c

TELEFONO PARTICULAR :

MTRICULA :

CARRERA :

DE CONCENTRACION :

TRIMSTRE :

HORAS S E m A :

LUGAR EN DONDE SE LLEVO A CABO :

FECHA DE INICIO :

JFECHA DE TERMINACION :

J N O M B R E DEL TUMB INTERNO: PUESTO Y

ADSCRIPCION. (U~ICAMENTE SE NECESL

TARA CUANDO SE REALICE DENTRO DE -

LA UAM-I) :

RTTOB :

ALUMNO :

7-94-1 3-33

80329853

Biología

Biología Experimental

86 -P

10 horas

Laboratorios de Bioqulmica y

Bioflsica ( 5-251 y S-253 )

30 de Mayo de 1984

¿ IC1

16 de Marzo de 1986 J

. ud

I

Dra. Ligia Toro Calzada.

Profesor Asociado "C" . Estudio de l a relaci6n entre l a H+-ATPasa mitocondrial y el - transporte de iones mediante el uso de ionóforos. 1I.Cinética - de hidrblisis de ATP en presencia de distintos ionbforos carboxili-

Raí& L-es Callejas .I .\ ,,' -

F- Av Michoscin y Puririma. Col Viceniina. Inapalapa. O F C P. OSW. Tal 688-03.12

. .

c

I

c.

L

c

.... _.

UNIVERSIDAD AIJTONOMA METROPOLITANA

U n i d a d Iz tapalapa D.C.B.S.

C INET ICA DE H IDROL IS IS DE ATP EN PRE-

SENCIA DE DISTINTOS IONOFOROS CARBOXI

L ICOS. -

ADP+- \

Por

RAUL LINARES CALLEJAS

A mis padres, quienes con in cansable esmero me han guia: siempre por e l mejor camino.

A m i esposa por su invalua-- ble ayuda y comprensi6n.

c1

Y

L

.-

L..

Expreso mi sincero agradecimiento a la M. en C. Ligia Toro Calzada- y al Dr. Cergio Estrada Orihuela- por su inapreciable estimulo ha-- cia ia investigación, quienes con paciencia y entasiasmo me aienta- ron a seguir siempre hacia adelan te.

-

I...

E l presente trabajo es un estudio en l a rama de l a Bioenergética, real izado en l o s labora - to r ios de Bioquímica y B i o f i s i c a (S-251 y -- S-253) del Departamento de Ciencias de l a Sa lud, División de Ciencias Bio lógicas y de 1; Salud, de l a Universidad Autónoma Metropoli- tana, bajo l a direcci6n de:

M. en C. L i g i a G. Toro Calzada Depto. de Ciencias de l a Salud, UAM-I T U T O R

Dr. Sergio Estrada Orihuela Depto. de Ciencias de l a Salud, UAM-I A S E S O R

1

C O N T E N I D O

PROLOGO

INTRODUCCION Y ANTECEDENTES

Generalidades

Hip6tesis @,1imiosm6tica

ATPasa Mitocondrial

Conceptos generales de

los ion6foros

OBJETIVOS

MATERIAL Y METODOS

RESULTADOS

Modificacibn de l a metodolo

g i a del aislamiento mitocon

d r i a l

Actividad de l a ATPasa Mito

condrial

Efecto de los iondforos cor

boxflicos cobre l a hidról i -

s is del ATP

-

-

-

DISC US I O N

CONCL US I O N

RESUMEN

BIBLIOGRAFI A

2

... 3

. . .6

... 6

. . . 0

* . . I 2

. . .25

. . .37

... 39

. . .43

. . .43

. . .45

. . .47

. . . 5a

. . .63

... 64

. . .66

P R Q L O G Q

La v ida se considera un proceso de continua act iv idad

que se da cuando interaccionan dinámicamente c i e r t o s elementos

en un orden establecido (1). A l o s sistemas v i vos se l e s consi - dera sistemas abiertos ya que intercambian materia y energía - con e l medio ambiente, además presentan otras dos ca rac t e r í s t i - cas importantes la autorrepi icación y autoreguiacibn.8racias a

esta Última función se puede regular l a cantidad de energía pa - ra su mejor aprovechamiento (2).

I LOS organismos v i vos presentan l a capacidad de ex- --

t raer y transformar l a energía de su entorno a pa r t i r de mate-

r i a s Primas sencillas,emple&ndola para ed i f i c a r y mantener sus

propias estructuras ( 3).

La meta básica de l a bioquímica es determinar de qué

modo e l conjunto de moléculas inanimadas que constituyen los - organismos vivos, se inf luyen mutuamente para const i tu i r , mante - ner y perpetuar e l estado de v ida(3) .

Una de l a s caracter is t icas más importantes, s i no es

que l a mas importante en una cé lu la es l a presencia de l a mem-

brana, ya que desde l a s primeras protocélulas que se formaron

durante e l proceso de or igen de l a v ida, l o primero que exis--

t i 6 fué precisamente l a membrana, que l e da l a caracter ís t ica

de separarse de l medio y cont i tu i rse como unidad individual -- que puede intercambiar materia y energía con su alrededor. A l

i r evolucionando l a cé lu la , l a membrana l o hacía de manera s i - multánea, adquiriendo cada vez una organización más compleja,-

de esta manera l a membrana adquiría funciones más especi f icas

3

y su fwicibn no fué solamente l a de intercambio de materia y - energía sino que poseía funciones se lect ivas y especí f icas en

cuanto a i transporte (4) .

En l as cé lu las eucariontes l a membrana es de suma i m -

portancia ya que l e i n f i e r e a ia cé lu la una caracter ís t ica muy

importante, l a de compartamentaiizaci6n (4 ) Las v ías principa - l e s por l a s cuales estos organismos transducen l a energía son:

l a g i i c 6 i i s i s y l a f o s f o r i i a c i ón oxidat iva (3).

Una de las membranas más importantes y más complejas

es l a membrana interna mitocondrial, ya que en e l l a se l levan

a cabo los fenómenos de transducción de energía, por consiguien - t e su estudio es sumamente importante, ya que l a s funciones que

se rea l i zan en un organismo no se presentan s in e l suministro - de energía en forma de ATP. Aunque todavía hay muchas cosas obs - curas en estos estudios, ya se han hecho avances muy val iosos

que nos han ayudado a entender e l proceso cada vez más sistemá-

ticamente, es te avance se ha dado en gran parte gracias a l des-

cubrimiento de l o s ion6foros. Los cuales se han convertido en - e l foco de atenci6n de l o s investigadores interesados en l a con - formaci6n y las propiedades f í s i c a s de las pequeñas moikcuias - bioi6gicamente importantes, se han establecido también como he-

rramientas para perturbar l o s sistemas bio l6gicos, para e l estu

d io del metabolismo, e l transporte y e l mecanismo de l a sinte-- s i s (h id r6 l i s i s ) del ATP, as í como e l establecimiento de sus -- respectivos modelos. Sus potenciales terapeúticos parecen no es

t a r muy c laros , s in embargo, pueden inducir una gran var iedad - de e fectos f i s i o l 6 g i c o s ( 4 ) .

-

-

En e l presente trabajo se u t i l i za rán var ios ionóforos

4

carboxf l icos para dar mayor informacibn acerca de l movimiento

de iones acoplado o derivado de l a h i d r ó l i s i s de ATP.

5

INTRODUCCION Y ANTECEDENTES

La r e a c c i h de l substrato con e l oxígeno molecular es

fundamental en todos l o s aspectos de l a vida ce lu lar en organis - mos aeróbicos, ya que es l a mejor fuente de energía ú t i l . Esta

reacción ocurre en l a mitocondria y está acoplada con l a produc - c ión de ATP en un proceso llamado f o s f o r i i a c i ón ox idat iva ,e l -- cual parece ser l a pr inc ipa l función de estos organeios ( 5 ) -- Además,la membrana mitocondrial contiene var ios sistemas de - - transporte l o s cuales cata l i zan e l movimiento de c i e r tos metabo - lites e iones entre e l espacio mitocondriai y e l c i t o s o i ( 5 ) .

Generalidades. EI tamaño, i a forma y i a ioca i i zac ión espec í f i ca de --

las mitocondrias dentro de l a cé lu la de un mismo t e j i d o son re-

lativamente constantes y parecen ser caracter is t icas para un -- mismo t i po de cé lu la ( 5 ) . En algunas cé lulas l a s mitocondrias - están distr ibuidas a l aza.r, mientras que en otras s e encuentran

local izadas cerca de l a s estructuras que requieren ATP ( 5) .

La mitocondria presenta dos membranas: l a membrana ex-

terna, l a cual es relativamente permeable, y l a membrana inter-

na, l a cual se invagina dentro de l a matriz. E l espacio entre - estas dos membranas es llamado espacio intermembranal y e l espa - cia dentro de i a membrana interna, matriz ( 6 ) .

La membrana externa d i f i e r e de l a membrana interna tan

t o en función como en contenido l i p í d i c o y protéico. E l conteni

do i i p í d i c o es cas i e l 50% de l peso y l a enzima más caracterfs-

t i c a presente es l a monoamino-oxidasa. La membrana externa es - inespecíficamente permeable a l a mayoría de l o s iones, substra-

tos y var ias moléculas con peso molecular arr iba de 5000 daito-

- -

nes (6).

6

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E l contenido de i íp idos l l e g a a ser hasta de un 20% - d e l peso, de l o s cuales l a mayoría son insaturados. Card io l ip i - na es un f o s f o l i p ido particularmente abundante en l a membrana

interna. Solamente trazas de co l e s t e ro l estan presentes. A l me - nos 60 proteínas biológicamente activas est& asociadas con l a

membrana interna (7).

La membrana interna es impermeable a l a mayoría de -- l o s iones, metabolitos y moléculas de bajo peso molecular. A - l a matriz solo pueden entrar c i e r t os iones y metabolitos indi-

viduales d a acarreadores. Por l o tanto, l a membrana interna - proporciona dos funciones: a) provee soporte de medio ambiente

espec í f i co y ioca i i zac ión para l a c a t á l i s i s , y b) provee sepa-

raci6n espacial. Con ésto promueve l a existencia de un gradien - te ibnico y l a compartamentaiizaci6n de - l as funciones metab6li - cas entre e l c i t o s o l y l a mitocondria (9-11).

En l o s Últimos 50 años se han propuesto muchos mode--

l o s para pretender entender o expl icar l a estructura de las -- membranas con base en la!; observaciones más frecuentes, muchas

de estas observaciones se encuentran resumidas en e l modelo -- del Mosaico Fluido ( 8 ) , e l cual considera l a estructura básica

de las membranas como un arreglo bidimencionai de proteínas i n

tegrales globulares dispersas en una matriz de bicapa l i p f d i c a

f l u i da .

-

Una de las proteínas más importantes de las que se en

cuentran insertadas en l a bicapa l i p í d i c a , es aquella re lacio-

nada con l a formacibn de l ATP.

-

Proceso que requiere de l a entrada de oxígeno, ADP y P i y que produce l a sal ida de ATP, agua y C02* Dicho proceso

estd basado en t r e s pasos coordinados: a) e l c i c l o de Krebs, - real izado por una s e r i e de enzimas solubles en l a matriz mito-

condria l , b) l a cadena resp irator ia o sistema de transporte de electrones que captura 1.0s pares de electrones y l o s transf ie-

r e a través de una s e r i e de transportadores, hasta que se pro-

duce l a Yormaci6n de agua, y c ) un sistema f os f o r i l an t e , es t re - chamente acoplado a l a cadena resp irator ia , que en t res de sus

puntos or ig ina moléculas de ATP (12).

Hip6tesis quimiosm6tica. La oxidación de sustratos o metabolitos del C i c l o de

Krebs i n i c i a en l a membrana interna mitocondrial, una s e r i e de

reacciones de óxido-reducción en cadena, que tienen como acep-

t o r f i n a l de electrones a l oxígeno molecular. Este proceso va

acornpadado por una gran disminucibn de l a energía l ibre (&),-

que puede s e r u t i l i zada para s ín tes i s de ATP, para e l transpor - t e de i onesypara promover reacciones de transhidrogenación. - (12) .

La naturaleza de l enlace entre l a cadena resp irator ia

y l a ATPasa es aún desconocida;lm hipbtesis que han fundamen-

tado e l pos ib le mecanismo molecular de transducción de energía

fueron originalmente postuladas para expl icar e l funcionamien-

t o de l a membrana mitocondrial. Sin embargo, es ahora evidente

que e l f a c t o r general de &cho mecanismo, es de apl icación uni

versa1 a todas l a s membranas capaces de conservar energía (12 ) . -

Una de las hipótesis que t rata de expl icar e l mecanis

mo d e l acoplamiento energético es l a hipotesis confonnacional.

Esta propone que l a energia l iberada durante e l transporte de

-

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electrones or i g ina e l cambio conformacional de una proteína de

l a cadena oxidativa. Esta idea fue estimulada por l o s hallaz--

gos experimentales rea1,izados en l a transferencia de energia - d e l sistema actina-miosina d e l músculo. Sin embargo y entre -- otras cosas, l a l ent i tud de estos cambios moleculares compara-

da con l a rapidez de l a s transformaciones energéticas hace di-

f í c i l asociar l o s cambios conformacionales, que de hecho mu--

rren durante l a respiraizibn con e l fenómeno de acoplamiento -- energetic0 (13).

Es en 1961, cuando l a bioenergética sufre un cambio - revolucionario. En es t e año Peter Mitche l l enuncia l a hipóte--

s i s Quimiosmbtica, que introduce en l a Bio log ia dos conceptos

propios l a F i s i ca : 1 ) La vec tor ia l idad de las reacciones quimi - cas,hecho que ex ige una topograf ía def inida de l a s proteinas - f i j a s en l a membrana y, 2) l a acumulacibn de energía bajo l a - forma de un gradiente de potencial electroquimico. La hipóte--

s i s quimiosmbtica ha permitido interpretar y predecir un gran

cúmulo de l a información experimental obtenida,'durante l o s ú1 - timos 20 anos, en l o s sistemas capaces de conservar energia -- (14):

Puede considerarse a l a cadena oxidat iva como un cami

no macromolécular que permite d i v i d i r en porciones pequeñas l a

abundante energia l ibre que se desprende cuando un par de e l ec

trenes es transfer ido desde e l NADH (IS"= -320 mV) hasta e l 0x1

geno ( E O = 800 mv). En es t e sentido, l a nomenclatura "S i t i o I,

I1 y 11188, tuvo su origen a l dividir l a cadena en t res seccio-

nes, en cada una de l a s cuales l a energia l i b r e l iberada es su

f i c i e n t e para l a s in tes i s de una molécula de ATP. La rotenona

-

- -

-

9

y e l amital son inhibidores espec í f i cos de l a NADH deshidroge-

nasa ( inhibidores de l S i t i o I ) ; l a antimzcina inhibe en e l S i - -

t i o 11; e l cianuro, l a azida y e l monóxido de carbono son inhi-

bidores del s i t i o 111 (15).

Por su part icular composición química (acarreadores de

protones y acarreadores de electrones) y por su distr ibución -- asimétrica en l a membrana, l a s proteínas de l a cadena respirato - r i a cumplen, paralelamente, una segunda función: l a transloca--

ci6n asimétrica v ec to r i a l de s e i s protones desde e l i n t e r i o r ha - c i a e l ex te r io r de l a mit:ocondria. Esto genera un gradiente de

concentración de protones (ApH) que hace a l a matriz a lca l ina

respecto a l medio externo. Como los protones no van acompañados

por e l movimiento de n i n g h anión, es te proceso es también equi - valente a l a remoción de cargas pos i t ivas de l a matriz, se or i -

gina as í un gradiente de potencial e l é c t r i c o (AY ) , t a l que e l

i n t e r i o r de l a m i tocondria resul ta e lectronegat ivo I ( 13) ..~

De l a re lacibn de l gradiente de l conductor de protones

(ApH) con e l gradiente de potencial e l é c t r i c o (by ) se establece

un potencial electroquímico (16).

Así , e l transporte de protones genera un puente termo-

dinámicoentre e l sistema de transporte de electrones y l a ATP - sintetasa, conduciendo a l a conservacibn de l a energia biolbgi-

ca ( 16).

LO anter ior puede resumirse en l a s iguiente f igura:

10

Figura 1. ~ o c a i i z a c i 6 n de l o s s i t i o s de acoplamiento y l o s lugares de acci6n de l o s inhibidores de l a r e s piraci6n. Scarpa,C. (1976).

-

Figura 2. Membrana interna mitocondrial. Inv. y Cien- c i a . (1978).

En l a membrana de l a s mitocondrias se encuentran inc lu í - dos l a s enzimas y otros componentes de l a cadena resp irator ia .

11

Mitocondrial. as a ATP

Desde l a pasada década ha habido un remarcado aumento

en e l número de publicaciones sobre l a ATPasa, esto r e f l e j a e l

descubrimiento de nuevas asociaciones de l a ATPasa con impor--

tantes funciones b io lóg icas , un avance importante en nuevos -- conceptos de enzimologia y e l mejoramiento de l a tecnología - pa - r a e l estudio de procesos enzimáticos vec tor ia l es ( 16).

En l a tabla I se encuentran enlistadas l a s cuatro di-

ferentes"c1ases de ATPasas (funcionalmente hablando): cuatro - de e l l a s son funcionalmente d i ferentes , asociadas a l transpor-

te de iones, s ín t es i s de ATP y movimiento - macromolecular y de

l a última s e desconoce su funcidn ( 16) .

Clas i f i cac ibn Cuncional de l a s ATPasas

Aquellas asociadas con: Tipo de ATPasa

I. Transporte

11. Síntes i s de ATP H+ 111. Movimiento de Macromoléculas miosina, tubulina, o

ácidos nucleícos.

I V . Otras funciones ecto ( super f i c i e ce- lu l a r )

La ATPasa es una de los complejos enzimáticos más cono - c idos , está íntimamente l igado con l a s membranas transductoras

de energía, su papel es tranlocar protones a traves de l a bica-

pa l i p í d i c a para c a t a l i z a r l a formación de ATP a pa r t i r de ADP

y P i y d i r k g i r l o s protones de t a l manera que es u t i l i z ada l a - energía almacenada en un gradiente electroquímico para producir

1 2

grandes concentraciones de ATP ( 17) .

Como en e l caso de todas l a s reacciones enzimáticas - e s t e proceso de o lYosfor i lac ión oxidativa" es revers ib l e ( 16) .- En ausencia de sustratos okidables l a h i d r ó l i s i s del ATP puede

inducir l a formación de un gradiente electroquímico de proto--

nes, e l cual puede, dependiendo de l a membrana en cuestibn con - ducir e l transporte de matabolitos, l a reducción de pir imidin

nucleótidos o revertir e l f l u j o de electrones a través de l a - cadena resp i ra tor ia , s:tn embargo en las mitocondrias l a direc-

cibn f i s i o l ó g i c a parece ser primariamente hacia l a s ín tes i s de

ATP (17).

La ATPasa mitocondrial es una enzima oligomérica de - peso molecular 500,000 que ha sido aislada y ampliamente estu-

diada en experimentos de reconstitución en vesículas de fos fo-

l íp idos (1'6).

La información re levante de l a estructura de l a ATP--

asa ha s ido obtenida en preparaciones de micrograf ia de l a mem

brana interna mitocondrial, en todas l a s preparaciones l a por-

c ión F aparece como una es fera de 90°A de diámetro conectada

con un t a l l o o base de aproximadamente 30A de diámetro y 40 A

de longitud (18).

- I

1

13

PK

I

+ Figura 3. Subunidades que componen l a H -ATPasa mito- condrial. Pedersen, P. (1982).

La F~-F, ATPasa de mitocondria t i ene una estructura

mucho más compleja que muchas otras bombas electrogénicas (19).

Está comprendida de t r e s unidades funcionalmente d i ferentes -- llamadas Fo, F1 e *fIo9. La FO e s un componente insoluble en agua

que actúa como conductor de protones. E l F1 es un componente ca - t a i í t i c o soluble en agua que par t i c ipa directamente en l a s h t e - s i s o h i d r6 i i s i s del ATP. '*Iff es una proteína reguladora cuya

funcidn primaria parece ser prevenir l a h i d rb l i s i s del ATP reci - en s intet i zado (20).

En e l caso de 1.a P I , l a estequiometrfa de sus subunida - des es:d3@ 3 (21). E l problema de determinar 121 estequio - metria de l sector Fo e s a6n más complejo, por l o que no hay -- buenos va lores para l a estequiometrfa en ninguna de l a s subuni-

14

I

dades. Se asume que algimas de e l l a s pueden estar presentes en

var ias copias ( 18) .

1 I I

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. ‘Av

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Figura 4. Modelo de l a subestructura F1-ATPasa. Pe-- dersen, L. (1982).

E l peso molecular de l a F1 es de l orden de 380 K, mien

(17) .

- tras e l peso molecular de l a base no ha s ido establecido

I Se han encontrado ocho proteínas pertenecientes a l a -

Fo: f a c t o r 6 , f a c t o r B, f a c t o r OCCP, proteina a l a que s e une -

1 5

e l DCCD y una proteina donde se unen l o s desacoplantes, l a s -- otras t r e s proteinas encontradas podrían jugar un papel estrus

tura l o funcional pero s u papel parece inc i e r t o (16).

Las subunidadec 6 y p son indispensables para l a a c t i - vidad de l a enzima: probablemente e n p está e l s i t i o de unibn

del ADP, en tanto que, d t i ene un papel regulatorio. Algunas

evidencias sugieren que l a subunidad y funciona como compuer-

t a para e l paso de H+, que l a subunidad 6 es necesaria para -- unir F1 a l a membrana, y que e l pol ipept ido c es un regulador.

(13)

Figura 5. Topogra f iade h P a s a (113).

E l mecanismo de :la ATP sint , i tasa pued,: s e r d iv id ido - conceptualmente n tres procesos. E l primero l a translocación

de protones a traves de l a bicapa l i p i d i c a ; e l segundo corres-

ponde a l a c a t á l i s i s de formación de l enlace P-'O-P anhidro, y e l tercero corresponde a l acoplamiento de l a disipacibn del -- gradiente de protones con l a formación de l anhidrido P-O-P a - concentraciones nucho más a l t a s que aquellas esperadas para l a

reacción desacoplante ( 17) .

16

Los procesos primero y segundo son l levados a cabo por l a s fracciones Fo y F1 respectivamente, e l t e rcer proceso proba

blemente requiere de l arreg lo correcto entre l a Fo y l a F1 ( 17).

I. TranslocaciOn de protones.

La conducccibn de H+ por l a ATP sintetasa fue determi-

nado por e l uso de oligomicina (23) . en esa fmc i bn están invo-

lucrados cadenas de aminoácidos ident i f icados como aspartato' o

giutamato, arginina y ti.rosina ( 23,24) .

Dos mecanismos .-.generales han s ido propuestos para l a

conducción de protones: E l primer mecanismo usa l a s ideas de l a

conduccibn de protones en e l h i e l o , es te involucra e l movimien-

t o de protones a través de una cadena de grupos hidrógeno perte

necientes a cadenas de pol ipéptidos o a l agua, pegados a cana--

l e s de proteínas. E l o t r o mecanismo (25) está basado en l a con-

ducción por medio de ñidróxidos de metales só l idos por e j a . -- Mg(OH)2. Sin embargo, no, hay su f i c i ente informacidn para deci--

d i r cual de l o s mecanismos. describe l a translocacibn de proto--

-

~...

Figura 6. Modelos conforma cionaies para i a ca tá l i s i s . A.Boyer, e t a i . (1974) y B. Tiefert, e t a l . (1979).

1 7

. <

. .

*-.

-. .

.., .,

Este modelo originalmente propuesto por Mi tche l l ha s i - do muy c r i t i cado en l o s últimos años (16) .

Figura 7 . Mecanismo directo del acoplamiento. Peder-- sen, L. (1982),

11. Formación de enlaces de h id r6 l i s i s .

~l segundo proceso correspondiente a l a formacidn del

enlace P-o-P anhidro. Este proceso es e l más entendido de l o s - procesos l levados a cabo por e l complejo ATPsintetasa (26). Ha

s ido demostrado que l a reaccidn ocurre en un desplazamiento li-

neal de una molécula de agua desde e l f o s f a t o , inducido por un

ataque nuc l e o f í l i c o por e l oxígeno d e l ADP (27). Se asume que - l a energ ía l i b r e estandar de l a reacci6n es aproximadamente ce - ro ( A GOSO) cuando ocurre entre compuestos l igados a enzimas( 17)

Varias l ineas de evidencias indican que l a unidn del

ADP(77)es necesaria para l a sa l ida d e l ATP durante l a s ín tes i s ,

mientras que l a sa l i da de ADP en l a h i d rd i i s i s esta acrecentada

por l a unibn de l ATP. Los experimentos parecen estar mehor en--

tendidos asumiendo que los s i t i o s de unidn de l ATP (ADP) no son

18

s i t i o s regulator ios , pero s e adaptan a una unión i n i c i a l de l - sustrato a l s i t i o act ivo. Esto es , en ambos casos l a unión d e l

sustrato a los s i t i o s act ivos acrecienta los productos de s a l i

da, todo esto indica WI mecanismo de "binding change" en e l -- cual l o s reactantes s e unen a l o s s i t i o s act ivos débi les de -- unión en l a subunidadp produciendo un cambio conformacional - que une a l o s reactantes, mientras e l producto en e l s i t i o ac-

t i v o de otra subunidad<@ se l i b e ra y es eventualmente despren-

dido. Este t i p o de mecanismo es bastante a t rac t i vo y parece ex

p l i c a r l a gran variedad de observaciones experimentales. Sin - embargo, otros mecanismos fueron propuestos, los cuales PO- -- drian expl icar igualmente l a mayoria de l o s datos. Esta catego

r i a incluye, por ejemplo e l mecanismo para l a FoFl propuesto - por Mi tche l l (28) quien sugiere una participación directa en - l a s reacciones químicas de l a s ín tes i s como un mecanismo en e l

cual l a translocación de protones puede ayudar en l a deshidra-

tación de l ADP y P i . En l a f igura I se i l u s t r a e l modelo que - designa e l canal de protones de l a Fo como una fuente de p r o t o> nes.se incrementa según e l grosor de l a membrana atravesado, - para le lo a l a reduccibn +x e i A P . En l a matriz, donde l a con--

centración de protones corresponde a l t o t a l d j i ~ ~ ' , e l s i t i o ac t i

vo de l a F1 está organizado en e l espacio de t a l forma que l a protonacibn del oxígeno alejándose del PI sea favorecida, s in

-

-

-

-

-

permit ir l a protonación de l ADPO-. Esto es seguido por un ata-

que del ADP sobre e l f o s f a t o con l a formacibn de un enlace f o s

f od i e s t e r y l a sa l ida de agua (19). -

Se piensa que el. A"F abandona e l s i t io c a t a l f t i c o en - estado protonado, e l cual d i f i e r e de l a protonacián de l ADP---

+ p i por exactamente e l niimero de protones usados en e l paso - de protonacián, as í l a sa l ida de l ATP 'a l a soiucián (matriz) -

19

completa l a transiocacibn de l o s protones (19).

Mi tche l l ha sugerido frecuentemente que dos protones

estan involucrados (28) pero e l ndmero podría se r de t r e s (29).

También hay una propuesta por Kozlov y Ckulachev (30)

un y una rec iente de Williams y Coleman (31) quienes sugieren

muy interesante mecanismo basado en datos de fotoaf inidad. En

SU esquema (30.33) hay un s i t i o de unibn a l ATP en l a subunidad

p en proximidad espacial y conectada a l s i t i o de unibn de l ADP en l a subunidad 6 . Ambos s i t i o s cuando son individualmente ocu - pados son s i t i o s de unibn tensa. Cuando un so lo nucle6tido es tá

imido a cualquier s i t i o l a reaccibn ATP + H20 = ADP + P i es tá

en equ i l i b r i o dentro de l a enzima (32). Este mecanismo de hidr6 - l i s is/s fntes is es t6 acompañado por l a translocaci6n de l o s ade-

nin-nucle6tidos en l a dirección d e b a laddurante l a k i d r6 l i s i s

o deU a p e n l a s ín tes i s . La sa l ida d e l producto está acrecenta-

da por l a uni6n de una nueva molécula a l s i t i o c a t a l f t i c o y no

se presenta

te esquema es en pr inc ip io muy s imi lar a l propuesto por Boyer,

pero en e l anterior e l s i t i o donde se une e l nuevo sustrato e s

e l mismo&-B de donde se l i b e r a e l podusto . Además en e l meca--

nismo propuesto por Boyer l a sa l ida de l sustrato es tá afectada - a

lostericamente, mientras e l s i t i o ac t i vo descrito por Williams y

Coleman (31 ) es tá afectado por interacciones d i rectas sitio/si--

t i o .

hasra que l o s dos s i t i o s son también ocupados. Es-

111. Acoplamiento.

20

E l tercer proceso cata l i zado por l a ATPsintetasa co-- rresponde a l acoplamiento de enlace P-O-P anhidro ( o hidróli--

s i s ) ya l a translocación de protones a traves de l a bicapa l i p i - dica. Este proceso es e l menos entendido y parece ser d i f i c i l

de preparar experimentalmente ( 17) .

En l a descripción termodinámica aparece que l a ener--

g i a del gradiente de protones ha sido ut i l i zada para incremen-

t a r l a sal ida de l ATP como producto( l7) .Existen di ferentes -- propuestas, una de e l l a s es l a de l mecanismo de Boyer donde -- l a s interacciones de l o s protones con l a ATP s in te taadan como

resultado LUI cambio conformacional en e l cual e l ADP y e l fos-

f a t o son fuertemente l igados, mientras e l ATP se l ibera y even - tuamenfe s a l e ( 34).

!

En e l mecanismo propuesto por m t c h e l l (17)los proto-

nes están directamente involucrados en l a abstracción del 02-

d e l enlace ADP, P i y Mg2+. As í , l a formación de ATP en un si--

t i o está acompañada por l a sa l ida de ATP de otro s i t i o ; en es-

te mecanismo l o s protones parecen incrementar l a sa l ida de ATP

y e l enlace de ADP y P i .

En e l caso de l mecanismo propuesto por Kozlov y Skula

chev (30) además de proponer e l enlace P-O-P, l o s protones cam

bian l a carga d e l complejo Mg+2-nucle6tido fosfatado, por +2,-

- -

Este cambio está propuesto para promover l a sa l ida de ATP.

Hay por l o menos tres di ferentes t ipos de moléculas - que parecen a f e c ta r alostéricamente l a h i d r ó l i s i s de ATP por - l a H+/ATPasa de l a mitocondria. Aniones como e l bicarbonato ac

t ivan marcadamente l a h id rb l i s i s , por consiguiente a fecta posi - -

21

- .--.- I,.-

-tivamente l a h idxb l i s i s (35) en contraste con otros nucieóti-

dos t r i f os fa tados que afectan negativamente l a h i d r ó l i s i s (36).

Finalmente un pequeño péptido inhibidor también a fecta negati-

vamente l a h i d r b l i s i s (37).Estudios cinéticos sugieren que es - te peptido podría promover una cooperatividad negativa entre - e l s i t i o a los té r i co del ATP y e l s i t i o h idro l í t i co ( 3 7 ) , Este

péptido está presente en bacter ias, mitocondrias y cloroplas--

tos , su peso molecular var ía entre 5,000 -20,000 Daltons. Se - une a l a subunidad p d e l a HtATPasa e induce l a inhibic ión de

l a h idrb l i s i s . Es probable que existan reguladores adicionales . _ < que aún no han sido descubiertos (16). e

m

Figura 8. Modelo de l a regulación de l a H+-ATPasa por e l peptido regulador. Schurzmann and Pedersen (1981).

22

La h ipótes is quimiosmótica predice que e l complejo ATP

es una bomba e lectrogénica de protones. La evidencia de que l a

FIFO ATPasa transloca protones durante l a h i d r ó l i s i s de l ATP y

que t a l transiocación e s e lec t fogénica , cae en dos categorias:

estudios c iné t i cos han medido l a proporción en l a que aparecen

l o s protones durante l a h i d r ó l i s i s (39,40), otros estudios mi-- den l a d i ferenc ia de potencial electroquímico generado durante

l a h id r6 l i s i s . usando una gran variedad de iones móviles o co lo - rantes sens i t ivos a l potencial o pH (41,42). Aunque l o s resul ta - dos cuantitat ivos no son idént icos , todas l a s técnicas usadas - producen datos consistentes con una transiocación de protones - desde l a fase acuosa (fase-M) a l a f a s e de l c i t o s o l (fase<), - durante l a h i d r ó l i s i s acoplada de l ATP en mitocondrias intactas

conteniendo e l complejo puri f icado F1-Fo ATPasa (19).

La h i d r ó l i s i s del ATP ailadido en mitocondrias donde se

encuentra inhibida l a respiración, y en presencia de K+ más va-

iinomicina, es tá acompaíiada por l a aparición de protones en e l

medio externo (39,N). La expulsión es bloqueada por ol igomici-

na ( l a cual también i nh ib e l a h i d r ó l i s i s de ATP)y también por - proton6foros l o s cuales estimulan l a h i d r ó l i s i s . Esto sugiere - que una translocación m5s que una producción de protones es tá - ocurriendo. En ausencia de un ca t ión móvii, tanto l a expuisión

de protones como l a h i d r ó l i s i s de ATP no ocurren, esto sugiere

l a ex is tenc ia de una compensaci6n de carga para obtener c i c l o s

r ep e t i t i v o s de h i d rb l i s i s de ATP (19) ; Reynafarge y Lahninger

(43) han reportado un movimiento hacia dentro de K+ equivalente

a l movimiento hacia afuera de protones.

Mediciones de estado estacionario A H generado por m i -

todondrias intactas a l hidrol izar ATP no son tan numerosas como ? '

23

l a s mediciones de l a respiracion, aunque experimentos cuantita - t i v o s indican e l desarro l lo de un potencial transmembranal in-

ternamente negativo, é s t o se ha hecho usando una gran variedad

de métodos. Nichol ls (1974) (44)usando l a distribucr6n de Rb+

i-h presencia de valinomicina y HOAc, report6 un va l o r de 125mV

y un r a t a . M ~ S recientemente, con trazas de un catibn permeante, e l

t e t ra f en i i f os fon io , amo e t a i (45) midi6 va lores deby = 150

mv Y A ~ H = 30mV. Este método que no emplea vaiinimicina, demu-

e s t ra que e l potencial e s generado durante e l "estado-4" y que

en l a h i d r6 l i s i s de ATP ocurre bajo condiciones acopladas.

pH correspondiente de 85mV en mitocondrias de hígado de

La h i d r6 l i s i s de ATP por l a F1-Fo ATPasa en parttcu - l a s submitocondriales está acompañada por l a entrada de proto-

nes sensibles a proton6foros (46). Debido a que estas partfcu- .

l a s están inver t idas en re iac i6n con l a s mitocondrias intac--

tas , presentan un acceso d i rec to a l ATP s i n l a intervenci6n de

un translocador ATP-ADP. Ya que, l a s particulas submitocondria

l e s presentan un acoplamiento pobre debido a que l a FO es tá a l

descubierto, va lores para e l ¿$#desarrollado durante l a h i d r ó l i - s i s de l ATP son raramente reportados.

-

-

La membrana interna mitocondrial es altamente permea--

b l e a l agua, siendo ésta capaz de moverse a gran veioci&ad a -- traves de l a barrera hidrofóbica (300-1000 moles/min.) . También

e l 02, e l Co2, d is t in tas moléculas l i p o f f l i c a s y var ios ácidos

monocarboxflicos débi les difunden pasivamente disolviéndose - en l a matriz l i p í d i c a . En cambio, es ta membrana e s práct ica -- mente impermeable a l paso de cationes mono, d i y t r i va l entes , - aniones, nuclebtidos y protones. De hecho, és ta es, quizá de - todas l a s membranas b io lóg i cas estudiadas, l a de más baja per--

24

meabilidad a protones (0.45 mno. cm2 0 0.11 nomles B+/seg. Uni - dad'pH-l. mgr-1 proteína). A pesar de esto, durante l a ac t i v i -

dad metabólica de l a mitocondria, s e detecta experimentalmente

e l movimiento de una impresionante cantidad de protones, a s í - como de cationes mono y divalentes, y de aniones y nucleótidos.

Este hecho ex ige postular l a existencia de moléculas espec f f i -

cas que, actuando como aanales o acarreadores transloquen espe - ties iónicas y l a necesidad de un mecanismo que i n i c i e y modu-

l e e s t e proceso. Es ahora evidente que l os acarreadores de pro - tones de l a cadena oxidat iva y l a ATPsintetasa, son l a s pr inc i - pales v ias para e l transporte de protones a través de l a mem-- brana. Pruebas funcionales concluyentes demuestran también l a

existencia de acarreadores se l ec t i vos para e l transporte de nu - c lebt idos , aniones y cationes mono y divalentes. En l o que res - pecta a i mecanismo que i n i c i a y regula e l transporte, es ú t i l

recordar que e l movimiento de moléculas o iones a través de -- una membrana solamente e:; espontbeo cuando ocurre en direc- - c ión que tiende a reducir su gradiente de potencial quimico o

e l é c t r i c o ( a favor de gradiente) , pero que l a mitocondria debe

incorporar y desechar muchas sustancias contra gradiente. Es - por eso que l a mayor parte de l o s procesos de transporte re- - quieren energia. Esta energia es provista por l a disipación -- del gradiente electroquimico de protones. Resulta entonces que,

e l movimiento de muchos iones está acoplado a l a s variaciones

del gradiente quimico de protones o de su potencial e l é c t r i co ,

y que es e l cambio de éstos factores energéticos e l mecanismo

que regula e l transporte (4).

Conceptos generales de los ionóforos.

E l entendimiento de cómo l a barrera de energia contro

l a l a permeabilidad de l o s iones fue aclarada a l descubrir que -

25

c i e r t as sustancias ( ionóforos ) , f a c i l i t a n en forma muy importan - te e l paso de iones a través de l a membrana, de esta manera se

pudieron sentar l a s bases moleculares del transporte de iones - por acarreadores a través de l a s membranas bio lógicas.

E l término t~ ionóforot l fue introducido por Pressman - - (49) para descr ib i r var ias clases de ant ib ió t icos que formaban

complejos organosolubles con cationes alcal inos, mediando su -- transporte a través de l a barrera l i p id i ca . Históricamente e l - e f e c t o de l o s ant ib ibt icos fue observado primero en mitocondria

( 50,511

Los ionbforos son compuestos de moderado peso molecu--

l a r ( entre 200 - 2000), forman complejos l iposolubles en l ip i - -

dos con cationes polares de l os cuales K+, Nai, Ca+$ Mgay ami-

nas b i o g b i c a s son l o s mas s i gh i f i ca t i vos biológicamente (52).

Estudios f i s i c o s indican que l a s c inét icac de formación y diso-

c iac ión de l o s complejos son tan favorables, que su nimero de - recambio a través de l a s membranas biológicamente alcanzan va lo

res de mi les por segundo (53), excediendo a l número de recambio

de l a mayoria de l a s enzimas macromoleculares; és to , más su al-

ta se l ec t i v idad a l os cationes, inspira para considerar a ios - ionóforos como modelo de acarreadores b io lóg icos (52).

-

Se encontró que var ias moléculas, como por ejemplo l a

Gramicidina y l a Alametecina, inducen l a permeabilidad cat ióni-

ca, inser thdose en l a membrana como canales estacionarios que

conducen iones. La 'alametecina, en part icular representa uh mo-

delo de canal dependiente d e l v o l t a j e de membranas e l ec t roex i ta

bles del nerv io y e l músculo (52 ) . -

26

E l área de estudio más act iva de l o s ionóforos inclu-

ye a l o s ionóforos carbox í l i cos X-537 y A23187 que transportan

Ca+2 a través de l a membrana b io lóg ica . E l X-537A también pue- de transportar aminas biogénicas (52).

Los ionóforos en general pueden ser considerados como

moléculas con esqueletos de carbono de diversas estructuras, - que contienen &tomos de oxígeno estratégicamente local izados. - E l esqueleto de carbono es capaz de asumir conformaciones cri-

t i cas que tienen como foco esos oxigenos, ya sea formando un - a n i l l o o cavidad, en e l cual un cat ión puede ajustarse más o - menos cbmodamente. Los oxígenos ligando consisten de var ios -- grupos funcionales, t a l e s como: éter, alcohol, carboxilo. Los

oxigenos neutros s e unen a l o s cationes v í a interacciones ión-

dipolo análogas a l a solvatación de iones en solventes de a l t a

constante d i e l é c t r i ca . Así , l o s ionóforos actúan como solvata-

dores, desplazando cationes. E l grupo polar de l o s ionóforos - se or ienta hacia e l i n t e r i o r , donde s e encuentran grupos hidro - carbonadas, l a so lubi l idad l i p í d i c a de l o s complejos resultan-

t e s puede ser parcialmente explicada, por l a e f e c t i v a protec--

cibn de su i n t e r i o r polar, e l cual des loca l i za l a carga de l ca t ión, y por l a compatibilidad de l ex t e r i o r d e l complejo con -- solventes de ba ja constante d i e l é c t r i c a (52).

I -

En cuanto a l a e f i c i enc i a d e l transporte de iones a - través de l a membrana, se d i r i a que en l a reg ión de a l t a cons-

tante d i e l é c t r i c a de l a in t e r f ase de l a membrana, l a s reaccio-

nes de formación y desformación pueden ser rápidas, a s i , uno - de l o s complejos deja l a in t e r f ase y entra a una reg ión de ba-

j a constante d l e l é c t r i c á de l i n t e r i o r de l a membrana donde es

inmune a l o s ataques de l o s solventes y puede a s í alcanzar es-

-tabi l idad (54).

La se lect iv idad iónica de l o s ionóforos es una función

combinada de l a energia requerida para l a des-solvatación de l - i ón y de l a energía obtenida en l a formación del complejo (55 ) ,

LOS ionóforos pueden ser c las i f i cados (56) por l a for-

ma de l transporte, en:

A. Ionóforos Neutros.

Caracterizados por l a estructura de c i r cu lo cerrado -- con un grupo ionizable , por ejemplo: l a valinomicina, l a eniahei - na, etc. ( 56 ) .

Estos ion6foros tienen grupos oxígeno orientados hacia

e l i n t e r i o r de l a molécula. La formacidn del complejo con e l -- ibn metálico involucra a 6 de l o s grupos oxígeno, en e l caso de

l a valinomicina y de 8-10 en po l ié teres . Otra caracter ís t ica es

que poseen un ex te r io r 1 . ipo f i l i co esencial para l a selubiiiza--

ción de l complejo ión ico en un medio hidrofdbico, l a interacción

de l catión con estos acarreadores resulta un complejo cargado

positivamente (56) .

La estructura de l ionóforo valinomicina fue correcta--

mente ident i f i cada y confirmada por s intes is (57 ) . F ig . 9 (-Hi+

genfeld,R.1982), ta les compuestos de hidrbxidos y aminoácidos - son metabolitos comunes de microorganismos y son genéricamente

nombrados como f'depsipkptidostf; l a valinomicina es por eso wi - dodecadepsipeptido c í c i l i c o ( 5 8 ) , aunque l o s ionóforos son fre--

cuentemente tóxicos suaves para l o s microorganismos, por i o que

d

28

-.

.I.

... .

."<

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.-. - r-

...

Figura 9. Estructura del ionbforo Valinomicina. Hilgenfeld,R. (1982).

VA1 INOMICINA

K ' K'

Figura IO. Transporte de K+por Valinomicina a -- través de las mambranas. Inv. y Ciencia (1978).

29

han s ido llamados ant ib ibt icos , son extremadamente tóxicos o - tienen fuertes e fectos f i s i o l ó g i c o s sobre l o s organismos, por

l o que llamarlos metabolitos microbiológicos puede ser más - - apropiado.

E l mecanismo por e l cual e l gran a n i l l o de l a forma - estructural de l a valinomicina descrimina tan exquisitamente - entre e l Na+ y e l K+ es explicado por l a conformación asumida

por e l an i l l o durante l a formación de l complejo (59) .

Fue independientemente descubierto por c r i s ta l i zac ibn

de rayos X (60) y por resonancia magnética nuclear (61) que e l

brazalete tenía 4A0 de a l t o y B A O de diámetro.

.

La valinomicina presenta una gran habil idad para trans - portar K+ a través de l a membrana mitocondrial (Moore y Press-

man 1965). ( f i gura I O ) presentando una se l ec t i v idad espec i f i ca

de K+)Na+ en re lac ión de 1:10,000; dicho transporte es c a t a l i

zado de l a s iguiente manera: i ) envolvimiento de l K+ en l a in-

t e r fase de l a membrana, :lo que causa l a subsecuente deshidrata

c ión de l catibn, ii) difusión d e l complejo a través de l a mem-

brana, iii) desligamiento d e l cat ión, e l cual sufre una rehi--

dratacidn en l a superf ic ie opuesta a donde i n i c i a o t ra vez e l

c i c l o ( 59).

-

-

B. Ion6foros Carboxí l icos.

Son moléculas abiertas que poseen un grupo carbox i l i -

co ion izable , cuyo complejo con e l i6n es neutro, por ejemplo:

n iger ic ina, monensina, dianemicina, etc. Estos iondforos pose-

en un húmero var iab le de grupos oxigeno (52 ) .

30

En general l o s ionbforos carboxi l icos tienen un esque - l e t o hidrocarbonado dentro d e l cual se encuentran an i l l os hete - r o c i c l i c o s de oxígeno y poseen una variedad de grupos oxígeno

para l i g a r a l catibn: e t e r , carboxiloc y carbonilos (52).

E l grupo carbonilo de l a n iger ic ina part ic ipa directa - mente en l a unibn con e l catibn v í a un enlace ión ico , suplemen - tad0 por cuatro enlaces (de oxígeno ión-dipolo,( 52). Su estruc-

tura s e muestra en i a s iguiente f i gura (Figura 11 A). ~

La n iger ic ina presenta un movimiento eléctricamente - s i lenc ioso de K+ y H+ a través de l a membrana. (Figura 11 B).

La dianemicina es uno de los ionóforos carboxi l icos - con un t o t a l de 8 oxigenos como se muestra en l a f igura 12.

Ma

Niytricin : R a O H

Figura 11 . A . Estructura de l a Niger ic ina y B. su meca- nismo de transporte. Inv. y Ciencia (1978).

Figura 12. Estructura de l a Dianemicina. Hilgenfeld,R. 1

(1982). I

31

c. ion6foros formadores de canales.

Los ionóforos que forman canales, están ejemplif icados

por l a gramicidina, un pol lpeptido l i n ea l de 15 aminoácidos. Es - te ionóforo incrementa l a permeabilidad de l a s membranas biolb-

g icas a cationes monovalentes. Evidencias estructurales y medi-

ciones c inét icas en sistemas modelo indican que dos moléculas - de gramicidina, una a cada lado de l a membrana, forman un dime-

ro con enlaces de H+ en e l centro de l a membrana. Esto forma un

poro transmembranal a través de l cual cationes monovalentes de

un c i e r t o tamaño son permeados (62) .

~

GRAMICIDINA A

Figura 13 . Estructura de l a Granicidina A. Inv. y Cienr c i a (1978).

Los ionóforos son moléculas f l e x i b l e s , e l l o s abren sus

estructuras para permitir l a entrada de cationes, y sus enlaces

dependen de l a f l e x i b i l i d a d del esqueleto de Atomade carbono - para enfocar l o s oxigenos Óptimamente alrededor del catibn que

forma e l complejo. La formación d e l complejo es también inf iuen

c iada por l im i tes de pequeña energia que surgen por l a altera--

cion en l a solvatacibn de l ionbforo en di ferentes estados (52).

-

32

Las afinidades de equ i l i b r i o entre l os iones y l o s io -

nóforos en sistemas i n v i t r o no proveen una gula de f in i t i va de

cómo l as reacciones de transporte podrían ocurr i r en sistemas - bio lóg icos (52). De acuerdo con l a f i gura 14 (52) una fue r t e -- afinidad de compiejación podría solamente ocurr i r a favor de -- una reaccidn de compiejación(c) de l a secuencia de l transporte y

podría aún impedir l a reaccibn de complejacidn(h) .Una correla--

c ión entre afinidades de complejación de var ios ionóforos y su

r e l a t i v a habil idad para so l t a r cationes desde l o s e r i t r oc i t o s - fantasmas, ecpecíficamente cargados, ha sido copilada. Estos da - tos pueden se r resumidos en una simple y c la ra generizalción: - pequeños iones son transportados desproporcionalmente, compara-

dos con sus afinidades de equ i l i b r i o (52).

Figura 14. Modelo de transporte de l o s ionóforos carbo- xílicos.Pressman,B.C. (1976).

33

La tabla I1 muestra di ferentes t ipos y especies de i o - nóforos, con su respectivas ser i es de se lect iv idad, basadas en

técnicas de equ i l i b r i o de complejación en una so la fase ( f lou-

recencia, conductividad, etc. ) o por técnicas de distr ibución

en dos fases (52).

Tabla 11. Selectividades de l o s Ionóforos (52).

-

Ionbforo M O 1 . W Secuencia de Select iv idad Ref. Peso molecular

Valinomicina 1110 Rb? K > Cs 7Ag>T I ( 63 )

Monensina 670 Na) K > Rb 7 Li >Cs (64)

-Nigericina 724 K > Rb > Na > Cs)) L i (64)

Dianemicina 867 Na) K 7RbX C s > L i ( 64)

34

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Puesto que LUI complejo ionóforo-catión responde a l A y , l a distr ibución en equ i l ib r io de l K+ (65) en presencia de v a l i

nomicina, puede ser usada para medir e l potencial de membrana - (44). Alternativamente, 1.a distr ibución transmembranal de c a t i o - nes l i p o f i l i c o s radiactivos puede ser usado para medir e l A? , para colapsar dicha parte d e l A p se pueden usar los ionóforos.

E l potencial de membrana de varias cé lulas ha sido medido con - ionóforos, de esta manera fue posible medir e ldp mitocondrial

cuyo va lo r es de 200-23OmV, negativo en e l i n t e r i o r , además, es - tos agentes han sido ú t i l e s para colapsar selectivamente a i A y o a l pH en sistemas modelo, usados para estudiar l as reaccio-

nes redox transmembranales (52) .

Los ionóforos ti.enen también un papel importante en e l

estudio d e l transporte de iones en l a mitocondria (66,67). Expe - rimentos MterioreS indican que los ionóforos neutros aumentan - l a f o s f o r i l a c i ón de l ADP, mientras que l o s ionóforos carboxi l i -

cos inhiben l a oxidación de c i e r t os sustratos (68).

Esto subsecuentemente hace c laras las condiciones que

pH (decrece e l A pH externo ( 6 9 ) , se colapsa e l AY elevan e l

por l a valinomicina fias e l potasio (70 ) , promueven l a entrada - de l anión; mientras condiciones que disminuyen e l ApH (niger i -

cina, incrementan e l AY por e l e f lu jo de K+ inducido por vaii nomicina) promueven e l ef ' lujo de l anibn (66 , 67). Así, l a magni

tud del PpH puede directamente i n f i u i r en l a proporción y ex--

tensión de l a entrada de iones en mitocondria.

- -

Con l a introducción de l o s ant ibiót icos que traspor--

tan efectivamente cationes divalentes, se h i zo posible exami-

35

nar e l papel de l o s cationes divalentes biológicamente impor--

tantes, Ca+2 y Mg+*, en sistemas bioenergéticos y otros ( 71 , - 72) .

Como punto f i n a l , l o s ionóforos móviles y l o s canales

han s ido estudiados intensamente como modelos para l o s acarrea

dores o canales que existen en membranas naturales. La descri-

minación entre e l K+ y e l Na+ por l a valinomicina y l a propor-

c ión de l a conductancia del ión por l o s canales de gramicidina,

no son iguales, es to naturalmente l o s hace di ferentes. Ec! paten

te que nuevos ionóforor; con gran se lect iv idad, quizá l a única

propiedad provechosa, podrían acrecentar e l estudio en general

de l o s mecanismos de transporte y encontrar l a s aplicaciones - de var ios cationes tanto en sistemas bioenergétices como en -- otros.

-

-

En es te trabajo s e estudió e l e f e c t o de d is t intos io -

nóforos carboxí l icos (n iger ic ina, diacimicina y monencina) so-

bre l a h i d r ó l i s i s de ATP en presencia de valinomicina y FCCP.

36

*

.. .

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O B J E T I V O S

E l ob j e t i vo de esta investigación es e l t ratar de obte - ner datos de interés en cuanto a l a función del transporte de - iones a través de l a membrana mitocondrial, para un mejor enten

dimiento de l o s procesos bioquimicos de transducción energética.

Uno de l o s obje t ivos que se planteó para r e a l i z a r esta

investigacibn fue e l obtener un método de extracción mitocon- - d r i a l donde las partículas mitocondriales estuvieran l o más in-

tactas posible para estar seguros que e l sistema fuese confia--

b l e , y obtener una técnica para l a medicion de P i que estuviera

de acuerdo con las necesidades requeridas para poder evaluar -- l a actividad de l a ATPasa.

Actualmente se cuentan con datos obtenidos por Estrada

O, y Lardy H. que no concuerdan totalmente con l a hipótesis qui - miosái6tica por l o que se hizo necesario t ra tar de expl icar es--

tas observaciones (73-76).

Se ha observado que e l ionóforo carbox í l i co n iger ic ina

no inhibe sustancialmente l a h id ró l i s i s de ATP promovida por e l

conductor de pyotones FCCP ( 7 3 ) y que por e l contrario esta hi-

d r ó l i s i s se v e inhibida cuando es mediada por valinomicina (con

ductor de cationes). -

E l ob je t i vo pr incipal de este trabajo es e l de estu- - d i a r l as c inet icas de l a h i d r ó l i s i s de ATP en presencia de l o s

ion0foros carboxí l icos (n iger ic ina, dianemicina y monensina) en

dos situaciones d i ferentes , para determinar s i e l e f ec to de l a

37

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C .

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niger ic ina mencionado en e l p&ra€o anterior, e s exclusivo de

es te ionóforo o se presenta con otros ionóforos.

Las dos condiciones son: en presencia de un conduc--

t o r para protones FCCP y en presencia de un conductor para ca

t iones vaiinimicina. -

Estudiar e l comportamiento de l a h i d r ó l i s i s con res- -

pecto a l tiempo para discrepar sobre su l inearidad ya que sólo

se han rea l i zado experimentos a l o s t r e s minutos '75).

38

M A T E R I A L E S Y M E T O D O S

Las mitocondriac; s e prepararon a p a r t i r de higado de - ra ta (Wistar) macho de wi peso aproximado de 200 gr. Las ratas

sacr i f icadas por desnucación inmediatamente se l es ext irpb e l - higado. E l procedimiento consiste básicamente de una centri fuga - c ion d i f e renc ia l en una solución que posee un soporte osmótico

adecuado, un amortiguadox, albúmina de svero bovino para atra--

par l o s ácidos grasos y cpe1antT.s (EDTA o EGTA). Todas l a s so lu - cienes s e ajustaron a un pH de 7.4 con TEA-HC1, todo e l procedi - miento se l levó a cabo a una temperatura de 4OC (77).

1. Primeramente e1 higado s e somete a homogenización - en un medio de Manitol 0.3 M, TEA 5mM, EGTA 0.4 mM y BSA 0,5 mg

/ m l . , con este tratamiento s e destruyen l a s cé lu las y se lib+-

ran l o s organelos intracelulares.

2. Después una centri fugación d i f e renc ia l de 500 a - - 1000 g para el iminar los organelos de mayor peso.

3. Resuspender e l p e l l e t y volver a centri fugación con

e l ob j e t i vo de incrementar e l rendimiento.

4. Para recuperar l a fracción mitocondriai s e cent r i fu - ga dos veces más (5000-2OOOOg).

5. Finalmente e l p e l l e t mitocondrial obtenido s e resus - pende para su poster ior uso.

La concentración de proteina mitocondrial se estiihb -- por e l método de b i u r e t (43).

39

Para l a medlcibri de l consumo de oxigeno se u t i l i z ó wi

electrodo t i p o Clark (79) y un espectrofotometro Espectro Pluss.

Para medir l a ac:tividad de l a ATPasa se midió e l f o s f a - t o inorgánico en estracto ácido (80).

~l fosfato inorgánico l iberado durante l a reacción de

h i d r ó l i s i s s e midi6 ut i l izando un método color im&tr ico ( 8 1 ) . Es - ta técnica está basada en l a formación de un complejo absorven-

te, entre e l fos fato y LIYL r eac t i vo de z inc, a pH 5; es te comple - j o t i ene un pico de absorvencia en e l rango del u l t rav io l e ta -- cercano con una longitud de onda de 34Gnm. E l pH f i n a l obtenido

a l agregar ácido perclbri.co requerido para detener l a reaccibn

de h id rb l i s i s es de 3 .5 . E l complejo se forma muy rapidamente,-

con un tiempo de 4 ceg. para adquir ir un 98% de absorvencia y - es estable por más de 24 hrs. ( 81 ) . Sin embargo, debido a l pH - tan acid0 requerido para extraer l a s mitocondrias, s e pens6 que

t a l vez s e r i a mejor neutra l i zar l a f raccibn de mitocondrias, an

tes de adicionar e l react:ivo de molibdato. Esto era conveniente

porque, a pH acido, e l ATP que no había s ido hidrol izado por l a

enzima, podría h idro l i zarse durante e l procedimiento, dando una

sobreestimación de l a act iv idad de l a enzima. Así, resolvimos - neutral izar con un volumen conocido, una mezcla de NaOH con TEA,

pues l a sosa Sold t i ene una curva de t i tu lac ión muy empinada -- por l o que es f á c i l pasarse en l a t i tulacibn. Este paso inter--

f i e r e con e l tiempo de formación de l complejo y notablemente, - con l a estab i l iaad d e l mismo, por l o que se decidió no neutral i

zar y r ea l i z a r l a s operaciones más rápidamente y en f r i o , para

minimizar l a h i d r ó l i s i s inespecl f ica. Los protocolos de f in i t i - -

vos s e muestran en l a f i gu ra 1 5 con los pasos seguidos para l o s

t ipos de experimentos real izados (incubacibn a 10 min. y c , inét i

-

-

- 40

-ca a 10 min.) a s í como para l a curva de cal ibración. Toda5 l a s

muestras s e procesan como en e l primer punto, con es te protoco-

l o s e h i zo l a curva de cal ibración, esto s e h i zo por t r ip l icado.

Este metodo nos dá un rango de anál is is entre 10 y 400 UM de P i

en l a muestra.

Todos l o s experimentos s e l levaron a cabo en celdas -- con agitation constante, en un medio basal con: Manitol 0.28 M,

TEA 10 M, KC1 3mM, ionók'oros lug/ml, y proteina mitocondrial - lmml; l a reaccibn se dispara con 6mM de ATP.

Las técnicas de aislamiento mitocondrial y medición de

P i se pueden observar en las f iguras 1 5 y 16 .

Figura 15. Diagrama de l o s protocolos para l a medición de ATPasa por medio de l a cuanti f icaci6n d e l f o s f a t o - i n o r g h i c o l iberado.

41

is 3 8 %

4%

R E S IJ L T A D O S

I. Modificación de l a Metodología de l Aislamiento Mitocondrial

Los resultados obtenidos en e l desarrol lo de un protoco - l o de aislamiento mitocondrial, descr i to anteriormente en Mate-

r i a l y Metodos, se pueden observar en l a f i gura 17 , donde es f á - c i i notar e l mejoramiento de l control r esp i ra tor io y de l a r e l a - ci6n ADP/O, con respecto a l o s obtenidos con l a técnica comb-- mente usada por nuestro grupo de trabajo, l a cual u t i l i z a saca-

rosa manitoi ( I : 3) como soporte osm6tico; por o t ro lado, es im--

tante mencionar que a l afiadir BSA, se mejoran l o s resultados,

ya que atrapa l o s ácidos grasos libres que desacoplan las mito-

condrias. L a tabla I11 muestra una comparaci6n de l o s resultados

obtenidos con l o s dist intos métodos de bislamiento mitocbndrial.

1 m i "

Figura 17 . Trazos de consumo de oxígeno mitocondrial. Según la- tecnica 16A (2) y l a 16B ( 1) ,

43

1 medio de Ais lamiento

25 t 3

F u r; c I o 14

20 f 2

I SAC / I“! RESPIRACION en ESTADO 3 80 3

Glutarnato-Malato

2,7 0.3 RELACION ADP/O Gtutamato-Malato

CONTROL RESPIRATORIO

Cuccinato I 1,2 : 0,2

CorirrOL RESPIRATORIO

3-tiidroxi b u t i r a t o

RELACION ADP/Q 1.1 _+ 0,3 Succinato

RELACION ADP10 I I 2.6 2 0.6 3 - t i i d r o x i b u t i r a t o

24 2 3 RESPIRACION BASAL Glut amato-Malato

1 RESPIRACION BASAL

29 ? 2

MI

Cucc i n a t o

OXIDACION DE NADH EXOGENO

TRANSPORTE DE Ca +2 1 i

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~W’iY + BSA t”

88?6 9825

3,4 ? 0,6

2,E5 : O,?

5,05 : 0,1

z.5 ! 0.0

1.8 ? 0,2 1,5 2 O S

3.0 ? 0.5 4,O 2 0,6

1.4 * 0,5 2,5 2 0,l

M f 3 55 3

WrJ + w 102 2 E

1.8 : 025

4,5 ? 0,8

2,9 2 0,l

4,O 2 0,3

l!? ? 1

60’2

No

+ i

Tabla 111. E f e c t o del medio de aislamiento en algunas - funciones mitocondriales. Valores y rango de 4 experimen t o s en preparaciones di ferentes . Respiraci6n en mol O/- min mg de proteína. Sustratos en m.

44

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11. Act iv idad de l a ATPasa mitocondrial.

Con e l f i n de determinar l a act iv idad de l a ATPasa, s e

u t i l i z ó un método colorirnétrico para l a medición del f o s f a t o -- i !

inorgánico l iberado durante l a h id rb l i s i s d e l ATP; dicha técni- !

ca está basada en l a formación de un complejo co lor ido absorven - te , entre e l f o s f á t o y un reac t i vo de molibdeno de zinc, a un - pH de 5. Este complejo presenta un pico de absorbancia en e l u1 - t rav io l e ta cercano, con una longitud de onda de 340 mm.

!

La f i gura 18 se muestra l a c ine t i ca de formación del - complejo co lor ido a un pH de 3.5, esto debido a l a u t i l i z ac i ón

de l ácido perc lór ico para detener l a reacción. Como puede verse

e l complejo se forma rápidamente, adquiriendo en 4 segundos un

98% de absorbancia. E l complejo es estable por más de 24 horas.

I

1 7 1 4 Pi

Figura 18. Cinet ica de formación de l complejo co- lor ido de l a técnica de l a medicion de l P i . E l - tiempo medio de formación es de 0.78s y e l tiempo para l l e g a r a un 98% de absorbancia es de 3.9s. Temperatura de 22OC, pH de 3.5.

45

Sin embargo, nos encontramos coli e l problema de que a

un pH de 3.5 e1 ATP no hidrol izado por l a ATPasa, s e podría h i - dro l i zar debido a l pH tan ácido q'ue prevalecía en e l medio, -- as i que'se neutra l i zó con NaOH y TEA, no obstante, como se Ob4

serva en l a f igura 19 con dichos react ivos l a formación de l -- complejo se ve afectada notablemente e in t e r f i e r en con l a esta - b i l idad de l mismo.

I

Debido a t a l e s problemas se decidió no neutral izar , y

r e a l i z a r l o s experimentos l o más rápidamente posible , mantenien - do siempre todo e l procedimiento en f r i o , minimizando as i l a - h id r6 l i s i s inespec i f i ca .

PI m

Figura 19. Estabil idad de l complejo co lor ido con y s in neutral izar con una mezcla de NaOH/TEA. Ver Métodos.

46

I - ...

Además se r e a l i z ó una..curva de ca l i b r a c i ón ( f i gu ra 20),

con e l f i n de tener un marco de r e f e r enc i a , obteniéndose una c o - r r e l a c i ón de o'. 99, ( l o s experimentos r ea l i z ados por t r ip l i cado ) . I

30

Figura 20. Curva de ca l i b rac ibn segun l a f i g u r a 1 5 C

111. Efecto de l o s i onó foros carbox i$ icos (monensina, n i g e r i c ina

y dianemicina) sobre l a h i d r ó l i s i s de l ATP.

Una v e z obtenidas l a preparación mitocondr ia l adecuada

y l a t ecn ica para l a medición de l a ac t i v i dad de l a ATPasa, s e

ana l i z ó e l efecto de d i s t i n t o s i onó foros ca rbox i l i c os ( n i g e r i c i

na, monensina y dianemicina) sobre l a ac t i v i dad de l a ATPasa, - -

inducida por FCCP (carbonii cianido p-trifiuoro metoxi feni l h i - drazona) y valinomicina en mitocondrias l i b r e s de sustrato exb-

geno,

Puesto que en l a s mitocondrias, cas i mo existen reac--

ciones dependientes de ATP, ya que este compuesto e s u t i l i zado

en e l e x t e r i o r de e l l a s , l a actividad de l a ATPasa medida en l a

f raccibn mitocondrial se debe cas i exclusivamente a l a ATPasa - de protones mitocondrial. NO obstante, se r e a l i z ó un control con

e l f i n de medir l a h id rb l i s i s d e l ATP adicionado basal, para po-

der restar l a actividad inespec f f i ca de l o s datos obtenidos expe - perimentalmente, inhibiendo l a H+-ATPasa con e l ant ibibt ico o l i -

gomicina.

Como puede observarse en l a f i gura 21, s i se adiciona

valinomicina a l sistema en presencia de potasio, a l cabo de 10

minutos se obtendrá un gran incremento de l a actividad de l a -- ATPasa sobre e l n i v e l basal. SLa este sistema se l e adiciona -- cualquiera de l o s ionbforos carboxfl icos: niger ic ina, monensina

o dianemicina, l a actividad de l a ATPasa decrecerá aproximada -- mente en un 80%. S i comparamos estos resultados a l equ i l ib r io y

consideramos como 100% l a actividad maxima obtenida, es posible

observar e l e f e c t o inh ib i to r io de parte de l o s ion6foros usados.

sobre l a activldad de l a ATPasa inducida por valin&micina; ade - más se,puede notar que no ex i s te una d i ferenc ia s i gn i f i ca t i va

entre e l e f e c t o de l a niger ic ina, l a monensina o l a dianemirim.,,

a pesar de su d i ferenc ia en cuanto a l a ‘ se lec t iv idad por e l pota - cia.

4a

-

+ VAL VAL +

NIGER

Figura 21. E fecto de

VAi 4- VAL + DIANE MONEN

os d is t in tos ion6 'oros carbóx i i i - ~~

l i c o s sobre e l porcentaje de Actividad de l a ATPasa, en presencia de Valinomicina. Se toma como 100% e l e f e c t o mbtimo obtenido. Condiciones basales. Manit01 0.3M, -- TEA 0.01M, KC1 3OmM, mitocondrias I mg/ml, ion6foro lug/ mg, pH 7.4. Incubaci6n a 10 min.

49

La Gigura 22 muestra e l mismo experimento pero u t i l i - -

zando como inductor de l a ATPasa a l FCCP (carbonil cianido p- - t r i f l u o r o metoxi f e n i l hidrazona), en lugar de valinomicina, en

e l experimento contro l , donde s e adiciona únicamente FCCP, s e - observa t amb ib un marcado incremento en l a act iv idad basal de

l a ATPasa. S i además, s e adiciona n iger i c ina , monensina o diane

micina, no s e observa una diPerencia valuable, es to es, no e x i s

te una inhibicibn s i gn i f i ca t i va . Lo que indica que aparentemen-

te l o s ionbforos carbox i l i cos estudiados son capaces de inh ib i r

l a act iv idad de l a ATPasa inducida por e l movimiento de un ca--

t ibn (E+) inducido por valinomicina y no 10: hacen cuando l a - - reaccibn es inducida por un ionbforo para protones (FCCP).

- -

Util izando valores absolutos de act iv idad en lugar de

porcentajes, s e observa un part icu lar e f e c t o de l a valinomicina,

mostrándose superior a l inducido por e l FCCP ( f i guras 23 y 24) ,

y que a l adicionar n iger i c ina , monensina o dianemicina esta ac-

t i v idad s e ve reducida a l o s va lores obtenidos con FCCP.

En cuanto a l a s concentraciones usadas, l a de l FCCP de

150 mM es su f i c i en t e para l a obtention de una act iv idad máxima

de transporte de protones y , de i gua l forma, l a de valinomicina

es su f i c i en t e para inducir un desacoplamiento s imi lar a l de l -- FCCP. Sin embargo, es notable que con valinomicina s e induce -- una h i d rb l i s i s mucho mayor que con FCCP, y que a l adicionar l o s

ionbforos carbox i l i cos s e restablece un sistema t i p o FCCP.

Las f iguras 25 y .26 muestran l a s c inét icas hasta 10 - minutos, donde s e t ra tb de ubicar en que f a se d e l procesb se ob

servan dichas d i ferenc ias en l a act iv idad de l a ATPasa, con e l -

50

+ FCCP FCCP

~4-

+ FCCP

+ FCCP

+

--#-

NIGER DIANE MONEN

Figura 22. Efecto de los d is t in tos ionóforos carboxi l i - cos sobre e l porcentaje de Actividad de l a ATPasa, en - presencia de FCCP. Mismas condiciones que en l a f i gura 21.

51

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VAL VAL VAL VAL + + +

NIGER DIANE MONEN

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FCCP FCCP FCCP FCCP t + +

NIGER DIANE MONEN

Figuras 23 (arriba) y 24 (abajo). Actividad de l a ATPasa en va lores absolutos. In f luenc ia de l o s diversos..ionófo- r o s carboxfl icos. Incubaci6n a 10 min. Mitos. lmg/ml, Ma n i t o l 0.3M. TEA 10 m ~ , Deta l les de l a s técnicas ver M e t o dos.

-

52

f i n de poder determinar s i es te e f e c t o se presenta en l a s prime - ras etapas o cerca de l equ i l i b r i o y s i e x i s t í a alguna di ferencia

entre l o s di ferentes ion6foros.

Es c l a ro que l a s c inet icas muestran e l mismo patrón des - de l a s primeras etapas, llegando a l equ i l i b r i o antes de l o s 5 m i - nutos. E l punto cero coincide con l a adición de l ATP exógeno con

e l cual se dispara l a reacción.

53

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~ .,. Anteriormente, l o s experimentos de Henry Lardy y Estra -

da-O ( 68 ) mostraron que l o s ionóforos carboxí l icos podían re- v e r t i r e l e f ec to de l o s ionóforos conductores de cationes t ipo

valinomicina y que cuando es t e e f e c t o se l levaba a cabo usando

un conductor de protones, l os ionbforos carboxí l icos no acusa--

ban ninguna modificación, estos datos y aquellos(73-76) donde - se menciona un e f e c t o sobre l a H+ ATPasa, fueron retomados en - esta investigación.

A S i , s i s e inducia una act iv idad de h i d r ó l i s i s extensi

va de ATP por medio de l a valinomicina en un medio con potasio,

l a n iger ic ina era capaz de inh ib i r la , l o cual no sucedía si l a

act iv idad s e inducia por desacoplamiento ut i l izando FCCP. Sin - embargo, a l comparar nuestros resultados en valores absolutos,

ut i l i zando como agente inductor l a valinomicina y e l FCCP, se - observa'que e l e f ec to de los ionóforos es e l de r e v e r t i r una so

bre-estimulación de l a act iv idad de l a ATPasa, inducida por va-

l inomicina, o valores comparables a l o s obtenidos con FCCP; ade

más se observó que los ionbforos no ejercen ningún e f ec to , en - e l caso de u t i l i z a r FCCP como agente inductor. Se observa tam--

Dién que curiosamente a pesar de que l o s ionóforos carboxi l icos

('nigericina, diwemicina y monensina) presentan una d i ferente - se l ec t i v idad para transportar potasio, l o cual ha s ido observa-

do en bicapas l ip id i cas :

-

-

-

Monensina Na>>K \>Rb ( 64 1 Niger ic ina K 7 Rb > Na ( 64)i

Dianemicina Na > K > Rb ( 64' )

no presentan una d i ferenc ia s i gn f i ca t i va en partículas mitocon-

dr ia les intactas en wi medio que contiene potasio.

58

Para t ra tar de expl icar e l mecanismo por e l cual se - l l evan a cabo estos procesos, s e analizaran ambos sistemas, -- tanto con valinomicina como con FCCP. Sibemos que l a ATPasa m i - tocondrial (con ATP exbgeno e inact iv idad resp irator ia ) tiende

a l a reaccibn de h id rb l i s i s d e l ATP s egm l a nueva l e y de ac--

cibn de masas, pero esta s e v e afectado a i generarse un poten-

c i a l electroquimico que impide que s e s i ga dando l a reacción de

h id rb l i s i s . A l añadir valinomicina s e d is ipa e l potencial y se

regenera l a Hidrb l is is . S i en nuestras condiciones experimenta - l e s e l gradiente para potasio es de aproximadamente 3omM en e l

ex te r io r y de 95mM en e l i n t e r i o r , e l ionbforo transportará -- iones potasio a l i n t e r i o r mitocondrial, para t ra tar de compen-

sar l a carga de l o s protones bombeados durante l a reaccibn de

h id rb l i s i s de l ATP, ocasionando l a h id rb l i s i s extensiva del -- ATP ( f i gura 27.)

1N"ERIOR

____) K+

H+

ADP + P i

Figura 27. Movimientos iOnicos en presencia de Valinomi- cina. AY& ; njiH+t,

59

A l dispararla reacción con FCCP (conductor de protones) se obsema que e l gradiente de potencial es disipado, tanto qui - mica como electricamente; puesto que se r ea l i z a w1 r e c i c l a j e de

protones como se muestra en l a f igura 28.

+ P i

F i a r a 28. Movimientos iónicos en presencia de FCCP.

Analizando e l e f ec to de l o s ionbforos carboxi l icos so-

bre estos parámetros se encontrb que a l adicionar los ionforos

n iger ic ina, rnonencina o dianemicina, para e l caso de l a h i d r b l i

s i s inducida por valinomicina, l a reacción regresa a valores s i

milares a l o s ,obtenidos con FCCP. Como vemos, los ionbforos car

boxi l icos son capaces de r e v e r t i r l o s e fectos inducidos por - -

- .

- -

60

valinomicina + K+ haciéndoles llegar hasta los valores obteni- dos por desacoplantes (FCCP).

Podemos decir, que los ionbforos carboxilicos (nigeri - tina, dianemicina y monensina) mimetizan una condicibn desaco-

plante en el sistema, cuando la reacción de hidrblisis del ATP es inducida por valinomicina. La figura 29. resume lo dicho an - teriormente.

EXTERIOR

I - , I

1 I

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1 1 ! I

I

I ' I I I I I I K't

INTERIOR

IONOFO

I I

I I 1 i I 1 1 t I I I

I /

+ Pi

Figura 29. Modelo de los movimientos i6nicos1 en presen- cia de los ionbforos carboxflicos, utilizando como agen- te inductor de l a hidr6lisis Valinimicina.

61

ES pos ib le obsemrar,que e l resultado en es te sistema, es un r e c i c l a j e de protones del i n t e r i o r a l ex te r io r mitocon--

dr ia l . Cabe aiiadir, que con e l f i n de esclarecer estos fenbme-

nos, s e real izaron estudios por m i grupo de trabajo, sobre me-

diciones de potencial transmembranal ( 82 ) .

Respecto a l os datos obtenidos con l a s c inet icas 10 - minutos, se puede ver que e l evento de l a h id rb l i s i s de ATP i n

ducido tanto por valinomicina como con FCCP, se presenta desde

l a s primeras etapas alcanzando e l equ i l i b r i o a l o s 5 minutos;-

a pesar de l o s estudios de se lect iv idad en bicapas l í p id i eas - ( 64 ) , l o s cuales muestran una di ferencia en l a af id idad'por - l o s metales, dependiendo del ionbforo en cuestibn, en esta in-

vest igación se observó que no existen di ferencias s i gn i f i c a t i -

vas entre l os ionbforos n iger ic ina, dianemicina y monensina, - a l se r estudiados en condiciones más bio lógicas, 'como es e l -- sistema de mitocondrias intactas; tanto dianernicina como nige-

r i c i na presentan un mismo e f e c t o en l a h id rb l i s i s de'ATP en un

medio que contiene K+, por o t r o lado, n iger i c ina es cas i tan - e f i c i en t e como e l l o s en este sistema.

-

62

C O N C L U S I O N E S

A l anal izar l os resultados obtenidos en esta invest iga - ción, podemos concluir que:

l o E l ionbforo para cationes valinomicina, en un medio

que contenga potasio, induce l a h id rb l i s i s en mayor proporcibn

que en e l caso de u t i l i z a r e l desacoplante FCCP.

2 O Los ionbforos carboxi l icos: n iger ic ina, dianemicina

y monencina, mimetizan una condición desacoplante$, en un medio

donde l a h id rb l i s i s ha s ido inducida por e l ionbforo para c a t i o - nes valinomicina.

3 O Los ionbforos carboxi l icos estudiados, no muestran

ninguna d i ferenc ia s i gn i f i c a t i v a en un medio donde l a hidrbli--

s i s de ATP ha s ido inducida por e l desacoplante FCCP.

63

R E S U M E N

LOS organismos v i vos presentan l a capacidad de extraer

y transformar energía de su entorno a pa r t i r de materias primas

senc i l l as , empleandola para edificar y mantener sus propias es-

tructuras (3) .

Este fenómeno tan importante está reg ido principalmen-

t e por medio de l transporte de iones, a través de l a membrana - interna mitocondrial (4) .

En 1961, se propone l a Hipótesis Quimiosm6tica para - t r a ta r de exp l i car e l mecanismo por e l cual se r e a l i z a e l aco - - plamiento energético (14) ; s i n embargo l a aparición de nuevos -:*

datos que no concuerdan totalmente con sus postulados, nos han

l levado a l a necesidad de un estudio mas profundo en e l ramo (53),

para l o cual, l a aparición de los ionóforos, ha servido de gran

ayuda en e l avance de es ta rama de l a c i enc ia (50,51) .

En es te proyecto se ha tratado de contribuir a l conoci-

miento de estos procesos, uti l izando como herramiedta a l o s ion6 - f o ros carbox í l i cos ( niger ic ina, dianemicina y monensina ) en un

estudio sobre l a h i d rb l i s i s de ATP inducida por Valinomicina y

FCCP. Para esto, se diseño un método de aislamiedto mitocondrial

que nos permitiera obtener l a s partículas mitocondriales l o más

intactas pos ib le , además de un método coiorimétrico para medir

l o s parbnetros a estudiar.

De esta manera, se obtuvieron datos que tratan de e xp l i

car una h i d r ó i i s i s extensiva de ATP en presencia de Valinqmicina

Y K+, en comparación con l a inducida por e l ionóforo para proto-

-

64

nes FCCP. Se observó que l os ionóforos carboxf l icos ( nigericina,

dianemicina y monensina ) no presentan d i ferenc ia s i gn i f i ca t i va

en es t e sistema, a b cuando su se lect iv idad en bicapas l i p id i cas

e s d i ferente para e l i6n potasio. A s i mismo, se muestra en l a s

c inét icas de h i d r ó l i s i s de ATP en presencia de d is t intos ion6fo-

r o s carboxf l icos, que dicho evento se da en l o s primeros minutos

llegando rápidamente a l equi l ibr io .

65

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- - F 1:

f I-

. * ...... . . . . - . . . . . . . . . . . . . .~ ... -

.j .~ ,,. ,

~. . . . . ...... - a U L . L m R E S CALLEJAS NOMBRE

. . . . . ,~ I .,,,. .

TELEFONO . PARTICILAR . :: :i ... . - . ~ ~ 7 9 4 ' i 3 33 -'. . .~

- ..mTRI-.. ... . . . - - - ...... 80329853 . . . . . . . I 1 ~ . . ....

CARRERA ._ __ .~ ~ . . . . . . . . . BIOLOGIA - . .~

AREA DE. CONCENTRACTON . -~ - .... . . . . . .

BIOLOGIA EXPERIMENTAL , . -

. . . . . . . . . . . . . . . 84-P TRIMESTRE ~

. . . - L . . . . . . . L A _ s ~ - " - - . .--

LUGAR DONDE 'SE LLEVAM A CABO

. . . . . . . -. . 20 HORAS . . . . - - .. -~ . ~ --- -- .

. . . . . . . LABORATORIOS S-251 y 5-253 AREA DE ~

INVESTIGACION BASICA DE C.B.S. - UAMI

10 DE MAYO DE 1984

10 DE NOVIEMBRE DE 1984

FECHA DE INICIO

FECHA DE TERMINACION

NOMBRE DEL TUTOR INTERNO PUESTO

Y ADSCRIPCION ' . M. en C. LIGIA TORO CALZADA

I

PROFESOR ASOCIADO "C" TIEMPO COMPLETO

' TITULO ESTUDIO DE LA RELACION DE LA ATPasa MITOCONDRIAL Y EL TRANSPORTE DE ION'ES MEDIANTE EL USO DE IONOFOROS CARBOXI-

L I S I S EN PRESENCIA DE DUNEMICINA, MO LICOS. ANALISIS CINETICO DE LA HIDR~-

NENCINA Y NIGERICINA. -

RAUL LINARES CALLEJAS

7 - ----- _I_..-.*-

.

JUSTIFICACION Y NATUBALEZA DEL PROYECTO

l ada h a sido m 8 e facinante para el hombre que el

hombre mimo, l as inquietudes de como empezó a ex ist i r

y como es que se mantiene vivo. De l a misma manera que

l o s niflos se preguntan di donde vienen los bebes, l o a

adultos nos preguntemos c u b fub e l origen del primer

niño. Esta curiosidad inata del hombre a llevado a l o s

científ icos a estudiar e l origen de l a vida a d como - l a complicada maquinaria que l o constituyen y l e da l a

. -

.

característica de estar vivo.

Los seres vivos e s t b integrados por moléculas i-

nanimadas. Cuando se exlrninan individualmente estas mo - iecuiaa aisladas se a j u s t a a todas l as leyes de i s f&

s i c a y l a quimica que rigen e l comportmiento de l a - materia inerte. Sin embargo, l o s orgaaimnos vivos PO-

seen, ademth, unos atributos extraordinarios que no -

. . I

. erHiBen cúmulos de materia inanimada S i examihanos

gunas de estas propiedades especialeg podemos acercq

nos estudio de l a bioquimica con una mejor compren-

sión de l o s problemas fundamenteles que trata de expli - Car .

E l atributo m á s sobresaliente de los seres vivos,

es, quizá, BU complejidad y su e l to grado de orgmizs

ci6n. Poseen estructuras internas intrincadas que cog

tienen muchas clases de moléculas complejas. Se pres-

tan además, en una variedad asombrosa de diferentes es - pecies, Cada una.-.de las partes componentes de l a m

r i a viva cumple un propósito y una función especf

Esto no e8 solamente a l o referente a estru

v i s ib les sino también a estructuras intraceluler

, . ,. ,.” ---, ~ . . . . . I ~ .. .

.

mo e l núcleo y l a membrana. ñn l o s orgauismoa vivos es

completamente legítimo preguntar cúh~ es l a funcidn - de una molécula determinada En canbio, c a ece de se2

tido preguntar esto con rblaci6n a l a materia inerte.

Los organismos vivos presentan l a capacidad de ex - traer y transformar l a energía de BU entorno a part ir

de materias primas sencillas, y de emplearla para e-

f icar y mantener ms propias estructuras intrincadas.

nar de que modo ei conjunto de moléculas inanimadas que

constituyen l o s orgaaiemos vivos se influyen mutucimen - t e para constituir, mantener y perpetuar e l estado de

l a vida. Uno de loa fenomenos biológicos muy importan -

La meta básica actaal de l a bioquimica es detenui -

tea es el reconocimiento de loa sistemas muitieneime

t icos como unidades cq t t i t i c a a en l a s rutas metabóli

cas principales y para . l a transferencia de energía en l a s células vivas.

üna de l as características más importante $i no - es que l a m& importante en una célula es l a membrana,

ya que desde las primeras protocélulas que se fOr10ar4n

durante e l proceso de origen de l a vida, l o primero - que existid fu6 una membrana que le daba l a caracted2

tica de separarse medio )r constituirse como unidad

inaividual que podia intercambiar materia y energía - con el alrededor.

Ai ir evolucionando l a célula l a membrana l o hacia

tainbidn simultaneamente adquiriendo cada vez una orgk

nieaci6n más compleja, de esta manera l a membrama a b

quir ia funciones más especificas y su función ya no era

.

solmente de intercambio de materia y anerdg adqPida

funciones muy selectivas y especificas en cuanto a i tr% aport e. -

Desde l o a primeros procariontee l a membrana j u g e

ba un papel muy importmte, ya que esta a l invaginarse

dentro de l a célula, l e conferia a esta l o s primeros - organoides con funciones especificas. En l r re c6lulas - eucariontes l a membrana tanbién es de suma importancia

ya que aparte de tener l a membrana plaamática que l a 62

para del medio y posee algunas funciones de transporte,

existen membranas internas que se encuentran COnti~UEmente

-

/rodeando a todos l o s organelos que se encuentran des

t ro de l a céiula, eetae caracteristicaa l e infieren a - l a célulaun fendmeno muy importante que es e l de conipar - tsanentalizaci6n. Una de las membranas mf i a complejas y - más importantes es l a membrana mitocondrial, ya que 8x1

e l l a se l levan a cabo l o s fenómenos de transhcci6n de

energía que es esencia para el proceso de v i d a

La mitocondria presenta dos membranas, l a membrana

interna que forma invaginacibn en iunatr5s para formar crestas. que es l a barrera de permeabilidad y l a membra - na externa que parece actuar como barrera f í s i c a a so- lutos relativemente grandes.

Es snmemente importante el estudio de l o s p W h +

t roa de trasducci6n de energía que se realizan en l a - membrana interna mitocondrial, ya que de &tos depende

r,

l a v i d4 así mismo es de amplio interea investigar los mecefamos por l o s cuales se l l e v a a cabo esta t rana9

cci6n de energ ía Aunque todavia hay muchas cosas obs-

curas en estos estudios ya ae han hecho avances muy v&

l i o s o a que noa han ayudado a entender el sistsana cada

.

.

.

ves máe. hnque e l tipo de invest igac ih que se reaiizan

en estos t ipos de estudios es b b i c a no se descarta - nunca l a posibilidad dege: que a i quedar esclarecido -

I e l sistema tenga una importante aplicad611 ú t i l en los

estudios a nivel energdtico y méuco.

I

_ .

INTRODUCCÍON Y ANTBCEDENTBS ’

Las mitocondriae son orgauoides presentes en ai. CL toplama de todas l a a c61ulas eucariontes. Son aietsmas

traeductoree de energfa qn l o s cueles l a energía quhi-

ca contenida en l o s alimentos se convierte en uniones de

a l t a energía (ATP) por medio de l a o d d a c l h f o s f o r i l e

tiva. Dentro de l e mitocondria existen dos compartimiq

toa: uno interno rodeado de una msmbraaa interna y ocu-

pado por l a matric mitocondriel, y otro externo, limik - do por l a a membranas externa e interna; l a membraua in-

terna presenta unaa partícula8 de 85A (particulaa Fl) * bre l a superiicie adyacente a l a matric mitocondriel, eg

tss partí&- contienen una ATPasa especial.

-

~

I Las encimae mitoconQiales muestran una comparteneg

I -

taiicaci6n bien definida. L a membrana externa contiene

IbDBI-citocromo-c-reduct ma formada por una fi rnroproteina

y e l citocromo é. E l compartimiento externo contiene 5

denilato ciciasa y otras en%imae solubles. Bn l a mmb-

na interna se encuentrau todos l o s componentes de l a c~

dena respiratoria y l a fosforilaci6n oxidativa.

5’

~1 prooeso para l a formaci6n tie (ATP) requiere l a

entrada de oxígeno, U P y fosfato, y produce l a sal ida

de A!TP, agua y CO Esta basado en tres pasos coordina - dos: a) e l ciclo de Krebs, realizado por una serie de

enzima8 solubles en l a matriz mitoo’ondrial, que produ-

cen CO por deecarboxilaci6n y extraen electrones de - l o s metabolitoa, b) l a cadena respiratoria o sistema de

transporte de electrones, que captura 1 0 8 pares de 83.82

tronds y loa transfiere etravér de una serie de traus-

portadoree, hasta que se produce l a fomaci6n de agua - p o r l a conbinaci6n del oxígeno activado. c) M eistama

2’

2

F

.

fosforilante, estrecharaente acoplado a l a cadena respi-

ratoria, que en tres de BUS puntos orighamoléculao de

ATP. El sistema f o s f o r i lw t e comprende el faotor F1 de

Backer, una ATPasa que es.ekaentra dentro de l a cabeca

de l a partícula elemental.' Bata ensima sintetiza ATP a-

part i r de ADP y foafato. Labaturaieea del enlace antre

l a cadena respiratoria ~ y l a ATPasa es desconocide, y se

han propuesto dos hipótesis para explicarla. Según l a - hipótesis quiaiomótica, l a ATPaea s intet i la ATP bajo - l a infinencia de un cmpo vec to r i a generado por l a tran - sferencia de eiéctrones atravéz de l a cadena respirato-

ria La hipótesis conformacional sostiene que l a t r a n s

ferencia de e1ectrones"prodnce un cmbio confomacional

en l a a proteinas de l a cadena respiratoria que dan l a - señai para l a sintesis de ATP.

En, l a década de l o s 609, Mitchell (1) introdujo el

concepto de que e l movimiento de H+ estabilieado por l a

estructura espacial de l a membrana biológica podia ser el responsable del aimacenauiento de enerda l iberada - en i s oxidación de sustratos y se podia transferir ésta

ene rda para l a síntesis de ATP. Aunque l a hipótesis e-

cerca de l a naturaleza preeAsa del movimiento de proto

nes variaa y son actuaimente e l sujeto de mtíltiplea in-

vestigaciones y debates (2-51, parece que e l mecanismo

propuesto por-Mitchell es e l involucrado en l a fosfori

1aci6n oddat iva en l a mitocondria. -

LOS modelos propuestos para l a síntesis de in-

oluyen l a discucidn de l a c a t h i s i s o bien e l acoplaui-

ento, o ambos. La mayoria de l o s modelos que consideran ánicamente elemento catd i t íco , sólo toman en menta

.

l a fomaci6n del enlace do foefato o l a liberacidn de - A!PP ya formado son producto de un cambio coniomacionai

dependiente de energfa (6-7). Otros mobeloe para l a sí=

tesis, describen explici&nente un papel para l o a proto - pes (8-12) i, esto e 4 los modelos quimiornóticos. Mitchell

ha sugerido que l a participaci6n directa del proton en-

l a reaccidn qdmica ea el mecanirno más simple por el - cu& l a traslocación de protones puede ay udar a l a deg

hidratación de bap y foefato (8). Bate modelo designa - eJ. canal conductor de protones de l a Focomo una “fuenteA

de protones, cuya concentraci6n aumenta haaia el interior

de l a membranq esto paralelo a l a reducción deA’fR*

concentración de protones- corresponde UW: e l s i t io ag

tiivo de l a P esta organizado en el espacio de tai ma2 ra que l a protonación del odgeno que sale del foefato

L

Bn l a superficie kue ve hacia l a matriz, donde l a

1

se ve favorecicia, sin permitir l a protonacidn de =O-.

Este proceso, va seguido de un ataque nucleofilico

del LLDP ai fodato, formandose a d l a iigatiura foefato-

diester y liberandose agua. Se piensa que el A!LT sale - del sitio catalít ieo protonado, por l o que, l a l i b e r b

cion de ATP a l a soluci6n del l ado de l a matriz, comple - t a l a treslocacibn de protones. Mitchell ha sugerido que

e l número de protonee involucrados son dos (9-10). ),

El modelo confomacionai de Boyer (11) y el modelo

del complejo de magnesio de Backer (12) son también c q

&atentes con e l papel d e i ~ & como l a fuerza que i i e v a

a l a sintesis de ATP; manque se pueden considerar como - modelos quimioandticos indirectos.

En auánto a l a hidrol ia is de W, l a hipótesis qui -

.

.

miomótica (1) predi,ce que e i complejo enzimático es u-

na bomba electrogénica de protones. Existen dos tipos - de evidencias de que l a Fly io m a s a traalooa protones

durante l a hldról is is de ATP: estudios cinéticoa en l o s

que se mide l a velocidad de aparicio'n de los protones - durante l a hldról le is de ATP (13-14); y estudios en l o s

que se mide l a diferencia de potenciai eiectroquimioo - tranamembran&l del protdn generado durante l a hidrolisis

(1516). Aunque l o s resultados mmntitativoa no son idén

t i c04 todas l a a tdcnicas' utilieadaa han dado datos cos siatentes con l a traalooaci6n electrogénlca de protones

de l a fase de lamatris al citosol durante l a hidrol is is

de ATP en mitocondria,.,.

-

-. -

-

En mitocondrlas en las que se inhibe l a resplraci-

6% si se agrega K+ y vailnomicina se observa l a apari-

ci6n de protonee en el'medio externo, aai como l a h i d -

l i s i a de ATP d a d i d o (13-141. La sal ida de protones QUZ

de aer bloqueada por oligomicing que taubibn inhibe l a

h idro l i s i s de ATP; y tanblén por protonóforos que esti-

mulan l a hidróllsis. Esto sugiere que en realidad l o que

ocurre es una trwlocacibn de protones en lugar de una

producci6n neta de el los. Ademha, se ha reportado un m=

vlmlento de potaslo equivalente a l e f l u j o de protonaa -

TaublQn se ha medido elA?N+del estado estacionedo

generado por l a mitocondria que hidroliza XPP. Nicholla

(16) utiliemldo l a dlstribuoidn de Bb en preeencla de v s

linomicina y HOAc, reporto 125 mV paraAvy un ApH de 85

mV. Recientemente, utilizando un electrodo sensible a -

>-I

(17). - >

.

tetrafanilfosfonio, se han obtenido valores para el bpñ

de 30 mV y pa r aby de 150 mV (18). me método que no - emplea vaiinomicina, demuestra que, en condiciones a c ~

pladaa ternbib se generapi potencid de hidrdl is ie pa-

. r a e l ATP.

La hidrol ie is de AZQ se ha estudiado tembibn en p-

tictilas sumitoconMdee; en ellas, i a hidróiisis va - acompafiada por una entrada de protones sensible a protz

nóioros (19-20). Debido a que estaa paaticulaa eaten ig vertidas en relaci6n con i a a mitoconMae intactas, l a - ATPasa tiene accemo directo al A!PP del medio externo sin

que tenga que intenemir el tranalocatior eiectrogénico - que intercaubia ATP- ADP.

!. 8s de esperarse que-durante lee mediciones de l a -

tranalocacidn de protonea l& l t a i t e s de l a respiración

e l movimiento de'lones o metabolitos pueda complicar lie : . interpretaciones acerca del transporte de protones dspeg ' .

diente de ATP. , .

L a hipótesis planteada por Mitchell (1) ha contri-

: buido a explicar Pmplimente los procesoi de trensducci I ' 6n de enerda, sin embargo a l a l u ~ de esta hipótesis no

existe una explicación obvia a observaciones inéditas re - lacionadas con di acoplmiento entre el 'transporte de - iones y e l proceso reversible de síntesis, es decir con

. .

r. l a hidro l ie is de UP.

Se ha observirdo que el ionóforo carborilico nigeri - tina no Inhibe sustancialmente l a hidrol ia is de ATP p-

movida por e l conductoa de protonee (PCCP) (U-34) y que

por 1o:contrarlo tiene l a capacidad de inhibia l a hi--

l i s i a de ATP mediada por l o s conductores de cationee mo - novalentea - vainomicina, eniantina y nonactina - aái

como l a h idró l i s i s de ATP $sociada a l a entrada de cal-

oio. -. ~

. Se a observdo que l o s antibióticos monoaarboxili

cos, monensina 4 B y C inhiben especificeaiente l a entq da de cationes .al.c&iinos en mitocondria de hígado de rs ta ~uando l e entrada be cationes alcelinos en mitocog

dria es estimulada por valinomicina o monaeomicina cm - precencia de ATP, monensina A y B inhiben el transporte

&e K m b que e l transporte de sodio y esto no afecta l a

entrada de ltb 6 Cs, l a monensina C muestra menos habili- ' dad que los compuestop A y B l a discriminación entre H

-

t

. _ y Jtb. ,,-

LOS antibi6ticos inhiben selnctivapiente l a hidroli - a i s y c ierta oxidaci6n de sustratos en l o s que e l medio

contenia K. Igualmente a otros antibióticos quelantes - monocarboxilicoe metálicos, l a monenaina inhibe l a oxi-

dacibn del glutcniato mas facilmente que l a oxidación del

'.-

succinato y hi droxibutirato.

L a inhibicidn puede ser observada por altas concen

traciones da sustrato, altas concentracionda de potado . -

o bajo algunas condiciones especiales p o r uso de Bb o Cs

en lugar de E

bidticos monocarboxilicos que causan una disminucibn de

l e - aeumULaai6n del metal alcalino en mitocondria (35). L a diferencia entre l o s diferentes antibidticos es

La monensina asem'éja a i a nigericina y otros anti- 1

con respeato a l a especificidad del i bn y e i mecanismo

por e l cuch .se l l e v a a cabo Bu transporte.

* . , . . .~ I_c

.... -.-____ ., .. t:' 4r

L a monenelna exhibe una mayor especificidad por el

potmslo m h a que otros antibldticoe de este grupo; por - ejemplo l a nigericina bA&uea l a eetimrf~ación de l a 0%

dacibn del auternato por vailnomlclna presencia de K, Bb o C 4 mientrae qne l a moneneüna lnbibe adlo en presa= .~ ..

c i a de ñ. En presencia de vdLlnomlclna, monenalna A y B

estimuiau l a respirac16n en l a presencia de Bb, superior

mente a l a respuesta que se obtiene con valinomicine.

La estrechahabilidad de laa monenslnas es discrimA

nar entre el transporte de K y ab, el trcnsporte es l a

única propiedad de estos compnestog esto no i o cOmpruc

t e l a nlgericlna ni o t r o s antiblótlcos carbodl lcos In , .

hibidores de l a eatrhda' del iÓn a l a mltocondxia.

La nigericina y - i aá :inonensinas lnhiben l a oxidaci-

:

L

. . , . . .

- ; , .

' A

< .

, . - ~

- I.. . , . . 6x1 del g lutkato sólo. en presencia de K. .

Las monenslna tynbldn exhiben una Impactante espe

c l f ic ldad cuando se prueban como Inhibidores de l a hl-

drollsirs -de ATP estimulada por vellnornlclng dinactlna

o grsmicidlna. (35).

HIPOTBSIS Y OBJBTIVOS

Si l os distintos ionoforoa carboxilicos muestran

una actividad selectiva en bicapas l ipfdicaa e inducen

una r e v e r s i ó n de los fenbenos inducidos por los ion& -. .

foros tipo vaiinonicina Entonces l o s distintos ion@

ros carboxilicos (nigericiae, dlanemicina y monenaina)

^mostrarán un patrdn de selectividad diferente en l a - inhibicibn de l a hidról is is de .ATP indncida por valino

m i c i n a

~

Se observará que l o s distintos ionoibros carboxid-

~ i c o s (nigericina, dianemicina y monenaina) mostrarán

sólo diferencias cuanfitativas en su capacidad de inhi

b i r l a m a s a inducida pol. el transporte de cationes - atravet de conductores como i a vaiinomicina; estas di-

f erenci aa ser& consecuenciaa de eta consentración, cons

- . .

.. - tante de formación coni& Ha, etc., modificada en todo

caso por el pH del microanbiente que rodea el ionbforo.

.

PROGRAMA Y YBTODOLOGIA

l.-Determinaci6n de l a curba-Ae celibracidn para Ir

medici6n de l a hidrol ie is de ATP.

e.-Obtenci6n de l o s con%roles de hidrol ie is de 4im con

un tiempo de 3 y 10 minutoe.

3.-Obtencibn de l a cinÓitica de hidrolisis tie ATP en - presencia del ionkoro carbodlico nigericirla

4.-Obtencián de l a ciné%ica de hidroiisis de ATP em - presencia del ionóforo carbosilico dianemicina.

5.-0btenci6n de lirr cindtica de hidrol is ie de ATP en - presencia del ionbforo oarboxilico monensina

6.-Eetudio y comparación de resulta8os.

7.-Formuiacibn del proyecto del Servicio Social.

.. - .

!. I

Se requiere hacer un analisis comparativo entre - l a s constantes de fowacidñ que 'muestran l o s ionóforos

aarboxilicos pbr l o s 'cationea monovalentes en funcián-

del cambio de pH que estos ion6foros causan.

,-* . _

La metodología a seguir arante e l proyecto ser&

l.-nlslaniento de mitocondriaai de higado de rata por - centrifugaci6;n diferenciel. (36) . 2.-~etenninacibn de proteina por e l método de Biuret (3'7) ).-Detewinacibn de l a actividad de l a sdenoaintrifoaf_a

taea (ATPasa) midiendo foefáto liberado (Pi) por un - m 8 t oao coiorimétrico (33- 39 1. 4.-El medio ae incubacibn contiene: 'Sacarosa .25& KC1

jOmM, ATP &A¶, Tea 10mM.

5.-Las mitoconarias se encuentrau en e l medio a l m g / m l

6.-Los iondforcs se encontraran en e l medio a lug/ml

.,. .

CROWOORAMA (GRAFICA DE ACTIVIDADBS VB. TIBMPO

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