LOS TRANSPORTADORES DE AZÚCARES EN LA GERMINACIÓN DEL MAÍZ SE REGULAN POR CARBOHIDRATOS. Sánchez-Nieto S, Ramírez-Verdejo S, Martínez-Marcelo V y Castañeda-Rico A. Depto. de Bioquímica, Conjunto E, Facultad de Química, UNAM, 04510, México DF. 5622 5284. sobeida@servidor.unam.mx. Resumen Los transportadores de azúcares en plantas son proteínas que participan en el transporte de carbohidratos, aunque también se ha sugerido que están relacionados con la percepción y transducción de señales por carbohidratos. En el presente trabajo se examino si los niveles y el tipo de carbohidratos (hexosas, disacáridos, análogos) extracelulares modifican el patrón de expresión de los transportadores de sacarosa y hexosas en los diferentes tejidos del maíz en germinación. Se obtuvieron las impresiones en papel de nitrocelulosa (“tissue printing”) de los embriones y ejes embrionarios germinados en diferentes carbohidratos, y se detecto a los transportadores de sacarosa y hexosas mediante anticuerpos específicos. El transportador de hexosas se expreso en niveles similares en ejes y embriones de maíz, pero el transportador de sacarosa no se expresa en el eje embrionario de maíz cuando se embebe en agar, manitol, sorbitol, glucosa o fructosa, pero si se expresa al embeber los ejes embrionarios en manosa solo en la zona de la radícula y en el tejido vascular. La manosa se sabe puede ser fosforilada por la hexocinasa, pero en plantas su metabolismo es lento o inexistente, por lo que se sugiere que la expresión del transportador de sacarosa depende o del metabolismo de carbono o bien de la vía dependiente de hexocinasa. Por otra parte, en los embriones completos en donde se encuentra el eje embrionario y el escutelo, se detecto al transportador de sacarosa en el escutelo. Inmunoréplicas tipo Western de las fracciones microsomales de embriones completos muestran que al embeber al embrión en glucosa y fructosa disminuye la intensidad de la banda detectada con el anticuerpo alrededor de un 80-90%. Estos resultados involucran a las hexosas como las señales que reprimen la expresión del transportador de sacarosa y la hexocinasa podría estar involucrada en la señalización. Introducción. Durante la germinación el eje embrionario de maíz recibe los nutrimentos de los tejidos de almacenamiento que le rodean, como son el escutelo (cotiledón modificado) y el endospermo y establecen una relación de fuente-demanda. Se conoce que el transporte de los nutrimentos desde el endospermo hacia el eje embrionario ocurre tardíamente durante la germinación, ya que comienza poco antes de la elongación de la raíz, evento finamente regulado por hormonas y por la concentración de glucosa (Bradford, 2004), sin embargo no se sabe que ocurre en cuanto al flujo de carbono durante el periodo de inicio de la imbibición de la semilla hasta que la raíz se elonga y sale de la cubierta de la semilla.

Memorias del XIV Congreso de Bioenergética y Biomembranas. Sociedad Mexicana de Bioquímica A.C. 13 al 18 noviembre 2005; Oaxaca, Oaxaca.

El escutelo es el tejido que se encuentra inmediato al eje embrionario y su principal reserva de carbono son los lípidos, se tienen evidencias de que el ciclo del glioxilato se encuentra activo en esta etapa, por lo que la síntesis de sacarosa puede ocurrir en el escutelo (Bradford 2004, Longo y Longo,1972). La sacarosa o bien los productos de su hidrólisis serán transportados y sustentarán el metabolismo del eje embrionario, hasta que comience en el endospermo la hidrólisis del almidón. En vista de que el tipo, concentración y localización de los carbohidratos cambia conforme avanza la germinación, es posible que éstos tengan un impacto en la expresión de los transportadores de azúcares. Para explorar la posible participación de los azúcares en la modulación de los niveles de los transportadores de hexosas y sacarosa, medimos la expresión de los transportadores en ejes y embriones de maíz germinados en diferentes carbohidratos. Materiales y métodos. Germinación de ejes y embriones de maíz. Lotes de 10 a 16 embriones y ejes embrionarios que fueron extraídos manualmente con navaja, son desinfectados en una solución de hipoclorito de sodio al 2%. La imbibición de los embriones y ejes embrionarios de maíz a los diferentes tiempos (8,12, 24, 30, 48, 60, y 72 h), se llevó acabo en cajas Petri que contienen agar al 1% por triplicado. Se incuban a 29°C y en ausencia de luz. Al termino de la germinación se colocan los tejidos en refrigeración a -80°C hasta su utilización. Germinación de embriones y ejes embrionarios en diferentes carbohidratos. El tejido se germino en los siguientes carbohidratos sorbitol, sacarosa, glucosa y fructosa, a concentraciones entre 5 a 50 mM en agar al 1% y con manosa a una concentración de 0.5 a 5mM en agar 1%. Se incuban por 24 h a 29°C en oscuridad y se almacenan a -80°C hasta su utilización. Extracción etanólica de carbohidratos solubles y almidón. El extracto se obtiene al moler 100 mg de embriones y ejes embrionarios en mortero con 1ml de etanol en ebullición (80% v/v) y una segunda vez con agua. La mezcla alcohólica se centrífuga a 14, 000xg por 10 minutos. El sobrenadante se evapora y se resuspende en 100 a 200ul de agua bidestilada. El extracto se guarda a –20°C hasta su utilización. El botón obtenido de la centrifugación del extracto agua-alcohol contiene al almidón. Determinación del contenido de glucosa, fructosa y sacarosa mediante un método enzimático. A 12ul de extracto etanólico se le adicionaron 200ul de reactivo de ensayo de glucosa (SIGMA G3293; 0.5mM NAD+, 1.0 mM ATP, 1.0 U/ml hexocinasa y 1.0 U/ml de glucosa 6P deshidrogenasa), la mezcla se incuba 15 min a temperatura ambiente y se lee la absorbencia a 340 nm, la primera lectura nos da la cantidad de glucosa en la muestra, posteriormente se le añaden 2ul de 600 U/ml fosfoglucosa isomerasa, la segunda lectura a 340nm lo que nos da la suma de fructosa y glucosa. Para la determinación de sacarosa se realizo

primero su hidrólisis, se incubaron 12ul de extracto etanólico con 10.6 U de invertasa de levadura a 37°C por 2 h, la glucosa producida se determino con el método enzimático ya descrito. Determinación de los niveles del transportadores de azúcares mediante inmunoréplica tipo Western. Se prepararon geles al 12% de poliacrilamida-SDS según la técnica de Laemli, 1970. Las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF en un sistema de transferencia húmeda por 2 h a 25V. Para la detección del transportador de sacarosa se utilizo el anticuerpo que reacciona con el péptido TARWGRRPFILIGC, secuencia que se localiza en la primera asa intracelular del transportador de sacarosa de maíz (Zavala-Zendejas, 2001), mientras que para detectar al transportador de hexosas se uso un anticuerpo que reacciona con una secuencia conservada para la mayoría de los transportadores de hexosas, LGWLPSEIFPLEIRSAC. Ambos anticuerpos se purificaron mediante una columna de CNBr-sefarosa acoplada con el péptido antigénico. Se corroboró que el anticuerpo solo reaccionará con una banda. La reacción de luminiscencia del segundo anticuerpo se revelo en placas fotográficas y las bandas de reacción se cuantificaron mediante el programa Quantity One incluido en el aparato Fluor S-TM Multimager de BIORAD. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. Improntas de ejes embrionarios de maíz secos muestran que el eje embrionario sin embeber no contiene transportador de sacarosa, mientras que los escutelos si (Figura 1A), y aún cuando la germinación comienza el eje embrionario no sintetiza transportador de sacarosa en la mayoría de sus células, a excepción de las localizadas en la punta de la raíz (Figura 1B). El resultado anterior no se debe a que el tejido haya sufrido daño con la extracción de la semilla, ya que el anticuerpo contra el transportador de hexosas reacciona tanto en el eje embrionario como en el escutelo (Figura 1C). La presencia del transportador de hexosas en ambos tejidos se explica conociendo la localización de los tejidos embrionarios, el eje embrionario se encuentra envuelto del escutelo y esta a su vez del endospermo, el escutelo al comenzar la movilización de las reservas del endospermo recibirá glucosa como fuente carbonada, mientras que el eje embrionario tendrá la capacidad de recibir glucosa del escutelo y del endospermo (Figura 1F). Pero lo que si es sorprendente es que el eje embrionario no contenga un transportador de sacarosa y entonces depende para su nutrición del transporte de hexosas. La imbibición de ejes embrionarios en presencia de sorbitol, sacarosa y glucosa no tiene un impacto en la expresión del transportador de sacarosa en el eje embrionario (Figura 1E), pero la imbibición en manosa induce la expresión en dos lugares principalmente, en la tejido vascular y en la coleorriza y raíz (Figura 1D). La manosa es un epímero de la glucosa, puede ser fosforilado por la hexocinasa, sin embargo en las plantas el metabolismo de la manosa-6P es reducido o no existe, por lo que la modificación en la expresión del transportador de sacarosa podría deberse a que la manosa se encuentra secuestrando fosfato del medio, es decir a que hay menor concentración de ATP y por tanto el metabolismo se

encontraría comprometido o bien que la hexocinasa, una enzima que se sabe puede mediar la señalización para la represión o inducción de genes no se encuentre realizando esta función en presencia de manosa y por tanto su acción de represión sobre el transportador no se ejerce y por tanto observamos que el eje logra producir transportador.

Figura 1. Distribución de los transportadores de sacarosa y hexosas en tejido embrionario de maíz y el efecto de la incubación en diferentes carbohidratos en su expresión. A. Detección del transportador de sacarosa en impronta de embriones secos de maíz, y en B ejes embrionarios embebidos 48 horas en 1% Agar. C. Detección del transportador de hexosas en embriones germinados 24 horas D. Efecto de manosa en la expresión del transportador de sacarosa, las flechas indican los sitios en donde hubo mayor expresión. E. Efecto de la Imbibición con sacarosa, sorbitol y glucosa en la expresión del transportador de sacarosa en ejes embrionarios. F. Caricatura de un embrión de maíz, en donde se indica donde se encuentran las células del escutelo (s y pc de scutellum y parenquima cell), el eje embrionario y como se conectan a través del haz vascular (v), además se observan en el eje embrionario los primordios de hojas y en la parte inferior la radícula con la cubierta denominada coleorriza.

100mM Sorbitol

100mM Sacarosa

100mM Glucosa

15mM Manosa

Tejido vascular

Radícula y coleorriza

DC

Escutelo

A B

E F Eje embrionario

La regulación de la expresión de los transportadores de sacarosa es probable que se lleve a cabo durante la germinación, debido a que la concentración de los azúcares va cambiando conforme la germinación procede. En la Figura 2A se muestran los cambios en contenidos de carbohidratos de ejes y embriones de maíz germinados en Agar, observandose que glucosa y fructosa son los carbohidratos que menos se acumulan en esos tejidos, mientras que sacarosa llega a ser de 6-7 veces mayor que glucosa y fructosa al inicio de la germinación, tanto en ejes como embriones. Los contenidos de sacarosa entre ejes y embriones son similares al inicio de la germinación y hasta las 24 h, pero después de 24 y hasta las 60 h se mantiene la concentración de sacarosa en el embrión mientras que en el eje disminuye. El escutelo es un tejido que es capaz de sintetizar sacarosa por lo que es probable que la sacarosa se vaya acumulando en este tejido.

0.010.020.030.040.050.060.070.080.0

0 8 12 24 30 40 48 60Tiempo de imbibición (horas)

Car

bohi

drat

o (m

g/ g

eje

)

glucosafructosasacarosa

0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0

70.0

0 8 12 24 30 40 48 60Tiempo de imbibición (horas)

Car

bohi

drat

o (m

g/g

embr

ión)

Figura 2. Curva temporal de contenidos de azúcares solubles durante la germinación de ejes y embriones de maíz. A. Ejes embrionarios y B. Embriones. Evaluamos el efecto de la imbibición de los embriones completos en diferentes carbohidratos sobre la expresión de los transportadores de sacarosa. Y como se aprecia en la Figura 3. El RNAm para el transportador de sacarosa se expresa mejor cuando embebemos el tejido 36 o 48h, mientras que a 15 horas los niveles de transcrito son indetectables. La imbibición en glucosa y fructosa reprime la expresión del transportador entre un 7 a un 20%, mientras que sacarosa no produce ningún cambio en la expresión del RNAm para el transportador (Figura 3ª y C). Cuando examinamos los niveles de proteína detectados por anticuerpos se observa nuevamente una disminución en la proteína al embeber con glucosa y fructosa los embriones completos, mientras que la imbibición en agua, sacarosa y sorbitol son similares entre sí (Figura 3B y C). La expresión del transportador en los escutelos de maíz si son regulados por las hexosas, lo sugiere nuevamente que la hexocinasa podría estar participando en la regulación del transportador de sacarosa, a través de la percepción de los contenidos de glucosa y fructosa en el medio. Estamos realizando experimento para medir la actividad y el contenido de hexocinasa con el fin de conocer la posible participación de la hexocinasa en la regulación de la expresión del transportador de sacarosa.

A B

Nuestros resultados son contrarios a los que se ha encontrado en algunas isoformas para el transportador de sacarosa como en betabel y haba, en donde se reprimen en presencia de sacarosa (Vaughn et al., 2002; Lalonde et al., 1999), aunque otras isoformas como el transportador SUT2 en tomate y Arabidopsis se inducen (Barker et al., 2000). En cuanto a los niveles del transportador de hexosas, no hemos observado un cambio en los niveles en presencia de los diferentes carbohidratos, sin embargo esto no es sorprendente ya que no se tienen muchos ejemplos de que esto ocurra, sólo en células de Vitis vinifera se encontró el aumento en la expresión del transportador VvHT1 tanto por glucosa como por sacarosa (Atanassova et al., 2003), no obstante se ha encontrado una relación en la inducción de la expresión de las invertasas con los niveles del transportador de hexosas (Sherson et al., 2003). Fru Glu Sac Mal Agua 15 36 15 36 15 36 15 36 15 36 48

Agua Glu Fru Sac Sorb

0

20

40

60

80

100

120

Fructos

a

Glucos

a

Sacaro

sa

Maltos

aAga

r

Sorbito

l

Can

tidad

rela

tiva

(%)

RNAm

Proteína

Figura 2. Niveles de expresión del RNAm y de la proteína para el transportador de sacarosa de embriones de maíz embebidos en diferentes carbohidratos. A. Northern Blot que muestra los niveles de RNAm a diferentes tiempos de germinación de los embriones y en diferentes carbohidratos, el panel inferior muestra el control de cargado, RNA teñido con bromuro de etidio. B. Inmunoréplica tipo Western del transportador de sacarosa de maíz, el panel inferior corresponde al control de carga, las proteínas se tiñeron con azul de Coomasie. C. Los niveles de RNAm y de proteína se determinaron al realizar la densitometría de las bandas.

Trabajo apoyado parcialmente por la DGAPA-PAPIIT IN200204 Y IN218505 y Facultad de Química PAIP6290-12. Referencias. 1. Atanassova R, Leterrier M, Gaillard C, Agasse A, Sagot E, Coutos-Thévenot,

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