Tp nº1 bioqui med 2012

Fundación H. A. Barceló-Facultad de Medicina Guía de Trabajos Prácticos: Enzimas: regulación por pH, temperatura y concentración de sustratos

FUNDACIÓN BARCELO

INSTITUTO UNIVERSITARIO DE CIENCIAS DE LA SALUD

FACULTAD DE MEDICINA

BIOQUÍMICA, INMUNOLOGÍA Y NUTRICION NORMAL

3° AÑO

GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS

ENZIMAS: REGULACIÓN POR pH, TEMPERATURA Y CONCENTRACIÓN DE SUSTRATOS

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ENZIMAS

Aspectos generales: Las enzimas son en su mayoría proteínas que catalizan reacciones químicas en los seres vivos. Las enzimas son catalizadores biológicos, sustancias que sin consumirse en una reacción, aumentan notablemente su velocidad. No hacen factibles las reacciones imposibles, sino que solamente aceleran aquellas reacciones que se producen espontáneamente. Las enzimas hacen posible la existencia de seres vivos, ya que permiten que se produzcan aquellas reacciones químicas que, sin catalizador, requerirían de tiempos y condiciones de presión, temperatura y pH incompatibles con la vida.Prácticamente todas las reacciones quimicas que tienen lugar en los seres vivos están catalizadas por enzimas. Las enzimas son catalizadores específicos: cada enzima cataliza un solo tipo de reacción, y casi siempre actúan sobre un único sustrato o sobre un grupo muy reducido de ellos.El sustrato se une a una región concreta de la enzima, llamada centro activo. El centro activo comprende un sitio de unión formado por los aminoácidos que están en contacto directo con el sustrato y un sitio catalítico formado por los aminoácidos directamente implicados en el mecanismo de la reacción. Una vez formados los productos, la enzima puede comenzar un nuevo ciclo de reacción.Propiedades de las enzimas: Las propiedades de las enzimas se encuentran íntimamente relacionadas con su estructura. Dada la alta complejidad estructural que presentan es que pueden llevar a cabo procesos catalíticos complejos. Por consiguiente cualquier modificación en la estructura nativa de la misma suele ir asociado a cambios en la actividad catalítica. Los factores que influyen de manera más directa sobre la actividad de una enzima son:

• Cambios de pH

• Cambios de Temperatura

• Presencia de Cofactores

• La concentración de sustrato y producto

• La fuerza iónica de la solución

Efecto del pH sobre la actividad enzimática: las enzimas poseen grupos químicos ionizables (carboxilos –COOH, aminos –NH2, tiol –SH, imidazol, etc.) en las cadenas laterales de sus aminoácidos. Según el pH del medio, estos grupos pueden tener carga eléctrica positiva, negativa o neutra. Como la conformación de las proteínas depende, en parte, de sus cargas eléctricas, habrá un pH en el cual la conformación será la más adecuada para la actividad catalítica. Éste es el llamado pH óptimo.La mayoría de las enzimas son muy sensibles a los cambios de pH. Desviaciones de pocas décimas por encima o por debajo del pH óptimo pueden afectar drásticamente su actividad. Así,

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la pepsina gástrica tiene un pH óptimo de 2, la ureasa tiene un pH óptimo de 7 y la arginasa tiene un pH óptimo de 10. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática: en general, los aumentos de temperatura aceleran las reacciones químicas: por cada 10°C de incremento, la velocidad de reacción se duplica. Las reacciones catalizadas por enzimas siguen esta ley general. Sin embargo, debido a su estructura biológica, a partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor. La temperatura a la cual la actividad catalítica es máxima se llama temperatura óptima. Por encima de esta temperatura el aumento de la velocidad de la reacción debido a la temperatura es contrarrestado por la pérdida de actividad catalítica debida a la desnaturalización térmica, y la actividad enzimática decrece rápidamente hasta anularse.Efecto de las concentraciones de sustrato sobre la actividad enzimática: La velocidad de una reacción enzimática depende de la concentración del sustrato mientras la enzima no se encuentre saturada.

TRABAJO PRÁCTICOOBJETIVOS

• Determinar la variación de la actividad de una enzima frente a variaciones en el pH del medio de reacción.

• Determinar la variación de la actividad de una enzima ante cambios de temperatura en la reacción química.

• Observar el incremento de la actividad enzimática frente a concentraciones crecientes de sustrato.

La determinación de la actividad de una enzima se realiza por métodos colorimétricos que requieren de la utilización del ESPECTROFOTOMETRO, que permite medir la cantidad de luz absorbida de una sustancia, preferentemente coloreada. La determinación de la concentración se realiza al pasar un fino haz de luz a través de la solución. La porción de luz que pasa a través de la solución colorida es la trasmitancia porcentual, la luz que no pasa es absorbida por la solución y es medida como unidades de absorvancia. Las soluciones concentradas dejan pasar menos luz que las diluidas. Así podemos decir que cuanto mayor es la concentración de una solución mayor es su absorvancia y menor su trasmitancia. Tanto la absorvancia como la trasmitancia pueden ser leídas en los espectrofotómetros.

El fundamento del método colorimétrico consiste en realizar una reacción que nos de cómo producto un compuesto coloreado, el cual va a ser valorado a través de la absorvancia que presente la solución. ENZIMA SUSTRATO PRODUCTO (coloreado)

El espectrofotómetro tiene la capacidad de medir la cantidad de luz que absorbe el producto coloreado en base a la siguiente relación:

ABSORBANCIA = a × l × c

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Donde a: es una constante propia de la sustancia coloreada, l: es el diámetro del tubo que contiene la sustancia coloreada, c: es la concentraciónLa absorbancia es directamente proporcional a la concentración de una solución dentro de un rango, a altas concentraciones se pierde la relación lineal. A mayor concentración de producto mayor concentración de sustrato reacción en presencia de la enzima.

ACTIVIDADES DE LABORATORIO

Para el desarrollo de los objetivos del TP se utilizará un sistema constituido por una enzima que cataliza la transformación de un sustrato en un producto coloreado.

Efecto del pH: Reactivos y materiales

• Buffer de reacción pH cercano a 7 (A)• Buffer de reacción pH ácido (B)• Buffer de reacción pH alcalino (C)• Sustrato• Enzima• Baño termostatizado a 37 °C

Procedimiento experimentalEn tres tubos de ensayo se colocarán respectivamente:

Tubo 1: pH óptimo Tubo 2: pH ácido Tubo 3: pH alcalinoBuffer A 1 mlBuffer B 1 mlBuffer C 1 mlEnzima ….. µl ……µl …..µl

Sustrato (1 g/l) 10 µl 10 µl 10 µlIncubar los tres tubos en baño de agua a 37°C, durante 10 minutos

Observar el color obtenido en cada tubo, leer la absorbancia a 505 nm frente a blanco de reactivo y relacionar con la actividad enzimática

Efecto de la temperatura: Reactivos y materiales

• Buffer de reacción pH cercano a 7 (A)• Sustrato• Enzima• Baño termostatizado a 37 °C• Hielo• Agua hirviendo

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Procedimiento experimental

En tres tubos de ensayo se colocará respectivamente:

Tubo 1: 0°C Tubo 2: 37°C Tubo 3: 100°C Buffer A 1 ml 1 ml 1 mlEnzima …..µl …..µl …..µl

Sustrato (1 g/l) 10 µl 10 µl 10 µlIncubar 10 min en baño de

hielo (0 °C)Incubar 10 min a

37°CIncubar 10 min a

100°CObservar el color obtenido en cada tubo, leer la absorbancia a 505 nm frente a blanco de

reactivo y relacionar con la actividad enzimática

Efecto de la concentración de sustrato: Reactivos y materiales

• Buffer de reacción pH cercano a 7 (A)• Sustrato• Enzima• Baño termostatizado a 37 °C

Procedimiento experimental

En dos tubos de ensayo se colocará respectivamente:

Tubo 1 Tubo 2Buffer A 1 ml 1 ml

Sustrato (1 g/l) 10 µl 30 µlEnzima ….µl ….µl

Incubar los tubos en baño de agua a 37°C, durante 10 minutosObservar el color obtenido en cada tubo, leer la absorbancia a 505 nm frente a blanco de reactivo y relacionar con la actividad enzimática

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CUESTIONARIO:

1- Grafique los resultados obtenidos en las experiencias de actividad enzimática en función de la variación del pH y temperatura. Compare con los gráficos teóricos. ¿Qué conclusiones obtiene?

2- Teniendo en cuenta la experiencia de efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad enzimática, discuta:a) ¿En que tubo se observa mayor cantidad de producto y por qué?b) ¿Dónde se observa mayor actividad enzimática y de que dependió la misma?c) En este sistema el aumento de actividad enzimática, ¿dependió de la cantidad de enzima?

3- El sabor dulce del maíz recién cosechado es debido a la gran cantidad de azúcar de los granos. Varios días después de la cosecha el maíz no es tan dulce debido a que el 50% del azúcar libre se convierte en almidón durante el primer día posterior a la cosecha. Para mantener el sabor dulce del maíz recién cosechado se sumergen las espigas en agua hirviendo durante unos minutos, enfriándolo después con agua fría. El maíz procesado de este modo mantiene su dulzor perfectamente. Utilizando lo estudiado sobre enzimas, trate de explicar esta situación.

4-¿Cómo se valora a través de un método colorimétrico la aparición de producto de una reacción enzimática y qué relación tiene con la actividad enzimática?

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