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Facu
ltad
de C
ienc
ias
Expe
rimen
tale
s
Grad
o en Q
uímica
Alumno: Álvaro Ávila Pérez
Junio, 2019
Mes, Año
Purificación de peroxirredoxinas a partir de órganos de animales
UNIVERSIDAD DE JAÉN Facultad de Ciencias Experimentales
Trabajo Fin de Grado
Trabajo Fin de Grado
2
Facu
ltad
de C
ienc
ias
Expe
rimen
tale
s
Grad
o en Q
uímica
UNIVERSIDAD DE JAÉN Facultad de Ciencias Experimentales
Trabajo Fin de Grado
Trabajo Fin de Grado Purificación de
peroxirredoxinas a partir de órganos de animales
Alumno: Álvaro Ávila Pérez
Junio, 2019
Mes, Año
3
ÍNDICE
ÍNDICE ........................................................................................................................ 3
1. RESUMEN / ABSTRACT ..................................................................................... 4
2. INTRODUCCIÓN ................................................................................................. 5
2.1. Especies reactivas de oxígeno ............................................................................. 5
2.2. Peroxidasas ............................................................................................................ 6
2.3. Peroxirredoxinas. Generalidades y tipos ............................................................. 7
2.4. Peroxirredoxinas tipo Prx6 .................................................................................... 9
2.5. Purificación de peroxirredoxinas ........................................................................ 10
3. OBJETIVOS ....................................................................................................... 12
3.1. Purificar Prdx6 de ratón ....................................................................................... 12
3.2. Analizar actividad peroxidasa dependiente de tiorredoxina ............................ 12
4. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................. 13
4.1. Reactivos ............................................................................................................... 13
4.2. Homogeneización ................................................................................................. 13
4.3. Cromatografías ..................................................................................................... 14
4.4. Diálisis, desalación y concentración de muestras. Determinación de la concentración de proteína .............................................................................................. 15
4.5. Electroforesis SDS-PAGE .................................................................................... 15
4.6. Detección inmunológica de Prdx6 ...................................................................... 16
4.7. Actividad peroxidasa dependiente de tiorredoxina .......................................... 17
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .......................................................................... 18
5.1. Purificación de Prdx6 ........................................................................................... 18
5.2. Actividad tiorredoxina peroxidasa ...................................................................... 32
6. CONCLUSIONES .............................................................................................. 33
7. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................. 34
4
1. RESUMEN / ABSTRACT
Este trabajo trata sobre la purificación de la Prdx6 de ratón que se ha hecho mediante
técnicas cromatográficas convencionales con el fin de tratar de analizar sus
características catalíticas. Este tipo de peroxirredoxina pertenece al tipo 1-Cys de la
cual no se ha llegado a un absoluto consenso sobre el mecanismo catalítico. No
obstante, se trata de probar si la peroxirredoxina purificada de ratón se ajusta al
mecanismo catalítico de la peroxirredoxina de 1-Cys de levadura [8].
This work deals with the purification of Prdx6 from a mouse that has been done by
chromatographic techniques in order to try to analyze its catalytic characteristics. This
type of peroxiredoxin belongs to the type 1-Cys from which it has not reached an
absolute domain of the catalytic mechanism. However, it is tried to test the
peroxiredoxin purified from the mouse conforms to the catalytic mechanism of 1-Cys
peroxiredoxin [8].
5
2. INTRODUCCIÓN
2.1. Especies reactivas de oxígeno
Como especies reactivas, tenemos generalmente iones de oxígeno, peróxidos y
radicales libres. Suelen ser pequeñas moléculas y altamente reactivas debido a la
capa de valencia. Son producidas debido al metabolismo de oxígeno, y dependiendo
de su estrés puede ser dañino para las células, lo que conlleva un estrés oxidativo.
El estrés oxidativo se produce debido a un desequilibrio entre las especies reactivas
y el sistema del organismo. Es un aumento en la reducción de la potencia celular, o
una disminución en la capacidad reductora de los pares redox como por ejemplo el
glutatión [9]. Este desequilibrio puede provocar efectos tóxicos en nuestras proteínas
e incluso ADN, debido a los peróxidos y radicales libres. Un estrés oxidativo fuerte
provoca la muerte celular, incluso la necrosis. El daño hace que haya un agotamiento
de ATP que detiene la muerte celular por apoptosis controlada, lo que hace que la
célula muera esparciendo por el medio compuestos muy tóxicos [5].
Hay varios tipos de especies reactivas:
® O2-: Se puede formar por una reacción de autooxidación. Es poco reactivo pero
puede liberar cationes de hierro (Fe2+) de ciertas proteínas.
® H2O2: Se puede formar por dismutación o por reducción directa. Se puede
difundir por membranas.
® ·OH: Se forma en la reacción de Fenton y por la descomposición de OONO-.
Es muy reactivo y puede dañar a todo tipo de componentes celulares.
® OONO-: Se forma entre una reacción de ·O2- y NO·. Puede someterse a
homólisis y formar radicales hidroxilo y NO2.
® ROOH: Se forma por reacciones entre lípidos y nucleobases.
® RO· y ROO·: Se produce o por adición de radicales o por eliminación de
hidrógeno.
® HOCl: Es muy reactivo y oxida fácilmente todo lo que tenga relación con
proteínas.
6
Como fuente principal de oxígeno reactivo tenemos a la pérdida de oxígeno activado
que hay en las mitocondrias durante la respiración oxidativa. El H2O2 se puede
producir por una gran parte de enzimas entre las que se incluyen las oxidasas y
monooxidasas. Éstas especies tienen una gran importancia en la señalización celular
y para que todo tenga un comportamiento adecuado debe de haber un equilibrio entre
el consumo y la producción de oxígeno reactivo [1][9].
2.2. Peroxidasas
Son un tipo de enzimas que actúan como catalizadores en reacciones redox, en el
que el oxidante es el grupo peróxido y un sustrato reductor que es oxidado por el
peróxido.
ROOR’ + 2e- + 2H+ ® ROH + R’OH
Algunas peroxidasas de plantas tienen aplicaciones inmunoquímicas debido a su
estabilidad y a su fácil conjugación con inmunoglobulinas.
En animales las peroxidasas suelen tener una acción defensiva en saliva o leucocitos.
No todas las peroxidasas son defensivas, también las hay que sintetizan hormonas
como por ejemplo la yoduro peroxidasa que se encarga de sintetizar las hormonas
tiroideas. Otro ejemplo es la glutatión peroxidasa la cual tiene una función
antioxidante. La glutatión peroxidasa cataliza una reacción de glutatión (GSH) a un
disulfuro (GSSG) utilizando H2O2.
GSH + H2O2 ® GSSG + H2O
Su función principal es proteger de la degradación que se produce por los
hidroperóxidos.
La mayoría de los tipos de peroxidasas son hemoproteínas. La figura 1 muestra los
diferentes tipos de enzimas peroxidasas caracterizados.
7
Fig.1. Tipos de peroxidasas [4]
2.3. Peroxirredoxinas. Generalidades y tipos
Las peroxirredoxinas son proteínas con una actividad peroxidasa con variedad de
sustratos como por ejemplo el H2O2, ROOH y ONOOH. Existen en casi todos los seres
vivos. Todas ellas tienen una cisteína peroxidática en el centro activo, que es oxidada
a ácido sulfénico por el peróxido. Este grupo se condensa con otra cisteína (cisteína
resolvente), entonces el disulfuro es reducido por un sistema enzimático,
generalemente el sistema tiorredoxina, que está compuesto por la tiorredoxina y
tiorredoxina reductasa. En algunos casos, el glutatión provee la cisteína resolvente,
formando un disulfuro mixto que se reduce por el sistema glutarredoxina. El NADPH
es el poder reductor que reduce las peroxirredoxinas [7].
Fig.2. Mecanismo general de peroxirredoxina [7]
8
Funcionalmente se pueden distinguir dentro de este grupo las peroxirredoxinas que
tienen 2-Cys y 1-Cys. En la de 2-Cys, tenemos la cisteína peroxidática y la cisteína
resolvente y eso se reduce con las tiorredoxinas.
Fig.3. Ciclo catalítico para peroxirredoxinas 2-Cys típicas [7]
Las de 1-Cys solo tienen la cisteína peroxidática, por lo tanto para este tipo de
peroxirredoxinas, el mecanismo catalítico tiene controversia. El consenso general dice
que el glutatión es el que aporta la cisteína resolvente, pero el mecanismo regenerador
general ya es debatido.
Fig.4. Ciclo catalítico para peroxirredoxinas 1-Cys [7]
Otra clasificación para las peroxirredoxinas se basa en secuencias conservadas y
perfiles de estructura alrededor del centro activo. Se divide en 6 tipos: AhpC/Prx1,
Prx5, Prx6, Bcp, AhpE y Tpx. De todas estas, solo se encuentran en mamíferos la
Prdx1, Prdx5 y Prdx6 [7].
9
2.4. Peroxirredoxinas tipo Prx6
La estructura de las peroxirredoxinas tipo Prx6 es similar a las tipo Prx1, con dímero
tipo B como estructura y con extensión C-terminal larga. Lo que diferencia a las Prx6
de las Prx1, es que ésta no tiene cisteína resolvente. La mayoría de Prx6 no tienen
residuos de cisteína cerca de la cisteína peroxidática para que se produzca el enlace
disulfuro, el cual se podría constituir sustrato para tiorredoxina. Incluso algunas Prx6
no tienen más que la cisteína peroxidática.
La peroxirredoxina tipo Prx6 en humanos (Prdx6) no muestra actividad peroxidasa
dependiente de tiorredoxina in vitro. Estudios, proponen que la Prdx6 actúa como
glutatión peroxidasa mediada por pGST (glutatión transferasa) donde la Prdx6
formaría un heterodímero el cual se disocia y otra molécula GSH actúa en el disulfuro
mixto regenerando la peroxiredoxina reducida y produciendo GSSG. La Prdx6 de
mamíferos tiene doble función, actividad peroxidasa y actividad fosfolipasa. La
actividad fosfolipasa se lleva acabo en un centro activo diferente y es óptima a pH
ácido debido a su localización lisosomal [2,3].
Fig.5. Mecanismo para la actividad peroxidasa de Prdx6 propuesto, con formación de una sulfenilamida como intermediario [3]
La Prx6 de levadura (Prx1p) muestra actividad peroxidasa dependiente de
tiorredoxina in vitro. Esta actividad tiorredoxina puede ser explicada debido a que la
cisteína peroxidática oxidada (CP-SOH) de una subunidad puede reaccionar con la
10
reducida (CP-SH) de otra subunidad, formando un puente disulfuro entre las dos
cisteínas peroxidáticas. Además, el CP-SOH oxidado de la Prdx6 de levadura puede
reaccionar directamente con el glutatión reducido, formando un intermedio
glutationilado en el centro activo que se resuelve con la tiorredoxina de la levadura
(Trx3p) y se recupera el GSH, como se muestra en la figura 6 [8]. La caracterización
de la Prx6 de levadura ha revelado una acción antioxidante nueva de la reducción de
glutatión, el cual actúa como colaborador en el mecanismo catalítico de una
peroxidasa de tiorredoxina [8][3].
Fig.6. Mecanismo propuesto para 1-Cys de levadura [8]
2.5. Purificación de peroxirredoxinas
Se hace esta purificación mediante técnicas recombinantes. Mediante la
tecnología de ADN Recombinante se sintetiza en un plásmido un gen sintético con
la secuencia que codifica la proteína de interés. Ésta metida en una bacteria, la
bacteria la produce y a partir de la misma se purifica. Sin embargo, en muchas
ocasiones este proceso no es efectivo porque la bacteria no puede sintetizar por
11
varias razones (toxicidad, mal plegamiento de la proteína, etc) la proteína con sus
propiedades catalíticas. Es por tanto que se debe de abordar la purificación a partir
de material biológico nativo si queremos estudiar este tipo de proteínas. En otros
estudios se ha realizado empleando cromatografías de afinidad, cromatografías de
intercambio iónico, etc [6]. En nuestro estudio, vamos a tratar de purificar mediante
técnicas cromatográficas convencionales y a partir de tejido de ratón la Prdx6
(Figura 7).
Fig.7. Secuencia Prdx6 de ratón [3]
12
3. OBJETIVOS
3.1. Purificar Prdx6 de ratón
Se quiere purificar la Prdx6 de ratón mediante técnicas cromatográficas
convencionales ya que la Prdx6 no se ha conseguido purificar satisfactoriamente
mediante técnicas recombinantes. Por lo tanto vamos a tratar de conseguir la Prdx6
de pulmón de ratón para poder hacer una caracterización de su actividad enzimática.
3.2. Analizar actividad peroxidasa dependiente de tiorredoxina
Este trabajo quiere demostrar que la actividad peroxidasa de la Prdx6, reflejada debido
al consumo de NADPH, es dependiente de la tiorredoxina ya que a día de hoy está en
entredicho el mecanismo catalítico de esta peroxirredoxina.
13
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. Reactivos
Tris-HCl Buffer Sigma
NaCl (99%) Sigma
EDTA (Anhidro, 99%) Sigma
(NH4)2SO4 (99%) Sigma
DTT Bio-Rad
PMSF (98%) Sigma
MES (99%) Sigma
PBS Tween 20 (10%) Bio-Rad
Persulfato amónico (98%) Bio-Rad
TEMED Bio-Rad
4.2. Homogeneización
Se pesó una cantidad de tejido (2 g) y se trituró en mortero con nitrógeno líquido. A
esto se le añadió 20 mL de una disolución tampón que contenía TrisHCl 50 mM, pH
8, 1 mM EDTA, 1 mM DTT y 1 mM PMSF. Después se homogeneizó con un disruptor
Polytron y posteriormente se completó la rotura mediante sonicación a la máxima
potencia permisible (Sonicador BANDELIN SONOPULS). Tras este paso, se
centrifugó a una potencia de 15000xg durante 1 h y el extracto libre de células o
sobrenadante constituyó el material de partida u homogenado con el que
comenzamos la purificación.
Fig.8. Homogeneización mediante sonicador
14
4.3. Cromatografías
Se realizaron las siguientes cromatografías:
® Cromatografía de exclusión molecular
Se lleva a cabo en un FPLC (Bio-Rad) con una columna SepfadexG75 (GE
Healthcare) equilibrada con tampón que contiene TrisHCl 20 mM, pH 8, 0,1 M
NaCl a un flujo de 0,25 mL/min
Fig.9. Columna Sepfadex G-75 acoplada a FPLC
® Cromatografías de intercambio iónico:
DEAE-Sefarosa cargada positivamente (Pharmacia, 1 x 10 cm), la cual se
equilibró con un tampón TrisHCl 50 mM, pH 8, 1 mM EDTA. Posteriormente las
proteínas se eluyeron con un tampón con 100 mM NaCl y después con 500 mM
NaCl. El flujo empleado fue de 1 mL/min
CM-Sefarosa cargada negativamente (Pharmacia, 1 x 10 cm) que se equilibró
con tampón MES 10 mM, pH 6,2, 1 mM EDTA. Tras esto, la muestra se eluyó
primero con un tampón con 100 mM NaCl y después con otro tampón con 500
mM NaCl, como hicimos en la resina DEAE-Sefarosa. El flujo fue de 1 mL/min
15
® Cromatografía hidrofóbica
Fenil-Sefarosa (Pharmacia, 1 x 5 cm) equilibrada con TrisHCl 20 mM, pH 8, 0,1
M NaCl y 1 M sulfato amónico, a un flujo de 1 mL/min. Después de realizar este
paso, se pasó un tampón sin sulfato amónico.
4.4. Diálisis, desalación y concentración de muestras. Determinación de la concentración de proteína
Se realizaron diálisis en membranas Spectrapor 1 (MWCO 8000 Da) frente a
tampón TrisHCl 20 mM, pH 8, 0,1 M NaCl y
® frente a tampón MES 10 mM, pH 6,2, 1 mM EDTA. Tras ésta, apareció cierta
turbidez en la muestra por lo que se decidió clarificarla mediante centrifugación
Para eliminar la alta concentración de sulfato amónico que pudieran tener algunas
muestras, que interfiere con los análisis electroforéticos y de determinación de la
concentración de proteínas, se utilizaron dispositivos Desaling Protein Columns,
(Thermo Fisher) según las instrucciones del fabricante.
Para reducir el volumen de una muestra, se utilizaron dispositivos concentradores
Spin-X UF (Corning) sometidos a centrifugación de 2500xg.
La concentración de proteína de las muestras se realizó por el método de Bradford
utilizando el reactivo Protein Dye Reagen (BioRad) y utilizando BSA para establecer
los patrones de concentración.
4.5. Electroforesis SDS-PAGE
Los geles de poliacrilamida han sido compuestos de la siguiente manera:
® Gel separador con 12% acrilamida, 0,37 M Tris-HCl y 0,1% SDS , pH 8,8.
® Gel concentrador con 5% acrilamida, 0,15 M Tris-HCl y 0,1% SDS , pH 6,8
Las proteínas de las muestras se sometieron a un proceso de desnaturalización,
añadiendo a las muestras 2% p/v de SDS y 100 mM DTT y calentando a 100º C.
La electroforesis se desarrolló un voltaje constante de 200 V.
16
4.6. Detección inmunológica de Prdx6
Para detectar la proteína Prdx6 sobre las membranas de nitrocelulosa se utilizaron
dos métodos, dot-blot y wester-blot.
Dot-blot consiste en añadir unas gotas de 5 µL sobre una superficie de nitrocelulosa,
en la que una vez secada, se llevó a cabo la exposición a los anticuerpos. Primero, se
sumerge la membrana durante 1 hora a una disolución de bloqueo, en tampón PBST
(fosfato 10 mM, pH 7,2, 100 mM NaCl, 5 mM KCl y 0,1 % v/v Tween-20) con 5% p/v
leche en polvo, seguido de la exposición durante 1 h a disolución de anticuerpo
IgPrx1p 1:5000 (inmunoglobulinas o anticuerpos anti Prx1p, purificada de sangre de
conejos inmunizado con la proteína Prx1p) [10], en PBST 1% leche. Posteriormente,
se realiza un lavado en PBST 1% leche (5 min x 3) y seguidamente se sumerge en
otra disolución con anticuerpo secundario Ig-HRPX (BioRad) diluido 1:10000 en PBST
1% leche, 1h. Finalmente se realizan 3 lavados más.
Después sumerge la membrana en el reactivo ECL prime WB detection reagen
Amersham (GE, Healthcare) y se realiza un revelado fotográfico.
Fig.10. Ejemplo de dot-blot con gotas de 5 µL; ELC (Extracto libre de células); F4 (Fracción 4); F11 (Fracción 11); F12 (Fracción 12); F13 (Fracción 13); F14 (Fracción 14); F15 (Fracción 15); F16 (Fracción 16)
Para realizar los western blot, previamente se realizó una electroforesis en SDS-PAGE
seguido de una trasnferencia de las proteínas del gel a membranas de nitrocelulosa
(GE Healthcare) mediante un sistema Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell (BioRad)
a un amperaje constante de 60 mA. Seguidamente se tiñeron las membranas con una
disolución de colorante rojo Ponceau, para detectar las bandas de proteína,
17
comprobar la eficacia de la transferencia y marcar la posición de las proteínas
marcadoras de peso molecular.
La detección mediante western-blot se hizo mediante el sistema Snap id. (Millipore)
Fig.11. Sistema Snap id. (Millipore)
que emplea una bomba se hace vacío para hacer pasar las disoluciones a través de
la membrana. Es un sistema rápido para hacer los western-blot oportunos. Este
proceso consta de un bloqueo (10 mL de PBST con 0,5% p/v de leche), luego se hace
pasar 5 L de una disolución con el anticuerpo primario IgPrx1P 1:1000, en PBST,
seguidamente se realizan 3 lavados de 10 mL cada uno en PBST, después se pasan
5 mL de una disolución con un anticuerpo secundario Ig-HRPX 1:5000 en PBST y por
último se realizan 3 lavados en PBST de 10 mL cada uno. Finalmente se realiza un
revelado fotografico previa exposición de la membrana al reactivo ECL prime WB
detection reagen Amersham (GE, Healthcare)
4.7. Actividad peroxidasa dependiente de tiorredoxina
La actividad peroxidasa de la peroxirredoxina dependiente de tiorredoxina se
determinó con un espectrofotómetro Ultrospec 4000 (Pharmacia) analizando el
consumo de NADPH a 340 nm de un medio de reacción que contiene: 250 µM
NADPH, 0,5 mM GSH, 0,5 µM Trx3p, 0,227 mg/mL proteína purificada (muestra fenil),
100 µM t-BuOOH, en TrisHCl 20 mM, pH 8, 0,1 M NaCl.
18
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1. Purificación de Prdx6
Primero comprobamos si podíamos detectar la Prdx6 en tejido de ratón debido a que
esta enzima no tiene una actividad específica y exclusiva que la permita detectar. Está
en tela de discusión que la Prdx6 tenga la actividad peroxidasa con la tiorredoxina.
Por lo tanto la manera de detectarla o perseguirla a través de la purificación es
mediante la detección inmunológica. Primero valoramos si el anticuerpo IgPrx1p, que
reconoce a la peroxirredoxina Prx1p de levadura, es también capaz de unirse a la
proteína Prdx6 de mamíferos, ya que ambas son muy homólogas
Fig.12. Comparación de la secuencia de levadura (Prdx1p) y Prdx6 en humanos [10]
En la figura 12, ambas secuencias son muy parecidas, por lo que por eso se usó el
anticuerpo de Prdx1p para intentar detectar la Prdx6 en extractos libre de células de
ratón. La utilización del anticuerpo usado en el western-blot reveló la presencia de una
sola banda correspondiente a una proteína de peso molecular correspondiente a
Prdx6 (Figura 13).
19
Fig.13. A) SDS-PAGE y tinción con azul Coomassie de ELC de pulmón de ratón, junto a proteínas marcadoras de peso molecular (Amersham Low Molecular Calibration Kit for SDS-PAGE, GE Healthcare). B) Western-blot de la muestra ELC con IgPrx1p
Basándonos en estos resultados, abordamos un procedimiento de purificación,
utilizando el método dot-blot para realizar la detección de Prdx6, que es en teoría un
procedimiento mas rápido, ya que el western-blot implica realizar una electroforesis,
una transferencia, etc.
En primer lugar, se realizó un homogenado de pulmón de ratón como se describe en
Materiales y Métodos. El extracto libre de células se sometió a cromatografía
hidrofóbica en fenil-sefarosa y se recolectaron fracciones a las que se determinó el
contenido en proteína según su absorbancia a 280nm. El cromatograma se muestra
en la figura 14.
20
Fig.14. Cromatograma de la columna de fenil-sefarosa. Con asterisco están las fracciones (5 mL) seleccionadas para la detectar la Prdx6 por dot blot.
Seguidamente, se seleccionaron varias fracciones para detectar a Prdx6 por dot-blot.
Fig.15. Revelado fotográfico del dot-blot sobre las muestras seleccionadas de la cromatografía hidrofóbica.
Debido a que daba resultado, seguimos con nuestra purificación, dializando las
muestras representativas que son las fracciones 12,13 y 14 (muestra Fenil, 15 mL) y
volviendo a hacer una cromatografía pero esta vez en columna de Carboximetil-
21
sefarosa con un gradiente de concentración después de que pasara la muestra, el
cual se termino regenerando con un tampón 1 M de NaCl.
Fig.16. Cromatograma de la columna de Carboximetil-sefarosa. En asterisco las fracciones mas llamativas y fue realizada con un gradiente de concentración NaCl (10-200 mM) con una regeneración con tampón 1 M NaCl.
Sobre estas fracciones marcadas se volvió a hacer un dot-blot con su correspondiente
revelado fotográfico para ver si realmente nos daban señal estas fracciones.
Fig.17. Revelado fotográfico del respectivo dot-blot de las fracciones de la columna de la figura 16
Hay 5 muestras que son las mas llamativas (F16-F20) que ocupan un total de 25 mL
de muestra (Muestra CM, 25 mL), por lo tanto se trató de concentrar la muestra a 0,5
mL por centrifugación en dispositivos Spin-X UF concentrator (Corning) y se pasa la
muestra a través del FPLC para realizar una cromatografía de exclusión molecular
que es mas precisa que las anteriores. Se concentró para poder adaptar la muestra a
22
una cromatrografía de exclusión molecular, que tiene como requisito una cantidad de
volumen limitada.
Fig.18. Cromatograma de la muestra concentrada en columna Sepfadex G-75 acoplada a FPLC
En el área de nuestro pico, se empieza a dar señal entre las fracciones 10-12 y termina
en torno a las fracciones 17-18, por lo tanto cogemos fracciones próximas tanto al
inicio como al final del área y realizamos otro dot-blot
Fig.19. Dot-blot con sus respectivas fracciones de la muestra pasada por el FPLC
Se recolectan las fracciones 13,14 y 15 que son las mas señaladas y forman nuestra
muestra Superdex (2 mL). Por lo tanto, con todas estas muestras que hemos obtenido
en la purificación, mediante Bradford se determinó la concentración de proteína la cual
fue:
23
ELC: 5,68 mg/mL (56,8 mg total) 100% de proteína
Fenil: 1,69 mg/mL (25,35 mg total) 45% de proteína
CM: 0,4 mg/mL (10 mg total) 18% de proteína
Superdex: 1,85 mg/mL (3,7 mg total) 6% de proteína con respecto al contenido inicial.
Con todo esto se realizó una electroforesis cargando 10 µg de proteína por calle y nos
dio este resultado.
Fig.20. Resultado electroforesis; 1.Amersham Low Molecular Weigh Calibration Kit for SDS-PAGE (GE Healthcare); 2. ELC; 3. Fenil; 4. CM; 5. Superdex
En la figura 20, en la calle 1 tenemos nuestro marcador de peso molecular para la
determinación de nuestra proteína y poder ver si se muestra o no. A 30 kDa se debería
de dar nuestra proteína y como indica la flecha, se ve ligeramente una especie de
señal por lo tanto vamos a realizar un western-blot para asegurarnos de que esto es
24
correcto. A 14 kDa en la calle 5, se puede ver una gran banda la cual correspondería
a una hemoproteína (hemoglobina).
Se realizó mediante el sistema SNAP id. (Millipore) para su exposición a los
anticuerpos. Todo esto con las mismas muestras con las que habíamos hecho la
electroforesis. Y tras esto hacemos el correspondiente revelado fotográfico con este
resultado.
Fig.21. Revelado fotográfico del respectivo western-blot; 1. Marcador de peso molecular; 2. ELC; 3. Muestra Fenil; 4. Muestra CM; 5. Muestra Superdex
En el ELC y en la muestra Fenil se detecta la proteína Prdx6, pero sin embargo en las
muestras posteriores no. Por ello vamos a tratar de realizar de nuevo el ensayo pero
sin realizar el dot-blot ya que parece que nos da falsos positivos, porque como bien
hemos visto en las imágenes anteriores daba señal, una vez que se ha hecho el
western-blot nos demuestra que esto no es así, debido a que posiblemente los
anticuerpos empleados reconocieron otras proteínas inespecíficas. La causa puede
deberse a que, a diferencia de la técnica western-blot, en el dot-blot se analizaron
proteínas no desnaturalizadas, por lo que la respuesta de los anticuerpos puede ser
diferente a la que presentan con las proteínas desnaturalizadas.
Replanteamos nuestra estrategia haciendo las purificaciones y tomando las fracciones
significativas y con ellas hacer el western-blot. Este proceso consiste como bien
hemos dicho antes en hacer la electroforesis y la transferencia a membrana de
25
nitrocelulosa, pero como es un proceso lento que puede llevarnos horas, para agilizar
este proceso lo hacemos mediante el método SNAP id. (Millipore)
Se somete al ELC (18 mL) a una cromatografía DEAE-Sefarosa en la cual recogemos
fracciones de 5 mL y se mide su absorbancia a 280 nm.
Fig.22. Cromatograma de la muestra ELC en columna DEAE-Sefarosa. Elución a 100 mM NaCl y a 500 mM NaCl. Con asterisco las fracciones mas representativas
Cogemos alícuotas de las muestras marcadas con asterisco y hacemos una
electroforesis y se tiño la membrana con rojo Ponceau siendo este su resultado
1. 2. 3. 4.
Fig.23. Membrana teñida; 1. ELC; 2. Flow through; 3. Elución 100 mM NaCl; 4. Elución 500 mM NaCl
Para intentar detectar la Prdx6 en las muestras se ejecutó un western-blot por el
método que he explicado con anterioridad y se realiza su correspondiente revelado
fotográfico con ECL prime WB detection reagen Amersham (GE, Healthcare)
26
1. 2. 3. 4.
Fig.24. Revelado fotográfico del western-blot; 1. ELC; 2. Flow through; 3. Elución 100 mM NaCl; 4. Elución 500 mM NaCl
La proteína no se retiene en la columna y se eluye en el flow through. Debido a esto,
se recogen las fracciones correspondientes al flow through (3-11), (Fig. 22). Estas
fracciones constituyeron la muestra DEAE-FT
Una vez dializada la muestra se obtuvo una cantidad de 33 mL, y se somete a una
nueva cromatografía esta vez por CM-sefarosa (Carboximetil-sefarosa). Esta columna
después de la muestra, se eluye con 100 mM NaCl y después con 500 mM NaCl.
27
Fig.25. Cromatograma columna CM-sefarosa. Con asterisco las fracciones mas representativas, esta vez las fracciones son de 10 mL.
Con estas fracciones, tomamos unas alícuotas y realizamos de nuevo una SDS-PAGE
12% y se vuelve a teñir la membrana con rojo Ponceau
1. 2. 3. 4.
Fig.26. Membrana teñida; 1. DEAE-FT; 2. Fracción 4; 3. Fracción 10; 4. Fracción 12
Se realizó un western-blot para detectar la Prdx6 en las muestras con este resultado
28
1. 2. 3. 4.
Fig.27. Revelado fotográfico del western-blot; 1. DEAE-FT; 2. Fracción 4; 3. Fracción 10; 4. Fracción 12
Se observó que la muestra eluye mayormente en el flow through (Figura 27,
numeración 2). Se recogen las fracciones correspondientes al flow through de la
columna CM-sefarosa que son las fracciones 2-5 y constituyen la muestra CM-FT
(volumen de 33 mL).
A esta muestra se le añade sulfato amónico de concentración 1 M y se somete a una
nueva cromatografía, en este caso en columna de fenil-sefarosa. La cual se le vuelve
a pasar un tampón sin sulfato amónico, el cual se realiza después de la flecha que
hay en la figura 28.
Fig.28. Cromatograma de la columna fenil-sefarosa. Con asterisco las fracciones mas llamativas, fracciones de 5 mL; Flecha, elución sin sulfato amónico.
Las alícuotas seleccionadas se trataron con dispositivos específicos (Desalting
Protein Columns, Thermo Fisher) para eliminar el sulfato amónico que contienen, y se
29
realizó una electroforesis, su correspondiente transferencia a membrana de
nitrocelulosa y su western-blot para detectar la Prdx6 con su correspondiente revelado
fotográfico.
Fig.29. Revelado fotográfico del proceso western-blot; 1. CM-FT; 2. Fracción 9; 3. Fracción 15
Se vio que la Prdx6 solo ha sido detectada en la muestra preliminar a la cromatografía.
Se realizó una SDS-PAGE de las muestras implicadas en la purificación y se tiñó la
membrana con Coomassie
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.
Fig.30. Electroforesis de las muestras implicadas en la purificación, 1. Marcadores de peso molecular; 2. ELC (20 µg proteína); 3. DEAE-FT (5 µg proteína); 4. CM-FT (2 µg proteína); 5. Fenil-Fracción 9; 6. Fenil-Fracción 14; 7. Fenil-Fracción 15; 8. Fenil-Fracción 16; 9. Fenil-Fracción 17; 10. Fenil-Fracción 18.
Se observó que las fracciones 16,17 y 18 contenían unas bandas que podrían
corresponder con la Prdx6, por lo que se volvió a realizar un western-blot con esas
fracciones y con las condiciones del western-blot anterior.
30
1. 2. 3. 4. 5.
Fig.31. Revelado fotográfico de western-blot; 1. CM-FT; 2. Fracción 16; 3. Fracción 17; 4. Fracción 18; 5. Fracción 19.
La Prdx6 es fuertemente retenida en la cromatografía de fenil sefarosa, ya que eluye
en las últimas fracciones del lavado sin sulfato amónico. Se reunieron las fracciones
17 y 18 que constituyeron la muestra Fenil (7 mL)
Mediante Bradford se determinó la concentración de proteínas de las muestras
implicadas en la purificación.
ELC: 5,33 mg/mL x 18 mL = 96 mg total (100 %)
DEAE: 1,50 mg/mL x 33 mL= 49,5 mg total (51 %)
CM: 0,12 mg/mL x 33 mL = 4 mg total (4 %)
Fenil: 0,04 mg/mL x 7 mL = 0,28 mg total (0.3 % de proteína con respecto a la cantidad
inicial)
La muestra Fenil se concentró en dispositivos Spin-X UF (Corning) hasta una
concentración 0,3 mg/mL. De esta manera se realizó una SDS-PAGE, cargando
aproximadamente 4,5 µg de proteína por calle. Se tiñó con Coomassie y luego se
realizó un western-blot con su revelado.
31
Fig.32. SDS-PAGE. Fig.33. Revelado fotográfico western-blot
La muestra fenil se marca con intensidad por lo tanto quiere decir que ahí tenemos la
Prdx6. No es una purificación total de la proteína porque para ello habría que hacerse
una cromatografía de exclusión molecular y otros pasos de purificación.
32
5.2. Actividad tiorredoxina peroxidasa
Fig.33. Actividad Tiorredoxina peroxidasa de la muestra purificada; 1. Ensayo completo; 2. Ensayo sin Trx3p; 3. Ensayo sin GSH; 4. Ensayo sin proteína purificada
Con este ensayo realizado, del cual ya he hablado de sus características en materiales
y métodos, se demuestra este modelo, ya que si no es con tiorredoxina, el consumo
de NADPH debido a la actividad peroxidasa no se refleja. La proteína de forma natural,
como contiene glutatión, sigue este mecanismo. Sin embargo, in vitro, si no se pone
glutatión en el sistema la proteína da una cierta actividad también con la tiorredoxina,
porque en vez de formar un disulfuro mixto con el glutatión, se forman disulfuros entre
las peroxirredoxinas, que en definitiva también lo reduce el sistema tiorredoxina.
En otros trabajos se llevó a cabo la purificación a partir de pulmón de vaca, donde se
realizaron cromatografías de exclusión molecular, una detección inmunológica como
también hemos hecho nosotros y obtuvieron una proteína semipura que dio señal con
una electroforesis. Después de esto se confirmó la presencia de pGST con un
western-blot y finalmente con una columna GST obtuvieron una proteína homogénea
[6], como bien podría ser nuestro caso si se sigue purificando como bien he dicho en
el final del apartado 5.1.
0
1
2
3
4
5
6
1 2 3 4
Cons
umo
NAD
PH (µ
M
min
-1)
33
6. CONCLUSIONES
Debido a la gran similitud que tenían las secuencias de la Prdx1 de levadura y la Prdx6
en humanos, se ha podido realizar este trabajo ya que, como se descubrió en otros
estudios [8], la Prdx1 de levadura tiene actividad peroxidasa, y esto ha sido vital para
poder llevar a cabo la purificación de nuestra proteína. Al añadir glutatión y haber
consumo de NADPH, está actuando el sistema tiorredoxina y por lo tanto se está
completando el ciclo que se propone en la figura 6.
Conclusiones:
1. En primer lugar hemos sacado en claro con este trabajo experimental que el
sistema dot-blot para la purificación de proteínas no es fiable ya que en algunos
casos puede dar resultados falsos y que el usuario crea que va por buen
camino cuando luego puede ser que no.
2. En segundo lugar, hemos comprobado que el sistema western-blot por SNAP
id. (Millipore) nos sirve de la misma manera que nos puede servir hacer el
experimento por el western-blot tradicional pero este último nos llevaría mucho
mas tiempo por lo que el sistema empleado en este trabajo es fiable y rápido.
3. Se saca en claro que la Prdx6 de pulmón de ratón muestra actividad peroxidasa
dependiente de tiorredoxina mediada con glutatión, ajustándose al modelo de
actividad de la peroxirredoxina 1-Cys de la levadura (Prx1p).
34
7. BIBLIOGRAFÍA
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35
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