Trabajo Práctico Nº 1: Histología del aparato reproductor masculino y femenino Se observarán al microscopio óptico los siguientes preparados histológicos: Aparato reproductor femenino:

1. Ovario: Mesotelio, corteza, médula, folículos primordial, primario y secundario, cuerpo lúteo, cuerpo albicans, antros foliculares, ovocito, células foliculares, células de la teca. Observar ovocitos en distintos estadios de maduración.

2. Utero: endometrio con glándulas epiteliales proliferativas y secretoras, miometrio con distintas capas

Aparato reproductor masculino:

1. Testículo: lobullillos con 4-7 túbulos seminíferos, cápsula albugínea, corte trasnversal del tubo seminífero, epitelio germinal, células de Seroli, membrana basal, tejido conjuntivo con células intersticiales de leydig y vasos sanguíneos

2. Epidídimo: epitelio pseudoestratificado con esterocilias, luz con espermatozoides, tejido conjuntivo y tejido muscular liso

3. Conducto deferente: epitelio pseudoestratificado con esterocilias, tejido conjuntivo, capa muscular longitudinal interna y capa muscular circular externa, capa adventicia

División Celular: Mitosis y Meiosis El crecimiento, reparación y renovación de todos los organismos multicelulares depende de la formación de nuevas células a través de la división de las células preexistentes. Existen dos mecanismos para la división celular: la mitosis en las células somáticas y la meiosis en las células germinales. Ambas formas de división presentan muchas características comunes, aunque difieren en el comportamiento de los cromosomas durante las fases iniciales de la división. Mitosis: La división mitótica da lugar a dos células hijas que poseen copias idénticas del genoma de la célula original. El ADN se replica antes del inicio de la división celular (periodo S). El período entre los episodios sucesivos de división celular se denomina interfase. La secuencia de acontecimientos que ocurren durante la mitosis se ha dividido en cuatro fases: profase, metafase, anafase y telofase.

Meiosis: El desarrollo de las células sexuales implica este tipo de división celular. Esta incluye dos divisiones nucleares sucesivas y una única replicación del DNA. Esta es una división celular de tipo reduccional. Además de reducir el número de cromosomas la meiosis permite variabilidad génica. Objetivo: Fases de la meiosis en el epitelio seminífero de Vizcacha: espermatogonias, espermatocitos I, estadíos de profase I, espermatocitos II, espermátides, espermatozooides.

Seminario Nº 2: BOR - Papers in Press, published online ahead of print November 27, 2002. Biol Reprod 2002, 10.1095/biolreprod.102.011023

BIOLOGY OF REPRODUCTION 68, 1463–1469 (2003) DOI: 10.1095/biolreprod.102.011023

© 2003 by the Society for the Study of Reproduction, Inc.

Localization of Tyrosine Phosphorylated Proteins in Human Sperm and Relation to Capacitation and Zona Pellucida Binding1 D. Sakkasa, G. Leppens-Luisierb, H. Lucasb, D. Chardonnensb, A. Campanab, D.R. Frankenc and F. Urner2,b a Department of Obstetrics and Gynecology, Yale University School of Medicine, New Haven, Connecticut 06520 b Clinic of Sterility, Department of Obstetrics and Gynecology, University Hospital of Geneva, 1211 Geneva 14, Switzerland c Department of Obstetrics and Gynecology, Reproductive Biology Unit, University of Stellenbosch and Tygerberg Hospital, Tygerberg, South Africa

ABSTRACT Mammalian sperm must undergo a process known as capacitation before fertilization can take place. A key intracellular event that occurs during capacitation is protein tyrosine phosphorylation. The objective of this study was to investigate and visualize

protein tyrosine phosphorylation patterns in human sperm during capacitation and interaction with the zona pellucida. The presence of specific patterns was also assessed in relation to the fertilizing capacity of the spermatozoa after in vitro fertilization. Protein tyrosine phosphorylation was investigated by immunofluorescence.

Phosphorylation increased significantly with capacitation and was localized mainly to the principal piece of human sperm. Following binding to the zona pellucida, the percentage of sperm with phosphotyrosine residues localized to both the neck and the principal piece was significantly higher in bound sperm than in capacitated sperm in suspension. When the percentage of principal piece-positive sperm present after capacitation was <7%, fertilization rates after in vitro fertilization were reduced. Different compartments of human spermatozoa undergo a specific sequence of phosphorylation during both capacitation and upon binding to the zona pellucida. Tyrosine phosphorylation in the principal and neck piece may be considered a prerequisite for fertilization in humans.

Trabajo Práctico Nº 3: Seminario a cargo de los Docentes del la materia. Mecanismos de la diferenciación celular. Conceptos de restricción, determinación y diferenciación celulares. Matrices Extracelulares

Trabajo Práctico Nº 4: Tejido ectodérmico general y Tejido ectodérmico neural El epitelio es un tejido compuesto por células con escasa sustancia intracelular, avascular, innervado que se apoya sobre una membrana basal. Los epitelios recubren todas las superficies libres de los órganos, tanto sean superficies internas como externas. Los distintos epitelios derivan de las tres hojas o capas del embrión: ectodermo, mesodermo y endodermo. Observar al microscopio óptico 1. Epitelio estratificado queratinizado: piel. 2. Epitelio estratificado no queratinizado: mucosa bucal. 3. Epitelio cúbico simple: tiroides 4. Médula espinal. 5. Cerebelo

Trabajo Práctico Nº 5: Tejidos de origen mesodérmico Observación al microscopio óptico de:

1. músculo esquelético estriado: lengua/ tibia

2. músculo liso: tráquea

3. tejido cartilaginoso: tráquea / tibia

4. tejido óseo por descalcificación: tibia.

Trabajo Práctico Nº 6: Tejidos de origen endodérmico Observación al microscopio óptico de:

1. Epitelios de revestimiento del aparato respiratorio: Tráquea / bronquio / bronquíolos / alvéolos - Pulmón 2. Epitelios de revestimiento del aparato digestivo:

Esófago / Intestino delgado

Trabajo Práctico Nº 7: Mechanical stress is communicated between different cell types to elicit matrix remodeling M. A. Swartz*, , D. J. Tschumperlin , R. D. Kamm§, and J. M. Drazen*,¶ * Department of Medicine, Pulmonary Division, Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School, Boston, MA 02115; Physiology Program, Harvard School of Public Health, Boston, MA 02115; and § Department of Mechanical Engineering and Division of Bioengineering and Environmental Health, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA 02139 Communicated by Yuan-Cheng B. Fung, University of California at San Diego, La Jolla, CA, March 16, 2001 (received for review July 18, 2000) Tissue remodeling often reflects alterations in local mechanical conditions and manifests as an integrated response among the different cell types that share, and thus cooperatively manage, an extracellular matrix. Here we examine how two different cell

types, one that undergoes the stress and the other that primarily remodels the matrix, might communicate a mechanical stress by using airway cells as a representative in vitro system. Normal stress is imposed on bronchial epithelial cells in the presence of unstimulated lung fibroblasts. We show that (i) mechanical stress can be communicated from stressed to unstressed cells to elicit a remodeling response, and (ii) the integrated response of two cell types to mechanical stress mimics key features of airway remodeling seen in asthma: namely, an increase in production of fibronectin, collagen types III and V, and matrix metalloproteinase type 9 (MMP-9) (relative to tissue inhibitor of metalloproteinase-1, TIMP-1). These observations provide a paradigm to use in understanding the management of mechanical forces on the tissue level. Key Words: airway wall remodeling / airway epithelium / asthma / lung fibroblasts

PARTE II: INTRODUCCIÓN A LA HISTOLOGÍA Y FISIOLOGÍA VEGETALES

Trabajo Práctico N º1 Reinos Fungi y Plantae Hongos: Introducción teórica: Características generales de los hongos. Divisiones: Chytridiomycota, Oomycota, Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota, Deuteromycota. Ciclos de vida. Desarrollo práctico: Observación a lupa y microscopio de micelios y estructuras reproductivas de las distintas divisiones. Plantas: Introducción teórica: Sistemas de clasificación de organismos: El objeto de la clasificación natural es agrupar las plantas de acuerdo al parentesco, ordenándolas en un sistema lógico, fundado en la subordinación de caracteres. Los criterios utilizados para las clasificaciones son múltiples, se toman en cuenta caracteres morfológicos, anatómicos, histológicos, citológicos, fisiológicos etc. y se los subordina de acuerdo a la importancia; en general, cuanto más alta es la jerarquía de un grupo, menos caracteres lo definen, siendo caracteres generales y profundos. Los grupos de distinta categoría que reúnen a las especies vegetales existentes se denominan taxa. El conjunto de especies afines forma el género. Si dos o más géneros de plantas tienen característica comunes o similares, se las agrupa formando una familia de plantas. Las familias, según el mismo criterio, se pueden agrupar en órdenes, que forman clases, las que conforman divisiones. Varias divisiones constituyen un reino, que es el taxón de mayor jerarquía. Sin haber visto nunca una planta, es posible reconocer un especimen a través de claves. En la actualidad todas las obras que describen la flora de una región o que contienen estudios sistemáticos contienen claves para facilitar la clasificación de las especies. En estas claves, se debe discernir entre dos caracteres (o grupo de caracteres) por vez, motivo por el que se las denomina dilemáticas o dicotómicas, y están basadas en pocos caracteres de fácil apreciación. Al usar las claves se comparan dilemas de igual jerarquía, A y AA, B y BB, etc (ver claves) y se selecciona el que refiera al espécimen en estudio. Pero para poder utilizar dichas claves es necesario contar con los conocimientos mínimos para poder hacer un reconocimiento adecuado de las estructuras observadas. En rasgos generales se pueden describir algunas de las características que son de utilidad para clasificar las plantas.

Órganos vegetales: La Flor La flor es el órgano reproductivo de las angiospermas. Alrededor del receptáculo floral se desarrollan los distintos ciclos de la flor: cáliz, corola, androceo y gineceo. Las flores de las distintas especies pueden presentar variaciones en cuanto a: -presencia o ausencia de partes florales (flores carpeladas, flores estaminadas) -disposición de las partes florales con relación al pedúnculo o receptáculo (ovario súpero o ínfero) -simetría de la flor (radial o actinomorfa, bilateral o zigomorfa) -disposición de pétalos y sépalos entre sí (fusionados o independientes) -número de unidades constitutivas de cada ciclo flor, tamaño, forma, color -disposición de flores (individuales o grupos de flores) La Hoja Por lo general, las hojas de las angiospermas están conformadas por una lámina delgada y expandida, un pecíolo y la base de la hoja, que es la zona de inserción al tallo. Asimismo como pasa con las estructuras reproductivas, se pueden observar variaciones en cuanto a presencia y ausencia de estructuras (ej. hojas sésiles = sin pecíolo) como así en la morfología: -disposición de venas (retinervadas, paralelinervadas) -morfología de hoja: tamaño, forma general, forma del ápice, borde de hoja (liso dentado, lobulado), base de la lámina (redonda, acorazonada), conformación de la lámina (hojas simples o compuestas) La Raíz Los sistemas radiculares pueden caracterizarse por tener una raíz principal de cuyo eje se originan raíces laterales (dicotiledóneas y gimnospermas). Otro sistema bien descripto es el sistema radicular fibroso, constituido por raíces que se desarrollan en o muy cerca de la superficie y conforman una densa red (monocotiledóneas). Por otro lado, pueden presentarse raíces especializadas en el almacenamiento de sustancias de reserva o que presenten cloroplastos. Desarrollo del TP: Observar y dibujar los distintos órganos de las plantas. Reconocer las características distintivas de las angiospermas, mono y dicotiledóneas. Determinar las especies arbóreas en base a la morfología foliar utilizando la clave 1. Determinar el género de las monocotiledóneas utilizando la clave 2. Determinar el género de las dicotiledóneas utilizando la clave 3. En todos los casos dibujar las características generales de cada espécimen.

Clave 1 Árboles A. hojas aciculares en grupos de dos 1.pino (pinus sp.) A. hojas con lámina aplanada B B. hoja simple C C. Hoja completa (margen liso, sin dientes ni lóbulos) D D. hoja elíptica 2. magnolia (M. virginiana) D. hoja no elíptica E E. hoja triangular (deltoide), redondeada en su base 3.Lila (Syringa vulgaris) E. hoja no triangula, ápice en forma 4. árbol de tulipán (Liriodendron de ángulo invertido tulipifera) C. hojas dentadas o lobuladas F F. hojas dentadas G G. hoja irregular en la base (oblicua) 5 Tila Tilia sp. G. hoja regular en la base H H. hojas acorazonada, ápice acuminado I I. hoja pequeña (2-5 cm en la base), 6 Abedul angular en la base (obtusa) Betula papyrífera var. subcordata I. hoja más larga (7-10cm en su base) base recta (truncada) 7 Alamo Populus sp H. hoja elíptica, ápice agudo notablemente 8 Olmo Ulmus sp. oblicua en su base (desigual) F. hoja lobulada J J. hoja con lobulación palmeada 9 Arce Acer sp. los ápices de los lóbulos son acuminados J. hoja con lobulación pinnada, ápices de los 10 Quercus Quercus sp. Lóbulos redondeados B. hoja compuesta ( con tres o más folíolos en un pecíolo K con una yema en su base) K. hoja con lobulación 11 Castaño de Indias palmeada grande (29-36cm de ancho) Aesculus hippocastanum K. hoja con lobulación pinnada, de menor tamaño L L. hoja con 3 a 5 folíolos 12 Arce negundo A. negundo L. hoja con 5 o más folíolos M M. Apice de los folíolos acuminado N N. hoja con 5 a 7 folíolos 13 Fresno, Fraxinus sp. N. hoja con más de 7 folíolos 14 Zumaque, Rhus typhina M. ápice de los folíolos redondeado O

O. hoja compuesta simple, folíolos dentados 15 Serbal, Sorbus sp. O. algunas hojas compuestas dobles 16 Acacia negra folíolos enteros Gleditsia triancanthos clave 2: Monocotiledóneas A. Plantas acuáticas B. plantas flotantes con raíces, talluelo muy reducido, hojas con dos bolsas prolíferas para reproducción vegetativa C. 1 raíz solitaria .........................................................................................................Lemma CC. varias raíces aagrupadas......................................................................................Spirodela BB. plantas flotantes sin raíces, con 1 sola bolsa prolífera D. hojas delgadas, alargadas.......................................................................................Wolfiella DD. hojas gruesas, globosas.......................................................................................Wolffia AA. plantas terrestres o epífitas E. plantas epífitas F. plantas con o sin raíces. Hojas en roseta, alargadas, recurvadas, punzantes. Flores en espigas terminales, pétalos iguales o subiguales. Corola azulada o lila. Gineceo súpero fruto cápsula........................................................................................................Tillandsia FF. plantas con raíces (a veces modificadas para absorber agua=velamen). Hojas fotosintéticas terminales, enteras. Tallos engrosados reservantes (pseudobulbos). Flores en racimos. Corola amarilla con un pétalo muy desarrollado (labelo). Androceo y gineceo fusionados (ginostemio), polen agrupado en polinias.......................................Oncidium EE. plantas terrestres G. Flores verdosas, poco desarrolladas, agrupadas en inlorescencias densas. Polinización anemófila. H. tallos trígonos. Inflorescencias terminales acompañadas de grandes brácteas alargadas...................................................Cyperus HH. tallos cilíndricos. I. Inflorescencias terminales Espiguillas agrupadas en panojas piramidales densas....................................................................Sorghum II. Inflorescencias terminales laxas, con pocas espiguillas grandes distanciadas entre sí, colgantes...................................................Avena GG. Flores dsarrolladas, con cáliz y corola vistosa, pequeñas agrupadas En inflorescencias muy vistosas (pseudantos). Polinización entomófila

J. Flores sésiles agrupadas en espigas de ejes más o menos carnosos (espádices) K. espádice entero L. Hojas fenestrtadas (perforadas). Espádices grandes, verdosos........Monstera LL. Hojas enteras. Espádices finos, espata blanca.............Zantedeschia KK. Espádice ramificado. Hojas flaveladas muy desarrolladas estípite leñoso desarrollado...............................................................Chamaerops

JJ. Flores grandes, pediceladas o sésiles, solitarias o agrupada en inflorescencias diversas (no espádice)

M. flores de gineceo súpero N. flores con cáliz y corola, pétalos azules o blancos............Commelina NN. flores con perigonio corolino de 6 tépalos vistosos Ñ Planta con bulbos subterráneos .....................................Lilium ÑÑ. Plantas sin bulbos, flores azuladas.................Agapanthus MM. Flores de gineceo ínfero O. Hojas en roseta, punzantes, recurvadas. Fruto compuesto............ Ananás OO. Hojas no punzantes, enteras, lámina paralelinervada

P. Pecíolo acanalado. Flores monoicas o a veces dioicas. Androceo con estaminodio escamoso y 5 estambres desarrollados. Rama aérea, en cada nudo porta las flores en la axila de una bractea coloreada con yemas múltiples. Fruto baya...........................................................Musa

PP. pecíolos no acanalados. Flores hermafroditas rodeadas de una gran bráctea navicular coloreada. Fruto cápsula................................................Strelitzia Clave 3: Dicotiledóneas A. F lores pequeñas, poco vistosas. Polinización generalmente anemófila B. árboles de hojas enteras C. plantas dioicas. Inflorescencias especiformes densas y péndula (amentos).

Fruto cápsula. Semillas numerosas, con pelos largos sin endospema D. yemas axilares cubiertas por varias escamas. Hojas aovadas o deltoides. Pecíolos largos.........................................................................................Populus DD. yemas axilares cubiertas por una sola escama. Hojas lanceoladas pecíolo breve......................................................................................Salix CC. Inflorescencias femeninas de pocas flores (paucifloras) con las flores redondeadas de un involucro de bracteas soldadas (cúpula). Hojas lobuladas fruto con cúpula persistente (bellota)..............................................Quercus BB. Arboles de hojas pequeñas, soldadas, escamosas, no verdes. Ramas verdes verticiladas, de aspecto equi setoide. Flores agrupadas en inflorescencias densas leñosas a la madurez......................................................................... .Casuarina AA. Flores desarrolladas con cáliz y corola (a veces ausente), con polinización

Generalmente entomófila. E. flores con pétalos casi o totalmente libres entre sí (corola diapétala) F. Gineceo súpero (carpelos soldados) o a veces carpelos libres hundidos en un receptáculo cupuliforme.

G. Hierbas con hojas carnosas, suculentas, anchas, cilíndricas. Flores actinomorfas, Pentámeras o tetrámeras. Carpelos libres..............................................................................Kalanchoe

GG. Hierbas, arbustos o árboles sin hojas carnosas H. Gineceo unicarpelar o dialicarpelar I. Gineceo Dialicarpelar con numerosos carpelos libres en el fondo de un receptáculo profundo. Androceo con numerosos estambres, ( muchos de ellos estériles convertidos en piezas petaloideas) hojas compuestas armadas con aguijones...............................Rosa II. Gineceo súpero formado por un único carpelo. Hoja s pinnadas J. Flores actinomorfas, tubulosas con numerosos estambres Fruto legumbre.................................................................Albizzia

JJ. flores zigomorfas. Corola papilionada, de pétalos amarillos:uno mayor Libre (estandarte), 2 soldados (quilla) y 2 más pequños libres Fruto samara...............................................................Tipuana

HH. Gineceo gamocarpelar K. Androceo formado por 6 estambres (4+2). Flores amarillas. Corola de 4 pétalos. Ovario cilíndrico de dos carpelos Raíz pivotante......................................................Brassica KK. Androceo formado por 5 a numerosos estambres (nunca 4+2) L- flores hermafroditas con cáliz y corola M. arbustos o hierbas con flores sin brácteas o calículo.

Androceo con numerosos estambres soldados en tubo estaminal.Corola roja, anaranjada o amarillenta........................Abutilon

MM. Árboles con flores soldadas a una bráctea floral Hojas acorazonadas..................................Tilia LL. Flores unisexuales. Corola ausente, cáliz acampanado, limbo con 5 lóbulos. Fruto polifolículo............... Brachychiton FF. Gineceo ínfero. Hojas con puntuaciones oleíferas y aceites esenciales

Fruto cápsula. Pétalos soldados formando un opérculo. Receptáculo turbinado o acampanado. Numerosos estambres exertos...................................Eucalyptus

E. Flores con pétalos casi totalmente soldados entre sí (corola gamopétala) N. flores de gineceo súpero

O. hojas opuestas, plantas con látex P. Estambres con un apéndice alargado en el extremo de las anteras Gineceo bicarpelar. Plantas con látex....................................Nerium PP. Estambres fusionados al gineceo en una columna central (ginostemio) polen agrupado en polinias plantas con látex........................Araujia OO. hojas alternas, palmadas. Corola acampanada grande azulada o violácea. Plantas trepadoras..................................Ipomoea NN. Flores de gineceo ínfero. Flores dimórficas en capítulos: las marginales liguladas con corola blanca y centrales tubulosas de corola amarilla..................................................................Matricaria

Trabajo Práctico N°2 Células y organelas vegetales Distinguir, observar y dibujar la morfología y características principales de distintos tipos de células y organelas vegetales:

1) Observación de células de tejidos fotosintéticos: Montar en portaobjetos (con una gota de agua) una hoja de Elodea sp. Observar los cloroplastos y su distribución intracelular. Qué es la ciclosis?

2) Observación de células de órganos de reserva: Montar en portaobjetos un corte fino de tubérculo de papa. Observar amiloplastos. Qué ocurre al colorearlos con lugol?

3) Observación de vacuolas: Montar en portaobjetos un corte fino de remolacha, y pétalos de distintas flores. Observar las vacuolas que contienen pigmentos.

4) Observación de cromoplastos: Montar en portaobjetos un corte fino de zanahoria. Observar los cromoplastos, que presentan diversas formas.

5) Observación de estomas y células epidérmicas: Montar en portaobjetos epidermis de helecho obtenida mediante pinza y bisturí. Observar células epidérmicas, estomas y cloroplastos. Es común la presencia de cloroplastos en la epidermis?

6) Observación de esclereidas: Montar en portaobjetos pulpa de pera. Observar las esclereidas. Histología vegetal: hojas de mono y dicotiledóneas Observar cortes transversales de hojas de mono y dicotiledóneas provistos por los docentes. En ellos se deberán distinguir los distintos tejidos, su disposición, tipos de células que los componen, función de las mismas. Observar las diferencias en la histología foliar de estos dos grupos de angiospermas. Realizar un esquema general que indique la disposición de los tejidos, utilizando la simbología de Metcalfe. Seleccionar una parte representativa del corte y realizar un dibujo detallado de los tejidos, teniendo en cuenta la morfología de las células, sus tamaños relativos, la existencia o no de espacios intercelulares, etc. Tejidos y estructuras a distinguir en hojas: Epidermis con cutícula, estomas, pelos. Mesófilo (con cloroplastos) en empalizada y esponjoso. Tejidos de sostén: colénquima, fibras de esclerénquima, esclereidas. Haces vasculares: xilema (hacia epidermis superior) y floema, células parenquimáticas que separan los haces vasculares del mesófilo (vainas). Otras estructuras: cristales de oxalato de calcio.

Trabajo Práctico N°3

Histología vegetal: raíces primarias de mono y dicotiledóneas. Tallo de dicotiledónea. Observar cortes transversales de raíces primarias de mono y dicotiledóneas, y de tallos de dicotiledóneas provistos por los docentes. En ellos se deberán distinguir los distintos tejidos, su disposición, tipos de células que los componen, función de las mismas. Observar las diferencias entre estos dos grupos de angiospermas. Realizar un esquema general que indique la disposición de los tejidos, utilizando la simbología de Metcalfe. Seleccionar una parte representativa del corte y realizar un dibujo detallado de los tejidos, teniendo en cuenta la morfología de las células, sus tamaños relativos, la existencia o no de espacios intercelulares, etc. Tejidos y estructuras a distinguir en raíces primarias: Epidermis: uni o pluriestratificada, sin cutícula, pelos. Corteza: parénquima con espacios intercelulares, esclerénquima, colénquima, endodermis sin espacios intercelulares y con bandas de Cáspary. Cilindro vascular (estela): Reconocer desde afuera hacia el centro: Periciclo (1 o 2 capas de células que originan raíces secundarias, proto-floema, meta-floema, proto-xilema, meta-xilema. Médula parenquimática central (puede o no haber). Tejidos y estructuras a distinguir en tallos: Epidermis con cutícula: uni o pluriestratificada. Colénquima, esclerénquima. Clorénquima: parénquima con cloroplastos. Médula y corteza parenquimáticas (dicotiledóneas), o parénquima disperso (monocotiledóneas). Haces vasculares dispersos: Reconocer desde afuera hacia el centro: esclerénquima, floema, xilema. Símbolos de METCALFE para simbolizar tejidos vegetales

colénquima

epidermis

floema

esclerénquima

parénquima

xilema

Clorénquima o mesófilo

Trabajo Práctico N°4 Transpiración Se cultivarán plantas de tomate (Lycopersicum esculentum) en macetas, en dos condiciones de disponibilidad hídrica: sin sequía (regados regularmente), con sequía (regados más espaciadamente). Luego de tres semanas de tratamiento, se evaluará el estado general de las plantas midiendo altura y número de hojas. Se medirá la transpiración (expresada como gramos de agua por unidad de tiempo y por área foliar) por un método gravimétrico. Para ello se procederá de la siguiente manera: Se colocará agua en las macetas hasta capacidad de campo, se cubrirá la tierra libre con un plástico, y se pesará la maceta con la planta (este será el tiempo cero). Luego se colocará la planta al aire libre en condiciones donde se favorezca el proceso transpiratorio (demanda evaporativa, luz), y luego de 3 hs se volverá a pesar. La diferencia de peso entre la primer medida y la siguiente equivalen a los gramos de agua perdidos por transpiración en ese intervalo de tiempo. Esto se realizará a lo largo del día (mañana, tarde, noche), de manera que es un TP en conjunto entre los dos turnos. Un grupo de plantas que estuvieron bien regadas se colocarán en oscuridad durante todo el día, para evaluar la pérdida de agua en oscuridad (situación en la cual no se favorece la apertura estomática). El área foliar se calculará al final del experimento de la siguiente manera: Se cosecharán todas las hojas de cada planta, se dibujará su silueta en una hoja de papel, y se calculará el área foliar total por planta. Se graficará la gramos de agua perdidos por unidad de tiempo y por área foliar a lo largo del día para las plantas que estuvieron sometidas a ambos tratamientos de disponibilidad hídrica, y para el control en oscuridad. Observación de estomas Se realizará una impresión sobre agarosa concentrada (6% m/V) de la epidermis de hojas de plantas de los dos tratamientos. Estas impresiones queda grabada la epidermis, pudiendose distinguir los estomas del resto de las células epidérmicas. Se contará el número de estomas abiertos y cerrados. El viernes siguiente a la realización de este TP se discutirán los resultados obtenidos.

Resolución de problemas En nuestro país, existen varias especies de pastos naturales. Dos de ellos, a pesar estar localizados en lugares con climas muy diferentes, poseen una morfología muy similar: hojas duras, pubescentes (con pelos), pequeñas con cutícula gruesa, sistema radical superficial. Mientras que el Stipa speciosa (coirón) se lo encuentra en la Patagonia argentina de clima árido, Distichlis spicata (pelo de chancho) se distribuye en la Cuenca del Salado, clima húmedo y suelo salino. i) Infiera cuál podría ser la presión de selección que sufrieron estas dos especies de

pastos que fijó una morfología similar. Para responder a esta pregunta puede servirle el gráfico detallado mas abajo.

ii) Explique el patrón de Ψa de las especies observados en el gráfico.

10 15 20

-2.5

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

Stipa speciosaDistichlis spicata

Horas del día

ψaho

ja

Trabajo Práctico N°5 Fototropismo y respuesta a la competencia de plantas vecinas de Arabidopsis thaliana Objetivo: Analizar las respuestas fototrópicas de plántulas del modelo experimental, Arabidopsis thaliana, estimuladas direccionalmente por distintas porciones del espectro lumínico. Métodos: Fototropismo y percepción lumínica. Una semana antes del inicio del TP se sembrarán en cajitas transparentes que contienen una solución 0.8% m/V de agar, semillas de Arabidopsis. Utilizaremos semillas de 2 genotipos: el salvaje y de los mutantes para el gen phot1, phyB y cop1. En cada caja se colocarán 8 semillas en hilera, de a una por vez, con una aguja mojada como se muestra en la figura. Todas las semillas sembradas serán incubadas durante 3 días a 4ºC en oscuridad y posteriormente se les aplicará un pulso de 30´ para estimular la germinación. En el caso del mutante phot1, se cultivarán las plántulas 48 hs en oscuridad (25ºC) y luego se dará un pulso de luz azul (430 nm) desde uno de los laterales y desde arriba. Los mutantes phyb y cop1 serán cultivados durante 4 días bajo luz roja (660 nm). Paralelamente, se cultivarán todos los genotipos en oscuridad. Cada grupo sembrará 1 cajita. En cada caja sembrarán hileras de ocho semillas de cada uno de los cuatro genotipos (el salvaje y los tres mutantes). Además, alguno de los grupos se encargará de sembrar cajas que servirán como controles de oscuridad. Respuesta de competencia a plantas vecinas La respuesta de competencia con plantas vecinas es una respuesta plástica caracterizada por alargamiento de los entrenudos y de los pecíolos de las hojas, cambio en el ángulo de inserción foliar y floración temprana. Esta síndrome es inducido por cambios en la composición espectral de la luz. El fitocromo B (phyB) percibe cambios en la relación R (660 nm) / RL (730 nm) que se traducen en señales tempranas de futura competición por la luz, redigiriendo recursos hacia la expresión de la respuesta de competencia. Mutantes en el phyB, phyb, presentan una respuesta de competencia constitutiva, aún creciendo bajo plena solar. Metodología Plantas de tres semanas de tomate (Lycopersicum esculentum) serán irradiadas durante las tres horas del trabajo práctico con rojo lejano (730 nm). Sobre estas plantas se medirá la variación del ángulo de inserción de las hojas respecto del eje vertical de la planta.

Seminario: “Increased phytochrome B alleviates density effects on tuber yiels of field potato crops” Plant Physiology (2003) Resolución de problemas 1. Un alumno de Biología II está estudiando las variaciones diarias del potencial agua de dos variedades comerciales de soja cultivados a capacidad de campo. Para ello mide los ΨH de las hojas y del suelo desde el amanecer hasta el mediodía obteniendo los siguientes resultados.

Podría citar un mecanismo fisiológico que explique estos resultados. Justifique. 2. Grafique la relación entre el intercambio neto de carbono (INC) y la concentración de CO2 en el aire para hojas de plantas C3 y C4. Explique sus gráficos y analice las diferencias.

-0.2 -0.1 -0.0

-0.25

0.00

ψ H Suelo

ψH H

oja

Novartis

-0.2 -0.1 -0.0

-0.25

0.00

ψ H Suelo

ψH H

oja

Dekalb

Trabajo Práctico N°6 Actividad fotosintética de cloroplastos aislados Objetivo: Verificar la integridad del sistema fotosintético de los cloroplastos aislados. Introducción Los procesos fisicos, quimico y bioquimicos que involucran la captacion y transferencia de la energia luminica y su almacenamiento en forma de energia quimica reciben en su conjunto el nombre de FOSINTESIS. La fotosintesis no solo es utilizada para transformar el CO2 en hidratos de carbono, (CH20)n, sino tambien para reducir el sulfato (SO4

= a SH) y el nitrato (NO3- a NH2),

cuyos estados mas reducidos vemos en numerosas moleculas biologicas (sulfhidrilos y aminos de proteinas, por ej.). Desde el punto de vista cuantitativo el tipo de fotosintesis mas importante es la oxigenica, en la cula se consumen H2O, CO2 y luz para generar (CH20) n y O2. Este tipo de fotosintesis es llevado a cabo no solo por las plantas y algas (todos eucariotas), sino tambien por las Cyanobacterias, mal llamadas algas azul-verdosas dada su naturaleza procariota . En los eucariotas la fotosintesis es llevada a cabo integramente dentro de organelas especializadas: los cloroplastos. Estos estan delimitados por dos tipicas membranas bicapa lipidicas y es por ello que mediante los procedimientos adecuados pueden obtenerse aislados del resto de los componentes celulares, y fotosinteticamente activos. Objetivos: 1- Verificar que esten fotosinteticamente activos (reaccion de Hill) e intactos (visualizacion al microscopio) 2- Ensayar la accion de distintos tratamientos sobre su capacidad fotosintetica (efecto de los detergentes e iluminacion a diferentes longitudes de onda). Materiales Buffer de homogeneización (BH10): Tris-HCL 30 mM (pH7.4) MgCl2 5 mM Sacarosa 10% w/v (292 mM) DCPIP :0.1 mg/ml (3.2 mM) de 2,6-diclorofenol- indofenol en BH10 SDS, Tritón x-100 0.8% w/v en BH10 Metodología El aislamiento de cloroplastos será realizado por los docentes. Los alumnos contarán con los cloroplastos para realizar los ensayos de la reacción de Hill. 1- Lavar con agua corriente unos 200 gramos de hojas de espinaca frescas (compradas

en el dia). Escurrir, destroncar y trozar las hojas en pedazos mas o menos chicos, y colocarlos en el vaso de la licuadora.

2- Agregar 350 ml de BH10 frio y licuar en forma intermitente hasta que las hojas queden en pedacitos de unos 1-2 milimetros de tamaño.

3- Filtrar en embudo por algodón (previamente humedecido en BH10) y centrifugar el filtrado a 40C 10 min. X 5.000 rpm (3000 g) y descartar el sobrenadante volcándolo con cuidado (ojo: el precipitado, que contiene los cloroplastos es muy flojo)

4- Resuspender el pellet de cloroplastos en 2ml de BH10 y dejarlos en hielo. 5- Armar el gradiente de sacarosa en un tubo transparente de centrifuga de 50 ml

agregando con pipeta Pateur las siguientes soluciones sucesiva y lentamente sobre la pared del tubo, para no mezclar las capas:

6- Cargar (despacio!) al tope del gradiente toda la suspensión de cloroplastos (aprox. 2

ml) y centrifugar a 4oC por 15 min (5 min a 4000 rpm = 2000g y 10 min a 7000 rpm= 6000 g, sin parar la corrida y sin freno)

7- Los cloroplastos enteros quedarán en la interfase entre BH40 y BH60 (parecerán "agrumados pero están bien). Retirar solamente estos, pasandolos a un tubo de vidrio limpio. Homogeneizar la suspensión lentamente con pipeta Pasteur hasta disolver los "grumos" y dejarla en hielo.

Aquí los cloroplastos han sido aislados de la mayoria de los componentes celulares y estan listos para comenzar con los ensayos siguientes.

Es importante que de ahora en adelante todas las suspensiones de cloroplastos sean manipuladas con la mayor delicadeza posible, ya que estos son frágiles y manteniéndolas todo el tiempo posible en hielo. Entonces en las manipulaicones siguientes manejarlos siempre:

- con pipeta Pasteur - tomando suspensiones despacio y soltándolas también despacio

sobre la pared del tubo - evitar la formación de espuma

BH20 8 ml

BH40 8 ml

BH 60 8 ml

Verificación de la actividad fotosintética e integridad de los cloroplastos aislados: Reacción de Hill: Rotular 4 tubos de ensayo y agregarles en el siguiente orden:

tubo 1 2 3 4 BH10 4ml 4ml 3ml 3ml DCPIP - - 1ml 1ml Susp. De cloroplastos

- 5 gotas - 5 gotas

Una vez agregados los cloroplastos mezclar de inmediato agitando suavemente el tubo, y colocar una serie de los duplicados en la oscuridad y la otra bajo luz blanca. Observación al microscopio 1- Colocar en un tubo de vidrio 1ml de BH10, agregarle 3 gotas de cloroplastos y

mezclar suavemente (rehidratación). 2- Dejar a temperatura ambiente 5 min 3- Colocar una gota sobre un portaobjetos y montar el cubreobjetos 4- Observar al microcopio Otros ensayos sobre la preparación de cloroplastos Iluminación a distintas longitudes de onda Hacer 4 tubos conteniendo 3ml de BH10 y 1 ml de DCPIP y mezclar Agregar a cada tubo 5 gotas de la suspensión de cloroplastos, mezclar suavemente y de inmediato iluminar a distintas longitudes de onda (azul, verde, rojo y oscuridad) Efecto de los detergentes Control SDS TX-100 BH10 3ml 3ml 3ml DCPIP 1ml 1ml 1ml SDS - 0.05 o 0.005 ml Triton X-100 - - 0.05 o 0.005 ml -Mezclar suavemente sin hacer espuma, agregar 5 gotas de los cloroplastos a cada tubo y volver a mezclar -Incubar bajo luz blanca.