1

Treball de Química Física Catàlisi enzimàtica: Mecanisme de Michaelis-Menten Els enzims són biocatalitzadors, és a dir, compostos d’origen biològic que acceleren les reaccions que es duen a terme dins de la cèl·lula de manera eficaç, específica i susceptible de ser controlada a través de mecanismes de regulació. A més, permeten que aquestes reaccions es donin en unes condicions més suaus que siguin compatibles amb la vida, és a dir, un pH pròxim a la neutralitat, a temperatura fisiològica, pressió atmosfèrica, etc. La especificitat fa que generalment transformin un compost o un grup reduït de compostos relacionats estructuralment (substrats) en els productes corresponents sense que es produeixin reaccions col·laterals. Cal destacar que, en general, els biocatalitzadors són proteics i els anomenem enzims, encara que des de l’any 1986 es coneixen unes altres biomolècules basades en RNA que també tenen capacitat catalítica i que s’anomenen ribozims. Per definició els catalitzadors, en general, són compostos que acceleren les reaccions químiques sense esgotar-se i que no es modifiquen durant la reacció que catalitzen, de manera que de forma general, n’hi ha prou amb petites quantitats d’ells per tal de produir una intensa acceleració de la reacció. La raó per la qual els compostos orgànics reaccionen amb molt poca velocitat és la elevada energia d’activació (Ea o �G++) que ha de portar cadascuna de les molècules que intervé abans de poder reaccionar.

En dissolució gran part d’aquesta energia d’activació s’utilitza per desplaçar la capa d’hidratació que envolta les molècules que reaccionen i sovint durant la reacció també s’eliminen transitòriament les estructures estabilitzades per ressonància, per la qual cosa també es requereix energia. El punt energèticament més alt de la reacció correspon a un estat de transició, aquest es caracteritza per ser energèticament desfavorable i altament inestable, de tal manera que no pot ser aïllat.

2

El que fa un catalitzador és possibilitar un altre mecanisme de reacció sovint força més complex pel que fa al seu mecanisme de reacció. Si tots els estat de transició que s’obtenen tenen una energia d’activació menor que la reacció no catalitzada, la via alternativa tindrà lloc més ràpidament, tot i que el nombre de productes intermedis sigui major. Pel fet que els compostos inicials i finals de la reacció són els mateixos, la variació d’energia lliure (�G) de la reacció catalitzada i la no catalitzada és la mateixa. Per això, els catalitzadors tampoc poden alterar l’estat d’equilibri de la reacció. Per tant, si considerem de forma estricta un catalitzador, aquest no disminueix l’energia d’activació de la reacció, sinó que permet que la reacció es doni per una altra via que té, no obstant, una energia d’activació menor. Si ens centrem en quin és el sistema que tenen els enzims, en concret, per proporcionar un descens tant important de la energia d’activació, l’explicació rau en el fet que gran part de l’energia que els cal per reduir l’energia d’activació l’obtenen, generalment, de les interaccions no covalents entre enzim i substrat. La formació de cada interacció dèbil en el complex enzim-substrat va acompanyada per una petita alliberació d’energia lliure que proporciona un cert grau d’estabilitat a la interacció (energia de fixació). Així, hi ha dos principis fonamentals interrelacionats que proporcionen una explicació general de com els enzims usen l’energia d’unió no covalent: 1.- El poder catalític dels enzims prové, en últim terme, de l’energia lliure emesa en formar-se els múltiples enllaços dèbils i interaccions que es produeixen entre l’enzim i el substrat. Essent aquesta energia de fixació clau tant per l’especificitat com per la catàlisi. 2.- Les interaccions dèbils estan optimitzades per tal que en l’estat de transició de la reacció, el llocs actius de l’enzim siguin complementaris no als substrats de per si, sinó a els estat des transició pels que passen els substrats en el procés de transformació en els productes de la reacció que catalitzen. Aquesta energia de fixació no explica per si sola perquè es redueix l’energia d’activació. Per donar resposta a aquesta qüestió, va aparèixer l’any 1894, la hipòtesi del “Pany i la clau” d’Emil Fisher. Posteriorment va ser modificat en la hipòtesi de “L’ajust induït” de Koshland. Aquesta consisteix en el fet que els enzims i els substrats són estructuralment complementaris en un grau màxim quan aquests últims es troben en l’estat de transició de tal manera que es redueix l’energia d’activació que de fet és la que impedeix arribar a l’estat de transició. Aquesta hipòtesi no es possible de ser concebuda des d’una complementarietat total entre el enzim i el substrat perquè, tal i com es mostra en la figura que hi ha a continuació, si la formació del complex enzim i substrat entraria en un estat excessivament estable des del punt de vista energètic que dificultaria encara més l’arribada a l’estat de transició. Així doncs, la “deformació” que li cal al substrat per arribar a l’estat de transició quan està en el centre actiu de l’enzim, es veu compensat en escreix per l’estabilització

3

d’aquest per les forces febles no covalents que constitueixen l’energia de fixació que hem esmentat anteriorment.

Per fer-nos una idea de la importància que tenen els enzims i com n’arriba a ser d’efectiva la seva tasca, veiem en primer lloc un exemple senzill com és el de la transformació de peròxid d’hidrogen (H2O2) o aigua oxigenada en oxigen i aigua. En la reacció no catalitzada al principi es degrada una molècula de H2O2 en aigua H2O i oxigen atòmic, que llavors reacciona amb una segona molècula de H2O2, fins formar més aigua i oxigen molecular. L’energia d’activació d’aquesta reacció és relativament alta: 75 kJ/mol.

2 2 2

2 2 2 2

2 2 2 2

1ª

2ª

2 2

H O H O O

O H O H O O

H O H O O

→ ++ → +

− − − − − − − − − − − − − − − −→ +

En presència de iodur (I-) com a catalitzador la reacció segueix una altra via; en aquest cas es genera com a productes intermedis aigua i hipoiodur (OI-), que amb una nova molècula de H2O2 també forma més aigua i oxigen molecular. Llavors com tot catalitzador s’allibera de nou en la forma original, el ió de iodur que pot participar de nou en una nova reacció.

2 2 2

2 2 2 2

2 2 2 2

1ª

2ª

2 2

H O I H O OI

H O OI H O O I

H O H O O

− −

− −

+ → +

+ → + +− − − − − − − − − − − − − − − − − − −

→ +

4

En aquest cas, l’energia d’activació de la via és més baixa, en concret, 56 kJ/mol. Aquest fet té com a conseqüència que la reacció s’acceleri aproximadament un factor de 2.000 ja que la velocitat de reacció depèn exponencialment de l’energia d’activació.

/ .Ea R Tv e−�

Els ions metàl·lics lliures com el platí i el ferro també són catalitzadors efectius de la degradació del H2O2. Una degradació encara més intensa és la de la catalasa, un enzim que protegeix les cèl·lules de l’acció tòxica de H2O2. En la degradació catalitzada per aquest enzim, el H2O2 s’uneix al grup hemo d’aquest, i allà – en interaccionar amb els diferents residus dels aminoàcids- es transforma ràpidament en aigua i oxigen atòmic. L’àtom d’oxigen es captat de forma transitòria per l’àtom central de ferro del grup hemo. Per tal de transfer-lo a una segona molècula de H2O2. L’energia d’activació associada a la catàlisi per la catalasa és d’aproximadament 23 kJ/mol. Així doncs, si ho comparem amb la reacció sense catalitzador hi ha una acceleració corresponent a un factor de 1,3.109. La catalasa un dels enzims més eficients que existeixen ja que una simple molècula pot degradar per segon fins a cent milions (108) de molècules de H2O2. Si entrem una mica més en detall de com es desenvolupen les reaccions químiques, observem que estan regulades per dos controls: el termodinàmic i el cinètic.

- El control termodinàmic és aquell que fa referència a la espontaneïtat dels processos i es relaciona amb l’energia lliure de Gibbs (�Gº), és a dir, la diferència energètica que hi ha entre els substrats i els productes en consideració de l’entropia a una determinada temperatura. Com ja hem dit anteriorment, en la catàlisi enzimàtica no es modifica aquest paràmetre de la reacció ja que productes i reactius continuen essent els mateixos. L’equació que la defineix és: º º ºG H T S∆ = ∆ + ∆ - Per altra banda, el control cinètic és aquell que fa referència a la velocitat amb que es desenvolupen les reaccions del pas de substrats a productes. Aquest control depèn en últim terme de la temperatura a la qual es dóna la reacció i de l’energia d’activació.

5

Es sobre aquest aspecte en el qual incideixen més els enzims, per això l’enfocament central en estudiar el mecanisme d’una reacció catalitzada per un enzim consisteix en mesurar la velocitat de la reacció i la forma en que es modifica com a resposta a canvis en els paràmetres experimentals, en el que es coneix com a cinètica enzimàtica. En primer lloc veiem com es desenvolupa una reacció sense la intervenció de cap enzim en el seu procés. Per una determina reacció de transformació del reactiu A en el producte B: A B→ Podem definir la velocitat com la variació de concentració de reactiu i producte per unitat de temps:

[ ] [ ]d A d Bv

dt dt

−= =

En una reacció de primer ordre, la velocitat depèn de la concentració de reactiu i del temps:

[ ]v K A=

Si igualem les dos equacions de velocitat anteriorment definides i les integrem obtenim una equació que ens dóna la concentració del reactiu A en el temps:

[ ] [ ] .

0. K tA A e−=

Pel que fa a les reaccions catalitzades pels enzims, el model mecanístic més senzill que podem trobar descrit, és la transformació d’un substrat S en un producte P, catalitzada per un enzim E. Les constants K1 i K-1 són les constants de formació i dissociació del complex Enzim-Substrat, mentre que K2 és la constant de formació del producte.

[ ] [ ]1 2

1( )K K

T TKE S ES E P S E

−+ → + >>�������

Cal destacar que en l’estudi de la cinètica enzimàtica, sempre treballem amb velocitats inicials de reacció ja que sovint es comprova que a temps creixents, l’evolució de la reacció experimenta anomalies degudes principalment al fet que es va acabant el substrat i la concentració del complex enzim-substrat no es constant, i la reacció inversa, si es possible, comença a ser cada vegada més significativa. Per aquest motiu l’estudi de la velocitat es fa amb concentracions creixents del substrat de la reacció. Per estudiar la cinètica de les reaccions enzimàtiques, la hipòtesi de Michaelis-Menten es basa en el supòsit del ràpid equilibri, és a dir, que la segona etapa del esquema de reacció no modifica el equilibri inicial. Això és cert només quan la constant de dissociació del complex enzim-substrat (K-1) és molt més gran que la de formació del producte (K2). Això, juntament amb el fet que hem comentat anteriorment que la concentració d’enzim total és molt inferior a la de substrat total se’n deriva la següent equació:

6

[ ] [ ] [ ] [ ][ ] [ ] [ ]

[ ][ ][ ]

[ ] [ ] [ ][ ] [ ] [ ][ ]

[ ]( )

TT T

T

T T

S SS E

E E ES

E S E ES S E SKs ES

ES ES Ks S

>> �

= +

−= = � =

+

�

Donat que la velocitat de formació del producte P és igual a la velocitat de reacció del complex enzim-substrat:

[ ] [ ]2

d Pv K ES

dt= =

Tenim que,

[ ] [ ][ ][ ]

[ ][ ]

22

TK E S Vm Sv K ES

Ks S Ks S= = =

+ +

Així si arreglem els paràmetres d’aquesta última equació obtenim l’equació de Michaelis-Menten.

[ ][ ]

[ ] [ ]2

1

1

T cat T

M M

Vm K E K EVm Sv on KK S K Ks K

−

= ==

+ = =

Aquesta equació descriu doncs una corba de velocitat hiperbòlica on a la velocitat de la reacció va augmentant de forma cada vegada més lenta a mesura que augmenta la concentració de substrat fins arribar a la concentració de saturació de l’enzim per substrat, i és llavors quan la velocitat és màxima. Si analitzem amb detall l’equació veiem que quan la concentració de substrat és molt alta, aquesta s’aproxima a una reacció d’ordre zero on la velocitat és constant i correspon a la velocitat màxima; mentre que a concentracions baixes, la concentració de substrat que es troba en el denominador de l’equació sumant es pot considerar despreciable respecte a la KM i tenim una equació d’ordre 1. Entrant més en detall sobre la definició de les diferents constants aparegudes fins ara, la velocitat màxima (Vm) és aquella que pot assolir la reacció amb la concentració d’enzim donada i les condicions experimentals amb les que estem treballant. Per altra banda, la constant catalítica (Kcat), que en el cas de la reacció enzimàtica tant simple plantejada a l’inici, es correspon amb la constant cinètica de la segona etapa del procés de reacció (K2); constitueix una mesura directa de la producció enzimàtica de producte en condicions òptimes, és a dir, quan l’enzim es troba saturat. Les seves unitats són inverses del temps en minuts o segons, per tant quan fem la inversa d’aquesta constant trobem unitats de temps que representen el temps necessari per tal que un mol d’enzim transformi o recanvi un mol de substrat. Per aquest motiu a la constant catalítica també se l’anomena nombre de recanvi.

7

Finalment, la constant de Michaelis (KM) es sol associar a l’afinitat del enzim pel substrat. També si observem la corba de velocitat en funció de la concentració de substrat, aquesta coincideix numèricament amb la concentració de substrat quan la velocitat inicial de reacció és la meitat de la velocitat màxima. Per aquest motiu aquesta constant té unitats de concentració. En ser la concentració que satura l’enzim en un 50%, de vegades també la podem trobar escrita com S50.

[ ][ ] [ ]/ 2 M

M

Vm Sv Vm K S

S K= = � =

+

El problema de la hipòtesi del “Ràpid equilibri” de Michaelis-Menten és que suposa que K2<<K-1, i aquest supòsit en la realitat rarament es compleix, ben al contrari K-1 i K1 són força més grans que K2. Per solucionar aquest problema Briggs i Haldane van formular de nou una hipòtesi més general que s’anomena del “Estat estacionari”, i que suposa que durant un cert lapse de temps realment es compleix que la concentració del complex enzim-substrat és constant.

[ ] [ ] [ ] [ ][ ] [ ]

[ ][ ] [ ][ ] [ ] [ ] [ ] [ ][ ]

[ ]

[ ] [ ][ ][ ]

[ ][ ][ ]

[ ][ ]

1 1 2

11 1 2

1 2 1

1 2 2/ 12

1 21 2 1

1

0 ( )

( ) T

T

T TK

M

d ESvf ES vd ES K E S K K ES

dt

K E SK E S K K ESES

E ES E K K K S

K K E S K E S Vm SK ES v v

K KK K K S K SSK

−

−

− −

−−

≈ = = +

= +� =

= + + +

= = → = =++ + ++

En aquest cas, no canvia la formula general de la velocitat sinó els significat matemàtic del terme de la constant de Michaelis (KM), que passa a definir-se no com una constant d’equilibri (Ks) sinó com una relació de diferents constants de velocitat.

8

Tant mateix, la definició matemàtica de la velocitat màxima de la catàlisi continua essent la mateixa.

[ ] [ ]2

1 2

1

T T

M

Vm K E Kcat E

K KK Ks

K−

= =+

= ≠

A la pràctica, per determinar els paràmetres cinètics de la reacció enzimàtica el que apliquem a l’equació de Michaelis-Menten són unes modificacions matemàtiques anomenades linealitzacions per tal que aquesta en comptes de tenir un comportament gràfic hiperbòlic, el tingui lineal. Les més importants són les de Lineawer-Burk i les de Eadie-Hofstee. El mètode de Lineweaver-Burk o representació de les dobles recíproques consisteix en fer inverses de l’equació de Michaelis-Menten i reordenar-les de tal manera que en resulti la equació d’una recta. D’aquesta manera el pendent de la recta és representat pel quocient entre la constant de Michaelis i la velocitat màxima, el punt de tall en l’eix de les ordenades és la inversa de la velocitat màxima, i el punt de tall a l’eix de les abscisses és la inversa de la constant de Michaelis en signe negatiu.

[ ]1 1 1MKv Vm S Vm

= +

El mètode de Eadie-Hofstee multiplica tots els termes de la equació de Lineweaver-Burk per la velocitat màxima i llavors reordena correctament l’equació. En aquest gràfic el pendent de la recta és la negativa de la constant de Michaelis, el punt de tall en l’eix de les abcisses és el quocient de la velocitat màxima entre la constant de Michaelis i el punt de tall amb l’eix de les ordenades correspon a la velocitat màxima.

[ ]M

vv K Vm

S= − +

9

Per altra banda, la cinètica dels enzims es pot veure alterada per uns compostos que s’anomenen inhibidors i es caracteritzen pel fet que en ser addicionats a la mescla de la reacció disminueixen la velocitat de catàlisi de l’enzim. Segons com sigui la naturalesa de l’efecte i la seva manera d’interactuar amb l’enzim els classifiquem en diferents tipus. Els inhibidors reversibles són aquells que es combinen instantàniament amb l’enzim lliure, el complex enzim-substrat o ambdós formant complexos reversibles. En general, la seva activitat inhibidora es veu afectada o anul·lada per la dilució, la diàlisi, filtració en gel, etc. Aquests es poden classificar segons els seus mecanismes d’acció en:

- Competitius, quan no modifiquen la velocitat

màxima de la reacció ja que s’uneixen a la forma lliure de l’enzim. En condicions de saturació de substrat l’efecte d’aquests inhibidors és mínima i es continua mantenint la concentració del complex enzim-substrat igual.

- Acompetitius, quan no modifiquen el quocient

de la velocitat màxima i la constant de Michaelis ja que s’uneixen al complex enzim-substrat fent que aquest sigui inactiu, resultant com si tinguéssim menys enzim la qual cosa afecta principalment a la velocitat màxima.

- Mixtes, quan modifiquen de manera diferent

els valors de la velocitat màxima i del quocient de la velocitat màxima amb la constant de Michaelis ja que s’uneixen tant a l’enzim lliure com al complex enzim-substrat. Segons com siguin les constants d’inhibició entre si podrem tenir tres comportaments amb diferents que ens recorden els dos mecanismes anteriors, mixtes competitius i mixtes acompetitius. En el cas particular que les constants d’inhibició siguin iguals pels dos substrats possibles de l’inhibidor (E i EI), parlem de no competitius, que es caracteritzen perquè modifiquen de la mateixa manera els valors de velocitat màxima i del quocient de velocitat màxima entre la constant de Michaelis pel fet que no modifiquen la constant de Michaelis.

Cal distingir que a part de la classificació feta anteriorment en funció de la forma enzimàtica a que s’uneix l’inhibidor. També distingim entre inhibidors totals i parcials, és a dir entre aquells que quan s’uneixen a l’enzim anul·len totalment la seva activitat i

10

aquells que només la redueixen. En la imatge anterior, tot els inhibidors que es mostren són totals. Els inhibidors irreversibles són aquells que es caracteritzen pel fet que la seva inhibició és progressiva en el temps de contacte de l’enzim amb l’inhibidor, no s’anul·la la inhibició en emprar les tècniques anteriorment descrites pels inhibidors reversibles ja que formen enllaços covalents amb els grups del centre actiu de l’enzim. Bibliografia: Nelson i Cox; Lehninger Principios de Bioquímica, Omega, New York, 3ª ed. 2000 Koolman i Röhm; Bioquímica Texto y Atlas, Panamericana, Marburg, 3ª ed.