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MÉTODOS Y TÉCNICAS PARA
CULTIVOS MICROBIOLÓGICOS
UNIDAD 2
INTRODUCCIÓN
Todas los microorganismos en microbiología
presentan una morfología y tamaño muy variables,
así como distintos sistemas de agrupación. El
conocer este tipo de características propias de
cada grupo microbiano se consigue por medio de
diferentes métodos de examen.
LA MEDIDA DE LOS MICROORGANISMOS
MICROSCOPIA
• Lente convexa• Punto focal
AUMENTO DE LA
IMAGEN
• Diferencia en la intensidad de la luz
• Uso de ColorantesCONTRASTE
• Poder de resolución• Tamaño de la primera lente de aumento• Longitud de onda de luz usada y espécimen• Índice de refracción
RESOLUCIÓN
AUMENTO
AUMENTO TOTAL
MICROSCOPIO LENTE OBJETIVO
LENTE OCULAR
AMPLIACIÓN TOTAL
Microscopio óptico
Débil 10X 10X 100X
Fuere seco 40X 10X 400X
Acetite de inmersión
100X 10X 1000X
Microscopio electrónico
Transmisión (MET)
200 000X
Barrido (MEB) 10 000X
RESOLUCIÓN
ACEITE DE INMERSIÓN
• IR 1.5• Aumenta la
resolución
APERTURA NUMÉRICA (AN)
• Grabado en la lente del objetivo del microscopio
• Tamaño de la lente
• Uso de aceite de inmersión
d = longitud de onda 2AN
DISTANCIA ENTRE DOS PUNTOS DE OBSERVACIÓN
USO DEL ACEITE DE INMERSIÓN
MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO
MIC
RO
SC
OP
IO
ELEC
TR
ON
ICO
DE
TR
AN
SM
ISIÓ
N
MIC
RO
SC
OP
IO D
IGIT
AL
CO
N P
AN
TA
LLA
(LC
D)
USOS DEL MICROSCOPIOTIPOS DE
MICROSCOPIACARACTERISTICA
CLAVEASPECTO DE LA
IMAGENPRINCIPAL
APLICACIÓN
Microscopia óptica
Campo claro El contraste se logra por absorción
Imagen clara Las muestras requieren tinción.
Contraste de fases El contraste se consigue por
interferencia; las diferencias en el
índice de refracción cambian la fase de la
luz
Imágenes claras y detalladas
rodeadas de un halo
No requiere tinción; se pueden observar
preparación en fresco de células
vivas
Campo oscuro Solamente la luz dispersada por la
muestra entra en el objetivo,
produciéndose un contraste elevado
Imagen brillante contra un fondo
oscuro
Para observar células vivas o
flagelos demasiado finos para la
microscopia de contraste de fases;
pocos detalles internos
TIPOS DE MICROSCOPIA
CARACTERISTICA CLAVE
ASPECTO DE LA IMAGEN
PRINCIPAL APLICACIÓN
Fluorescencia Se basa en la capacidad de emitir
luz visible que tienen los
especímenes fluorescentes cuando se les ilumina con luz
ultravioleta
Espécimen coloreada
(luminosa) contra un fondo oscuro
Utilizando anticuerpos
fluorescentes se pueden identificar tipos específicos
de microorganismos presentes en una mezcla compleja
Microscopia electrónica
Transmisión (MET)
Hace pasar un haz de electrones a
través de la preparación,
produciendo un gran aumento útil
Imágenes muy ampliadas con
gran detalle
Para poder observar virus , no se puede observar organismos vivos, las preparaciones
son desecadas
TIPOS DE MICROSCOPIA
CARACTERISTICA CLAVE
ASPECTO DE LA IMAGEN
PRINCIPAL APLICACIÓN
Barrido (MEB) Barre los especímenes con
un chorro de electrones,
produciendo la salida de electrones
secundarios que crean una señal,
que, a su vez, genera una imagen
por ordenarlos
Imagen tridimensional
Para ver estructuras de
organismos intactos, y
estructuras con detalles reales se ocupan muestras
desecadas
PREPARACIONE
S EN FRESCO
1. PREPARACIÓN
EN FRESCO SIMPLE
2. PREPARACIÓN
EN GOTA PENDIENTE
M.O. VIVOS
CONDICIONES DE UNA PREPARACIÓN EN FRESCO
1. La muestra debe ser representativa
2. Muestras recogidas en condición de esterilidad
3. Distribución adecuada en el portaobjeto,
homogénea
4. Cantidad de agua y colorante adecuada
5. Si necesita calor no debe calentarse demasiado
6. Evitar la contaminación
MÉTODO DE EXAMEN EN FRESCO ENTRE PORTAOBJETOS Y CUBREOBJETOS
1. Se prepara un portaobjeto y cubreobjetos limpio y desengrasado
2. En el portaobjeto se deposita una gota de agua estéril3. Con el asa de siembra previamente estéril o flameado,
se toma un poco de muestra del microrganismo y se realiza una suspensión de estas en la gota
4. Se extiende y homogeniza la gota de muestra, se coloca sobre esta un cubreobjetos formando un ángulo de 45°, evitando burbujas de aire y corrientes
5. Se sellan con parafina los bordes del cubreobjetos para disminuir la evaporación y evitar corrientes en a preparación
6. Observar al microscopio inicialmente con objetivo de 40 aumentos
MÉTODO DE EXAMEN EN FRESCO SOBRE GOTA PENDIENTE EN PORTA EXCAVADO
1. Se utiliza en este caso un cubreobjetos adecuadamente limpio y desengrasado, se coloca una gota de la suspensión microbiana con una asa de siembra inicialmente estéril
2. Se colocara vaselina en los bordes del pocillo del portaobjetos excavado
3. El cubreobjetos se invertirá sobre el portaobjetos excavado perfectamente limpio, colocándolo encima del área cóncava del portaobjetos
4. Se invertirá la preparación5. Se observa al microscopio con objetivo inicialmente
de 40 aumentos
TINCIONES
Colorantes vitales
Fijación por calor
Fijación química
Fijación
Extensión
FACTORES QUE AFECTAN LA TÉCNICA DE TINCIÓN
1. Fuerza del colorante
2. pH del colorante
3. Conservación del colorante
4. Elaboración
5. Técnicas empleadas
6. Temperatura
7. Cantidad de muestra
8. Realizar correctamente el frotis
9. Soluciones mordientes
10. Tiempos de tinción
TIPOS DE COLORANTES
BASICO • Ion cargado positivamente
ACIDOS • Ion cargado negativamente
MORDIENTES• Dan
afinidad a la célula
BASICO
ACIDO
MORDIENTES
Safranina, fucsina básica, cristal violeta y
azul de metileno
Tejidos animales afectados por m.o.
Eosina, fucsina acida y rojo Congo
Engrosan las estructuras externas de las células, iodo , lugol
TÉCNICAS USUALES DE TINCIÓN PARA BACTERIAS
TINCION USO TECNICATinción simple Un colorante proporciona
contraste para observar mejor un organismo
completo
Se tiñe con un colorante básico durante 5 minutos.
Se aclara con agua, todas las bacterias se
tiñen, la mayoría de los tejidos no
Tinción diferencial (Tinción de Gram)
Dos o mas colorantes, distingue entre bacterias
Gram (+,-)
Se cubre la preparación de bacterias fijas con cristal violeta, iodo, se
decolora con acetona al 95%, las Gram positivas permanecen teñidas de cristal violeta, las Gram
negativas de rosa
TINCION USO TECNICA
Tinción de alcohol-acido(Ziehl-Neelsen)
Dos colorantes; distingue entre las mico bacterias
(acido-alcohol resistencia) y el resto de las bacterias
Se tiñen las células con fucsina básica y se
calienta a emisión de vapores durante 5 minutos. Todas la
bacterias se tiñen de rojo. Se decolora brevemente
con una mezcla de alcohol- HCl. Las
bacterias resistentes se tiñen de rojo, todas las
demás se decoloran. Se trata con el colorante de
contraste azul de metileno. Las bacterias
alcohol-acido resistentes continúan teñidas de rojo, las otras se tiñen de azul
TINCION USO TECNICA
Tincion especificas(Tincion de esporas de
Wirtz-Conklin)
Tiñe selectivamente las endosporas
Se cubre la preparación con verde de malaquita y se calienta a emisión de
vapores durante 60 segundos. Se lava con
agua durante 30 segundos y se tiñe con
safranina. Las endosporas retienen el
color verde, el resto de la célula toma el color rosa
Tincion de flagelos de Leifson
Permite observar los flagelos
A las células previamente fijadas, se le añade una mezcla de acido único
(mordiente) y del colorante rosanilina. El mordiente engruesa los
flagelos y el colorante los tiñe
TINCION USO TECNICA
Tinción negativa Revela la presencia de capsulas
Se utiliza tinta china o nigrosina para teñir una preparación en
fresco del espécimen. Las partículas de
colorante no pueden penetrar en la capsula, que se observa como
una región clara alrededor de la célula
TINCIÓN SIMPLE1. Si la muestra es solida tomarla con una asa bacteriológica
estéril2. Si la muestra es liquida tomarla con una pipeta Pasteur estéril3. Extender ambas de manera uniforme y homogénea por un
portaobjetos 4. Dejar que la muestra se seque al aire, una vez seca se fija con
calor, haciendo pasar la muestra de 2 a 3 veces a la llama del mechero
5. Cubrir el portaobjeto con un correspondiente colorante, que para esta tinción suele ser azul de metileno, o azul de toluidina dejándose actuar por 5 minutos
6. Transcurrido el tiempo, se verterá agua abundante en la preparación, para eliminar restos de colorante
7. Dejar secar la preparación al aire8. Observar al microscopio con objeto de inmersión
TINCIÓN GRAM1. Realizar la preparación con la correspondiente fijación por el método ya
explicado2. Aplicar sobre el portaobjetos el primer colorante que corresponderá a cristal
violeta durante 1 minuto, o violeta de genciana durante 2 minutos3. Lavar abundantemente con agua destilada para eliminar el exceso de
colorante4. Añadir mordiente, el lugol, que actuara fijando el colorante anterior a las
bacterias, aplicándose durante 1 minuto5. Se vuelve a eliminar el exceso mediante u lavado con abundante agua
destilada6. Decolorar con alcohol del 96° unos 20 segundos o hasta arrastrar todos los
restos.7. Lavar con agua abundante8. Cubrir el portaobjetos con el segundo colorante o colorante de contraste
(safranina) durante 1 minuto9. Lavar con agua para arrastrar los restos de colorantes y dejar secar10. Observar con objetivo de inmersión11. Gram positivas cristal violeta12. Gram negativas rojo-rosado
La tinción de ácido-alcohol resistencia se utiliza para identificar a Mycobacterium, ya que esta bacteria posee ceras en su pared
celular que resisten la decoloración. La microfotografía muestra masas de células de M. leprae en el interior de sus células
hospedadoras. Las mico-bacterias permanecen teñidas de rojo, mientras que el resto de las bacterias toman el color azul
del colorante de contraste.
Tinciones específicas. (a) La tinción de Wirtz-Conklin se utiliza para observar endosporas. Bacilius cereus es una bacteria esporulada. Las endosporas
mantienen la tinción primaria verde, mientras que las otras células se observan teñidas con la coloración de contraste rosa. (b) La tinción de
Leifson revela que este microorganismo posee flagelos, lo cual contribuye a su identificación como Spirillum volutans..(c) La tinción negativa con tinta china permite observar que esta bacteria posee cápsula, lo que facilita su identiticación como Klebsiella pneumoniae, agente causal de la neumonía.
MÉTODOS DE CONTROL PARA EL DESARROLLO DE MICROORGANISMOS
Esterilización
Desinfección
Antisepsia Asepsia
Microbiostasis
Microbiocida
Tratamiento para el control de microorganismos
Tratamiento Efecto Modo de acción Aplicación
METODOS FISICOS
Calor seco Esteriliza Desnaturaliza proteínas
Material seco
Calor húmedo Material liquido
Pasteurización Mata ciertos m.o.
Elimina patógenos, productos alimenticios
Frio Hace lento o detiene el
crecimiento de m.o.
Disminuye velocidad de reacción de
químicas
Conserva productos perecederos y m.o.
Radiación
Luz UV Esteriliza Daña el DNA Se esterilizan superficies
Rayos X, gamma Expulsa electrones de átomos
Material plástico y frutas y verduras
Filtración Elimina m.o. celulares
Elimina células Medios de cultivo, antibióticos
Desecación
Evaporación o calor
Mata muchos m.o.
Distorsiona la membrana
Conservación de alimentos
Sublimación o liofilización
Detiene el crecimiento m.o.
Detiene reacciones químicas
Conservación de cultivos
Tratamiento para el control de microorganismos
Tratamiento Efecto Modo de acción Aplicación
AGENTES QUIMICOS
Fenoles Matan la mayoría de m.o.
Desnaturalización de proteínas
Germicida
Compuestos fenólicos
Desinfectante, antiséptico
Desinfecta superficies, piel, termómetrosAlcoholes
Halógenos Oxida compuestos bioquímicos esenciales
Desinfecta superficies, piel, tratamiento de aguas
Peróxido de hidrogeno
Antiséptico para la piel
AGENTES SURFACTANTES
Jabón y detergente
Elimina m.o. Elimina físicamente m.o
Desinfecta superficies, mesas antiséptico de piel
Sales de amonio cuaternario
Alteran membranas Agente esterilizante
AGENTES ALQUILANTES
Formaldehido y glutaraldehido
Mata m.o. Inactiva enzimas Conservación de tejidos, vacunas y equipo quirúrgico
Oxido de etileno Gas utilizado para material sensible, hospitales
ESTERILIZACIÓN
Eliminación de todos los microorganismos, todos los aparatos y material deben ser esterilizado para obtener cultivos axénicos.
• Medio• Sustancias liquidas, solidas• Matraces• Tubos de ensayo• Placas • Pipetas etc.
ESTERILIZACIÓN POR CALOR
Húmedo 121°C1 atm
Volumen 20 minutos
AUTOCLAVE ESCOLAR
1. Tornillos móviles para el cierre hermético 2. Material a esterilizar 3. Vaciado de la caldera 4. Fuente de calor 5. Gas 6. Agua 7. Apoyo para alejar el material del agua 8. Caldera 9. Manómetro 10. Cierre de la tapa 11. Válvula de seguridad 12. Espita
USO DE INDICADORES BIOLÓGICOS
• Control de autoclave con
respecto a la capacidad
• Caldo nutritivo
• Azúcar
• Indicador de pH
• Esporas de Geobacillus
stearothermophilus ATCC
7953
• 60 ± 2 °C, 48 hrs
• Violeta rojizo transparente
(negativo)
• Amarillo naranja (positivo)
CONTROL DE EQUIPOS Y MATERIALES DE TRABAJO
ACTIVIDAD POR CORRIDA
DIARIO SEMANAL MENSUAL
Registrar la temperatura, presión de esterilización
X
Utilice cinta testigo para control de la esterilización
X
Utilizar indicadores biológicos de esterilización para verificar
la eficacia
X
Registro de uso X
Chequeo de nivel de agua X
Chequeo del funcionamiento de válvulas de seguridad
X
Limpieza interior y exterior X
Verificación del manómetro X
Limpieza del drenaje y sellos X
TRATAMIENTO PARA CONTROL DE M.O
FACTORES PARA LIMPIEZA EFECTIVA
1. Elección adecuada del producto de limpieza 2. Temperatura del agua 3. Dureza del agua 4. pH del agua utilizada 5. Período de contacto 6. Método de aplicación del detergente (por espuma, aspersión,
etc.)
COMO TRABAJA UN SANITIZANTE
1. Destructor de membrana celular: hipoclorito de sodio, acido peracético
2. Eliminación de la alimentación bacteriana y eliminación de desechos: amonio cuaternario
3. Inactivación de enzimas criticas: compuestos fenólicos
PRUEBA DE RETO BACTERIANO NMX-BB-SCFI-1999
Cepas: 1. Staphylococus aureus2. Escherichia coli3. BHI ó Soya Tripticaseina
Remover crecimiento con 3 ml de solución salina al 0.85%
Obtener suspensión que leída a 580 nm, de una lectura de 3 a 5% de %T
• Incubación de 20 a 24 h• Temperatura de 35 a 37
°C
• Resembrar tubo inclinado con 12 ml de agar nutritivo
Determinar el numero de UFC/ml y precisar el %T de una suspension de 75 a 125 X 108 UFC/ml
PR
EPA
RA
CIÓ
N D
E M
.O. D
E
PR
UEB
A
DETERMINACIÓN DE CUENTA VIABLE INICIAL
A un matraz Erlenmeyer que contenga 99 mL de la solución amortiguadora de fosfatos diluida estéril, transferir 1 mL de la suspensión de los microorganismos de prueba y efectuar las diluciones decimales necesarias para obtener placas que contengan cada una entre 25 y 250 colonias
Colocar en cajas de petri estériles, por duplicado1 mL de cada dilución, agregar a cada placa de 15 mL a 18 mL de agar para métodos estándar, homogeneizar y dejar solidificar invertirlas cajas de petri e incubar durante 48 h a 303 K - 308 K (30°C - 35°C). Contar las colonias contenidas en cada una de las cajas, en un cuenta colonias
DETERMINACIÓN DE CÉLULAS SOBREVIVIENTES
Para cada uno de los microorganismos de prueba, medir exactamente y por duplicado 99 mL del producto o su dilución, transferir a matraces Erlenmeyer de 250 mL con tapón de rosca estériles
Agitar los matraces, suspender la agitación, justamente antes de la inoculación, para que en el momento de la misma, aún exista movimiento residual del líquido y así facilitar la incorporación del inóculo. Inocular en forma individual cada matraz con cada uno de los microorganismos de prueba en el centro de la superficie del líquido, evitando tocar con la pipeta, el cuello o las paredes del matraz
Agitar el matraz con la muestra inoculada y exactamente 30 s después de la inoculación, transferir 1 mL de la misma, a un tubo de ensayo conteniendo 9 mL de la solución neutralizante diluida o del caldo neutralizante, mezclar y transferir por duplicado alícuotas de 1,0 mL a cajas de petri estériles y continuar diluyendo hasta tener las diluciones necesarias para obtener placas que contengan de 25 a 250 colonias, agregar a cada placa de 15 mL a 18 mL del medio agar para métodos estándar con neutralizante, homogeneizar, permitir que solidifique, invertir las placas e incubar durante 48 h entre 308 K a 310 K (35°C a 37°C). Después del período de incubación, contar el número de UFC en las placas
Obtener resultados:
Donde:
S= Celulas sobrevivientesC.V.= Cuetna viable inciial
Interpretación de resultados:
Un producto etiquetado como germicida, debe tener un por ciento de reducción de la cuenta viable de 99,999 % en 30 s de contacto a la concentración de uso recomendada, cuando la cuenta viable inicial se encuentra entre 75 y 125 X 108 UFC / mL
LAVADO DE MATERIAL• pH • Azul de Bromotimol
al 4%• 16 de NaOH 0.01 N • 1 g de ABT
• Cloro residual• Almidón-Yoduro• 2 g almidón en 100 ml de
agua• 8 g de KI• Formaldehido ó cloroformo• 2 a 3 semanas de
estabilidad
Color Cloro residual (mg/litro)
Incoloro 0.0
Celeste 0.1 a 0.3
Azul oscuro > 0.3
CEPARIO
1. Cepas Estándar de Control de Calidad
2. Colecciones de cepas
• ATCC: American Type Collection USA
• NCIC: National Collection of Industrial Bacteria INGLATERRA
• JFCC: Japanese Federation of Culture Collection of Microorganism JAPON
• CCTM: Colección Nacional FRANCIA
• RIA: Reseac Institute for Antibiotics USSR
• NCIB: Colección Nacional Industrial ESCOCIA
• DSM: Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen ALEMANIA
3. Requisitos de las cepas
• Características típicas
• Características estables
• Reproducibilidad
CONSERVACION DE CEPAS EN MEDIO DE CULTIVO INCLINADO CON ACEITE MINERAL
• Agar de Cebrero-Corazón
• Agar Mueller-Hinton
• Esterilizar aceite a 15 lb de presión por
45 minutos
• Incubación por 24 h a 35 °C
• 1 ml de aceite mineral
• Cultivos viables por 2 años
• Control de calidad de trabajo diario
• Cultivos jovenes de 24 o 48 h antes
• Resiembra dos veces por semana
• Cepas semistock
• Etiquetado de cepas
MEDIOS DE CULTIVO
Tipos de medio de cultivo:
1. Medios definidos
2. Medios complejos
3. Medios selectivo
4. Medios diferenciales
5. Medios selectivos-
diferenciales
6. Medias de
enriquecimiento
TIPO DE MEDIO CARACTERISTICA
Medios definidos Es aquel del cual se conoce su composición exacta, ha sido preparado a partir de compuestos químicos puros
Medios complejos Se desconoce la composición química exacta de un medio complejo, se preparan a partir de extractos de productos
naturales tales como carne, sangre, caseína, levadura o soja
Medio selectivo Favorece el crecimiento de ciertos microorganismos, mientras suprime el crecimiento de otros, se utilizan para aislar especies particulares a parir de mezclas complejas
Medios diferenciales Se identifican colonias de un determinado microrganismo
Medios selectivos diferenciales
Actúan como un tamiz grosero que disminuye el campo de identificación.
Medios de enriquecimiento
Aíslan u tipo particular de microrganismo a partir de una población mixta de gran tamaño
CONTROL DE CALIDAD EN MEDIOS DE CULTIVO
CARACTERISTICAS
• Higroscópicos• Temperatura ambiente• Protegidos de luz y humedad• Vida útil de 2 años
CARACTERISTICAS DE CALIDAD
• pH • Prueba de promoción de crecimiento• Prueba de funcionalidad• Esterilidad• Validación de medios de cultivo
FALLAS Y CAUSAS EN LA PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO
• Valor de pH incorrecto• Turbidez o precipitación• Oscurecimiento• Gel reblandecido• Crecimiento pobre• Control de suplementos
pH Antes y Después de la esterilización
Prueba de promoción de crecimiento
Tubos o Cajas recién esterilizadasCepas de trabajo diario E. Coli,
Enterobacter aerogenes método por estría
Prueba de funcionalidad
Inhibición del crecimiento de diferentes m.o. y favorecen el crecimiento de otras, se inoculan microorganismos que deben
ser inhibidos
Esterilidad Un par de tubos o cajas se incuban sin ser inoculados de 48 a 72 h se hace por lote
preparado
Validación de medios de
cultivo
1. Técnica ecométrica de Mossel y Col2. Técnica de Nefelómetro de Mac Farland3. Índice de Recuperación
ESCALA MAC FARLAND
TUBO Cl2Ba 1% SO4H2 1% U.F.C/ml
1 0,1 9,9 3,0x108
2 0,2 9,8 6,0x108
3 0,3 9,7 9,0x108
4 0,4 9,6 1,2x109
5 0,5 9,5 1,5x109
6 0,6 9,4 1,8x109
7 0,7 9,3 2,1x109
8 0,8 9,2 2,4x109
9 0,9 9,1 2.7x109
10 1,0 9,0 3,0x109
ESCALA MAC FARLAND
OBTENCION DE CULTIVOS AXENICOS Y MIXTOS
Axénico: consiste en una sola especie microbiana proveniente de una sola
célula (laboratorio)
Mixto: viven diferentes especies de forma continua
(naturaleza)
MÉTODOS DE AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
Técnicas Indirectas
• Turbidez • Peso seco• Cultivos Continuos
Técnicas Directas
• Recuento directo al microscopio (vivas y muertas)
• Siembra por estría• Vaciado en placa • Extensión en placa• Recuento en tubo múltiple• Filtración
Espectrofotómetro mide la cantidad de
luz transmitida de una solución o
cultivo liquido de células microbianas.
Cuanto mayor masa de células tenga
un cultivo, mayor será su turbidez, se
transmitirá menos luz y la lectura en el
espectrofotómetro será mayor.
El espectro se utiliza para estimar un
cultivo denso, y registrar el crecimiento
de una población microbiana, para ello
necesitamos una curva patrón.
PESO SECO
1. Las células de un cultivo se pueden medir dividiendo el peso seco del cultivo por el peso seco de una célula individual. El peso seco de las células se determina separándolas del medio, desecándolos y pesándolas.
2. Se hace por centrifugación, ultra centrifugación, luego las células se re suspenden en agua destilada y se filtran o centrifugan de nuevo.
3. Después las células del segundo lavado se secan en horno a 105 °C por 24 h y luego se enfrían en el desecador
CULTIVO CONTINUO (QUIMIOSTATO)
Mantiene una población microbiana en un estado de crecimiento constante
CAMARA LIBRE DE OXIGENO
CAMARA LIBRE DE OXIGENO
PARA ANAERO
BIOS ESTRICT
OS
CÁMARA DE RECUENTO PETROFF-HAUSER
METODO DE AISLAMIENTO DE SIEMBRA POR ESTRIA EN PLACA
METODO DE
EXTENSION EN PLACA
Y VACIADO EN
PLACA
TÉCNICA DE NMP Ó TUBO
MÚLTIPLE
Número de tubos con turbidez inoculados a partir de tres
diluciones sucesivasNMP
Número de tubos con turbidez inoculados a partir de tres
diluciones sucesivasNMP
0 1 0 0,18 5 0 0 2,3 1 0 0 0,20 5 0 1 3,1 1 1 0 0,40 5 1 0 3,3 2 0 0 0,45 5 1 1 4,6 2 0 1 0,68 5 2 0 4,9 2 1 0 0,68 5 2 1 7,0 2 2 0 0,93 5 2 2 9,5 3 0 0 0,78 5 3 0 7,9 3 0 1 1,1 5 3 1 11,0 3 1 0 1,1 5 3 2 14,0 3 2 0 1,4 5 4 0 13,0 4 0 0 1,3 5 4 1 17,0 4 0 1 1,7 5 4 2 22,0 4 1 0 1,7 5 4 3 28,0 4 1 1 2,1 5 5 0 24,0 4 2 0 2,2 5 5 1 35,0 4 2 1 2,6 5 5 2 54,0 4 3 0 2,7 5 5 3 92,0
5 5 4 160,0
TÉCNICA DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA
FROTIS EN SUPERFICIES
VIVAS E INERTES
MétodoMicroorganismos para los
que se utilizaTipo de
recuentoUsos / Limitaciones
IndirectoTurbidez La mayoria de las
bacterias y levadurasTotal Determina la turbidez con un
espectrofotómetro; rápido y reproducible; la suspensión
debe contener más de unos l0 millones de células por ml; se
requiere una curva patrónPeso seco Cualquier microorganismo Total Tedioso y requiere un cierto
tiempo, pero preciso y reproducible
DirectoRecuento
microscópicoCualquier microorganismo
unicelularTotal Muy útil para el recuento de un
tipo de células de una mezcla; requiere un cierto tiempo; no
es adecuado para cultivos diluidos
Recuento electrónico
Cualquier microorganismo unicelular
Total Muy útil para el recuento de células de un cultivo axénico;
rápido y preciso
MétodoMicroorganismos para
los que se utilizaTipo de
recuento Usos / Limitaciones
Recuento en placa
Cualquier microorganismo unicelular viable
Viables Muy sensible - puede detectar incluso una célula; lento y tedioso; para evitar el error debido al muestreo, se debe recontar un gran
número de coloniasNumero más
problableCualquier
microorganismo viableViables Utilizado para
microorganismos que son dificiles de cultivar en medio sólido y para
determinar contaminación por Escherichia coli en
aguas; requiere un cierto tiempo
Filtración Cualquier microorganismo viable
Viables Se concentra una muestra, de manera que se puede
recontar un pequeño número de células a partir de grandes volúmenes de
un líquido o de un gas
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
1. IMVIC• Indol• Rojo de Metilo• Voges Proskauer• Citrato2. Enzimáticas• Oxidasa• Catalasa• Coagulasa• Ureasa3. Reducción Nitratos• B-D Galactosidasa • Descarboxilasa4. Otras• Agar TSI• Óxido - Fermentativa o de Hugh-Leifson• Ácidos y gases• Hidrolisis Gelatina5. Índice Analítico de Perfil6. Enlaces externos
PRUEBAS
BIOQUÍMICAS COMUNES
1. Granados P. Raquel, “Microbiología Tomo 1”, 1° edición 2002, Editorial Thomson Paraninfo, SA de CV, México DF
2. Lansing M. Prescott, “Microbiología”, 5° edición, Editorial Mc Graw Hill, México DF
3. Michael T. Madigan, “Biología de los Microorganismos”, 10° edición, Editorial Prentice Hall, México DF
4. Patrick R. Murray, “Microbiología Medica”, 5° edición 2006, Editorial Elservier España , SA de CV, Madrid España
BIBLIOGRAFÍA