UNIDAD: Iztapalapa

DIVISION: Ciencias Biológicas y de la Salud

CARRERA: Biología Experimental

MATERIA: Reporte de Servicio Social

¿e la acción ¿e ra¿icales libres pro¿xi¿os por arsénico y sus rnetabolitos, sobre DNA plasrniXco. 1

& A N O : María del Carmen Acuña González

MATRICULA: 92 330 213

" CARACTERIZACION DE LA ACCION DE RADICALES LIBRES PRODUCIDOS POR ARSENIC0 Y SUS METABOLITOS, SOBRE DNA PLASMIDICO "

INTRODUCCION

Toxinas ambientales

Los seres vivos estamos expuestos a la acción de numerosos agentes ambientales potencialmente dañinos de indole biológico, físico y química, denominados xenobióticos, los cuales pueden provocar procesos fisio-patológicos y genotóxicos. Así, cientos de toxinas naturales son generadas por microorganismos, hongos, plantas y animales que son muy perjudiciales para otros seres vivos. Además existen agentes dañinos que provienen de fuentes naturales de radiación y de la corteza terrestre, como los metales (Arnaiz, 1997). Sin embargo, la mayoria de los xenobióticos presentes en el ambiente tienen origen artificial, es decir, son generados por el hombre, entre los que se encuentran las radiaciones, aditivos alimenticios, medicamentos, pesticidas, solventes orgánicos, desechos industriales, etc.

Metales tóxicos

Los metales con propiedades físicas y químicas características, son elementos de gran importancia para los seres vivos, algunos de ellos actúan como cofactores en múltiples reacciones enzimáticas y forman parte constitutiva de macromoléculas esenciales. (Arnaiz, 1997); además, son de especial interés para el hombre debido a SUS aplicaciones tecnológicas. Sin embargo, aproximadamente 30 de ellos forman compuestos que resultan dañinos para el ser humano (Snow, 1991). A diferencia de otros agentes tóxicos, la presencia de los metales en el ambiente se debe a su distribución por los ciclos geológicos, biológicos y a las actividades antropomórficas como la extracción y uso de estos elementos que al ser manejados inadecuadamente contribuyen a su dispersión, de tal manera que pueden entrar en contacto con los seres vivos a través de partículas suspendidas en el aire o por la ingestión de alimentos y agua contaminados. (Quintus, 1995). Resulta importante destacar que la exposición a tales elementos puede ser aguda si se presenta en grandes dosis, generándose efectos a corto plazo ó crónica si es de forma continua y en bajas dosis, cuyos efectos se manifiestan a largo plazo. Además, la exposición se puede dar- de forma ambiental, accidental y laboral (Arnaiz, 1997; Ostrosky y Gonsebatt, 1997).

Arsénico

El arsénico es un metaloide, es decir un semimetal o metal de transición situado en el grupo V de la tabla periódica. Se encuentra en forma natural en la corteza terrestre, tejidos animales, vegetales de USO alimenticio y en algunas estados de la República Mexicana (Coahuila, Chihuahua, Durango, Zacatecas y San Luis Potosí) en el agua que se ingiere (Hopenhoyn-Rich, et al 1996; Cebrián, et al 1994).

€ 1 AS en su forma inorgánica puede ser liberado al ambiente a partir de fuentes naturales entre las que se encuentran principalmente depósitos de antimonio, azufre, bismuto, cobre, hierro, oro, plata, plomo y zinc; así como por la extracción' y fundición de otros metales y durante la manufactura de vidrios y químicos. Se usa frecuentemente en aleaciones, insecticidas, dispositivos electrónicos, en la formulación de pinturas, como aditivo, en la manufactura de papel tapiz y flores artificiales, como sustancia de guerra, en medicina veterinaria y como medicamento homeopático para aliviar varias formas de dolor de cabeza, gastritis aguda, peritonitis, tifoidea, miocarditis, pericarditis y en la nefritis crónica difusa. (Farrington y Farrington, 1936 Cebrián, et a/, 1994; Pereira 'y Nefussi, 1986).

Durante la fundición de cobre, níquel, plomo y cobalto, se genera el trióxido de arsénico (As~O~), el cual es ligeramente soluble en agua formando el ácido arsenioso (H3As03) y la oxidación de este último compuesto genera ácido arsénico (H~AsO~), ambos ácidos son capaces de formar sales con metales alcalinos. En el agua, en presencia de oxígeno, el AS (III) tiende a oxidarse a As (V), especialmente a pH alcalino. El AS también puede formar enlaces estables con el carbono, formando varios compues:tos orgánicos, de los cuales los ácidos monometilarsónico (MMA) y dimetilarsínico (DMA) y sus sales, son los de mayor importancia, ya que en estas formas se encuentra al As en la naturaleza, debido al metabolismo microbiano del As inorgánico, y en los tejidos animales a causa de la metilación enzimática que se lleva a cabo en el hígado. En humanos las formas metiladas del AS comprenden aproximadamente el 75 Yo del As excretado por vía urinaria.

En personas no expuestas a As, existen indicios de este elemento en la glándula tiroides, en las glándulas mamarias, en cabello y en las uñas. Los niveles en sangre van de 1 a 5 &I, en tejidos blandos, estos niveles son de 10 a 100 ng/g, en cabello y uñas, los niveles pueden incrementarse con el tiempo (de 0.1 a 1 &g) y la exposición a este metaloide o a sus derivados puede aumentar tales niveles en todo el cuerpo. (Farrington y Farrington, 1936; Del Ram, et al. 1993).

Estudios hechos en animales y humanos han indicado que las formas solubles del As son fácilmente absorbidas en el tracto gastrointestinal, estimándose un intervalo de absorción de 50 a 100 % en humanos y de 75 a 95 'Xo en animales. Así, los compuestos de este elemento pueden causar envenenamientos tanto agudos como crónicos, siendo el primero en la actualidad poco común, en tanto que el segundo por lo general se presenta a causa de la exposición del ser humano al As mediante aire o agua contaminados. Ejemplos de compuestos que pueden causar daño severo y agudo al sistema respiratorio si son inhalados, son el As203,

el tricloruro de arsénico y los gases de guerra arsenicales. Los síntomas que se manifiestan incluyen: tos, disnea, dolor toráxico, gastroenteritis con nauseas, diarrea, taquicardia, edema, urticaria, desórdenes motores, neuritis múltiple, hipo e hipertermia. A nivel tisular, se presenta irritación de los epitelios. El establecimiento de tales manifestaciones deriva de la experiencia en incidentes, debidamente documentados, de exposición a este metaloidea @ARC, 1980,1987: Gonsebatt, 1994; Engel y Smith, 1994; Ostrosky, etal., 1996). En Japón, la ingestión de leche en polvo contaminada dio como resultado en las personas que fa ingirieron, el siguiente cuadro clinico: fiebre, insomnio, anorexia, inflamación hepática, melanosis y disturbios en la función cardíaca. En este mismo país, la ingestión de salsa de soya

contaminada hizo que los individuos que la ingirieron presentaran edema facial, anorexia, molestias en el tracto respiratorio superior, lesiones cutáneas, signos de neurosis e inflamación hepática. Por estos y otros reportes se ha llegado a plantear que la dosis letal de trióxido de arsénico ingerido, para humanos está en el margen de 70-180 mg (Cebrián, et al. 1994).

Efectos t6xicos del arsinico

Dada la gran importancia que tiene el arsénico sobre la salud es importante destacar los efectos secundarios que se presentan después de una exposición crónica a este elemento, ingestión de dosis subletales, vía administración oral de medicamentos, de agua de pozo contaminada o por exposición ocupacional:

- Lesiones cutáneas: Verrugas, melanosis e hiperqueratosis palmar y plantar. Esta última relacionada con cáncer de piel. - Desór¿enes ¿el sistema nervioso: Polineuropatía periférica (sensitiva y motora) y pérdida auditiva en niños expuestos. - Disturbios en el sistema hematopoyético: Anemia y leucopenia. - Disturbios hepáticos: Funciones disminuidas y cáncer hepatobiliar. - Desúr¿enes cardacos: Electrocardiogramas anormales indicativos de un efecto tóxico al rniocardio. - Desór¿enes ¿el sistema circulatorio: Disturbios vasculares periféricos, endoangitis, acrodermatitis atrófica y otros síntomas menos severos de daños a los vasos sanguíneos periféricos. - Desór¿enes respiratorios: Perforación del septo nasal, traqueobronquitis y lesiones enf isematosas. - Efectos carcinogénicos: Algunos estudios epidemiológicos han indicado una relación causal entre el cáncer de piel y una exposición vasta a AS inorgánico. También se ha demostrado la prevalencia de riesgo de cáncer pulmonar entre trabajadores expuestos al trióxido de As en fábricas de esmaltes e insecticidas. Así mismo se ha informado que el As es capaz de producir, en poblaciones expuestas a éI, cánceres de pulmón, hígado, riñón y vesícula biliar. Entre trabajadores que se dedican a rociar insecticidas conteniendo As, se han encontrado casos de sarcoma hemangioendotelial, frecuentemente complicados por la presencia de cirrosis hepática y esplenomegalia. Por todo ello se han establecido, a la fecha, relaciones dosis- respuesta entre la exposición al AS y la aparición de diferentes tipos de cáncer. Resta por esclarecer si la exposición crónica a concentraciones cercanas al límite de 0.05 mg/L establecido por la Organización Mundial de la Salud (OMS), aumenta la prevalencia de lesiones neoplásicas. - Efectos teratogeiricus: Anencefalia, agenesia renal y malformaciones de las costillas, en animales de experimentación. - Efectos citotóxicos: Son escasos los estudios que existen al respecto pero en líneas celulares humanos se ho encontrado efecto de acuerdo a la concentracijn de As adicionado al cultivo (Salazar, etal., 1997). - Efectusgenutóxicos: En este rubro, los estudios en humanos expuestos al As son pocos y los resultados obtenidos contradictorios. Se ha informado que en individuos que han estado

expuestos a este metal por razones médicas u ocupacionales se presentan frecuencias elevadas de aberraciones cromosómicas y de intercambio de cromátidas hermanas (Gonsebatt, et a/., 1994; Cebrian, e t al. 1994). Sin embargo, también se han encontrado resultados negativos.

A la fecha, el mecanismo por el cual el As causa toxicidad y, en particular, genotoxicidad, permanece desconocido. El conocimiento de cómo el As induce la muerte celular y de cómo las células tratan de evitar el daño, puede ayudar a comprender el (los) mecanismo(s) por el (los) cual(es) se produce la carcinogénesis que causa este elemento, así como para determinar si existe un umbral para que el As presente dicho efecto (Abernathy, et a/., 1996; Wang, et a/., 1996). En un intento por realizar lo anteriormente expuesto, varios grupos de investigación han comenzado a enfocar su atención tanto en e! metabolismo del As, como en los efectos de sus compuestos metilados.

El metabolismo del As involucra dos procesos básicos: reacciones de óxido-reducción y reacciones de metilación. La redtlccijn de AS V a AS 111 se ha demostrado en animales, con lo participación del glutatión, el cual después de la reacción queda oxidado, disminuyendo las concentraciones de glutatión reducido en eritrocitos. Se menciona que esta reacción pudiese ser importante en las reacciones de metilación del As (Carter, 1995). En contraste con el AS inorgánico, ni el MMA ni el DMA, tienen la capacidad de interaccionar fuertemente con macromoléculas biológicas (proteínas, DNA, etc.), tal vez debido a que al metilarse, disminuya la capacidad de formar complejos de coordinación y por lo tanto, la metilación pudiese ser un mecanismo importante de destoxificación, ya que al disminuir la capacidad de metilación del As, daría como resultado un incremento en su retención (Snow, 1991). Por lo general, entre el 50-90 % de una dosis de As es eliminada entre 2 y ~4 días después de la ingesta, principalmente como DMA. El proceso de metilación-destoxificación enzimática, puede resultar en una curva de dosis-respuesta no linear para los efectos producidos por el As, ya que estudios de los patrones de excreción de MMA y DMk en humanos expuestos a dosis crecientes de AS, indicaron que dosis de ca. 200 mg/día, fueron eficientemente metiladas, pero dosis superiores ca. 500-1OOO mg/día, saturaron el sistema enzimático (Goyer, 1991). Dado que el AS es un elemento que puede llevar a cabo ciclos de óxido reducción, se propone que pudiese funcionar como lo hacen varios metales de tansición (ej.: Fe, Cu, Cr, etc.), que en presencia de agentes reductores, son capaces de donar electrones al oxígeno para que, mediante las llamadas reacciones de Fenton y de Haber-Weiss, generar radicales libres de oxígeno. (Chevion, 1998).

Radicales libres

Los radicales libres son compuestos que poseen uno o más electrones desapareados por lo que son inestables y altamente reactivos (Duran, 1998). Se distinguen: radicales de carbono, de nitrógeno, de oxígeno y metalcetilos.

Los radicales de mayor interés en el campo de la biomedicina son los derivados del oxígeno. Estos son el anión superóxido, el peróxido de hidrógeno y el radical hidroxilo. Cabe destacar que si bien el peróxido de hidrógeno no es un radical propiamente dicho, es el precursor del

OH-, el radical más tóxico y reactivo de ellos. A continuación, y antes de t ratar SUS efectos nocivos, se examina el origen de cada uno de ellos:

i) Origen ¿elanión superóxi¿o. El anión superóxido ( 0 2 3 es un radical libre cargado, con una vida media muy corta (milisegundos). Se forma al adquirir un electrón la molécula de oxígeno:

OZ+ e- + 02- Se sabe desde hace tiempo que se producía por acción de la radiación ionizante sobre el oxígeno y durante años su interés biológico descansaba únicamente en su papel (junto a otros radicales) en la lesión de los tejidos por la radiación. Recientemente se ha identificado como un intermediario normal en ciertos procesos biológicos. Por ejemplo, la xantina oxidasa, enzima que cataliza la oxidación de, la xantina a ácido úrico genera aniones superóxido como productos normales. Habitualmente, el anión superóxido tiene corta vida y se convierte en peróxido de hidrógeno en una reacción catalizada por la enzima superóxido dismutasa, la cual mantiene la concentración del estado estacionario en un bajísimo nivel. Muchas otras flavoproteínas oxidasas generan asimismo aniones superóxido de esta forma. También se produce este anión en la autoxidación (es decir, oxidación en donde no participa ninguna enzima) de quinonas reducidas, catecolaminas y tioles. En magnitud traza también se produce, cuando el oxígeno se combina con la hemoglobina o la mioglobina.

ii) Origen ¿eIperóxi¿o ¿e hi¿r@eno. A diferencia de los aniones superóxido, el papel de la producción de peróxido de hidrógeno (H202) en las oxidaciones celulares (y la necesidad de rebajar la concentración de este metabolito tóxico) se conoce desde hace más de 50 años. Entre las enzimas que producen peróxido de hidrógeno se encuentran la D-aminoácido oxidasa, la amina oxidasa, así como la superóxido dismutasa.

¡¡¡)Origen de los ra¿icales hi¿roxilo. LOS radicales hidroxilo (OH-) se originan probablemente en la interacción del peróxido de hidrógeno con el anión superóxido en la reacción de Haber-Weiss, cuya velocidad aumenta por efecto de los iones de hierro o cobre:

H202 + OF "b O2 + OH- + OH-

Los radicales hidroxilo son considerablemente más reuctivos y, por consiguiente, más tóxicos que el peróxido de hidrógeno o que el superóxido.

Los radicales libres pueden ser generados tanto endógena como exógenamente. De manera endógena y como se describió con anterioridad, forman parte normal del metabolismo, pero su velocidad de producción nunca excede la capacidad de los tejidos para eliminarlos. De forma exógena son generados por agentes ambientales oxidantes (Cortinas, 1997). Alteraciones en el metabolismo celular pueden dar lugar a una sobre acumulación de radicales libres, estos pueden ocasionar daños muy severos a diversos componentes celulares como son los fosfolípidos de las membranas, las proteínas y el DNA (Tortora, 1981; Cortinasj991). Aunque el peróxido de hidrógeno y los aniones superóxido puedan tener sus propios efectos nocivos, el

mayor problema parece ser la generación de radicales hidrloxilo, los cuales promueven una reacción en cadena. La base química del efecto de los radicales sobre el DNA, posiblemente sea la peroxidación y la modificación química de SUS bases nitrogenadas; el efecto sobre las proteínas atañe probablemente a la oxidación de los grupos sulfidrilos (los grupos -SH son convertidos en grupos -S-S-). Con relación al efecto sobre los lípidos, los radicales hidroxilo podrían atacar los ácidos grasos insaturados de los fosfolípidos y de otros componentes lipídicos de las membranas, resultando en la formación de hidroxiperóxidos lipídicos (Slater y Benedetto, 1981). Dicha hidroperoxidación presenta dos consecuencias. Primeramente, aumenta el carácter hidrofílico del lípido, lo cual hace que cambie la estructura de la membrana y altere su función. En segundo lugar, los hidroxiperóxidos lipídicos (y sus productos de desdoblamiento inmediatos) son potentes inhibidores de algunas enzimas y, por tanto, ciertos procesos que tienen lugar en la membrana o en el interior de la célula pueden resultar inhibidos.

Existen al menos cuatro mecanismos que contribuyen a aminorar los efectos perjudiciales de estos oxidantes en la célula. A tensiones de oxígeno normales, estos mecanismos consiguen eliminar completamente el problema. Tales mecanismos de protección son:

i) Reacción ¿e la superóxi¿u ¿isrnutasa. Esta enzima cataliza la destrucción del radical superóxido según la ecuación:

La enzima se encuentra presente en la mayoría, si no en todos, los tejidos y sirve para mantener la concentración intracelular de superóxido en unos niveles extremadamente bajos. El peróxido de hidrógeno producido es eliminado por acción de la catalasa.

ii) Reacción ¿e la catalasa. Desde hace tiempo se le ha asignado a la catalasa un papel protector en este sentido. Esta enzima es ubicua, altamente activa y cataliza la reacción:

2 Hz!& 02 + 2 Hz0

ROOM + 2 GSH + GSSG + ROH + Hz0 + 2 GSH __+ GSSG + 2 Hz0

La enzima puede ejercelr tres funciones: primero, convertir el peróxido de hidrógeno en agua para mantener SU concentración muy baja; segundo, convertir los ácidos grasos peroxidados en derivados hidroxilados y, tercero, revertir la oxidación de los grupos sulfidrilos de las proteínas. El glutatión oxidado se reduce por acción del NADPH mediante una reacción catalizada por la glutatión - reductasa:

GSSG + NADPH' H' + 2 GSH + NADP'

El NADP' se reduce por la oxidación de la glucosa 6 fosfato, mediante la acción secuencia1 de la glucosa 6 fosfato-deshidrogenasa y la fosfogluconato-deshidrogenasa.

Cada una de las tres enzims ontzriormente examinadas se localizo en diferentes sitios intracelulares y parecen desempeñar funciones complementarias entre sí. La catalasa se encuentra predominantemente en los peroxisomas que, aparte de la catalasa, contienen oxidasas que producen peróxido de hidrógeno. La glutatión-peroxidasa está más ampliamente distribuida y se encuentra en las mitocondrias y en el citosol, pero no en los peroxisomas. La superóxido dismutasa se encuentra predominantemente en el citosol, aunque una segunda forma de la enzima también aparece en las mitocondrias.

iv) htíoxía'antes. Diversos compuestos naturales tienen la capacidad de reaccionar con los radicales libres sin generar nuevos radicales. La presencia de estos compuestos por tanto, mitiga las reacciones en cadena. Tienen esta propiedad las vitaminas A, C y E, el P-caroteno, los flavonoides y retinoides. Existen pruebas de que tales compuestos pueden proteger in vivo contra los radicales libres (Oski, 1980).

Toxicidad de los radicales libres

Ahora bien, durante los G!timos 40 afios, se ha involucrado a los radicales l i b r a como causales de un gran número de enfermedades. Ello debido probablemente a la deficiencia en los mecanismos de defensa en contra de los mismos, ya sea por problemas hereditarios que afecten sus sistemas enzimáticos o por problemas nutricionales (Cortinas, 1991).

En la actualidad, se acepta ampliamente que, en la mayoría de los casos, los radicales libres son un componente que complica la patología de la enfermedad, apareciendo en mayor o menor relación como una consecuencia del proceso intrínseco de la enfermedad.

Una compilación de las diversas enfermedades que pudiesen tener SU origen en la acción de los radicales libres, ha sido propuesta por Gutteridge (1993), agrupándolas en ocho grandes categorías, de acuerdo a cómo se producen estos radicales:

1. Enfermedades que involucran la producción excesiva del 02-, H z 0 2 y ácido hipocloroso (HOCI), vía células fagocíticas activadas. Ejemplos, asbestosis, enfermedad de Alzheimer, úlcera duodenal, enfisema pulmonar, artr i t is reumatoide y gota.

2. Enfermedades provocadas por la formación aumentada de radicales libres de oxígeno debidas a la acción de ciertas drogas y toxinas, como por ejemplo el alcohol, la adriamicina, la bleomicina, el metil mercurio y el Paraquat. Las enfermedades causadas por agentes diabetogénicos, la de Chagas, la de Parkinson, son los ejemplo más claros a este respecto.

3. Enfermedades provocadas por la transferencia de electrones al oxígeno mediada por metales de transición (Fe, Ni, Cu, As, etc.). Ejemplo de ello son la hemorragia ocular y la talasemia.

4. Enfermedades que involucran la oxidación anormal de substratos o cambios en la concentración de oxígeno. Las enfermedades características son: Alcaptonuria, diabetes mellitus, hipoxia e hiperpoxia, la influenza y el estrés por ejercicio excesivo sin entrenamiento previo.

5. Enfermedades que involucran la falla o consumo excesivo de defensas protectoras. Se incluyen en esta categoría la acatalasia, la aterosclerosis, la ataxia telangiectasia, la fibrosis quística, el síndrome de Down, la pancreatitis y el xeroderma pigmentosum.

6. Enfermedades en las cuales los radicales libres se forman a través del disturbio estructural de la arquitectura celular. Enfermedades tales como la ulceración de la córnea, el envenenamiento con plomo, cadmio, benceno y la distrofia muscular.

7. Daño tisular provocado por radiaciones electromagnéticas de alta o baja energía. Daño que da lugar a la cataratogénesis, el melanoma y la fotosensibilidad.

8. Complicaciones en la formación de radicales libres atribuibles a defectos genéticos. La corea de Huntington, los síndromes progeroides y Ita anemia de células falciformes son algunos ejemplos de enfermedades que se incluyen en esta categoría.

Halliwell y Gutteridge (1984) proponen que la inmensa mayoría de los informes que involucran oxidación lípidica en enfermedades humanas, se explica mejor por la siguiente secuencia de eventos:

Enfermedad o toxina -b Daño o muerte celular "b Peroxidaxión lipídica incrementada

LOS productos de la lipoperoxidación, los radicales libres y los compuestos antioxidantes aumentan notablemente durante la ovulación, la implantación y a medida que transcurre la gestación. En este sentido, cabe destacar que el papel de los radicales libres no sólo se limita a efectos nocivos, sino que oportunamente y en concentraciones adecuadas, participan como inductores de factores de crecimiento o en la fluide2r membranal, así Como en el mantenimiento de la homeostasis.

Producción de radicales libres de ox'@wo por arsénico

Como se menciono anteriormente, existen evidencias experimentales que permiten afirmar que durante el metabolismo del As se producen radicales libres, en particular el radical hidroxilo, que es la especie más reactiva de ellos, y al cual se le atribuyen daños severos a las macromoléculas biológicas, vía el mecanismo "sitio específico" (Chevion, 1998), teoría según la cual el daño a proteínas y DNA mediado por radicales libres es más fuerte cuando un metal de transición forma complejos de coordinación con los componentes de estas macromoléculas, e in situ se llevan cabo las reacciones de oxido reducción que producen al radical hidroxilo y con ello un daño de importancia, generalmente la ruptura de los enlaces covalentes de las macromoléculas.

Brown, et al, (1997), ha propuesto que los compuestos metilados del As son menos tóxicos por mg o mmol que los correspondientes compuestos inorgánicos, sin embargo, existe evidencia creciente de que dichos compuestos (el DMA en particular), causan serios problemas, tales como el daño al DNA, aberraciones cromosómicas (Moore, et u/., 1994) y

promoción de tumores ( Wanibuchi, et al./ 1996; Yamamoto, et al./ 1995). Así Yamanaca, et d., (1989, 1996), encontraron que el DMA induce daño al DNA, específicamente en pulmones tanto de ratas como de ratones y han confirmado sus hallazgos, en cultivo de células pulmonares humanas, atribuyendo este daño a los radicales libres que el As es capaz de formar durante el metabolismo del DMA. Ver Esquema 1.

0- 0- 0- 0- 0- 0- 0- CH3

\ / \ ' \ / \ /

/ As; / nb y d Asm As"

SAM

0- O 0- 0- O H3C 0- Arsenato Arsenito Acido nwnometil Acido dimetil

Ardnico arsínico

("4 (DMA)

I / CHj

/ \ As

H3C O \

O' Radical peroxil dimetilarsknico

Daño al DNA y otras macromoléculas

1 H O 8

Radical hidroxilo

a - Iniciación de carcinogénesis Radical superóxido

4 Cáncer

. Esquema 1. Ruta metabólico propuesto por Brown et al(1997) para el daño al DNA e iniciación de la carcinogénesis inducido por As y DMA vía producción de radicales libres. SAM: s-adenosilmetionina.

Evidencias experimentales del daño causado por arsénico 2 2 2 4 9 0 Lee y Ho (1995) han reportado que fibroblastos humanos expuestos a arsenite de sodio,

aumentan la formación del producto fluorescente de la diclorofluresceína, causado por oxidación; la formación de este producto es inhibida por el hidroxitolueno butilado, el cual se conoce que es un apagador de radicales libres. Además, el tratamiento de 10s fibroblastos con el arsenite, incrementa la actividad de la hemo-oxigenasa y los niveles de ferritins en 10s cultivos; esta actividad es inhibida por la presencia de dimetilsulfóxido (otro agente apagador de radicales libres). También se informa en este trabajo, que el tratamiento con el arsenito aumenta significativamente los niveles de glutatión y disminuye la actividad de catalasa, además cuando se agrega esta enzima al medio de cultivo, .se observa que la toxicidad del arsenito se reduce.

Ensayos acerca de la naturaleza de la muerte inducida por el arsenito de las células K1 de ovario de hamster, usando citometría de flujo), indican (Wang, et a/., 1996) al realizar ensayos acerca de la naturaleza de la muerte inducida por el arsenito de las células K1 de ovario de hamster, usando citometría de flujo, reportan que al hacerse el tratamiento con es$csuttstancia hay presencia de apoptosis. A la administr*ación de trolox (análogo de la vitamina C), neocuproína o cicloheximida (agentes quelantes de metales), después del tratamiento con el arsenito (40 nM durante 4 h.), reducen significativamente el grado de apoptosis. Estos autores concluyen que este fenómeno inducida por el arsenito, es disparado por la generación de peróxido de hidrógeno, seguido por una reacción de Fenton mediada por Cu, para producir el radical hidroxilo, el cual selectivamente activa a la proteina cinasa a través de una síntesis de nova. Por SU parte, Barchowsky, et a/(1996), informa que al tratar células endoteliales con arsenito se incrementan los niveles de oxidantes intracelulares, presentándose un estímulo en la transición nuclear de factores que actúan en trans, así como una acción mitogénica. AI incubar en un segundo pase las células en presencia de una concentración de arsenito menor a 5 nM durante 4 hrs., se detecta un aumento en la incorporación de [H3] timidina en el DNA genómico, en tanto que en concentraciones mayores a la mencionada, no estimulan o inhiben la síntesis de DNA. Estos autores concluyen que SUS datos sugieren que el arsenite inicia una disfunción vascular ai activar una señal celular sensible a oxidantes.

Por Su parte, Constan, et u/., (1996) evalúan la apoptosis que se presenta en hígado de ratas al tratarlas con niveles bajos (ppm) de contaminantes tóxicos (As, Cr, Pb, hnceno, cloroformo, feno! y tricloroetileno), administrados en el agua de beber a 10 largo de 6 meses. LOS resultados de tal investigación revelan una proliferación celular máxima a 10s 10 dias del tratamiento Y una apoptosis máxima un mes después; a este respecto se plantea que esta secuencia de eventos pudiese deberse a que la proliferación se dispara como consecuencia del daño causado al tejido y, posteriormente, la apoptosis se presenta como medida de protección para eliminar aquellas células cuyo DNA es dañado irreversiblemente. Relacionado a este trabajo, Se encuentra el realizado por Hanna, et al ., (199'0, en el que se investigan 10s

efectos del Cr, Hg, Pb, V, Ag, Cd y AS sobre el desarrollo embrionario de ratones; 10s embriones fueron cultivados durante 72 horas en presencia de cantidades variables de 10s

metales (de 0.05 a 200 nM), evaluando la consecuencia a tal exposición, mediante el registro de formación de blastocistos y número final de células de los embriones, encontrando que los metales esenciales que muestran una actividad ¿e óxido-reducción, son menos tóxicos que los metales no esenciales con baja actividad de óxido-reducción. Los autores sugieren a este respecto que la unión directa del metal a sitios críticos de la membrana y/o ligandos intracelulares (proteínas y ácidos nucleicos), pueden disparar un desarrollo anormal y muerte celular antes de que se efectúe un daño oxidativo. Sin embargo, estos autores parecen obviar que los metales escenciales (Fe, Cuy, Zn, etc.), están fuertemente regulados, a f in de que sus concentraciones en estado libre sean tendientes a cero, para lo cual los organismos poseen proteínas especializadas que los quelan desde el momento mismo de su entrada a la célula, previniendo así que se pueda llevar a cabo el mecanismo "sitio específico" de producción de radicales libres.

Hochadel y Waalkes (1997), demostraron que al administr-ar dosis no tóxicas de AS (22.5 nM de NaAs OZ/kg, S.C.) a ratas, 24 horas antes de tratarlas con Cd (10, 20 o 30 nmol Cd &/kg S.C.), reportan que el pretratamiento con As reduce marcadamente la mortalidad por intoxicación con Cd (9 sobrevivientes/lO tratados), en contraste con las no pretratadas @/lo). Además informan que dicho pretratamiento reduce la hepatotoxicidad causada por el Cd (ensayada por la actividad de la transaminasa glutámico-oxalacética), así como la necrosis hemorrágica testicular, además de que aumenta en ocho veces los niveles hepáticos de la metalotioneína (MT, proteína que se asocia a la destoxificación del Cd). Esto último es indicativo de que el As causa probablemente un daño oxidatiwo, ya que la MT es una proteína que se induce por daño celular y, entre estos daños se encuentre el causado por radicales I i bres.

También se ha reportado que la MT es una proteína de respuesta a varios estados de estrés además de participar como respuesta al daño oxidativo. Albores et al ., (1992 a y b, 1996), han reportado que el As (III) pero no el As (V), es capaz de inducir la expresión en hígado de los niveles de ARNm de las isoformas 1 y 2 de la MT, pero no en riñón ni en páncreas, concluyendo que esto constituye un mecanismo inusual de aumento de la expresión de los genes de la MT y que esto parece estar mediado por la unión del arsenito a la MT.

Con base a toda esta información, se sospecha que el mecanismo de daño genotoxico y carcinogénico por As, sea a través de la generación de radicales libres, en el cual el As se comporte como transportador de electrones desde un agente reductor hacia el oxígeno disuelto en las soluciones de As, para formar en última instuncia el radical hidroxilo, el cual sería la especie dañina de oxígeno que causa daño al DNA plasmídico.

OBJETIVOS

Objetivo General

Determinar el tipo de daño(s) causado(s) en el DNA plasmídico por la exposición a arsénico (V) y a sus compuestos metilados (MMA y DMA), así como el mecanismo probable por el cuál estos compuestos ejercen su acción.

Objetivos Particulares

I) Obtención de los plásmidos pUC18 y pJA321 contenidos en las cepas de Escherichia coli transformadas.

11) Determinar si el As (V) y sus derivados metilados (MMA y DMA), generan especies reactivas de oxígeno mediante la detección del Malondialdehído (MDA), como producto de daño.

111) Determinar si los radicales libres generados por el tratamiento con As, causan la ruptura de los enlaces fosfodiéster del DNA plasmídico, mediante electroforesis en geles de agarosa y por espectrofotometría visible-UV.

I V ) Determinar el efecto que causa la presencia de la Metalotioneína de levadura (MT) sobre la acción dañina del AS (V) sobre el DNA plasmídico, a través de electroforesis en gel y espectrofotométricamente.

METODOL06IA

I.

11.

Plásmidos . Se amplificaron los plásmidos pUC18 y pJA321, obtenidos comercialmente.

Obtención del DNA Plasmídico. Se realizó de acuerdo al procedimiento descrito por el método de extracción alcalina de Bimboim y Doly (1979). -,.

,a

1' .. , '(

111. Tratamiento del DNA Plasmídico con los Compuestos de Arsénico. (Inactivación) y , ,

El DNA plasmídico se expuso a concentraciones variables de arseniato de sodio, <A **:

Monometilarsónico (MMA), Dimetilarsínico (DMA) y Metalotioneína de Levadura (MT, j incubada con CdCI). La evaluación del tratamiento se realizó mediante electroforesis en 5, geles de agarosa. rz 2

2 >

r - (-2

L; .:

3 s r-. 7

IV. Electroforesis en 6el de Agarosa E C n ' 6 Se llevó a cabo por la metodología descrita por Perball (1988), usando TBE (Tris- m Boratos-EDTA) como amortiguador. Los geles fueron teñidos con bromuro de etidio y -d.

fotografiados en un documentador de geles. c.; ?'")

6 3 ..u ( > "

> t . J

V. Determinación de los Productos de Daño por Radicales Libres. Se realizó mediante modificaciones a la Técnica del Acido Tiobarbitúrico (TBA), descrita por Halliwell, e t d (1987) y por Brown y Kelly (1996).

v1:. Determinaciones Espectrofotométricas. Se realizaron espectros de absorción de las muestras tratadas y las no tratadas en un rango de 190 a 300 nm, empleando un espectrofotómetro visible-UV Shimadzu-2100.

ACTIVIDADES REALIZADAS

I. Preparación de Medios de Cultivo

Medio Luria-Beltrani (1 litro)

10 g Triptona (peptona de caseína 5.09 Extracto de levadura 5.0 g NaCl (Baker) Disolver yaforar con agua bidestilada Añadir ampicilina ( 50 pg/mL ) Esterilizar.

11. Preparación de Reactivos

RNasa pancreática (preparar a 1 mg/mL, calentar 10 min. a 80 "C y enfriar lentamente).

Amortiguadores

TBE lox (Tris 0.9 M-boratos 0.9 "EDTA 0.25 M)

TE (Tris 10 mM-EDTA 1 mM), pH 8.0

Sales

lOOmM arseniato de sodio (Na$iAsO4*7H20) Metabisulf ¡to de sodio (NazSz05) Tiosulfato de sodio al 1 '% (Na2SzOs)

Soluciones

Agarosa al 1% en regulador TBE l x

5M acetato de potasio, pH 4.8

1 0 0 mM ácido ascórbico (Asc)

1 0 0 mM ácido Monometilarsónico (MMA)

100 mM ácido Dimetilarsínico (DMA)

10 mM CuSOli

2-Desoxiiribosa (200 m/mL) en ácido tricloroacético (TCA) al 10%

Difenilamina (difenilamina + ácido acético glacial + ácido fosfórico concentrado)

50 mM EDTA

Glucosa(50 mM)-Tris(25 mM)-EDTA (10 mM)

15 N HZ504

HsP04 al 1%

0.15 M NaCi

0.1 N NaOH

NaOH(0.2 N)-SDS(l%)

100 mM peróxido de Hidrógeno (H202)

TBA al 0.6%

TCA al 10%

1 mM tetrametoxipropano (TMP)

0.2 mM TMP

111. Propagación de Plasmidos

Se utilizaron los plásmidos pUC18 y pJA321, obtenidos comercialmente y amplificados en cepas de E coli. DH5a (AlacNA-argF, recAI, gyrA96, relAl; Life Technologies). Las cepas portadoras se seleccionaron mediante el marcador de ampicilina que estos plásmidos poseen.

IV.Obtenci6n del DNA Plasmíidico

b En un matraz Ferbach se colocó 1 1 de medio de cultivo de Luria, adicionado con ampicilina (Sigma Chem. Co.) a una concentración final de 50 m/mL, y se depositó un inóculo ¿e la cepa portadora del plásmido (pUC 18 o pJA321). LOS cultivos se incubaron toda la noche a 37 "C con agitación constante de 175-200 rpm. Terminada la incubación se cosecharon las células centrifugando a 7,000 rpm durante 10 min., se lavaron con TE y se centrifugaron nuevamente a 7,000 rpm durante 10 min. El paquete celular se mantuvo en hielo y fue resuspendido en 20 mL de una solución de Glucosa(50mM)-Tris(25mM)- EDTA(lOmM), pH 8.0. Inmediatamente se le añadieron 40 ml de una solución alcalina de Na0H(0.2N)-SDS(l~o), se homogenizó e incubó por 5 min. en hielo. Posteriormente, se adicionó acetato de potasio frío, 5 M pH 8, se mezcló suavemente y se incubó en hielo por 5 min. Después de este tiempo, las mezclas se centrifugaron a 15, O00 rpm por 10 min. LOS sobrenadantes se transfirieron a tubos limpios de centrifuga añadiéndose 0.9 volúmenes de isopropanol frío, dejándose a 10 min. a T ambiente y se centrifugaron a 15,000 rpm por 15 min. El paquete resultante se resuspendió en la cantidad necesaria de amortiguador TE, pH = 8.0. A continuación se adicionó RNasa pancreática, incubándose primeramente a 37 "C por 30 min. y después toda la noche a temperatura ambiente. A l día siguiente se le añadió un volumen igual de etanol absoluto frío durante toda la noche.

Finalmente las muestras se centrifugaron a 15,000 rpm por 15 min., redisolviendo el paquete en un volumen adecuado de TE. Las muestras se almacenaron a 4°C.

Cuantificación ¿e la concentración ¿e DNA plasmí¿ico.

a) Se empleó una cámara de cuarzo de 1 cm de ancho para medir en un espectrofotómetro de luz UV, utilizándose agua bidestilada como blanco.

6) Las preparciones de plásmidos se caracterizaron espectrofotométricamente, realizando espectros de absorción entre 190-300nm.

c) Se calcularon las concentraciones con la expresión:

* valor de absortividad.

V. Inactivación de los Plásmidos.

i) pUC 18. Se tomaron alicuotas de 100 & de plásmido que conteniendo aproximadamente0.922 M de DNA y se les agregaron concentraciones variables de

sencia o ausencia de Ascorbato (100 mM) y Solución eron mantenidas en regulador TE. LOS derivados mercialmente y se prepararon a concentraciones

se preparó disolviendo 0.28 g de metabisulfito de sodio ando 2 mL de tiosulfato de sodio al 1% y 0.25 mL

conteniendo 0.7 M de DNA plasmídico, se les ó ascorbato preparados a una concentración 100 ración final lOmM. Además, se agregaron

levadura (10 a 200 M /mL, partiendo de una V (3 a 62 ppm). [Ver Tabla 21.

las preparaciones se incubaron a diferentes ndose alícuotas a cada intervalo de tiempo para

realizar eleetrdbresis en geles de agarosa.

Tabla l. Protocolo de Inactivacion del Plasmid0 pUC 18

Tubo Regvlodor Sotitciói Ac. Asc. MMA 0' hparacich de pldsmido TE Reductor0 (l(XkM) DMA

CIA.) 0 CUL) (100 mM) CUL)

1 2

300 O O O 100

O O 200 10 0 100 8 20 O 200 80 100 7 60 O 200 40 100 6 80 O 200 20 100 5 96 O 200 4 100 4 200 O O 100 100 3 250 50 O O 100

O O 25 1 5

10 20 25

Tabla 2. Protocolo de Inactivación del Plásrnido pJA321 en Presencia de MT de Levadura.

Hacer la siguiente serie

- Tubo

- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

- -

11

- 12 13 14 15 16 17 18 19 20

- - -

- - -

PmpracÍh de Pf&mido

CUL)

0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.0 0.0

0.0

0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.0

Arc Ó H’z Pmparacih (100 mM) de MT 0 CUL)

0.0 0.0 100 0.0 100 0.0 100 0.0 100 0.0 100 0.0 100 0.0 100 0.0 100 0.0 100 0.0

0.0 100

100 10 100 20 100 40 100 50 100 60 100 80

200

As 09 (10

CUL) 0.0 0.0 0.0 1.0 3 .O 6.0 10 20 0.0 20

0.0

10 10 10 10 10 10 10 10 10

500 O O 400 O 10 mM Asc.

10 mM Asc

0.03 400 0.06

- 390 I 31 I 0.1 380 62 o. 2 900 O T Asc 10 mM

900 O T ¿e MT

380 31 MT (10) - 370 31 MT (20)

- (lQ/mL)

- 350 31 MT (40) - 340 31 MT ( 5 0 ) - 330 31 MT (60)

3 10 31 MT (80) - 290 31 MT (100) - 190 31 MT (200)

790 31 MT+ As I

VI. Electroforesis en e l e s de Agarosa.

Corrimiento, tincón y registro.

Se hicieron geles de agarosa al 1% en TBE 1X. Los pozos fueron cargados con una mezcla de 15 de muestra (series de inactivación) y 10 & de azul de bromofenol (0.5 70) en sacarosa al 40 %. El corrimiento electroforético se desarrolló a 80 V durante 80 min. o hasta que las manchas del colorante alcanzaran las f partes del gel, usando TBE lx como regulador de corrida. Posteriormente, los geles se tiñieron con dos o tres gotas de una solución de bromuro de etidio (2 mg/mL). Finalmente, los geles se observaron al transiluminador y se fotografiaron utilizando un documentador de geles Eagle-Eye 200.

VII.Determinación de los Productos de Daño (Detección de Malondialdehído).

i) pUC18. Para la determinación de los productos de daño causado por radicales libres expresados como concentraciones de Malondialdehído, se empleó el Método de Dische (1955)' el cual determina la cantidad de desoxirribosa degradada y la Técnica del Acido Tiobarbitúrico (TBA) descrita por Halliwell, et al. (1987).

Para la determinación de la desoxirribosa se preparó una solución patrón de este azúcar (200 m/mL) disuelta en TCA al 10 Yo. Se tomaron 10 mL de esta solución tratándose con los siguientes compuestos: 50 pL de EbTA 50 mM, 10 de CuS04 10 mM, 250 & de Acido Ascórbico (Asc) 100 mM y 50 mL de NaOH 0.1 N. Dicha solución se dejó reposar a temperatura ambiente por 24 hrs. Transcurrido este tiempo se realizaron curvas patrón de 2-desoxirribosa tratada 'o no, siguiendo el protocolo que se muestra en la Tabla 3.

Posteriormente, se colocó 0.1 mL de cada una de las muestras de la serie de inactivación para el pUC 18, en tubos de ensaye y se añadieron 3 mL de ácido fosfórico al 1% y 1 mL de TBA al 0.6 %. Los tubos se calentaron Q ebullición durante 60 min. Las muestras se enfriaron y se leyeron a 535 nm. (Ver TabPa 4).

ii) pJA321. Se utilizó una modificación a la técnica descrita por Brown y Kelly (1996) para detectar malondialdehído como producto de daño generado por los radicales libres sobre el DNA plasmídico. Se elaboró una curva patrón de Malondialdehído siguiendo el protocolo que se muestra en la Tabla 5, para lo cual se preparó una solución stock de TMP 1 mM, diluyendo 17 & de este reactivo en 100 mL de agua bidestilada e inmediatamente se tomó 1 mL de esta solución y se agregaron 4 mL de agua bidestilada para preparar TMP 0.2 mM. Posteriormente, a 1 0 0 & de las muestras de las series de inactivación se les trató con 3 mL de &ido fosfórico al 1% y con 1 mL de TBA al 0.6 Yo. Los tubos se calentaron a ebullición durante 60 min. Las muestras se enfriaron y se leyeron a 515 nm. (Ver Tabla 6).

Tabla 3. Determinación de Oesoxirribosa por el Método de Oische (1995)

Curvas Tipo de 2-desoxirribosa.

Tubo Concentración de TCA Sol. 2’-desoxirríbosa flratada 6 No) desoxirribosa 10 %

W) (pg/mL) OnL)

1 20 2

O lo00 O

40 900 100 7 32 920 80 6 24 940 60 5 20 950 50 4 16 960 40 3 8 980

I a 48 880 120

Enseguida se añadió a todos los tubos 3 m1 del reactivo de Difenilamina recién preparado. l o s tubos se colocaron a ebullición por 10 min., se enfriaron y las muestras se leyeron a 600 nm.

Posteriormente se prepararon las siguientes series con la 2‘-desoxirribosa tratada ó no.

Tubo Concentración de Agua Sol. 2’-desoxirribosa Vratada 6 No) desoxirribosa Bidestilada

olt) @g/ml) olt) 1

280 300 700 8 240 400 600 7 200 500 500 6 160 600 400 5 120 700 300 4 80 800 200 3 40 900 100 2 O lo00 O

Se agregaron 3 mL de ácido fosfórico al 1% y 1 m1 de reactivo de ácido tiobarbitúrico al 0.6 %. l a s muestras se calentaron a ebullición por 60 min., se enfriaron y se leyeron a 535 nm.

Tabla 4.Técnica del Acido Tiobarbitúrico (TBA).

Halliwel1,et aL(1987)

I 5

1 8

Muestras de la Serie TBA k P 0 4

de Inactivación 0.6 96 1% OIL) (mL) (mL) 100

1 3 100 1 3 100 1 3

3 100 100

1 3 100 1 3 100 1 3 100

Los tubos se calentaron a ebullición durante 60 min. Las muestras se enfriaron y se leyeron a 535 nm.

Tabla 5. Curva Tipo de Malondialdehido (MOA) por la Técnica del Acido Tiobarbitiirico

(Brown y Kelly, 1996 [modif ¡cado])

Tubo

1 2 3 4 5 6 7 8

TMP Malondialdehido bidestilada 0.6 % 1% 0.2 mM

Concentración de Agua TBA H3PO4

OIL) @M) (mL) (mu (mL) O

4.0 0.90 1 3 100 2.8 0.93 1 3 70 2.0 0.95 1 3 50 1.2 0.97 1 3 30 0.8 0.98 1 3 20 0.4 0.99 1 3 10 0.2 1 1 3 5 O 1 1 3

cr - Esta serie se hizo por duplicado. Los tubos se calentaron a ebullición durante 30 min., las

muestras se enfriaron y se leyeron a 515 nm.

Tabla 6. Detección de Malondialdehido (MDA) por la Técnica ¿el Acido Tiobarbitljrico.

. Muestras de series de Agua TBA

Tubo bidestilada 0.6 % 1% inact. con Hz02 Ó Arc .)

1 100

0.90 1 3 100 4 0.90 1 3 100 3 0.90 1 3 100 2 0.90 1 3

100 3 1 0.90 100 3 1

0.90 1 3 100 0.90

20 100 3 1 0.90

(CrL) (mL) (mL) ( W

.

.

Esta serie se hizo por duplicado. Los tubos se calentaron Q ebullición durante 60 min., las muestras se enfriaron y se leyeron a 515 nm.

VIII. beterminaciones Espectrofotométricas

Las muestras de DNA correspondientes al pJA321, tratadas con o sin Hz02 o con Ascorbato, fueron analizadas a través de SUS espectros de absorción entre 190-300 nm en un Espectrofotómetro Shimadtzu-2100. También se realizaron los espectros de absorción de los controles positivos de Ha2 o de Ascorbato, teniendo como referencia agua bidestilada.

OBJETIVOS Y METAS ALCANZADAS

La propagación de los plásmidos pUC18 y pJA321 en las cepas de Escherichia coli, permitió tener el suficiente DNA plasmídico para realizar los ensayos pertinentes.

El tratamiento del DNA plasmídico con arsénico V y los derivados metilados de arsénico (MMA, DMA), confirmó datos obtenidos con anterioridad en el Laboratorio de Regulación Celular de la ENCB, IPN (Muñoz - Sánchez, 1998), donde se ponen de manifiesto los efectos dañinos de estos compuestos. Además estos experimentos generaron datos de interés, para ayudar a esclarecer el mecanismo por el cual el arsénico causa SUS efectos tóxicos sobre el DNA a través de la generación de radicales libres, así como el efecto que causa la presencia del peróxido de hidrógeno, ascorbato y metalotioneína de levadura sobre la acción dañina del As V sobre el DNA .

Las electroforesis en gel de agarosa de las preparaciones del plásmido tratadas o no con los compuestos de arsénico, permitieron observar el grado de. daño que el As o SUS derivados provocan al DNA, al causar rupturas en los enclaces fosfodiéster y la acción dañina de las sustancias generadoras de radicales.

Las determinaciones espectrofotométricas (espectros de absorción de las muestras tratadas, no tratadas y los controles) ofrecieron un análisis complementario a los experimentos anteriormente mencionados.

Los datos generados en el presente estudio contribuyeron a elaborar el trabajo titulado "Daño de DNA plasmídico causado por el As (V), a concenlraciones subtóxicas y agentes reductores fisiológicos" presentados en el X I V Congreso Latinoamericano de Microbiología en conjunto con el Congreso de Microbiología del Mercosur y con el II Congreso Paraguayo de Microbiología, como parte de un proyecto de este Laboratorio bajo la dirección del Dr. José Luis Muñoz Sánchez.

Inactivación del plásmido pUC 18

Un ejemplo de las preparaciones del plásmido pUC18, se presenta en la fig. 1, donde se observan las 3 bandas correspondientes Q las formas superenrrollada, circular relajada Y lineal.

En la fig.2 se puede apreciar la acción del Monometilarsónico ("A) en presencia 0

ausencia del agente reductor (ácido ascórbico 50 mM), durante 24 (fig. 2A) y 48 hrs. (fig. 2 0).

En el caso de la fig.ZA, en los carriles 1, 2 y 3 no se observan cambios apreciables en la estructura del DNA, ya que los topoisomeros se mantienen, mientras que las muestras de los carriles 4 a 7 tratadas con MMA + Ascórbico, la degradación del DNA comienza a presentarse, siendo más evidente en el carril 8. En la fig.2BI se presentan formas ligeramente más dañadas de DNA.

Después de 100 hrs de tratamiento (fig.3C), en el carril 1 se muestra el plásmido sin tratamiento, donde se aprecian los topoisomeros. En el carril 2, la migración del DNA plasmídico tratado con la solución reductora es menor, indicando cierto daño, ya que predominan las formas circular relajada y lineal. En el caso del plásmido tratado solamente con MMA (carril 3) hay una mayor degradación de DNA con respecto al DNA de los carriles 4 y 5, donde se observa que la degradación es menor indicando probablemente un efecto protector del ácido ascórbico sobre el efecto del compuesto metilado de AS. Para las muestras de los carriles 6 al 8 se muestra una degradación gradual y ascendente de DNA plasmídico.

Los carriles 1, 2 y 3 de la fig.3D, no presentan cambios significativos con respecto a las observaciones hechas para la fig. 3C. Para los carriles 4 y 5, el efecto protector parece mantenerse, aunque es menor con respecto a las muestras de la fig.3A, ya que se observa un barrido ligeramente visible del DNA. En el caso de los carriles 6 al 8, el DNA se encuentra considerablemente dañado, a las 140 hrs de tratamiento.

En la fig.3€, a las 170 hrs de tratamiento, se observa que la 3ra y 4ta banda del plásmido control se presenta degradación, debido probablemente a la formación de radicales OH- producidos por el oxígeno disuelto en el medio y a trazas de metales en el agua, durante este tiempo de incubación. La muestra tratada con solución reductora (carril 2) presenta un mayor número de bandas de degradación, sugiriendo que al haber luna fuente donadora de e-, se acelera la formación de radicales OH-. De forma global para los carriles 4 al 8, se nota un incremento significativo en la degradación de DNA.

Finalmente para el caso de la fig. 3F, la situación es muy semejante a la presentada para 10s carriles 1 y 2 de la fig.3E. Por otra parte se hace cada vez más patente que a concentraciones crecientes de MMA, se observan barridos considerables, indicando la degradación severa del DNA plasmídico, analizado a las 200 hrs de tratamiento.

En general para las figuras 3C-3F, cuando el plásmido es tratado solamente con MMA hay un mayor daño de DNA con respecto a las muestras que han sido tratadas con concentraciones menores de MMA (de 1-5 mM) y ácido ascórbico.

En la fig. 4 se muestra la acción del Dimetilarsínico ( M A ) en presencia o ausencia de un agente reductor como lo es el ácido ascórbico 50 mM.

A las 24 hrs de tratamiento, el carril 1 de la fig. 4A, muestra las formas del plásmido control, en el carril 2, se pueden apreciar estas mismas bandas ligeramente degradadas, debido al efecto que la solución reductora tiene sobre el DNA, ya que predominan las formas circular y relajada lineal. En el caso del carril 3, la 2da. banda indica que comienza a presentarse degradación de DNA. Las muestras tratadas con DMA + ácido ascórbico (carriles 4 al 8), presentan una degradación gradual y ascendente.

En el caso de la fig.4B, a las 100 horas del tratamiento, los plásmidos de los carriles 1 y 2, no presenta cambios significativos de las bandas de DNA con respecto a la fig. 4A, en tanto que la muestra del carril 3, presenta un ligera degradaci6n de DNA con respecto a las muestras de los carriles 5 a! 8, donde e! daño a! DNA se hace más evidente, siendo casi total para los carriles 7 y 8, ya que las dos primeras bandas han sido totalmente degradadas, sugiriendo que el tratamiento con DMA + ascórbico a concentraciones de 1 a 25 mM es más dañino para el DNA plasmídico que con respecto al tratamiento hecho solamente con DMA o con MMA + ascórbico.

En la fig.4C el carril 1 revela una ligera degradación del plásmido control, debido probablemente a la formación de radicales OH- producidos por el oxigeno disuelto en el medio y a trazas de metales en el agua, durante este tiempo de incubación. La muestra tratada con solución reductora (carril 2) presenta una migración menor de los topoisomeros, indicando daño al DNA debido probablemente a la formación de radicales hidroxilo. En el caso del pl6smido tratado solamente con DMA (carril 3) no existen diferencias notables en el daño al DNA entre los tiempos de incubación a las 140 horas. Para las muestras de los carriles 4 al 8 se observan barridos considerables indicando la degradación severa del DNA plasmidico ya que la detección con bromuro de etidio ya no es posible.

Finalmente, a las 200 horas de tratamiento (fig. 40), se observa que la degradación de la muestra del carril 3 es más evidente que en la figura 4c, mientras que para las muestras de los carriles 4 al 8, la degradación del DNA plasmídico ha sido total, proponiéndose que el tratamiento del DNA plasmidico con DMA es más dañino que el tratamiento hecho con MMA a estos tiempos de incubación.

1 2 3 4 5 6 7 8

Fig. 1. Fotografía del plúsmido pUC 18. Carril 2. Preparación del plásmido obtenido por el método de la extracción alcalina de Bimboim y boly (1979). Carril 4, duplicado. Carriles 1, 3 , 5-8, sin muestra.

1 2 3 4 5 6 7 8

Fig.2. Acción del MMA sobre el plásmido pUC 18, en presencia ó ausencia de ácido ascórbico 50 mM. Carriles: 1) Testigo, 2) Solución reductora, 3) MMA 25 mM, 4) MMA 1 mM y Asc., 5)MMA 5 mM, y Asc., 6) MMA 10 mM y Asc., 7) MMA 20 mM y Asc., 8) MMA 25 mM y Asc. Inactivación durante (A) 24 hrs. y (e) 48 hrs.

1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8

C D

1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 0

E F

Fig.3. Acción del M M A sobre el plásmido pUC 18, en presencia o ausencia de ácido ascórbico 50 mM. Carriles: 1) Testigo, 2) Solución reductora, 3) MMA 25 mM, 4) MMA 1 mM y Asc., 5)MMA 5 mM, y Asc., 6) MMA 10 mM y Asc., 7) MMA 20 mM y Asc., 8) MMA 25 mM y Asc. Inactivación durante (C) 1 0 0 hrs. (O) 140 hrs. (E) 170 hrs. y (F) 200 hrs.

1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8

A B

1 2 3 4 5 6 7 8 :l 2 3 4 5 6 7 8

Fig.4. Acción del b M A sobre el plásmido pUC 18, en presencia o ausencia de ácido oscórbico 50 mM. Carriles: 1) Testigo, 2) Solución reductora, 3) DMA 25 mM, 4) DMA 1 mM y Asc., 5) DMA 5 mM, y Asc., 6) DMA 10 mM y Asc., 7) DMA 20 mM y Asc., 8) DMA 25 mM y Asc. Inoctivación durante (A) 24 hrs. (6) 48 hrs. (C) 1 0 0 hrs. y (b) 1 4 0 hrs.

Detección de MDA como producto de daño

La cuantificación del daño oxidativo (degradación de desoxirribosa) expresada como concentración de malondialdehído (MDA), se realizó por la técnica de Dische (1995) y la reacción del TBA (método indirecto), al finalizar el tiempo de inactivación. Sin embargo, el hallazgo de una técnica sencilla, rápida y económica, basada también en la reacción del TBA y desarrollada por Brown y Kelly (1996), proporcionó un método alternativo (método directo) para el manejo e interpretación de los datos. El azúcar desoxirribosa es degradado por la acción de los radicales libres generados por sistemas Fenton. Si la mezcla compleja resultante se calienta bajo condiciones ácidas, el MDA es formado y puede ser detectado por SU capacidad para reaccionar con el TBA al formar un cromógeno rosa.

En la &áf. 1, se comparan las concentraciones de MDA obtenidos a partir del método directo e indirecto, y que fueron producidas a las 200 hrs. de tratamiento con MMA (series de inactivación) sobre el DNA plasmídico.

Las concentraciones de MDA registradas para la muestra control (barra 1) y la tratada con solución reductora (barra 2), probablemente son debidas a que al haber oxígeno disuelto en el medio y a la presencia de trazas de metales en el agua, se acelera la formación de radicales OH-, los cuales atacan a la desoxirribosa. En el caso de las muestras de tratadas con MMA y ácido ascórbico, se nota un incremento en la concentración de MOA con respecto a las muestras 1,2 y 3, sin embargo, no se aprecia una tendencia definida de aumento o disminución de daño oxidativo, al aumentar la concentración de MMA,

I

Para el tratamiento hecho con DMA (6ráf.2), la producción de MOA por las muestras 1,2 y 3 es menor que la cuantificada para el resto de las muestras tratadas. Así, a partir del tratamiento 4, se observa que la producción de MOA se incrementa conforme aumenta la concentración de DMA, lo que concuerda con las observaciones correspondientes a las electroforesis realizadas a esta hora del tratamiento, indicando que el ácido ascórbico, en este caso actúa como agente donador de electrones.

Por lo tanto, el método directo parece ser más sensible y específico que el método indirecto para la determinación de MOA y con menos interferencias de sustancias contaminantes que también absorben a la misma longitud de onda.

r Productos de daño al AbN plasmídico

1 2 3 4 5 S 7 8

Inactivación con MMA (200 hrs.)

Grdfica 1. Barra 1) plásmido contro!. 2) P + Sn!nción Red~tora . 3) F' + MMA 25 mM. 4) P + MMA 1. mM. + Asc. 5) ? + MMA 5 mM + Asc. O) ? + MMA 10 mM + Asc. 7 ) ? + MMA 20 mM + Asc. 8) ? + MMA 25 mM + Asc. P= plásmido. Asc.= ácido ascbrbico 50 mM.

Productos de daño a l A D N piasmidico

I Met dir

I 1 2 3 4 5 6 7

Inact ivación c o n D M A (200 hrs.) i _-

Inactivación del plásmido pJA321

Se analizaron las acciones que sobre el DNA ptasmídico, ejerció el AS (V), en presencia y ausencia de la MT de levadura, caracterizándose éstas mediante electroforesis en gel de agarosa, así como por sus propiedades espectrofotométricas.

Un ejemplo de las preparaciones del plásmido pJA321, se: presenta en la fig.1, donde se observan las tres bandas correspondientes a las formas superenrrollada, circular relajada y Lineal.

En la fig.2a, se presenta el resultado de la electroforesis de las muestras tratadas con peróxido de hidrógeno 10 mM y en presencia de As (V), en concentraciones variables (de 3 a 62 ppm). En ella podemos observar que a las 24 horas de tratamiento, sólo a partir de la concentración de 31 ppm de As (carril 7), comienza a visualizarse una degradación del DNA del plásmido. En la fig.2b, podemos apreciar que, en presencia de MT (de 10 a 200 m/mL), se incrementa el efecto de degradación, usando As a 31 ppm (0.1 mM) y que la degradación es prácticamente total en presencia de 200 m/mL de MT.

En la fig.3a, se presenta la acción del ascorbato 10 mM, en presencia de cantidades variables de As (V) (de 0.01 a 0.2 mM) actuando durante 24 horas, en donde observamos que, a diferencia del caso del peróxido de hidrógeno, el ascórbico solo o con concentraciones de 0.01 y 0.03 mM de As, ejerce un grado apreciable de degradación del plásmido. AI hacerse el tratamiento en presencia de la MT (Fig.3b), a las mismas concentraciones antes mencionadas, el grado de daño es mayor. Sin embargo, cabe destacar que no hay un efecto de dosis- respuesta.

Para estos mismas tratamientos, o las 72 horas de e!!os, en o,! coso de !as muestras tratadas con ascorbato 10 mM y concentraciones de As de 0.03 a 0.2 mM, podemos observar en la fig.4a, que el grado de daño se ha aumentado, como lo pone de manifiesto el barrido más intenso del DNA plasmídico, así como la aparición de DNA lineal, el cual es claramente observable en la parte superior del carril 8. En cuanto a la presencia de la MT en las mezclas de reacción, podemos ver en la fig.4b, que la degradación es mayor y a partir del carril 4, en este caso, si se observa un efecto de dosis-respuesta (de la M,T) de degradación del DNA.

A este mismo tiempo (72 horas), en el caso de las muestras tratadas con peróxido de hidrógeno, en presencia de cantidades crecientes de As (V), podemos observar en la fig.% que existe una degradación notable, sobre todo en los carriles 4,5 y 6 (concentraciones de As de 0.01, 0.03 y 0.06 mM). Con respecto a la presencia de MT en cantidades crecientes, podemos ver la fig.5b que, con relación al testigo sin tratamiento (carril 1) existe sólo una ligera degradación del DNA.

A las 120 horas de tratamiento, se puede observar para el caso del ascorbate en la fig.&, que existe un mayor grado de degradación del DNA, la cual es total a la concentración de As de 0.06 mM (carril 6), revertiéndose este efecto a concentraciones mayores. Al estar presente la MT en las mezclas, a este tiempo, se observa en la fig6.b, que la degradación es total, apreciándose en el fondo una gran cantidad de material plasmidico degradado de muy bajo peso molecular.

A este mismo tiempo, en el caso de las muestras tratadas con peróxido de hidrógeno, se puede observar que la degradación es mayor que en el caso del ascorbato, pues las bandas del DNA plasmídico casi han desaparecido por completo (fig.7a). AI añadírseles la MT, podemos observar que, como en el caso del ascorbato, la degradación es total (fig.7b), con la diferencia, de que los fragmentos son de pesos moleculares mayores (barrido continuo a lo largo de todo el gel).

1 2 3 4 5 6 7 8

Fig.1. Fotografía del plásmido pJA321. Carril 2, preparación del plásmido obtenido por el método de la extracción alcalina de Bimboim y Doly (1979), sin RNAasa. Carril 3, duplicado. Carril 6, plásmido tratado con RNAasa. Carril 7, duplicado. Carriles 1,4,5 y 8 sin muestra.

1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8

a b

Fig.2. Acción del Hz02 10 mM (24 hrs), en presencia de (a) As (V) en concentraciones variables y (b) metalotioneina (MT) en concentraciones variables más As (V) 0.1 mM, sobre el plásmido pJA321. Carriles (a): l)Testigo, 2 y 3) Hz02 10 mM, 4) 3 ppm, 5) 9.5 ppm, 6) 19 ppm, 7) 31 ppm de AS (V). Carriles (b): 1) 10 M/mL), 2) 20 M/mL, 3) 40 @/mL, 4) 50 M/mL, 5) 60 M/mL. 6) 80 &mL, 7) 100 &mL, 8) 200 &mL de MT, en todos los casos se añadieron Asc 10 mM y AS (V) 0.1 mM.

1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8

a b mz Z b

Fig.3. Acción del ascorbato (Asc) 10 mM (24 hrs), en presencia de (a) As (V) en concentraciones m z variables y (b) metalotioneína (MT) en concentraciones variables más As (V) 0.1 mM, sobre el plásmido pJA321. Carriles (a): l)Testigo, 2 y 3) Asc 10 mM, 4) 3 ppm, 5) 9.5 ppm, 6 ) 19 ppm, 7) 31 ppm de AS (V). 5 3 -+ - Carriles (b): 1) 10 &mL), 2) 20 M/mL, 3) 40 &mL, 4) 50 m/mL, 5) 60 &mL. 6 ) 80 &mL, i3

Iil Iz >LC

$9

p # cn

7) 100 M/mL, 8) 200 M/mL de MT, en todos los casos se añadieron Asc 10 mM y As (V) 0.1 mM.

1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8

a

Fig. 4. Acción del ascorbato (Asc) 10 mM (72 h Ire sencia de (a) As (V) en concentraciones variables y (b) metalotioneina (MT) en concentraciones variables más AS (V) 0.1 mM, sobre el plásmido pJA321. Carriles (a): l)Testigo, 2 y 3) Asc 10 mM, 4) 3 ppm, 5) 9.5 ppm, 6) 19 ppm, 7) 31 ppm de AS (V). Carriles (b): 1) 10 M/mL), 2) 20 M/mL, 3) 40 @mL, 4) 50 m/mL, 5) 60 &mL. 6) 80 &mL, 7) 100 M/mL, 8 ) 200 m/mL de MT, en todos los casos se añadieron Asc 10 mM y AS (V) 0.1 mM.

1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8

a b

Fig.5. Acción del H202 10 mM (72 hrs), en presencia de (a) As (V) en concentraciones variables y (b) metalotioneina (MT) en concentraciones variables más As (V) 0.1 mM, sobre el plásmido pJA321. Carriles (a): l)Testigo, 2 y 3) H202 10 mM, 4) 3 ppm, 5) 9.5 ppm, 6) 19 ppm, 7) 31 ppm de As (V). Carriles (b): 1) 10 M/mL), 2) 20 H/mL, 3) 40 M/mL, 4) 50 H/mL, 5) 60 &mL. 6) 80 M/mL, 7) 100 m/mL, 8) 200 &mL de MT, en todos los casos se añadieron Asc 10 mM y As (V) 0.1 mM.

1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 0

a b

Fig.6. Acción del Asc 10 mM (120 hrs), en presencia de (a) As(V) en concentraciones variables y (b) metalotioneina (MT) en concentraciones variables mós As(V) 0.1 mM, sobre el plásmido pJA321. Carriles (a): l)Testigo, 2 y 3) H202 10 mM, 4) 3 ppm, 5) 9.5 ppm, 6) 19 ppm, 7) 31 ppm de As (V). Carriles (b): 1) 10 M/mL), 2) 20 M/mL, 3) 40 &mL, 4) 50 e/mL, 5) 60 &mL. 6) 80 m/mL, 7) 100 &mL, 8) 200 &mL de MT, en todos los casos se añadieron Asc 10 mM y As (V) 0.1 mM.

1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8

a b

Fig. 7. Acción del Hz02 10 mM (120 hrs), en presencia de (a) As (V) en concentraciones variables y (b) metalotioneina (MT) en concentraciones variables más As (V) 0.1 mM, sobre el plásmido pJA321. Carriles (a): l)Testigo, 2 y 3) Asc 10 mM, 4) 3 ppm, 5) 9.5 ppm, 6) 19 ppm, 7) 31 ppm de AS (V). Carriles (b): 1) 10 @/mL), 2) 20 @/mL, 3) 40 &mL, 4) 50 @/mL, 5) 60 &/mL. 6) 80 &mL, 7) 100 M/mL, 8 ) 200 @/mL de MT, en todos los casos se añadieron ASC 10 mM y As (V) 0.1 mM.

Detección de MDA como producto de daño

La concentración de MOA registrada para las muestras 4-7, no parece incrementarse al aumentar la concentración de As (V), sin embargo, para la muestra 8, se observa una ligera disminución en la concentración de éste producto, debida quizá, a la destrucción del MOA por un excesc! de radica!es OH- A hora bien, en e! caso de !as muestras 12-17, se observa un incremento en la concentración de MOA con respecto a las muestras anteriores, pero no una diferencia considerable entre ellas y la presencia de la MT parece no tener ningún efecto protector, sin embargo al aumentar la concentración de MT, dicho efecto se observa para las muestras 18-20. (ver gráfica 1).

Para el caso de las muestras tratadas con peróxido de hidrógeno (gráf. 2), a pesar de existir una producción considerable de MDA, no se observa un aumento o disminución definida entre las muestras 4-8. Sin embargo, se observa una disminución constante en la degradación de desoxirribosa para las muestras tratadas con MT + Asc y As (V), sugiriendo que la MT pudiese estar desempeñando un papel protector en contra del daño oxidativo.

Producto de daño a i A D N plásmídico.

1.2

1

0.8

0.6

0.4

0.2

O 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Tratamiento con A s c , A s ( V ) y MT (120 hrs.)

Grdfica 1. Barra 1) pldsmido contro!. 2 y 3) P + Asc. 10 mM. 4-8) P + Asc. 10 mM + AS V (0.01 mM a 0.2 mM). 9) Asc. 10 mM. IO) As (V) 0.2 mM. 11) MT 100 ,q/rnL. i2-19) MT + Asc 10 mM + As V (0.01 mM a 0.2 mM). 20) MT + As (V) 0.2 mM. P p!ásmido. Asc.= k i d 0 ascbrbico. MT = metalotioneina.

Producto de daño al A O N plasmidico

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Tratamiento con peróxido, A s ( V ) y MT (120 hrs)

Gráfica 2. Barra 1) p!ásmido control. 2 y 3) P + /-!:O:. 10 mM. 4-8) P + H2Q:. 10 mM + As V (0.01 mM e 0.2 mM). 9) H 2 0 2 10 mM. 10) As (V) 0.2 mM. 11) MT 100 ~ / m ! - ~ i2-19) MT + H2Q2 10 mM + As V (0.01 mM Q 02 m”). 20) MT + As (V) 02 m&. P = p!&smi$o= A%= &cid0 aschrbics. MT = meta!otionelna.

Determinaciones Espectrofotométricas

Con respecto a los estudios espectrofotométricos realizados a las muestras después de las 120 horas de tratamiento, los datos se presentan de las figuras 8 a la 17.

En la figura 8a , se presenta el espectro de absorción del plásmido sin tratamiento, en el que se pueden apreciar el máximo característico del DNA a 257.7 nm y su mínimo a 228.4 así como la absorción en el máximo de 1.015. En la fig.8b, se presenta el espectro de absorción del ascorbato a una concentración de 10 mM, observándose un máximo a los 251.6 nm y un mínimo a los 212.5 nm, los cuales son ostensiblemente diferentes que los del plásmido, pero que sin embargo, al estar en mezcla estas dos sustancias, debería observarse la suma de sus absorbancias. En las fig.8c, podemos apreciar el espectro de absorción del ascorbato en mezcla con el As, el cual, comparado con el del ascorbato solo, no se modifica, indicando que no hay formación de un complejo de coordinación entre ellos. En la fig.8d , podemos observar el espectro de absorción de la MT de levadura, la cual despks de ser tratada con un agente reductor ha perdido SU máximo característico a 256 nm, indicando que se ha liberado el Cd con el que formaba el quelato, permaneciendo sólo la señal de absorción del enlace peptídico (región entre 200-215).

En la fig.9a, se aprecia el espectro del plásmido en presencia del ascorbato, en donde es de hacerse notar que el máximo se presenta a los 363.8 nm y el mínimo a los 249.5 nm, valores que difieren a las longitudes de onda del máximo y del mínimo de ambos componentes. Además, el valor de absorbancia registrado en este espectro, no corresponde a las sumas de absorbancias de los componentes individuales. Estos dos parámetros, indican fuertemente que pudiese haber una interacción entre el ascorbato y el DNA del plásmido. En la fig.9b, se presenta el espectro de la MT en presencia de arsénico. AI no modificarse este espectro, con relación a la MT sola, pudiese afirmarse, que a diferencia del Cu y del Cd que forman complejos de coordinación con la MT, el As no forma este complejo o SU interacción con ella es muy pobre. AI tenerse la mezcla con el DNA, el ascorbato y el arsénico, se obtuvo el espectro representado en la fig.9c. Se observa que hay un cambio batocrómico notable en el máximo (desplazamiento de la longitud de onda de máxima absorción a valores mayores) y un cambio hipsocrómico (desplazamiento de la longitud de onda de mínima absorción a valores menores), lo cual indicaría que, en condiciones reductoras (dadas por el ascorbato), el AS es capaz de interaccionar con el DNA, formando alguna clase de complejo.

En la fig.10, del (a) al (d), se observan los espectros de absorción de las mezclas DNA +

Asc + As (este último en cantidades crecientes de 0.03 a 0.2 mM), en donde podemos observar en la secuencia, que en a, b y c, no hay cambios notables, pero en (c) se observa que el máximo y el mínimo retornan a sus valores originales del plásmido sin ninguna adición, así como una disminución notable en el valor de absorbancia. Estos datos, tomados en conjunto, indicarían que en el caso (d), hubo tanto ruptura extensiva del DNA, liberando sus interacciones con el AS, así como un daño a las bases nitrogenadas, con productos de menor absorci6n de radiacijn ultravioleta.

En la fig. 11, del (a) al (d), se presentan los espectros de las mezclas DNA + Asc + AS + MT (esta última en concentraciones crecientes de 10 a 50 M/mL). En este caso, se puede observar que no hay una diferencia notable entre los espectros, entre sí y con relación al del espectro de la mezcla en ausencia de la MT. Ya que la MT, ni la mezcla de MT con el AS presentan una absorción de importancia en la región de interés, al no modificarse los espectros como en el caso (d) de la mezcla DNA + Asc + As, pudiesen interpretarse estos espectros como que la presencia de la MT está ejerciendo algún grado de protección hacia el DNA, de los radicales libres generados por la mezcla Asc-As-02 disuelto en la mezcla.

En la fig.l2a, se presenta el espectro de absorción del plásmido pJA321, en presencia de MT en cantidades crecientes y mayores que en la fig. 11 (de 60 a 200 M/mL). En estos casos, también es válido lo descrito para la figura anterior.

En la fig. 13a, se presenta el espectro de absorción del plásmido sin ninguna adición, y en el cual se puede apreciar, que como en su duplicado, presentado en la fig. 8a, sus propiedades espectrales son sensiblemente iguales. En la fig.l3b, se presenta el espectro del peróxido de hidrógeno, el cual a diferencia del ascorbato, no presenta sefiales de absorción importantes. En ia fig. 13c, se presenta el espectro del peróxido en presencia de As (V) 0.2 mM y en la fig.l3d, el de la metalotioneína. Como en el caso anterior, no se observan señales de absorción importantes en la región de interés.

En la fig.l4a, se presenta el espectro del plásmido en presencia del peróxido, en donde puede apreciarse que no hay cambios significativos con respecto al espectro del plásmido sin adiciones. En la fig. 14b, se presenta el espectro de la MT en presencia de peróxido y AS. Puede notarse que la presencia de estas dos sustancias, no modifican el espectro con relación al de la MT sola. En la fig. 14c, se presenta el espectro del plásmido en presencia de As(V) y de peróxido, en donde puede apreciarse que no hay cambios con relación al espectro del plásmido sin tratamiento.

En la fig.15 del (a) al (d), se presentan los espectros de absorción del plásmido en presencia de peróxido de hidrógeno y de As en cantidades crecientes (de 0.03 a 0.2 mM). En ellos puede observarse que no hay cambios notables, excepto en (d), en donde existe una disminución de la absorbancia (efecto hipocrómico) a 256.9 nm (de 1.024 a 0.960), indicando posiblemente un daño a las bases nitrogenadas, cuyos productos de reacción con los radicales libres sean compuestos que presenten menor absorción de luz UV. Además, si se considera que los geles indican una ruptura extensiva de las cadenas de DNA, y que por tanto debía esperarse una mayor absorción en la región de interés, podría decirse que el grado de daño a las bases es mayor que el que se supondría por esta disminución en la absorbancia.

En las figs,l6 y 17, del (a) al (d), se presentan los espectros de absorción de las mezclas del plásmido con peróxido de hidrógeno + As + MT en cantidades crecientes (de 10 a 200 m/mL). En estas 8 figuras, se puede observar que la variación en las propiedades espectrales al aumentar la cantidad de MT es mínima. Sin embargo, si se toman estos datos en conjunto con los resultados de las figuras de los geles del análisis electroforético, se puede llegar a suponer que hay mayor daño a las bases que los causados por el ascorbato + As, pues ya que si en los geles se observa que en estas mezclas hay degradación total, debería haberse esperado un aumento notable en la absorbancia de estas muestras y, al no haberlo, debe interpretarse esto como una compensación entre los efectos de ruptura con los de modificación de bases.

Fig. 8. Espectros de absorción de: a) plásmido pJA321. b) Ascórbico 10 mM. c) Ascorbato 10 mM en presencia de As(V) 0.2 mM. d) Metalotioneína (200 m/mL).

: n m :

N

hl o O

Fig. 9. Espectros de absorción de: a) Plásmido en presencia de Asc. 10 mM b) MT en presencia de As (V) O,$ mM y c) Plásmido en presencia de Asc. 10 mM y As (V) 0.01 mM.

I-

vl n C I

I-

O o o

O C, o

Fig. 10. Espectros de absorción del plásmido pJA321, en presencia de Asc. 10 mM y a) As (V) 0.03 mM b) As (V) 0.06 mM c) As (V) 0.10 mM d) As (V) 0.20 mM.

c

8 o

3

Fig. 11. Espectros ¿e absorción ¿el plásmido pJA321, en presencia de Asc. 10 mM, As (V) 0.1 mM y a) MT 10 m/mL b) MT 20 m/mL c) MT 40 @/m1 d) MT 50 &mL.

c

O O U

Fig. 12. Espectros de absorción del plásmido pJA321, en presencia de Asc 10 mm, As(V) 0.1 mM y a) MT 60 H/mL. b) MT 80 M/mL c) MT 100 @/mL d) MT 200 H/mL.

Fig. 13. Espectros de absorción de: a) Plásmido pJA321 b) HZ02 10 mM c) Hz02 10 mM en presencia de As(V) 0.2 mM y d) Metalotioneína (200 m/mL).

2 2 2 4 9 0

Fig. 14. Espectros de absorción de: a) Plásmido en presencia de Hz02 10 mM b) MT en presencia de As (V) 0.1 mM y c) Plásmido en presencia de Hz02 10 mM y As (V) 0.01 mM.

N

I-.

O

8

i c O O O

I fJ 8 O

Fig. 15. Espectro de absorción de I plásmido pJA321, en presencia de Hz02 10 mM y a) As (V) 0.03 mM b) As (V) 0.06 mM c) As (V) 0.10 mM y d) As (V) 0.20 mM.

Y

Y

O O O

I N O o O

Fig. 16. Espectros de absorción del plásmido pJA321, en presencia de Hz02 10 mM, AS (V) 0.1 mM y a) MT 10 &mL. b) MT 20 &mL c) MT 40 M/mL d) MT 50 j,g/mL.

.

O

Fig. 17. Espectros de absorción del plásmido pJA321, en presencia de Hz02 10 mM, AS (V) 0.1 mM y a) MT 60 H/mL b) MT 80 &mL c) MT 1 0 0 N/mL d) MT 200

CONCLUSIONES

1. El arsenato, en presencia de agentes reductores de electrones (ascorbato y peróxido de hidrógeno), es capaz de generar radicales libres de oxígeno.

2. Estos radicales libres, pueden causar daño al DNA plasmídico no habiendo diferencia si el plásmido tiene (pJA321) o no (puc 18) insertos de DNA ajenos a él.

3. Los ensayos de inactivación del plásmido tanto con MMA como con DMA, indicaron que el daño al DNA plasmídico es menor con estos compuestos que las formas inorgánicas del AS, siendo el grado de daño mayor con As (V).

4. Además de las rupturas de los enlaces fosfodiéster del DNA, los radicales libres generados por la presencia del As, causan posiblemente modificaciones de las bases nitrogenadas, como lo sugieren los análisis espectrofotométricos.

5. La detección de Molandialdehído es claro reflejo de la producción de radicales hidroxilo que degradan a la desoxirribosa, los cuales son generados por el As mediante las reacciones acopladas de Fenton.

6. El As no forma complejo de coordinación con la MT o su interacción con ella es muy pobre. Sin embargo, dependiendo de la cantidad de MT y de las concentraciones de As, ésta puede tener o no un efecto protector hacia el DNA, en contra de los radicales de oxígeno producidos por As. Para confirmar tales suposiciones se requieren más estudios al respecto.

CRITERIOS DE EVALUACI~N

BIBLIOGRAFIA

Abernathy, C.O.; W.R. Chappell; M.E. Meek; H. Gibb and H.R. Guo. I s ingested inorganic arsenic a "threshold" carcinogen?. Fund. Appl. Toxicol. 1996. 29:168-175.

Albores, A.; Cebrián, ME.; Connelly, J. C.; Bachs, P. H. y Bridges, J. W. Effects of arsenite on hepatic mixed-function oxidase activity in rats. Xenobiotica. 1992 a . 22: 591-597.

Albores, A.; Koropatnick, J.; Cherian, M. G. y Zelazowski, A. J. Arsenic induces and enheces rat hepatic metallothionein production in vivo. Chem. Biol. Interactions. 1992 b. 85: 127-140.

Albores, A.; Cebrián, ME; Garcia-Vargas, G. Connelly, J.C. ; Price, S. C.; Hinton, R. H.; Bachs, P. H. y Bridges, J. W. Enhaced arsenite-induced hepatic morphological and biochemical changes in phenobarbital-pretrated rats. Toxicol. Pathol. 1996. 24: 172-180.

Arnaiz, R. R. 1997. Las toxinas ambientales y sus efectos genéticos. F.C.E. Col. La ciencia para todos. México. 95 pp.

Barchowsky, A.; Dudek, EJ.; Treadwell, M.D. y Wetterharn, K.E. Arsenic induces oxidant stress and NF-kappa B activation in cultered aortic endothelial cells. Free Rad. biol. Med. 1996.21:783-790.

Birnboim, H.C. y Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 1979. 7/6:1513-1523.

Brown, J.; Kitchin, K.T. y George, M. Dimethlyarsenic treadment alters six different ra t biochemical parametres: Relevance t o arsenic carcinogenesis. Terat. Carcinog and Mut. 1997. 17: 71-84.

Brown, R. K. Y Kelly, F. J. 1996. Peroxides and other products. En: Free radicals. A practical approach. (Ed. N. A. Punchard y F. J. Kelly). Oxford University Press. Inc. New York. pp. 125-128

Carter, D.E. Oxidation-reductions of metal ions. Envir. Healt Perspect. 1995.103:17-19.

Cebrián, ME.; Albores, A.; Garcia-Vargas, G.; Del Razo, L.M. y Ostrosky-Wegman, P. 1994. Chronic Arsenic Poisoning in Humans: the Case of mexico. En: arsenic in the Enviroment. Part 11: human Health and Ecosystem Effects. De. Nriagu, J.O. John Wiley & Sons, Inc. USA. pp. 93-100.

Chevion, M. A site-specific mechanism for free radical induced biological damage: the essential role of redox-active transition metals. Free Rad. Biol. Med. 1988. 5:27-37.

Constan, A.A.; Benjamin, S.A.; Tessar, J.D.; Baker, D.C. y Yang, R.5.H ... Increased rate of apoptosis correlates with hepatocellular proliferation in Fisher-334 rats following long-term exposure t o a mixture of groundwater contaminants. Toxic01 Pathol. 1996. 24:315-322.

Cortinas, C. 1991. Cáncer: Herencia y ambiente. F. C. E. Col. La ciencia desde México. México. pp. 24-54, 2 2 2 4 8 9 Del Razo, l. M.; Corona, J. C.; Garcia-Vargas, G; Albores, A. y Cebrián, M. E. Fluoride levels in well-water from a chronic arsenucism area of northern Mexico. Env. Pollution. 1993. 80: 91- 94.

Dische, 2. 1955. Color reactions of nucleic acids. En: The nucleic acids (Ed. E. Chargaff y J. N. Davidson). Academic Press. Inc. Publishers. N. Y. Vol. 1, pp. 285-305.

Durán, R. G.; Gómez, M. R. Y Hicks, G. J: J: Importancia de los radicales libres durante el ciclo reproductor. Ginec. Obst. Mex. 1998. 66: 371-376.

Engel, R.R. y A.H. Smith. Arsenic in drinking water and mortality from vascular disease: An ecologic analysis in 30 counties in tha United states. Arch. Environ. Health. 1994.. 49418- 427.

Farrington, E. A. y Farrington, H. 1936. Materia médica clínica. Tomo 11. México. pp. 567- 580.

hnsebatt, M.€.: Vega, L.; Montero, R.; Garcia-Vargas, G.; Del razo, L.M.; Albores, A,; Cebrián, M.E.y Ostrosy-wegman, P. Lympocyte replicating ability in indioviduals exposed t o arsenic via drinking water. Mut. Res. 1994; 313: 293-299.

Goyer, R. A. 1991. Toxic effects of metals. En: Cassaret y Doull' S Toxicology: The basic science of poisons. 4' ed. Ed. M.O. Amdur, J. Doull y C. D. Klaassen. Pergamon Press, Inc. pp. 623-634.

Gutterdidge, J. M. C. Free radicals in diase process: a compilation of cause and consequence. Free Rad. Res. Comms. 1993.19: 141-158.

Halliwell, B. y Gutterdge, J. M. C. lipid peroxidation, oxygen radicals, cell damage and antioxidant theraphy. Lancet. 1984.. 1: 1396-1397.

Hanna, A. L.; Peters, J. M.; Wiley, l. M.; Clegg, M. S. y Keen, C. l. Comparative effects of essential and nonessential metals on preimplantation mouse embryo development in vitro. TOxiCoIOgy. 1997. 116: 123-131.

Hatlelid, K.M.; Brailsford, C. y Carter, DE. An in vitro model for arsine toxicity using isolated red blood cells. Fund. Appl. Toxicol. 1995. 25:302-306.

Hochadel, J.F. y Waalkes M.P. Sequence of exposure t o cadmium and arsenic determine the extent of toxic effects in male Fischer rats. Toxicology. 1997. 116: 89-98.

Hopenhayn-Rich, C.; Biggs, M.L.; Kalman, D.A.; Moore, LE. y Smith, A.H. Arsenic methylation patterns before and after changing from high t o lower concentrations of arsenic in dinking water. Envir. Health Perspect. 1996.104:1200-1207.

I A R C (International Agency for Research). 1987. Some metals and metallic compounds, En: 2 3 I A R C Monographs on the evaluation of carcinogenic risk of chemicals t o Humans, Supp. 7. t

8 8

IARC, Lyon. pp. 100-106.

Ish-Horowicz D.; Burke, J.F.. Rapid and efficient cosmid cloning. Nucleic Acids Res. 1981. y 9/13:2989-2998. m , p I*

q z Lee, T.C. y Ho I.C.. Modulation of cellular antioxidant defense activities by sodium arsenite in m human fibroblasts. Arch. Toxicol. 1995. 49498-504. 5% Moore, M; Harrington-Brock, K. Y Doerr, C: Genotoxicity o f arsenic and i ts methylated metabolites. En: Chapell, W.R, Abernathy CO. Cothern, C.R: Ars exposure and health. SurreyGreat Britain: Northwodd, 1994, pp. 191- 198.

Newsholme, F. A y Leech, A. R. 1987 Bioquímica médica. Ed. Interamericana. MLxico. pp 127- 131.

Oski, F. A. Vitamin E. A radical defense. New Eng. J. Med. 1980,303: 454-455

Ostrosky- Wegman, P; Gosenbatt, M. E; Montero, R; Vega, L; Barba, H. Espinosa, J. Palao, A; Cortinas, C; Garcia-Vargas, G: Del Razo, L. M, Cebrián, M. Lymphocyte proliferation kinetics and genotoxicty findings in a pilot study on individuals chronically exposed t o arsenic in Mexico. Mut. Res. 1994. 250: 477-482.

Ostrosky- Wegman, P. y Gosenbatt, M. E. Biomarcadores moleculares en la determinación de efectos xenobióticos, Gac. Med. Mex. 1997,137 , Supl. 1: 93-96.

Perbal, B. 1988. A practical guide t o molecular cloning. 2da. ed. Ed. Wiley interscience. USA.

Pereira, B. M. E. y Nefussi, N. 1986. Aspectos toxicológicos de agentes químicos, ECO/ OPM/ OMS. Metepec, México. pp 9-16.

Quintus, F.. Metal speciation in enviromental and biological systems. Envior. Health Perspect. 1995. 103:13-16.

Salazar, A.M; Ostrosky-Wegman, P; Menéndez, O; Miranda, E; Garcia-Carrancá, A. y Rojas, E. Induction of p53 protein expression by odium arsenite. Mut. Res. 1997,381: 259-265.

Slater, T. F. Y Benedetto, C. 1981. Free radical reactions in relation t o lipid peroxidation, inflamation and prostaglandi metabolism. En: The prostaglandine system (Ed. Berti, F; Velo, G. P.) Plenum Press, New York, pp.109-126.

Snow, E.T. Metal cacinogenesis: mechanistic implications. Pharmacol. Ther. 1992. 53:31-65.

Tortora, G. J. y Anagnostakos, N. P. 1993. Principios de anatomía y fisiología. 6a ed. Ed. Harla, México. PP. 713-714.

Wang, T.S.; Kuo, C.F.; Jan, K.Y. y Huang, H.M.. Arsenite induces apoptosis in Chinese hamster ovary cells by generation o f reactive oxygen species. J. Ce1t:Physiol. 1996.169:256-268.

Wanibuchi, H; Yamamoto, S; Chen, H; Yoshida, K; Endo, G; Hori, T y Fukushima, S. promoting effects of dimethylarsenic acidon N-butyl-N- (4-hidroxib~di,l) ni)rosaminainduced urinary bladder carcinogenesis in rats. Carcmqenesis in rats. Carcinogenesis. 1996, 17:2435-243.

Weinberg, R.A. How cancer arises ?. Sci. Am. 19%. 275:32-40.

Yamanaka, K; asegawo, A., Sowamura, R. Y Okado, S. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1989. 165, 43-50.

Yamanaka, K; Hoyashi, H; Kato, K; Hasegowa A. y Okada, S. Involvement o f preferential formation of apurinic/apyrimidinic sites in dimethyarsenic-induced DNA strand breaks and DNA-protein crosslinks in cultured alveolar epithelial cells. Biochtm. Biohys. Res. Comm. 1995. 207 (1): 244-249.

Vo.Bo. Bid. Pablo Gustavo Damián Matzumura Vo.Bo. Dr. José Luis Muñoz Sánchez Profesor Titular B, Tiempo Completo Profesor Titular C, Tiempo Completo

Asesor interno Asesor externo

~ ~~~

Depto. Biología de la Reproducción, UAM-I Depto. Bioquímica. ENCB, I P N

María del Carmdn Acuña González Alumna