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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
IDENTIFICACIÓN E INCRIMINACIÓN DE POTENCIALES ESPECIES DE VECTORES (DIPTERA: CERATOPOGONIDAE) DEL VIRUS LENGUA AZUL (ORBIVIRUS) EN VENADO COLA BLANCA (ODCOILEUS VIRGINIANUS) Y
ESPECIES DE GANADO EN EL ESTADO DE NUEVO LEÓN, MÉXICO.
POR
M. C. JORGE ALEJANDRO LOZANO RENDÓN
COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS CON ACENTUACIÓN EN MANEJO DE VIDA SILVESTRE Y
DESARROLLO SUSTENTABLE
NOVIEMBRE, 2015
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
SUBDIRECCION DE ESTUDIOS DE POSGRADO
IDENTIFICACIÓN E INCRIMINACIÓN DE POTENCIALES ESPECIES DE VECTORES (DIPTERA: CERATOPOGONIDAE) DEL VIRUS LENGUA AZUL (ORBIVIRUS) EN VENADO COLA BLANCA (ODCOILEUS VIRGINIANUS) Y
ESPECIES DE GANADO EN EL ESTADO DE NUEVO LEÓN, MÉXICO.
POR
M. C. JORGE ALEJANDRO LOZANO RENDÓN
COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS CON ACENTUACIÓN EN MANEJO DE VIDA SILVESTRE Y
DESARROLLO SUSTENTABLE
NOVIEMBRE, 2015
IDENTIFICACIÓN E INCRIMINACIÓN DE POTENCIALES ESPECIES DE VECTORES (DIPTERA: CERATOPOGONIDAE) DEL VIRUS LENGUA AZUL (ORBIVIRUS) EN VENADO COLA BLANCA (ODCOILEUS VIRGINIANUS) Y
ESPECIES DE GANADO EN EL ESTADO DE NUEVO LEÓN, MÉXICO.
Comité de Tesis
__________________________________________________________ Dr. Armando Jesús Contreras Balderas
Presidente
__________________________________________________________
Dr. José Ma. Torres Ayala Secretario
__________________________________________________________
Dr. Ildelfonso Fernández Salas Vocal
__________________________________________________________
Dr. Juan Antonio García Salas Vocal
__________________________________________________________
Dr. Roberto Mercado Hernández Vocal
TABLA DE CONTENIDO
Sección Página
AGRADECIMIENTOS……………………………………………………….……..……i
DEDICATORIA………………………………………………………………………….ii
LISTA DE TABLAS………………………………………………………...…………...iii
LISTA DE FIGURAS…………………………………………………………….……....iv
NOMENCLATURA……………………………………………………………………...v
RESUMEN……………………………………………………………………………….vi
ABSTRACT…………………………………………………………………………...…vi
1. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………..........1
2. ANTECEDENTES………………………………………………..………….......3
2.1 Virus lengua azul…….……………………………...……………………......3
2.2 La transmisión de la enfermedad………………………………………….....4
2.3 Culicoides……………………..……………………………………….…….4
2.4 Odocoileus virginianus (Venado Cola Blanca)…………………………........5
2.5 Presencia del Virus Lengua Azul en América……………..………………...6
3. JUSTIFICACIÓN……………………………………………………………......12
4. HIPÓTESIS……………………………………………………………………....13
5. OBJETIVOS…………………………………………………………..................14
5.1 Objetivo General………………………………………………………..…...14
5.2 Objetivos Particulares………………………………………………………..14
6. MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………………………..15
6.1 Área de estudio y captura de insectos …….………………………………...15
6.2 Diseño experimental para la captura…………………………………..…….15
6.3 Lugar de trabajo en el laboratorio…………………………………..……….16
6.4 Identificación de especímenes…………………..…………………………..16
6.5 Detección molecular de Orbivirus (Lengua Azul)……………………….17
6.6 Detección serológica de VLA…………………………………………….18
6.7 Análisis Estadístico………………………………………………………..19
7. RESULTADOS…………………………………………………………………20
8. DISCUSION……………………………………………………………….........24
9. CONCLUSIONES……………………………………….……………………...29
10. RECOMENDACIONES…………………………………….…………………..30
11. LITERATURA CITADA………………………………………………….........31
12. RESUMEN BIOGRÁFICO…….………………………………………….........36
i
AGRADECIMIENTOS
Quiero expresar mi más sincero agradecimiento al Dr. Armando J. Contreras
Balderas Director de mi tesis. Así como al Dr. Ildelfonso Fernández Salas y al Dr.
Ramiro Avalos Ramírez (Director externo), Dr. José María Torres Ayala, Dr. Juan
Antonio García Salas, Dr. Roberto Mercado Hernández por formar parte del Comité de
Tesis, por sus valiosas sugerencias e interés, en la revisión del presente trabajo.
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por el apoyo económico para la
realización de mis estudios.
Al Laboratorio de Entomología de la Facultad de Biología U.A.N.L. al Laboratorio de
Virología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia U.A.N.L. y a la
Administración de la Facultad de Medicina Veterinaria 2010-2016 a cargo del Dr. Juan
José Zarate Ramos por todo el apoyo brindado.
A mi familia por el apoyo moral que siempre me han brindado y a todas las personas
que contribuyeron de una forma u otra en la realización de este trabajo.
ii
DEDICATORIA
A Dios por permitirme haber llegado a concluir este proyecto.
A mis padres Federico Lozano Galván (+) y Genoveva Rendón de Lozano (+) que
siempre me inculcaron el estudio y la superación.
A mi Esposa (Adriana) mis dos Hijas (Adriana y Georgina) y a mi Hijo (Jorge) que son
mi fuerza para seguir adelante.
A mis hermanos (a) Gabriela, Federico, Jaime y Cristóbal.
iii
LISTA DE TABLAS
CONTENIDO PÁGINA
Tabla 1. Áreas de estudio y cronograma de muestras………………………..…16
Tabla 2. Análisis insectos colectados por mes en relación de
microrregión y meses del año 2013……………………………….……21
Tabla 3. Análisis porcientos de sueros positivos por serología por
microrregión y especies………………………………………………..22
Tabla 4. Relación de rumiantes muestreados para Lengua Azul con la
prueba de ELISA en 2013……………………………………………...23
Tabla 5. Análisis de seroprevalencia por estación del año y especies…………..24
Tabla 6. Relación entre la detección molecular de los virus de BTV y EDHV
en lotes de Culicoides y el sitio de captura en el Noreste de México…25
iv
LISTA DE FIGURAS
CONTENIDO PÁGINAS
Figura 1. Lugares de captura de Culicoides spp en
microrregiones del Noreste de México……………………………16
Figura 2. Relación de insectos colectados por mes de 2013…………….......21
Figura 3. Sueros positivos por serología……………………………………..22
Figura 4. Seroprevalencia por estación…………………………………........23
Figura 5. Temperatura optima de oligonucleótidos…………………….........24
Figura 6. Amplificación segmento 520pb del gen NS1……………….……..25
Figura 7. Detección Molecular del Virus de la Enfermedad Epizoótica
Hemorrágica del Venado (EEHV) en Órganos y Tejidos de
Venado Cola Blanca Texano (Odocoileus virginianus
texanus) en N. L……………………………………………....…..25
Figura 8. Electroforesis en gel de agarosa del producto de amplificación
del 266 pb de un fragmento del gen NS3/NS3A del BTV en
lotes de Culicoides…..……………………………………………27
v
NOMENCLATURA
ADN Ácido desoxirribonucleico
ANP Áreas naturales protegidas
ARN Ácido ribonucleico
BT1 Biotipo 1
C Centígrados
CO2 Dióxido de carbono
EEHV Enfermedad epizoótica hemorrágica del venado
ELISA Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas
INIFAP Instituto nacional de investigaciones forestales, agrícolas y
pecuarias
N Norte
NL Nuevo León
NS3 Proteína no estructural 3
pb Pares de bases
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
RT-PCR Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real
S Sur
SEMARNAT Secretaria de medio ambiente y recursos naturales
UMA Conservación de la vida silvestre
VLA Virus lengua azul
vi
RESUMEN
El identificar e incriminar las potenciales especies de vectores (Díptera:
Ceratopogonidae) del Virus Lengua Azul (VLA, genero Orbivirus, Familia Reoviridae)
en el venado cola blanca (Odocoileus virginianus) y especies de ganado en el Estado de
Nuevo León es de suma importancia para el manejo sanitario de rumiantes silvestres y
domésticos. El área de estudio comprende cuatro microrregiones distintas del estado de
Nuevo León. Para la captura de los posibles vectores (jejenes) se usaron trampas
acondicionadas con emisión de luz ultravioleta y emisión de CO2 a contraflujo. Las
mismas se colocaron en sitios de los Municipios de Linares, General Bravo, Villaldama
y Zaragoza. Los mosquitos se identificaron y clasificaron según sus características
morfoanatómicas y se detectó molecularmente el VLA mediante RT-PCR. Se capturaron
Culicoides variipennis en proporción variable según la época y la microrregión de
estudio. Se encontraron moderados índices de seropositividad contra VLA en rumiantes
silvestres y domésticos con asociación a la época del año. Incidentemente, se detectó un
venado (Odocoileus virginianus texanus) afectado clínicamente por Orbivirus.
Culicoides variipennis se encuentra en el estado de N.L. en cantidades variables según
el área de estudio. Existe evidencia serológica del VLA en rumiantes silvestres y
domésticos que está asociada a la especie animal.
vii
ABSTRACT
Identifying and incriminate potential vector species (Diptera: Ceratopogonidae) of
Bluetongue Virus (BTV, gender Orbivirus Family Reoviridae) in White-tailed Deer and
different species of domestic livestock in the state of Nuevo León is very important for
health management of wild and domestic ruminants. The study area comprises of four
different micro state of Nuevo León. For capturing the gnats equipped with ultraviolet
light emission and CO2 emission counterflow traps were used. They were placed on
different sites farms or in the municipalities of Linares, General Bravo, Villaldama and
Zaragoza. Mosquitoes were identified and classified according to their
morphoanatomical characteristics and the VLA was detected molecularly by RT-PCR.
Culicoides variipennis were captured in varying proportions depending on the time and
study the micro-region. Moderate rates of seropositivity against BTV were found in wild
and domestic ruminants with an association to the time of year. Incidentally, a deer
(Odocoileus virginianus texanus) affected by Orbivirus was detected clinically. The
Culicoides variipennis circulate in the state of NL in varying amounts depending on the
area of study. There is serological evidence of BTV in wild and domestic ruminant; it is
associated with the animal species.
1
1. INTRODUCCIÓN
El VLA y el virus de la Enfermedad Epizoótica Hemorrágica de los venados
(EEDV) (Familia Reoviridae, Genero Orbivirus), son dos virus altamente emparentados
y considerados como agentes infecciosos emergentes a nivel mundial. Ambos orbivirus
son capaces de afectar a una variedad importante de rumiantes silvestres y domésticos.
Debido a los efectos negativos sobre la economía de los sistemas pecuarios y entre otros,
las dificultades para su control y erradicación, en los países miembros de la OIE, la
aparición y circulación de estos orbivirus en rumiantes es de declaración obligatoria.
Ambos virus se transmiten de forma primaria, entre los animales susceptibles, por
especies de mosquitos del género Culicoides (Diptera: Ceratopogonidae). El género
Culicoides agrupa a los artrópodos hematófagos voladores más pequeños y abundantes,
a nivel mundial se han reportado más de 1400 especies de las cuales más de 39 especies
han sido implicadas como sospechosas o confirmadas como vectores biológicos del
VLA y/o EEDV.
La identificación y diferenciación de las distintas especies de Culicoides puede
llevarse a cabo mediante métodos fenológico (Sánchez et al. 2007) y moleculares. La
capacidad o competencia de estos insectos vectores para trasmitir a VLA y EEDV reside
en su habilidad para aumentar la carga viral en el medio ambiente. Lo cual implica la
habilidad de ambos virus para reconocer receptores de células intestinales del mosquito,
la subsecuente internalización y replicación y diseminación a partir de este sitio hacia
otros tejidos que permiten la dispersión como glándulas salivales y ovarios del insecto.
La presencia de estos virus en los tejidos de sus insectos vectores es indicativa de la
circulación y presencia en determinada región geográfica; por lo que la distribución de
las enfermedades causadas por estos orbivirus dependen de la presencia y distribución
en el medio ambiente estos insectos vectores. La epidemiología y aparición de brotes de
las infecciones causadas por VLA y EEDV dependen de las múltiples interacciones que
se establecen entre estos virus, sus vectores, el medio ambiente y la susceptibilidad del
rumiante. En México, se ha reportado evidencia serológica y virológica del VLA en
rumiantes domésticos. Particularmente, en el noreste de México, se han reportado altas
2
tasas de seropositividad contra VLA y EEDV en poblaciones de venado cola blanca
(Odocoileus virginianus texanus). De acuerdo a estos datos, aparentemente ocurren
condiciones de medio ambiente favorables en esta zona del país para la presencia y
circulación tanto del vector Culicoides como de los virus de la Lengua Azul y de la
Enfermedad Epizootica hemorrágica del Venado. El presente estudio fue llevado a cabo
para obtener parámetros entomológicos y de epidemiologia molecular para poder
determinar la presencia de secuencias genéticas de los Orbivirus VLA y EEDV en su
vector potencial artrópodo Culicoides (Culicoides, Diptera: Ceratopogonidae) capturado
en microrregiones selectas del Noreste de México.
3
2. ANTECEDENTES
La Lengua azul es una enfermedad viral no contagiosa de rumiantes domésticos y
silvestres transmitida por insectos hematófagos. Dada la importancia y los efectos de
esta afección para la economía de la industria pecuaria mundial la enfermedad se ha
incluido en la lista A de la Oficina Internacional de Epizootias (Metcalf et al., 1980,
OIE, 2002). El agente causal, el VLA, es el virus prototipo del genero Orbivirus dentro
de la familia Reoviridae (Gould y Hyatt, 1994). El VLA tiene genoma de RNA doble
cadena con 10 segmentos que codifican siete proteínas estructurales (VP1-VP7) y cuatro
no estructurales (NS1, 2, 3, y 3A) (Mertens et al., 1984; Gould y Hyatt, 1994).
Se han descrito cuando menos 24 serotipos a nivel mundial (Davies et al., 1992;
Huismans y Cloete, 1987). La infección por el VLA se presenta en regiones de clima
templado y tropical en las cuales ocurre el vector, principalmente artrópodos
hematófagos del genero Culicoides. En estas regiones la presentación de la enfermedad
ocurre comúnmente a finales de verano cuando la densidad del vector aumenta, sin
embargo la epidemiología y el curso de la infección depende de múltiples interacciones
entre el virus, el vector y el animal (Gibbs y Greiner, 1994). La infección en la mayoría
de los rumiantes es asintomática, destacándose los ovinos domésticos como la especie de
mayor susceptibilidad (Gorman-B., 1990).
2.1 Virus Lengua Azul
La lengua azul es una enfermedad infecciosa no contagiosa, de etiología viral que
afecta a los ovinos, caprinos, bovinos y a algunos rumiantes silvestres. Es transmitida
principalmente por picaduras de insectos artrópodos hematófagos del género Culicoides
y no afecta a humanos (Mellor, 1990).
La enfermedad se caracteriza por producir procesos febriles con inflamación catarral
en las mucosas respiratorias y digestivas, inflamación en las bandas coronarias y láminas
sensibles de las pezuñas, así como también degeneración muscular. En la hembra
gestante produce placentitis, abortos y malformaciones congénitas. En el macho,
infertilidad temporal con debilidad y emaciación que dan lugar a una convalecencia
4
prolongada y considerables pérdidas en la productividad. Los animales adultos que se
recuperan de la infección generalmente desarrollan inmunidad únicamente a la cepa del
virus responsable de la misma, y no son portadores del agente causal (Gorman, 1990).
2.2 La transmisión de la enfermedad
El agente causal de la lengua azul pertenece a la familia Reoviridae, del género
Orbivirus, al que también pertenecen el virus de la enfermedad epizoótica hemorrágica
de los venados y el virus ibaraki. Los Orbivirus tienen un genoma formado por diez
segmentos de ARN de doble cadena para los que, hasta la fecha, se han identificado en
el mundo 24 serotipos relacionados con la enfermedad (Gorman, 1990).
El virus de la lengua azul ha sido aislado de ovinos, bovinos, caprinos, venados de
cola blanca y en otros rumiantes silvestres. En EE.UU. la transmisión se realiza por un
único vector artrópodo (Culicoides variipennis) y en el Subtrópico y el Caribe por C.
insignes y C. pussilus. Este último vector se extiende hasta la región de Brasil y
Ecuador. El virus está presente en una franja de países que se extiende aproximadamente
entre 40°N y 35°S. Se ha demostrado por serología la presencia del virus de la lengua
azul en regiones en que está presente el vector Culicoides (por ejemplo, en África,
EE.UU., América Central, América del Sur y algunos países de Asia y Oceanía). Sin
embargo, sólo se ha observado en unos pocos países la enfermedad clínica con
confirmación por aislamiento del virus, lo que indica que el problema puede ser mucho
más extenso y que probablemente su aparición pueda estar relacionada con una
disminución de la inmunidad de los animales (USAHA, 1998; Canals y Rosell, 2006).
El virus se ha encontrado en el semen de toros y carneros, y puede transmitirse a las
vacas y ovejas susceptibles, pero este no es un mecanismo de transmisión significativo.
El virus puede transferirse también al feto mediante la placenta. El virus no se transmite
por contacto con animales o lana, ni por el consumo de leche. El virus de la lengua azul
replica en células hematopoyéticas y de los vasos sanguíneos. La destrucción de estas
células ocasiona las hemorragias e inflamaciones que generalmente se observan en el
animal. (USAHA, 1998; Martín and Amken, 2000; Fenner et al, 1992). La lengua azul
no es una zoonosis, por lo que no se transmite a humanos. Esto implica que los
5
productos elaborados con animales que posean el virus no tendrán ninguna repercusión
para los consumidores, por lo que no se trata de un problema de sanidad animal (Mellor
PS. 1990).
2.3 Culicoides
El vector biológico de la lengua azul es un díptero de la familia Ceratopogonidae, del
género Culicoides, el cual se encuentra ampliamente distribuido a lo largo del mundo.
En Europa, las principales especies relacionadas con la transmisión del virus de la
lengua azul son Culicoides imicola, Culicoides obsoletus y Culicoides pulicaris. De
ellas, C. imicola es la predominante y la responsable de los brotes de lengua azul
ocurridos hasta la fecha, en España y Portugal (Mehlhorn et al, 2007). La presencia de
los vectores va a condicionar la epidemiología de la enfermedad, tanto en su distribución
geográfica como en la estacionalidad. En países templados, el período de actividad de C.
imicola comprende desde los meses de Mayo-Junio hasta Noviembre-Diciembre, con el
pico máxima abundancia entre Agosto y Octubre. Tal y como lleva ocurriendo en la
cuenca del Mediterráneo durante los últimos años, estos períodos de máxima abundancia
son los que dan lugar a la transmisión del virus de la lengua azul y a la aparición de
brotes de la enfermedad que se puede extender fácil y rápidamente a todas aquellas áreas
en las que coexisten vectores y vertebrados (Meiswinkel, et al, 2004).
Dentro de este género, las especie se clasifican en los subgéneros por diferentes
criterios, por ejemplo, la pigmentación del patrón de las alas, por la longitud y por la
forma de los segmentos de las antenas, en los machos por las características de los
genitales y en las hembras por la distribución de la sensilia en las antenas, el número y el
tamaño de la espermateca (Campbell y Pelham-Clinton 1960, Wirth y Huber1989;
Boorman 1993; Rawlings 1996, Boorman y Hagan 2007). Sin embargo, de acuerdo a las
investigaciones biológicas moleculares, algunos subgéneros son polifiléticos, que
contiene tres o más complejos de especies (Meiswinkel et al. 2004).
Los Culicoides son insectos que se caracterizan por su pequeño tamaño pues miden
entre 1.5 y 3 mm de longitud. Tienen las patas muy cortas y pliegan las alas sobre el
dorso cuando se posan sobre la piel de los animales para picar. Poseen un pequeño
6
aparato bucal de tipo cortador chupador con el que hacen pequeños cortes en la piel
donde se acumula la sangre que succionan con su trompa. Muy característico de éste
género es la morfología de las alas que disponen de unas venas y celdillas
características. También suelen tener manchas cuya forma y disposición son importantes
para clasificarlos a nivel de especie (Mellor, 1990).
Como muchos dípteros sólo las hembras son hematófagas, necesitando ingerir sangre
para que se produzca la maduración de los ovarios y el desarrollo de los huevos.
Habitualmente son oportunistas y la gran mayoría suelen picar a cualquier tipo de animal
incluso el hombre. La realidad es que dependiendo del lugar donde crían van a succionar
sangre de las especies más abundantes. Los machos y también las hembras necesitan
alimentarse de azúcares para sobrevivir y para mantener su actividad. Los azúcares los
consiguen de plantas, de las flores y también directamente a los pulgones (Mehlhorn, et
al, 2007).
Son insectos holometábolos es decir de metamorfosis compleja. Las hembras ponen
huevos alargados fusiformes, con una longitud entre 200 y 500 micrones. De ellos salen
unas larvas alargadas que tras sufrir tres mudas se transforman en pupas y éstas darán
origen a los adultos. Los lugares donde realizan la puesta de huevos y se desarrollan las
larvas varían mucho de una especie a otra. En general necesitan abundante materia
orgánica que sirve de nutrientes a las bacterias, algas o nematodos de vida libre que son
la base de su alimentación. Estos hábitats de cría varían mucho y pueden ser desde
barros en zonas encharcadas, a agujeros de árboles con restos vegetales o incluso frutos
en descomposición (Mellor, 1990).
Las especies que están implicadas en la transmisión de la Lengua Azul crían en zonas
próximas a los lugares donde se encuentran los rumiantes y lo hacen en zonas con barros
en praderas o cerca de abrevaderos o incluso las propias heces de los animales
especialmente en las de ganado vacuno. El tiempo que tardan en desarrollar todo su ciclo
varía con la especie y hábitat, pero sobre todo también con las temperaturas ambientales.
Con temperaturas entre 28 y 35 ºC el ciclo puede ser tan corto como unos 15 días pero
7
con temperaturas más bajas y sobre todo en invierno pueden invertir hasta siete meses en
realizar todo su desarrollo larvario (Mehlhorn et al, 2007).
En general tienen actividad crepuscular y nocturna. Normalmente suelen empezar a
volar cuando se pone el sol, aprovechando que disminuye la temperatura y aumenta la
humedad ambiental. La sequedad del ambiente puede llegar a matarlos en pocas horas.
Algunas especies que se han estudiado más detalladamente presentan su máxima
abundancia justo en las primeras horas de actividad, más o menos hasta media noche,
desapareciendo prácticamente durante la noche presentando un pequeño rebrote de
actividad justo antes del amanecer. En días cubiertos y con humedad ambiente elevada
pueden volar incluso durante el día (Balczun et al, 2009).
Hasta hace poco tiempo se pensaba que eran exófilos, es decir que pican a los
animales solo en el medio ambiente, fuera de las construcciones o de zonas cubiertas.
Recientemente se ha podido comprobar que llegan a penetrar dentro de las explotaciones
ganaderas para alimentarse de los animales que se encuentran en su interior (Balczun, et
al, 2009). En condiciones normales los adultos alados vuelan como mucho unos pocos
centenares de metros. A pesar de ello parece que es habitual que se formen enjambres
para realizar la cópula y que en determinadas condiciones de temperatura del suelo se
forman corrientes ascendentes que pueden elevarlos decenas de metros sobre el mismo,
si en ese momento se generan corrientes de aire con una velocidad de unos 10 metros
por segundo, la temperatura que no sobrepase los 30 ºC y una humedad superior al 25%,
estas pueden llegar a transportar vivos a estos insectos centenares de kilómetros,
desplazándolos de un país a otro o incluso de un continente a otro, colonizando nuevas
zonas o portando virus en el caso de estar infectados (Mellor, 1990).
2.4 Odocoileus virginianus (Venado Cola Blanca)
En México podemos encontrar actualmente 4 especies de venados en vida silvestre:
el venado cola blanca (Odocoileus virginianus), el venado bura (Odocoileus hemionus),
el temazate rojo (Mazama temama) y el temazate gris yucateco (Mazama pandora)
(Gallina y Mandujano, 2009). Como miembros de una misma familia, llamada Cervidae,
8
comparten similitudes físicas, tales como la presencia de astas, además de tener
diferencias que los hacen distinguibles entre sí.
El venado cola blanca está ampliamente distribuido en nuestro país, con excepción de
la Península de Baja California. También se localiza en el sur de Canadá, Estados
Unidos de América y desde Centroamérica hasta Bolivia (Galindo-Leal y Weber, 1997;
Gallina et al., 2010). En México existen 14 subespecies o razas, las cuales habitan desde
las selvas de Chiapas y Yucatán hasta los matorrales de Nuevo León. Generalmente las
formas norteñas son de talla más grande y de coloración grisácea, y en los climas
tropicales son más pequeños y de color rojizo (Mandujano et al., 2010).
El venado ha tenido y tiene un papel importante en la economía de los pueblos
indígenas y mestizos debido al consumo de su carne, al uso de sus pieles para elaborar
prendas de vestir y artesanías, entre otras cosas. Ha sido utilizado en la caza furtiva y en
la de subsistencia, actualmente la cacería deportiva se ha extendido a muchas regiones
del país, produciendo importantes beneficios económicos. La industria de ésta es una
actividad nueva, creciente y cada vez más importante, que genera empleos e ingresos
económicos a quienes se dedican a ello (Gallina y Mandujano, 2009).
Desde una perspectiva biológica, los cérvidos son especies claves dentro de la
naturaleza al formar parte de una red alimenticia como herbívoro dispersor de las
semillas de las diversas plantas que come, y como presa de carnívoros: puma, coyote,
gato montés y algunos otros (Fulbright y Ortega-S, 2007). Al morir, sus restos son
consumidos por diversos animales carroñeros, como zopilotes y cuervos, y por varios
pequeños y medianos carnívoros, como zorros y coyotes. Los excrementos de los
venados son desintegrados, utilizados y reincorporados al suelo por muchos escarabajos
y otros insectos. Las astas mudadas y los huesos son usados por roedores (ardillas y
ratones) como una fuente de calcio (Galindo-Leal y Weber, 1997). En diversos sentidos,
el venado tiene una gran importancia ecológica en los sitios donde vive, ésta se extiende
a otros aspectos, como el económico, alimenticio y de supervivencia de las costumbres
relacionadas con ellos en los pueblos indígenas.
9
Los venados llaman la atención de los cazadores por sus características físicas, éstos
los utilizan como alimento, ropa o adorno, haciendo que las poblaciones de este animal
se vean disminuidas severamente, lo anterior muchas veces provoca que las crías se
queden sin protección. Las actividades que más perjudican a bosques y selvas, sitios
donde habitan los venados, son la agricultura y la ganadería, ya que modifican el
ambiente y dejan a sus habitantes sin comida ni lugar donde vivir, además se vuelve
muy difícil que encuentren una pareja para reproducirse (Weber y González, 2003).
Las vacas y los chivos, entre otros, compiten por el alimento con los venados al ser
introducidos a las zonas donde éstos habitan y también pueden contagiarlos de
enfermedades que no son propias, por lo tanto es necesario hacer un buen manejo del
ganado para que no perjudique a los venados (Villarreal-Espino, 2006). Para poder
ayudar a conservar los venados se deben tomar acciones en contra de la cacería ilegal e
informar a los cazadores y a la población acerca del correcto aprovechamiento que
pueden hacer de ellos, por ejemplo, sobre la existencia de lugares donde pueden cazar de
manera legal sin dañar gravemente a sus poblaciones, pues las leyes de nuestro país
permiten su aprovechamiento siempre y cuando sea un sitio autorizado (Weber y
González, 2003).
Además de las normas de protección, en México la conservación y el uso racional de
las especies de fauna silvestre y por consiguiente de los venados están legalmente
sustentados en 2 esquemas: las Áreas Naturales Protegidas (ANP) y las Unidades de
Manejo para la Conservación y Aprovechamiento Sustentable de la Vida Silvestre
(UMA) (SEMARNAT, 1997).
Las ANP son zonas terrestres o marinas destinadas a la protección de las especies que
en ellas habitan. Dentro de una, los venados se encuentran protegidos, ya que no está
permitida su caza. Sin embargo, éstos, así como otras especies de fauna y flora silvestre,
representan una importante fuente de alimento en comunidades rurales, por lo que su
consumo no debe ser totalmente prohibido, aunque sí regulado para un uso racional. En
este sentido es donde entran las UMA, áreas definidas en las que es posible aprovechar
10
de manera racional una especie ya sea para consumo, para trofeo deportivo o para
vender productos derivados de ésta (Fulbright, 2007).
Ambos esquemas resultan importantes para su conservación, siempre y cuando las
personas encargadas de la protección (en el caso de las ANP) y de la planificación del
uso racional (en las UMA) sean responsables y éticas (Mandujano y González-Zamora,
2009). Existen diversas formas a partir de las cuales se puede estimar su tamaño
poblacional. Cuando es relativamente fácil observarlos, se pueden usar métodos en los
que se cuentan directamente desde camionetas, helicópteros o avionetas; pero cuando es
difícil ver uno, ya sea porque hay muy pocos o porque la vegetación es muy densa como
en las selvas, se pueden llevar a cabo procedimientos indirectos donde, a partir de los
rastros que dejan, como sus excrementos o huellas, se pueden contar.
2.5 Presencia del Virus Lengua Azul en América
En casi toda la zona de América hay presencia del virus lengua azul. En Norte
América el principal vector ha sido durante mucho tiempo el C. variipennis (Mellor,
1990). Sin embargo, la evidencia actual sugiere que C. variipennis es, en realidad, un
complejo de al menos tres subespecies definidas genéticamente (C. c. occidentalis, C. v.
sonorensis, C. v. variipennis), de las cuales hay suficientes diferencias entre sí como
para justificar su consideración como especies separadas (Tabachnick, 1992, Tabachnick
et al, 1992). De estos, C. v. sonorensis se cree que es el principal vector de la lengua
azul a partir de aislamientos de campo, existe una estrecha relación entre la distribución
de los anticuerpos del VLA y la gama de C. sonorensis (Tabachnick, 1992, Tabachnick
et al, 1992). Además, las poblaciones de C. v. variipennis han demostrado ser mucho
más resistente que el C. v. sonorensis, en la infección oral por dicho virus (López et al,
1992, Tabachnick, 1996). Sobre la base de estos resultados se ha sugerido que las tasas
bajas por vía oral de C. v. variipennis son un factor importante en la aparente ausencia
de transmisión de la lengua azul en el noreste de Estados Unidos, una región donde C. c.
variipennis es el único representante del complejo de especies, y se ha propuesto que
estas áreas deben ser consideradas zonas libres de lengua azul (Tabachnick WJ,
Holbrook FR. 1992). En el sureste de Estados Unidos el VLA puede ser co-transmitido
11
por C. variipennis y otras especies de Culicoides. En el centro-este de Alabama, una
zona en donde la C. variipennis es escasa y donde C. stellifer es muy común, se
registraron tasas de VLA mensual de seroconversión de hasta 87% en bovinos y en
venados de cola blanca. También se han detectado productos de ARN del virus en C.
variipennis y C. Stellifer (Mullen, Anderson, 1998). Más al sur, C. variipennis está
ausente desde el sur de Florida, la región del Caribe, la mayor parte de América Central
y toda América del Sur, sin embargo, estas son regiones donde también se han registrado
casos del VLA. En estas zonas, C. insignis y C. pusillus se cree que son los principales
vectores, y VLA 2, 3, y 6 han sido aislados de C. insignis, y VLA 3 y 4 de C. pusillus
(Mo et al, 1994).
12
3. JUSTIFICACIÓN
El Virus de la Lengua Azul (VLA) es causado por un Orbivirus de la familia
Reoviridae. Afecta a ovejas, cabras, vacas, búfalos, camellos, antílopes y venados; las
ovejas son más susceptibles. En varias partes del mundo el VLA es causa de pérdidas
económicas considerables para el ganado. Las áreas con actividad del vector durante
todo el año pueden mantenerse fácilmente por medio del ciclo continuo vector-huésped.
El insecto se reproduce en el agua y abunda en las riberas de ríos, especialmente durante
los períodos de lluvias. La infección en la mayoría de los rumiantes es asintomática y
muy variable, destacándose los ovinos domésticos y la fauna silvestre como las especies
de mayor susceptibilidad. Entre los síntomas más comunes se encuentra fiebre hasta
42ºC que puede permanecer entre 2 y 11 días, hiperemia, tialismo, descarga nasal y
ocular, lesiones necróticas en encías, mucosa bucal y lengua, hemorragias en mucosas,
lesiones pódales y problemas reproductivos (abortos).
En la zona Noreste de México se ha reportado la actividad serológica del VLA en
algunos rumiantes e incluso se ha aislado de bovinos y ovinos domésticos, no obstante,
no se cuentan con datos actuales de la prevalencia de la infección y, además, no ha sido
posible incluir otras especies de rumiantes mantenidos en el Estado. La enfermedad de
Lengua Azul es una enfermedad que, desde el punto de vista de las autoridades oficiales
del país, es de tipo exótica. Dados los efectos de esta enfermedad en las poblaciones de
rumiantes silvestres y domésticas los datos del presente estudio servirán de base para
que Médicos Veterinarios, Biólogos y otras profesiones afines establezcan medidas
apropiadas de control, monitoreo y manejo de las especies involucradas y un mejor
aprovechamiento de los recursos naturales.
13
4. HIPÓTESIS
Dadas las características ecológicas del noreste de México es probable que en esta
región se presente distintas especies de Culicoides (Diptera: Ceratopogonidae) que son
portadores de secuencias genéticas del Orbivirus, mismos que están asociados a la
seropositividad en rumiantes hospederos de distintas microrregiones de la región.
14
5. OBJETIVO GENERAL
Obtener parámetros entomológicos y de epidemiologia molecular que permitan
asociar la presencia de Orbivirus en su vector artrópodo (Diptera: Ceratopogonidae:
Culicoides) en Venado cola Blanca Odocoileus virginianus y ganado en el Noreste de
México.
5.1 Objetivos específicos
1. Identificar a nivel fenotípico y molecular las distintas especies de Culicoides
(Diptera: Ceratopogonidae) que circulan en distintas regiones de Nuevo
León.
2. Determinar la dinámica poblacional de las especies de Culicoides (Diptera:
Ceratopogonidae) en dos periodos anuales consecutivos.
3. Detectar secuencias genéticas de Orbivirus en el vector potencial Culicoides
spp. y asociar su presencia a la seropositividad en rumiantes silvestres y
domésticos, hospederos en distintas microrregiones del Noreste de México.
15
6. MATERIALES Y MÉTODOS
6.1 Área de estudio y captura de insectos
El área de estudio comprendió cuatro microrregiones distintas del estado de Nuevo
León Figura 1. Para la captura de los jejenes se usaron trampas acondicionadas con
emisión de luz ultravioleta y emisión de CO2 a contraflujo (Liberty Plus®, American
Biophysics Co., USA) mismas que se colocaron en ranchos o ejidos, según la
disposición para cooperar, en los municipios de Linares, Villaldama, China, General
Bravo y Zaragoza. Los sitios de captura serán seleccionados acorde a las diferencias que
existan entre ellas como microrregiones y serán referenciadas geográficamente con Geo-
Posicionador satelital (GPS) comercial. Se tomaron en cuenta los parámetros de altura
sobre el nivel del mar, temperatura y humedad local promedio mensual, vegetación
predominante y distancia de la fuente de agua más cercana, tipo y cantidad aproximada
de rumiantes silvestres y domésticos en un radio de 10 kilómetros.
Figura 1. Posición relativa de los sitios de captura de Culicoides spp en
microrregiones del Noreste de México: 1: General Bravo, 2: Zaragoza, 3:
Villaldama y 4: Linares.
16
De cada área se registro la temperatura y humedad al momento del muestreo mediante el
uso de un termo-higrómetro portátil (Trotec BC 15). Estos datos se contrastaron con los
datos de las estaciones de monitoreo climático que tiene la SAGARPA ó el INIFAP que
se encuentren más próximos al sitio de muestreo. Las trampas se colocaron a 1.5 m.
arriba del suelo y operaron desde una hora antes de la salida del sol y hasta una hora
después de la puesta del sol. Por la mañana siguiente los insectos fueron recolectados en
contenedores ó bolsas de plástico con un algodón humedecido con agua. Se almacenaron
en refrigeración y se transportaron al laboratorio bajo estas condiciones.
6.2 Cronograma de muestras
El periodo de estudio comprendió desde enero del 2012 hasta diciembre del 2013 y se
analizo la población de Culicodes spp capturadas a intervalos regulares durante tres
noches seguidas de una semana del mes; según la Tabla 1.
Localización (Municipio)
Semana
1 2 3 4
Linares X
Zaragoza X
Villaldama X
General Bravo X
Tabla 1. Áreas de estudio y cronograma de muestras.
17
Se pudieron obtener un total de 6 capturas por estación dando un total de 24 capturas
anuales en cada microrregión seleccionada. Para el análisis de datos la captura de tres
noches consecutivas, según el calendario propuesto, se contabilizo como una captura. En
caso de lluvia se recorrió la captura una noche más.
6.3 Lugar del trabajo del laboratorio
La identificación y actividades para el reconocimiento de distintas especies de
Culicoides se realizaron en el departamento de Entomología Medica de la Facultad de
Ciencias Biológicas de la UANL. La detección y diferenciación molecular de Orbivirus
(Virus de la Lengua Azul) se realizaron en el Laboratorio de Virología Veterinaria de la
Faculta de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la UANL.
6.4 Identificación de especímenes
En laboratorio se conto el total de especímenes por captura y se inició la
identificación fenotípica y el sexado. Los ejemplares que correspondan a Culicoides spp
fueron separados del resto de los insectos y se obtuvo la proporción de Culicoides
atrapados con respecto a otras especies de insectos. La identificación será realizada
según lo reportado por Boorman 1980, Rowling 1996 y Boorman y Hagan 2007, los
cuales se basan en el patrón característico de manchas ó áreas oscuras y claras de las alas
e incluyen otros caracteres como el patrón del lado dorsal del tórax (mesonotomun),
tamaño y forma del segmento de las antenas, posición relativa de los ojos, cantidad de
espermatecas en hembras y la forma de los genitales en machos; entre otros. Se obtuvo
la proporción de las especies de Culicoides (por cantidad y sexo) basados en estas
características para obtener la especie predomínate por captura, mes, estación y región.
Las distintas especies de Culicoides se registraron y almacenaron fotográficamente y en
la base de datos a través del programa de Microsoft Excell 2007. Una vez identificados
los insectos, y de acuerdo a la densidad encontrada, la mitad de especímenes se preservo
en etanol al 70% y la otra en congelación a -80°C
.
18
6.5 Detección molecular de Orbivirus (Lengua Azul)
Lotes de más de 30 especímenes de distintas especies y fueron analizadas para
determinar la presencia de secuencias genéticas del Virus de la Lengua Azul (VLA)
mediante RT-PCR anidado. Se obtuvo el RNA total de cada lote con la ayuda del
estuche comercial “FastRNA® Pro Soil – Direct Kit” y del Fast Prep-24
(www.mpbio.com), siguiendo las recomendaciones del fabricante. Se calculó la
concentración de RNA mediante el método tradicional de espectrofotometría a 260 nm
con la ayuda de un espectrofotómetro y se ajusto a 1µg/µl para llevar a cabo la RT-PCR.
Las reacciones de la RT-PCR anidada fueron llevadas a cabo con la ayuda de los
estuches comerciales “SuperScriptTM III one Step RT-PCR System with Platinum® Taq
High Fidelity” y “AccuPrimeTMSuperMix I” (www.invitrogen.com) siguiendo las
recomendaciones del fabricante. La amplificación de un fragmento genético del VLA se
realizo con ligeras modificaciones acorde al protocolo descrito Aradaib et al., 2003. Los
oligonucleótidos a emplear fueron diseñados en base a regiones altamente conservadas
dentro del gen NS3 y aparentemente amplificarían todos los serogrupos del VLA
descritos a la fecha. Las secuencia de los oligonucleótidos es como sigue: BT1: 5´-GAT-
TAC-GCA-AAT-GCC-ACG-AG-3´, BT2: 5´-TAC-GAG-GAG-GAT-GTC-GAA-GG-
3´, BT3: 5´-TTC-CGA-AGA-GCT-GTT-GTA-CA-3´, BT4: 5´-GGT-GTA-ATG-GAA-
ATT-CAC-CT-3´. BT1 y BT4 amplifican un fragmento de 790 pb dentro del gen NS3
dentro del segmento 10 del VLA. BT2 y BT3 producen un fragmento de 520 pb dentro
del fragmento generado por BT1 y BT4. Todas las reacciones de PCR se realizaran a un
volumen final de 50 µl por tubo. Los ciclos de amplificación térmica para la PCR se
llevaran a cabo en un termociclador (Maxygen, Unión City, Calif. USA) y consistieron
en : 2 min a 95°C seguido de 40 ciclos de 95°C 1 minuto, 55°C 30 seg y 72°C 45 seg y
una incubación final de 72°C por 10 min. La evidencia de amplificación se realizo en
geles de agarosa al 1.5% teñido con bromuro de etilo, para lo cual se separaron 20 µl del
producto de PCR bajo condiciones de electroforesis acorde al protocolo estándar. El
tamaño del producto amplificado se comparo contra un marcador de peso molecular de
1Kb (Axygen). Cada gel se fotodocumentó con la ayuda de un equipo y programa
19
diseñado para el propósito. (MultiDoc-ItTM Imaging System (www.uvp.com). En cada
corrida se incluyeron controles negativos y positivos de reacción. El control positivo de
reacción de la RT-PCR será el RNA obtenido de un virus vacunal del VLA tipo 10
(Colorado Serum Company, Denver, USA.) y el control negativos consistieron en agua
doble destilada estéril libre de RNAsas y DNasas.
6.6 Detección serológica de VLA
Se obtuvieron muestras aleatorias de rumiantes domésticos y eventualmente
silvestres que se encontraron dentro de un radio de 10 km al sitio de colocación de la
trampa para insectos. Los animales se mantuvieron en aéreas cercadas o libres y se
manejaron por contención física y/o química. De forma arbitraria solo fueron
seleccionados de 25 animales por especie (bovinos, ovinos, caprinos, cérvidos) y por
estación del año y a partir de ellos se establecieron los índices de seropositividad contra
VLA. La determinación serológica se realizará usando un estuche comercial basado en
basado en ELISA de competencia (VMRD, inc.). Se utilizo el protocolo y criterios
recomendado por el fabricante a partir del uso del suero de cada una de las especies de
rumiantes seleccionadas.
6.7 Análisis estadístico
Se determinó la asociación entre la presencia de determinada especie de Culicoides
spp con las microrregión, altura sobre el nivel del mar, temperatura y humedad local
promedio mensual, densidad poblacional de rumiantes y seropositividad contra el VLA
en distintos rumiantes del área de captura. Similarmente se obtuvo el grado de
asociación entre la época del año y densidad estimada de Culicoides por microrregión.
Todos los cálculos estadísticos se realizaron con el programa SPSS 17 (IBM). Los
índices de seroprevalencia contra VLA en las distintas especies de rumiantes se obtuvo
mediante la fórmula P= N° de animales positivo/ N° de animales muestreados X 100
(Steel, et al, 1997). Se utilizaron intervalos de confianza de un 95%, un análisis de la
varianza por ANOVA y una comparación de medias mediante Tukey. Para los análisis
estadísticos, p<0.05 fue considerado significativo.
20
7. RESULTADOS
En los cuatro municipios de Nuevo León se encontraron Ceratopogónidos. La
identificación de los Culicoides se realizó mediante las claves de Borror y de Delongs,
2011. Los Culicoides encontrados son de la especie variipennis (este es un complejo en
donde se encuentra la especie sonorensis, reportada para México). Sin embargo
podemos hacer la diferenciación morfológica por medio de taxonomía molecular. La
cantidad de mosquitos capturados estuvo asociada con la temperatura promedio anual,
altura y época del año en el sitio de captura (p<0.01). Lotes de entre 3 y 15 mosquitos
hembras fueron analizados para detectar secuencias genéticas de VLA (parte del gen
NS3/NS3A del segmento 10) y EEHV (parte del gen NS1 del segmento 5) empleando
oligonucleótidos reportados en estudios previos. Con excepción de la microrregión,
localizada en el municipio de Zaragoza N. L. (23°57´10.24´´N, 99°46´12.24´´O; 1454
msnm), en la cual solo fue posible capturar un jején, los grupos de mosquitos capturados
en todos los sitios resultaron RT-PCR positivos al VLA y al EEHV. La mayor
proporción de grupos de mosquitos positivos al RT-PCR fue en primavera y verano. La
presencia de secuencias genéticas de VLA y EEHV en mosquitos Culicoides spp
capturados pueden eventualmente asociarse a la aparición de brotes de enfermedades
causadas por estos virus en rumiantes silvestres y domésticos del noreste de México. El
manejo de estas poblaciones animales debe de tomar en cuenta la circulación de
culícidos portadores de ambos virus por los que es necesario realizar subsecuentes
estudios para confirmar la presencia del VLA y EEHV en poblaciones potencialmente
susceptibles. Se capturó Culicoides variipennis y se realizó un análisis de la proporción
variable según la época y la microrregión de estudio y podemos ver como para el mes de
abril hay una mayor incidencia de Culicoides por la época del año (Tabla 2, Figura 2).
Se encontraron moderados índices de seropositividad contra VLA en rumiantes
silvestres y domésticos con asociación respecto a la época del año (Tabla 3, Figura 3).
Incidentemente, se detecto un venado (Odocoileus virginianus texanus) afectado
clínicamente por Orbivirus. Adicional se realizó una relación de seroprevalencia
estacional con los porcientos de casos positivos (Tabla 4, Figura 4). También se
21
relacionó la detección molecular de los virus de VLA y EEHV en lotes de Culicoides y
el sitio de captura en el Noreste de México (Tabla 5). Mediante RT-PCR en gradientes
de temperatura se logró obtener la temperatura optima de unión de los oligonucleótidos
B1 y B4 (50, 55 y 56ºC) (Figura 5). Además por PCR anidado se ha logrado poner a
punto las condiciones para amplificar un segmento de 520bp del gen NS1 con los oligo-
nucléotidos B2 y B3 (Figura 6). Para el sexado de los Culicoides se utilizó un
microscopio estereoscópico para realizar la diferenciación de machos y hembras. Luego
se llevó a cabo la extracción del RNA total y posteriormente se realizó el RT-PCR y
DNA anidado. En la detección Molecular del Virus de la Enfermedad Epizoótica
Hemorrágica del Venado (EEHV) en órganos y tejidos de Venado Cola Blanca Texano
(Odocoileus virginianus texanus) en N.L. con un caso positivo. Adicional se detectó
molecularmente un caso del virus de la EEHV en órganos y tejidos de un Venado cola
blanca texano (Odocoileus virginianus texanus) en Villaldama, N.L. (Figura 7).
|Insectos Colectados por Mes 2013
Abril Mayo Junio Julio Agost Sept Oct EEM Valor P
Linares 24 23 0 0 0 6 0 0.32 0.512
Bravo 80 12 27 27 131 8 1 0.026 0.271
Villaldama 30 5 5 5 4 2 1 0.45 0.639
Zaragoza 0 0 0 0 1 0 1 0.39 0.785
Tabla 2. Relación de insectos colectados por mes de 2013. Se muestran los números de
insectos colectados por los meses de 2013 en Zaragoza, Linares, General Bravo,
22
Porcientos de Sueros Positivos por Serología
Venados Bovinos Ovinos Caprinos EEM Valor P
Zaragoza 0 27 0 0 0.012 0.410
Linares 0 0 0 0 0 0
Bravo 0 39 0 38 0.023 0.311
Villaldama 43 0 0 0 0.019 0.298
Tabla 3. Análisis porcientos de sueros positivos por serología por microrregión y
especies.
Figura 2. Análisis insectos colectados por mes en relación de microrregión y meses del año
2013.
23
Municipio Total de Sueros
Positivos % Positivos EEM Valor P
Zaragoza 80 6 7.5 0.27 0.543
Villaldama 93 40 43.01 0.032 0.314
Linares 80 0 0 0 0
Gral. Bravo 134 50 37.31 0.019 0.223
Figura 3. Valores de los sueros positivos por serología. En el eje de y se presenta el
porciento de sueros positivos y en el eje de x las especies muestreadas con relación a los
Municipios muestreados. Se tomo como significativo a p<0.05.
Tabla 4. Relación de rumiantes muestreados para Lengua Azul con la prueba de ELISA en 2013
24
Seroprevalencia por Estación del Año
Venados Bovinos Ovinos Caprinos EEM Valor P
Primera
(15-30ºC)
26 53 9 33 0.037 0.245
Verano
(18-38ºC)
18 41 3 20 0.018 0.329
Figura 4. Seroprevalencia por estación. Las especies muestreadas durante el
2012 7 2013, venados, bovinos, ovinos y caprinos con sus respectivos porcientos de
casos positivos. Se consideran significativos p<0.05.
Tabla 5. Análisis de seroprevalencia por estación del año y especies.
25
(1) Sitio de captura de los Culicoides, (2) altura sobre el nivel del mar, (3) Lotes + / N° total de lotes
analizados.
Municipio Posición(1)
Geográfica
Altura(2)
Estación del año
Primavera
(Marzo-Mayo)
Verano
(Junio-Agosto)
Otoño
(Septiembre-
Noviembre)
VLA EEHV VLA EEHV VLA EEHV
General
Bravo
25°49´2.24´´N,
99°15´31.47´´O.
137
6/11(3) 4/11 8/15 4/15 0/2 0/2
Linares 24°51´13.69´´N,
99°32´40.76´´O.
345 3/8 0/8 1/3 0/3 0/2 0/2
Villaldama 26°29´04.06´´N,
100°26´10.32´´O.
434 3/5 2/5 1/3 2/3 0/1 0/1
Zaragoza 23°57´10.24´´N,
99°46´12.24´´O.
1454 0/0 0/0 0/1 0/1 0/0 0/0
Figura 5. Temperatura optima de oligonucleótidos. Mediante RT-PCR en gradientes de
temperatura se logró obtener la temperatura optima de unión de los oligonucleótidos B1 y B4 (50,
55 y 56ºC).
Tabla 6. Relación entre la detección molecular de los virus de VLA y EEHV en lotes de Culicoides y
el sitio de captura en el Noreste de México.
26
Figura 6. Amplificación segmento 520pb del gen NS1. Por PCR anidado se ha logró
poner a punto las condiciones para amplificar un segmento de 520bp del gen NS1 con
los oligo-nucléotidos B2 y B3.
Figura 7. Detección Molecular del Virus de la Enfermedad Epizoótica Hemorrágica
del Venado (EEHV) en Órganos y Tejidos de Venado Cola Blanca Texano
(Odocoileus virginianus texanus) en N. L.
27
Figura 8. Electroforesis en gel de agarosa del producto de amplificación del 266 pb de un
fragmento del gen NS3/NS3A del BTV en lotes de Culicoides. 1. Control positivo (vacuna
comercial). 2 – 4 muestras representativas de los sitios General Bravo (2), Villaldama (3) y
Linares (4), 5. Control negativo (agua destilada). M: Marcador de Peso Molecular.
28
8.DISCUSIÓN
En zonas endémicas ambos virus pueden potencialmente trasmitirse por el mismo
vector (Mellor, 2000), (Cetre-Sossah, 2014). Con excepción del sitio localizado en el
municipio de Zaragoza, N.L., en el cual sólo se capturó un ejemplar, en todas las
microrregiones analizadas fue posible capturar al vector Culicoides. La cantidad de
mosquitos capturados fue dependiente de la microrregión ó sitio, la época del año,
temperatura promedio y altura sobre el nivel del mar (p<0.01) (Tabla 5). La
identificación fenotípica básica de los especímenes capturados permitió conocer que
todos los ejemplares correspondieron al complejo de especies Culicoides variipennis
(Wirth, 1957, Borror, 1989), (Rawlings, 1996). Aparentemente este complejo de
especies está ampliamente disperso en Estados Unidos de América (Mullens, 1992,
Holbrook, 2000) y en México (Wirth, 1957). La circulación de miembros de este
complejo de especies de Culicoides variipennis se ha reportado en México desde el año
1948 (Macfie, 1948). El complejo de especies de Culicoides varipennis son
competentes para transmitir virus del genero Orbivirus (Familia Reovidirae) incluidos
BTV y EHDV (Ruder, 2012), (Tabachnick, 1996) y otros agentes infecciosos (Drolet,
2005).
Hasta la fecha no se ha reportado la detección de secuencias genéticas a partir de
mosquitos Culicoides que circulan en el Noreste de México. La detección y el monitoreo
de estos insectos es importante para el control de los patógenos que potencialmente
pueden transmitir (Maclachlan, 2013). En la región noreste de México se ha reportado
actividad serológica en rumiantes silvestres y domésticos contra el BTV y el EEHV
(Ávalos-Ramirez, 2003), (Suzan, 1983), (Teclaw, 1985), (Martinez, 1999). BTV ha sido
aislado de bovinos y ovejas de esta y otras regiones de México (Stott, 1989). En este
trabajo las secuencias genéticas de ambos virus fueron detectadas solo en lotes de
Culicoides obtenidos en primavera y verano de ciertos sitios (Figura 1) (Tabla 5). La
secuencia genómica del BTV fue encontrada en proporciones relativamente altas en
todos los sitios de captura (Figura 5) (Tabla 5). Las secuencia genómica del EEHV
29
(Figura 6) fue encontrada lotes de Culicoides capturados en solo dos de los cuatro sitios
analizados (Figura 1) (Tabla 5).
Los datos del presente estudio sugieren fuertemente que el complejo de especies de
Culicoides variipennis circula con secuencias genéticas de los virus de la Lengua Azul y
el de la Enfermedad Epizoótica Hemorrágica en el noreste de México. La circulación del
potencial vector es variable y dependen de la estación del año y de las condiciones de la
microrregión bajo estudio. Estas observaciones concuerdan con otros estudios realizados
en otras partes del mundo (Kedmi, 2011). Observaciones similares han sido La
detección de secuencias genéticas tanto BTV como EEHV implica que es muy probable
que ambos virus estén circulando en esta zona de México. Estas observaciones sugieren
que eventualmente las poblaciones de rumiantes domésticos y silvestres podrían verse
afectados por mono o co-infecciones de ambos virus (Sailleau, 2012), (Toye, 2013).
Bajo este contexto, alteraciones clínicas y patologías concernidas con la infección por
Orbivirus pueden estar siendo no detectadas o mal diagnosticadas en las poblaciones de
rumiantes silvestres y domésticos, lo que dificultaría su control (Maclachlan, 2013). La
eventual presencia de ambos virus en las zonas y poblaciones estudiadas puede
constituirse en brotes de enfermedad, lo cual compromete la salud, el manejo y la
producción del sistema pecuario. Acorde a lo anterior, es necesario realizar estudios
posteriores para determinar el eventual impacto de ambos virus en la salud de los
animales susceptibles en la zona noreste de México.
30
9. CONCLUSIONES
Se obtuvieron parámetros entomológicos, serológicos, moleculares y clinico-
patológicos que permiten asociar la presencia de Orbivirus (VLA, EEHV, fam:
REOVIRIDAE) tanto en el vector artrópodo (Culicoides, Diptera: Ceratopogonidae)
como en rumiantes silvestres y domésticos en el Noreste de México.
El vector Culicoide de los Orbivirus; BTV y EEHV se encuentra circulando en
diversas microrregiones de Nuevo León (Zaragoza, Villaldama, Linares y Gral. Bravo).
La dinámica poblacional del vector está asociada a la temperatura, humedad y época del
año (p<0.05). Existe fuerte evidencia serológica, clínica y patológica de la presencia de
Orbivirus (VLA, EEHV) en rumiantes silvestres y domésticos de NL. Se detectaron
secuencias genéticas de Orbivirus en los Culicoides capturados pero solo en ciertas
épocas del año y en algunas regiones.
El Culicoide variipennis spp. que se encuentra en el estado de Nuevo León en
cantidades variables según el área de estudio. Existe evidencia serológica y molecular
del VLA en rumiantes silvestres y domésticos que está asociada a la especie animal.
Encontrando una relación entre las estaciones del año (primavera, verano) y la presencia
del vector. Con excepción del municipio de Zaragoza, N.L., en el cual sólo se capturó
un ejemplar y detectamos actividad serológica, en todas las microrregiones analizadas
fue posible capturar al vector Culicoides para VLA, viendo un incremento en la
primavera en la incidencia del mismo y de igual manera se obtuvo evidencia molecular y
serológica. Mientras que para el municipio de Linares N.L. no se detectó evidencia
serológica. La cantidad de mosquitos capturados fue dependiente de la microrregión ó
sitio, la época del año, temperatura promedio y altura sobre el nivel del mar.
31
10. RECOMENDACIONES
Conforme a lo encontrado en este estudio se considera deberá tener un mayor
monitoreo, principalmente en las épocas criticas que serian primavera–verano y
colección de datos determinados por serología y biología molecular de los
microorganismos en los rumiantes silvestres y la frecuencia y/o incidencia de los
vectores en las diferentes microrregiones de estudio.
32
11. LITERARUTA CITADA
Ávalos R R, Lozano R J, Marroquín C A, Ramírez R R, Riojas V V, González, S J,
Salinas M J. 2003. Actividad serológica del Virus de la Lengua Azul (VLA) en
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Aradaib IE, Smith WL, Osburn BI, Cullor JS. 2003. A multiplex PCR for
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12. RESUMEN BIOGRÁFICO
M.C. Jorge Alejandro Lozano Rendón
Candidato para el Grado de
Doctorado en Ciencias con Orientación en Manejo de Vida Silvestre y Desarrollo
Sustentable
Tesis: IDENTIFICACIÓN E INCRIMINACIÓN DE POTENCIALES ESPECIES DE
VECTORES (DIPTERA: CERATOPOGONIDAE) DEL VIRUS LENGUA AZUL
(ORBIVIRUS) EN VENADO COLA BLANCA (ODCOILEUS VIRGINIANUS) Y
ESPECIES DE GANADO EN EL ESTADO DE NUEVO LEÓN, MÉXICO.
Campo de Estudio: Ciencias de la Vida Silvestre.
Datos Personales: Nacido en Monterrey Nuevo León el 13 de Enero de 1965, hijo de
Federico Lozano Galván (+) y Genoveva Rendón Garza (+).
Educación: Egresado de la Universidad Autónoma de Nuevo León, grado obtenido
Médico Veterinario Zootecnista en 1987.
Maestría en Ciencias Veterinarias Egresado de la Universidad Autónoma de Nuevo
León, grado obtenido en 2004.
Experiencia Profesional: Maestro de Tiempo Completo de la Universidad Autónoma de
Nuevo León desde 1989.
Artículo publicado
Molecular detection of bluetongue virus (BTV) and
epizootic hemorrhagic disease virus (EHDV) in
captured Culicoides spp. in the northeastern regions of Mexico
Lozano-Rendón, J. A.1, Contreras-Balderas, A. J.2, Fernández-Salas, I.2, Zarate-Ramos,
J. J.1 and Avalos-Ramírez, R.1*
1Universidad Autónoma de Nuevo León, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Av. Francisco Villa
s/n Col. Ex Hacienda el Canadá, Escobedo, N.L., 65050 México.
2 Universidad Autónoma de Nuevo León, Facultad de Ciencias Biológicas, Apartado Postal 425, San Nicolás
de los Garza, Nuevo León, 66455 México.
Received 6 July, 2015; Accepted 25 September, 2015
Vol. 9(XX), pp. XXX-XX, XX XXX, 2015
DOI: xxxxxxxxxxxx
Article Number: XXXX
ISSN 1996-0808
Copyright © 2015
Author(s) retain the copyright of this article
http://www.academicjournals.org/AJMR
African Journal of Microbiology Research
Full Length Research Paper
Molecular detection of bluetongue virus (BTV) and epizootic hemorrhagic disease virus (EHDV) in
captured Culicoides spp. in the northeastern regions of Mexico
Lozano-Rendón, J. A.1, Contreras-Balderas, A. J.2, Fernández-Salas, I.2, Zarate-Ramos, J. J.1 and Avalos-Ramírez, R.1*
1Universidad Autónoma de Nuevo León, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Av. Francisco Villa s/n Col. Ex
Hacienda el Canadá, Escobedo, N.L., 65050 México. 2 Universidad Autónoma de Nuevo León, Facultad de Ciencias Biológicas, Apartado Postal 425, San Nicolás de los
Garza, Nuevo León, 66450 México.
Received 6 July, 2015; Accepted 25 September, 2015
Midges of Culicoides spp. (Diptera: Ceratopogonidae) captured in 2013 (February to November) in four micro-regions located in the northeast of Mexico were analyzed to determine the presence of genetic sequences of the viruses of Bluetongue (BT) and Epizootic Hemorrhagic Disease (EHD) by reverse transcription–polymerase chain reaction (RT-PCR). In all the micro-regions sampled, it was possible to detect the presence of culicoides biting midges, along with other insects. The basic phenological identification of midges showed that all specimens corresponded to the Culicoides variipennis complex (Wirth & Jones). The amount of captured midges was associated with the annual mean temperature, altitude and time of year at the site of capture (p <0.01). A total of 51 pools, each one of 3 to 15 female midges, were analyzed for genetic sequences for BTV (part of NS3 / NS3A gene segment 10) and EHDV (part of the NS1 gene segment 5) using oligonucleotides reported in previous studies. Except for the micro-region located in the municipality of Zaragoza, Nuevo Leon (23 ° 57'10.24''N, 99 ° 46'12.24''O; 1454 m), where it only was possible to capture one midge, midges groups captured at all other sites were RT-PCR positive for BTV and EHDV. The highest proportion of positive midges groups to RT-PCR was found in spring and summer. The presence of genetic sequences of BTV and EHDV in captured Culicoides spp. may eventually be associated with outbreaks of diseases caused by these viruses in wild and domestic ruminants in the northeastern part of Mexico. The information on the movement of midges carrying both viruses could be taken into account for the management of animal populations, and further studies are needed to confirm the presence of the mentioned viruses. Key words: Bluetongue virus (BTV), Epizootic Hemorrhagic Disease virus (EHDV), Culicoides, RT-PCR, Ruminants, northeast Mexico.
INTRODUCTION Bluetongue virus (BTV) and Epizootic Hemorrhagic Disease virus (EHDV) (Family Reoviridae, Genus
Orbivirus) are two highly related viruses which are considered emerging infectious agents globally
(Maclachlan and Guthrie, 2010; Maclachlan and Mayo, 2013). Both Orbivirus are able to affect a large variety of wild and domestic ruminants (Legisa et al., 2014; MacLachlan and Guthrie, 2010). Due of their negative effects on the economy of livestock systems, and the difficulties in their control and eradication, the appearance and movement of such Orbivirus in ruminants are a required declaration in the countries members of the World Organization for Animal Health (OIE) (Wittmann and Baylis, 2000), (OIE, 2015). Both viruses are transmitted, by primary form, between susceptible animals by the species of midges of the Culicoides genus (Diptera: Ceratopogonidae) (Searle et al., 2014), (Mellor et al., 2000). The Culicoides genus groups are the smallest and most abundant flying blood-sucking arthropods, and more than 1,400 species are reported worldwide (Mellor et al., 2000); of these, more than 39 species have been implicated as suspicious or confirmed as biological vectors of BTV and EHDV (Savini et al., 2011). The identification of different species of Culicoides can be accomplished by phenological and molecular methods (Meiswinkel et al., 2004), (Mathieu et al., 2007), (Werner and Kampen, 2007). The ability of these vectors to transmit BTV and EHDV lies in its ability to increase the viral load in the environment (Mellor, 2000), (Ruder et al., 2012). It implies the recognition of the virus receptors in the intestinal cells of midges, subsequent internalization and replication, as well as the spreading from this site to other tissues that allow the dispersion to salivary glands and ovaries of the insect (Mellor, 2000). The presence of these viruses in the tissues of their insect vectors is indicative of their movement in certain geographic region (Hoffmann et al., 2009); therefore, the distribution of arboviral diseases caused by these viruses depends on the presence and distribution in the environment of such insect vectors (Wittmann and Baylis, 2000). The epidemiology and outbreaks of infections caused by BTV and EHDV depend on the multiple interactions that exist between these viruses, their vectors, the environment and the susceptibility of ruminants (Mellor, 2000) (Savini et al., 2011) (Legisa et al., 2014). In Mexico, serologic and virologic evidence has been reported for BTV in domestic ruminants (Hernandez et al., 1994), (Stott et al., 1989) (Suzan et al., 1983), (Mooehead-Jackson, 1981), (Teclaw et al., 1985). Particularly, in the northeastern region of Mexico, high rates of seropositivity against BTV and EHDV in populations of white-tailed deer (Odocoileus virginianus texanus) has been reported (Martínez et al., 1999). According to these data, favorable environment conditions for the presence and movement of the Culicoides vector in this area of the country are apparently occurring. The present study was performed
to determine the presence of genetic sequences of the orbivirus BTV and EHDV in their potential arthropod vector (Culicoides midges), caught in selected regions in the northeast of Mexico. MATERIALS AND METHODS Study area and sample collection Capture sites for biting midges include four distinct micro-regions located in the state of Nuevo Leon, in the northeast of Mexico (Figure 1). The sites show differences in altitude above sea level, temperature, average annual precipitation and predominant vegetation. Each site was located near pens of ranches with domestic ruminants (cattle, goats, sheep), not more than 20 maway and with the concurrence of wild ruminants (white-tailed deer) within an area of 5 km. The capture of midges was carried out with Mosquito Magnet® traps (Liberty Plus, American Biophysics Co., USA). The traps were set at 1.5 m above ground and operated from 1 h before sunset until 1 h after sunrise. Captured midges were deposited in a plastic bag and transported under refrigeration to the laboratory for further analysis. The capture lasted from February to November 2013. The four capture sites were visited once in a month. Identification of specimens Previous separation of other captured insects, Culicoides (Culicoides, Diptera: Ceratopogonidae) were identified with the aid of a binocular stereoscopic microscope (Carl Zeiss) according to the characteristics observed in the wings as reported by Rawlings (1996) and Borror et al. (1989). The identification is based on the characteristic pattern of dark and light areas of the wings, the dorsal side of the thorax, size and shape of the segment of the antennas, the relative position of the eyes, the shape of the spermathecal in females and the shape of the genitals in males (Meiswinkel et al., 2004; Werner and Kampen, 2007). The data of the specimens were recorded with the program of Microsoft Excel version 2007 and the samples of some specimens by a digital photography. After the identification, the specimens were separated according to sex and depending on the quantity, a sample 3 to 5 male and female midges were preserved in 70% ethanol while the remaining specimens were kept frozen at -80°C until use in RT-PCR. Molecular detection of orbivirus (BTV and EHDV) Pools of 7 to 15 female specimens were analyzed separately to determine the presence of genetic sequences of BTV and EHDV by RT-PCR. Total RNA from each batch was obtained using the commercial kit "FastRNA® Soil Pro - Direct Kit" and the Fast Prep-24 (www.mpbio.com), following the manufacturer's recommendations. RNA was recovered in 30 µl of DEPC-treated water and stored at -70°C until use. The quantity and quality of total RNA harvested was analyzed by spectrophotometry at 260 nm using the EpochTM device and Gen5TM microplate data analysis software (www.biotek.com). For the RT-PCR analysis, total RNA concentration was adjusted to 1 µg/µl with DEPC-treated water. The RT-PCR reactions were performed with the help of the commercial kits "SuperScript III One Step RT-PCR System with
*Corresponding author. E-mail: [email protected]. Tel: +52(81)83294000 ext. 3616. Author(s) agree that this article remains permanently open access under the terms of the Creative Commons Attribution License 4.0 International License
Figure 1. Relative position of the capture sites of the Culicoides spp in the regions at the Northeast of Mexico. 1,General Bravo; 2, Zaragoza, 3, Villaldama; 4, Linares.
Platinum ® Taq High Fidelity" and "AccuPrimeTMSuperMix I" (www.invitrogen.com), following the manufacturer's recommendations. For the amplification of the gene segments from each virus, specific oligonucleotides were used as previously reported for BTV (Leblanc et al., 2010) and EHDV (Aradaib et al., 2003). In both cases, the oligonucleotides were designed based on highly conserved regions within the NS3 / NS3A of the segment 10 of BTV (BTV serotype 9) and of the NS1 gene segment 6 of the EHDV (EHDV serotype 1), respectively. The names and sequences of the oligonucleotides for the amplification of genomic fragment of BTV are: BTV-20F 5´-ATGCTATCCGGGCTGATYC-3’, BTV-285R 5´-ACRTCATCACGAAACGCTTC-3´. Both oligonucleotides amplify a fragment of 266 bp (Leblanc et al., 2010). The genetic sequence of EHDV was amplified in two steps, first by RT-PCR with the following oligonucleotides: 5'-TCGAAGAGGTGATGAATCGC-3' and 5'-TCATCTACTGCATCTGGCTG-3’ and subsequently with nested PCR with the following oligonucleotides: 5'-CATGCGGCATATAGATTGGC-3' and 5'-GTCATCTAGCACGATGCGTG-3'. These latter oligonucleotides amplify a specific fragment of EHDV of 225 bp (Aradaib et al., 2003). The amplification of gene segments from both viruses was performed in a first instance with gradient RT-PCR to determine the optimum bonding temperature of the primers. All the PCR reactions were performed in a thermocycler (Maxygen, Union City, Calif. USA) to a final volume of 50 µl per tube. The reaction of the RT-PCR step was one initial denaturation at 95°C for 1 min followed by 30 min at 48°C (cDNA synthesis) and 95°C for 1 min. The thermal cycles of PCR amplification were: 1 min at 95°C followed by 40 cycles of 95°C for 30 s (denaturation of DNA), 50°C for 30 s (oligonucleotide binding) and 72°C for 40 s (DNA extension) and a final incubation at 72°C for 10 min. 5 µl of the amplification product
were analyzed by electrophoresis in 2.5% agarose gels stained with commercial dye GelRedTM according to the standard protocol. The size of the amplified product was compared against a molecular weight marker of 1 Kb (AxygenTM). The pools were considered positive if the band size for each respective genetic sequence of the virus was observed. The image obtained of the gel was documented electronically with the help of the equipment and the program of MultiDoc-It Imaging System (www.uvp.com). In each run, negative and positive controls of the reaction were included. The positive control reaction of RT-PCR for detection of BTV was the RNA obtained from a commercial vaccine against the virus containing serotype 10 (Colorado Serum Company, Denver, USA.); for EHDV it was not possible to include a positive control. Negative controls consisted of sterile double distilled water free of RNase and DNase, containing the reaction mix except nucleic acid. Statistical analysis The association between the presence of Culicoides spp. with the micro-region, altitude above the sea level and the monthly average of local temperature was analyzed by Chi-square using the WinEpi program, considering p <0.05 as significant. The data were processed in the program Working in Epidemiology (Blas 2006, http: //www.winepi.net/), with a confidence level of 95%.
RESULTS The results of the study are shown in the Table 1,
Table 1. Relationship between the molecular detection of Bluetongue Virus (BTV) and Epizootic Hemorrhagic Disease Virus (EHDV) in pools of Culicoides spp. and the capture site in northeastern regions of Mexico.
Town Geographical Position(1)
Altitude(2)
Season of the Year3
Spring [272](4)
Summer [274] Autumn [22]
BTV EHDV BTV EHDV BTV EHDV
General Bravo[368](4) 25°49´2.24´´N, 99°15´31.47´´O. 137 5/11(5) 3/11 7/15 3/15 0/2 0/2
Linares[101] 24°51´13.69´´N, 99°32´40.76´´O. 345 2/8 0/8 1/3 0/3 0/2 0/2
Villaldama[94] 26°29´04.06´´N, 100°26´10.32´´O. 434 2/5 1/5 1/3 2/3 0/1 0/1
Zaragoza[1] 23°57´10.24´´N, 99°46´12.24´´O. 1454 0/0 0/0 0/1 0/1 0/0 0/0
Total . 9/24 4/24 9/22 5/22 0/5 0/5 (1)Capture site. (2)Altitude above the sea level. (3)Spring = March-May, Summer June-August, Autumn= September-November. (4)[ ] Analyzed female midges captured by season or town. (5)Lots + / N ° total of batch analyzed.
Figure 2. Agarose gel electrophoresis of the amplification product of 266 bp (arrow) fragment of the gene NS3/NS3A of BTV in Culicoides pools. Lanes: 1, Positive Control (commercial vaccine); 2-4, representative samples of the sites in General Bravo (2), Villaldama (3) and Linares (4); 5, negative control (distilled water); M, molecular weight marker.
according to the geographical position (town) and season of year. A total of 564 female midges distributed on 51 pools were analyzed by RT-PCR. From the total of pools, 18 and 9 were positive for BTV and EHDV, respectively. When the season is taken into account, spring and summer showed the highest occurrence of both Orbiviruses, with a frequency of 9/24 in spring and 9/22 in summer for BTV and 4/24 in spring and 5/22 in summer for EHDV. In the autumn months (September to November) it was not possible to detect positive pools. By geographical position (Figure 2) the town of Bravo showed the highest occurrence of positive pools with a frequency of 12/28 for BTV and 6/28 for EHDV. Through the study, the capture site located in the town of Zaragoza (Figure 1), with an altitude above sea level of 1454 m, is the only one place where practically no midges were captured. In this site it was possible to catch
a single specimen in summer. However, and taking into account this specimen, in virtually all analyzed micro-regions (Figure 1), at least one midge was captured. With these data, it appears that the amount of captured midges was dependent on the micro-region and season of year (p<0.1) (Table 1). Though, in the study the quantity of harvested midges could have been influenced by the device type (Mosquito Magnet®) used to trap the Culicoides midges as well as by their monthly use at each site, the usage frequency (from sunset to sunrise, ~12 h) and local wind (climate) conditions at time of trapping. In our study, the primary objective was the detection of genetic sequences Orbiviruses BTV and EHDV in Culicoides circulating in northeastern Mexico. So biting midges trapped were identified only at basic phenotypic level to determine if they belong to the genus Culicoides. In addition, the basic phenotypic identification
Figure 3. Agarose gel electrophoresis (stained with Gel RedTM ) of RT-PCR and Nested PCR for the detection of EHDV, in which a specific PCR product of ~ 225 bp (arrow) of the NS1 gene segment 6 of the EHDV is shown. M, molecular weight marker; lanes: 1, negative control (double distilled water); 2-6, representative samples of pools of midges collected from different parts of the Northeastern regions of Mexico.
of all midges captured showed that all specimens corresponded to the Culicoides variipennis complex (Coquillett) (Wirth, 1957; Borror et al., 1989), (Rawlings, 1996). Midges of C. variipennis complex comprise the species C. variipennis, C. sonorensis and C. occidentalis (Schmidtmann et al., 2011; Tabachnick, 1996). In the present study, no further analyses were performed in Culicoides midges to determine the species. For molecular detection of BTV on midges, preliminary gradient-PCR experiments were conducted using a BTV vaccine strain serotype 10 (data not shown). On the other hand, unfortunately we were unable to include a positive control in our experiments to detect EHDV, so the findings are based on the band size as previously described (Aradaib et al., 2003). Examples representing the PCR amplification products of 266 bp for BTV and 225 bp for EHDV from each studied region are shown in Figures 1 and 2, respectively. Amplicones were of the same molecular weights as those expected from amplification of BTV (LeBlanc et al., 2010) and EHDV (Aradaib et al., 2003) viral nucleic acids. PCR assays performed separately for both viruses in each of the 51 pools of Culicoides midges generally resulted in bands of the expected size of variable intensity (Figures 2 and 3). DISCUSSION The detection of the BTV and EHDV and its biological vector Culicoides spp. in certain areas of livestock production is important for the design of management programs and for the health of domestic and wild animals susceptible to these viruses (Hoffmann et al., 2009),
(Charron, et al., 2013), (Coetzee et al., 2012; Savini et al., 2011). In endemic areas both viruses can potentially be transmitted by the same vector (Mellor et al., 2000), (Cêtre-Sossah et al., 2014). The presence of Culicoides midges has been reported in Mexico since 1948 (Macfie, 1948). Apparently, these types of biting midges are widely dispersed in USA and Latin America (Mullens and Dada, 1992), (Holbrook et al., 2000), (Lager, 2004). It has been reported that C. varipennis var. sonorensis midges are competent to transmit the virus of the Orbivirus genuses (Family Reoviridae), including BTV and EHDV (Ruder et al., 2012), (Tabachnick, 1996), as well as and other infectious agents (Drolet et al., 2005). In the US, C. variipennis var. sonorensis midges have been reported as the primary vector of EHDV and BTV (Foster et al., 1977; Tabachnick, 1996; Tabachnick, 2004). Apparently, very little information is available about the main vector (s) involved in the transmission of BTV and EHDV outside US in the American continent (Lager, 2004). Although several studies have implicated Culicoides variipennis var. insignis as the predominant vector in South America, and it has been captured in Central America and the Caribbean (Lager, 2004), (Mo et al., 1994), (Ronderos et al., 2003), there are no recently reports of its presence in Mexico. The detection and monitoring of these midges are important for the control of the pathogens that they can potentially transmit (Maclachlan and Mayo, 2013). In the northeastern region of Mexico, serological evidence has been reported in wild and domestic ruminants for both BTV and EHDV (Suzan et al., 1983), (Teclaw et al., 1985), (Martinez et al., 1999). On the other side, BTV has been isolated from cattle and sheep in this and other regions of Mexico (Stott et al.,
1989). However, to date the detection of genetic sequences of BTV and or EHDV from Culicoides biting midges circulating in the northeastern of Mexico has not been reported. In this work, genetic sequences of both viruses were detected in pools containing only Culicoides, obtained in spring and summer of certain sites (Figure 1) (Table 1). The BTV genomic sequence was found in relatively high proportions in all sites of capture (Figure 2) (Table 1). The putative genomic sequence of EHDV (Figure 3) was found in pools of Culicoides captured in only two of the four sites analyzed (Figure 1) (Table 1). These observations are consistent with the high seropositivity against both viruses, recorded in ruminants from this geographical area of Mexico. Taking together, the data presented in this study strongly suggests that Culicoides spp do contain genetic sequences of the Bluetongue virus and the Epizootic Hemorrhagic Disease Virus in the northeastern regions of Mexico. The circulation of this potential vector is variable and depends on the season of the year and the conditions of the micro-regions under study. These observations are consistent with other studies in other parts of the world (Kedmi et al., 2011). The detection of genetic sequences of BTV and EHDV implies that it is very likely that both viruses are circulating in this area of Mexico. This result is in accordance with the high seropositivity recorded in previous serological studies in this region (Suzan et al., 1983; Teclaw et al., 1985; Martinez et al., 1999). These observations suggest that eventually the population of domestic and wild ruminants could be affected with the infection of one or both viruses (Sailleau et al., 2012; Toye et al., 2013). Under this context, clinical alterations and the concerned pathologies caused by the infection of these Orbivirus may be going undetected or misdiagnosed in populations of wild and domestic ruminants, which make it difficult to control (Maclachlan and Mayo, 2013). The possible presence of both viruses in the areas and populations studied may result in disease outbreaks, which could compromise the health and management of the livestock in the production system. According to the above mentioned, further studies are needed to determine the potential impact of both viruses in the health of susceptible animals in the northeast of Mexico. Conflict of interests The author(s) did not declare any conflict of interest. REFERENCES Aradaib IE, Smith WL, Osburn BI, Cullor JS (2003). A multiplex PCR for
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