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Troubleshooting Viales: Revisión de parámetros

clave en sistemas de inyección

Presentan: Esmeralda Moliner & Olatz Mitxelena Chat: Bàrbara Bagó, Marta Burrull y Sandra Salvador


Desafíos en los laboratorios

Realizar y asegurar la exactitud de los resultados cromatográficos a través de un enfoque de garantía de la calidad.

Minimizar el tiempo empleado en el diagnóstico de problemas o malfuncionamiento.

Trabajar con métodos robustos que aporten resultados sólidos, fiables y duraderos.


Botella- Bomba Autoinyector Columna Detector Fase móvil

Tiempo de retención Área

Linearidad

Resolución

”Tailing” Nº platos

Ruido/drift

Mapa origen malfuncionamiento


Autoinyector y Viales

Viales: a menudo lo último en considerar en caso de problemas*, aunque puede ser el mejor punto de inicio a revisar en la resolución de problemas.

(*) Problemas: - Forma de pico - Área/sensibilidad - Linealidad - Contaminación cruzada - Contaminación: picos fantasma - Paradas imprevistas equipo


Agenda

Origen problemas cromatográficos relacionados con el inyector

Contribución de los viales a los problemas – Aspectos Dimensionales – Aspectos Composición/Químicos

Viales Certificados: la calidad de los viales y su contribución

a la calidad de los análisis LC Combinación óptima vial/inyector/método

– Septum – Tapón – Vial

o Volumen muestra limitado o Pequeños volúmenes de inyección


Origen problemas en Inyector

Inyector – Parámetros programados erróneamente – Aire en la jeringa de muestra o jeringas de lavado – Volumen de inyección inconsistente o fuera de rango – Loop de muestra obstruido – Loop de muestra mal configurado – Tornillos y férrulas del loop fijadas incorrectamente – Jeringa dañada o mal configurada – Jeringa contaminada – Fuga por las válvulas – Fuga por el sello – Insuficiente volumen de muestra en el vial para realizar la inyección – Vial colocado en una posición equivocada – Utilización de viales no adecuados – Solventes de inyector inadecuados


Posibles problemas relacionados con sistema de inyección: “Carryover”

Problema Origen Inyector Solución

Más picos de los esperados o mayor área de la esperada

Carryover: compuestos que se arrastran de una inyección anterior. Puede deberse a: 1. Inyector no se limpia suficente en

cada inyección

a. Sistema de limpieza de aguja no funciona

b. Disolventes de limpieza de inyector inadecuados

c. Tiempo programado de limpieza insuficiente

d. Solventes de inyector contaminados

e. Viales inadecuados: fuente de contaminación

2. Columna no se limpia bien en cada

inyección

Chequear el equipo para diagnosticar origen de contaminación (documento de ayuda: diagnóstico de contaminación). Determinar si carryover es en columna y/o inyector. a. Revisar inyector y reemplazar piezas

defectuosas

b. Revisar los solventes de limpieza de inyector y sustituir por unos más adecuados al método

c. Aumentar tiempo/volumen de limpieza en el método

d. Hacer una inyección a full loop, si la cromatografia es ok, el solvente de limpieza está contaminado.

e. Descartar viales como fuente de contaminación (cambiar vial, eliminar tapón)

- Incrementar fase de limpieza en gradiente o tiempo entre inyección e inyección

?


Posibles problemas relacionados con sistema de inyección: Forma de pico

Problema Origen Inyector Solución

Picos anchos ó picos con cola

Volumen de inyección o concentración de muestra demasiado elevada Diluyente de muestra demasiado orgánico respecto a la fase móvil Solvente de purga del inyector con demasiada proporción de orgánico Modo de inyección inadecuado en inyectores donde se existen opciones de modo de inyección Tornillo o férrulas conectadas de modo incorrecto y generan volumen muerto

Reducir a la mitad el volumen de inyección para chequear si es el problema, diluir la muestra si es necesario Chequear y sustituir si es necesario. Diluir la muestra con fase móvil si es posible Solvente de purga debe tener composición similar a la de la fase móvil inicial respecto al porcentaje agua/orgánico y debe ser compatible con el diluyente de muestra Probar con otro modo de inyección. Por ej con Full loop puede que inyectemos demasiada cantidad de muestra en la columna. Chequear conexiones y conectarlos correctamente


Forma de pico y consecuencias

Problema

Origen Inyector Solución

Picos con hombros o fronting Picos inacabados

Volumen de inyección demasiado grande o sample overload, demasiada concentración Diluyente de muestra demasiado orgánico Composición de solvente de purga del inyector demasiado orgánico Volumen inyectado o concentración de muestra demasiado elevada

Diluir la muestra o reducir volumen de inyección. Reducir volumen de inyección ó disminuir porcentaje de orgánico del diluyente Solvente de purga del inyector debe tener composición similar a la de la fase móvil inicial Diluir la muestra o reducir volumen de inyección


Posibles problemas relacionados con sistema de inyección: Pérdida de sensibilidad

Problema


Línea de base plana Pérdida de sensibilidad

No se ha inyectado Aguja o loop obstruido Volumen de inyección incorrectamente programado Inyector mal configurado Concentración insuficiente La muestra no está completamente disuelta o precipita a lo largo del tiempo. Muestra se evapora o degrada Muestra adherida a vial o partes de inyector (ejemplo aguja de peek, los compuestos hidrofóbicos se enganchan a ella)

Revisar suficiente volumen de muestra en vial, vial en correcta posición, test de pesada para saber si aspira muestra Sustituir aguja o loop Chequear el volumen de inyección Chequear volumen de loop y aguja. Caracterizar de nuevo volumen de loop y aguja si procede Aumentar concentración o volumen de inyección Chequear su solubilidad y si hace falta elevar la temperatura del compartimento de muestras (a temperaturas bajas puede ser insoluble) Disminuir la temperatura del compartimento de muestras Utilizar viales adecuados (desactivados, plástico). Utilizar piezas inyector adecuadas (probad otro tipo de agujas)


Posibles problemas relacionados con sistema de inyección: Pérdida de sensibilidad Problema


Pérdida de sensibilidad

Aguja calibrada demasiado alta, o mal programada en el método Disolventes de inyector: demasiado orgánico, resulta en mala forma de pico, especialmente para los compuestos más hidrofílicos Jeringa de muestra: No se han purgado o hay burbujas. Jeringa de muestras mal configurada Fuga en el inyector (jeringa, loop, aguja…) Velocidad de aspiración de la jeringa demasiado alta. Puede coger burbujas Burbuja de aire en el fondo del vial, habitual en los insertos Volumen de muestra dentro del volumen residual del vial o placa Efecto vacío/presión vial

Realizar de nuevo calibración Z de la aguja. Comprobar la posición de la aguja en el método si procede Cambiar la composición de solventes de inyector Purgar el inyector y chequear la jeringa Chequear configuración del inyector Realizar test de inyector, Chequear fugas en las conexiones del inyector Cambiar la velocidad de aspiración en el método Poner volumen de muestra superior al volumen residual Vigilar volúmenes residuales de cada tipo de vial o placa Utilizar septum pre-slit


Posibles problemas relacionados con sistema de inyección: cambios tiempo de retención

Problema Origen inyector Solución Decremento progresivo en el tr Incremento progresivo en el tr Cambio del tiempo de retención a un nuevo valor fijo

Diluyente de muestra es más fuerte que fase móvil Volumen de inyección y concentración excesivos En modos de inyección Partial loop con presión asistida con el solvente de purga diferente de fase móvil

Reducir el volumen de inyección o bien diluirlo con fase móvil. Si se utiliza un solvente más débil que la fase móvil, se puede inyectar un 10% del volumen de la columna, pero si este solvente es más fuerte, tan sólo un 1%. Reducir el volumen de inyección o bien diluirlo con fase móvil. Si se utiliza un solvente más débil que la fase móvil, se puede inyectar un 10% del volumen de la columna, pero si este solvente es más fuerte, tan sólo un 1%. Chequear o cambiar solvente de purga del inyector por una adecuado y caracterizarlo


Agenda








Reproducibilidad succión volumen de muestra Evaporación Diseño de Aguja– elección correcta de vial Desplazamiento y descorazonamiento de septum Inyector dañado– parada instrumento

Mechanical Issues

Total Recovery Max Recovery QSert

1.- Aspectos Dimensionales


Síntoma – área de pico aumenta tras primera inyección del mismo vial

o Primera inyección– área de pico menor o Inyecciones posteriores– área de pico mayor

Posible causa: – Inadecuada ventilación –formación de vacío

o Vacío provoca succión parte de muestra en la retirada de la aguja (cuando sale del vial)

Test – confirmación – Eliminar la tapa y septum del vial – Realizar múltiples inyecciones – Área de pico consistente– el problema era el vacío: Septum Pre-slit

1.1.- Variación succión muestra


1.1.- Variación succión muestra Recomendación

Recomendación – septum “pre-slit” para precisión de succión de muestra

Ante la necesidad de usar septum no “pre-slit” (relacionado con evaporación) – Consejo:

o Dejar espacio frontal– no llenar el vial hasta el tope


1.2.- Evaporación

Pérdida de solvente– septum resellable – Slit y no slit (PTFE/silicona)

Pérdida de solvente– septum no resellable Pérdida de Analito de la muestra


1.2.- Evaporación – septum resellable

Estudio evaporación: septum (PTFE/silicona) pre-slit vs no slit – Acetona – volátil (T ambiente~ 20° C)

o Septum perforado con Aguja Alliance o 20 viales para cada condición

Non Slit SlitNo pierce 2 hours 0 0

3 days 0.16% 2.16%

Pierced 2 hours 0 03 days 1.53% 3.20%


Pérdida evaporación– septum no resellable

PTFE solamente – no resella– gran pérdida PTFE / silicona – resella Temperatura ambiente~ 20° C

-08%

-07%

-06%

-05%

-04%

-03%

-02%

-01%

00%

0 5 10 15 20 25 30

% lo

ss

Hours

Evaporative Loss 50/50 Acetonitrile/Water

PTFE – does not reseal

Slit PTFE/silicone –does reseal


Pérdida Evaporación Analito

~1.5% pérdida evaporación~ 10° C Concentración Analito varía

– Naftaleno (neutral + menor MW) evapora – Componentes polares(ej: propranolol) no

QCRM 186006363 Methanol/20 mM potassium phosphate

-100000

-80000

-60000

-40000

-20000

0

20000

40000

60000

0 20 40 60 80

Ch

ang

e P

eak

Are

a

Hours in Vial

Analyte Concentration

propranolol

amitriptyline

butyl paraben

naphthalene

dipropyl phthalate

acenaphthene

propranolol

naphthalene

amitriptyline

butyl paraben

dipropyl phthalate

propranolol amitriptyline naphthalene % Change 19.73% 19.23% -62.59% MW 296 277 128 BP 435°C 398°C 78°C

http://www.google.com/url?url=http://lifeinthefastlane.com/toxicology-conundrum-044/&rct=j&frm=1&q=&esrc=s&sa=U&ei=-z72U8X6GqzNsQTuuICwCA&ved=0CCoQ9QEwCg&usg=AFQjCNG1m9gJumfLy8RraD8LoZCw85vKUg

http://www.google.com/url?url=http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Amitriptyline-2D-skeletal.png&rct=j&frm=1&q=&esrc=s&sa=U&ei=5ED2U87gGZLnsAS0zILwAw&ved=0CCAQ9QEwBQ&usg=AFQjCNEDom5zyadyr0RxOtH_9bwVwdT_9A


1.2.- Evaporación Recomendaciones

Considerar Volatilidad Analito /solvente Tiempo que muestra permanecerá en los viales tras la primera

inyección de aguja Habilidad de resellado del septum Opciones Tiempos de análisis cortos:

– Muchas posibilidades- incluyendo septum que no resellable

Tiempos de análisis largos: Requiere septum resellable o septum no slit – Re-inyectar muestra – mucho tiempo tras inyección inicial

o Dividir muestra en más de un vial o Refrigerar muestras nuevo tapón entre usos


1.3.- Diseño de aguja

Diseños de aguja diferentes – Aguja ACQUITY UPLC H-Class con

orificio de succión en extremo – Aguja Alliance– aguja sólida, orificio

de succión lateral – Aguja “Fixed Loop” ACQUITY UPLC

con aguja de punción– succión en extremo o Aguja de Muestra se desliza del

interior de la aguja de punción

Piercing Needle Sample Needle

H-Class – bottom draw

Bottom Draw



Combinación vial-diseño aguja para correcta adquisición muestra - p.e. Alliance® 2695 aguja orificio lateral

2 mL vial Total Recovery Vial



Aguja ACQUITY Maximum Recovery Vial – posiciona volumen limitado de

muestra al centro del vial para aguja de inyector de succión centrada en la punta

Max Recovery Vial

Bottom Draw Needle


1.3.- Diseño de aguja “Default offset”

Los sistemas de inyección tienen un “Default offset” o posicionamiento de aguja por defecto –Dirección Z – dónde para la aguja

“Needle offset” erróneo puede: –Inhabilidad de succionar suficiente muestra del vial –Volumen residual excesivo –Dañar la aguja –Dañar el vial


1.3.- Diseño de aguja Recomendaciones

Conocer especificaciones dimensionales del autoinyector Calibrar posicionamiento de aguja si procede Elegir diseño de vial para maximizar volumen de muestra

(volumen total y volumen residual)


1.3.- Diseño de aguja Recomendaciones

Selector Viales http://www.waters.com/app/selector/en/vials.html


1.4.- Desplazamiento y descorazonamiento de septum

Calibrar posicionamiento de aguja para evitar daños– eje Z Alinear autoinyector /rack viales o carrusel para punción

central del septum Sistemas no alineados y posición incorrecta de la aguja pueden

causar daños en la aguja y/o rotura del vial,

Capa Teflon

Capa Silicona


1.4.- Desplazamiento de septum Diseño aguja puntiagudo vs romo

Posibles razones para agujas redondeadas – La aguja se puede redondear al golpear

una superficie dura, entre otros – No visible a simple vista (el desplazamiento de septum suele ser

una señal o un warning en sistema de inyección)

Agujas redondeadas requieren 3-5 veces la fuerza para perforar el septum

Afilada

Redondeada Aguja redondeada


1.4.- Desplazamiento de septum Qué sucede en la punción

Con aguja afilada: Silicona es elástica y la aguja estira y separa.

Capa PTFE– estira hasta rotura– no tiene la memoria de la silicona

Con aguja redondeada: la silicona no

se separa, creando un hisopo aguja/silicona que ha de romper la capa de PTFE.

El septum cede hasta rotura de capa PTFE (puede verse afectado el resellado) o septum se desprende de la tapa


1.4.- Desplazamiento de septum Recomendaciones

No aplicar demasiada fuerza al enroscar el tapón Calibrar posicionamiento de aguja para evitar daños– eje Z Definir “Default Offset” adecuado Alinear autoinyector /rack viales or carrusel para punción

central del septum Utilizar tapones con septum adecuado y proporción óptima

capas Teflon/Silicona


1.4.- Descorazonamiento septum

Descorazonamiento o “Coring” – tapa o

septum demasiado dura (H-Class no recomendado “cap mat”).

[En ocasiones la congelación de muestra fragiliza material tapas]


1.5.- Aguja dañada

Aguja dañada al golpear superficie dura – Vial no adecuado (o no adecuado “Needle Offset”) – Puede alterar capacidad de resellado de la silicona al deformarla:

irreproducibilidad áreas


1.5.- Aguja dañada

Vial fuera tolerancia Vial Certificado Waters

Todos contenedores necesitan fondo arqueado para ser estables.

Para autoinyectores– anchura debe ser controlada.

Este fondo de vial podría causar daño de aguja y posible rotura de vial


1.5.- Aguja dañada Recomendaciones

Tapa placa y septum vial adecuados “Needle offset” en función del vial Dimensiones adecuadas vial:

• Altura • Anchura • Cuello • Rosca • Proporción Silicona/PTFE y características material

(rigidez, fragilidad) esencial • La anchura del fondo es muy importante para la

profundidad de aguja • El vial debe ser cilíndrico con septum centrado para

punción

¡Viales fuera de Tolerancias Dimensionales pueden causar daños en la aguja!


1.- Aspectos Dimensionales Resumen

Considerar el tipo de aguja del inyector – Calibrar posicionamiento de aguja, alineamiento

o Evitamos inyecciones fallidas y daños a aguja

Septum pre-slit recomendado para ventear y succión precisa repetitiva de muestra

Considerar viales adecuados para volumen de muestra limitado-recomendaciones de fabricante.

Los viales Certificados aseguran calidad


Picos fantasma (extraíbles vial) Degradación analito/muestra Adsorción Analito/muestra en vial

Mechanical Issues 2.- Aspectos Composición/Químicos

Vidrio (superfície polar Si-O-H)

Tapón (PP/PE, polímeros)

Septum (Silicona/PTFE, polímeros)


2.1- Picos fantasma

Fabricación Vidrio – proceso final de re-cocido o “annealing” – Resultado: superficie polar muy limpia y seca – Realza impurezas y facilita su adherencia – Pueden ser resíduos de:

o Procesado incompleto o Manipulación inapropiada o Empaquetado

Septum – PTFE/silicona

o Curado incompleto– picos (depende detector/sensitibilidad)

• ¡Cuidado!: evitar que el laboratorio sea el origen • Manipulación (rotulación, p.e.) y almacenaje • Instrumentación más sensible

Surfactantes, Lubricantes, Antiestáticos, Antioxidantes, Silicona bajo Mw


2.1- Picos fantasma Extraíbles septum

Resistencia a solventes (PTFE/silicona) – Agujas “Flow through” FTN (mayoría

inyectores Alliance y ACQUITY H-Class + I-Class )

– En inserción de aguja en septum, solvente lavado de aguja entra en contacto

– En retirada de la aguja – muestra/solvente “rascan” la aguja

Si re-inyectamos del mismo vial: o Contacto aguja con solvente de lavado

de inyección anterior o Si solventes pueden solvatar algo del

septum, la aguja conllevará a contaminación de la muestra

o Aparición de picos en segunda inyección y posteriores

Solvente Lavado de Aguja

Resistencia silicona vs PTFE/silicona ¿múltiples inyecciones?


2.1- Picos fantasma Extraíbles septum-Múltiples inyecciones

Alliance HPLC / ELSD, THF solvente lavado de aguja

Pico inesperado

Línea base verde, vial sin tapón

Resistencia silicona una vez pinchado PTFE/silicona


2.1- Picos fantasma Extraíbles septum- Recomendaciones

(Lavado Aguja 100% ACN)

Primera inyección

Varias inyecciones Polímero de Silicona solvatado

Soluciones: Química

– Menor % ACN lavado aguja

Elección producto – Usar septums mínimo sangrado

o TruView Septum tapa negra

Estrategia inyección muestra – Dividir muestra en diferentes

viales– evitar re-inyección / contaminación

Nota: Considerar que a mayor sensibilidad del sistema, requiere materiales más exigentes (Garantía Viales Certificados)


2.2- Degradación analitos

Analitos sensibles a la luz: viales ámbar filtran algunas longitudes de onda de la luz

Analitos sensibles pH: ¡cuidado! el vidrio puede aumentar el pH

de soluciones acuosas. Recomendaciones:

– Viales de plástico – Viales TruView– son neutros – Muestra tamponada


2.3- Adsorción analitos Más de un mecanismo de adsorción: El vidrio contiene intercambiadores iónicos, grupos silanoles, …la

superficie puede ser compleja y algunos analitos pueden tener gran reactividad (más crítico para concentraciones muy pequeñas)

Enlace no específico: p.e. Gentamicina


2.3- Adsorción analitos Recomendaciones

Viales vidrio desactivado (DV): vidrio tratado con organosilano para amortiguar silanoles superfície y hacer hidrófoba la superficie.

Viales TruView™: proceso patentado de vidrio Viales de plástico: polipropileno PP


Agenda








Viales Certificados

Testing LC/GC Certified LCMS Certified TruView LCMS CertifiedDimensions √ √ √Septum GC Test √ √ √HPLC UV Test - residues √ √ √MS Scan - ionizable masses and polymer √ √Low Adsorption Test - ng/mL level √

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Recommended

Analyte Concentration µg/mL 100's ng/mL ng/mL or lessDetection UV/ RI MS more sensitive MS

Key Features cleaner septa

low adsorption glass, cleanest/lowest bleed

septum

Certification Tests

Certificación para garantizar calidad dimensional-composicional de los viales en análisis LC


Viales Certificados


Viales Certificados Recomendaciones

Analyte Concentration Detection Source Recommended

Product

µg/mL UV, RI (non MS) LC/GC Certified Vials

100's ng/mL single quadrapole and older MS/MS LCMS Certified Vials

1 ng/mL and lower MS/MS Truview LCMS

Certified Vials


Agenda








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¿Sistema cromatográfico? ¿Autoinyector? ¿Detector? ¿Tiempo permanencia vial? ¿Solvente muestra? ¿Inyección única o múltiples inyecciones del mismo vial? ¿Volumen total a inyectar? ¿Disponibilidad muestra? ¿Características críticas analitos?


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