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RIA
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UNIDAD 5: RADIOINMUNOANÁLISIS
1 INTRODUCCIÓN
El radioinmunoanálisis (RIA) es una técnica inmunológica desarrollada por Solomon A.
Berson y Rosalyn Yalow en 1960 para determinar la concentración de insulina en el plasma
sanguíneo. Por ese motivo, R. Yalow recibió el Nobel de Medicina en 1977 (Berson murió en 1972).
Esta técnica proporcionó un gran avance de la endocrinología.
En la actualidad su potencial y uso son muy altos en diversas áreas de la biomedicina:
endocrinología hematología, farmacología clínica, oncología y enzimología.
Se puede desarrollar un RIA en principio para cualquier sustancia, que por sus características sea
capaz de inducir una respuesta inmunológica.
En sustancias que no inducen la formación de anticuerpos, se puede obtener un RIA acoplando el
analito (sustancia a estudiar) a una sustancia de alto peso molecular como una proteína.
Hoy en día, esta técnica se utiliza para detectar y cuantificar sustancias que se encuentran
en cantidades muy pequeñas y mezcladas con muchas otras. Es por tanto una técnica muy sensible
y muy específica.
Utilizando anticuerpos de gran afinidad se pueden cuantificar de forma exacta de
compuestos biológicos presentes en el organismo en concentraciones tan bajas como ng/ml
(nanogramo=10-9 g) o incluso de pg/ml (picogramo=10-12g), incluso hacerlo en mezclas con
enormes cantidades y diversidad de materiales extraños, por lo que no es necesario purificar
previamente la muestra.
En el RIA se utilizan isótopos radioactivos. Se trata de una técnica in vitro, es decir, se
extrae la sangre del paciente y es analizada para ver sustancias.
Se basa en una reacción antígeno-anticuerpo. Para poder entender el fundamento del RIA, es
necesario conocer los siguientes conceptos.
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CONCEPTOS PREVIOS DE INMUNOLOGÍA
1.1 Antígeno (Ag): o inmunógeno
Son las moléculas capaces de inducir una respuesta inmune, pudiendo reaccionar con los
anticuerpos formados. Suelen ser moléculas de gran tamaño.
Existen varios factores que determina el poder antigénico de una molécula. Entre ellos
está su naturaleza química, tamaño, complejidad, conformación y accesibilidad, así como su calidad
de extraño.
Reúnen las siguientes características:
a) Son exógenas, es decir, extrañas al organismo.
b) Son inmunológicas, es decir, capaces de inducir la formación de anticuerpos en el hospedador.
c) Reacciona específicamente con estos anticuerpos.
d) Son de naturaleza química muy variada (proteínas, polisacáridos, lipoproteínas, etc.) y de gran
peso molecular.
e) Se localizan en la superficie de un agente patógeno o bien son sustancias producidas y liberadas
por éste.
-Las macromoléculas antigénicas constan de dos
tipos de estructuras:
1) El portador de la antigenidad, que es una
macroproteína .
2) Los determinantes antigénicos (epítopes), que son
pequeñas moléculas unidas a la anterior, con una
configuración espacial particular que puede ser
identificada por un anticuerpo; por tanto, los epítopes son los responsables de la especificidad del
antígeno por el anticuerpo.
Una misma molécula antigénica puede inducir la producción de distintas moléculas de
anticuerpo, tantas como determinantes antigénicos distintos posee. Por esta razón se dice que los
antígenos son polivalentes.
Generalmente, un antígeno posee entre 5 y 10 determinantes antigénicos en su superficie
(aunque algunos tengan 200 o más), que pueden ser distintos entre sí, por lo que podrán reaccionar
con diferentes tipos de anticuerpos (reacciones cruzadas).
1.2 Haptenos:
Son moléculas de menor tamaño, que por sí solas no pueden
provocar una respuesta inmune, pero que asociadas a una molécula
transportadora inmunogénica ( o carrier) pueden reaccionar
específicamente con los anticuerpos formados.
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Pero no se consideran antígenos ya que no provocan la síntesis o formación de anticuerpos, no son
inmunológicos).
1.3 Anticuerpos (Ac):
Son glucoproteínas que forma el organismo como respuesta al contacto con un Ag y que
reaccionan específicamente contra él.
Debido al papel que desempeñan en el sistema inmunitario y a que, en la electroforesis,
migran junto a otras globulinas, también se les llama inmunoglobulinas (Ig).
Las forma el organismo como respuesta al contacto con un Ag específico y que reaccionan
específicamente contra él.
Se encuentran en la sangre, la linfa y las
secreciones corporales.
Las inmunoglobulinas están compuestas por cuatro
cadenas polipeptídicas:
- 2 cadenas pesadas iguales (cadenas H)
-2 cadenas ligeras también idénticas (cadenas L)
Unidas entre sí por puentes disulfuro, constituyendo
una estructura simétrica en forma de Y griega, flexible.
- Las moléculas de los anticuerpos son muy parecidas, es la
región variable la que determina su poder de combinación
específica con los epítopes (determinantes antigénicos) del
antígeno.
-Existen diferentes clases de anticuerpos o
inmunoglobulinas: IgG, IgA, IgD, IgM e IgE.
La variabilidad de las Ig y su heterogeneicidad tiene una
base genética.
-Anticuerpo monoclonal o paraproteína.
Los anticuerpos monoclonales son anticuerpos que se unen a un mismo epítope específico
de un antígeno (no producen reacciones cruzadas).
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En los pacientes con mieloma múltiple, las células del mieloma son productora de una Ig
que se divide continuamente, debido a ello, el paciente posee enormes cantidades de células
idénticas, derivadas de la célula original, que forman una sola familia o clon. Todas estas células
sintetizan la misma Ig que recibe el nombre de Anticuerpo monoclonal o paraproteína.
Los Ac monoclonales también pueden obtenerse in vitro, fusionando linfocitos B,
inmunizados contra un determinado Ag,
con células de mieloma, para producir un
clon de hibridomas en constante división
y dedicado a formar el Ac específico
contra ese Ag.
Los hibridomas son
suficientemente diluidos y cultivados
para obtener un número diferente de
determinadas colonias, las cuales
producen sólo un tipo de anticuerpo.
Los anticuerpos de diferentes
colonias son analizados para conocer su
capacidad de unirse a un antígeno
determinado, por ejemplo con un tipo de
test llamado ELISA, y para seleccionarse y
aislarse de la manera más efectiva.
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1.4 Reacción antígeno-anticuerpo (Ag-Ac):
Cuando un Ac entra en contacto con un Ag contra el que está dirigido, ambos se unen
formándose un complejo Ag-Ac o complejo inmune o inmunocomplejo.
Esta unión entre el Ag y el Ac es reversible y su permanencia depende del grado de
adaptación entre ambas moléculas y de la fuerza y estabilidad de los enlaces que las unen.
Cuando un Ac sólo es capaz de reaccionar
contra un Ag, se dice que ese Ac es muy
específico para este Ag.
Pero muchas veces, varios Ag pueden
compartir uno o más determinantes antigénicos
idénticos o similares. En este caso, un mismo Ac
puede reaccionar con todos los Ag y se considera
que su especificidad es baja. A este último
fenómeno se le llama reactividad cruzada.
2 FUNDAMENTO DEL RIA
El RIA (radio-inmuno-assay) consiste en enfrentar la sustancia buscada en la muestra
problema (analito o antigéno no marcado) a una molécula radiomarcada (antígeno marcado) y
ambas compiten por la unión a sustancias específicas (anticuerpo Ac).
Como resultado de esta unión competitiva, la cantidad del complejo Ac-Ag* radiadiactivo
disminuye a medida que aumenta la concentración de Ag no marcado presente en el medio.
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La evaluación de los resultados obtenidos se ejecuta, posteriormente, mediante el recuento de la
radiactividad desprendida del complejo formado.
LA TÉCNICA ES LA SIGUIENTE:
Si queremos cuantificar un determinado antígeno problema en una muestra.
-Se obtienen anticuerpos específicos, para ello se inyectan en un animal pequeñas cantidades en
varias dosis del antígeno muy purificado. El animal generará anticuerpos que podrán ser recogidos
del plasma sanguíneo.
Se construye la recta de calibración:
-Se mezcla una cantidad constante de antígeno marcado radioactivamente y una cantidad constante
y conocida de un anticuerpo para ese antígeno.
-Se produce la reacción entre antígeno (Ag) y anticuerpo (Ac)
-Se separa la fracción de antígeno que se ha unido de la que permanece libre (hay varias formas de
hacerlo.
- Se determina la radioactividad.
-Se repite el proceso pero añadiendo concentraciones crecientes conocidas de antígeno frio junto
con el antígeno marcado y se mide la radiactividad.
-El antígeno frío (no marcado) competirá con el marcado para unirse al anticuerpo, y se observará
un descenso en la medida de la radioactividad.
-Este descenso es proporcional a la concentración de antígeno frío en la muestra.
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-Para cuantificar el antígeno presente en la muestra:
-Se añaden Ac a una placa de titulación y quedan unidos al soporte sólido.
-Se agrega el Ag* en cantidad conocida y el Ag de la muestra problema.
-Se elimina el antígeno no unido por decantación y lavado, y se determina la cantidad de marcaje
unido.
-Se interpola el valor obtenido en la recta de calibración que debe haberse realizado con
anterioridad.
3 ELEMENTOS DEL RIA
Los elementos necesarios para la realización del RIA son los elementos necesarios para
establecer el mecanismo de competición:
� (Ac) anticuerpo específico-> Ligandos (Anticuerpos)
� (Ag) antígeno puro similar al antígeno a determinar ->Antígeno estándar
� (Ag*) antígeno marcado. ->Antígeno radiactivo (marcadores radiactivos)
� Asimismo se requiere de algún sistema capaz de distinguir la proporción de antígeno que
ha quedado unido al anticuerpo del que ha quedado libre. Esto se consigue mediante algún
método de separación.
3.1 Ligandos (Anticuerpos)
Los ligandos son elementos capaces de fijarse a una sustancia (problema) con alta afinidad
y especificidad.
� Los ligandos más usados son los anticuerpos.
Estos pueden ser fabricados, incluso, contra sustancias de baja capacidad inmunogénica, al
adherirse a un portador adecuado (por ejemplo a una proteína) y transformarlas en un hapteno.
� También se pueden emplear como ligandos proteínas de fijación naturales. Éstas tienen las
desventajas de poseer una afinidad menor y una especificidad irregular.
Además, sólo existen para un número reducido de sustancias (por ejemplo para determinar
hormonas tiroideas pueden utilizarse sus globulinas plasmáticas trasportadoras).
Las técnicas que usan proteínas de fijación reciben el nombre de RADIOENSAYOS.
� Otras estructuras potencialmente utilizables como ligandos
son los receptores de la membrana celular.
Éstos son complejos moleculares capaces de
reconocer e interaccionar selectivamente con la porción
biológicamente activa de una sustancia (por ej de un
fármaco). Pero, son bastantes inestables y pueden alterarse
en el proceso de aislamiento de los tejidos donde están
presentes.
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3.2 Antígeno estándar
Ya mencionamos anteriormente que la adición al sistema de reacción del antígeno no
marcado Ag se traduce en una disminución del complejo antígeno marcado-anticuerpo, disminución
que va aumentando a medida que aumenta la concentración de antígeno no marcado.
Disponiendo de un antígeno estándar, idéntico en su comportamiento antigénico al
antígeno que deseamos cuantificar, y utilizando cantidades crecientes del antígeno, es posible,
mediante separación del complejo radiactivo obtenido para cada una de las distintas
concentraciones, medir la radiactividad y construir una curva con los valores obtenidos. La gráfica
resultante recibe el nombre de curva de calibración.
3.3 Antígeno radiactivo (marcadores radiactivos)
Para obtener el antígeno marcado, es decir el antígeno radiactivo, se utilizan isótopos
radiactivos. Pueden emplearse marcadores isotópicos emisores de radiaciones β, como el tritio
(3H); aunque más comúnmente, se utilizan otros que emiten radiaciones γ (57Co, 75Se, 131I y 125I).
De todos ellos, el usado más frecuentemente es el yodo -125.
El proceso de marcar la molécula indicadora puede acarrear una reducción de su
inmunorreactividad y puede necesitar de algunos requisitos (por ejemplo, para marcar con
isótopos del yodo, el antígeno a marcar debe poseer residuos de tirosina).
El problema de los antígenos marcados es su baja estabilidad. La mayoría de ellos no
pueden utilizarse transcurridas dos semanas de su preparación, o de 2 meses si se conservan
liofilizados en frío o congeladas a -20ºC.
4 SISTEMAS DE SEPARACION
Dado que el antígeno marcado Ag* es el único componente realmente medible gracias a su
emisión de radiación, tanto si se considera en su forma
libre Ag* como formando el complejo Ag*-Ac, es
fundamental disponer de un sistema capaz de
separlos.
Los métodos empleados para la separación se
basan en las diferentes propiedades físicas que
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existen entre la fracción de Ag* libre y la unida al anticuerpo (Ag*-Ac):
a) Precipitar la fracción ligada (por ejemplo, mediante sulfato amónico) y dejar en
disolución la fracción libre.
b) Adsorción de la fracción libre por productos como el carbón activado, el talco o el
Florisil.
c) Sin embargo, el método más utilizado consiste en recubrir con Ag o Ac, según el caso,
un soporte sólido (generalmente, las paredes internas de un tubo o las de los pocillos
de una placa) al que van a ligarse, directa o indirectamente, algunas moléculas
indicadoras. Tras ello, la fracción libre puede ser eliminada
fácilmente mediante lavado (determinación en fase sólida).
d) Otro método consiste en partiendo de unas cantidades conocidas de un Ag control marcado
radiactivamente, se añade un anticuerpo que se une formando el complejo Ag*-Ac
A continuación se añade un un 2º anticuerpo dirigido el anticuerpo unido al antígeno (un
antianticuerpo) que origina la precipitación del complejo Ag*-Ac debido a la formación de Ag*-
Ac-antiAc .
A mayor cantidad
de Ag en la muestra
(Ag no marcado),
menor será la
radiactividad del
precipitado, ya que
el Ag de la muestra
ha competido con el
Ag* marcado.
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� Estas técnicas son variables en función del antígeno que se quiera analizar y en general
han de caracterizarse por ser rápidas, baratas y simples.
5 TIPOS DE RIA
Existen dos categorías principales de RIA: Análisis competitivo y no competitivo.
5.1 RIA Competitivo
En el análisis competitivo el
antígeno de la muestra y el antígeno
marcado (Ag*) se ponen en contacto con
un anticuerpo específico en
concentración limitante, compitiendo
por los sitios de unión del Ac.
Cuanto más Ag haya en la muestra, menos Ag* se unirá al Ac, por lo que la medida de la
radiactividad de la fracción ligada es inversamente proporcional a la concentración de analito.
Generalmente el soporte sólido está sensibilizado con un Ac específico para un Ag. Al
poner en contacto este soporte sólido sensibilizado con la muestra problema que puede contener
ese Ag buscado y con un reactivo preparado a base del mismo Ag pero marcado con un isótopo
radiactivo.
El Ag problema va a competir con el Ag radiomarcado por su unión al Ac; de forma que,
cuanto mayor sea la concentración del Ag en la muestra problema, menor será la cantidad de Ag
radiomarcado que se fija al Ac.
A continuación, se elimina, mediante lavado, el Ag radiomarcado no ligado (Ag
radiomarcado libre).
Finalmente, se cuantifica la radiactividad desprendida del soporte sólido y que procede del
Ag radiomarcado fijado al Ac.
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Cuanto menor sea la radiación medida, menos Ag radiomarcado se habrá ligado, y mayor
será la concentración del Ag en la muestra problema.
5.2 RIA No competitico o RIA de Sandwich.
Recientemente se ha introducido el análisis inmunorradiométrico no competitivo conocido
como técnica de “sándwich”.
Se utilizan dos Ac, uno de ellos unido en fase sólida y otro marcado, con capacidad de
unión a diferentes lugares antigénicos del Ag problema. Ambos Ac se
encuentran en cantidad excesiva, formándose un sándwich Ac-Ag-Ac*.
Se producirán tantos complejos Ac*-Ag problema como lo permita la
cantidad de Ag existente. Tras lavado para eliminar el Ac*2 no unido. Se
determina la cantidad de anticuerpo marcado unido.
Las cpm son directamente proporcionales a la concentración del Ag
problema.
A partir de una recta patrón se interpola el valor obtenido para saber la concentración de
Ag presente o bien se realiza la recta de calibrado.
-Cuando se quiere cuantificar un anticuerpo de una muestra, un Ag se adhiere, previamente, a un
soporte sólido (sensibilización).
Tras ello, se añade al soporte sólido con el antígeno unido, la muestra problema que puede
contener el Ac buscado y dirigido específicamente contra ese Ag. Las proteínas que no se fijan al Ag
son eliminadas mediante lavado. Después, se agrega a todo lo anterior una anti-inmunoglobulina
que está marcado con un isótopo radiactivo y que tiende, a su vez, a fijarse al Ac.
Finalmente, se evacua, mediante lavado, el ligante radiomarcado libre y se cuantifica la
radiactividad desprendida del soporte sólido y que procede del ligante radiomarcado fijado, a través
del Ac, al Ag. Cuanto mayor sea la radiación medida, más Ac problema habrá en la muestra.
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5.3 IRMA
La pérdida de eficacia inmunorreactiva y de estabilidad del Ag cuando es marcado por un
isótopo llevó a estudiar la posibilidad de marcar el Ac, ya que la zona de marcaje de éstos está
alejada de la parte inmunorreactiva de su molécula. Así surgió el análisis inmunorradiométrico
(IRMA).
Este análisis puede ser competitivo y no competitivo.
� En el primero se establece la competición entre un Ag unido al tubo (en fase sólida) de
cantidad conocida y el Ag problema, para ligarse al Ac*. Realizada la separación por
decantación o lavado, las cpm del complejo Ag-Ac* unida a la fase sólida son inversamente
proporcionales a la cantidad de Ag problema.
Recientemente se ha introducido el análisis inmunorradiométrico no competitivo conocido
como técnica de “sándwich”, en el que el Ac* se encuentra en exceso, formándose tantos
complejos Ac*-Ag problema como la permita la cantidad de Ag existente.
Se utilizan dos Ac, uno de
ellos unido en fase sólida y
otro marcado, con capacidad
de unión a diferentes lugares
antigénicos del Ag problema.
Ambos Ac se encuentran en
cantidad excesiva.
-En la primera parte del
ensayo se pone en contacto
el Ag problema con el tubo
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que contiene el Ac en fase sólida, formándose complejos Ag-Ac.
-Posteriormente añadimos el Ac*, produciéndose un sándwich Ac-Ag-Ac*.
-Tras lavado para eliminar el Ac libre marcado, las cpm son directamente proporcionales a la
concentración del Ag problema.
6 CONTAJE DE LA ACTIVIDAD DE LAS MUESTRAS. INSTRUMENTOS DE MEDIDA
La radiactividad resultante se cuantifica mediante un contador gamma o uno de centelleo
líquido. Las unidades en que se mide la radiactividad son las cuentas por minuto (cpm).
El uso de un aparato u otro depende del tipo de radiación emitida por el marcador
radiactivo.
� En el caso de emisores beta, con poco poder de penetración, será necesario un contador
de centelleo líquido que permita un contacto cercano entre el detector y la muestra.
� En el caso de los emisores gamma como el 125I, mucho más penetrantes, se utilizará un
CONTADOR DE CENTELLEO SÓLIDO, preferiblemente de pozo (único o multipozo), para
mejorar la eficiencia del contaje.
El elemento más importante del mismo es el cristal de yoduro sódico enriquecido con talio, NaI(Tl).
La radiación del 125I ioniza el cristal produciendo fotones de luz visible en cantidad
proporcional a la energía entregada por el fotón incidente.
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Como se puede observar en la figura, la luz incide a
continuación sobre un tubo fotomultiplicador que
producirá un haz de electrones, los acelerará y
amplificará para después enviarlos a un dispositivo
electrónico, que finalmente los convertirá en
impulsos eléctricos.
Figura 8. Esquema de un contador de pozo de centelleo sólido, con cristal de NaI(Tl).
La magnitud de la señal, en voltios,
es proporcional a la energía absorbida por
el cristal del contador.
El analizador de señal será el
encargado, previa calibración por parte del
operador, de aceptar o rechazar las señales
que tengan un determinado rango de
energía, que constituye la "ventana"
electrónica del contador, que limita la
entrada de energías que no correspondan
al valor energético del Rn (fotópico).
El dispositivo de salida suele ser, en RIA, una escala de recuento que suma las cuentas que
pasan por el analizador. Unido a una computadora puede proporcionar datos relacionados con el
contaje total.
Así mismo, existe la posibilidad de, mediante contadores más complejos, trabajar con
diferentes isótopos al mismo tiempo, realizando las correcciones numéricas necesarias.
Resulta de gran importancia en el trabajo de cualquier laboratorio de RIA el adecuado
MANTENIMIENTO DEL CONTADOR para evitar incorrecciones en el contaje.
Tres son los parámetros que se deben tener en cuenta al a hora de evaluar el correcto
funcionamiento del aparato:
� Eficacia del contaje. Este parámetro representa el número de cuentas con relación al número
de emisiones del isótopo utilizado (cpm/dpm) y se comprueba cuando se calibra el aparato
utilizando un patrón con un esquema de desintegración similar al del radionúclido con el que
queremos trabajar.
� Desviación estadística.
� Actividad de fondo, que puede artefactar los resultados de las diferentes lecturas.
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7 REPRESENTACIÓN DE LOS DATOS Y CUANTIFICACIÓN
En el RIA, se recomienda analizar el blanco (preparado sin marcador radiactivo), la muestra
problema y cada uno de los patrones, por duplicado.
Una vez terminado el ensayo, se calcula la media aritmética de los resultados obtenidos
con cada par de determinaciones y, posteriormente, se hallan las cuentas netas (N.C.) conseguidas
con la muestra y con los patrones, de la forma que a continuación se indica:
N.C. (B) = media aritmética de las cpm (X) de la muestra o patrón – medida aritmética de las cpm del
blanco
NC patrón(B0) = X cpm patrón- Xcpm blanco
NCmuestra(B)= X cpm muestra – Xcpm blanco
En el RIA competitivo, además, se calcula el porcentaje de ligamiento o PB (percent binding)
logrado con la muestra y con cada patrón, de la siguiente manera:
P.B. = __B x 100
B0
B = cuentas netas de la muestra o patrón
B0 = cuentas netas de un preparado que carece de Ag sin marcar y con el que se ha de obtener,
por lo tanto, un máximo de ligamiento del Ag radiomarcado.
Los resultados obtenidos tras el contaje de los tubos se llevan a la curva patrón en la que
tendremos la actividad ligada a los inmunocomplejos frente a concentraciones conocidas de
antígeno (estándares).
Se traza, en un papel semilogaritmico, una curva de calibración.
Para ello, se sitúan, en ordenadas, las cuentas netas o porcentajes de ligamiento, según el
caso, conseguidos con los patrones y, en abscisas, los valores de concentración que les
corresponde.
La concentración del analito* en la muestra problema se haya mediante interpolación en esta
curva de calibrado.
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8 CARACTERISTICAS Y VENTAJAS DEL RIA El RIA tiene varias ventajas sobre otros métodos analíticos. Estas ventajas se concentran en
una mayor sensibilidad, especificidad, exactitud y precisión. Es necesario, por tanto, definir estos
conceptos.
Sensibilidad
Es la capacidad para detectar pequeñas cantidades de sustancias. Está favorecida por la
capacidad para medir cantidades muy pequeñas de radiactividad.
Especificidad
Es la capacidad para medir sólo las sustancias a detectar, evitando al máximo las reacciones
cruzadas con otras de estructura biológica muy similar. Ejemplo: medida sólo de T4 y no de T4 + T3.
La especificidad del RIA era excelente y ha sido mejorada con la introducción de los Ac
monoclonales.
Exactitud
Capacidad de detectar la cantidad real de una sustancia con el mínimo de errores.
Precisión
Capacidad de reproducibilidad de una determinación al repetirla en el mismo ensayo
(intraensayo) o en ensayos diferentes (interensayo).
En el RIA las determinaciones son extremadamente reproducibles.
LAS VENTAJAS DEL RIA son:
– La vida media del I-125, marcador habitual, es de dos meses, lo que facilita considerablemente
su distribución y almacenamiento.
– La radiación emitida es muy escasa, muy por debajo de las severas normas distadas por los
organismos de seguridad nuclear de los diferentes países.
– Su volatilización hacia la atmósfera es insignificante, siempre menor del 1%.
– Esto, junto al mantenimiento de unas simples precauciones, impide la ingestión o inhalación
por el técnico.
Por tanto, ésta no debe ser una razón científica para el desarrollo de otras técnicas por el
momento más imprecisas.
– Con un criterio economista, los kits comerciales que no utilizan los Ri como marcador son más
caros y los equipos de contaje son más sofisticados que los simples contadores gamma y, por
tanto, sometidos a mayor cuidado en el mantenimiento.
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1 INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 1
1.1 Antígeno (Ag): o inmunógeno ................................................................................. 2
1.2 Haptenos: ................................................................................................................ 2
1.3 Anticuerpos (Ac): ..................................................................................................... 3
1.4 Reacción antígeno-anticuerpo (Ag-Ac): .................................................................. 5
2 FUNDAMENTO DEL RIA ........................................................................................................ 5
3 ELEMENTOS DEL RIA ............................................................................................................ 7
3.1 Ligandos (Anticuerpos) ........................................................................................... 7
3.2 Antígeno estándar ................................................................................................... 8
3.3 Antígeno radiactivo (marcadores radiactivos) ......................................................... 8
4 SISTEMAS DE SEPARACION ................................................................................................. 8
5 TIPOS DE RIA ....................................................................................................................... 10
5.1 RIA Competitivo .................................................................................................... 10
5.2 RIA No competitico o RIA de Sandwich. ............................................................... 11
5.3 IRMA ..................................................................................................................... 12
6 CONTAJE DE LA ACTIVIDAD DE LAS MUESTRAS. INSTRUMENTOS DE MEDIDA ......... 13
7 REPRESENTACIÓN DE LOS DATOS Y CUANTIFICACIÓN ................................................ 15
8 CARACTERISTICAS Y VENTAJAS DEL RIA ........................................................................ 16