A. Prieto, C. Moldes, L.I. de Eugenio, J.L.García and P. García

Grupo de Biotecnología Medioambiental, Dpto. Microbiología MolecularCentro de Investigaciones Biológicas (CSIC), Madrid.

Contaminación por plásticos derivados del petróleo

Estimación de la producción mundial de plásticos:

100 millones de toneladas

Generación de residuos no biodegradables

Contaminación marinaAcumulación en el suelo

Reciclado Productos

alternativos:Los bioplásticos

Aumento de la emisión de CO2

Fuente no renovable

Poliésteres biodegradables

Alifáticos Aromáticos

PBS PCL PHA PLA

PHAscl PHAmclPET modificado AAC

PBS: polibutilén succinatoPCL: policaprolactonaPHA: polihidroxialcanoatoPHAscl: polihidroxialcanoato de cadena cortaPHAmcl: polihidroxialcanoato de cadena mediaPLA: ácido polilácticoPET: polietilén tereftalatoAAC: copoliésteres alifático-aromáticos

Origen natural-Fuentes renovables

Origen sintético-Fuentes renovables

Origen sintético-Fuentes no renovables

Gránulo de PHA

Pseudomonas putida GPo1

Propiedades del PHAPolímero plástico Biodegradable Fuentes renovables

•Producción de PHA en bacterias y plantas

Biocompatible Quiral

•Tejidos artificiales

•Implantes

•Material quirúrgico

•Fármacos de liberación sostenida

•Monómeros: Compuestos de interés industrial

Estructura química del PHA

OO

OO

CCCC CC

C3 -12 nn

Cadena lateral de los PHA(Incorporación de más de 150

monómeros diferentes)

PHAscl PHAmcl

-Saturados -Cianofenoxi-Insaturados -Nitrofenoxi-Ramificados -Epoxi-Metilester -Ciano-Bencil-ester -Halogenados-Fenoxi -Hidroxilo

La composición del PHA depende del sustrato utilizadoen la fermentación

Estudio de la viabilidadeconómica y de mercado

Diseño de nuevas rutas para

la producción de PHA mediante

ingeniería metabólica

Determinación de las rutas metabólicas implicadas en la producción

de PHA

Técnicasde

fermentación

Downstreamprocessing

Determinación de los genes responsables de la síntesis y degradación

del PHA

Productos de interés industrial

Monómerosquirales

PHA

Grupo génico pha de Pseudomonas putidaPcI

phaF phaIphaC1 phaZ phaC2 phaD

1 kb

Gránulo de PHA

PolimerasasDespolimerasa

Fasinas

PHA

El carácter bifuncional de la proteína PhaF

Proteínas asociadas al gránulo de PHA

PhaF

PhaI

kDa

976645

31

21

14

PhaI

PhaF

Motivo de unión al gránulo Motivo de unión a DNA

PHA

N-terminal de PhaF=Tag BioF

Dominio

N-terminal

PhaF

Dominio de unióna DNA

Proteína de fusión

PHA

BioFProteína

PHA

Inmovilización in vivo de proteínas de fusión a bioplásticos: El tag BioF

PHA

1) FERMENTACIÓN(Condiciones para la producción

de PHA)

Extracto crudo

4,000 × g

15 min

Tratamiento suave con

detergentes

3) AISLAMIENTO MEDIANTE CENTRIFUGACIÓN DE LA PROTEÍNA INMOVILIZADA EN EL GRÁNULO

4) LIBERACIÓN DE LA PROTEÍNA DE

FUSIÓN

2) Lisis celular

PFproteína

BioF proteína

Flyt(36kDa)

PHABioF

ChBD

P. putida GPG-Tc6

produciendo Flyt

6645

2114

31

7

kDa

P. putida GPG-Tc6

12

50

3021

112

36FlytChBD

kDa

Flac (130 kDa)

PHABioF

β-Galactosidasa

9766

45

31

200

2114

66

45

31

200

2114

Flac

21

RELATIVE β-GALACTOSIDASE ACTIVITY OF FlacPROTEIN DURING THE PROCESS

FRACTION % ACTIVITY

CRUDE EXTRACT 100SUPERNATANT 15ISOLATED GRANULES 60

RELATIVE β-GALACTOSIDASE ACTIVITY OF FlacPROTEIN DURING THE PROCESS

FRACTION % ACTIVITY

CRUDE EXTRACT 100SUPERNATANT 15ISOLATED GRANULES 60

ACTIVIDAD β- GALACTOSIDASA RELATIVADE Flac DURANTE EL PROCESO DE PURIFICACIÓN

FRACCIÓN % ACTIVIDAD

EXTRACTO CRUDO 100SOBRENADANTE 15GRANULOS AISLADOS 60

PURIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS DE FUSIÓN MEDIANTE

TRATAMIENTO CON DETERGENTES

kDa

66

200

97

45

1 2 3

116Flac

% Tween20 Tween80 Brij 58 DOC Sarkosyl Triton X-100 CHAPS CTAB

0.0015 - - - - 9 9 - - 0.015 - - - - 19 84 - - 0.15 13 34 29 13 98 92 - - 1.5 13 41 32 16 98 100 71 88

15 - - - - - - 82 100

RENDIMIENTO DE LA PURIFICACIÓN DE Flyt y Flac

2.8 x 10

0.1224 36.72 61.7 x 10-3 60.3 x 10-3

70 x 10-3 68.6 x 10-348.600.1848 2.8 x 105 2.2 x 105

Flyt

Flac

Protein CDW(g × L-1)

PHA(mg × L-1)

Protein immobilized(mg ×mg-1 of PHA)

Units ×mg-1 of protein immobilized (mg ×mg-1 of PHA)

Protein purified Units ×mg-1 of Pure protein

2.8 x 10

0.1224 36.72 61.7 x 10-3 60.3 x 10-3

70 x 10-3 68.6 x 10-348.600.1848 2.8 x 105 2.2 x 105

Flyt

Flac

Protein CDW(g × L-1)

PHA(mg × L-1)

Protein immobilized(mg ×mg-1 of PHA)

Units ×mg-1 of protein immobilized (mg ×mg-1 of PHA)

Protein purified Units ×mg-1 of Pure protein

RESUMEN DE RESULTADOS

•El dominio N terminal de la proteína PhaF de P. putida puedeutilizarse como tag (BioF) para inmovilizar proteínas en losgránulos de PHAmcl de forma simultánea a su biosíntesis en la célula.

• Inmovilización

• Purificación

• El sistema BioF es una nueva herramienta biotecnológica quepresenta ciertas ventajas frente a otros métodos de purificación e inmovilización de proteínas:

•Bajo coste

•Matriz biodegradable y biocompatible

•Procesos de fermentación a gran escala ya establecidospara la producción de PHA

Un biocida ecológico fusionado a BioF

Cristal de una toxina de tipo Cry1

Bacillus thuringiensis

Mecanismo de acción de las toxinas Cry de B. thuringiensis

Ingestión SolubilizaciónActivaciónproteolítica

Unión al receptor

Formación del poro

Fk-Bt1 Un biocida fusionado a BioF:

Cry1A(b) (1155 aa, 130.623 kDa)Toxina de Bacillus thuringiensis

PHAFormación Unión al Dominio de

del poro receptor cristalización

k-Bt1

PFk-Bt1BioF

Fk-Bt1 (88.64 kDa)

PFk-Bt1 Actividad insecticida

11392

52,9

92

52

kDa

35

PFk-Bt1

PFk-Bt1

Gránulos

S. nonagrioides Nº de larvas tratadas Larvas muertas

32 5

Fk-BT1

Control

2232

2631

322

PFk-Bt1

Características de la nueva formulación de insecticidas Bt:

•Soporte biodegradable: producto ecológico

•Material pegajoso: incremento de la persistencia del insecticida en la planta

•Control de la composición del producto: biocidas de diseño

•Ausencia de microorganis-mos recombinantes: producto final seguro

Dra. M. Auxiliadora Prieto (auxi@cib.csic.es)Dra. C. Moldes L. I. de Eugenio Prof. J.L. García

Grupo de Biotecnología MedioambientalDpto. Microbiología Molecular CIB-CSIC, Madrid

ColaboradoresDr. P. García (Dpto. Microbiología Molecular) Prof. P. Castañera (Dpto. Biología de Plantas)Biomedal S.L.

Estabilidad de las PFproteinas

M -70 -20 4 20 37 50 65 M -70 -20 4 20 65 50 37

Temperatura (ºC)C

pHM 9 8 7 6.5 6 5 4 3 M M 3 4 5 6 9 8 7 6,5

Fuerza iónica (mMNaCl)M 1000 500 50 5 0 M M 1000 500 50 5 0

3-Hydroxyacid/ester Application

O

OOH

F

F

F

Intermediate for the preparation of Befloxatone(MD-370503), an antidepressant (Phase III)

O

OOH Intermediate for the preparation of Xemilofiban(SC-54684) for antiplatelet treatment (Phase III)

O

OOH Intermediate for the preparation of Tomoxetinehydrochloride (LY -135252) for treatment ofattention deficit hyperactivity disorder (Phase III)

O

OOH Intermediate for the preparation of Sanfetrinemcilexetil (GV-118819), trinems (Phase III)

OH

OOH Intermediate for the preparation ofTetrahydrolipstatin (Ro-18-0647), Antiobesity drug (Launched-1998)

OH

OOH Intermediate for the preparation of Ono -4007, Oncolytic drug (Phase II)

OH

OOH Intermediate for the preparation of N -4909 fortreatment of lipoprotein disorders (Biologicaltesting)

OH

OOH Intermediate for the preparation of Hapalosin, anmultidrug resistance modulator (Biological testing)

O

OOH Citrus flavours

O

OOH Synthon in EPC synthesis

O

OOH

N

Intermediate for the preparation of Lipitor, a cholesterol-lowering drug (Launched, Pfizer)

2

Algunos ejemplos de (R) 3-hidroxiácidos o ésteres que podrían obtenerse del PHA y utilizarse para la síntesis de productos de

interés industrial

3-Hydroxyacid/ester Application

OH

OOH

X X = F, Cl, Br, INH

O

HO

OH

OO

synthons

OH

OOH

OBn

OH

OOH

OH O O

HO

synthons

OH

OOH

NHBn

OH

OOH

NH2NH

O

HO

synthons

OH

O

O

NH a Gabab antagonist (Sch50911)

O

OOH

Nn n = 1-10

O

OOH

H2N

O

n O

OOH

HO

O

n O

OOH

H2N n

NH

O

OH

n

NH

O

OH

R*

n

as synthons

OH

OOH

OBn

nn=2-10

OH

OOH

OH

n

O O

HO

n as synthons

OH

OOH

N

OH

ONH2

N intermediate for preparing Elarofiban(RWJ-53308) for antiplatelet therapy (Phase III)

OH

OOH

O

O

OH

ONH2

O

O

intermediate for preparing TBC-3486 andTBC-3342, antiarthritic and antiallergy drug (Preclinical)

OH

OOH

OH

ONH2

intermediate for preparing a anti -HIV agent (biological testing)

Modelo del carácter bifuncional de la proteína PhaFPcI

phaFI

PHA

phaC1 phaZ phaC2 phaD--

PcI

phaC1 phaZ phaC2 phaD phaFI

PfiPfi

Formación de PHA

?

Función estructural

Función represora de los genes pha

Condiciones de crecimiento que NO

favorecen la formación de PHA