EVALUACION DE UN MÉTODO PARA CUANTIFICAR TROPONINA I CARDÍACA CON

ALTA SENSIBILIDAD

Dra. Amparo Galán Hospital Universitario Germans Trias i Pujol.

Badalona . Barcelona

CONTENIDO

I. EVOLUCIÓN DEL DIAGNÓSTICO BIOQUÍMICO DE DETECCIÓN DEL SÍNDROME CORONARIO AGUDO (SCA)

II. EVALUACION ANALÍTICA DE UN MÉTODO PARA CUANTIFICAR TROPONINA I CARDÍACA, MEDIANTE TECNOLOGÍA LOCI®, EN EL ANALIZADOR DIMENSION® EXL™

EVOLUCIÓN DEL DIAGNÓSTICO BIOQUÍMICO DE DETECCIÓN DEL SÍNDROME CORONARIO AGUDO (SCA)

Hasta 1999 : Criterios de la OMS (Circulation 1979;59:607-09)– Marcador de elección : actividad catalítica de CK y su

isoenzima MB.– Deben de cumplirse dos de los siguientes tres criterios : Dolor

precordial, cambios en ECG específicos, alteración enzimática.

Sin embargo, durante la década de los noventa se comercializan y utilizan marcadores cardíacos más sensibles y específicos que las clásicas enzimas, como la concentración proteíca de la isoenzima MB (CKMBmasa) o la Troponina .

En 2000 : Redefinición de IAM :(Documento de consenso entre TheJoint European Society of Cardiology y American College of Cardiology) (European Heart Journal 2000;21:1502-13)– Imprescindible la alteración de los marcadores bioquímicos:

(Troponina o CKMB masa) – acompañado de síntomas de isquemia o alteraciones en el ECG.Do

ACTINAACTINA ACTINAACTINA

TROPOMIOSINA

I

TROPONINA

C

T

MIOSINA

I C

T

REPOSO CONTRACCION

Ca++

ATP

ADP+P

FilamentoFilamentogruesogrueso

FilamentoFilamentodelgadodelgado

MUSCULO ESQUELETICO

MIOSINA

A.GalánMed Clin 2000;115:671-76

ISOFORMAS DETROPONINA I

MúsculoEsquelético(rápido)

MúsculoEsquelético(lento)

Músculocardíaco

N C

31

55

109 123 146

215

211

Heterogeneidad 69%

Músculocardíaco

Heterogeneidad 44%

209

ISOFORMAS DE TROPONINA I

PM24000

PM19.800

A.GalA.Galáán y n y colscols. . MedMed ClinClin 2004;123:5512004;123:551--66

Las formas de troponina (I y T) de músculoesquelético y cardíaco :

•Están codificadas por genes diferentes. •Poseen estructuras perfectamente diferenciadas•Son reconocidas por inmunoensayos específicos

•La troponina (I o T) valora específicamenteel daño miocárdico aún en presencia de lesión de músculo esquelético

CARDIOESPECIFICIDAD DE LA TROPONINA

ESPECIFICIDAD ANALÍTICA TROPONINA I Reacciones Cruzadas

012345678TR

OP

ON

INA

I (n

g/m

l)

MÚSCULOESQUELETICO

(cuadriceps)

MÚSCULOESQUELÉTICO

(biceps)

MIOCARDIO

CITOSOLICAMIOFIBRILAR

A.Galán y cols.J Automated.Methods,2002;24(2):51-7

Problemáticas en la implementación de Troponina

• Es tan útil la troponina?• Qué método de troponina es el ideal?• Qué punto de corte hay que elegir?• Qué marcador o marcadores se deben

seleccionar?• Qué intervalos de tiempo deben usarse?

RECOMENDACIONES DE SOCIEDADES CIENTÍFICAS EN EL MANEJO DE MARCADORES CARDÍACOS

Ya en 1999 : The National Academy of Clinical Biochemistry (NACB) (ClinChem 1999;45:1104-21) publica las primeras Guias de Práctica Clínica para el uso de Troponina como Marcador cardíaco estableciendo recomendaciones analíticas y Clínicas. DoEn 2001 : El Comité de standarización de marcadores cardíacos de la IFCC se decanta por la Troponina como marcador de elección de necrosis miocárdica y establece recomiendaciones de calidad analítica y preanalítica para los ensayos de Tn. ,(Clin Chem Lab Med 2001;39:174-8)

Estimulando a los laboratorios clínicos su utilizaciónInduciendo a los fabricantes a mejorar la calidad analítica de los métodos de valoración de Tn.

Principales puntos oscuros del manejo de Troponina

• Elección del punto de corte• Falta de estandarización los métodos de TnI• Baja sensibilidad de los métodos

Estos factores pueden producir confusión

en la interpretación de resultados

ELECCIÓN DEL PUNTO DE CORTE Y/0 VALORES DE REFERENCIA?: discrepancias de criterios entre las Sociedades

Científicas

- Curvas ROC de sensibilidad y especificidad diagnóstica : * 2 puntos de corte (IAM y daño

miocárdico)(NACB)

* 1 solo punto de corte

- Valores de referencia en la población normal:percentil 95 (NACB) / percentil 99 (ACC)

NACB : National

Academy of

Clinical

BiochemistryACC: Colegio Americano de Cardiologia

SOLUCIONES

Obtención de un MATERIAL DE REFERENCIAinternacional

(IFCC,AACC)(NIST)

(SRM # 2921(2006)

A largo plazo

Elegir el inmunoensayoque mejor se

adapte a lainfraestructura

del centro

Exigir la documentación técnica al fabricante

o EVALUAR el método

Solución inmediatapara el usuario

PROBLEMÁTICA

Falta de estandarizaciónde métodos de TnI

No hay transferibilidad

de resultados entremétodos de TnI

Variacionesen los

límites de corte, valores de

normalidad, rangosde linealidad

Dificulta la eleccióndel método

Confusion por lavariabilid analítica yclínica de resultados

- Heterogeneidad de las formas de Tn en sangre.- Los anticuerpos de los EIA, detectan epítopos

diferentes de las formas libres y los complejos

Relativa sensibilidad

PROBLEMÁTICA DE LOS MÉTODOS INICIALES DE Tn

Incerteza en la sensibilidad diagnóstica

de la detección de necrosis

Coeficientes de variación elevados, a niveles

próximos del límite inferior de los valores de referencia

Aconsejar la utilización de métodos para valorar Troponina: con la MAYOR SENSIBILIDAD analcon la MAYOR SENSIBILIDAD analíítica posibletica posible , para aumentar la sensibilidad diagnsensibilidad diagnóósticastica de la prueba en la necrosisnecrosismiocmiocáárdica.rdica.

Así como evitar los problemas que surgen a partir de la falta falta de de standarizacistandarizacióónn de los métodos que miden TnI, problema aún NO RESUELTO.

OBJETIVOS DE CALIDAD ANALÍTICA DE LAS SOCIEDADES CIENTÍFICAS EN EL MANEJO DE

MARCADORES CARDÍACOS

Recomendaciones de la SEQC para el uso de marcadores bioquímicos de lesión miocárdica (ii)

Métodos de Troponina• Cada laboratorio debe evaluar susmétodos, establecer sus valores de referencia, así como sus valores de corte . •

Aconsejamos utilizar como punto de

corte de daño miocárdico un valor en el que el coeficiente de variación interserie del ensayo sea inferior al 10% .

A.Galán y cols.Quim Clin 2003;22(1)29-32

GUIAS ACTUALESGUIAS ACTUALES DE PRÁCTICA CLÍNICA DE SOCIEDADES CIENTÍFICAS EN EL MANEJO DE MARCADORES CARDÍACOS

En 2007, The Joint ESC/ACF/AHA/ WHF Joint ESC/ACF/AHA/ WHF Task ForceTask Force 20072007 ((European European HeartHeart J. J. 2007;28:25252007;28:2525--25382538):

• Publica las últimas Guias de Práctica Clínica sobre las recomendaciones del del diagndiagnóóstico bioqustico bioquíímico de deteccimico de deteccióón del SCA n del SCA

• Redefinen los criterios de Infarto de Miocardio estableciendo una definicioninicion universal de IAM. universal de IAM.

• La recomendación (clase I):-- En presencia de evidencias clínicas (síntomas o alteraciones en el ECG),

concentraciones de Troponina sérica superiores al percentil 99 del intervalo de referencia del método, (con óptima precisión analítica CV<10%), son indicativas de necrosis de miocardio

- Sino se dispone de Troponina la medición de CKMB-masa es otra aceptable alternativa. – La extracción de sangre debe llevarse a cabo al ingreso del paciente y a las 6-9 horas

GUIAS ACTUALESGUIAS ACTUALES DE PRÁCTICA CLÍNICA DE SOCIEDADES CIENTÍFICAS EN EL MANEJO DE

MARCADORES CARDÍACOS

Estas Guias están en consonancia con las últimas recomendaciones analíticas, para el uso de Troponina publicadas en 2007 por The National Academy of ClinicalBiochemistry (NACB) y El Comité de Standarización de marcadores cardíacos de la IFCC ((ClinClin ChemChem 2007; 53(4):5472007; 53(4):547--551551))que recomiendan que para: que recomiendan que para:

- Establecer valores de referenciaEstablecer valores de referencia. Se debe aplicar el aplicar el percentil 99percentil 99 sobre una población de un mínimo de 120 sujetos exentos de daño miocárdico. Se requiere que la imprecisión del método en el percentil 99 elegido sea inferior o igual a un coeficiente de variación del 10%.

Métodos de Troponina de Nueva Generación

Métodos de alta Sensibilidad

Que detecten Tn en el percentil 99 del intervalo de referencia, con ALTA PRECISIÓN ANALÍTICA

Detecten con fiabilidad el diagnóstico precoz de la necrosis

y la estratificación de riesgo miocárdico

Que cumplan las recomendaciones de las Sociedades científicas

OBJETIVO DE LA EVALUACIÓN

Comprobar si el método de medición de troponina I con tecnología LOCI® cumple las condiciones de alta sensibilidad analítica requeridas en las últimas recomendaciones de la Guias de Práctica Clínica de las Sociedades Científicas.

Comparar los resultados con los obtenidos con el inmunoensayo de lectura espectrométrica que utiliza el analizador Dimension®® RxL

MATERIAL

• Analizador automático Dimension® RxL (Siemens) • Analizador automático Dimension® ExL™ (Siemens)• Reactivos y calibradores CTNI ( Inmunoensayo heterogeneo)

(Siemens)• Reactivos y calibradores TNI ( Módulo LOCI® ) (Siemens)• Plasma (heparinato de litio) de pacientes exentos de

alteraciones cardíacas • Plasma (heparinato de litio) de pacientes con SCA • Sueros control Dade y Bio Rad• Mezcla de plasmas (heparinato de Litio)• Paquete estadístico SPSS 15.0

ASPECTOS ENSAYADOS

• Estudio de imprecisión • Estudio de inexactitud• Estudio de la sensibilidad

– Estudio del límite de detección – Estudio de la linealidad a nivel de concentración baja – Estudio de la sensibilidad funcional.

• Establecer valores de referencia (percentil 99)• Correlación con el método usado en Dimensión® RxL

Procedimiento metodológico(i)• Imprecisión e inexactitud : Se analizan replicados de dos tipos de

sueros control, a tres niveles de concentración, durante 20 días diferentes.– Se calcula el valor medio, SD y CV(%) , así como el porcentaje de

inexactitud .• Límite de detección : Se procesa el diluyente (CTNI ADIL) durante

cinco días diferentes por triplicado. – Se calcula el percentil 99 de los resultados.

• Sensibilidad analítica : Se estudia la linealidad del método a niveles bajos, utilizando:

• calibradores a niveles < 0.7 ng/mL, • y sueros control diluidos, por debajo de una concentración de

0.1 ng/mL. – Se procesan durante tres días diferentes por triplicado (n=9). – Se calcula la recta de regresión de mínimos cuadrados, así como la

mínima concentración medible con un coeficiente de variación < 10%.

Procedimiento metodológico (ii)• Sensibilidad funcional. Se prepara un pool de sueros de

concentración inferior a 0,2 ng/mL, y se diluye con diluyente para obtener diferentes concentraciones. – Se realizan alícuotas que se congelan (-20ºC). – Se mide en ellas la concentración de troponina durante 20 días por

duplicado.– Se calcula la concentración mínima medible con un coeficiente de

variación inferior al 10% (limite de cuantificación) • Límite de cuantificación: . El cálculo a utilizar es:

- La aplicación de la fórmula de aproximación de decaimiento no lineal Y = A*X^B + C*X^D ( programa Graphpad) donde Y=(CV) y X: Conc de TnI

- o la interpolación lineal entre los dos puntos circunscritos.

Procedimiento metodológico(iii)

• Valores de normalidad : Se calcula el percentil 99 de una población de 82 pacientes (46 mujeres y 36 varones) con edades comprendidas entre (20 y 61años) exentos de patología cardíaca.

• Correlación con otro método de troponina: Se procesan, por ambos métodos, sueros de 41 pacientes a los que se solicita este parámetro , con niveles de concentración de la proteína entre 0 y 57ng/mL. – Se calcula la recta de regresión de mínimos cuadrados y el coeficiente de

correlación de Pearson entre los resultados obtenidos.

Estudio de la imprecisión interserial

Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3

n 20 20 20 Media TnI (ng/mL) 0,127 1,184 4,260

Desv. Tip. 0,0066 0,0319 0,0826

Coef. Variación (%) 5,20 2,69 1,93

Imprecisión con controles Bio-Rad

Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3n 20 20 20

Media TnI (ng/mL) 0,331 1,39 15,61Desv. Tip. 0,0295 0,1146 0,900

Coef. Variación(%) 8,91 8,20 5,76

Imprecisión con controles Dade

Estudio de la inexactitud

Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3n 20 20 20

TnI teórica (ng/mL) 0.15 1,40 4.40

TnI observada (ng/mL) 0,127 1,184 4,260

% inexactitud - 15.3 -15.7 -3.1

Imprecisión con controles Bio-Rad

Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3n 20 20 20

TnI teórica (ng/mL) 0.31 1.43 14.9TnI observada (ng/mL) 0,331 1,39 15,61

% inexactitud 6.4 2.7 4.6

Imprecisión con controles Dade

Limite de detección

Los sueros solo pueden tratarse con diluyente

AGUA Suero fisiologico

Diluyente *

N 5x3 5x3 5x3Media 0,06566 0,05644 0,00076

Des. Tip 0,00655 0,00838 0,00202

Percentil 99 0.0790 0.065 0.007

Estudio del límite de detección

Estadísticos:

N : 20

Media : 0,0007619

Percentil 1 : 0,000

Percentil 50 : 0,000

Percentil 99 : 0,0070

0

0,2

0,4

0,6

0,8

0 0,2 0,4 0,6 0,8Troponina teórica(ng/mL)

Trop

onin

a ha

llada

(ng/

mL

y = 0.926 x + 0.003(r=0.998; p=0.00)

calibradores (n= 3x3)

Límite inferior del rango de linealidad realizada con calibradores (3x 3)

0

5

10

15

20

25

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,30,02 Conc de Tn (ng/mL)

CV (%)

Coeficientes de variación en el límite inferior del rango de linealidad

Realizado con calibradores

LLíímite inferior del rango de mite inferior del rango de linealidad : 0.02 linealidad : 0.02 ngng/mL/mL

Linealidad del método a concentraciones bajasrealizada con controles diluidos (n = 3x2)

y=0.963 x + 0.003r = 0.998 ; p = 0.000

00,020,040,060,080,1

0,12

0 0,05 0,1 0,15

concentraciones teóricas (ng/mL)

Con

cent

raci

ones

ha

llada

s

y=0.963 x + 0.003r = 0.998 ; p = 0.000

Coeficientes de variación en el límite inferior del rango de linealidad

Realizado con controles

0

5

10

15

20

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12Conc de Tn (ng/mL)

CV

(%)

0.028

Sensibilidad Funcional con pool de sueros (n=20)

05

1015202530

0 0,05 0,1 0,15 0,2

Conc. media de Troponina I (ng/mL)

Coe

ficie

nte

de

varia

ción

(%)

0,058

Límite de cuantificación:concentración mínima medible con un

CV < 10%.

Valores de Normalidad

El percentil 99 de los valores de Normalidad (trabajando a coeficientes de variación < 10% es de 0.0700

82N =

LOCI

,08

,06

,04

,02

0,00

-,02

162677

25

35350

42

LOCI

,069,063

,056,050

,044,038

,031,025

,019,013

,0060,000

Histogram

Freq

uenc

y

50

40

30

20

10

0

Std. Dev = ,02 Mean = ,010

N = 82,00

Stadisticos:

n : 82

Media: 0.0101

Percentil 1 : 0.0000

Percentil 50: 0.0005

Percentil 99: 0.070

0

10

20

30

40

50

60

70

0 10 20 30 40 50 60

TNI RXL

TNI E

XL

CorrelaciCorrelacióón: n:

n = 41 r =0.997 p=0.000n = 41 r =0.997 p=0.000

Correlación Troponina Dimensión RXL-EXL

Recta de regresión:

EXL= 1.149 RXL + 0.41EXL= 1.149 RXL + 0.41

Diferencias de Sensibilidad Diferencias de Sensibilidad nalnalííticatica entre el mentre el méétodo de todo de Troponina I con medida Troponina I con medida espectromespectroméétricatrica (RxL) (RxL)

versus LOCI (versus LOCI (ExLExL))RxL RxL ((insertinsert))

ExLExL--LOCILOCI(evaluaci(evaluacióón)n)

IncrementoIncrementoSensibilidadSensibilidad(datos (datos insertinsert RxL)RxL)

IncrementoIncrementoSensibilidadSensibilidad(seg(segúún nuestra n nuestra experiencia con experiencia con RxL )RxL )

LLíímite de deteccimite de deteccióón (n (ngng/mL)/mL) NVNV 0.0070.007

LLíímite inferior en el rango de mite inferior en el rango de linealidad con CV < 10% linealidad con CV < 10% ((ngng/mL)/mL)

0.040.04 0.020.02 2 veces2 veces 7.5 veces 7.5 veces

Sensibilidad funcional: Sensibilidad funcional: LLíímite de cuantificacimite de cuantificacióón CV n CV < 10% (< 10% (ngng/mL/mL))

0.140.14 0.0580.058 2.4 veces2.4 veces 5.8 veces 5.8 veces

Valores de normalidad:Valores de normalidad:Percentil 99 (CV< 10%) Percentil 99 (CV< 10%) ((ngng/mL) /mL)

00--0.07 0.07 (CV: 15- 22%)

00-- 0.070.07 NVNV 5.7 veces5.7 veces

Conclusiones

El método evaluado presenta una sensibilidad analítica muy superior al comparado (IAE espectrométrico del Dimensión RxL).

Los estudios de imprecisión denotan buena calidad metrológica.Su límite de cuantificación (0.058 ng/ml) (cv <10%), es inferior

al percentil 99 de los valores de referencia (entre 0 y 0.070 ng/ml) encontrados para el método , por lo que cumple las recomendaciones de las Guias de Práctica Clínica de las principales Sociedades Científicas para la detección del SCA.

Desde el punto de vista de la practicabilidad es una importante mejora de calidad diagnóstica para la plataforma analítica de los equipos Dimension, y por ello para la Urgencia Médica.

Muchas gracias por su atención…!!!