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Replicación del DNA: reglas que la gobiernan.
Punto de origen y dirección. Cadena conductora
y rezagada. Polimerasas y su rol en la
replicación. Fases de la replicación en
procariotas y eucariotas: inicio, elongación,
terminación.
Transcripción: polimerasas en procariotas y
eucariotas. Hebra molde y no molde. Promotores.
Secuencia consenso. Regulación del inicio de la
transcripción. Terminación de la síntesis del
mRNA. Maduración de los distintos mRNA en
procariotas y eucariotas. Actividad catalítica del
mRNA. Operón lac.
Traducción de la información
genética. Código genético. RNA de
transferencia. Ribosomas:
conformación y función. Biosíntesis
de proteínas: etapas de activación,
prolongación, terminación,
plegamiento y transformación
LOS NUCLEÓTIDOS
Están formados por:
Una base nitrogenada BN
Un azúcar (pentosa) A
Ácido fosfórico (H3PO4) P
Unidos en el siguiente orden: P A BN
Nucleósido
FUNCIONES DE LOS NUCLEÓTIDOS
Son fundamentales para la vida de las células, pues
al unirse con otras moléculas cumplen tres
funciones cruciales:
TRANSPORTAN ENERGÍA
ACTUAN COMO MOLECULAS
REGULADORAS
TRANSPORTAN ÁTOMOS
TRANSMITEN LOS CARACTERES
HEREDITARIOS
• El ADN se hidroliza no enzimáticamente a nivel de los grupos fosfatos lentamente. En cambio, en condiciones alcalinas el ARN lo hace con mayor facilidad.
• Reacción positiva de los polidesoxirribonucleótidos a la difenilamina y al reactivo de Schiff
• Reacciona con orcinol en medio ácido (Reactivo de Bial)
• Reacción con agentes intercalantes (acridinas)
• Absorben a una longitud de onda a 260 nm
• Las bases púricas y pirimidinicas que lo conforman tiene carácter hidrofóbico. Mientras que el azúcar y el grupo fosfato son hidrofílicos. Esto tendrá importancia en la conformación de su estructura secundaria.
Propiedades de las ácidos nucleicos
Química de los ácidos
nucleicos • A pH 7 y a 25ºC forma
soluciones viscosas. Se
desnaturalizan a pHs y
temperaturas extremas
caract. (se rompen los
puentes H no los enlaces
covalentes, por lo tanto
pierde su estructura 2daria).
• Se pueden volver a enrollar
por hibridación.
• El ADN desnaturalizado
incrementa su Abs. al UV.
Efectos por radiaciones • la luz UV Formación de dímeros
de timina
Algunas bases
del ADN están
metiladas La adenina y la
citosina se
metilan con
mayor frecuencia
La unidad de información en los
organismos es el GEN
• Un GEN es un segmento de ADN o ARN
que codifica la información requerida para
sintetizar un producto biológico funcional
• El ADN y el ARN son los llamados ácidos
nucleicos.
LOS NUCLEÓTIDOS
Están formados por:
Una base nitrogenada BN
Un azúcar (pentosa) A
Ácido fosfórico (H3PO4) P
Unidos en el siguiente orden: P A BN
Nucleósido
LA PENTOSA PUEDE SER:
LA RIBOSA
LA DESOXIRRIBOSA
LA BASE NITROGENADA PUEDE SER:
ADENINA A
GUANINA G
CITOSINA C
TIMINA T
URACILO U
FUNCIONES DE LOS
ÁCIDOS NUCLEICOS
SÍNTESIS DE PROTÉINAS ESPECÍFICAS DE LA
CÉLULA
ALMACENAMIENTO, REPLICACIÓN Y
TRANSMISIÓN DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA
(Son las moléculas que determinan lo que es y hace cada
una de las células vivas)
La función principal del ARN es servir como
intermediario de la información que lleva el ADN en
forma de genes y la proteína final codificada por esos
genes.
Replicación de DNA
• Cómo hacen los organismos para hacer copias fieles de sí mismo?. Molde
• Este proceso está regulado por un conjunto de reglas:
• A) la replicación del DNA es semiconservativa cada hebra del DNA actúa como molde para la sintesís de una nueva hebra---------- Experimento de Meselson-Stahl
• B) La replicación del DNA empieza en un punto
de origen y normalmente transcurre de forma
bidireccional
El desenrollamiento y
la separación de las
cadenas ocurren
simultáneamente a la
replicación Horquillas
de
replicación
El punto de origen son
generalmente
regiones ricas en
timina---adenina
Esquema de la Replicación del DNA
mediante fragmentos de Okazaki y
cebadores de RNA
• C) La síntesis del DNA transcurre en
dirección 5´ 3´ El 3´ OH libre constituye el punto de
elongación del DNA
Cadena que se sintetiza
continuamente
Cadena se sintetiza
discontinuamente, rezagada
El DNA es sintetizado por DNA-polimerasas
1º DNA polimerasa I (Ecoli)
(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPI
Requerimientos de las DNA-
polimerasas
• Necesitan un molde ( en este caso la cada hebra del DNA actúa como molde)
• Necesitan un cebador: una pequeña fracción del DNA (COMPLEMENTARIO) con un extremo 3`libre (ext. cebador).
En gral. los cebadores son oligonucleótidos de RNA que se sintetizan en sitios y lugares específicos donde son requeridos.
Algunas polimerasas se disocian y reasocian al molde a medida que sintetizan. Procesividad
La replicación es muy precisa,
el índice del número de
errores es bajo.
La precisión está dada por:
1.Los puentes H
2.La geometría en común de
los pares de bases
3.Las DNA-poli merasas
-Tienen un centro activo
-Tienen actividad 3´
5´exonucleolítica correción
de pruebas
Existen mas de una DNA-
polimerasa
La DNA-polimerasa I tiene
además una actividad
adicional
Exonucleasa 5´ 3´
IMPORTANTE EN LA
ELIMINACIÓN DE
CEBADORES
Actividad polimerizante
Exonucleasa 3´--5´
Unión estable del molde
Abrazadera del DNA necesaria
para una procesividad óptima
La replicación del DNA
1.Requiere de enzimas y cofactores.
2.Procede en etapas.
1.Helicasas ------- ATP
2.Topoisomerasa impiden el superenrollamiento
de la hélice
3.Proteínas de unión al DNA ------estabilizar
4.Primasas sintetizan el cebador
5.DNA ligasas---- reparar las mellas
Procede en etapas: iniciación, elongación y
terminación
1.Iniciación
La
Iniciación
está
regulada
por la
metilación
del sitio ori
C y la
lenta
hidrólisis
del ATP
2. Elongación
Síntesis de la cadena
conductora
y de la cadena
rezagada
Hebra
rezagada
mella
DNA sellado
El desplazamiento de
AMP sella la mella
MECANISMO DE ACCIÓN DE LA DNA LIGASA
Necesita previa adenilación del grupo fosfato libre
Adenilación
de la DNA
ligasa
Activación del
5´fosfato de
la mella
3. Terminación
En E coli la región de
terminación es una región
llamada Ter donde se para la
replicación
Los DNA formados se llaman
catenarios que por acción de
una topoisomerasa (IV) se
separan y forman las dos
hebras.
En eucariotas la replicación es más
compleja
1.DNA polimerasas б, ε, alfa
2.Los DNA tiene múltiples sitios de
origen de replicación.
Metabolismo del RNA
• Al ser de cadenas sencillas pueden
adoptar una gran diversidad estructural y
funcional: macromoléculas con función
catalítica e informativa.
ADN-----------------------------TRANSCRIPCION---------------------------------ARN
TRANSCRIPCIÓN/Replicación
Hay 4 tipos de ARN, cada uno codificado por su propio gen:
ARNm - ARN Mensajero: Traslada la información genética
desde el ADN hasta los ribosomas (moldes).Antes de llegar a
ser mensajero es un RNA nuclear heterogéneo (HnRNA), que
por modificaciones enzimáticas se convierte en ARNm
ARNt - ARN de Transferencia: RNA de transferencia (tRNA), al
cual se unen los distintos aminoácidos, que quedan así
activados y aptos para integrarse en la biosíntesis de
proteínas.
ARNr - ARN Ribosomal: RNA ribosómico (rRNA) que integra,
junto con proteínas, la partícula conocida como ribosoma.
ARN np- ARN nuclear pequeño: RNAs nucleares pequeños
(snRNA) o RNAs nucleolares pequeños (snoRNA), que
participan en la conversión de HnRNA en mRNA (no se
encuentra en las células procarióticas).
Cadenas de DNA utilizadas como
molde en la transcripción
Gen 2
Polimerasa
de RNA
Cadena
molde gen 1
Polimerasa
de RNA
RNA Cadena
molde gen 2
Cadena antisentido
gen 2
Cadena antisentido
gen 1
Gen 1
El RNA es sintetizado por RNA- polimerasas
Requieren: 1- un molde (DNA); 2- los cuatro ribonucleótidos
(ATP, GTP, UTP,CTP) y Mg2+. La dirección de síntesis es 5´--
--3´. La enzima se une a regiones llamadas promotores del
DNA. Carecen de actividad reparadora. NO REQUIERE CEBADOR
Hebra no-
molde
Hebra
molde
Regiones promotoras: secuencias específicas del
DNA ----------DIRIGEN LA TRANSCRIPCIÓN. Reconocida por
la subunidad 70 de la RNA POLIMERASA
Estas secuencias no son idénticas pero hay nucleótidos que se encuentran con
mayor frecuencia que otros……………..SECUENCIAS CONSENSO
Derivación
LA TRANSCRIPCIÓN PUEDE SER REGULADA POR:
1. Promotores
2. Por proteínas: pueden activar (CRP) o reprimir (represor
LAC)
Secuencias
específicas en el
DNA indican la
terminación en E coli
existe un factor
proteico ρ
Existen varias RNA polimerasas:
1- RNA-polimerasa I: es responsable de la síntesis de pre-rRNA.
2- RNA-polimerasa II: síntesis de mRNA y otros RNA especiales
Secuencia promotora
reconocida por Pol II
3- RNA-polimerasa III: síntesis de tRNA, rRNA (5S).
Maduración del RNA: CATALIZADAS POR RIBOZIMAS
Transcrito
primario
Clivaje,
poliadenilación
corte y empalme
Codificante No-codificante
Secuencias clave para la transcripción
y traducción de un gen eucariótico
Exón 1
Sitio de inicio de
la transcripción
Codón de inicio
de la traducción
(AUG)
Secuencia lider
no traducida
Terminación de la
transcripción
Cola no
traducida
Codón de terminación
de la traducción
(AUG, UUA, UAG )
Señal de
poliadenilación
(AAUAAA)
Promot
or
Exón 2 Exón 3
GU A AG
Intrón 2
GU A AG
5´ 3´
Adición de casquete 5´
Corte 3´
Escisión de intrones Poli(A)
mRNA funcional
Procesamiento del transcrito a mRNA
Mecanismo de corte y empalme
Procesamiento de tRNA Generalmente no existen intrones en un transcripto primario de tRNA
RNAasa D y P
nucleotidiltransferasa
Estructura y función del tRNA Sitio de unión al
aminoácido
Triplete del
anticodón
PUENTES H
Posición
de
balanceo
Brazo D Brazo TΨC
EL CODIGO GENETICO La comprensión de la síntesis de proteínas fue uno de los mayores logros de
la bioquímica en los últimos años. Para entender el mecanismo molecular
que ello ocurre se debían responder dos preguntas:
1. ¿Cómo se transmite la información de ADN-ARN-PROTEÍNAS
2. ¿Cuál es el mecanismo enzimático mediante el cual este proceso ocurre?
Bases - Bases- Aminoácidos
1960-1964. Paul Zamecnik; Robert Holley; H. G. Khorana; Marshall
Nirenberg; Masayasu Namura
Características: Universal; En tripletes; No solapado; Redundante;
La síntesis de proteína ocurre de
manera similar en todas las células
• Tres tipos de RNA participan de un modo cooperativo:
mRNA; rRNA; tRNA.
• El orden de los aa en la cadena proteica (secuencia)
está determinada por la secuencia (orden) de
nucleótidos.
• El orden de los aa en la cadena proteica (secuencia)
determina la función de la nueva proteína
• Es necesario un código “bilingüe”para pasar la
información de bases a aa CODIGO GENETICO
• Codón: es un triplete de nucleótidos que codifica
para un aa específico- La traducción tiene lugar de
manera que estos codones son leídos sucesivamente y
sin solapamiento. El primer codón es el que determina el
marco de lectura. No hay puntuación entre los codones
sucesivos de aa
¿Todos los mRNA tienen tres posibles marcos de lectura?. Sí
Marco
de
lectura
Pero sólo uno de ellos dará origen a una proteína
Universalidad y….excepciones
Genoma Codón Código
Universal
Excepción
Bacteriano
Mycoplasma
UGA stop Trp
DNA
mitocondrial
en humano
UGA
AUA
AGA
Stop
Ile
Arg
Trp
Met
Stop
No ambiguo= cada codón especifica sólo un aminoácido)
Redundante= distintos codones para un aminoácido. La diferencia
radica gral. En la tercera base.
Codones con funciones especiales
• Codón de iniciación AUG (Met).
• Codón de terminación: UAA; UAG; UGA Segunda letra del codón
Primera
letra del
codón
Relación codón-anticodón.
La primera base del codón del mRNA se
aparea con la tercera base del anticodón
del tRNA
Habría entonces un tRNA
para cada codón de un aa?
NO Inosinato
(hipoxantina)
---Puente H más débil
Hipótesis de balanceo • Las dos primeras bases del codón siempre forman pares de bases fuertes
del tipo W-C y son responsables de la mayor especificidad del código.
• La primera base del anticodón determina el Nº de codones reconocidos por
el tRNA. Esta hipótesis permite que las interacciones C-Ac no sean muy
fuertes, el tRNA se disociaría fácilmente y la síntesis de proteínas avanzaría
a una velocidad razonable.
La base en la posición de balanceo del anticodón determina
el número de codones que puede reconocer un tRNA
1. Un codón reconocido:
Anticodón
Codón
2. Dos codones reconocidos
Anticodón
Codón
3. Tres codones reconocidos
El ribosoma: organela formada por proteínas
ribosómicas y rRNA, formando subunidades de
diferentes coeficientes de sedimentación
Otros sitios funcionales importantes del ribosoma
• Sitio A o aminoacilo: es donde se sitúan
todos los aminoacil-tRNAs entrantes, excepto el de
iniciación
• Sitio P o peptidilo: es el lugar donde se sitúa el peptidil-
tRNA en formación y el metionil-tRNA de iniciación
• Sitio E o de salida: es el lugar donde se sitúa el tRNA
descargado antes de abandonar el ribosoma
Fases de la síntesis de proteínas
1. Activación de aa: para ello se debe:
• a) activar el grupo CO2 de cada aa para
facilitar la formación del enlace peptídico
(tRNA-aa) – unión covalente- citosol-
aminoaciltRNAsintetasas. 32 tRNA
• b) cada nuevo aa debe ser incorporado
de acuerdo a la información del mRNA.
Aminoácido activado por unión a su
tRNA específico
La reacción está catalizada por
el enzima:
aminoacil-tRNA sintetasa
Cada enzima es específica para cada aa y de
uno o más tRNA y es lo que se llama Segundo
Código Genético
Aminoácido + tRNA + ATP Mg, enz-- AMINOACIL-tRNA + AMP +PPi
Precisión en la
síntesis de
proteínas
Sitios críticos de las aminoacil-tRNA
sintetasas Cada aminoaciltransferasas
es muy específica y capaz de
reconocer entre dos aa muy
similares, por ej, Val e Ileu
2. Inicio la síntesis empieza en el extremo amino terminal (dado
por el codón de iniciación AUG del mensajero -Met) y avanza
hacia el extremo carboxilo terminal
Requerimientos: subunidad ribosómica 30S y 50S (P) el mRNA; una tRNAfMET ;
Factores de Inicio (IF, Proteínas, 9 en euc); GTP; Mg.
Fases de la síntesis de proteínas
La secuencia iniciadora AUG es guiada su
posición correcta gracias a una secuencia
conocida como secuencia de Shine-
Dalgarno.
Abandono de los tres
factores de inicio
Complejo de inicio:
ribosoma; mRNA; el
iniciador tRNAfMet
En
eucariotas
3. Elongación a) el complejo de inicio;
b) aminoaciltRNA
c) factores de elongación
(EF-Tu; EF-Ts; EF-G
Pr- citosólicas)
d) GTP
Fases de la síntesis de proteínas
Paso 1: Unión del
aminoaciltRNA entrante
Paso 2: Formación del enlace
peptídico
Ambos tRNA permanecen
unidos al ribosoma.
La enzima que cataliza este
enlace es una
peptidiltransferasa que es
una rRNA (ribozimas)
Paso 3: Traslocación
El ribosoma se traslada un codón
hacia el extremo 3´del mRNA
utilizando energía dada por el GTP.
El dipeptidil se encuentra ahora en
el sitio P dejando el sitio A libre
para la entrada de un tRNA3
entrante
Se requiere una señal de
terminación: UAA, UAG, UGA
en el sitio A. Existen también
factores de liberación (RF1 o
RF2). Se produce la hidrólisis
del enlace éster entre el
polipétido y el tRNA en el sitio
P y la liberación del Pr-.
Finalmente el mRNA, tRNA
desacilado y el factor de
liberación dejan el ribosoma el
cual se disocia en sus
subunidades.
Fases de la síntesis de proteínas
4. Terminación
Fases de la síntesis de proteínas 5. Plegamiento y modificación de las proteínas
sintetizadas a) Modificaciones amino y carboxilos terminales: todos los polipéptidos
empiezan con Met (eucariotas) y formilmetionina (procariotas). El grupo formilo, residuo Met NH terminal y el CO2 son eliminados.
b) Pérdida de secuencias señal: la mayoría de las proteínas tiene una secuencia aminoterminal llamada secuencia señal que es la que las dirige hacia las organelas donde cumplirán su función desde el RE. Esta señal es eliminada por peptidasas.
c) Modificación de determinados aa: ciclos de fosforilación en Ser, Thr y Tyr. Adición de grupos CO2 a Glu.
d) Las proteínas recién sintetizadas se pliegan en el RE , se forman los puentes disulfuros y muchas son glicosiladas (GLICOPROTEÍNAS).
e) Adición de grupos prostéticos (biotina y el grupo hemo) e isoprenilo (derivados del metabolismo del colesterol).
f) Modificación proteolítica g) Formación de puentes disulfuro
Degradación de las proteínas
La mayoría de las Pr tiene un t1/2 de segundos a días. Es importante
degradarlas para reciclar los aa.
Transcriptasa inversa
• Síntesis de DNA o RNA a partir de RNA
• Virus
Transcriptasa inversa
Transcripción
Inversa
Replicación del
DNA
Transcripción
Traducción
Replicación del
RNA
Parte Práctica
• 1) Obtener el ácido ribonucleico precipitado de la levadura de cerveza.
• 2) Obtener el ácido desoxirribonucleico precipitado del timo de ternera
• 3) Comprobar la solubilidad de los ácidos nucleicos en diferentes solventes.
• 4) Realizar la hidrólisis de los ácidos nucleicos obtenidos.
• 5) Verificar el resultado de la hidrólisis a través de reacciones características de cada uno de sus componentes
