Unidad 1. Cinetica y estequiometria de las reaccionesbiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/uploads/2010/04/Unid… · ] y } } W 9 u ] v ] v o s } o µ u v 9 } ] ] v } v ]

BIOREACTORES IBIOREACTORES IDOCENTE: ANGÉLICA MORALESE-MAIL : [email protected]

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Modalidad de las Clases: Teórico-Prácticas (22 horas)Aprobación: Asistencia obligatoria al 80% de las clases + aprobación de una evaluación de contenidos.

CEBI_E9 Angélica MoralesCEBI_E9 Angélica Morales

CONTENIDOS MÍNIMOSCONTENIDOS MÍNIMOS CinéticaCinética yy EstequiometríaEstequiometría dede laslas reaccionesreacciones: Definiciones. Ecuaciones cinéticas.Reacciones catalizadas por enzimas. Desactivación. ReactoresReactores idealesideales isotérmicosisotérmicos:: Reactores discontinuos, continuos y semi-continuos. Ecuaciones de diseño.


ReactoresReactores idealesideales NONO isotérmicosisotérmicos:: Diseño de reactores NO Isotérmicos. Reactoresadiabáticos. CinéticaCinética yy EstequiometríaEstequiometría deldel crecimientocrecimiento dede célulascélulas:: Crecimiento en cultivosdiscontinuos. Modelos cinéticos. Estequiometría. Medio de cultivo. Cultivos mixtos. ReactoresReactores parapara elel cultivocultivo dede célulascélulas:: diseño de reactores con crecimiento celular.Reactores discontinuos, continuos y alimentados (Fed-batch). Fed Batch: Diseño yoptimización. Quimiostatos: Diseño y optimización.

BIBLIOGRAFÍA…BIBLIOGRAFÍA…


CINÉTICA Y ESTEQUIOMETRÍA DE CINÉTICA Y ESTEQUIOMETRÍA DE REACCIONESREACCIONESUNIDAD 1UNIDAD 1


UNIDAD 1UNIDAD 1Estequiometria de las reacciones químicas simples (irreversibles y reversibles). Y múltiples(en serie, paralelo y semi-paralelo). Concepto de grado de avance de una reacción y deconversión. Definición de rendimiento y selectividad. Definición de velocidad de reacción.Factores que influyen sobre la velocidad de la reacción. Ecuaciones cinéticas. Energía deactivación. Cinética de reacciones catalizadas por enzimas. Expresión de Mikaelis-Menten. Expresiones cinéticas en presencia de inhibidores. Expresiones cinéticas ensistemas con desactivación.

INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN

Etapas de TratamientoUPSTREAMUPSTREAMEtapas de TratamientoDOWNSTREAMDOWNSTREAM

ReactorReactor

Reactivos Productos

• Parte principal del proceso• Modifica sustancialmente los costos


RecicloOperaciones Unitarias: UPSTREAMDOWNSTREAM

Diseño de reactores: Determinación del VolumenAsociación con principales condiciones de proceso (T, Conc, F)

Estequiometría / Cinética químicaFluidodinámicaTQ y TMEconomía

INTRODUCCIÓN…INTRODUCCIÓN…OBJETIVO: OBJETIVO: Incorporar conceptos que permitan diseñar reactores que utilizan material biológico:

EnzimasMicroorganismos

Células de animales


Células de animales

Estequiometría: Estequiometría: Conceptos básicos / DefinicionesCinética:Cinética:Definiciones / Efecto de la temperatura y la concentración de los reactivos

ESTEQUIOMETRIA Y CINÉTICAESTEQUIOMETRIA Y CINÉTICA


ESTEQUIOMETRIA Y CINÉTICA…ESTEQUIOMETRIA Y CINÉTICA…Estequiometría

Reacción QuímicacC + dD + …. – aA – bB - …. = 0


Variables que indican la evolución de una reacción química a lo largo del tGrado de avanceGrado de avanceConversiónConversión

Grado de avance o avance de reacciónGrado de avance o avance de reacción• Es un parámetro que permite medir el proceso de una reacción química.• Varia entre 0 y el número de moles iniciales del reactivo limitante.• Sirve para relacionar la concentración de todos los componentes

El grado de avance permite definir la velocidad de reacción


velocidad de reacciónVariable extensiva: Dependiente de la masa del sistema consideradoConveniente contar con una medida adimensional (entre 0 y 1)

Variable intensivaConversiónConversión

A tiempo 0, ni0= moles de la especie AiA tiempo t, ni = moles de la especie Ai

ConversiónConversión• Es una medida adimensional de la evolución de la reacción

Si “i” es una especie reactiva, inicialmente:ni = ni0 Xi = 0


0

Si reaccionó todo el reactivo que estaba presente inicialmenteni = 0 Xi = 1

Reactivo limitanteReactivo limitante

En adelante…La conversión La conversión de una reacción química dada se referirá al reactivo limitanteLa conversión La conversión de una reacción química dada se referirá al reactivo limitanteEl cual está dado por las cantidades presentes inicialmente en el sistema y por la estequiometría de la reacción.Las otras especies intervinientes se expresarán en función del reactivo limitante (k)


Ejemplo 1Ejemplo 1. (. (LLo vemos juntos!)o vemos juntos!)

Resolución…Resolución…


Resolución…Resolución…a) Determinación del Reactivo Limitante → Se calcula cual reactivo da el menor grado de avance (Conversión completa del mismo)

A es el Reactivo Limitante

Avance de la reacción cuando XA = 50% ??0,5 = nA0 - nAnA0nA0 – nA = 0,5 nA0

Por definición el grado de avancec = nA – nA0

n = - 0,5 nA0-4 = - 0,5 CA0

-4 = 0,125 M



c = nA= -4 = -4 = 0,125 M

V cteA partir del grado de avance se calculan las otras concentraciones:

b) Cuando CD = 0,3M → el grado de avance es ??

De la misma forma que en a) se calculan las concentraciones restantes:

c = CD – CD0nD

= 0,3M - 0-2 = 0,15 M



c) La mínima [C0] para no ser reactivo limitante:

Ejemplo Ejemplo 2 (Ver en casa…)2 (Ver en casa…)






CINÉTICA QUÍMICACINÉTICA QUÍMICA


CINÉTICA QUÍMICA…CINÉTICA QUÍMICA…

ni = No. moles de la sustancia iV = Volumenni = Grado de avanceCi = [mol/L]i

A Volumen constante,

Tiene el mismo valor cualquiera sea el componente evaluado


ir = de Rxn

La velocidad de aparición de un producto o desaparición de un reactivo, se define como:

r es siempre positiva ri es positiva para los producción (ni > 0) y negativa para los reactivos (ni <0) r (ni) y ri son válidas a volumen contante o variable

Ecuación cinéticaEcuación cinética La velocidad de reacción depende de la Temperatura,Temperatura, lala presiónpresión yy lala composicióncomposicióndeldel sistemasistema. Los catalizadores o inhibidores, si bien no aparecen en la ecuaciónestequiométrica, afectanafectan lala RxnRxn aún estando presentes en trazas.A temperatura constante, la velocidad de la reacción, generalmente decrece con elavance de la reacción.


avance de la reacción. La velocidad de la reacción se puede expresar por medio de una ecuación cinéticaque tiene en cuenta las variables temperatura,temperatura, presiónpresión yy concentraciónconcentración:

Constante denominada velocidad específica de reacción, que es función de la temperaturafunción de la temperatura de acuerdo a la Ley de Arrhenius

Función que depende de la concentración de las especies presentes en el sistema.

Ley de ArrheniusLey de Arrhenius Describe la variación de k con la temperatura (T)Cuanto > es T, > es el valor de la velocidad específica, k

Donde Ea = Energía de activaciónR = Cte universal de los gasesk = Factor pre-exponencial o factor de frecuencia: Es el valor de k a


kꝏ = Factor pre-exponencial o factor de frecuencia: Es el valor de k a Temperatura infinita. Temperatura infinita. En general, no es función ni de la T ni de las concentraciones.Si se grafica el ln(k) versus 1/T

De la pendiente se puede se puede determinar la energía de activación, EaLa ordenada de origen es ln (kꝏ)

Si 1/T →0 entonces T → ꝏY entonces kꝏ = k (T→ꝏ)

Ley de ArrheniusLey de Arrhenius

Si Ea1 > Ea2 entonces k1/k2 ↓ si T ↓


Las reacciones de Ea altas Ea altas se favorecen a altas temperaturasaltas temperaturasPara calcular kkꝏꝏ y Ea y Ea se deben hacer experiencias a distintas temperaturas con concentraciones similares

Ecuación cinéticaEcuación cinéticaInfluencia de las concentraciones de los componentesInfluencia de las concentraciones de los componentes

En general Ci puede ser cualquiera de los reactivosLa función f(Ci) puede tomar formas muy complejas

Los primeros investigadores de la cinética química encontraron que existen relaciones simples entre las velocidades de Rxn y las concentraciones de reactantes


Supóngase una reacción irreversible de desaparición de A:A → C Entonces r = kCAaA → C Entonces r = kCA mA orden de la reacción orden de la reacción respecto a AmA = a cuando la reacción es elementalmA ≠ a cuando nA > 2

aA + bB → cC + dDDonde mA es el orden de la reacción con respecto a A y mB es el orden con respecto a B.Σ de mA y mB es el orden general de la Rxn

Influencia de las concentraciones de los componentesInfluencia de las concentraciones de los componentesSupóngase una reacción irreversible de desaparición de A:

Difícilmente mA y mB tomen valores > 2


Difícilmente mA y mB tomen valores > 2 Si el mecanismomecanismo es complejo el orden puede ser fraccionario (Ej.: 3/2: Hidrocarburos). Si se conoce el mecanismo se establece un modelo matemático predictivosSi no se conoce el mecanismo se determinan mA y mB de modo experimental para el rango de concentraciones de la operación .

Mecanismo de RxnMecanismo de Rxn:Ecuación balanceada muestra: -Sustancias al inicio de la Rxn- Sustancias que se producen conforme avanza la RxnComo ocurre la Rxn??Describe con gran detalle el orden de ruptura y formación de enlaces y los cambios de las posiciones relativas de los atamos!

Ecuación cinéticaEcuación cinéticaMétodos para determinar ordenes de Rxn!!Métodos para determinar ordenes de Rxn!! IntegralDiferencialTiempo de vida mediaMETODO INTEGRAL

1) Se realizan determinaciones Cdeterminaciones CAA vs tiempovs tiempo2) Se supone un orden de reacción Se supone un orden de reacción y se integra la ecuación de velocidad3) La expresión de esta ecuación cinética para la especie A, que desaparece durante la

Se manipulan los datos de CAy t y se describen en términos de una Ec. Integrada, la cual después se linealiza


3) La expresión de esta ecuación cinética para la especie A, que desaparece durante la reacción y para un sistema con volumen contante, se puede describir como:

Para reacciones irreversibles de orden 1 mA = 1, nA = -1 A → PRODUCTOS

(1)

METODO INTEGRAL…… orden 1Si utilizamos la definición de conversión

La expresión de velocidad (1) se transforma en:La ecuación cinética queda:


Si se grafica ln(CA0/CA) ó ln(1-XA) en función de t y se obtiene una línea recta de pendiente k, se confirma que la Rxn es de primer orden

METODO INTEGRAL…

Si interviene más de un reactivo:Si interviene más de un reactivo:


Si interviene más de un reactivo:Si interviene más de un reactivo:1) Se deberá trabajar con exceso de B para obtener una reacción de pseudo-orden mA

2) Si CB0 >> CA0 entonces CB ~ cte y entonces

3) Luego CA0 >> CB y se obtiene k“ y mB

4) Una vez calculados mA y mB se obtiene k a partir de k`ó k”

Ecuación cinéticaEcuación cinéticaMétodos para determinar ordenes de Rxn!!Métodos para determinar ordenes de Rxn!! IntegralDiferencialTiempo de vida mediaMETODO DIFERENCIAL

1) Es poco riguroso pero requiere de pocos datos experimentales.2)2) No se necesita suponer el orden de la RxnNo se necesita suponer el orden de la Rxn, sino que este surge a través del método3) Se grafican los valores experimentales de CA vs t, y se halla la derivada de la curva


3) Se grafican los valores experimentales de CA vs t, y se halla la derivada de la curva resultante en varios puntos, obteniéndose de esta manera un conjunto de pares de valores (dCA/dt) ; CA

METODO DIFERENCIAL…

4) Entonces graficando Ln (r) vs Ln(CA), se obtiene una línea recta cuya pendiente es mA y su ordenada al origen es Ln (k).5) Si interviene más de un reactivo se produce como se vi anteriormente (obteniendo mA; k`; mB k” y finalmente k)


Método diferencial utilizando velocidades inicialesMétodo diferencial utilizando velocidades inicialesMETODO DIFERENCIAL…

Si resulta difícil determinar CA v t se determinará r0 a distintos valores de CA

CA0 r0CA01 r01CA02 r02C r


CA03 r03CA04 r04

Ejemplo 1Ejemplo 1. . Ecuación cinéticaEcuación cinética


ResoluciónResolución… … a) Método Integral: a) Método Integral: Suponemos orden, planteamos la ecuación y la integramos para ver como conviene graficarOrden 1!!

NO ES LINEAL!!!!

Orden 2!! Graficamos (1/CA – 1/CA0) vs t


ES LINEAL!!!!

Resolución… Resolución… b) Método Diferencial: b) Método Diferencial: Se utiliza un orden genérico y se aplica el logaritmo


Resolución… Resolución… b) Método Diferencial…b) Método Diferencial…


Ecuación cinéticaEcuación cinéticaMétodos para determinar ordenes de Rxn!!Métodos para determinar ordenes de Rxn!! IntegralDiferencialTiempo de vida mediaMETODO TIEMPO DE VIDA MEDIA


Si se quiere calcular el tiempo que tarde en reaccionar la mitad del reactivo A, se reemplaza CA por CA0/2 resultando: Si mA = 1, t1/2 no depende de la concentración inicial

Si mA ≠1 se puede despejar mA, con dos determinaciones de t1/2 a distintos valores de concentración inicial: CA0 y C`A0 = CA0/2

Ecuación cinéticaEcuación cinéticaReacciones irreversibles múltiplesReacciones irreversibles múltiples Paralelo SeriePARALELO O COMPETITIVAS

No existe un único grado de grado de avanceavance. No se puede seguir la composición conociendo un único componente1) Suponemos orden 1 en A; nR =1 , nS =1


2) Siguiendo A y R ó A y S porque CR + CS + CA = cte = CA0 + CR0 + CS0, se pueden conocer k1 y k2.3) Si se grafica CR vs CS, la pendiente de la recta es k1/k2, con lo cual se tienen dos ecuaciones con dos incógnitas y se puede resolver los valores de k1 y k2.

Ecuación cinéticaEcuación cinéticaReacciones irreversibles múltiplesReacciones irreversibles múltiples Paralelo Serie

1) Suponemos orden 1 en A; nR =1 , nS =1SERIE


SERIE


Si se conoce k1 y se mide la concentración máxima del producto intermedio R, se puede determinar k2

Ecuación cinéticaEcuación cinéticaReacciones reversiblesReacciones reversibles


Ecuación cinéticaEcuación cinéticaReacciones reversibles…Reacciones reversibles…


Ecuación cinéticaEcuación cinéticaEjemplo 2. Reacciones reversible…Ejemplo 2. Reacciones reversible…Se estudia la desnaturalización de una proteína en una disolución cuya concentraciónes 20,2 mg/mL, midiendo a lo largo del tiempo la concentración de proteína quepermanece en estado nativo. Se han obtenido los siguientes resultados:


a) ¿Qué siguiere el hecho que, al cabo de cierto intervalo de tiempo, la concentraciónde proteína que permanece en estado natico alcanza un valor constante y no seanula?.b) Determinar el orden de la reacción y la constante de velocidad.c) Calcular cada una de las constantes especificas.

ResoluciónResolución… …


Si la concentración de la proteína nativa no cae a cero ↓Proceso de desnaturalización reversible

ResoluciónResolución… …

1era


Realizando esta representación gráfica también se comprueba la relación lineal y por lo tanto el orden de la reacción supuesto es correctocorrecto2da

CINÉTICA ENZIMÁTICACINÉTICA ENZIMÁTICA


CINÉTICA ENZIMÁTICA…CINÉTICA ENZIMÁTICA…ConceptosConceptos

Los catalizadores son sustancias capaces de acelerar la velocidad de una Rxn Qca quees termodinámicamente factible sin consumirse en el transcurso de la reacciónSu efecto es el de disminuir la energía de activación necesaria para que ocurra latransformación de los reactivos


ConceptosConceptos


Las enzimas son catalizadores biológicos que aceleran en forma altamente específicael progreso de determinada reacción. La mayoría son proteínas que logran su capacidad catalítica por que unenunen enen formaformatemporaltemporal aa unouno oo másmás reactivosreactivos (substratos) involucrados en la reacción que catalizan.La unión enzima sustrato es débil y no covalente (Puente de H; Van del Waals;hidrofobias; iónicas).Requiere que una buena parte de la superficie de las dos moléculas puedanaproximarse en el espacio.

2 H2O2 catalasa 2H2O + O2

Parámetros de influenciaParámetros de influenciaLa velocidad de una reacción catalizada por :1) La concentración de las moléculas de sustrato2) La temperatura: Las enzimas poseen una temperatura óptima a la cual la enzimapresenta máxima eficiencia catalítica.3) El pH del medio: que afecta a al conformación (estructura espacial) de lasenzimas. Existe un pH óptimo de actuación, a valores superiores o inferiores lavelocidad disminuye.4) La [Enzima] a pH y T óptimos: La velocidad inicial es proporcional ala


4) La [Enzima] a pH y T óptimos: La velocidad inicial es proporcional alaconcentración de enzima, al menos en determinado rango de concentraciones.5) La presencia de inhibidores.

Efecto T

Efecto pH

Parámetros de influenciaParámetros de influenciaConcentración del substrato Concentración del substrato ––Ecuación de MichaelisEcuación de Michaelis--MentenMentenLa concentración de substrato es uno de los factores más importante que determinan la velocidad de una reacción enzimáticaLa relación V vs [S] es del tipo hiperbólica: Vmax: máxima velocidad que sepuede alcanzar para una dadaE0. Se da cuando casi toda laenzima está formando complejocon el substrato (Saturación)


con el substrato (Saturación)Km: Constante de afinidad deM-M. Su inversa se relaciona conla afinidad aparente de laenzima por el substrato. Es la [S]a la cual V es 50% de Vmax

Para ↓[S], la velocidad inicial de la reacción es directamente proporcional a [S].Para valores intermedios de [S], el incremento de la velocidad deja de ser lineal, tendiendo a un valor constante, Vmax, para ↑ [S]. Esta Vmax depende de la concentración de enzima empleada.

Parámetros de influenciaParámetros de influenciaEcuación de MichaelisEcuación de Michaelis--MentenMenten El mecanismo de acción se basa en la formación de un complejo enzima-substrato, E-S, que se descompone luego para generar los productos de la Rxn, liberando enzima.La secuencia de las reacciones puede expresarse como:

Donde E = enzima libre k


Donde E = enzima libre k1S = substrato k-1 Las respectivas ctes de velocidadE-S = Complejo enzima-substrato k2P = Producto/productos de la reacción Se supone que el equilibrio se alcanzará rápidamente Km~k-1/k1

La determinación de Km es muy útil en casos de enzimas que no son específicas casos de enzimas que no son específicas hacia un único sustrato hacia un único sustrato Da una indicación de por cual sustrato la enzima presenta mayor afinidad y actúa preferentemente.

Parámetros de influenciaParámetros de influenciaEcuación de MichaelisEcuación de Michaelis--MentenMenten La mayoría de las reacciones enzimáticas involucran más de un substrato y un producto y la enzima tendrá un Km para cada substrato.

Siempre será posible determinar los Km aparentes para cada uno de los substratos, agregando los otros en exceso (en condiciones de saturación) y variando únicamente el variando únicamente el substrato cuyo Km se quiere determinarsubstrato cuyo Km se quiere determinar.


Parámetros de influenciaParámetros de influenciaDeterminación de los parámetros de MDeterminación de los parámetros de M--MM Es conveniente representar laslas inversasinversas dede laslas velocidadesvelocidades en función de laslas inversasinversasdede laslas concentracionesconcentraciones dede substratosubstrato (Representación de LineweaverLineweaver--BurkBurk) paraencontrar un relación lineal de la cual es más sencillo determinar los valores de Vmax yKm


r

Parámetros de influenciaParámetros de influenciaDeterminación de los parámetros de MDeterminación de los parámetros de M--MM Otra forma de representar la Ec. M-M para obtener una relación lineal es expresar lavelocidad referida a la concentración del substrato

Obteniéndose un tipo de representación propuesto por Woolf, Eadie y HofsteeWoolf, Eadie y Hofstee


r

r / [S]

Parámetros de influenciaParámetros de influenciaPresencia de inhibidorPresencia de inhibidorEfecto que hace disminuir la actividad enzimática, a través de las interacciones con elcentro activo u otros centros específicos (alostéricos)Esta definición excluye todos aquellos agentes que inactivan a la enzima a través de ladesnaturalizacióndesnaturalización dede lala moléculamolécula enzimáticaenzimática→ ReversiblesReversibles: La enzima recupera su actividad→ Irreversibles: Irreversibles: La enzima continua inhibida por modificaciones irreversibles


→ Irreversibles: Irreversibles: La enzima continua inhibida por modificaciones irreversiblesEl inhibidor interactúa en forma reversible con algún grupo esencial de la enzima, formando un complejo Enzima-Inhibidor, E-I

Se establece un equilibrio entre ese complejo y la enzima y el inhibidor libres. Se define una constante de equilibrio de disociación, KI, que determina la Rxn.


Parámetros de influenciaParámetros de influenciaInhibición competitivaInhibición competitiva Los inhibidores ejercen su acción sobre el centro activo centro activo Dentro de este tipo de inhibidores se incluyen sustancias que estructuralmente son estructuralmente son muy parecidas al sustratomuy parecidas al sustrato pero que generalmente, no reaccionan por efecto de la enzimaEl inhibidor se combina reversiblemente con la enzimase combina reversiblemente con la enzima en el sitio por el cual debería unirse al sustrato, impidiendo por la tanto la formación del complejo activo E-S


unirse al sustrato, impidiendo por la tanto la formación del complejo activo E-S

El substrato y el inhibidor compiten por el mismo sitio y tratan de desplazarse mutuamente de la enzima

Puede disminuirse considerablemente ↑ [S]

Parámetros de influenciaParámetros de influenciaCálculos de constante de MCálculos de constante de M--M en presencia de inhibidorM en presencia de inhibidor Ecuaciones de velocidad de Rxn en función de las concentraciones de substrato e inhibidor, expresadas según lo requerido en la representación de Lineweaver- Burk, doble recíproca de velocidad y concentración de substrato será:Inhibición Competitiva:


El valor de Vmax para una cantidad de enzima no se modifica con el agregado de inhibidor.Km aparente aumenta por que la presencia del inhibidor hace que se necesite una mayor cantidad de substrato para saturar la enzima.

Donde [I] representa la concentración de inhibidor y KI la constante de disociación del complejo E-I


Parámetros de influenciaParámetros de influenciaInhibición No competitivaInhibición No competitiva Ejerce una acción sobre otra parte de la molécula, causando un cambio causando un cambio conformación con repercusión negativa en la actividad conformación con repercusión negativa en la actividad enzimática.El inhibidor se une con la enzima en otro sitiootro sitio, no en el sitio activo del sustrato.

El sustrato aún puede unirse a la enzima y formarse un complejo ternario enzimaternario enzima--substratosubstrato--inhibidorinhibidor, E-S-I, que es catalíticamente inactivo catalíticamente inactivo y no puede escindirse en productos de la reacción y el complejo E-I


productos de la reacción y el complejo E-I

Se pueden definir dos contantes dos contantes para el inhibidorpara el inhibidor:

Esta inhibición se caracteriza por que no puede revertirse por un ↑ [S]

Si las dos constantes son iguales, se tendrá una inhibición no-competitiva pura.Si ambas contantes son diferentes, la inhibición será parcialmente competitiva o mixta.

Parámetros de influenciaParámetros de influenciaCálculos de constante de MCálculos de constante de M--M en presencia de inhibidorM en presencia de inhibidorInhibición No Competitiva: En la forma no- competitiva pura, la presencia del inhibidor disminuye el valor de Vmax sin modificar el sin modificar el valor de Kmvalor de Km ya que la unión del substrato a la unión del substrato a la enzima no se altera por la unión simultánea del enzima no se altera por la unión simultánea del inhibidorinhibidor.


En el caso de la inhibición mixta o parcialmente competitiva , la familia de rectas se interceptarán en un punto que no estará sobre ninguno de los ejes, sino a la izquierda del eje vertical y, según los valores relativos de KI1 Y KI2, por encima o por debajo del eje horizontal


Parámetros de influenciaParámetros de influenciaInhibición AcompetitivaInhibición Acompetitiva Frecuentemente en sistemas más complejos (con más de un substrato). El inhibidor se une al complejo E-S para dar un complejo E-S-I incapaz de transformarse incapaz de transformarse en productos.en productos.


Cualquiera sea la concentración del inhibidor e incluso cuando la concentración de substrato es infinitamente grande, será imposible revertir la formación del complejo será imposible revertir la formación del complejo ternario Eternario E--SS--II.El efecto experimental será el de ↓ la Vmax en presencia del inhibidor, tal como ocurre en la inhibición no-compe va. Pero también ↓ Km, es decir aumenta la afinidad aumenta la afinidad aparente de la enzima por el substratoaparente de la enzima por el substrato.

Parámetros de influenciaParámetros de influenciaCálculos de constante de MCálculos de constante de M--M en presencia de inhibidorM en presencia de inhibidorInhibición Acompetitiva Tanto los valores de VVmaxmax como los de KmKmdisminuyenLa pendiente es la misma en presencia o ausencia del inhibidor.


Parámetros de influenciaParámetros de influenciaCálculos de constante de MCálculos de constante de M--M en presencia de inhibidorM en presencia de inhibidor

Para determinar el efecto de un determinado inhibidor será necesario:• Establecer las velocidades de reacción para distintas concentraciones de substrato en ausencia de inhibidor y en presencia de concentraciones variables de éste.•Representar los resultados según lo sugerido por


•Representar los resultados según lo sugerido por Lineweaver-Burk.•Si se obtiene una familia de rectas que pasan por una misma ordenada al origen, la inhibición será competitivacompetitiva.•Si las rectas se intersectan en un punto a la izquierda del eje de ordenadas, la inhibición será no competitivano competitiva.•Si las rectas son paralelas, la inhibición es acompetitiva

Ejemplo 1Ejemplo 1. . Cinética EnzimáticaCinética EnzimáticaLa glucosa oxidasa que cataliza la oxidación de la glucosa por el oxígeno molecular para dar ácido glucónico y H2O2, resulta inhibida por el compuesto D-glucal. En una primera serie de experiencias, se mantuvo contante la concentración de oxígeno (0,27 mM) y se hizo variar la concentración de glucosa:Experiencia A: en ausencia de inhibidor.Experiencia B: concentración de D-glucal = 0,079 mMExperiencia C: concentración de D-glucal = 0,113 mMEn la siguiente tabla se indican las velocidades iniciales, que se han dividido por la concentración de enzima total:


En una segunda serie de experiencias, se mantuvo constante la concentración de glucosa (20mM) y se trabajo con diferentes concentraciones de oxígeno.Experiencia A: en ausencia de inhibidorExperiencia B: concentración de D-glucal = 0,11M

Resolución…Resolución…1) [O2] = 0,27 mM; r0/[E0] vs ≠ [glu]; sustrato: glucosaExp A = Sin inhibidorExp B = Con D-glucal = 0,079 mMExp C = Con D-glucal = 0,113 mM


Resolución…Resolución…1) [O2] = 0,27 mM; r0/[E0] vs ≠ [glu]; sustrato: glucosaExp A = Sin inhibidorExp B = Con D-glucal = 0,079 mMExp C = Con D-glucal = 0,113 mM


Km´= 0,0328 M > Km = 0,02 M1/Vmax = 3004,8 ~ 1/Vmax = 3054,6

1/VmaxKm aparente ↑por que la presencia de inhibidor hace que se necesite > cantidad de sustrato para saturar la enzima

Igual coordenada de origen! Inhibición competitivaInhibición competitiva

Resolución…Resolución…1) [O2] = 0,27 mM; r0/[E0] vs ≠ [glu]; sustrato: glucosaExp A = Sin inhibidorExp B = Con D-glucal = 0,079 mMExp C = Con D-glucal = 0,113 mMEcuación de la recta:y = 109,55x + 3171,3


Inhibición competitivaInhibición competitiva

Resolución…Resolución…2) [glu] = 20 mM; r0/[E0] vs ≠ [O2]; sustrato: O2

Exp A = Sin inhibidor

Exp B = con D-glucal 0,11M


Exp B = con D-glucal 0,11M

Inhibición Inhibición acompetitivaacompetitiva

En presencia del inhibidor bajan ambas contante

Cinética EnzimáticaCinética EnzimáticaEnzimas alostéricas ó cooperativasEnzimas alostéricas ó cooperativas Enzimas que tiene más de un sitio de unión.Una molécula facilita la entrada de otra.

n: n: Coeficiente de cooperación, n>1n>1 indica cooperación positiva


positiva

La gráfica de r0 frente a [S] no es una hipérbola, sino una sigmoide. En la cinética sigmoideacinética sigmoidea, pequeñas variaciones de [S] en una zona crítica (cercana a la Km) se traduce en grandes variaciones en r0

Cinética EnzimáticaCinética EnzimáticaInhibición por sustratoInhibición por sustrato Altas [S] pueden causar inhibición.

Esquema de Rxn:


Esquema de Rxn:

Cinética EnzimáticaCinética EnzimáticaInhibición por sustratoInhibición por sustrato

A bajas [S]: → Sin inhibición


A altas [S]: → Inhibición

La [S] que maximiza la velocidad se obtiene por dt/d[S] = 0

Cinética EnzimáticaCinética EnzimáticaDesactivación por CalorDesactivación por Calor Para T > Tóptima, la actividad enzimática decae siguiendo una cinética de primer primer ordenorden

La constante de desactivación sigue con la T una cinética tipo Arrheniustipo Arrhenius:


La constante de desactivación sigue con la T una cinética tipo Arrheniustipo Arrhenius:


GRACIAS!!!

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