizan reacciones principalmente en presencia de
peróxido de hidrógeno (Duran y col., 2002; Martorell 2014) y presentan tres sitios de
unión al sustrato y un residuo de triptófano expuesto. Las enzimas peroxidasas
ligninolíticas poseen la capacidad para degradar aminas aromáticas, compuestos
aromáticos y fenólicos, por esto, los microorganismos que poseen dicho sistema
30
enzimático constituyen una alternativa atractiva para su empleo en biodecoloración de
efluentes con colorantes textiles y melanoidinas (Singh y col., 2015; Bilal y col., 2017).
Las enzimas LiP y MnP difieren en su mecanismo catalítico. La LiP es oxidada por el
H2O2, y posteriormente la enzima cataliza la oxidación de los compuestos fenólicos y
no fenólicos, promoviendo la producción de los radicales libres correspondientes. La
MnP oxidada cataliza la oxidación de Mn (II) a Mn (III) y el Mn oxidado (III) cataliza
la oxidación de los compuestos fenólicos y no fenólicos, promoviendo así también la
producción de los radicales libres correspondientes (Bharagava y Chandra 2009). Los
radicales libres generados por los dos mecanismos son responsables de la degradación
de una amplia variedad de contaminantes, incluidas las melanoidinas y colorantes
textiles (Enayatizamir y col., 2011; Bezuneh 2016; Chowdhary y col., 2017).
Se ha descripto además que la presencia de sustratos lignocelulósicos mejora la
decoloración de compuestos mediante la inducción en la producción de dichas enzimas
responsables de la decoloración (Jadhav y col., 2008).
1.1.3.3 Enzimas fenol oxidasas involucradas en la decoloración
Las enzimas fenol oxidasas son enzimas oxidorreductasas que catalizan la oxidación
de compuestos fenólicos, contienen sitios de unión para dos compuestos aromáticos y
para el oxígeno. Estas enzimas reaccionan con el oxígeno sin la necesidad de
cofactores, produciendo la hidroxilación de monofenoles a difenoles y la oxidación de
los difenoles a quinonas (Durán y Espósito, 2000; Martorell 2014). Dentro de las
enzimas fenol oxidasas se encuentran las tirosinasas (Tyr), catecolasas (Cat) y lacasas.
La acción de este tipo de enzimas permite degradar diversos contaminantes
xenobióticos de sitios contaminados, incluso en bajas concentraciones (Singh y col.,
2015).
1.1.3.3.1 Tirosinasas y catecolasas
Las tirosinasas (EC 1.14.18.1), conocidas como polifenol oxidasas, son cupro-
proteínas que catalizan reacciones de oxidación de fenoles de manera similar a la
peroxidasa, sin necesitar del H2O2 (Singh y Dubey 2008). Cataliza las reacciones en
dos etapas diferentes: primero cataliza la hidroxilación de monofenoles para formar
orto-difenoles, actuando como una monofenolasa o cresolasa, luego cataliza la
oxidación de los orto-difenoles a orto-quinonas, actuando como una orto-fenolasa o
31
catecolasa. El O2 se utiliza como oxidante en ambas reacciones. Luego, las orto-
quinonas formadas sufren un proceso no enzimático de polimerización. Estas enzimas
también catalizan la oxidación de muchos tipos de compuestos fenólicos como los
clorofenoles, los difenoles, los metilfenoles y los naftanoles (Zamani y col., 2015). Las
anilinas y las anilinas cloradas también pueden oxidarse en cierta medida y la posterior
co-polimerización con fenoles no sustituidos puede dar como resultado una buena
eliminación de estos compuestos difíciles de oxidar (Agarwal y col., 2016).
1.1.3.3.2 Lacasas
Las lacasas (E.C.1.10.3.2) también son cupro-proteínas que catalizan la oxidación de
sustancias aromáticas (principalmente fenoles) y compuestos inorgánicos con la
reducción concomitante de oxígeno a agua (Majcherczyk y col., 1998). Estas enzimas
son oxidorreductasas que poseen ciertas características distintivas con respecto a las
demás enzimas, como una baja especificidad de sustrato, requisitos simples para la
catálisis (presencia de sustrato y O2) y elevada estabilidad aparente (Senthivelan y col.,
2016), por lo que son ampliamente utilizadas en diferentes procesos biotecnológicos,
tales como la biodegradación de hidrocarburos poliaromáticos (Wong y col., 2012),
eliminación de compuestos fenólicos (Tarasi y col., 2018), desarrollo de biosensores
(Baluta y col., 2017), desarrollo de un apósito con hidrogel bioactivo (Rocasalbas y
col., 2013), bioremediación de bifenol A (Chhaya y Gupte 2013), biodegradación de
colorantes y melanoidinas (Kanagaraj y col., 2015; Georgiou y col., 2016).
En el caso de los colorantes azoicos, este tipo de enzimas degrada dichos
compuestos sin escisión directa de los enlaces azoicos a través de un mecanismo de
radicales libres altamente inespecífico, evitando así la formación de aminas aromáticas
tóxicas (Kanagaraj y col., 2015). En el caso de las melanoidinas, se ha descripto la
participación de la enzima MnP y PiMn en una primera etapa durante la escisión de los
enlaces C=C, C=O y C≡N con la posterior formación de diversos compuestos
fenólicos, los cuales son degradados posteriormente por la enzima lacasa (Chandra y
col., 2018).
En base a lo expuesto, el objetivo de este capítulo fue evaluar la capacidad de
decoloración de colorantes textiles y vinaza empleando como biocatalizador células
libres en crecimiento de T. akiyoshidainum HP-2023.
32
1.2 Materiales y Métodos
1.2.1 Estrategia experimental
Figura 5. Esquema general de la estrategia experimental llevada a cabo. La parte
sombreada en gris se desarrolla en este capítulo.
*ETR: efluente textil real, *CT: colorantes textiles
1.2.2 Microorganismo
La levadura seleccionada para evaluar el bioproceso de decoloración empleando
células libres fue Trichosporon akiyoshidainum HP 2023, levadura basidiomicetácea,
aislada de Las Yungas (Tucumán), previamente seleccionada por su potencial
decolorante e identificada molecular y fisiológicamente (Pajot y col., 2008). La
levadura se encuentra depositada en el cepario del Laboratorio de Biotecnología
Fúngica de PROIMI y en la American Type Culture Collection con el número de acceso
ATCC MYA-4129. Las levaduras se conservaron en placas de Petri con medio NDM
sólido a 5 °C y en glicerol 30% a ˗40 °C. La composición del medio NDM (en g L-1)
33
es: glucosa 20; extracto de levadura 2,5; (NH4)2SO4 2,5; KH2PO4 5; CaCl2 0,13 y
MgSO4 0,5 (Ramalho y col., 2004).
1.2.3 Medio de cultivo estándar optimizado para decoloración
En este trabajo, se utilizó una versión del medio NDM optimizado (NDMopt.) para
decoloración de colorantes textiles con T. akiyoshidainum HP-2023, según lo descripto
por Martorell y col. (2012) y su composición (en g L-1) es: lactosa 10; extracto de
levadura 1; KH2PO4 1; MgSO4 1 y urea 0,5. La urea se preparó en una solución stock
de 50 g L-1 (100X), y se esterilizó por filtración a través de filtros de 0,22 µm.
Posteriormente, se agregó la cantidad necesaria para llegar a una concentración final de
0,5 g L-1.
1.2.4 Biomasa de Trichosporon akiyoshidainum HP-2023
Los inóculos en todos los ensayos consistieron en una suspensión de la levadura T.
akiyoshidainum HP-2023 (DO= 8), obtenida a partir de cultivos de 16 h en medio
NDMopt sin colorante. Los inóculos fueron utilizados en una proporción al 10% v/v, de
manera tal que la DO inicial del cultivo fue de 0,8.
1.2.5 Medios de cultivo y efluentes utilizados
1.2.5.1 Medio de cultivo con colorantes textiles
Se estudió el proceso de decoloración en el medio NDMopt. con colorantes que
normalmente se emplean en la industria textil (Figura 6). Por un lado se empleó 200 mg
L-1 del colorante Negro Vilmafix® B-V (C.I. Negro Reactivo 5, NR5), un colorante
diazoico altamente sulfonado. Por otra parte, se empleó una mezcla de cuatro
colorantes textiles, en una concentración final de 200 mg L-1. Los colorantes que
formaban la mezcla fueron: Negro Vilmafix® B-V, Amarillo Vilmafix® 4R-HE (C.I.
Amarillo Reactivo 84), Rojo Vilmafix® 7B-HE (C.I. Rojo Reactivo 121), colorantes
diazoicos, altamente sulfonados que poseen grupos monoclorotriazina y el colorante
Azul Vilmafix® RR-BB (C.I. Azul Reactivo 221), un colorante formazánico que forma
un complejo de cobre y tiene además un grupo sulfatoetilsulfona.
34
Las soluciones stock del NR5 y de la mezcla fueron preparadas con agua destilada
en una concentración 10X (2 g L-1) con respecto a la utilizada en los ensayos y fueron
esterilizadas por filtración (filtros de 0,22 μm, Sartorius, USA).
Figura 6. Estructura química de los colorantes (A) Rojo Reactivo 141, (B) Amarillo
Reactivo 84, (C) Azul Reactivo 221 y Negro Reactivo 5 (D)
35
1.2.5.2 Efluentes textiles
1.2.5.2.1 Efluente textil real
Las muestras fueron tomadas del efluente líquido de una industria textil ubicada en
el departamento capital de la provincia de La Rioja (Figura 7). Previo a la toma de
muestras, dentro de la industria, estos efluentes fueron sometidos a un tratamiento
primario que consistió en reducir la temperatura hasta aproximadamente 30 °C y
separar las sustancias sólidas mediante filtración. Posteriormente son volcados en un
piletón como se observa en la Figura 7. Las muestras recogidas se transportaron en
recipientes plásticos estériles.
Figura 7. Imagen del sitio de muestreo del efluente textil real. En la figura se observa
el canal del desagüe del efluente hacia las piletas que reciben el efluente luego del
tratamiento físico del mismo
El efluente textil real se utilizó sin dilución (100% p/v). Se adicionaron los
nutrientes del medio NDMopt. para evaluar el proceso de decoloración con la levadura
T. akiyoshidainum HP-2023 libre en crecimiento. Se incluyeron además los controles
no inoculados correspondientes en cada ensayo (controles abióticos).
36
1.2.5.2.2 Efluente textil simulado
Se utilizó un efluente textil simulado descripto por O’Neill y col. (1999a),
modificado por Martorell (2014) para evaluar el proceso de decoloración con la
levadura T. akiyoshidainum HP-2023 libre en crecimiento. Este medio contenía,
además de los componentes del medio de cultivo NDMopt., en g L-1: almidón 1,9; NaCl
0,18; ácido acético 0,53 y 200 mg L-1 de la mezcla de colorantes antes descripta. Se
incluyeron además los controles no inoculados correspondientes en cada ensayo
(controles abióticos).
1.2.5.4 Vinaza de destilería de alcohol
Las muestras de vinaza fueron recolectadas de una destilería de alcohol localizada en
el departamento Cruz Alta, en la provincia de Tucumán (Figura 8). El efluente se
obtuvo a partir de la fermentación de melaza de caña de azúcar y se recolectó
inmediatamente a la salida de la columna de destilación, en bidones resistentes a altas
temperaturas, acondicionados debidamente.
Figura 8. Imagen del sitio de muestreo de la vinaza
La vinaza se utilizó diluida al 10% v/v. Se adicionaron los nutrientes del medio
NDMopt. para evaluar el proceso de decoloración con la levadura T. akiyoshidainum
37
HP-2023 libre en crecimiento. Se incluyeron además los controles no inoculados
correspondientes en cada ensayo (controles abióticos).
1.2.6 Análisis físico-químico de los efluentes coloreados
Los análisis físico-químico de los efluentes textiles (real y simulado) fueron
realizados por la SAT (Sociedad Aguas del Tucumán), de acuerdo a procedimientos
estándares.
La caracterización físico-química de la vinaza fue llevada a cabo por la EEAOC
(Estación Experimental Agroindustrial Obispo Colombres) de acuerdo a
procedimientos estándares.
1.2.7 Ensayos en medio líquido: crecimiento y decoloración por células
libres de Trichosporon akiyoshidainum HP-2023 en crecimiento
Las cinéticas de crecimiento y decoloración se realizaron en Erlenmeyers de 250 mL
con 50 mL del medio a decolorar, en las concentraciones antes descriptas.
Los cultivos se incubaron a 25 ºC y 250 rpm durante 48 h para los colorantes y el
efluente textil y durante 96 h para la vinaza. Se tomaron muestras asépticamente al
inicio del cultivo y a las 3, 6, 9, 12 y 24 h durante el primer día, y luego cada 12 h. Las
muestras fueron centrifugadas a 12.000 xg durante 10 min.
Se determinó la biomasa por peso seco, para esto las células se lavaron dos veces
con agua destilada estéril y se secaron a 80 ºC hasta peso constante. Los sobrenadantes
del medio de cultivo se conservaron para las siguientes determinaciones: decoloración,
pH, determinaciones enzimáticas, aminas aromáticas totales, toxicidad y reutilización
de biomasa en sucesivos ciclos.
1.2.7.1 Decoloración
La remoción del color se midió en un espectrofotómetro Thermo Scientific
Multiskan Go. Para el colorante NR5 y el efluente vinaza la decoloración se midió
determinando la absorbancia a la longitud de onda (λ) de 595 y 475 nm,
respectivamente (Martorell 2014, Ahmed 2016). La remoción del color fue calculada
según la siguiente fórmula:
38
𝑫 (%) =(𝑨𝟎 − 𝑨𝒕) × 𝟏𝟎𝟎
𝑨𝟎
Donde, D (%): Decoloración porcentual; A0: absorbancia inicial y At: absorbancia
en el tiempo t a la λ correspondiente.
Para los cultivos con la mezcla de colorantes se realizó un espectro de absorción
entre 400 y 800 nm a fin de analizar la disminución de la absorbancia en el rango
establecido. Para cada longitud de onda, se calculó un porcentaje de disminución del
color, comparando la absorbancia inicial (al inicio del cultivo) con de la absorbancia
final (al tiempo de la muestra tomada).
El porcentaje total de decoloración de la mezcla de colorantes se determinó
calculando el promedio de cada disminución en los valores de absorbancia para cada
longitud de onda, según la siguiente ecuación (Martorell y col., 2018):
𝐃 (%) = ∑ [(𝐀λ𝟎 − 𝐀λ𝐭)]
𝐀𝟎
𝟖𝟎𝟎
𝟒𝟎𝟎
× 𝟏𝟎𝟎
Donde, D (%): decoloración porcentual; A0: absorbancia inicial para una longitud de
onda específica λ y At: absorbancia para una longitud de onda específica λ en el tiempo
t.
1.2.7.2 Determinación de aminas aromáticas totales (AAT)
La concentración de AAT se determinó en los sobrenadantes de cultivo por el
método de Oren y col. (1991). La cuantificación de AAT se realizó a partir de una
curva de calibración con ácido sulfanílico debido al carácter altamente sulfonado de los
colorantes usados.
1.2.7.3 Determinaciones enzimáticas
1.2.7.3.1 Lacasa
La actividad lacasa se midió a 25 ºC usando como sustrato ABTS (ácido 2,2´-azino-
bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico)) (Heinzkill y col., 1998). La mezcla de reacción
contenía ABTS 1,8 mM en buffer acetato 50 mM; pH 4,0. Se utilizaron 100 μl de
39
sobrenadante de cultivo en 200 μL de volumen final. El incremento en la absorbancia
fue monitoreado a 420 nm (ε420 = 36.000 M-1 cm-1). Se definió una unidad como la
cantidad de enzima capaz de oxidar 1 μmol de sustrato por minuto.
1.2.7.3.2 Peroxidasa, manganeso peroxidasa y peroxidasa independiente de
manganeso
Se utilizó el método propuesto por Castillo y col. (1994). La mezcla de reacción para
determinar actividad peroxidasa (POX) consistió en MBTH (hidracina de 3-metil-2-
benzotiazolona) 0,07 mM; DMAB (p-dimetilaminobenzaldehído) 1 mM; MnSO4.4H2O
0,3 mM; H2O2 0,05 mM; buffer succinato-lactato 100 mM, pH 4,5. Se emplearon 100
μL de sobrenadante de cultivo en 300 μL de volumen final. Se siguió el curso de la
reacción a 25 ºC y 610 nm (ε610 = 53.000 M-1 cm-1). Se definió una unidad como la
cantidad de enzima capaz de oxidar 1 μmol de sustrato por minuto.
Se midió también actividad peroxidasa independiente de manganeso (PiMn)
empleando la misma mezcla de reacción, pero sin Mn2+ (sin MnSO4.4H2O). Así, la
actividad MnP se calculó en base a la siguiente ecuación:
𝐌𝐧𝐏 (𝐔/𝐋) = 𝐏𝐎𝐗(𝐔/𝐋) − 𝐏𝐢𝐌𝐧(𝐔/𝐋)
1.2.7.3.3 Catecolasa
La actividad catecolasa se determinó a 25ºC con catecol 0,01% y MBTH 0,07 mM
en buffer fosfato 50 mM, pH 7,4. Se utilizaron 100 μL de sobrenadante en 200 μL de
volumen final. El incremento de la absorbancia se midió a 420 nm. Una unidad de
catecolasa se definió como la cantidad de enzima capaz de causar un cambio de 0,01
unidades ópticas por min, con un paso óptico de 1 cm (Bora y col., 2004).
1.2.8 Bioensayos de toxicidad
En los experimentos de decoloración de NR5, mezcla de colorantes, efluente textil
real, simulado y vinaza se probó la potencial toxicidad de los sobrenadantes de cultivos
al inicio y final del tratamiento sobre semillas de lechuga (Lactuca sativa). El análisis
del efecto de los sobrenadantes sobre la elongación de la radícula, del hipocótilo y
germinación de las semillas permite ponderar el efecto tóxico de compuestos solubles
40
presentes en niveles muy bajos. Estos son indicadores subletales para la evaluación de
efectos tóxicos en vegetales causados por la descarga de efluentes.
1.2.8.1 Verificación de la viabilidad de semillas
Antes de realizar los ensayos de toxicidad y debido a la variabilidad de los lotes de
semilla de L. sativa disponibles, se determinó si el lote usado presentaba una
germinación superior al 90%, que la misma fuese sincronizada y que existiera poca
variabilidad en las longitudes promedio de radículas e hipocótilos obtenidas.
1.2.8.2 Determinación de la toxicidad de efluentes y efluentes tratados
Para estas determinaciones se incubaron 30 semillas de L. sativa en tres placas de
Petri con papel de filtro y saturadas con 4 mL de sobrenadante correspondiente, según
el procedimiento estándar (EPA, 1989; Lumbaque y col., 2017). Las placas se
incubaron a 25 °C en la oscuridad 120 h. Al finalizar la incubación se determinó el
porcentaje de semillas germinadas (GR), la longitud promedio porcentual de radículas
(LR) e hipocótilos (LH) y se calculó el índice de germinación (IG) según la siguiente
fórmula (Lumbaque y col., 2017):
𝑰𝑮 (%):𝑮𝑹(%) × 𝑳𝑹𝑹(%)
𝟏𝟎𝟎
Donde, IG: Índice de Germinación, GR: Germinación Relativa, LRR: Longitud
Radicular Relativa.
Los valores de IG se diferenciaron en tres categorías según los efectos de toxicidad
observados (Silva y col., 2013):
• Altamente tóxico: IG ˂ 50%
• Moderadamente tóxico: IG ˂ 80%
• Sin toxicidad: IG ≥ 80%
1.2.9 Reutilización de las células libres de Trichosporon akiyoshidainum HP-
2023 durante ciclos sucesivos de decoloración
Para evaluar la reutilización de la biomasa durante ciclos sucesivos de decoloración
se separó la biomasa obtenida después del primer ciclo de tratamiento y fue reutilizada
41
en un nuevo ciclo. Así, las células fueron separadas del medio decolorado por
centrifugación (12.000 xg durante 10 min), luego fueron lavadas con agua bidestilada
estéril y utilizadas para la decoloración en un segundo ciclo. El procedimiento se repitió
tres veces (cuatro ciclos en total) (Phugare y col., 2010).
1.2.10 Análisis estadístico
Las cinéticas de crecimiento de la levadura se analizaron mediante el paquete
estadístico GraphPad Prism 7.0. Los parámetros de crecimiento determinados fueron:
velocidad máxima de crecimiento (μ; h-1), biomasa máxima (g L-1) y duración de la fase
lag (h-1); los mismos fueron determinados con un índice de confianza del 95%.
Los datos se ajustaron al modelo de Gompertz modificado (Zwietering y col., 1990),
según la siguiente fórmula:
𝑌 = 𝑌𝑀 × exp{− exp[((µ x e) ÷ YM) × (Lag x) + 1]}
Donde Y es la biomasa seca en el tiempo t (g L-1), YM es la biomasa máxima (g L-
1), µ es la velocidad de crecimiento específica (g L-1 h-1) y Lag es el retraso de la fase
lag (h).
Las diferencias entre los cultivos de control (medio NDMopt. sin colorantes ni
efluente) y los medios coloreados se evaluaron mediante la prueba F, con un valor p
límite de 0,05.
Las diferencias en los valores de decoloración y toxicidad se analizaron mediante un
análisis de la varianza de un solo factor (One way ANOVA). Cuando se encontraron
diferencias significativas se utilizó la prueba de Tukey para separar los efectos de los
tratamientos. Las pruebas se consideraron significativamente diferentes si p < 0,05 con
un intervalo de confianza (IC) del 95%. Los análisis se realizaron empleando el paquete
estadístico Minitab 17.0.
42
1.3 Resultados y discusión
1.3.1 Análisis físico-químico de los efluentes coloreados
1.3.1.1 Efluente textil real y simulado
En base a la Resolución Nº 778/96 del Reglamento General para el Control de
Contaminación Hídrica (Reglamentación Nacional), los efluentes textiles industriales
se categorizan en el número dos según la peligrosidad o toxicidad de los efluentes. El
grupo dos se refiere “a aquellos establecimientos que manipulan u operan elementos o
sustancias de características tóxicas o peligrosas, cuya influencia en el dominio público
hidráulico a través de sus vertidos pueden alterar negativamente su calidad, afectar el
medio ambiente hídrico, lo sistemas de redes de riego o al recurso hídrico en general”.
Los resultados del análisis físico-químico del efluente textil real y simulado se
resumen en la Tabla 8. Los valores obtenidos para el efluente real estuvieron dentro de
los valores permisibles, a excepción de la Demanda Bioquímica de Oxígeno y la
Demanda Química de Oxígeno (DBO y DQO, respectivamente) ya que no deberían en
ningún caso superar los 200 mg L-1 (Resolución Nº 778/96. Contaminación Hídrica).
Por el contrario, los valores correspondientes al efluente simulado fueron diez veces
mayores que el real. Sin embargo, se asemejaron más al afluente textil real descripto
por Khatri y col. (2015), quienes reportaron valores promedio de DBO y DQO de 900 y
1.700 mg O2 L-1, respectivamente.
Los valores de pH´s de ambos efluentes fueron similares (9,11 y 9,47 para el
efluente textil real y simulado, respectivamente). Estos valores de pH, coinciden con
los reportados por Khatri y col. (2017) y Priya y Selvan (2017), quienes reportaron que
los efluentes textiles se caracterizan por presentar valores de pH comprendidos entre
7,5 y 11,8. Sin embargo, estos valores deberían estar comprendidos entre 6 y 8 para que
puedan ser volcados al medio ambiente (Resolución Nº 778/96-Contaminación
Hídrica).
43
Tabla 8. Características físico-químicas del efluente textil real y simulado
Los resultados expresados son el promedio de determinaciones realizadas por
triplicado, para cada uno de los parámetros analizados.
Es importante destacar que no existen en la legislación vigente valores definidos
para la presencia de aminas aromáticas; sin embargo, en la mayoría de los países
desarrollados existe un estricto control sobre este aspecto.
En la Figura 9 se observan los espectros de absorción del efluente textil real y del
efluente simulado adicionado con 200 mg L-1 de la mezcla de colorantes. La gran
absorbancia en la región visible indica claramente la elevada coloración que presentan
ambos efluentes. A su vez, los espectros del efluente real y el efluente simulado fueron
similares, con picos de absorbancia en la región comprendida entre los 550 y 610 nm.
Esto demuestra que el espectro de absorción obtenido de la combinación de los cuatro
colorantes se asemeja al de un efluente real, es decir que utilizar la mezcla de
colorantes en el efluente simulado permite aproximarse más a un efluente real, como
fue descripto previamente por O´Neill y col. (1999b).
44
Figura 9. Espectros de absorción de los efluentes textiles en el rango visible del
espectro electromagnético. A) Efluente textil real. B) Efluente textil simulado con la
mezcla de colorantes
1.3.1.2 Vinaza
Los resultados del análisis físico-químico del efluente vinaza se resumen en la Tabla
9.
En base a la Resolución Nº 778/96 sobre la Contaminación Hídrica, las vinazas
provenientes de la industria sucroalcoholera se categorizan también en el número dos
según la peligrosidad o toxicidad de los mismos.
45
Tabla 9. Características físico-químicas de vinaza de destilería de alcohol
Los resultados expresados son el promedio de determinaciones realizadas por
triplicado, para cada uno de los parámetros analizados. *UNT: unidades nefelométricas de turbidez
La vinaza con la que se llevó a cabo este trabajo, obtenida de la fermentación de
melaza de caña de azúcar, presentó un valor de pH de 5,15. Este resultado se encuentra
dentro del rango publicado por Valeiro y col. (2017) para vinazas provenientes de la
industria sucroalcoholera de Tucumán. Los valores bajos de pH de las vinazas se
deben, principalmente, a la presencia de iones SO42- en concentraciones entre 3.000 y
6.000 mg L-1. debido a que se utilizan grandes cantidades de H2SO4 para mantener el
pH del mosto de alimentación (Silva y col., 2014; Ahmed 2016). La presencia de
ácidos orgánicos, tales como ácido láctico, acético, oxálico y málico producidos por las
levaduras durante la fermentación, también contribuyen al pH ácido de las vinazas
(Parnaudeau y col., 2008; Nasr y col., 2011).
El valor de conductividad eléctrica (CE) obtenido (32,2 mS cm-1) es
considerablemente superior a los permitidos por la reglamentación ambiental provincial
(≤ 1 mS cm-1). Los valores de CE de vinazas son muy variables ya que dependen del
tipo y origen de las mismas (Ramana y col, 2002; Fuess, 2013; Silva y col., 2014). La
vinaza analizada por Valeiro y col. (2017) presentó un valor promedio de CE de 26,54
mS cm-1. Por el contrario, los valores promedio de CE reportados para vinazas
brasileras fueron de 4,35 mS cm-1 (Vilar y col., 2018)
El análisis de la vinaza utilizada en este trabajo arrojó valores de DBO y DQO de
aproximadamente 64.340 y 109.852 mg O2 L-1, respectivamente. Por otra parte, Valeiro
y col. (2017) obtuvieron valores de DBO y DQO inferiores, de alrededor de 42.940 y
46
98.753 mg O2 L-1, respectivamente. De la misma manera, los valores reportados para la
vinaza de Brasil fueron significativamente inferiores (DBO y DQO de 6.900 y 11.076
mg O2 L-1, respectivamente). A partir de los valores de DQO y DBO obtenidos del
análisis físico-químico de la vinaza, se calculó un índice de biodegradabilidad
(DBO/DQO) de 0,58 (Bermudez-Savon y col., 2000). A partir de esta relación se
concluyó que la vinaza analizada fue biodegradable. En la Figura 10 se observa el
espectro de absorción de la vinaza.
Figura 10. Espectro de absorción del efluente vinaza en el rango visible del espectro
electromagnético
1.3.2 Ensayos en medio líquido: crecimiento y decoloración por células
libres de Trichosporon akiyoshidainum HP-2023 en crecimiento
1.3.2.1 Decoloración de NR5 y la mezcla de colorantes
Se estudió el proceso de decoloración del colorante textil NR5 y de la mezcla de
cuatro colorantes sintéticos utilizando como microorganismo la levadura T.
akiyoshidainum HP-2023 libre en crecimiento. Las curvas de crecimiento de la
levadura en los distintos medios analizados, así como en el medio NDMopt. sin
colorantes (medio control) se observan en la Figura 11.
47
Figura 11. Cinéticas de crecimiento durante el cultivo con células libres de T.
akiyoshidainum HP-2023 en el medio NDMopt. control, con NR5 y la mezcla de
colorantes
Los datos de biomasa obtenidos se ajustaron al modelo de crecimiento microbiano
de Gompertz con un R2˃0,93 para todas las curvas (Tabla 10). Teniendo en cuenta los
parámetros estimados, se puede decir que el colorante NR5 y la mezcla no afectaron el
rendimiento máximo de biomasa ni la velocidad de crecimiento máxima de la levadura
T. akioshidainum HP-2023.
Tabla 10. Parámetros de crecimiento de T. akiyoshidainum HP-2023 en el medio
NDMopt. control, con NR5 y con la mezcla de colorantes. Los parámetros se estimaron
aplicando el modelo modificado de Gompertz a las curvas de crecimiento empírico.
95% IC: intervalo de confianza del 95%
Los porcentajes de decoloración obtenidos en el medio NDMopt. con NR5 y la
mezcla de colorantes fueron aproximadamente del 90% a las 12 h de tratamiento
(Figura 12). Es decir que la decoloración obtenida fue similar, independientemente de
los colorantes empleados.
48
Debido a que la decoloración ocurrió en las primeras 12 h de tratamiento y teniendo
en cuenta las cinéticas de crecimiento obtenidas (Figura 11), el proceso se asoció a la
fase de crecimiento de la levadura.
El pH inicial del cultivo con NR5 y la mezcla fue 5,5 y 5,79, respectivamente. En
ambos cultivos el pH disminuyó alcanzando valores aproximadamente de 3,5 (Figura
12).
Las aminas aromáticas disminuyeron paralelamente a la decoloración, obteniéndose
una reducción de los valores iniciales de entre un 60 y 80% a las 12 h (Figura 12). Las
aminas aromáticas presentes al inicio del tratamiento probablemente sean impurezas del
colorante, ya que como se mencionó anteriormente, los colorantes azoicos se forman a
partir de aminas. La disminución dichas aminas implica que estas no se generan durante
del proceso de decoloración, o bien que se consumen fácilmente. Middelhoven y col.
(2001) demostraron que numerosas levaduras, especialmente del género Trichosporon,
son capaces de degradar aminas aromáticas en condiciones aeróbicas e incluso pueden
utilizarlas como fuentes de carbono y energía. Por lo tanto, la disminución de los
valores iniciales de las aminas aromáticas podría atribuirse a la capacidad de T.
akiyoshidainum HP 2023 de asimilar estas mismas aminas.
49
Figura 12. Cinéticas de decoloración, AAT y pH durante el cultivo con células libres
de T. akiyoshidainum HP-2023 en el medio NDMopt. con (A) NR5 y (B) mezcla de
colorantes
Los ensayos de fitotoxicidad son herramientas valiosas para monitorear el éxito de
un proceso de remediación (Saez y col., 2014). Como se observa en la Figura 13, los
colorantes textiles inhiben la germinación de L. sativa con un índice de germinación
<50%. Es decir que los colorantes resultaron altamente tóxicos previo al tratamiento
con la levadura. Sin embargo, luego de la decoloración con T. akiyoshidainum HP-2023
se observó una reducción significativa de la fitotoxicidad de los medios coloreados. Al
finalizar el tratamiento con la levadura, la germinación relativa (GR) de las semillas
superó el 95% y la longitud radicular relativa (LRR) superó el 90%, tanto para el NR5
como para la mezcla (Tabla 11), por lo que los índices de germinación aumentaron a
valores mayores a 85% (Figura 13), es decir que no fueron tóxicos para las semillas de
L. sativa, acorde a lo descripto por Silva y col. (2013).
50
Figura 13. Índice de germinación de los sobrenadantes obtenidos durante el cultivo con
células libres de T. akiyoshidaiunum HP 2023 con NR5 y la mezcla de colorantes al
inicio (Ti) y final del tratamiento (Tf). Como control se utilizó H2O destilada.
Tabla 11. Efectos de NR5 y la mezcla de colorantes al inicio (Ti) y final del
tratamiento de decoloración (Tf) con células libres de T. akiyoshidainum HP-2023 sobre
la germinación y desarrollo de L. sativa.
*LR: Longitud Radicular; LH: Longitud del Hipocótilo; GR: Germinación Relativa,
LLR: Longitud Radicular Relativa, IG: Índice de Germinación
Como se explicó anteriormente, las actividades ligninolíticas tienen el potencial de
degradar una amplia gama de colorantes aromáticos complejos. Por lo tanto, el análisis
de dichas actividades durante la decoloración es muy importante cuando se prevén
aplicaciones industriales. En este sentido, se midieron actividades enzimáticas
relacionadas con la degradación de lignina, las que podrían estar involucradas en los
procesos de decoloración. Se midió actividad lacasa, POX, PiMn, MnP y catecolasa. La
51
actividad lacasa no se detectó en ninguna de las condiciones ensayadas. Las actividades
MnP y catecolasa fueron positivas sólo en presencia de los colorantes (Figura 14).
Las actividades POX y MnP se detectaron en valores significativos (superiores a 0,1
U L-1). Las máximas actividades MnP se alcanzaron a las 12 h, tanto durante la
decoloración de NR5 (0,31 U L-1) como de la mezcla de colorantes (0,40 U L-1) (Figura
14A). Las actividades POX obtenidas fueron mayores (con respecto a la actividad
MnP) e iguales a 0,49 y 0,52 U L-1 para NR5 y la mezcla, respectivamente.
Con respecto a la actividad catecolasa los mayores títulos se obtuvieron durante la
decoloración de la mezcla de colorantes (0,4 U L-1) (Figura 14B). Las actividades
enzimáticas medidas pueden estar involucradas en la decoloración, ya que las mismas
no fueron detectadas en ausencia de los colorantes.
Figura 14. A) Actividad MnP y B) actividad catecolasa durante el cultivo con células
libres de T. akiyoshidainum HP-2023 en el medio NDMopt. control (sin colorantes), con
NR5 y la mezcla de colorantes
52
Se evaluó también el reciclaje de la biomasa, es decir la capacidad de las células de
T. akiyoshidainum HP-2023 para decolorar el NR5 y la mezcla de colorantes durante
ciclos sucesivos de decoloración. El reciclo de la biomasa celular evidenció que la
levadura disminuye gradualmente la eficiencia en la decoloración con los ciclos. Así, al
final del cuarto ciclo, la capacidad decolorante de la levadura libre disminuyó más de
un 60%, ya que se obtuvieron valores de remoción del 40 y 17% para el NR5 y la
mezcla de colorantes, respectivamente (Tabla 12). La disminución de la decoloración
podría estar asociada con el efecto tóxico de los colorantes textiles sobre el crecimiento
de las células o bien por el envejecimiento de las células durante los reciclos.
Por otra parte, las actividades enzimáticas medidas durante los ciclos también
disminuyeron, debido a que no pudieron ser detectadas a partir del segundo ciclo, tanto
durante la decoloración de NR5 como de la mezcla (Tabla 12), lo cual estaría
relacionado también con la baja decoloración observada en los reciclos.
Tabla 12. Decoloración (%), actividad MnP y actividad catecolasa máximas (U L-1)
obtenidas durante la decoloración de NR5 y la mezcla de colorantes con células libres
de T. akiyoshidainum HP-2023 durante cuatro ciclos sucesivos de reutilización de la
biomasa
1.3.2.2 Decoloración del efluente textil real y simulado
Se evaluó el proceso de decoloración con las células libres de T. akiyoshidainum
HP-2023 en un efluente textil real y simulado.
Debido a que los efluentes textiles varían día a día, e incluso hora a hora, como
consecuencia de la naturaleza discontinua del proceso de tinción, el empleo de
efluentes simulados facilita el estudio del proceso de tratamiento cuando no se puede
acceder de manera fácil a muestras de efluentes reales (O´Neill y col., 1999a). Por esto,
se analizó también si la levadura podía crecer y decolorar un efluente textil simulado de
53
manera similar al real. Debido a que el espectro de absorción de una mezcla de
colorantes se asemeja al de un efluente real (1.3.1.1), al efluente simulado utilizado en
este trabajo se le adicionó la mezcla de cuatro colorantes antes descripta.
En la Figura 15 se observan las cinéticas de crecimiento de T. akiyoshidainum HP-
2023 durante la decoloración del efluente textil real, simulado y en el medio NDMopt.
control. A partir de dichas curvas se calcularon los parámetros de crecimiento (Tabla
13). En base a los resultados obtenidos se asume que ninguno de los efluentes afectó
negativamente el rendimiento máximo de biomasa ni la velocidad de crecimiento
máxima de T. akioshidainum HP-2023.
Figura 15. Cinéticas de crecimiento durante el cultivo con células libres de T.
akiyoshidainum HP-2023 en el medio NDMopt. control, efluente textil simulado con la
mezcla de colorantes y efluente textil real
Tabla 13. Parámetros de crecimiento de T. akiyoshidainum HP-2023 en el efluente
textil real, simulado y medio NDMopt. control. Los parámetros se estimaron aplicando
el modelo modificado de Gompertz a las curvas de crecimiento empírico. 95% IC:
intervalo de confianza del 95%
*ETR: Efluente Textil Real, ETS: Efluente Textil Simulado, Vel. Máx. crec.: velocidad
máxima de crecimiento, Biomasa máx.: biomasa máxima, p: significancia
54
Con respecto a la decoloración, los porcentajes obtenidos con T. akiyoshidainum
HP-2023 en suspensión a las 12 h de cultivo tanto para el efluente textil simulado como
el real fueron del 76 y 92%, respectivamente (Figura 16). A su vez, la remoción del
color del efluente textil real aumenta a 100% a las 24 h.
La decoloración de ambos efluentes ocurrió durante la fase de crecimiento de la
levadura, ya que las máximas decoloraciones se obtuvieron a las 12 h de cultivo (Figura
16).
Con respecto a las AAT, como se observa en la Figura 16, a medida que aumenta la
decoloración de ambos afluentes, las aminas disminuyen a lo largo del cultivo, similar a
lo descripto previamente para NR5 y la mezcla de colorantes. Con respecto a los
valores de pH iniciales (aproximadamente 9,5), el tratamiento con la levadura produjo
una gran disminución en el pH del efluente real (3,5), sin embargo, el descenso en el
efluente simulado no fue tan marcado, alcanzando un valor de 7,5 (Figura 16).
Figura 16. Cinéticas de decoloración, AAT y pH durante el cultivo con células libres
de T. akiyoshidainum HP-2023 en el efluente textil simulado y real
Con relación a la fitotoxicidad de los efluentes, se observó que ambos resultaron
altamente tóxicos para L. sativa, ya que se obtuvieron IG ˂ 50% (Silva y col., 2013)
(Tabla 14). El efluente simulado a tiempo inicial (Ti) fue el medio con colorantes que
mayor toxicidad presentó (IG=10%) (Figura 17). Sin embargo, la fitotoxicidad se
redujo significativamente al finalizar el tratamiento con la levadura (Tf), ya que el IG
aumentó a 89%, mientras que el IG del efluente real alcanzó un 94% (Figura 17). Los
resultados obtenidos revelaron que el tratamiento de decoloración con células libres de
55
T. akiyoshidainum redujo significativamente la fitotoxicidad del efluente textil real y
simulado.
A partir de los resultados obtenidos se supone que el estudio de la decoloración en
un efluente textil simulado es una aproximación válida para el estudio del bioproceso
en condiciones reales.
Tabla 14. Efectos del efluente textil real y simulado s al inicio (Ti) y final del
tratamiento de decoloración (Tf) con células libres de T. akiyoshidainum HP-2023 sobre
la germinación y desarrollo de L. sativa.
*ETS: Efluente Textil Simulado; *ETR: Efluente Textil Real; *LR: Longitud
Radicular; *LH: Longitud del Hipocótilo; *GR: Germinación Relativa, *LLR: longitud
radicular relativa, *IG: índice de germinación.
Figura 17. Índice de germinación (IG) de los sobrenadantes de cultivo de T.
akiyoshidaiunum HP 2023 en el efluente textil real, medio NDMopt. y efluente simulado
con y sin la mezcla de colorantes al inicio (Ti) y final del tratamiento (Tf). Como
control se utilizó H2O destilada.
56
Como se hizo para la decoloración de NR5 y la mezcla de colorantes, se evaluó la
capacidad de las células libres de T. akiyoshidainum HP 2023 para decolorar el efluente
textil real en ciclos sucesivos. Tanto la decoloración como las actividades enzimáticas
medidas, disminuyeron con los ciclos. Así, al finalizar el primer ciclo (24 h) se obtuvo
la decoloración completa del efluente con una actividad MnP y catecolasa de 0,22 y
0,23 U L-1 (Tabla 15). Al finalizar el cuarto ciclo, la decoloración disminuyó a un 20%
aproximadamente y no se detectó ninguna actividad positiva.
Tabla 15. Decoloración (%), actividad MnP y actividad catecolasa máximas (U L-1)
obtenidas durante la decoloración del efluente textil real con células libres de T.
akiyoshidainum HP-2023 durante cuatro ciclos sucesivos de reutilización de la biomasa
Estos resultados coincidieron con las conclusiones de algunos trabajos publicados
sobre el decaimiento de la actividad decolorante al reutilizar microorganismos libres en
crecimiento. Por ejemplo, Phugare y col. (2010) reportaron una disminución en la
eficiencia de decoloración al reutilizar la biomasa de Sacharomyces cerevisiae MTCC
463 durante la decoloración de un efluente textil industrial. Así, obtuvieron una
disminución en la decoloración mayor al 60% después del tercer ciclo de reacción,
asociando dicha disminución al efecto tóxico del efluente sobre las células y,
posteriormente, en los sistemas enzimáticos que participan en la decoloración. Kurade
y col. (2016) estudiaron la decoloración de Rojo Disperso 54 durante 8 ciclos
consecutivos por Brevibacillus laterosporus. En el primer ciclo obtuvieron un 84% de
decoloración, mientras que la eficiencia disminuyó a 59% en el segundo ciclo. Así,
observaron un decaimiento continuo en la actividad decolorante de la bacteria con los
ciclos de decoloración.
57
1.3.2.3 Decoloración de vinaza
El crecimiento de T. akiyoshidainum HP-2023 en vinaza se puede ver en la Figura
18. La curva obtenida también se ajustó al modelo de crecimiento microbiano de
Gompertz con un R2˃0,95. A partir de los parámetros de crecimiento determinados
(velocidad máxima de crecimiento, biomasa máxima y duración de la fase lag), tanto en
presencia como ausencia del efluente vinaza, se asume que el efluente no afectó el
crecimiento de la levadura (Tabla 16). Estos resultados muestran la versatilidad de la
levadura empleada ya que fue capaz de crecer con parámetros cinéticos similares en
diferentes medios, tanto adicionados con colorantes como con efluentes industriales. Es
decir que, independientemente de la naturaleza del medio a decolorar empleado, el
crecimiento de la levadura T. akiyoshidainum HP-2023 no fue afectado.
Figura 18. Cinéticas de crecimiento, decoloración y AAT durante el cultivo con células
libres de T. akiyoshidainum HP-2023 en vinaza de destilería de alcohol
Tabla 16. Parámetros de crecimiento de la levadura T. akiyoshidainum HP-2023 en el
efluente vinaza y medio NDMopt. control. Los parámetros se estimaron aplicando el
modelo modificado de Gompertz a las curvas de crecimiento empírico. 95% IC:
intervalo de confianza (95%), R2: coeficiente de determinación.
58
La máxima decoloración de vinaza que se obtuvo fue del 40% y ocurrió a las 72 h de
cultivo (Figura 18). Es decir que, de todos los medios y efluentes estudiados, éste fue el
que se decoloró en menor medida y el que más tiempo de tratamiento necesitó,
demostrando así ser el más recalcitrante. En cuanto a las AAT, sólo se obtuvo una
remoción del 35%, a las 72 h de cultivo (Figura 18).
A diferencia de lo observado en los tratamientos de los colorantes textiles, la vinaza
se decolora mayormente durante la fase de crecimiento estacionario (Figura 18). En
otras levaduras, como Issatchenkia orientalis SF9-246 la decoloración de vinaza
también se asoció al metabolismo secundario (Tondee y col., 2008).
El pH inicial del cultivo fue de 4,5; y posterior al tratamiento con la levadura se
alcanzó un pH igual a 3,00 (Figura 19), similar a lo observado en los otros tratamientos,
es decir que independientemente del medio de cultivo, la levadura crece disminuyendo
el pH del mismo.
Figura 19. Cinética de pH durante el cultivo con células libres de T. akiyoshidainum
HP-2023 libre en vinaza de destilería de alcohol
También se determinó la toxicidad de la vinaza antes y después del tratamiento con
la levadura. La vinaza sin tratar (Ti) inhibió la germinación de las semillas de lechuga
en un 70%. Con estos valores, conjuntamente con la longitud radicular promedio, se
calculó un índice de germinación del 55% (toxicidad moderada) (Figura 20, Tabla 17).
Estos resultados eran esperados ya que los efectos tóxicos de la vinaza ya fueron
descriptos en diversos estudios (Ferreira y col., 2011; 2014; Colin y col., 2016; Ahmed
2016). El exceso de contaminantes orgánicos genera un desbalance en la germinación
de las semillas ya que alteran sus procesos bioquímicos naturales. Esto también se
59
observa, por ejemplo, cuando dichas semillas son cultivadas en presencia de ciertos
plaguicidas organoclorados (Alvarez y col., 2015). Sin embargo, las semillas cultivadas
con la vinaza tratada (Tf) germinaron aún en menor medida (aproximadamente 60%)
con respecto a la vinaza sin tratar, lo cual se vio reflejado en un IG menor e igual a 31%
(Figura 20). Lo que implica que la decoloración de la vinaza se produce a través de un
mecanismo que no conlleva a la degradación de los compuestos tóxicos de la vinaza.
Tabla 17. Efectos del efluente vinaza al inicio (Ti) y final del tratamiento de
decoloración (Tf) con células libres de T. akiyoshidainum HP-2023 sobre la
germinación y desarrollo de L. sativa.
*LR: Longitud Radicular; *LH: Longitud del Hipocótilo; *GR: Germinación Relativa,
*LLR: Longitud Radicular Relativa, *IG: Índice de Germinación.
Figura 20. Índice de germinación (IG) de los sobrenadantes de cultivo de T.
akiyoshidaiunum HP 2023 con vinaza a tiempo inicial (Ti) y final (Tf). Como control se
utilizó H2O bidestilada.
Durante la decoloración de la vinaza con T. akiyoshidainum HP-2023 se midieron
las actividades MnP y catecolasa (0,27 y 0,3 U L-1, respectivamente) (Tabla 18). La
actividad lacasa no se detectó durante el tratamiento de vinaza, al igual que no pudo ser
medida en los tratamientos de colorantes antes descriptos. Sin embargo, pueden existir
60
otros sistemas en la levadura T. akiyoshidainum HP-2023 que participan en el proceso
de decoloración conjuntamente con las actividades que si fueron medidas (MnP y
catecolasa), como la producción de H2O2 y radicales hidroxilos, el sistema
monooxigenasa citocromo P450 y los cambios en el pH del medio (Novotný y col.,
2004; Anastasi y col., 2011).
Tabla 18. Decoloración (%), actividad MnP y actividad catecolasa máximas (U L-1)
obtenidas durante la decoloración de vinaza con células libres de T. akiyoshidainum
HP-2023 durante cuatro ciclos sucesivos de reutilización de la biomasa
Cuando se reutilizó la biomasa de T. akiyoshidainum HP-2023 en un nuevo ciclo, la
remoción del color se redujo y se obtuvo sólo un 17% de decoloración, llegando a cero
en el tercer y cuarto ciclo (Tabla 18). Las actividades enzimáticas MnP y catecolasa
también disminuyeron con los ciclos, ya que se detectaron valores inferiores a 0,1 U L-1
a partir del segundo ciclo de decoloración (Tabla 18).
Los resultados obtenidos en este capítulo permiten suponer que el bioproceso de
decoloración con T. akiyoshidainum HP-2023 en suspensión es un sistema efectivo para
remover el color de medios definidos con colorantes textiles y efluentes industriales
coloreados, como efluentes textiles reales, simulados y vinazas.
61
1.3.4 Conclusiones parciales
• El espectro de absorción obtenido a partir de un efluente simulado adicionado con
una mezcla de diferentes colorantes se asemeja al espectro de un efluente textil real
• La decoloración en un efluente textil simulado adicionado con una mezcla de
colorantes es una estrategia válida para realizar estudios preliminares del proceso de
biodecoloración
• La decoloración de colorantes y efluentes textiles (real y simulado) mediada por
células libres de Trichosporon akiyoshidainum HP-2023 es un proceso asociado a la
fase de crecimiento exponencial
• La decoloración de vinaza de destilería de alcohol mediada por células libres de
Trichosporon akiyoshidainum HP-2023 es un proceso asociado a la fase estacionaria
• Los medios coloreados evaluados en este trabajo no afectaron la velocidad de
crecimiento ni la biomasa máxima de Trichosporon akiyoshidainum HP-2023
• El proceso de decoloración de Negro Reactivo 5, la mezcla de colorantes, los
efluentes textiles real y simulado con Trichosporon akiyoshidainum HP-2023
disminuyó la toxicidad inicial de los medios y no hubo acumulación de aminas
aromáticas en los sobrenadantes de cultivo
• El proceso de decoloración mediado por Trichosporon akiyoshidainum HP-2023
disminuye los valores iniciales de pH de los efluentes
• El colorante Negro Reactivo 5, la mezcla de colorantes y los efluentes textiles real y
simulado fueron decolorados más rápido que el efluente vinaza.
• La presencia de colorantes, efluentes textiles y vinaza fue requerida para evidenciar
actividad catecolasa y manganeso peroxidasa durante el crecimiento y decoloración
con Trichosporon akiyoshidainum HP-2023
CAPÍTULO II
Bioproceso 2: Inmovilización de
Trichosporon akiyoshidainum HP-
2023 en perlas de alginato de calcio
para la decoloración de colorantes
textiles y vinaza
63
CAPÍTULO II
Inmovilización de Trichosporon akiyoshidainum HP-2023 en perlas de
alginato de calcio para la decoloración de colorantes textiles y vinaza
2.1 Introducción
2.1.1 Empleo de microorganismos inmovilizados como una alternativa al
cultivo con células libres en crecimiento
La inmovilización se definió como "el confinamiento o localización física de células
intactas o de enzimas en una cierta región del espacio” (Karel y col., 1985). La
inmovilización a menudo imita lo que ocurre naturalmente cuando las células crecen
sobre superficies o estructuras naturales.
Las ventajas que ofrece la técnica de inmovilización sobre los sistemas de células
libres han sido reportadas ampliamente (Ha y col., 2003; Plessas y col., 2007). Los
tratamientos de remediación con células inmovilizadas demostraron ser más efectivos
que con células libres, principalmente debido a la mayor productividad, la viabilidad de
procesos continuos, la estabilidad celular y los menores costos de recuperación,
reciclaje del biocatalizador y el procesamiento posterior (Bayat y col., 2015; Okafor y
Okeke 2017). A su vez, la inmovilización protege a las células del daño debido a las
fuerzas de cizallamiento, reduce la viscosidad aparente del medio y torna las
características reológicas de éste más favorables para el suministro de oxígeno y
transferencia de masa (Vassilev y Vassileva, 1992; Thongchul y Yang, 2003). Por lo
tanto, la inmovilización es una de las mejores herramientas para desarrollar
biocatalizadores económicamente rentables para procesos de biorremediación. Dicha
técnica puede ser aplicada tanto para enzimas como para células completas (Zajkoska y
col., 2013; Bayat y col., 2015).
Una de las principales ventajas de inmovilizar células completas comparada con la
inmovilización enzimática es que no se requiere la purificación previa de las enzimas
(Christwardana y col., 2018). La mayoría de los trabajos llevados a cabo sobre
inmovilización fueron inicialmente realizados con células bacterianas. Sin embargo,
con el correr de los años, el uso de levaduras y hongos filamentosos despertó un mayor
interés.
64
Las técnicas de inmovilización se pueden dividir en tres grupos principales según el
mecanismo físico empleado: (a) inmovilización por agregación celular, (b)
inmovilización por adhesión sobre superficies, (c) inmovilización por entrampamiento
dentro de una matriz porosa (Eş y col., 2015).
2.1.1.1 Inmovilización por agregación celular
La agregación o floculación celular ha sido definida por muchos autores como una
propiedad de las células para agregarse y adherirse rápidamente en grupos y
sedimentos. Puede considerarse como una técnica de inmovilización, debido a que los
agregados formados son de gran tamaño lo que hace posible su uso potencial en
reactores; por ejemplo, de lecho compacto, de lecho fluidizado y tanque agitado
continuo (Soares 2011; Zou y col., 2018).
La adhesión entre células se lleva a cabo a través de proteínas de la pared celular
denominadas “adhesinas” o “floculinas”. Dichas proteínas tienen propiedades de unión
a otras proteínas o de unión a carbohidratos. Así, los mecanismos de adhesión se
categorizan en dos grupos principales: adhesión de tipo lectina o adhesión insensible al
azúcar (Verstrepen y Klis 2006). El primer tipo se forma por la unión de un
carbohidrato de la pared de una célula a una “adhesina” de la pared de otra célula,
mientras que la adhesión insensible al azúcar se forma mediante la unión entre dos
proteínas (Zhao y Bai 2009). La capacidad para formar agregados se observa
principalmente en células con pared celular tales como hongos, levaduras y células
vegetales. También se pueden usar agentes floculantes artificiales o reticulantes para
mejorar la agregación en cultivos celulares que no floculan naturalmente (Verstrepen y
col., 2003; Kourkoutas y col., 2004).
2.1.1.2 Inmovilización sobre superficies por adhesión
La inmovilización celular en una superficie sólida se lleva a cabo por adsorción
física o unión covalente entre la célula y el soporte. La adsorción física implica
interacciones iónicas, fuerzas de Van der Waals o puentes de hidrógeno. La elección
del soporte resulta determinante en el comportamiento posterior del sistema. Este
soporte debe ser resistente a las condiciones de operación y fácilmente separable del
medio líquido para que pueda reutilizarse (Kourkoutas y col., 2004; Ahmed 2016). Este
método de inmovilización es probablemente el más utilizado. Como no existe ningún
65
tipo de barrera entre las células y el medio, el desprendimiento y la reubicación de las
células en el soporte es frecuente. Por lo general se llega a un estado de equilibrio entre
las células absorbidas y las células liberadas al medio (Bayat y col., 2015). Algunos
ejemplos de soportes utilizados en este tipo de inmovilización son materiales
inorgánicos como la espuma de poliuretano, esponja de nylon, sílice, piedra pómez,
porcelana porosa, vidrio poroso, etc. (Zucca y Sanjust 2014). También materiales
orgánicos como almidón, dextranos, agar y soportes lignocelulósicos como bagazo de
caña de azúcar, virutas de madera de pino o esponja vegetal (Mohammadi y
Nasernejad, 2009, Zucca y Sanjust 2014). Estos últimos permiten la reutilización de
residuos agrícolas y/o forestales, lo que representa una alternativa positiva desde el
punto de vista ambiental.
2.1.1.3 Inmovilización por entrampamiento dentro de una matriz porosa
Los métodos de entrampamiento se basan en la inclusión de células dentro de una
red rígida que evita que las mismas difundan al medio circundante y a la vez permite la
transferencia de nutrientes y metabolitos desde el medio hasta las células
inmovilizadas.
El crecimiento celular en la matriz porosa depende de las limitaciones en la difusión
de gases y nutrientes, que a su vez dependen de la porosidad y de la acumulación de
biomasa dentro del material (Smet y col., 2015).
Uno de los problemas del entrampamiento de células dentro de una matriz porosa es
la liberación y multiplicación de células al medio, lo que conduce a un sistema que
comprende tanto células inmovilizadas como libres. Para evitar este problema, se han
desarrollado métodos de recubrimiento del gel que permiten formar perlas de doble
capa que reducen la pérdida celular (Tang y col., 2011; Ching y col., 2017).
Se han utilizado diversas matrices sólidas para la inmovilización por
entrampamiento. Entre estas se destacan el entrampamiento en gel de polisacáridos
como alginato, carragenina, agar, quitosano y ácido poligalacturónico u otro tipo de
matriz polimérica como la gelatina, el colágeno y el alcohol polivinílico (Bayat y col.,
2015).
Los alginatos (polímeros formados por dos tipos de monosacáridos: ácidos
manurónicos y gulurónicos extraídos de algas pardas) son los polímeros de elección
para la mayoría de los sistemas de inmovilización ya que son fáciles de manejar y no
66
son tóxicos para los seres humanos ni el medio ambiente ni para los microorganismos
entrampados en ellos. A su vez, se encuentran disponibles en grandes cantidades, son
relativamente económicos, son transparentes y permeables. Desde una perspectiva
fisiológica, una de las principales ventajas del alginato es que, durante el procedimiento
de inmovilización, las células no sufren cambios extremos (Bayat y col., 2015; Ching y
col., 2017).
En base a lo expuesto, el objetivo de esta parte del trabajo fue evaluar la capacidad
de decoloración de colorantes textiles y vinaza empleando como biocatalizador células
en crecimiento de T. akiyoshidainum HP-2023 inmovilizadas en perlas de alginato de
calcio.
67
2.2 Materiales y métodos
2.2.1 Estrategia experimental
Figura 21. Esquema general de la estrategia experimental llevada a cabo. La parte
sombreada en gris se desarrolla en este capítulo.
*ETR: efluente textil real, *CT: colorantes textiles
2.2.2 Microorganismo y condiciones de cultivo
En todos los ensayos llevados a cabo en este capítulo se utilizó la cepa T.
akiyoshidainum HP-2023 cultivada en medio NDMopt.
2.2.3 Medios coloreados utilizados
Para los ensayos de decoloración con la levadura inmovilizada se trabajó con el
colorante NR5 y la mezcla de colorantes, en una concentración inicial de 200 mg L-1,
ambos en medio NDMopt. También se empleó el efluente textil real sin diluir y la vinaza
de destilería de alcohol, diluida al 10% v/v en agua destilada estéril (previamente
descriptos en la sección 1.2.5).
68
2.2.4 Biomasa de Trichosporon akiyoshidainum HP-2023
La cantidad de inóculo utilizada para la inmovilización fue equivalente a la utilizada
en los ensayos descriptos durante el capítulo 1, para que los resultados obtenidos
pudieran ser comparados entre sí (1.2.4). Los mismos consistieron en una suspensión
de la levadura T. akiyoshidainum HP-2023 (DO= 8) obtenida a partir de cultivos de 16
h en medio NDMopt. sin colorante. Los inóculos fueron utilizados en una proporción al
10% v/v en relación al medio a decolorar agregado. Luego se procedió a la
inmovilización de las células en perlas de alginato de calcio (CaAlg).
2.2.5 Método de inmovilización celular
La técnica de inmovilización se llevó a cabo siguiendo el protocolo publicado por
Tan y col. (2014), con modificaciones. Una vez preparado el inóculo se mezcló con un
volumen igual de solución de alginato de sodio (NaAlg) y se dejó caer gota a gota en
una solución de cloruro de calcio fría (5%, p/v) en agitación constante, utilizando una
pipeta Pasteur estéril.
Para minimizar la pérdida celular desde las perlas hacia el medio de cultivo, las
mismas se sometieron a un método de recubrimiento del gel. Después de permanecer a
4°C durante 1,5 h, las perlas fueron lavadas con agua bidestilada estéril y fueron
colocadas en una solución de NaAl (0,5% p/v) durante 10 minutos. Esto hizo que la
difusión del Ca2+ de las perlas produjera la gelificación de una segunda capa de alginato
sobre la superficie de las mismas. Posteriormente, las perlas fueron lavadas con agua
bidestilada estéril y se dejaron endurecer durante 1,5 h en una solución de cloruro de
calcio (5%, p/v). Finalmente las perlas se lavaron dos veces con una solución de cloruro
de sodio (0,9% p/v). Este método de recubrimiento del gel se llevó a cabo siempre que
se formaron las perlas de CaAlg, independientemente de las condiciones usadas.
Como control abiótico se prepararon perlas con buffer fosfato estéril en lugar de la
suspensión celular.
2.2.6 Microscopía electrónica de barrido de las perlas de alginato de calcio
Se realizó una microscopía electrónica de barrido de las perlas con las células de T.
akiyoshidainum HP-2023 inmovilizadas en un microscopio FESEM (Field emission
scanning electron microscopy) Carl Zeiss AG- SUPRA 55VP, en el Centro Integral de
Microscopía Electrónica (CIME), Tucumán, Argentina. Para esto, las perlas de CaAlg
69
con la levadura inmovilizada fueron deshidratadas en 30, 50, 70 y 90 % v/v de solución
de etanol durante 15 min sucesivamente. Luego fueron secadas y recubiertas con oro al
vacío. Los aumentos utilizados durante la microscopía fueron de: 75, 200, 10.000 y
12.000X.
2.2.7 Ensayos en medio líquido: decoloración por Trichosporon
akiyoshidainum HP-2023 inmovilizada en perlas de CaAlg
Las cinéticas de decoloración llevadas a cabo en este capítulo se realizaron en
Erlenmeyers de 250 mL con 50 mL del medio correspondiente. Los cultivos se
incubaron a 25 ºC y 250 rpm, excepto que se indique lo contrario. Las muestras
tomadas en cada ensayo fueron centrifugadas a 12.000 xg durante 10 min. El pellet y
los sobrenadantes obtenidos se conservaron para realizar las determinaciones analíticas
correspondientes a cada ensayo.
2.2.8 Determinaciones analíticas
2.2.8.1 Decoloración
La remoción del color se midió en un espectrofotómetro Thermo Scientific
Multiskan Go, como se detalló anteriormente en el capítulo 1 (1.2.7.1).
2.2.8.2 Determinación de la concentración de proteínas extracelulares
La concentración de proteínas totales en el sobrenadante durante el cultivo con
células de T. akiyoshidainum HP-2023 inmovilizadas en perlas de CaAlg se determinó
empleando el kit comercial del Ácido Bicinconínico (Kit BCA, Sigma-Aldrich)
utilizando albúmina de suero bovino (ASB) como patrón para la construcción de la
curva de calibración. La determinación se llevó a cabo durante el cultivo con y sin el
agregado de colorante (200 mg L-1 de NR5).
2.2.8.3 Determinación de aminas aromáticas totales (AAT)
En todos los casos, las AAT fueron determinadas en los sobrenadantes de cultivo
por el método de Oren y col. (1991), como se describió anteriormente en el capítulo 1
(1.2.7.2).
70
2.2.8.4 Determinaciones enzimáticas en medio líquido
Se evaluaron las actividades lacasa, POX, MnP, PiMn y catecolasa en los
sobrenadantes de cultivo; según la metodología descripta en el inciso 1.2.7.3 del
capítulo 1.
2.2.8.5 Bioensayos de toxicidad
Para determinar la toxicidad de los sobrenadantes se realizaron los bioensayos con
semillas de lechuga (L. sativa), de la misma manera en la que se detalló en el capítulo 1
(1.2.8).
2.2.9 Efectos de diferentes parámetros sobre la decoloración de NR5 por
células Trichosporon akiyoshidainum HP-2023 inmovilizadas en perlas de
CaAlg
2.2.9.1 Evaluación del efecto de diferentes concentraciones iniciales de
alginato de sodio sobre la decoloración de NR5
Como se explicó anteriormente (2.2.5), para formar las perlas de CaAlg se mezcló
un volumen de NaAl (a una determinada concentración) con un volumen de la
suspensión celular. En este ensayo se prepararon las perlas utilizando tres
concentraciones diferentes de NaAl: 1; 2 y 2,75% p/v y se evaluó el efecto sobre la
decoloración de 200 mg L-1 de NR5. Los cultivos se incubaron durante 24 h, a 25 ºC y
250 rpm. Se tomaron muestras al inicio del cultivo y a las 3, 6, 9, 12 y 24 h. Se
determinó biomasa por peso seco para evaluar la pérdida celular de las perlas hacia el
medio de cultivo. A partir de las muestras de sobrenadante se evaluó la decoloración en
un espectrofotómetro Thermo Scientific Multiskan Go, como se describió en 1.2.7.1.
Se incluyeron además ensayos con perlas no inoculadas como controles abióticos.
Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
2.2.9.2 Evaluación del efecto de la proporción de volumen inicial de
perlas/volumen inicial de medio sobre la decoloración de NR5
Se evaluó el efecto de la relación entre el volumen de perlas (Vp) y el del medio
líquido a decolorar (Vm) sobre la decoloración de 200 mg L-1 de NR5. Así, se trabajó
con valores de Vp/Vm de 0,05; 0,1; 0,4; 0,7 y 1 y teniendo en cuenta que el volumen de
71
medio fue siempre de 50 mL (2.2.5) se trabajó con volúmenes de perlas de 2,5; 5; 20;
35 y 50 mL.
Los cultivos con las diferentes cantidades de perlas se incubaron durante 24 h a 25
ºC y 250 rpm. Se tomaron muestras al inicio del cultivo y a las 3, 6, 9, 12 y 24 h y a
partir del sobrenadante se determinó decoloración en un espectrofotómetro Thermo
Scientific Multiskan Go, como se describió en 1.2.7.1.
Se incluyeron además ensayos con perlas no inoculadas como controles abióticos.
Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
2.2.9.3 Evaluación del efecto de diferentes velocidades de agitación sobre la
decoloración de NR5
Una vez determinada la concentración inicial de NaAl y el valor de Vp/Vm, se
evaluó el efecto de diferentes velocidades de agitación sobre la decoloración de 200 mg
L-1 de NR5. Los cultivos fueron incubados en agitador rotatorio a 150, 200 y 250 rpm
durante 24 h a 25 ºC. Se tomaron muestras al inicio del cultivo y a las 3, 6, 9, 12 y 24 h.
A partir de las muestras de sobrenadantes se determinó decoloración en un
espectrofotómetro Thermo Scientific Multiskan Go, como se describió en 1.2.7.1
(capitulo 1).
A fines comparativos, se incluyeron ensayos con cultivos de células de T.
akiyoshidainum HP-2023 no inmovilizadas, con inóculos iniciales equivalentes a los
ensayos con la levadura inmovilizada. Además, se realizaron ensayos con perlas no
inoculadas como controles abióticos. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
2.2.9.4 Evaluación del efecto de diferentes concentraciones iniciales de NR5
sobre la decoloración
Una vez seleccionada la concentración inicial de alginato, la relación óptima Vp/Vm
y la velocidad de agitación más adecuada, se trabajó con cuatro concentraciones
diferentes de NR5: 200, 400, 600 y 800 mg L-1. Los cultivos se incubaron durante 24 h
a 25 ºC y 250 rpm. Se tomaron muestras al inicio del cultivo y a las 3, 6, 9, 12 y 24 h y
a partir del sobrenadante se determinó decoloración en un espectrofotómetro Thermo
Scientific Multiskan Go, como se describió en 1.2.7.1 (capitulo 1).
A fines comparativos se incluyeron ensayos con cultivos de células de T.
akiyoshidainum HP-2023 no inmovilizadas, que contenían cada una de las
72
concentraciones de NR5 antes descriptas, con inóculos iniciales equivalentes a los
ensayos con la levadura inmovilizada. Además, se realizaron ensayos con perlas no
inoculadas como controles abióticos. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
Una vez seleccionados los parámetros que condujeron a la mayor remoción del
colorante NR5 en menos tiempo utilizando T. akiyoshidainum HP-2023 inmovilizada
en CaAlg (2% de NaAl, Vp/Vm: 0,7 y 250 rpm), se continuó trabajando con dichas
condiciones en todos los ensayos subsiguientes.
2.2.10 Reutilización de las células de Trichosporon akiyoshidainum HP-2023
inmovilizadas en perlas de CaAlg durante ciclos sucesivos de decoloración
Una vez que se determinaron los parámetros que mejor removieron el colorante NR5
en menos tiempo (2% de NaAl, Vp/Vm: 0,7 y 250 rpm) utilizando T. akiyoshidainum
HP-2023 inmovilizada en CaAlg, se evaluó la decoloración de NR5 durante ciclos
sucesivos. Además, se evaluó la decoloración de la mezcla de colorantes, efluente textil
real y vinaza utilizando los mismos parámetros de formación de perlas, durante ciclos
sucesivos de decoloración.
Después de la decoloración máxima alcanzada por la levadura (primer ciclo), las
perlas fueron separadas del medio decolorado, lavadas dos veces con agua bidestilada
estéril y luego fueron utilizadas para la decoloración en un segundo ciclo. Este
procedimiento se repitió tres veces (cuatro ciclos en total) (Tuttolomondo y col., 2014).
2.2.10.1 Decoloración de NR5 durante ciclos sucesivos
Se evaluó la decoloración de NR5 durante cuatro ciclos de 24 h cada uno. Se
tomaron muestras asépticamente al inicio del cultivo y a las 3, 6, 9, 12 y 24 h. En el
sobrenadante de dichas muestras se evaluó la decoloración y la actividad enzimática.
Además se determinó AAT y toxicidad al inicio y final del ensayo (al final del cuarto
ciclo).
Para comparar los resultados obtenidos con células inmovilizadas con el tratamiento
con células libres, se utilizaron los resultados obtenidos utilizando la levadura libre en
suspensión descriptos en el capítulo 1, ya que se realizaron en condiciones
experimentales idénticas.
73
2.2.10.2 Decoloración de la mezcla de colorantes durante ciclos sucesivos
Se evaluó la decoloración de la mezcla de colorantes durante cuatro ciclos de 24 h
cada uno. Se trabajó de la misma manera descripta para el colorante NR5 (2.2.9.1).
2.2.10.3 Decoloración del efluente textil real durante ciclos sucesivos
Se evaluó la decoloración del efluente textil real durante cuatro ciclos de 24 h cada
uno. Se trabajó de la misma manera descripta para el colorante NR5 (2.2.9.1).
2.2.10.4 Decoloración de vinaza durante ciclos sucesivos
Se evaluó la decoloración de vinaza durante cuatro ciclos de 96 h cada uno. Se
tomaron muestras asépticamente al inicio del cultivo y a las 3, 6, 9, 12 y 24 h, durante
el primer ciclo y luego cada 12 h. En el sobrenadante de dichas muestras se evaluó
decoloración y actividad enzimática. Además, se determinó AAT y toxicidad al inicio y
final del ensayo (final del cuarto ciclo).
Para comparar los resultados con el tratamiento con células libres, se utilizaron los
resultados obtenidos utilizando la levadura libre en suspensión descriptos en el capítulo
1, ya que se realizaron en condiciones experimentales idénticas.
2.2.11 Análisis estadístico
Las diferencias en los valores de decoloración y toxicidad se analizaron mediante un
análisis de la varianza de un solo factor (One way ANOVA). Cuando se encontraron
diferencias significativas se utilizó la prueba de Tukey para separar los efectos de los
tratamientos. Las pruebas se consideraron significativamente diferentes si p < 0,05 con
un intervalo de confianza (IC) del 95%. Los análisis se realizaron empleando el paquete
estadístico Minitab 17.0.
74
2.3 Resultados y discusión
2.3.1 Microscopía electrónica de barrido las perlas de alginato de calcio
Se estudió la estructura de las perlas de CaAlg con la levadura inmovilizada
utilizando la microscopía electrónica de barrido. Las imágenes se muestran en la Figura
22.
El diámetro promedio de la perla fue de 0,5 cm. Con un aumento de 75X se observó
su forma esférica, con una superficie lisa y aparentemente sin grietas (Figura 22A). A
200X se evidenció una perla densa, con una rugosidad marcada y de superficie irregular
(también sin grietas) (Figura 22B). A 10.000X, las microfotografías revelaron la
presencia de cristales en las superficies de las perlas (Figura 22C). Las microfotografías
22D (10.000X) y E (12.000X) muestran la levadura T. akiyoshidainum HP-2023
incrustada en la matriz de gel de CaAlg. El ancho promedio de la levadura fue 2,6-3,5
um.
75
Figura 22. Fotografías tomadas mediante MEB de las perlas de CaAlg. (A), (B) y (C)
morfologías superficiales; (D) y (E) parte interna de las perlas. Las perlas fueron
preparadas a partir de una solución de 2% de NaAl. Cristal; Levadura.
76
2.3.2 Efectos de diferentes parámetros sobre la decoloración de NR5 por
células Trichosporon akiyoshidainum HP-2023 inmovilizada en perlas de
CaAlg
2.3.2.1 Evaluación del efecto de diferentes concentraciones iniciales de
alginato de sodio sobre la decoloración de NR5
Las perlas de alginato no inoculadas adsorbieron cantidades significativas de NR5.
Luego de 30 minutos de incubación, las perlas removieron un 40% del color del medio
con NR5, tiñéndose en el proceso. Como se observa en la Figura 23, este porcentaje
permaneció constante hasta el final de los ensayos. Estos resultados indicaron que las
perlas no inoculadas fueron capaces de adsorber el colorante NR5, alcanzando
rápidamente el equilibrio entre la cantidad adsorbida y la concentración de colorante en
el medio de cultivo.
Por el contrario, las perlas inoculadas con la levadura lograron la decoloración total
de la solución. Al finalizar el tratamiento de 24 h no quedaron coloreadas, lo que indica
la degradación del colorante por la levadura. De todos modos no se puede descartar una
primera etapa de adsorción del mismo a las perlas de alginato (Figura 23).
Figura 23. Controles abióticos sin levaduras (arriba) y con células de T.
akiyoshidainum HP-2023 inmovilizadas (abajo) en perlas de CaAlg al inicio del
tratamiento (T0), a los 30 min (T30') y a las 24 h de tratamiento (T24h).
La Figura 24 muestra las cinéticas de decoloración de NR5 en el medio NDMopt.
obtenidas al emplear la levadura inmovilizada en perlas de alginato, preparadas a partir
77
de diferentes concentraciones iniciales de NaAl (1, 2 y 2,75%). A las 6 h de cultivo se
observó una remoción aproximadamente del 80% para las perlas formadas con 2 y
2,75% de alginato. Por el contrario, las perlas formadas con 1% evidenciaron una
decoloración más lenta, obteniéndose una remoción del 60% a las 6 h de cultivo. Por lo
tanto, la velocidad de remoción (mg de colorante removido por hora) fue mayor al
emplear mayores concentraciones de alginato (20,06; 28,62 y 29,96 mg h-1 para 1; 2 y
2,75% de alginato, respectivamente). Debido a que no se observó diferencias
significativas en las velocidades de remoción al emplear 2 y 2,75% de alginato
(p=0,109), se decidió continuar trabajando con la menor concentración.
Figura 24. Cinética de decoloración durante el cultivo con células de T.
akiyoshidainum HP-2023 inmovilizadas en perlas de CaAlg en medio NDMopt. con 200
mg L-1 de NR5 empleando 1, 2 y 2,75% de NaAl
En la figura 25, se observan las curvas de crecimiento de las células de T.
akiyoshidainum HP-2023 liberadas de las perlas al medio líquido. En los cultivos con
las perlas preparadas con 1% de NaAl se detectó un mayor crecimiento celular en el
medio en comparación con 2 y 2,75% de NaAl. Cabe destacar que, independientemente
de las concentraciones de alginato utilizadas, siempre se trabajó con el mismo medio de
cultivo y por lo tanto las mismas concentraciones de nutrientes. Por lo tanto, las
diferencias en las cinéticas de crecimiento se deben a que al utilizar bajas
concentraciones de alginato, la malla de gel formada permite una mayor liberación y
multiplicación de levaduras en el medio de cultivo.
78
Figura 25. Cinética de crecimiento de las células de T. akiyoshidainum HP-2023
liberadas de las perlas de CaAlg en medio NDMopt. con 200 mg L-1 de NR5 empleando
1, 2 y 2,75% de NaAl
El espesor de la pared de las perlas depende directamente de la concentración de
NaAlg y de la transferencia de nutrientes y O2 entre el medio y las perlas depende de
dicho espesor (Li y col., 2006). Por lo tanto, las concentraciones más altas de NaAlg
empleadas (2 y 2,75%) no perjudicarían la transferencia de nutrientes y O2 debido a que
tanto la eficiencia en la decoloración de NR5 como el crecimiento de la levadura no se
vieron afectadas por la técnica de inmovilización ya que se obtuvieron muy buenos
valores de decoloración y, como se explicó anteriormente, la decoloración por T.
akiyoshidainum HP-2023 ocurre durante el crecimiento de la levadura.
2.3.2.2 Evaluación del efecto de la proporción de volumen inicial de
perlas/volumen inicial de medio sobre la decoloración de NR5
A las 6 h de tratamiento se registraron valores de decoloración menores al 60% para
Vp/Vm de 0,05; 0,1 y 0,4; mientras que con relaciones iguales o superiores a 0,7 se
obtuvieron decoloraciones superiores al 85% (Figura 26). Es decir que los valores de
decoloración dependen de la relación entre el volumen de perlas y el volumen de medio
a decolorar. A su vez, comparando estos últimos resultados (Vp/Vm ≥ 0,7) con los
obtenidos con la levadura libre en suspensión, se observó un aumento en la velocidad
de decoloración al inmovilizar la levadura ya que, a las 6 h de cultivo, los valores de
remoción fueron de aproximadamente 50 y 85% con la levadura libre e inmovilizada,
respectivamente (Figura 27). Además, el sobrenadante resultante del tratamiento de
decoloración con las perlas fue más límpido que el obtenido con las células libres,
como se observa en la Figura 28. Esto pudo deberse a un aumento en la eficiencia de
79
decoloración de la levadura, o bien a una remoción inespecífica de sólidos en
suspensión por las perlas.
En base los resultados descriptos, se decidió continuar trabajando con una relación
Vp/Vm de 0,7.
Figura 26. Porcentajes de decoloración obtenidos a las 6 y 24 h durante el cultivo con
células de T. akiyoshidainum HP-2023 inmovilizadas en perlas de CaAlg en medio
NDMopt. con 200 mg L-1 de NR5 empleando diferentes valores de Vp/Vm
Figura 27. Cinética de decoloración durante el cultivo con células de T.
akiyoshidainum HP-2023 inmovilizadas en perlas de CaAlg (Vp/Vm=0,7), libres en
suspensión y con el control abiótico en medio NDMopt. con 200 mg L-1 de NR5. CL:
Célula libre, CI: Célula inmovilizada
80
Figura 28. Sobrenadantes obtenidos a las 24 h de cultivo con células de T.
akiyoshidainum HP-2023 inmovilizadas en perlas de CaAlg (izquierda) y libres en
suspensión (derecha) durante la decoloración de 200 mg L-1 de NR5
2.3.2.3 Evaluación del efecto de diferentes velocidades de agitación sobre la
decoloración de NR5
Como se observa en la Figura 29, las velocidades de agitación influyen en la cinética
de decoloración por T. akiyoshidainum HP-2023. Así, con la levadura inmovilizada, a
200 y 250 rpm se removió más del 85% de NR5 en 6 h, mientras que a 150 rpm fue
necesario el doble de tiempo para lograr dicha remoción. De manera similar, con las
células libres en crecimiento, la velocidad de decoloración aumentó con la velocidad de
agitación, ya que a las 12 h de cultivo se obtuvieron valores de decoloración
aproximadamente de 45 y 85% a 150 y 250 rpm, respectivamente. Estos resultados
posiblemente se deban a un aumento en la velocidad de transferencia de O2 y nutrientes
entre el medio y la biomasa como consecuencia de la mayor velocidad de agitación,
acorde con lo descripto por Stalin (2014).
Debido a que la decoloración obtenida con las levaduras inmovilizadas a 200 y 250 rpm
fue similar, se decidió continuar trabajando con 250 rpm, ya que son las condiciones
estándares utilizadas en nuestro laboratorio.
81
Figura 29. Cinética de decoloración durante el cultivo con células de T.
akiyoshidainum HP-2023 inmovilizadas en perlas de CaAlg y libres en suspensión en
medio NDMopt. con 200 mg L-1 de NR5 a 120, 200 y 250 rpm. CL: Célula libre, CI:
Célula inmovilizada.
2.3.2.4 Evaluación del efecto de diferentes concentraciones iniciales de NR5
sobre la decoloración
En la Figura 30 se observan las cinéticas de decoloración obtenidas con diferentes
concentraciones iniciales de NR5, utilizando tanto la levadura inmovilizada (Vp/Vm=
0,7) como cultivos de células libres en suspensión a 250 rpm.
Figura 30. Cinéticas de decoloración durante el cultivo con células de T.
akiyoshidainum HP-2023 inmovilizadas en perlas de CaAlg y libres en suspensión en
medio NDMopt. con 200, 400, 600 Y 800 mg L-1 de NR5. CI: Levadura inmovilizada,
CL: Levadura libre.
82
A partir de estas cinéticas se confeccionó la Tabla 19, donde se observa que, al
inmovilizar la levadura, la velocidad de decoloración es aproximadamente 1,4 veces
mayor que al emplear las células libres. En la Tabla 20 se muestra la mayor capacidad
de la levadura inmovilizada para decolorar una concentración superior de colorante.
Así, en cultivos con 600 mg L-1 de NR5, las células decoloraron menos del 55%,
mientras que las células inmovilizadas decoloraron el 100%.
Tabla 19. Velocidad de decoloración (mg colorante h-1) durante el cultivo con células
de T. akiyoshidainum HP-2023 inmovilizadas en perlas de CaAlg y libres en
suspensión en medio NDMopt. con 200, 400, 600 Y 800 mg L-1 de NR5.
*CL: Célula Libre, CI: Célula Inmovilizada.
Tabla 20. Concentración de colorante removido al final del tratamiento (T24) /
porcentaje de decoloración equivalente, durante el cultivo con células de T.
akiyoshidainum HP-2023 inmovilizadas en perlas de CaAlg y libres en suspensión en
medio NDMopt. con 200, 400, 600 y 800 mg L-1 de NR5.
*CL: Célula Libre, CI: Célula Inmovilizada.
Independientemente de la concentración inicial de colorante y partiendo de inóculos
iguales, la levadura en suspensión remueve aproximadamente 340 mg L-1 de NR5 como
máximo, mientras que inmovilizada en las perlas remueve 650 mg L-1 de colorante en
24 h (Tabla 20).
83
Otro resultado interesante observado durante la decoloración de NR5 (200 mg L-1)
con las células inmovilizadas fue que la concentración total de proteínas en los
sobrenadantes (3,72 µg mL-1) fue significativamente mayor (2,5 veces mayor) que en
los de las levaduras libres (1,5 µg mL-1). Es decir, que las levaduras al estar
inmovilizadas producen una mayor cantidad de proteínas extracelulares, probablemente
involucradas en el proceso de decoloración de NR5.
En comparación con la literatura relacionada, la levadura T. akiyoshidainum HP-
2023 mostró una alta eficacia para decolorar NR5. Tuttolomondo y col. (2014)
reportaron una decoloración máxima de 100 mg L-1 de Negro Remazol, Naranja
Bencilo y Naranja de Metilo empleando la bacteria Pseudomonas sp. inmovilizada en
una matriz de sílice de sol-gel. Por otro lado, la levadura Magnusiomyces ingens LH-F1
inmovilizada en perlas de CaAlg fue capaz de decolorar hasta 300 mg L-1 de Rojo
Ácido B en 56 h de tratamiento (Tan y col., 2014), mientras que la levadura T.
akiyoshidainnum HP-2023 inmovilizada decoloró hasta 650 mg L-1 de NR5 en 24 h. En
base a los resultados obtenidos, se decidió continuar trabajando con 2% de NaAl, 250
rpm, proporción Vp/Vm de 0,7 y 200 mg L-1 de colorante NR5, para que así los
resultados de decoloración obtenidos puedan ser comparados con los ensayos utilizando
la levadura libre. A su vez, efluentes textiles con concentraciones residuales entre 10 y
200 mg L-1 resultan muy coloreados (Pandey y col., 2007), por lo que es una
concentración útil para evaluar bioprocesos de decoloración.
2.3.3 Reutilización de las células de Trichosporon akiyoshidainum HP-2023
inmovilizadas en perlas de CaAlg durante sucesivos ciclos de decoloración
Una vez seleccionadas las condiciones de trabajo que permitieron la decoloración
más eficiente de NR5 (2% de NaAl, 250 rpm y una proporción Vp/Vm de 0,7) se
decidió evaluar la reutilización de las perlas en ciclos sucesivos de decoloración de
NR5, mezcla de colorantes (200 mg L-1), efluente textil real y vinaza.
2.3.3.1 Decoloración de NR5 durante ciclos sucesivos
Cuando se reutilizó la biomasa de T. akiyoshidainum libre, la eficiencia en la
decoloración de NR5 disminuyó a partir del segundo ciclo, ya que se obtuvo un 50 y
40% de remoción en el tercer y cuarto ciclo, respectivamente (Tabla 21).
84
85
Tabla 21. Decoloración máxima obtenida durante la decoloración de NR5 con el
cultivo de células de T. akiyoshidainum HP-2023 libres e inmovilizadas por cuatro
ciclos sucesivos de reutilización de la biomasa.
*CL: Célula Libre, CI: Célula Inmovilizada.
Por el contrario, la capacidad de decoloración de la levadura inmovilizada se
mantuvo hasta el final del cuarto ciclo (100% de remoción) (Figura 31A, Tabla 21).
También se midió el pH a lo largo de los cuatro ciclos de decoloración (Figura 31B). Se
observó que independientemente del reciclo de la biomasa, el valor de pH a las 24 h de
tratamiento fue aproximadamente 2,8. Con respecto a las AAT, las mismas fueron
removidas en un 60% al finalizar el cuarto ciclo, es decir que a pesar que se reutilizó la
biomasa, esto no conllevó a la acumulación de aminas en el medio.
86
Figura 31. Cinética de decoloración de NR5 (A) y de pH (B) durante el cultivo con
células de T. akiyoshidainum HP-2023 inmovilizadas en perlas de CaAlg por cuatro
ciclos sucesivos de reutilización de biomasa
La actividad enzimática lacasa no fue detectada en ninguno de los ciclos de
decoloración de NR5 con la levadura inmovilizada. Las actividades POX, PiMn, MnP y
catecolasa sólo se detectaron en presencia del colorante.
La actividad MnP obtenida con T. akiyoshidainum HP-2023 inmovilizada en el
primer ciclo de decoloración de NR5 (0,65 U L-1) fue aproximadamente el doble de la
observada en cultivos con células libres (0,31 U L-1), lo cual puede estar en directa
relación con la mayor cantidad de proteínas extracelulares producidas durante el cultivo
con células inmovilizadas (2.3.2.4).
Con respecto a la actividad PiMn, los valores fueron similares independientemente
del sistema utilizado (células libres o inmovilizadas), por lo tanto, los aumentos que se
observaron en la actividad POX con la levadura inmovilizada fueron atribuidos a la
actividad MnP. Se demostró también que la actividad MnP obtenida en el primer ciclo
de decoloración se mantuvo hasta el ciclo 3 (Tabla 22).
La actividad catecolasa medida también fue mayor para las levaduras inmovilizadas
en comparación con las levaduras libres. En el primer ciclo con NR5, se observó que la
levadura inmovilizada producía aproximadamente tres veces más actividad catecolasa
(0,95 U L-1) que las levaduras libres (0,31 U L-1). Tanto la actividad MnP como la
actividad catecolasa fueron positivas en todos los ciclos de decoloración de NR5 (Tabla
22).
87
Tabla 22. Decoloración (%), actividades MnP y catecolasa máximas (U L-1) obtenidas
durante la decoloración de NR5 con células de T. akiyoshidainum HP-2023
inmovilizadas en perlas de CaAlg durante cuatro ciclos sucesivos de reutilización de la
biomasa
Como se describió en el capítulo 1 (1.3.2.1), el colorante NR5 presentó una elevada
fitotoxicidad antes del tratamiento con la levadura (Figura 32). Al finalizar el cuarto
ciclo de decoloración con las células inmovilizadas, se observó un aumento en el
número de semillas germinadas, longitud radicular y de hipocótilos (Tabla 23), lo cual
se reflejó en el mayor índice de germinación del medio con NR5 decolorado (mayor a
85%) (Figura 32).
Figura 32. Índice de germinación de los sobrenadantes obtenidos durante el cultivo con
células de T. akiyoshidaiunum HP 2023 inmovilizadas en perlas de CaAlg con NR5 al
inicio (Ti) y final del último ciclo de decoloración (Tf). Como control se utilizó H2O
destilada
88
Tabla 23. Efectos del colorante NR5 al inicio (Ti) y final del último ciclo de
decoloración (Tf) con células de T. akiyoshidainum HP-2023 inmovilizadas en perlas de
CaAlg sobre la germinación y desarrollo de L. sativa
*LR: Longitud Radicular, LH: Longitud del Hipocótilo, GR: Germinación Relativa,
LLR: Longitud Radicular Relativa, IG: Índice de Germinación.
2.3.3.2 Decoloración de la mezcla de colorantes durante ciclos sucesivos
La decoloración de la mezcla de colorantes en cultivos con la levadura inmovilizada
ocurre más rápido que en los cultivos con células libres (de igual manera a lo observado
durante la decoloración de NR5) (Figura 33A). Con la levadura inmovilizada se
obtuvieron porcentajes de remoción mayores a 75% a las 6 h de cultivo, mientras que
con la levadura libre fue necesario un tratamiento de 12 h para alcanzar el mismo
porcentaje de decoloración. Estos resultados demostraron un aumento del 100% en la
velocidad de decoloración mediante la técnica de inmovilización.
Con respecto a los ciclos de decoloración, se observó una decoloración
aproximadamente del 70% en el tercer ciclo con la levadura inmovilizada (Figura 33B),
mientras que con las células libres en suspensión la remoción fue menor al 30% (Tabla
24).
89
Figura 33. Cinética de decoloración de la mezcla de colorantes durante (A) el primer
ciclo con células de T. akiyoshidainum HP-2023 inmovilizadas en perlas de CaAlg
(Vp/Vm=0,7) y libres en suspensión; (B) los cuatro ciclos de decoloración con T.
akiyoshidainum HP-2023 inmovilizada
Tabla 24. Decoloración máxima obtenida durante la decoloración de la mezcla de
colorantes con el cultivo de células de T. akiyoshidainum HP-2023 libres e
inmovilizadas por cuatro ciclos sucesivos de reutilización de la biomasa
*CL: Célula Libre, CI: Célula Inmovilizada.
La disminución en la decoloración con la levadura inmovilizada en el tercer y cuarto
ciclo se puede explicar por la presencia del colorante Rojo Reactivo 121. Dicho
colorante es decolorado mediante un mecanismo de adsorción cuando T.
akiyoshidainum HP-2023 es cultivada tanto en forma libre (Pajot 2009, Martorell 2014)
como inmovilizado; hecho que se refleja en la coloración rojiza de las perlas al final del
tratamiento (Figura 34A), a diferencia de la coloración de las perlas al final del
tratamiento con NR5 (Figura 34B).
90
Figura 34. Imágenes de las perlas de CaAlg con la levadura T. akiyoshidainum HP-
20230 inmovilizada al finalizar el tratamiento de decoloración con (A) mezcla de
colorantes y (B) NR5.
Por lo tanto, se asume que la diminución en la decoloración se debe a la saturación
de las perlas con dicho colorante, razón por la cual no es removido del medio en el
tercer y cuarto ciclo. La saturación con colorante en perlas de alginato fue previamente
descripta por Aravindhan y col. (2007), quienes describieron que posterior al estado de
equilibrio entre moléculas adsorbidas y adsorbente (punto de saturación) no puede
haber más decoloración por adsorción.
Al finalizar el cuarto ciclo con las células inmovilizadas se obtuvo una remoción de
AAT aproximadamente del 45%, es decir, que la reutilización de la biomasa no
conduce a acumular aminas aromáticas. Con respecto al pH del medio, se observó que
al finalizar el cuarto ciclo se alcanzaron valores aproximadamente de 3,5; similar a los
obtenidos durante el tratamiento de la mezcla con células libres (inciso 1.3.2.1).
La actividad lacasa tampoco pudo ser detectada durante los ciclos de decoloración
con las perlas. La actividad MnP medida durante el primer ciclo con las células
inmovilizadas fue mayor (0,7 U L-1) que la medida en cultivos con las células libres
91
(0,4 U L-1), similar a lo observado durante el tratamiento de NR5. La misma tendencia
se observó para la actividad catecolasa, ya que se obtuvieron 0,86 y 0,4 U L-1 durante el
primer ciclo de decoloración con la levadura inmovilizada y libre, respectivamente. Al
finalizar el cuarto ciclo con la mezcla, la actividad MnP y catecolasa fueron también
positivas e iguales a 0,59 y 0,63 U L-1, respectivamente (Tabla 25).
Tabla 25. Decoloración (%), actividad MnP y actividad catecolasa máximas (U L-1)
obtenidas durante la decoloración la mezcla de colorantes con células de T.
akiyoshidainum HP-2023 inmovilizadas en perlas de CaAlg durante cuatro ciclos
sucesivos de reutilización de biomasa
De manera similar a lo observado durante la decoloración de NR5, al finalizar el
cuarto ciclo de decoloración, la toxicidad de la mezcla disminuyó, lo cual se evidenció
por el aumento en el IG a 87%, diez veces mayor que el obtenido a tiempo inicial
(Tabla 26, Figura 35).
Tabla 26. Efectos la mezcla de colorantes al inicio (Ti) y final del último ciclo de
decoloración (Tf) con células de T. akiyoshidainum HP-2023 inmovilizadas en perlas de
CaAlg sobre la germinación y desarrollo de L. sativa.
*LR: Longitud radicular; LH: longitud del Hipocótilo; GR: Germinación Relativa,
LLR: Longitud Radicular Relativa, IG: Índice de Germinación
92
Figura 35. Índice de germinación de los sobrenadantes obtenidos durante el cultivo con
células de T. akiyoshidaiunum HP 2023 inmovilizadas en perlas de CaAlg con la
mezcla de colorantes al inicio (Ti) y final del último ciclo de decoloración(Tf). Como
control se utilizó H2O destilada
2.3.3.3 Decoloración del efluente textil real durante ciclos sucesivos
En el primer ciclo de tratamiento se observó la decoloración completa del efluente
textil real, tanto en cultivos con la levadura inmovilizada como con la levadura libre en
suspensión (Figura 36A). Sin embargo, la remoción del color con las células libres
disminuyó con el número de ciclos (Tabla 27), ya que a partir del segundo ciclo sólo se
removió un 50%, mientras que con la levadura inmovilizada la decoloración se
mantuvo entre 100 y 90% durante los cuatro ciclos (Figura 36B).
93
Figura 36. Cinética de decoloración del efluente textil real durante (A) el primer ciclo
con T. akiyoshidainum HP-2023 inmovilizada en perlas de CaAlg (Vp/Vm=0,7) y
libres en suspensión; (B) los cuatro ciclos de decoloración con T. akiyoshidainum HP-
2023 inmovilizada
Tabla 27. Decoloración máxima obtenida durante la decoloración del efluente textil
real con el cultivo de células de T. akiyoshidainum HP-2023 libres e inmovilizadas por
cuatro ciclos sucesivos de reutilización de la biomasa
*CL: Célula Libre, CI: Célula Inmovilizada
Durante los ciclos de decoloración del efluente real, se detectaron actividades MnP y
catecolasa, es decir las mismas que para los tratamientos descriptos recientemente.
La actividad MnP medida en cultivos con células libres durante el primer ciclo de
decoloración fue 0,22 U L-1, mientras que en cultivos con la levadura inmovilizada fue
de 0,39 U L-1. La actividad catecolasa medida fue 0,23 y 0,35 U L-1 en cultivos con las
células libres e inmovilizadas, respectivamente. Es decir, que la actividad enzimática en
los cultivos con células inmovilizadas fue aproximadamente 1,6 veces mayor que la
activad presente en las células libres. Tanto la actividad MnP como la actividad
catecolasa fueron positivas en todos los ciclos durante los cultivos con la levadura
inmovilizada. Así, en el cuarto ciclo se obtuvieron 0,29 y 0,13 U L-1 de actividad MnP
94
y catecolasa respectivamente (Tabla 28), mientras que con las células libres no se
detectó actividad enzimática a partir del segundo ciclo (inciso 1.3.2.1).
Tabla 28. Decoloración (%), actividad MnP y actividad catecolasa máximas (U L-1)
obtenidas durante la decoloración del efluente textil con células de T. akiyoshidainum
HP-2023 inmovilizadas en perlas de CaAlg durante cuatro ciclos sucesivos de
reutilización de la biomasa
Como se describió en el capítulo 1 (1.3.2.2), el efluente textil real a tiempo inicial
resultó ser sumamente tóxico (IG ˂ 50%). Sin embargo, luego del cuarto ciclo de
decoloración, la toxicidad de dicho efluente disminuyó ya que se obtuvo un valor de IG
˃ 85% (Figura 37, Tabla 29). Por lo tanto, la reutilización de la biomasa inmovilizada
no sólo permite la decoloración eficiente del efluente textil durante cuatro ciclos
consecutivos, sino que también disminuye la fitotoxicidad del mismo.
Figura 37. Índice de germinación de los sobrenadantes obtenidos durante el cultivo con
células de T. akiyoshidaiunum HP 2023 inmovilizadas en perlas de CaAlg con el
efluente textil real al inicio (Ti) y final del último ciclo de decoloración(Tf). Como
control se utilizó H2O destilada.
95
Tabla 29. Efectos de la mezcla de colorantes al inicio (Ti) y final del último ciclo de
decoloración (Tf) con células de T. akiyoshidainum HP-2023 inmovilizadas en perlas de
CaAlg sobre la germinación y desarrollo de L. sativa.
LR: Longitud radicular, LH: longitud del Hipocótilo, GR: Germinación Relativa, LLR:
Longitud Radicular Relativa, IG: Índice de Germinación
2.3.3.4 Decoloración del efluente vinaza durante ciclos sucesivos
La máxima decoloración de vinaza con la levadura inmovilizada (40%) se obtuvo a
las 36 h de tratamiento mientras que, con las células libres, dicha remoción fue
alcanzada a las 72 h de cultivo (Figura 38A). Con respecto a los ciclos de decoloración,
aproximadamente un 40% del color de la vinaza se removió en el cuarto ciclo con las
células inmovilizadas, mientras que con las células libres menos del 10% (Figura 38B y
Tabla 30). Es decir que, al igual que lo observado durante la decoloración de NR5, la
mezcla de colorantes y del efluente textil real, el tratamiento con las células de T.
akiyoshidainum HP-2023 inmovilizadas redujo a la mitad el tiempo necesario para
alcanzar la máxima decoloración de vinaza.
96
Figura 38. Cinéticas de decoloración de vinaza durante (A) el primer ciclo con T.
akiyoshidainum HP-2023 inmovilizada en perlas de CaAlg (Vp/Vm=0,7) y libres en
suspensión; (B) los cuatro ciclos de decoloración con T. akiyoshidainum HP-2023
inmovilizada
Tabla 30. Decoloración máxima obtenida durante la decoloración de vinaza con el
cultivo de células de T. akiyoshidainum HP-2023 libres e inmovilizadas por cuatro
ciclos sucesivos de reutilización de la biomasa
*CL: Célula Libre, CI: Célula Inmovilizada
En la Figura 39 se observa el color de la vinaza a tiempo inicial y luego del
tratamiento con las células de T. akiyoshidainum HP-20230 inmovilizadas.
De manera similar a lo descripto durante el tratamiento con células libres en el
capítulo 1 (1.3.2.3), las AAT disminuyeron a lo largo del cultivo, alcanzando valores de
remoción de 30% al final del cultivo. El pH inicial de la vinaza fue de 5,15. El descenso
del pH acompañó la decoloración por la levadura inmovilizada, alcanzándose valores
de entre 2,50 y 2,80 al finalizar el tratamiento, ligeramente inferiores a los obtenidos
con la levadura libre (pH= 3,00).
97
Figura 39. Imagen de la vinaza a tiempo inicial (izquierda) y final del tratamiento
(derecha) con células de T. akiyoshidainum HP-20230 inmovilizadas en perlas de
CaAlg
Las actividades enzimáticas medidas durante la decoloración de vinaza con la
levadura inmovilizada mostraron la misma tendencia que la descripta para los
colorantes y el efluente textil. Las máximas actividades MnP y catecolasa obtenidas
durante el primer ciclo con las células inmovilizadas fueron mayores (0,49 y 0,79 U L-
1, respectivamente) a las observadas con las células libres (0,27 y 0,3 U L-1,
respectivamente).
Como se describió en el capítulo anterior, la decoloración y las actividades
enzimáticas medidas durante la decoloración de vinaza con células libres disminuyeron
con el número de ciclos (1.3.2.3). Por el contrario, al inmovilizar la levadura, no sólo se
mantuvo la decoloración durante los cuatro ciclos, sino también los títulos de las
actividades MnP y catecolasa (Tabla 31). Así, en el último ciclo se obtuvieron 0,44 y
0,54 U L-1 de actividad MnP y catecolasa, respectivamente.
Tabla 31. Decoloración (%), actividad MnP y actividad catecolasa máximas (U L-1)
obtenidas durante la decoloración de vinaza empleando la levadura T. akiyoshidainum
HP-2023 inmovilizada durante cuatro ciclos sucesivos de reutilización de la biomasa
98
La vinaza a tiempo inicial exhibió una elevada toxicidad sobre las semillas de L.
sativa (IG ˂ 50%) (Figura 40) (lo cual fue descripto anteriormente, 1.3.2.3). Sin
embargo, la vinaza resultante del cuarto ciclo resultó menos tóxica ya que luego de
incubar las semillas con dicha vinaza, se obtuvieron mayores longitudes de hipocótilos
y radículas (Tabla 32) lo cual se reflejó en un mayor índice de germinación (˃70%).
Los resultados aquí obtenidos difieren con los descriptos durante la decoloración de
vinaza con células libres en suspensión (1.3.2.3), donde el tratamiento de decoloración
con la levadura no reduce la fitotoxicidad del fluente (IG ˂ 50%).
Figura 40. Índice de germinación de los sobrenadantes obtenidos durante el cultivo con
células de T. akiyoshidaiunum HP-2023 inmovilizadas en perlas de CaAlg con vinaza
al inicio (Ti) y final del último ciclo de decoloración (Tf). Como control se utilizó H2O
destilada.
Tabla 32. Efectos de la vinaza al inicio (Ti) y final del último ciclo de decoloración (Tf)
con células de T. akiyoshidainum HP-2023 inmovilizadas en perlas de CaAlg sobre la
germinación y desarrollo de L. sativa.
*LR: Longitud radicular; LH: longitud del Hipocótilo; GR: Germinación Relativa,
LLR: Longitud Radicular Relativa, IG: Índice de Germinación, IV: Índice de Vigor.
99
Los resultados obtenidos en este capítulo comparados con los descriptos en el
capítulo 1, sugieren que la inmovilización de la levadura promueve un cambio en sus
características fisiológicas y actividades enzimáticas, por lo que el proceso de
decoloración con la levadura libre y con la levadura inmovilizada son diferentes,
principalmente en relación a la velocidad de decoloración y capacidad de decoloración
durante la reutilización de la biomasa.
Los cambios fisiológicos en levaduras inmovilizadas fueron descriptos por
numerosos autores. Ganatsios y col. (2014) inmovilizaron la levadura S. cerevisiae
sobre un material de celulosa poroso para la fermentación de maltosa a 10 °C. Las
células inmovilizadas completaron la fermentación, mientras que las células libres no
pudieron fermentar la maltosa a esa temperatura. Jamai y col. (2001) observaron que la
actividad fermentativa de levaduras inmovilizadas en alginato era independiente del pH
del medio de cultivo, mientras que la misma actividad fermentativa en levaduras libres
dependían del pH. Nedović y col. (2015) observaron cambios en las concentraciones de
metabolitos producidos durante la fermentación de bebidas alcohólicas, con respecto a
la levadura libre en suspensión, como consecuencia de las alteraciones genéticas,
morfológicas y fisiológicas que ocurren en la levadura inmovilizada.
Los resultados de las pruebas de decoloración en ciclos sucesivos demostraron que,
a través de la técnica de inmovilización, la levadura T. akiyoshidainum HP-2023 puede
mantener una elevada eficiencia en la decoloración de NR5, una mezcla de colorantes,
un efluente textil y de vinaza, durante al menos cuatro ciclos de tratamiento. La
principal ventaja de trabajar con la levadura inmovilizada, en comparación con la
utilización de células libres, fue la posibilidad real de reciclar las perlas de CaAlg sin
pérdida significativa en la capacidad de decoloración.
100
2.4 Conclusiones parciales
• La levadura Trichosporon akiyoshidainum HP-2023 fue inmovilizada en perlas de
alginato de calcio sin perder su viabilidad y capacidad de decoloración.
• La inmovilización de Trichosporon akiyoshidainum HP-2023, en comparación con
la levadura libre, conduce a una mayor producción de proteínas extracelulares
• La levadura Trichosporon akiyoshidainum HP-2023 inmovilizada fue capaz de
remover hasta 650 mg L-1 de NR5 durante 24 h de tratamiento
• La decoloración de Negro Reactivo 5 no estuvo relacionada con la adsorción del
colorante a la matriz de alginato
• La decoloración de Rojo Reactivo 121 se relacionó con la adsorción del colorante a
la matriz de alginato
• La decoloración con Trichosporon akiyoshidainum HP2023 inmovilizada redujo el
tiempo necesario para la decoloración de NR5, una mezcla de cuatro colorantes, un
efluente textil y de vinaza.
• La decoloración de NR5, mezcla de colorantes, efluente textil y vinaza, con
Trichosporon akiyoshidainum HP2023 inmovilizada, se evaluó con éxito durante
cuatro ciclos, manteniendo una elevada eficiencia en la decoloración
• Durante la decoloración con Trichosporon akiyoshidainum HP2023 inmovilizada se
midieron mayores títulos de actividad MnP y catecolasa implicadas en la
decoloración.
• Los resultados indican que Trichosporon akiyoshidainum HP-2023 puede ser
utilizada como un sistema eficaz para la bioremediación ambientalmente segura de
los efluentes coloreados analizados
CAPÍTULO III
Bioproceso 3: Inmovilización
enzimática mediante la formación de
CLEAs para la decoloración de
colorantes textiles y vinaza
102
CAPÍTULO III
Bioproceso 3: Inmovilización enzimática mediante la formación de CLEAs
para la decoloración de colorantes textiles y vinaza
3.1 Introducción
3.1.1 Empleo de enzimas inmovilizadas como una alternativa al cultivo con
células libres inmovilizadas
Las técnicas de inmovilización enzimática pueden dividirse en tres tipos: adhesión a
un soporte, entrampamiento dentro de una matriz porosa y entrecruzamiento o
reticulación de las proteínas (Cao y col., 2003; Velasco-Lozano y col., 2016). La unión
a un soporte y el entrampamiento en matrices inertes, conducen inevitablemente a la
dilución de la actividad catalítica debido a la introducción de una gran proporción (90-
99% del total) de masa no catalítica. Esto se traduce en menores rendimientos
volumétricos y espaciales y, por lo tanto, en una menor productividad del catalizador.
La inmovilización a través del entrecruzamiento entre moléculas de enzima, con un
agente de reticulación bifuncional, es un método que no utiliza un soporte sólido y por
lo tanto el biocatalizador resultante contiene un 100% de proteína.
La técnica de entrecruzamiento de proteínas, mediante la reacción por ejemplo entre
glutaraldehído y grupos amino (-NH2) reactivos de la superficie de las proteínas, se
desarrolló originalmente hace más de 40 años (Cao y col., 2003; Sheldon, 2007). En las
últimas décadas, el uso de CLEAs (cross-linked enzymes aggregates) se convirtió en
una de las técnicas más prometedoras para su empleo como biocatalizadores
industriales.
3.1.2 CLEAs (cross-linked enzyme aggregates)
La precipitación de proteínas a partir de soluciones acuosas sin perturbación de su
estructura terciaria, y el posterior entrecruzamiento de estas, conduce a la formación de
CLEAs (Figura 41). La precipitación puede llevarse a cabo mediante la adición de
sales, solventes orgánicos miscibles en agua o polímeros no iónicos. La reticulación,
por su parte, se realiza con agentes reticulantes como el glutaraldehído. Al agregar,
tanto los agentes precipitantes como los reticulantes a un sobrenadante de cultivo, las
proteínas precipitan formando agregados proteicos unidos por enlaces covalentes (Cui y
103
Jia 2015). Esta metodología combina una parcial purificación e inmovilización en una
sola unidad de operación (Bilal y col., 2017).
Figura 41. Proceso de formación de CLEAs
3.1.2.1 Optimización del proceso de formación de CLEAs
3.1.2.1.1 Efectos del agente precipitante
La formación de CLEAs incluye dos procesos diferentes. El primero implica la
agregación física de la enzima por un agente precipitante que favorece la formación de
enlaces químicos entre las enzimas. El segundo paso es cuando se agrega el agente
reticulante.
En general, la adición de sales, disolventes orgánicos o polímeros no iónicos a los
extractos enzimáticos induce la agregación de las proteínas debido a un cambio en el
estado de hidratación de las moléculas, o bien por alterar la constante electrostática de
la solución. Sin embargo, debido a las diferentes propiedades bioquímicas y
estructurales de las proteínas, el mejor agente precipitante puede variar de una enzima a
otra. En consecuencia, es necesario optimizar el proceso de preparación de CLEAs,
seleccionando el agente precipitante más adecuado (Cui y Jia 2015).
3.1.2.1.2 Efectos del agente reticulante
Entre los agentes reticulantes, el más utilizado es el glutaraldehído ya que es una
molécula pequeña y reactiva que puede penetrar en la estructura interna de las proteínas
y reaccionar con los grupos amino. La reticulación se produce por la reacción entre los
grupos amino libres de residuos de lisina presentes en la superficie de moléculas de
104
proteínas vecinas (Sheldon, 2011). La concentración de agente reticulante es crucial ya
que un exceso puede dar como resultado una distorsión de la estructura de la enzima e
impedir el acceso de los sustratos al sitio activo y, por lo tanto, disminuir la
recuperación de la actividad enzimática de los CLEAs. Por el contrario, bajas
concentraciones de glutaraldehído puede generar una reticulación insuficiente y una
baja recuperación de actividad enzimática en los CLEAs. Por ejemplo Schoevaart y col.
(2004) observaron que la actividad lipasa de los CLEAs estaba significativamente
influenciada por la concentración del agente reticulante. Estos autores obtuvieron
mayor actividad enzimática a mayor concentración de glutaraldehído (hasta 1,2%), a
causa del aumento en el número de cavidades formadas en la estructura de los
agregados enzimáticos, lo que resultó en una transferencia de masa más efectiva. A
concentraciones superiores de 1,2%, la recuperación de la actividad lipasa disminuía.
Por lo tanto, una variable clave en la producción de CLEAs es la extensión de la
reticulación, que depende de la concentración del agente reticulante y del tiempo de
reacción (tiempo de entrecruzamiento o cross-linking). Matijošyte y col. (2010)
investigaron el efecto de diversos parámetros (temperatura, concentración de
glutaraldehído y tiempo de reticulación) sobre la recuperación de la actividad,
almacenamiento y estabilidad operativa de CLEAs con actividad lacasa de tres
microorganismos diferentes: Trametes versicolor, Trametes villosa y Agaricus
bisporus. Los resultados mostraron que las condiciones óptimas de reticulación fueron
diferentes para las lacasas de cada especie. Como sucede con el agente precipitante, es
importante evaluar diferentes factores como la concentración y tiempo de reacción del
glutaraldehído para cada extracto enzimático en particular, ya que influyen en el
rendimiento de los CLEAs.
En base a lo expuesto, el objetivo de esta parte del trabajo fue aislar un
microorganismo productor de actividad lacasa y a partir del extracto enzimático formar
CLEAs para evaluar así su posible uso en la decoloración de colorantes textiles y
vinaza.
105
3.2 Materiales y métodos
3.2.1 Muestreo
Dado que a partir de los cultivos de T. akiyoshidainum HP-2023 no se pudieron
obtener CLEAs con actividad lacasa detectable, se llevó a cabo un muestreo con el
objetivo de aislar un microorganismo con elevada actividad lacasa para así optimizar la
formación de CLEAs.
La toma de muestras se realizó en dos sitios diferentes durante el mes de mayo de
2014. El primer sitio seleccionado fue la salida de un canal de desagüe de una fábrica
textil de Famaillá, provincia de Tucumán, que desemboca en el Arroyo Maravilla
(Figura 42). Se recolectaron asépticamente muestras de suelo, del biofilm asociado a las
paredes del canal de descarga y de la zona donde se unen el efluente y el cauce del
Arroyo Maravilla. La temperatura promedio del efluente in situ fue de 24,5 ºC.
El segundo muestreo se realizó directamente a partir de un efluente real de una
industria textil ubicada en la provincia de La Rioja (Figura 43). La temperatura
promedio del efluente in situ fue de 28 ºC. Todas las muestras recolectadas
asépticamente fueron colocadas en recipientes estériles, los que se almacenaron a 4 ºC
para los ensayos de aislamiento.
Figura 42. Imágenes del primer sitio de muestreo (A) Canal del desagüe, B) Zona de
mezcla entre el efluente y el cauce del Arroyo Maravilla
106
Figura 43. Imágenes del segundo sitio de muestreo: (A) y B) piletones de
almacenamiento del efluente textil
3.2.2 Aislamiento de microorganismos
Se suspendió 1 g o 1 mL de cada una de las muestras en medios de enriquecimiento
YM (Yeast Morphology) ácido (pH 4) cuya composición (en g L-1) es: extracto de
levadura 3, extracto de malta 3, peptona 5. El medio fue adicionado con glucosa o fenol
como fuente de carbono (10 g L-1). El fenol se utilizó con el fin de estimular el
desarrollo de microorganismos con actividad lacasa ya que dicha actividad está
involucrada en la degradación de compuestos fenólicos (sección 1.1.3.3.2). Los medios
fueron incubados a 25 ºC y 250 rpm en agitador rotatorio. Cada muestra fue procesada
por duplicado. Luego de 48 h, se sembraron 100 uL de cada cultivo en placas con el
mismo medio sólido. Las placas fueron incubadas a 25ºC hasta el desarrollo de
colonias. Este procedimiento se realizó por triplicado para cada cultivo. En todos los
casos se seleccionaron colonias con distintas características morfológicas (morfotipos)
y se las repicó en placas con medio YM ácido hasta obtener cultivos puros. Las cepas
de levaduras obtenidas fueron conservadas en placas de Petri con YM ácido sólido a 4
ºC y en glicerol 30% a -20 °C.
3.2.3 Selección de microorganismos en medio sólido
Se llevaron a cabo diversas pruebas cualitativas para cada uno de los aislamientos
obtenidos con el objetivo de determinar su potencial decolorante. Además se evaluó la
producción de enzimas con actividad ligninolítica, las cuales podrían estar involucradas
en la decoloración (Pointing, 1999).
107
3.2.3.1 Determinaciones enzimáticas en medio sólido
Las actividades enzimáticas fueron evaluadas en placas de Petri con LBM,
especialmente diseñado para la detección de actividades lignocelulolíticas (Pointing
1999) y NDM-agar, diseñado para la decoloración de colorantes azoicos por levaduras
ascomicetes (Ramalho y col., 2004). A cada medio se agregaron diferentes sustratos
según la actividad ensayada. La composición del medio LBM-agar (en g L-1) es:
glucosa 3; peptona 0,1; extracto de levadura 0,01; agar 20.
Los medios de cultivo fueron inoculados a partir de colonias de levaduras cultivadas
en medios LBM o NDM-agar, según correspondiese. Los cultivos fueron incubados a
25ºC durante 72 h. Se evaluó periódicamente la aparición de halos de actividad como
una medida cualitativa de la actividad enzimática de los aislamientos.
La actividad lacasa (Lac) se determinó empleando como sustrato ABTS en
concentración final 0,1% (p/v). La aparición de halos de color verde oscuro indicó
actividad Lac positiva (Pointing, 1999).
Para la actividad fenoloxidasa (FOX) se utilizaron placas de Petri con guayacol y
otras con ácido tánico (1 Mm) como sustratos. La formación de un halo de color
rojizo/amarronado alrededor de la colonia indicó, en ambos casos, reacción positiva
(Pointing, 1999).
La actividad LiP se evaluó agregando el colorante Azure b en una concentración
final de 0,01% (v/v). La aparición de un halo de decoloración debajo o alrededor de la
colonia puso de manifiesto la presencia de esta actividad en el medio de cultivo
(Pointing, 1999).
3.2.3.2 Decoloración en medio sólido
Para evaluar el potencial decolorante se prepararon placas de Petri con medio LBM-
agar y NDM-agar suplementado con NR5 (200 mg L-1), efluente textil real sin diluir y
vinaza diluida al 10% p/v. En los ensayos se incluyeron medios LBM y NDM-agar sin
inocular, como controles abióticos.
En cada caso, los medios de cultivo fueron inoculados a partir de colonias de
levaduras cultivadas en medios LBM o NDM-agar, según correspondiese. Los cultivos
fueron incubados a 25 ºC durante 72 h. Se evaluó periódicamente la aparición de halos
de decoloración alrededor de las colonias.
108
Estos ensayos en medio sólido permitieron seleccionar aquellos aislamientos con
mayor actividad enzimática y mayor actividad decolorante.
3.2.3.3 Determinaciones enzimáticas en medio líquido
Para los aislamientos seleccionados en base a los ensayos en medio sólidos, se
llevaron a cabo determinaciones enzimáticas en medio líquido. Se evaluó actividad
lacasa y catecolasa según la metodología descripta en el inciso 1.2.7.3 del capítulo 1.
Además, la actividad lacasa se determinó empleando 2,6-dimetoxifenol (DMP) 1,6 mM
como sustrato, en las mismas condiciones de trabajo utilizadas en los ensayos con
ABTS (Palmieri y col., 1997). A partir de estos resultados se seleccionó el aislamiento
que presentó actividad enzimática.
3.2.4 Identificación del aislamiento seleccionado
3.2.4.1 Extracción de ADN genómico total
El ADN genómico total del aislamiento seleccionado se extrajo con el método
descripto por Yamada y col. (2002). Se tomaron 2 mL del medio de cultivo NDM
líquido inoculado con el aislamiento seleccionado e incubado a 25 ºC, cinco días.
Luego se centrifugó 10 min a 10.000 rpm y se descartó el sobrenadante. El pellet
obtenido se suspendió en 400 μL de buffer de lisis (Tris-HCl 100 Mm, pH 8,00; SDS
1%; Triton X-100 2%; EDTA 10Mm; NaCl 100 mM) y luego fue colocado en un tubo
Eppendorf de 2 mL junto con 400 μL de la mezcla fenol: cloroformo: alcohol
isoamílico (25:24:1) y con 300 mg de perlas de vidrio. Esta mezcla se agitó
vigorosamente en vortex por 5 min y luego se enfrió a 20 ºC durante 5 min. El proceso
de agitación y enfriamiento se repitió 5 veces. Se centrifugó la mezcla obtenida durante
10 min a 10.000 rpm y 4 ºC. La fase acuosa fue recuperada y transferida a tubos de
microcentrífuga estériles. Cada solución se lavó dos veces con un volumen de
cloroformo:alcohol isoamílico (24:1). Luego cada muestra se precipitó con un volumen
de isopropanol y se centrifugó 10 min a 10.000 rpm y 4 ºC. El ADN precipitado fue
lavado dos veces con etanol 70%, secado y resuspendido en agua bidestilada estéril
para su posterior uso.
3.2.4.2 Amplificación y secuenciación del ADNr
Se amplificó y secuenció la región comprendida entre el ADNr 18S; ITS1; ADNr
5,8S; ITS2 y dominio D1/D2 del ADNr 26S. Para ello se utilizaron los cebadores
109
universales ITS1 y NL4 (Figura 44). La secuenciación fue realizada por Macrogen
(Korea).
Las secuencias obtenidas se compararon con secuencias de cepas tipo en GenBank,
mediante el uso de BlastN. Las secuencias más relacionadas fueron alineadas con las
correspondientes a los aislamientos mediante el algoritmo MUSCLE del programa
MEGA 5. Los árboles filogenéticos fueron inferidos mediante el método de Máximum
likelihood, basado en el modelo de Tamura y Nei (1993). El árbol presentado es el
consenso de 1000 réplicas obtenidas por bootstrap. Los análisis evolutivos se realizaron
en MEGA6 (Tamura y col., 2013).
Figura 44. Localización de los cebadores en el cassette de ADNr que contiene los
genes 18S, 5,8S y 26S y los espaciadores intergénicos transcriptos ITS1 e ITS2. La
escala se encuentra en pares de bases, de acuerdo a las extensiones de Gargas y
DePriest (1996)
3.2.5 Perfil de actividad lacasa en medio sólido
Las lacasas pueden tener diferentes potenciales redox. Para caracterizar mejor la
actividad lacasa del aislamiento seleccionado se realizó un estudio más detallado de la
actividad enzimática en medio sólido, por la metodología de pocillos, descripta por
Pointing (1999).
Para el perfil de actividad Lac se usaron siete sustratos diferentes. Los sustratos
utilizados fueron: ABTS, Catecol, DMP, 1-Naftol, Bencidina, Siringaldazina (Syr), y
Guayacol (50 mg L-1 p/v). Todos se prepararon en buffer acetato 50 Mm pH: 3,5, según
Pointing (1999). Cabe destacar que algunos de los sustratos utilizados podría ser
110
oxidado también por otras enzimas (Pointing, 1999). Por ejemplo ABTS y α-naftol
pueden ser oxidados por peroxidasas.
El procedimiento incluyó el cultivo del aislamiento seleccionado en placas de Petri
con medio YM-agar e incubado a 25 °C, durante 7 días. Posteriormente en cada placa
se realizaron 8 pocillos de 5 mm de diámetro en el margen de las placas, uno para cada
sustrato y uno para el blanco (buffer Acetato 50 mM, pH 4,0). Para esto se utilizó un
sacabocados estéril. En cada pocillo se agregó 50 µL del sustrato correspondiente y las
placas fueron incubadas a 25 °C por una hora. Durante ese período se controlaron las
placas para detectar la formación de halos coloreados característicos de cada sustrato
alrededor de los pocillos. Este procedimiento se llevó a cabo por triplicado.
3.2.6 Producción de lacasas en cultivos sumergidos y en sustrato sólido
Se evaluó la actividad Lac producida por el aislamiento seleccionado, tanto en
condiciones de fermentación en cultivo sumergido (FCS) como en ensayos en sustrato
sólido (FSS). Como inóculos se utilizaron cultivos del microorganismo realizados en
placas de YM-agar e incubadas 7 días a 25 °C.
3.2.6.1 Fermentación en cultivo sumergido
Los experimentos en cultivo sumergido se llevaron a cabo en frascos Enlermeyers de
250 mL con un volumen final de 50 mL de medio de cultivo YM líquido. Los mismos
se inocularon con 10 tacos de agar de 6 mm de diámetro recubiertos con micelio
fúngico, tomado a partir del borde de los cultivos crecidos en medio YM-agar. Los
cultivos fueron incubados a 250 rpm y 25 °C, durante 7 días. Se tomaron muestras a
tiempo final, las mismas fueron centrifugadas a 10.000 rpm (4 °C), durante 15 min y
los sobrenadantes se congelaron a -20 °C hasta el momento de realizar la determinación
de actividad. Se utilizó ABTS y DMP como sustratos.
3.2.6.2 Fermentación en sustrato sólido
Los experimentos en sustrato sólido se llevaron a cabo en frascos de vidrio de 12 cm
de alto por 7,3 cm de diámetro (Figura 45) con cubos de espuma de poliuretano (EPU)
(~1x2 cm) como matriz sólida hasta alcanzar una altura máxima de 2,5-3 cm desde la
base (0,8 g del soporte, aproximadamente 30-35 cubos de EPU). Este tipo de soporte es
ampliamente utilizado para inmovilizar hongos filamentosos ya que no es
111
biodegradable por lo que no produce efectos secundarios en las actividades enzimáticas
del hongo (Romero Gòmez 2001; Ahmed 2016). Como tapones de los frascos, se
emplearon discos de algodón de 1 cm de altura envueltos en tela voile, de manera de
favorecer el intercambio gaseoso entre el interior del sistema y el medio circundante
(Figura 45). Los frascos así preparados fueron esterilizados por vapor húmedo a 121 °C
y 1 atm de sobrepresión, durante 15 min.
Figura 45. Frasco de vidrio relleno con cubos de espuma de poliuretano utilizado para
los ensayos en fermentación en sustrato sólido
Cada frasco se inoculó con 10 tacos de agar recubiertos con micelio fúngico (6 mm
de diámetro) y se agregó 50 mL de medio de cultivo YM líquido. Los cultivos fueron
incubados a 25 °C por 7 días en oscuridad (Ahmed, 2016). Transcurrido el tiempo de
incubación, los frascos fueron sacrificados y se recuperó la totalidad del medio de
cultivo por prensado de los cubos de espuma de poliuretano en jeringas estériles de 50
mL. Los medios recuperados fueron centrifugados 15 min a 10.000 xg a 4 °C. El
sobrenadante resultante fue almacenado a ˗20 °C hasta el momento de realizar la
determinación de actividad lacasa empleando ABTS y DMP como sustratos. En todos
los casos, las experiencias se realizaron por duplicado.
112
3.2.6.3 Caracterización del pH óptimo de acción de la actividad lacasa
A partir de los sobrenadantes obtenidos en los ensayos de FCS y FSS se evaluó la
actividad lacasa a diferentes pH (entre 2,5 - 6,5) en buffer acetato 50 mM pH 3,5. Se
utilizó DMP y ABTS como sustratos. La determinación de la actividad se llevó a cabo
como se explicó en el capítulo 1 (1.2.7.3).
3.2.7 Formación de CLEAs
3.2.7.1 Selección del precipitante
Se evaluaron diferentes agentes precipitantes con el fin de seleccionar el más
apropiado para recuperar la mayor actividad lacasa. Los agentes precipitantes utilizados
fueron: isopropanol, etanol, acetona, acetonitrilo, sulfato de amonio saturado,
polietilenglicol (PEG, PM: 4.000 y 6.000) y dimetilsulfóxido (DMS) (Cabana y col.,
2007). La precipitación se realizó con 9 mL de agente precipitante y 1 mL de
sobrenadante de medio de cultivo (extracto enzimático libre de células). Las mezclas se
incubaron a 4 °C por 1,5 h con agitación constante a 200 rpm. Posteriormente, las
mezclas se centrifugaron a 12.000 xg, 15 min. A continuación, se separó el
sobrenadante y las proteínas precipitadas se suspendieron en 1 mL de buffer acetato 50
mM, pH 3,5. Luego se midió la actividad lacasa con DMP, tanto de las proteínas
precipitadas como del sobrenadante.
Los resultados de la actividad enzimática del precipitado y sobrenadante fueron
expresados como actividad lacasa recuperada porcentual (Act. Lac rec. %):
𝐴𝑐𝑡. 𝐿𝑎𝑐 𝑟𝑒𝑐. % =𝐴𝑐𝑡. 𝐿𝑎𝑐 𝑑𝑒𝑙 𝑝𝑟𝑒𝑐𝑖𝑝𝑖𝑡𝑎𝑑𝑜 𝑜 𝑠𝑜𝑏𝑟𝑒𝑛𝑎𝑑𝑎𝑛𝑡𝑒
𝐴𝑐𝑡. 𝐿𝑎𝑐 𝑒𝑛 𝑒𝑙 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚á𝑡𝑖𝑐𝑜 𝑙𝑖𝑏𝑟𝑒 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠× 100
Se calculó también actividad Lac recuperada específica porcentual (Act. Lac Rec.
Específica %), donde la recuperación de actividad específica es la actividad lacasa del
precipitado, sobrenadante o extracto enzimático libre de células por mg de proteína
total. La determinación de proteínas totales en el extracto enzimático libre de células se
llevó a cabo como se detalló en el capítulo 2 (2.2.6.4.1).
113
3.2.7.2 Selección de las condiciones de entrecruzamiento
Una vez que se seleccionó el agente precipitante se determinaron las condiciones
adecuadas de formación de los agregados proteicos. Se evaluó el efecto de diez
concentraciones de glutaraldehído y cinco tiempos de reacción.
Una vez transcurrido el tiempo de entrecruzamiento o cross-linking, las muestras
fueron centrifugadas por 15 min a 12.000 xg, se descartó el sobrenadante y los CLEAs
obtenidos fueron lavados con agua bidestilada estéril, hasta no detectar actividad Lac
residual en el agua de lavado. Finalmente, los CLEAs lavados fueron resuspendidos en
100 µL de buffer acetato 50 mM, pH 3,5 (Matijošyte y col., 2010). Los resultados de la
actividad enzimática de los CLEAs formados a partir del sobrenadante de cultivo
fueron expresados como Act. Lac rec. %:
𝐴𝑐𝑡. 𝐿𝑎𝑐 𝑟𝑒𝑐. % =𝐴𝑐𝑡. 𝑙𝑎𝑐 𝑑𝑒 𝑙𝑜𝑠 𝐶𝐿𝐸𝐴𝑠 𝑓𝑜𝑟𝑚𝑎𝑑𝑜𝑠
𝐴𝑐𝑡. 𝐿𝑎𝑐 𝑒𝑛 𝑒𝑙 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚á𝑡𝑖𝑐𝑜 𝑙𝑖𝑏𝑟𝑒 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠× 100
3.2.7.2.1 Selección de la concentración óptima de glutaraldehído
Se evaluaron diferentes concentraciones de glutaraldehído como agente reticulante
(0,023; 0,1; 0,5; 5; 25; 30; 50; 100; 200 y 250 mM), utilizando el agente precipitante
seleccionado anteriormente.
En todos los casos, se trabajó con un volumen final de reacción de 1.050 µL (900 µL
agente precipitante isopropanol + 100 µL extracto enzimático libre de células + 50 µL
glutaraldehído). El ensayo fue llevado a cabo durante 1,5 h (tiempo óptimo de reacción)
con agitación a 200 rpm a 4 °C, por triplicado. Transcurrido el tiempo de reacción, los
CLEAs ya formados fueron separados, lavados y resuspendidos en buffer acetato y se
calculó Act. Lac Rec. %, como se describió previamente.
3.2.7.2.2 Selección del tiempo más adecuado de reacción del glutaraldehído
Se evaluó el efecto de siete tiempos diferentes de reacción (30, 60, 90, 120, 150, 180
minutos y 24 horas) entre el glutaraldehído y las proteínas del extracto enzimático libre
de células. En este ensayo se trabajó con dos concentraciones de glutaraldehído, 5 y 25
mM. Todos los ensayos se realizaron por triplicado. Transcurrido el tiempo de
reacción, los CLEAs fueron separados, lavados y resuspendidos en buffer acetato. Se
calculó Act. Lac Rec. %, tal como se describió previamente. Una vez seleccionadas las
114
condiciones de preparación de los CLEAs (agente precipitante, concentración y tiempo
de reacción de glutaraldehído), se continuó trabajando de la misma manera en todos los
incisos posteriores.
3.2.7.3 Microscopía electrónica de barrido de los CLEAs
Para estudiar la conformación interna y medir el diámetro promedio de los CLEAs,
se realizó una microscopía electrónica de barrido. Se utilizó un microscopio FESEM
(Field Emission Scanning Electron Microscopy) Carl Zeiss AG- SUPRA 55VP, en el
CIME, Tucumán, Argentina. Las muestras se secaron a temperatura ambiente. Luego
fueron revestidas con partículas de oro usando un equipo de recubrimiento por
pulverización catódica. Los aumentos utilizados durante la microscopía fueron de:
10.000 y 30.000X.
3.2.7.4 Reutilización de los CLEAs: actividad lacasa
Una de las principales ventajas de las enzimas inmovilizadas es la posibilidad de
reutilizarlas. Es por esto que se evaluó la factibilidad de reutilizar los CLEAs en ciclos
sucesivos de reacción utilizando DMP y ABTS como sustratos. El procedimiento de
trabajo fue el siguiente: se agregaron 200 µL de la mezcla de reacción (sustrato + buffer
acetato 50 mM) a los CLEAs ya formados y se agitaron a 240 xg durante 15 minutos.
Después del primer ciclo, la mezcla de reacción con el sustrato oxidado se separó de los
CLEAs por centrifugación (10 min a 12.000 xg). Luego se agregó un volumen fresco
de la mezcla de reacción, iniciando así un nuevo ciclo. Este procedimiento se repitió
cinco veces (seis ciclos en total).
La medición de la actividad enzimática se determinó a tiempo final a partir de la
mezcla de reacción con el sustrato oxidado. Se midió la absorbancia en un espectrofoto
a 420 y 460 nm para ABTS y DMP, respectivamente.
3.2.7.5 Estabilidad de los CLEAs frente a desnaturalizantes químicos e
inactivación térmica
Se evaluó la estabilidad de la actividad Lac del extracto enzimático libre de células y
de los CLEAs frente a diferentes desnaturalizantes. Se utilizaron soluciones de CoCl2,
CaCl2, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), en concentraciones 10 μM, y en
acetona 25% v/v, las cuales causan desnaturalización de proteínas e inhiben la actividad
115
enzimática Lac (Xu y col., 2013). Las mezclas de reacción con el extracto enzimático
libre de células o con los CLEAs junto a los agentes desnaturalizantes fueron incubadas
durante 3 h a 25 °C. Como control, las mezclas de reacción contenían agua bidestilada
estéril en lugar de los agentes desnaturalizantes.
Se evaluó también la estabilidad térmica incubando el extracto enzimático y los
CLEAs con agua bidestilada estéril a ˗4 y 40 °C durante 3 y 24 h. Como control, se
incubó a 25 °C.
Pasado el tiempo de incubación se determinó la Act. Lac rec. %:
𝐴𝑐𝑡. 𝐿𝑎𝑐 𝑟𝑒𝑐. % =𝐴𝑐𝑡. 𝐿𝑎𝑐 𝑑𝑒 𝑙𝑜𝑠 𝐶𝐿𝐸𝐴𝑠 𝑎 𝑙𝑎𝑠 3/24 ℎ 𝑑𝑒 𝑖𝑛𝑐𝑢𝑏𝑎𝑐𝑖ó𝑛
𝐴𝑐𝑡. 𝐿𝑎𝑐 𝑑𝑒 𝑙𝑜𝑠 𝐶𝐿𝐸𝐴𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙× 100
116
3.2.7.6 Decoloración con CLEAs
3.2.7.6.1 Estrategia experimental
Figura 46. Esquema general de la estrategia experimental llevada a cabo. La parte
sombreada en gris se desarrolla en este capítulo.
*ETR: efluente textil real, *CT: colorantes textiles
3.2.7.6.2 Decoloración
Una vez determinadas las condiciones más adecuadas para la formación de los
CLEAs, se llevaron a cabo ensayos de decoloración. Se trabajó con el colorante NR5 y
la mezcla de colorantes, en una concentración inicial de 50 mg L-1. También se empleó
vinaza diluida al 10% v/v. Se evaluó la decoloración de dichos medios utilizando los
CLEAs y el extracto enzimático libre de células.
Las reacciones de decoloración se llevaron a cabo en 200 μL de mezclas de reacción
que contenían el sustrato a decolorar (100 uL) más 100 μL del extracto enzimático o el
equivalente de CLEAs formados con dicho volumen de extracto. Las mezclas fueron
117
incubadas en la oscuridad a 25 °C, bajo agitación constante a 240 xg, durante 30 min.
La remoción del color se midió en un espectrofotómetro Thermo Scientific Multiskan
Go (Cap. 1.2.7.1).
3.2.7.6.3 Reutilización de los CLEAs: decoloración de colorantes textiles y
vinaza
Se determinó la decoloración de NR5, mezcla de colorantes y vinaza, con los
CLEAs durante ciclos sucesivos.
El procedimiento de trabajo fue el siguiente: se agregó 200 µL del sustrato a
decolorar a los CLEAs ya formados, se agitó a 250 rpm durante 30 min. Después del
primer ciclo, se separó el sobrenadante decolorado de los CLEAs por centrifugación
(10 min a 12.000 xg) y se agregó medio fresco de decoloración, iniciando así un nuevo
ciclo. Este procedimiento se repitió tres veces (cuatro ciclos en total) (Kumar y col.,
2014). A partir de los sobrenadantes se midió decoloración (1.2.7.1).
118
3.3 Resultados y discusión
3.3.1 Aislamiento de microorganismos
Al final del esquema de aislamiento, se obtuvieron 34 aislamientos levaduriformes
diferentes a partir de las muestras de agua, suelo y biofilm del canal de descarga de la
planta textil en Tucumán, mientras que a partir del efluente textil solamente se
obtuvieron cuatro levaduras y seis hongos filamentosos. En la Tabla 33 se enumeran los
44 aislamientos, se indica además la muestra a partir de la cual fueron aislados, con el
medio empleado y el tipo de crecimiento.
Tabla 33. Aislamientos obtenidos a partir de las diferentes muestras y medios
utilizados
119
3.3.2 Selección de microorganismos en medio sólido
3.3.2.1 Determinaciones enzimáticas en medio sólido
En términos generales, los ensayos realizados en placas de Petri con LBM-agar
revelaron actividad enzimática positiva más rápido que en medio NDM-agar, donde, a
su vez, los aislamientos crecieron más rápido (Figura 47). En la Tabla 34 se puede
observar las actividades enzimáticas medidas en medio LBM y NDM sólidos. Se
observó que el 8% de los aislamientos evidenciaron actividad FOX positiva frente a
guayacol y ácido tánico, el 17% actividad LiP frente a Azure B y el 50% actividad
lacasa frente a ABTS.
Figura 47. (A) Crecimiento y decoloración del asilamiento #5 en el medio NDM y
LBM con vinaza diluida al 10% v/v. (B) Crecimiento y decoloración por los
asilamientos ED1, ED4, ED5, ED6 y ED9 en el medio NDM y LBM con NR5 200 mg
L-1.
120
Tabla 34. Actividad enzimática de los 44 aislamientos en medio LBM y NDM sólidos
121
*Halos de actividad: - sin halo, + halo pequeño, ++ halo grande
3.3.2.2 Decoloración en medio sólido
En cuanto a la decoloración, los ensayos llevados a cabo en placas de Petri con
NDM-agar revelaron actividad decolorante positiva más rápido que en LBM-agar.
El colorante NR5 fue el sustrato decolorado por el mayor número de aislamientos
(65%), mientras que el efluente textil y la vinaza fueron decolorados por el 50 y 40%
de microorganismos, respectivamente (Tabla 35).
122
Tabla 35. Decoloración de Negro Reactivo 5, efluente textil y vinaza en medios LDM
y NDM sólidos por los 44 aislamientos
123
*Halos de decoloración: - sin halo, + halo pequeño, ++ halo grande
De acuerdo a los perfiles enzimáticos registrados en medio sólido, se seleccionaron
aquellos aislamientos que demostraron ser capaces de oxidar ABTS y al menos un
sustrato enzimático más (Tabla 34). Dichos aislamientos presentaron además una
elevada capacidad decolorante, dado que produjeron halos de decoloración en al menos
3 de los 6 medios evaluados (Tabla 35). Según estos resultados se seleccionaron cinco
aislamientos levaduriformes: ED2, ED9, TD7, BD1 y M11 y tres filamentosos: #1, #2 y
#5 para continuar con los siguientes ensayos.
3.3.3 Determinaciones enzimáticas en medio líquido
Se evaluó la actividad lacasa, empleando ABTS y DMP como sustratos y actividad
catecolasa, con catecol como sustrato de los aislamientos seleccionados (ED2, ED9,
TD7, BD1, M11, #1, #2 y #5).
La actividad catecolasa fue positiva para todos los microorganismos evaluados,
excepto para el aislamiento BD1, y los mayores títulos obtenidos fueron para el hongo
filamentoso #5 (13,85 U L-1) (Tabla 36). Se detectó actividad lacasa frente a DMP en
valores significativos (mayores a 0,1 U L-1) en ED2, #2 y #5, mientras que frente a
ABTS se registró actividad significativa en ED2, TD7, BD1, #2 y #5. Las máximas
124
actividades lacasa se obtuvieron para el aislamiento #5 (15,43 y 43,3 U L-1 frente a
DMP y ABTS, respectivamente) (Tabla 36).
De acuerdo a estos resultados, se decidió seleccionar el aislamiento #5 para
optimizar el proceso de formación de CLEAs con actividad Lac.
Tabla 36. Actividad lacasa y catecolasa para los aislamientos seleccionados
3.3.4 Identificación molecular del hongo filamentoso #5
El aislamiento fúngico #5 seleccionado se clasificó en un grupo perteneciente a la
subdivisión basidiomycota. El análisis de las secuencias ITS1-5,8S-ITS2 del
aislamiento demostró que el mismo pertenece al subclado 3 del género Trametes de
acuerdo al trabajo de Welti y col. (2012), por lo que se lo llamó Trametes sp. #5.
125
Figura 48. Análisis filogenético de cepas basidiomecetáceas basado en secuencias de la
región ITS1-5,8S-ITS2 del ADNr. El árbol se dibuja a escala, con longitudes de rama
medidas en el número de sustituciones por sitio. El análisis involucró 25 secuencias de
nucleótidos. Se eliminaron todas las posiciones que contienen huecos y datos faltantes.
Hubo un total de 490 posiciones en el conjunto de datos final.
3.3.5 Perfil de actividad lacasa en medio sólido
La técnica de revelado en pocillos estableció que Trametes sp. #5 presentó actividad
lacasa positiva frente a todos los sustratos empleados (ABTS, Catecol, DMP, 1-Naftol,
Bencidina, Siringaldazina y Guayacol) (Figura 49).
126
El género Trametes es un conocido productor de enzimas lacasas y fue ampliamente
utilizado para la decoloración de vinazas de caña de azúcar y efluentes coloreados
(Carmen y col., 2006; Matijošyte y col., 2010; Fernández-Fernández 2013).
Figura 49. Perfil de actividad Lac en medio sólido para Trametes sp. #5. Del pocillo 0
a 7: buffer acetato, syr, bencidina, 1-naftol, catecol, guayacol, DMP y ABTS.
3.3.6 Producción de lacasas en cultivo sumergido y en sustrato sólido
3.3.6.1 Caracterización del pH óptimo de acción de la actividad lacasa
Como se observa en la Figura 50, independientemente de si el hongo se cultivó en
sustrato sólido o sumergido y del uso de ABTS o DMP como sustratos, la actividad
lacasa máxima de Trametes sp. #5, se obtuvo a pH 3,5 – 4,0 (Figura 50A y B). Esta es
una propiedad muy común entre las lacasas fúngicas extracelulares descriptas en la
literatura (Liu y col., 2009; Packiyam y Ragunathan, 2017).
En todos los casos la actividad decreció con el aumento de pH, haciéndose
prácticamente nula a pH 6,5, similar a lo descripto por Liu y col. (2009) para la
actividad Lac de Pleurotus ostreatus 10969.
Durante la FCS, a pH 3,5 y con DMP como sustrato, actividad lacasa fue de 6 U L-1,
mientras que en la FSS la actividad aumentó aproximadamente nueve veces (43 U L-1)
(Figura 50A y 51). Lo mismo se observó con el sustrato ABTS, ya que se obtuvieron 43
y 387 U L-1 durante la FCS y FSS, respectivamente (Figura 50B y 51). Esta tendencia
se mantuvo en todo el rango de pH analizado. En base a estos resultados, se decidió
continuar trabajando en todos los ensayos siguientes con el hongo Trametes sp. #5
127
cultivado en FSS, utilizando el extracto enzimático libre de células como fuente
enzimática para los ensayos siguientes.
Figura 50. Actividad lacasa durante el cultivo de Trametes sp. #5 por fermentación en
cultivo sumergido (FCS) y fermentación en sustrato sólido (FSS) con diferentes valores
de pH. Se utilizaron como sustratos (A) DMP y (B) ABTS.
128
Figura 51. Actividad lacasa durante el cultivo de Trametes sp. #5 en FCS y FSS a pH
3,5. Se utilizaron como sustratos (A) DMP y (B) ABTS.
3.3.7 Formación de CLEAs
3.3.7.1 Selección del precipitante
La naturaleza de los agentes precipitantes de proteínas tiene implicancia directa en el
tipo de precipitado formado y por lo tanto en su actividad. Ribeiro y Rabaça (2011)
investigaron los efectos del sulfato de amonio, el polietilenglicol 6000 y el alcohol terc-
butílico como precipitantes en la recuperación de la actividad naringinasa a partir de un
extracto enzimático libre de células. Sus resultados mostraron que sólo la precipitación
con el alcohol terc-butílico permitió la formación de CLEAs con actividad naranginasa.
Cui y col. (2012) evaluaron el efecto del sulfato de amonio, isopropanol, etanol y
acetona como precipitantes en la recuperación de la actividad fenilalanina amoníaco
liasa (PAL). Los resultados mostraron que los disolventes orgánicos fueron
precipitantes ineficaces para PAL, en cambio la mayor recuperación de la actividad se
observó con sulfato de amonio como precipitante. Por ello, es necesario seleccionar
adecuadamente el agente precipitante, ya que éste afecta de manera directa a la
actividad enzimática de los CLEAs (Kumar y col., 2012).
En la Figura 52A se muestra la actividad lacasa (Act. Lac. Rec. %) de los
precipitados obtenidos a partir del cultivo en sustrato sólido de Trametes sp. #5,
empleando los diferentes agentes precipitantes. Los resultados obtenidos demostraron
que el isopropanol, el acetonitrilo y el sulfato de amonio formaron precipitados con
129
mayor actividad lacasa, con una recuperación de actividad del 29, 21 y 19%,
respectivamente.
Se calculó también la actividad lacasa específica de los precipitados obtenidos
(unidades enzimáticas por mg de proteína precipitada), lo que da una idea de la pureza
de la enzima en el precipitado. Como se observa en la figura 52B, las actividades
específicas más elevadas fueron obtenidas con sulfato de amonio (156%), isopropanol
(117%), etanol (58%) y acetonitrilo (49%). Las actividades específicas relativas
superiores al 100% indicaron que con la precipitación se obtuvo una purificación
parcial de las lacasas o bien la eliminación de inhibidores durante el proceso
(Matijošyte y col., 2010; Jiang y col., 2014). Teniendo en cuenta estos resultados, se
eligió continuar trabajando con isopropanol como agente precipitante. El sulfato de
amonio fue descartado ya que a pesar de haberse obtenido elevados valores de Act. Lac
Rec. % y Act. Lac. Rec. Específica %, estos fueron muy variables, lo que indicó la poca
reproducibilidad de los resultados obtenidos (Figura 52B).
130
Figura 52. (A) Act. Lac rec. % y (B) Act. Lac rec. específica %, en los precipitados
obtenidos con los diferentes agentes precipitantes
3.3.7.2 Selección de las condiciones de entrecruzamiento
3.3.7.2.1 Selección de la concentración óptima de glutaraldehído
Dentro del rango de concentraciones de glutaraldehído evaluadas (Figura 53), los
CLEAs formados con 5, 25 y 30 mM de glutaraldehído fueron los que presentaron
mayor Act. Lac Rec. (33, 35 y 31%, respectivamente).
Figura 53. Act. Lac Rec. % de los CLEAs formados con diferentes concentraciones de
glutaraldehído
131
La actividad disminuyó con concentraciones más bajas del agente reticulante,
probablemente porque la cantidad de glutaraldehído no fue suficiente para el
entrecruzamiento del total de las proteínas precipitadas. Sin embargo, con
concentraciones mayores de 30 Mm los valores de actividad fueron menores al 30%, a
pesar de que el volumen de CLEAs obtenidos fue mayor. Este resultado pudo deberse a
que un exceso de agente reticulante pudo actuar sobre los grupos aminos ubicados en
los sitios activos o cerca de ellos, produciendo estructuras pseudocristalinas compactas
que multiplican el efecto estérico; o bien provocando una gran cantidad de enlaces
cruzados que dificultan la adaptación conformacional de la enzima al sustrato dando
lugar a una inactivación de las moléculas enzimáticas (Cabana y col., 2007; Nadar y
Rathod, 2016). Cuando se utilizó glutaraldehído 5, 25 y 30 mM la actividad recuperada
fue similar (p ˃0,05), entonces se decidió continuar trabajando con las concentraciones
menores: 5 y 25 mM.
Durante la formación de los CLEAs, el agua del primer y segundo lavado presentó
actividad lacasa positiva, atribuible a las enzimas que no fueron inmovilizadas durante
el proceso de entrecruzamiento. A partir del tercer lavado no se registró actividad
positiva.
3.3.7.2.2 Selección del tiempo más adecuado de reacción del glutaraldehído
Como se mencionó anteriormente, el tiempo de reacción entre el glutaraldehído y las
proteínas es otro factor crucial en la formación de CLEAs con actividad lacasa.
En la Figura 54 se observa el tiempo de reacción más adecuado que fue 1,5 h. Se
obtuvieron los mayores valores de Act. Lac Rec. % (27 y 36% para 5 y 25 mM de
glutaraldehído, respectivamente).
132
Figura 54. Act. Lac Rec. % de los CLEAs formados con glutaraldehído 5 y 25 mM
durante diferentes tiempos de reacción
Se observó que la actividad enzimática disminuyó con incubaciones más
prolongadas, lo que indicó una pérdida parcial de la actividad, posiblemente por una
restricción en la flexibilidad enzimática debido a un entrecruzamiento más intenso.
Mientras que, al disminuir el tiempo de incubación, la actividad Lac recuperada
también fue menor.
En base a los resultados obtenidos se decidió continuar trabajando con 25 mM de
glutaraldehído y un tiempo de reacción de 1,5 h.
3.3.7.3 Microscopía electrónica de barrido de los CLEAs
El tamaño y la morfología de los CLEAs se estudiaron utilizando microscopía
electrónica de barrido. Las imágenes se muestran en la Figura 55. Schoevaart y col.
(2004) describieron dos tipos de CLEAs, según su estructura y apariencia
microscópica. Los CLEAs de tipo 1 tienen formas esféricas, gran número de cavidades
y un tamaño promedio de entre 1-5 µm; mientras que los CLEAs tipo 2 presentan
estructuras amorfas, menor número de cavidades y mayor tamaño (˃100 µm). Los
CLEAs obtenidos en este trabajo a partir del extracto enzimático de Trametes sp. #5,
con isopropanol como agente precipitante y 25 mM de glutaraldehído durante 1,5 h de
reacción, tuvieron un tamaño mayor a 200 µm y se clasificaron dentro del tipo 2. El
gran tamaño de los CLEAs obtenidos pudo ser porque la cantidad de proteínas
precipitadas a partir del extracto enzimático fue muy elevada, lo cual también fue
133
observado por Cabana y col. (2007), cuando emplearon 1 mg L-1 de BSA adicional a
las proteínas precipitadas y obtuvieron CLEAs de tamaño similar.
Figura 55. Fotografías obtenidas mediante MEB de los CLEAs. (A) magnificación
10.000X y (B) magnificación 30.000X
3.3.7.4 Reutilización de los CLEAs: actividad lacasa
Entre las ventajas del uso de los CLEAs se puede mencionar la facilidad de
recuperar el catalizador para poder reutilizarlo en una nueva reacción enzimática. Por
ello, un parámetro operacional importante de los CLEAs es su estabilidad frente al
reciclo.
Como se observa en la Figura 56, la actividad de los CLEAs medida con DMP
disminuyó abruptamente con los ciclos de reacción, obteniéndose en el segundo sólo un
16% de la actividad inicial. En cambio, cuando se utilizó ABTS como sustrato se
registró más de un 80% de actividad en el segundo ciclo, 50% en el quinto ciclo y una
actividad residual de 38% en el séptimo ciclo, respecto a su actividad original. Esta
tendencia en la actividad catalítica de los CLEAs durante los ciclos sucesivos fue
reportada por diversos autores, por ejemplo, Sinirlioglu y col. (2013) formaron CLEAs
con actividad lacasa capaces de retener su actividad catalítica en un 60% durante cinco
ciclos de reacción.
134
Figura 56. Act. Lac Rec. % de los CLEAs formados con glutaraldehído 25 mM
durante 1,5 h de reacción durante ocho ciclos sucesivos de reacción frente a DMP y
ABTS
Las diferencias observadas pueden explicarse por el mecanismo de reacción del
DMP. Este sustrato es incoloro y al ser oxidado forma un polímero coloreado mediante
una reacción radicalaria. EL polímero puede alcanzar pesos moleculares muy altos,
coprecipitando con los CLEAs durante la centrifugación. En los ciclos siguientes, el
monómero de DMP oxidado por las lacasas, reacciona rápidamente con el polímero de
DMP presente, por lo que no contribuye a colorear la solución. Aunque el DMP es un
sustrato muy utilizado para medir actividad lacasa (Solano y col., 2001; Sondhi y col.,
2015) no resultó apropiado para evaluar la estabilidad de la actividad Lac en los CLEAs
durante los ciclos sucesivos de reacción.
3.3.7.5 Estabilidad de los CLEAs frente a desnaturalizantes químicos e
inactivación térmica
En la Figura 57 se observa la Act. Lac Rec. % de los CLEAs y del extracto
enzimático libre de células (a partir del cual se formaron los CLEAs) incubados durante
3 h frente a desnaturalizantes químicos, a ˗4 y 40 °C. Los respectivos controles (sin
agentes desnaturalizantes) mantuvieron su actividad durante las 3 h de incubación.
135
Figura 57. Act. Lac Rec. % del extracto enzimático libre de células y de los CLEAs
formados con glutaraldehído 25 mM durante 1,5 h, al inicio (T0) y luego de incubarlos
durante 3 h (T3h) con diferentes inhibidores químicos y temperaturas
La actividad del extracto enzimático fue afectada considerablemente por todos los
inhibidores evaluados. Se observaron valores de Act. Lac Rec. inferiores al 40%,
mientras que los CLEAs mostraron mayor estabilidad (Figura 57).
La temperatura de incubación presentó una considerable influencia sobre la
actividad del extracto enzimático. A ˗4 °C, la actividad lacasa recuperada en el extracto
enzimático fue del 32%, mientras que la actividad de los CLEAs fue el doble (60% de
Act. Lac Rec). A 40 °C la actividad recuperada del extracto enzimático fue cercana a
cero, probablemente debido a una desnaturalización de las proteínas. Sin embargo, la
presencia de enlaces covalentes en la superficie de las proteínas impidió la
desnaturalización de las enzimas en los CLEAs (Barbosa y col., 2014), ya que la
actividad recuperada fue de un 60%. Esta tendencia, que es coincidente con lo
observado por Cabana y col. (2007), pudo deberse al efecto del entrecruzamiento entre
las enzimas lacasas, lo que impide el despliegue de la estructura en condiciones de
estrés térmico.
Al incubar con CoCl2, NaN3 y EDTA 10 µM, la actividad recuperada con los
CLEAs fue aproximadamente el doble que la del extracto enzimático (Figura 57). Esto
puede ser porque la estructura de los CLEAs impediría que estos compuestos migrasen
hacia la estructura del sitio catalítico de la enzima y la inactivaran (Ba y col., 2014). La
inhibición de la actividad Lac en extractos enzimáticos en presencia de iones metálicos
fue previamente descripta por Liu y col. (2009). Por lo tanto, la inmovilización
136
enzimática mediante la formación de CLEAs mejoró la estabilidad de la actividad
frente a los iones Co2+ y Na+ y al quelante EDTA. Estos resultados difieren de los
obtenidos por Cabana y col. (2007) quienes observaron la misma actividad para la
lacasa libre e inmovilizada frente a CoCl2. Esto se puede explicar teniendo en cuenta
las condiciones que emplearon tales autores para formar los CLEAS, ya que utilizaron
una concentración menor de glutaraldehído (0,2 mM). En estas condiciones la
estructura formada es menos compacta debido a un menor número de enlaces
covalentes entre proteínas, lo que puede ocasionar la difusión del ión Cl- hacia el sitio
catalítico de la enzima. Este fenómeno no ocurrió en las estructuras obtenidas en el
presente trabajo, al haber empleado una mayor concentración de glutaraldehído (25
mM). Por lo tanto, los resultados obtenidos en este ensayo apoyaron la elección de
trabajar con glutaraldehído 25 mM.
3.3.7.6 Decoloración con CLEAs
Es importante evaluar la capacidad decolorante tanto de los CLEAs como de los
extractos enzimáticos a partir del cual son formados porque la inmovilización
enzimática puede llevar a un cambio en la selectividad o actividad catalítica de las
proteínas con respecto a aquellas presentes en el sobrenadante de cultivo (Velasco-
Lozano y col., 2016).
La Tabla 37 compara la decoloración de NR5, mezcla de colorantes y vinaza, tanto
por el extracto enzimático como por los CLEAs, obtenidos a partir de cultivos de
Trametes sp. #5.
Las enzimas libres presentes en el extracto decoloraron un 60, 10 y 15% la mezcla
de colorantes, el NR5 y la vinaza, respectivamente, mientras que los CLEAs
decoloraron eficientemente el colorante NR5 y la mezcla de colorantes (90 y 100%,
respectivamente) y la vinaza fue decolorada sólo en un 55% (Tabla 37). Estos
resultados demostraron mayor capacidad de decoloración de los CLEAs, por lo que la
inmovilización enzimática llevada a cabo no sólo estabiliza las enzimas, sino que
también resulta ventajosa para la actividad decolorante de las enzimas, similar a lo
observado por Yang y col. (2015) durante la decoloración de Azul brillante remazol por
CLEAs con actividad lacasa.
137
Tabla 37. Decoloración máxima obtenida durante la decoloración de NR5, mezcla de
colorantes y vinaza empleando el extracto enzimático libre de células y los CLEAs
formados a partir de dicho extracto.
3.3.7.6.1 Reutilización de los CLEAs: decoloración de colorantes textiles y
vinaza
La principal ventaja de los agregados CLEAs es la posibilidad de reutilizar los
catalizadores, lo que es importante para sus posibles aplicaciones industriales
(Sinirlioglu y col., 2013).
Para los colorantes textiles, se observó una decoloración mayor al 70% en el
segundo ciclo, sin embargo, dicha eficiencia disminuyó en el cuarto ciclo obteniéndose
valores de remoción de 10 y 25% para el NR5 y la mezcla de colorantes,
respectivamente (Tabla 38). Estos valores de remoción obtenidos al final del cuarto
ciclo fueron inferiores a los obtenidos con las células de T. akiyoshidainum
inmovilizadas en perlas de CaAlg (100% de decoloración). Es decir que a pesar que los
CLEAs conservaron hasta un 60% la actividad lacasa durante 4 ciclos, la actividad
decolorante disminuyó más de un 75%.
Con respecto a la vinaza, en el cuarto ciclo de decoloración, la remoción del color
por los CLEAs fue nula (Tabla 38), mientras que al emplear las perlas de CaAlg, la
decoloración fue del 40%. Zhou y col. (2016) también observaron una disminución en
la eficiencia de decoloración de Negro Directo 30 con CLEAs, y atribuyeron dicha
disminución a una desnaturalización de las enzimas en los CLEAs, durante el proceso
de lavado, previo al inicio de un nuevo ciclo de decoloración.
138
Tabla 38. Decoloración máxima obtenida durante la decoloración de NR5, mezcla de
colorantes y vinaza con los CLEAs durante cuatro ciclos sucesivos de reacción
139
3.4 Conclusiones parciales
• Trametes sp. #5 fue el aislamiento que presentó mayor actividad lacasa frente a los
sustratos ABTS y DMP.
• Los sistemas de cultivo en sustrato sólido son más efectivos que los sumergidos para
expresar actividad lacasa
• La eficiencia en la actividad lacasa de los CLEAs fue mayor que la actividad del
extracto enzimático libre de células
• Los CLEAs conservaron la actividad lacasa empleando ABTS como sustrato durante
ciclos sucesivos de reacción.
• La actividad lacasa de los CLEAs mostró una mayor estabilidad frente a las
condiciones extremas de los agentes químicos y térmicos en comparación con la
actividad del extracto enzimático libre de células.
• Los CLEAs decoloraron de manera más efectiva el colorante NR5, la mezcla de
colorantes y la vinaza, en comparación al extracto enzimático libre de células.
• Durante los ciclos sucesivos de decoloración los CLEAs presentaron una capacidad
mayor de decoloración que el extracto enzimático libre de células
CAPÍTULO IV
Escalamiento del bioproceso para la
decoloración de NR5
141
CAPÍTULO IV
Escalamiento del bioproceso para la decoloración de NR5
4.1 Introducción
4.1.1 Escalamiento a biorreactor
Una vez que se evaluó un proceso determinado a escala de laboratorio (10 µL a 2 L),
el paso siguiente es el aumento a una escala intermedia de 2 a 10 L. Esto se usa con
frecuencia como un puente entre la escala laboratorio y un sistema a escala piloto (10 a
50 L de volumen) (Pleissner y col., 2016). El escalamiento se puede realizar en
diferentes tipos de biorreactores de escala creciente. Para el escalamiento de procesos
aeróbicos, el efecto del transporte de O2 es fundamental (Liu y col., 2006). Los
bioprocesos en medios líquidos, como son los tratamientos de efluentes coloreados, se
llevan a cabo en medios acuosos. En estos procesos, el oxígeno es un nutriente
importante, ya que lo utilizan los microorganismos para el crecimiento, el
mantenimiento y la producción de metabolitos, y por lo tanto su escasez afecta el
rendimiento del proceso (Liu y col., 2006). Por esto, es importante garantizar un
suministro adecuado de oxígeno hacia el medio de cultivo (Campani y col., 2017).
Desafortunadamente, la extensión de un ensayo de laboratorio a escala intermedia
con frecuencia introduce limitaciones en el transporte de O2, riesgos de contaminación
porque el proceso se vuelve más robusto al trabajar a mayores volúmenes y otros
factores que pueden inhibir el crecimiento microbiano, como por ejemplo condiciones
desfavorables de pH, nutrientes o desbalances redox. Por esto, muchas veces lo que
parece ser una estrategia de biorremediación viable en el laboratorio puede no tener
éxito a una mayor escala. El éxito en el escalamiento de un bioproceso se confirma por
los resultados experimentales que muestran que no hay diferencias en los resultados
obtenidos al trabajar a diferentes escalas (Pérez-Bibbins y col., 2015).
Existen varios tipos de reactores que pueden utilizarse en procesos aeróbicos con
levaduras libres o inmovilizadas. Entre estos se incluyen reactores de lecho
empaquetado, lecho fluidizado, el convencional reactor de tanque agitado y el de
elevación por aire (airlift) (Pérez-Bibbins y col., 2016).
142
4.1.1.1 Reactor de lecho empaquetado
El biorreactor de lecho empaquetado es generalmente un reactor de columna donde
el medio de cultivo circula a través de un lecho sólido fijo con el
microorganismo/enzima inmovilizada. En este tipo de reactor el flujo del medio de
fermentación que circula a través del vaso se asemeja al modelo de flujo de tapón. En
los reactores de flujo tapón los sustratos y componentes presentes en el medio se
consumen a medida que avanzan en la longitud del reactor (Nguyen y col., 2016).
Este tipo de reactores se utiliza principalmente cuando existe una inhibición por
producto significativa, por lo cual no es muy empleado para tratamientos de
decoloración. Los inconvenientes de estos sistemas son las limitaciones de
transferencia de masa, el atrapamiento de gases entre las partículas, la compactación del
lecho y la desintegración de las biopartículas (Kilonzo y col., 2009).
4.1.1.2 Reactor de lecho fluidizado
Los reactores de lecho fluidizado son reactores de columna en los que una fase
sólida se suspende por medio de un flujo, que generalmente es un líquido, aunque
también puede operarse en un flujo de gas, principalmente utilizado para la aireación.
Este sistema presenta la ventaja de tener elevadas tasas de transferencia de masa y
oxígeno en comparación con reactores de lecho empaquetado. Como resultado se logra
un mejor control de los parámetros operativos, así como la ausencia de fuerzas de
cizallamiento (Sarrouh y da Silva, 2013).
En este tipo de reactores, el flujo de líquido muchas veces se ve obstaculizado por la
densidad del catalizador, más si se trata de un microorganismo que flocula o bien se
encuentra inmovilizado en algún tipo de soporte. Por lo tanto, la densidad del soporte
de inmovilización debe considerarse cuidadosamente durante el diseño del reactor.
Durante el diseño del caudal del líquido o gas, también se deben tener en cuenta las
posibles variaciones en el tamaño y la densidad de las partículas durante el proceso
como consecuencia del crecimiento de la biomasa y la degradación del soporte (Yates y
Lettieri 2016).
143
4.1.1.3 Reactor de tanque agitado
El reactor de tanque agitado es el biorreactor más utilizado en procesos
biotecnológicos. Se ha empleado para fermentaciones aeróbicas y anaeróbicas,
operadas en condiciones continuas y discontinuas. Los equipos de menor tamaño
generalmente se construyen con vidrio, mientras que los dispositivos de mayor escala
empleados para la producción a planta piloto o industrial son de acero inoxidable. Las
principales desventajas del tanque agitado son el alto consumo de energía y fuerzas de
cizallamiento (Gupta y col., 2015). Este tipo de reactor permite aumentar las tasas de
transferencia de masa por agitación forzada, lo cual se realiza mediante mezcla
mecánica utilizando diferentes tipos de impulsores, como agitadores de pala, cinta
helicoidal, tornillo o anclaje.
Los tanques agitados generalmente están equipados con deflectores para la supresión
de la formación de vórtices en la agitación y así romper el flujo circular del líquido
(Myers y col., 2002). Un deflector es una paleta que dirige el flujo en el tanque, sus
dimensiones suelen ser aproximadamente una décima parte del diámetro del vaso. Sin
embargo, al trabajar con células inmovilizadas en tanques agitados, se debe tener
cuidado que el soporte de inmovilización no se dañe y que las células no sufran
demasiado esfuerzo por cizallamiento (Verbelen y col., 2006; Louhasakul y col., 2018).
Es por esto que los tanques agitados, por lo general, no son adecuados para
microorganismos filamentosos debido a que la agitación mecánica genera estrés por las
fuerzas de cizallamiento (Rodríguez Couto y col., 2006).
4.1.1.4 Reactor de elevación por aire (airlift)
El reactor de elevación por aire, comúnmente conocido como airlift, es un tipo de
reactor en el que la circulación del fluido tiene lugar en un patrón cíclico definido a
través de canales construidos específicamente para este fin (Vunjak-Novakovic y col.,
2005). Los biorreactores airlift poseen múltiples aplicaciones en diversas áreas de la
ingeniería química, especialmente para sistemas monofásicos y multifásicos, debido a
la simplicidad para su construcción, flujo de circulación dirigido, buena mezcla, bajos
costos operativos y requisitos de energía relativamente más bajos que los otros tipos de
reactores descriptos (Sivasubramanian y col., 2008; Pérez-Bibbins y col., 2016).
En este tipo de reactores el gas inyectado crea un flujo ascendente responsable de la
circulación del líquido a través del circuito del reactor. Cuenta con una zona ascendente
144
(parte rica en burbujas y zona con baja densidad) y una zona descendente (con mayor
densidad). El gas inyectado, generalmente aire en procesos biotecnológicos,
proporciona el oxígeno necesario para el crecimiento celular. En consecuencia, si se
aplica a células o enzimas inmovilizadas (o bien agregados celulares o enzimáticos),
estas deben presentar una densidad similar a la del líquido para facilitar la suspensión
del biocatalizador. Este punto es importante para lograr una elevada eficiencia de
mezclado, obtenida por el patrón de circulación del gas inyectado, que es la principal
ventaja de los biorreactores airlift (Kilonzo y col., 2009; Pérez-Bibbins y col., 2016).
En base a lo expuesto, se seleccionaron los reactores de tanque agitados y airlift para
escalar el bioproceso de decoloración más eficiente: células de T. akiyoshidainum HP-
2023 inmovilizadas en perlas de CaAlg. La eficiencia del sistema empleado se evaluó
en términos de remoción de color y tiempo requerido.
145
4.2 Materiales y métodos
4.2.1 Biomasa de T. akiyoshidainum HP-2023
La cantidad de inóculo utilizada para la inmovilización fue equivalente a la utilizada
en los ensayos descriptos en el capítulo 1 y 2. Los mismos consistieron en una
suspensión de la levadura T. akiyoshidainum HP-2023 (DO= 8), obtenida a partir de
cultivos de 16 h en medio NDMopt. sin colorante. Los inóculos fueron utilizados en una
proporción al 10% v/v en relación al medio a decolorar agregado. Una vez preparado el
inóculo se procedió a realizar la inmovilización en perlas de alginato de calcio.
4.2.2 Método de inmovilización celular
El método de inmovilización de las células de T. akiyoshidainum HP-2023 se llevó a
cabo siguiendo el protocolo publicado por Tan y col. (2014), con modificaciones, como
se explicó en el capítulo 2 (2.2.5).
4.2.4 Escalamiento a biorreactor airlift
Se utilizó un biorreactor airlift con tubos concéntricos y loop interno. El mismo se
construyó en base a un vaso de vidrio de 3,5 L de capacidad de un fermentador Infors
HT labfor 5. El volumen de trabajo fue de 3 L. Se colocó en el interior un tubo de
vidrio. Las medidas del tubo externo fueron 37 cm de alto y 15 cm de diámetro interno,
mientras que la del tubo interno fueron 27,5 cm alto y 8 cm de diámetro interno.
El control de temperatura (25 °C) se realizó a través de una camisa externa
(cobertura total del vaso) conectada a un baño termostatizado. El flujo de aire se
mantuvo constante a 1 L min-1. La medición y control de O2 se realizó a través de un
electrodo óptico. En la Figura 58 se esquematiza el biorreactor airilift utilizado.
146
Figura 58. Esquema del biorreactor airlift de tubos concéntricos y loop interno
utilizado
4.2.5 Escalamiento a tanque agitado
Se utilizó un biorreactor de tanque agitado con un vaso de vidrio de 3,5 L de
capacidad (Infors HT labfor 5), equipado con 4 deflectores. El volumen de trabajo fue
de 3 L. El control de temperatura (25 °C) se realizó a través de una camisa externa (con
cobertura total del vaso) conectada a un baño termostatizado. Se trabajó con una
agitación de 250 rpm. El flujo de aire se mantuvo constante a 1 L min-1. La medición y
control de O2 se realizó a través de un electrodo óptico.
4.2.3 Decoloración de NR5
Para evaluar la factibilidad del escalamiento del bioproceso con células de T.
akiyoshidainum HP-2023 inmovilizadas en perlas de CaAlg se decidió trabajar con el
colorante NR5, tomado como colorante modelo. Esto permite un análisis más sencillo
que el de la decoloración de la mezcla de colorantes o efluentes reales. Además, se
consideró que el colorante fue completamente degradado por la levadura durante el
proceso de decoloración.
Se trabajó con 200 mg L-1 de NR5 en medio NDMopt. (previamente descripto en la
sección 1.2.5) en dos tipos de biorreactores: airlift y tanque agitado.
147
Se evaluaron diferentes relaciones de volumen de perlas (Vp) y del medio líquido a
decolorar (Vm), de igual manera a los descripto en el capítulo 2 para los ensayos en
frascos Erlenmeyers (2.2.9.2). Así, se trabajó con valores de Vp/Vm de 0,05; 0,1; 0,4;
0,7 y 1.
Los ensayos de decoloración se incubaron durante 24 h a 25 ºC. Se tomaron
muestras al inicio del cultivo y a las 3, 6, 9, 12 y 24 h y a partir del sobrenadante se
determinó decoloración en un espectrofotómetro Thermo Scientific Multiskan Go
(1.2.7.1). Se calcularon las productividades volumétricas (Prv) para cada reactor, en
base a la siguiente ecuación:
𝑃𝑟𝑣 =𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒 𝑟𝑒𝑚𝑜𝑣𝑖𝑑𝑜 (
𝑚𝑔𝐿 )
𝑇𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 (ℎ)
Se incluyeron ensayos con perlas no inoculadas como controles abióticos. Todos los
ensayos se realizaron por triplicado.
148
4.3 Resultados y discusión
4.3.1 Escalamiento a biorreactor
Para realizar los experimentos a mayor escala en fermentador, se tuvieron en cuenta
todos los resultados obtenidos en los capítulos anteriores. La Tabla 39 compara los tres
tipos de procesos de decoloración evaluados durante este trabajo: decoloración con
células libres e inmovilizadas de T. akiyoshidainum HP-2023 y con los CLEAs,
formados a partir del extracto enzimático libre de células de Trametes sp. #5.
Tabla 39. Bioprocesos de decoloración de Negro Reactivo 5, mezcla de colorantes,
efluente textil real y vinaza empleando cultivos con células de T. akiyoshidainum HP-
2023 libres e inmovilizadas y CLEAs preparados a partir del extracto enzimático de
Trametes sp. #5.
*ETR: Efluente Textil Real
Según los resultados obtenidos, se seleccionó el bioproceso con células de T.
akiyoshidainum HP-2023 inmovilizadas en perlas de CaAlg, en comparación con las
células libres. En estas condiciones se decoloraron más rápido los medios con NR5,
mezcla de colorantes, el efluente textil real y la vinaza. A su vez, en comparación con
149
los CLEAs, el sistema con células inmovilizadas mantuvo la eficiencia de decoloración
al menos en cuatro ciclos de reacción (Tabla 39). Además, este tipo de sistema tiene la
ventaja de facilitar la reutilización del biocatalizador en lotes sucesivos lo que evita la
necesidad de un nuevo inóculo y permite disminuir de manera más marcada la
toxicidad inicial de los efluentes. Por lo tanto, se escaló el proceso con las perlas de
alginato a biorreactor airlift y tanque agitado.
4.3.2 Biorreactor airlift
Cuando se utilizó el biorreactor airlift se obtuvieron decoloraciones de entre 50 y
60% a las 24 h de cultivo (Figura 59), lo que se traduce en una productividad
volumétrica aproximadamente de 2,29 g L-1 h-1 independientemente del valor inicial de
Vp/Vm. Es decir, que el aumento en las relaciones Vp/Vm no resultó en un incremento
en la velocidad de decoloración (como se observó en frascos agitados 2.3.2.2), ya que a
elevadas relaciones de Vp/Vm (0,7 – 1,0) no se pudo mantener la circulación de las
perlas, por lo tanto, la agitación de las mismas fue baja. Esto originó una disminución
tanto en la decoloración máxima como en la velocidad de decoloración (˂ 60 % de
decoloración en 24 h). Esto sugiere que una baja eficiencia de mezclado podría afectar
la transferencia de oxígeno hacia las levaduras inmovilizadas, lo cual se traduce en una
disminución en la capacidad para decolorar.
Figura 59. Porcentajes de decoloración de NR5 en biorreactor airlift con medio
NDMopt. y células de T. akiyoshidainum HP-2023 inmovilizadas en perlas de CaAlg,
empleando diferentes valores de Vp/Vm
150
4.3.3 Biorreactor de tanque agitado
En este tipo de biorreactor se observó que el aumento de las relaciones Vp/Vm
tuvieron un incremento en la decoloración (Figura 60). Así, se obtuvieron porcentajes
mayores a 85% con relaciones Vp/Vm de 0,7-1, a las 6 h de cultivo. A su vez, estos
resultados fueron similares a los obtenidos en los ensayos llevados a cabo en
Erlenmeyers (p˂0,05). A diferencia de lo descripto para el reactor airlift, las
productividades volumétricas aumentaron con las relaciones Vp/Vm, obteniéndose un
máximo de 28,3 g L-1 h-1 a partir de Vp/Vm de 0,7. La productividad se incrementó
aproximadamente doce veces en comparación al reactor airlift (2,29 g L-1 h-1).
Es decir, que en el reactor de tanque agitado la agitación empleada fue suficiente
para mantener las perlas con la levadura inmovilizada en suspensión y obtener así una
decoloración similar a la observada en los Erlenmeyers (Figura 60).
Figura 60. Porcentajes de decoloración de NR5 en en biorreactor airlift, tanque agitado
y frascos Erlenmeyers con medio NDMopt. y células de T. akiyoshidainum HP-2023
inmovilizadas en perlas de CaAlg, empleando diferentes valores de Vp/Vm
Diversos autores demostraron que la transferencia de O2 desde el medio de cultivo
hacia la biomasa depende principalmente de la agitación del sistema (Gomes y col.,
2007; Amaral y col., 2008; Gómez-Díaz y col., 2008; Braga y col., 2015). En
concordancia con lo descripto, el proceso de decoloración por T. akiyoshidainum HP-
2023 inmovilizada debe ser agitado de manera tal que mantenga las perlas en
circulación. Esto favorece la transferencia de O2 hacia la biomasa inmovilizada y la
151
eficiencia en la decoloración no se ve afectada. De manera similar a lo observado en
este trabajo, Carvalho y col. (2002) obtuvieron eficiencias variables durante la
producción de xilitol con Candida guilliermondii inmovilizada en CaAlg, dependiendo
del sistema empleado (Erlenemeyers, tanque agitado y reactor de tipo cesta). Esto
ocurrió por las limitaciones de cada sistema en la transferencia de O2, lo cual afectó el
crecimiento de la levadura y, por lo tanto, la producción de xilitol.
De esta manera, el bioproceso de decoloración con células de T. akiyoshidainum HP-
2023 inmovilizadas en CaAlg se escaló satisfactoriamente a un biorreactor de tanque
agitado. Se obtuvieron perfiles de decoloración similares a los observados en frascos
Erlenmeyers (volumen final 50 mL), demostrando así el éxito de tal procedimiento.
152
4.4 Conclusiones parciales
• El escalamiento a biorreactor airlift no fue adecuado para trabajar con las células de
Trichosporon akiyoshidainum HP-2023 inmovilizadas en alginato de calcio a
relaciones Vp/Vm elevadas
• El escalamiento a biorreactor de tanque agitado con células de Trichosporon
akiyoshidainum HP-2023 inmovilizadas en alginato de calcio fue exitoso, con
valores de decoloraciones similares a los obtenidos en frascos Erlenmeyers.
CONCLUSIONES FINALES
154
Conclusiones finales
• Los elevados valores de decoloración y el crecimiento similar de Trichosporon
akiyoshidainum HP 2023, tanto en el efluente textil real como simulado,
demostraron que el simulado de efluentes es una estrategia válida para realizar
estudios preliminares del proceso de biodecoloración
• La velocidad de crecimiento y biomasa máxima de Trichosporon akiyoshidainum
HP-2023 no fue afectada por la presencia de colorantes, efluente textil ni vinaza
• Se seleccionaron las condiciones de trabajo, para la inmovilización de Trichosporon
akiyoshidainum HP-2023 en perlas de alginato de calcio, que permitieron la
decoloración más eficiente de Negro Reactivo 5
• La levadura Trichosporon akiyoshidainum HP-2023 inmovilizada fue capaz de
remover mayores concentraciones de Negro Reactivo 5 en comparación con la
levadura libre
• El bioproceso que empleó células de Trichosporon akiyoshidainum HP-2023
inmovilizadas en perlas de alginato de calcio redujo a la mitad el tiempo de
decoloración de Negro Reactivo 5, mezcla de colorantes, efluente textil y vinaza
• El proceso de decoloración de Negro Reactivo 5, la mezcla de colorantes y efluente
textil real con células de Trichosporon akiyoshidainum HP-2023 libres e
inmovilizadas disminuyó la toxicidad inicial de los medios y no condujo a la
acumulación de aminas aromáticas en los sobrenadantes de cultivo
• La toxicidad inicial de la vinaza disminuyó como consecuencia del tratamiento de
decoloración con células de Trichosporon akiyoshidainum HP-2023 inmovilizadas
en perlas de alginato de calcio
• La inmovilización de Trichosporon akiyoshidainum HP2023 en perlas de alginato de
calcio permitió la reutilización de la levadura manteniendo la eficiencia en la
decoloración de todos los medios evaluados durante al menos cuatro ciclos de
decoloración
• En base al esquema de aislamiento y selección utilizado, se determinó que Trametes
sp. #5 fue el microorganismo que presentó mayor actividad lacasa frente a los
sustratos ABTS y DMP.
• Se formaron CLEAs con actividad lacasa a partir del extracto enzimático libres de
células de Trametes sp. #5
155
• La actividad lacasa de los CLEAs mostró una mayor estabilidad frente a las
condiciones extremas de los agentes químicos y térmicos en comparación con la
actividad del extracto enzimático libre de células.
• Los CLEAs decoloraron de manera más efectiva el colorante NR5, la mezcla de
colorantes y la vinaza, en comparación al extracto enzimático libre de células.
• El bioproceso con células de T. akiyoshidainum HP-2023 inmovilizadas en perlas de
alginato de calcio se seleccionó como el más eficiente para decolorar efluentes
industriales coloreados
• El bioproceso con células de T. akiyoshidainum HP-2023 inmovilizadas en perlas de
alginato de calcio se escaló exitosamente a biorreactor de tanque agitado
• La inmovilización de la levadura T. akiyoshidainum HP-2023 demostró ser un
sistema exitoso para la decoloración de medios coloreados. Es una técnica eco-
amigable que facilita la reutilización celular, disminuyendo no sólo el color de los
efluentes sino también la toxicidad de los mismos
PROYECCIONES
157
Proyecciones
Debido a los grandes problemas que originan en el medio ambiente los efluentes
industriales coloreados, es de gran importancia diseñar procesos robustos que puedan
efectivamente remover el color y a su vez sean económicamente rentables.
Las proyecciones de este trabajo se basan en las siguientes propuestas:
➢ Escalar el Bioproceso con perlas de alginato de calcio a volúmenes mayores
empleando tanto efluente textil real como vinaza. A su vez, evaluar la reutilización del
biocatalizador en dicho fermentador
➢ Realizar un análisis de costo real del bioproceso de decoloración
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159
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181
Producción científica
Parte de los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral dieron lugar a las siguientes
publicaciones:
Trabajos publicados:
• “Optimization and Mechanisms for Biodecoloration of a Mixture of dyes
by Trichosporon akiyoshidainum HP 2023” (2017). María M. Martorell1, María del
Milagro Rosales Soro2, Hipólito F. Pajot2, Lucía I. C. de Figueroa. Environmental
Technology. http://dx.doi.org/10.1080/09593330.2017.1375024
Presentaciones a congresos:
• “Decoloración de Negro Reactivo 5 por levaduras inmovilizadas en perlas
de alginato en un biorreactor airlift de tubos concéntricos y loop interno” (2018).
María del M. Rosales Soro, Natalia M. Bulacio Gil, Osvaldo Delgado, Carlos G. Nieto
Peñalver, Lucía I. Castellanos de Figueroa, Hipólito F. Pajot. Libro de resúmenes.
Presentación del trabajo en formato Póster en el VI Simposio Argentino de Procesos
Biotecnológicos SAPROBIO en Julio de 2018 en la ciudad de San Miguel de Tucumán
- Argentina.
• “Metabolic Pathways involved in aromatic azo dyes degradation by T.
akiyoshidainum” (2018). Natalia M. Bulacio Gil, María M. Rosales Soro, Daniel
Kurth, Carlos G. Nieto Peñalver, Lucía Inés Castellanos de Figueroa and Hipólito F.
Pajot.
182
Trabajo seleccionado para presentar en formato Oral en el Congreso Internacional
“INTERNATIONAL SPECIALIZED SYMPOSIUM ON YEASTS”. Bariloche,
Argentina.
• “Decolorization of Reactive Black 5 by Suspended Growing Yeasts and Ca-
alginate Beads Immobilized Yeasts” (2018). María M. Rosales Soro, Natalia M.
Bulacio Gil, Daniel Kurth, Carlos G. Nieto Peñalver, Lucía Inés Castellanos de
Figueroa and Hipólito F. Pajot. Trabajo seleccionado para presentar en formato Oral en
el Congreso Internacional “INTERNATIONAL SPECIALIZED SYMPOSIUM ON
YEASTS”. Bariloche, Argentina, 2018.
• “Preparación de Agregados Enzimáticos de Lacasas y su Aplicación en el
Tratamiento de Colorantes Textiles“ (2017). Rosales M.M, Décima M.A, Bulacio
N.M, H.F. Pajot y L.I. Castellanos. Libro de resúmenes del Congreso Internacional
“Aguas, Ambiente y Energía 2017. ¿Uso o conservación de los recursos?”.
Presentación del trabajo en formato Oral en el congreso. Octubre de 2017, Mendoza –
Argentina.
• “Biodecoloración de una mezcla de colorantes textiles por Trichosporon
akiyoshidainum” (2016). M.M Martorell, H.F. Pajot, M.M Rosales y L.I. Castellanos.
Libro de resúmenes del “IV Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos”. 4, 250.
Presentación del trabajo en formato Póster en el IV Simposio Argentino de Procesos
Biotecnológicos SAPROBIO en Diciembre de 2016 en la ciudad de Buenos Aires -
Argentina.
• “Biodecoloración de Efluentes Textiles Simulados y Reales” (2015). M.M
Rosales, M.M Martorell, H.F. Pajot y L.I. Castellanos. Revista "Enfoques
Interdisciplinarios para la Sustentabilidad del Ambiente" – Argentina y Ambiente 2015.
1, 279. Presentación del trabajo en formato Póster en el II Congreso Internacional de
Ciencia y Tecnología Ambiental. II Congreso Nacional de la Sociedad Argentina de
Ciencia y Tecnología Ambiental en Diciembre de 2015 en la ciudad de Buenos Aires -
Argentina.
183
• “Aislamiento, selección e identificación de levaduras con capacidad
decolorante para el tratamiento de efluentes industriales coloreados” (2014).
Rosales Soro, Milagro; Bulacio Gil, Natalia; Martorell, Ma. Martha; Pajot, Hipólito;
Figueroa, Lucía Inés. Revista LapsusCalami. 2, 40. Presentación del trabajo en formato
Póster en las I° Jornadas de Investigación, Docencia y Extensión en Ciencias Naturales
“Dr. José Busnelli” en Noviembre de 2014 en la ciudad de San Miguel de Tucumán,
Tucumán - Argentina.
• “Biodegradación de colorantes con levaduras aisladas de muestras de
efluentes y suelos contaminados” (2014). Bulacio Gil, Natalia; Rosales Soro,
Milagro; Martorell, Ma. Martha; Pajot, Hipólito; Figueroa, Lucía Inés. Revista
LapsusCalami. 2, 35. Presentación del trabajo en formato Póster en las I° Jornadas de
Investigación, Docencia y Extensión en Ciencias Naturales “Dr. José Busnelli” en
Noviembre de 2014 en la ciudad de San Miguel de Tucumán, Tucumán – Argentina.
• “Aislamiento y caracterización de levaduras con potencial actividad
ligninolítica a partir de muestras de efluentes textiles industriales” (2014). Bulacio
Gil Natalia, Rosales Soro Milagro, Martorell María Martha, Pajot Hipólito Fernando,
Figueroa Lucía Inés. Revista LILLOA. 51, 205-206. Presentación del trabajo en
formato Póster en el XIII Congreso Argentino de Micología. XXIII Jornadas
Argentinas de Micología. 1ra. Reunión de la Asociación Micológica Carlos Spegazzini
en Agosto de 2014 en la ciudad de Buenos Aires – Argentina
