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FACULTAD DE MEDICINA
EFECTO DEL PÉPTIDO TAT(49-57) SOBRE LA
BIODISTRIBUCIÓN Y DOSIMETRÍA DE
RADIOFÁRMACOS ANÁLOGOS DE LA
BOMBESINA
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
DOCTOR EN CIENCIAS CON ESPECIALIDAD EN FÍSICA MÉDICA
P R E S E N T A
CLARA LETICIA SANTOS CUEVAS
TOLUCA, MÉXICO JUNIO 2011
Directoras de Tesis: Dra. Guillermina Ferro Flores Dra. Eva Leticia Rojas Calderón
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO
INSTITUTO NACIONAL DE
INVESTIGACIONES NUCLEARES
ININ
AGRADECIMIENTOS y RECONOCIMIENTOS
El presente trabajo se realizó en el Departamento de Materiales Radiactivos del
Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares, bajo la dirección y tutoría de la Dra.
Guillermina Ferro Flores, con el apoyo financiero de CONACyT (Proyecto: CONACYT-
SALUD-69051-Mexico) y de la Agencia Internacional de Energía Atómica (Contrato
No. 14539/RO).
A la Dra. Guillermina Ferro Flores del Departamento de Materiales Radiactivos del
Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares por todo su apoyo en la realización de
este proyecto.
A la co-dirección de la Dra. Eva Leticia Rojas Calderón de la Gerencia de Ciencias
Ambientales del Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares por las asesorías en
el tema de la simulación por el método Monte Carlo
Al comité doctoral, Dras. Consuelo Arteaga de Murphy y Martha Pedraza López, del
Departamento de Radiofarmacia del Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición
Salvador Zubirán por las facilidades prestadas para la realización de este trabajo.
A la Dra. Rocío García Becerra y al Lic. David Ordaz Rosado del Departamento de
Biología de la Reproducción del Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición
Salvador Zubirán por su ayuda y aportaciones en el área biológica.
A la Dra. Flor de M. Ramírez de la Cruz del Departamento de Química del Instituto
Nacional de Investigaciones Nucleares por su colaboración en el diseño de los
radiofármacos desarrollados en esta tesis.
A los miembros del jurado Drs. Guillermina Ferro Flores, Consuelo Arteaga de Murphy,
Rocío García Becerra, Jeanette Rodríguez Cortés, Fernando Ureña Núñez, Eugenio
Torres García y Miguel Angel Camacho López por sus valiosas aportaciones
Al Posgrado en Ciencias con Especialidad en Física Médica de la Facultad de
Medicina de la Universidad Autónoma del Estado de México.
ÍNDICE Resumen i
Abstract iii
CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS 1
1.1. Introducción 2
1.2. Objetivo General 4
1.3. Objetivos Específicos 5
1.4. Referencias 6
CAPÍTULO 2: MARCO TEÓRICO 9
2.1. Péptidos específicos para imagen de cáncer in vivo 10
2.1.1. Análogos de la somatostatina 11
2.1.2. Análogos del péptido liberador de la gastrina 12
2.1.3. Péptidos ligantes de colecistoquinina (CCK) y receptores de gastrina
21
2.1.4. Péptidos ligantes de la integrina αvβ3: Marcadores de angiogénesis tumoral
21
2.1.5. Péptidos ligantes para receptores de neurotensina 22
2.1.6. Péptidos de internalización Tat 23
2.2. Sistemas multifuncionales con péptidos para la imagen óptica
24
2.2.1. Fluorocromos de infrarrojo cercano 24
2.2.2. Quantum Dots
26
2.2.3. Nanopartículas de oro
28
2.3. Sistemas multifuncionales con nanopartículas de óxido de hierro conjugadas a péptidos para imagen por resonancia magnética
29
2.4. Péptidos para imagen molecular con técnicas multimodales 31
2.5. Radioterapia de blancos moleculares
32
2.5.1. Proceso Auger 36
2.5.2. Efecto Auger en la terapia de blancos moleculares 38
2.5.3. Rango de las partículas y proximidad al ADN 40
2.5.4. Muerte celular inducida por radiación 43
2.5.5. El papel de la apoptosis en la radioterapia dirigida 45
2.5.6. La necrosis en la radioterapia dirigida 46
2.5.7. La catástrofe mitótica inducida por radiación 46
2.5.8. Cuantificación del efecto Auger 47
2.6. Metodología de cálculo de dosis absorbida de radiación 48
2.6.1. Sistema MIRD para cálculo de dosis interna 50
2.6.2. Modelos radiofarmacocinéticos 51
2.6.2.1.
Modelos Empíricos 51
2.6.2.2.
Modelos Analíticos 52
2.6.2.3.
Modelos Compartimentales 53
2.7 Dosimetría celular 54
2.7.1. Esquema MIRD celular 55
2.8. Simulación Monte Carlo 56
2.8.1. Códigos de simulación del transporte de radiación 57
2.8.2. Código de simulación Monte Carlo PENELOPE 58
2.8.2.1. Geometría del sistema 60
2.8.2.2. Definición de materiales 61
8.2.2.3. Descripción del programa principal 61
2.9. Microdosimetría 64
2.11 Referencias 66
CAPÍTULO 3: MARCO METODOLÓGICO 78
3.1. Obtención de los radioconjugados [99mTc]EDDA/HYNIC-Lys3-BN (99mTc-BN), [99mTc]N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN (99mTc-Tat-BN) y [188Re]N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN (188Re-Tat-BN)
79
3.1.1. Síntesis de HYNIC-Lys3-BN 79
3.1.2. Síntesis de N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN 79
3.1.3. Modelado Molecular 80
3.1.4 Procedimiento de radiomarcado de HYNIC-Lys3-BN con 99mTc
80
3.1.5. Procedimiento de radiomarcado de N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN con 99mTc.
81
3.1.6. Procedimiento de radiomarcado de N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN con 188Re
81
3.1.7. Evaluación de la pureza radioquímica de 99mTc-Tat-BN y 188Re-Tat-BN
82
3.1.8. Estabilidad en suero humano 84
3.1.9 Desafío a la cisteina 84
3.2. Pruebas in vitro 84
3.2.1. Líneas celulares 84
3.2.2. Prueba de internalización y unión no específica 85
3.2.3. Internalización nuclear de 99mTc-Tat-BN 85
3.2.4. Modelo Biocinético 86
3.2.5. Análisis estadístico 87
3.2.6. Localización in vitro de Tat-BN internalizado en células de cáncer por inmunocitoquímica
87
3.2.7. Efecto del 99mTc-Tat-BN sobre la proliferación celular
88
3.3. Pruebas in vivo 89
3.3.1. Estudios de biodistribución 89
3.3.2. Inducción de tumores en ratones atímicos 89
3.3.3. Imágenes 90
3.4. Dosimetría subcelular 90
3.5. Referencias 94
CAPÍTULO 4: RESULTADOS 99mTc-N2S2-Tat(49-57)-BN 95
4.1. Diseño y preparación 96
4.1.1. HYNIC-Lys3-BN
96
4.1.2. N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN
97
4.2. Modelaje Molecular: Diseño de (Acm)2-S2N2-Tat-Lys3-BN, Tc(O)S2N2-Tat-Lys3-BN por cálulos semiempíricos
98
4.3. Evaluación de la pureza radioquímica de 99mTc-N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN (99mTc-Tat-BN)
101
4.4. Estabilidad en suero de 99mTc-Tat-BN 102
4.5 Desafío a la cisteina 102
4.6. Pruebas in vitro
103
4.6.1. Captación in vitro de 99mTc-Tat-BN
103
4.6.2. Internalización celular de 99mTc-Tat-BN
104
4.6.3. Biodistribución subcelular de 99mTc-Tat-BN
106
4.6.4. Modelos biocinéticos subcelulares de 99mTc-Tat-BN
108
4.6.5. Localización in vitro del Tat-BN internalizado en las células de cáncer por inmunocitoquímica
110
4.6.6. Efecto del 99mTc-Tat-BN sobre la proliferación celular
114
4.7. Pruebas in vivo
116
4.7.1. Estudios de Biodistribución in vivo de 99mTc-Tat-BN
116
4.7.2. Imágenes de ratónes atímicos con tumores inducidos PC3
117
4.8. Dosis absorbida celular de 99mTc-Tat-BN
119
4.8.1. Dosis absorbida de 99mTc-Tat-BN en células PC3
120
4.8.2. Dosis absorbida de 99mTc-Tat-BN en células MCF7
121
4.8.3. Dosis absorbida de 99mTc-Tat-BN en células MDA-MB231
123
4.8.4. Resumen de dosis absorbida de 99mTc-Tat-BN en células de cáncer
124
4.9. Discusión y conclusiones 126
4.10. Referencias 133
CAPÍTULO 5. RESULTADOS 188Re-N2S2-Tat(49-57)-BN 136
5.1. Diseño y preparación
137
5.2. Modelaje Molecular: Diseño de Re(O) 2S2N2-Tat-Lys3-BN por cálculos semiempíricos
138
5.3. Evaluación de la pureza radioquímica de 188Re-N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN (188Re-Tat-BN)
140
5.4. Estabilidad en suero humano de 188Re-Tat-BN 143
5.5 Desafío a la cisteina 144
5.6. Pruebas in vitro 144
5.6.1. Captación in vitro de 188Re-Tat-BN 144
5.6.2. Internalización celular de 188Re-Tat-BN 145
5.6.3. Biodistribución subcelular de 188Re-Tat-BN 147
5.6.4. Modelos biocinéticos subcelulares de 188Re-Tat-BN 149
5.7. Pruebas in vivo 151
5.7.1. Estudios de Biodistribución in vivo de 188Re-Tat-BN 151
5.8. Dosis absorbida celular de 188Re-Tat-BN 153
5.8.1. Dosis absorbida de 188Re-Tat-BN en células PC3 154
5.8.2. Dosis absorbida de 188Re-Tat-BN en células MCF7 156
5.8.3. Dosis absorbida de 188Re-Tat-BN en células MDA-MB231
157
5.8.4. Resumen de dosis absorbida de 188Re-Tat-BN en células de cáncer
158
5.9. Discusión y conclusiones 160
5.10. Referencias 166
CAPÍTULO 6. CONCLUSIONES GENERALES Y TRABAJO A FUTURO
169
6.1 Conclusiones generales 170
6.2 Relevancia y trabajo a futuro 173
ANEXOS 175
1. Santos-Cuevas CL , Ferro-Flores G, Arteaga de Murphy C, Ramírez Fde M, Luna-Gutiérrez MA, Pedraza-López M, García-Becerra R, Ordaz-Rosado D. Design, preparation, in vitro and in vivo evaluation of 99mTc-N2S2-Tat(49-57)-bombesin: a target-specific hybrid radiopharmaceutical. Int J Pharm. 2009 Jun 22;375(1-2):75-83. 2. Ferro-Flores G, Ramírez Fde M, Meléndez-Alafort L, Santos-Cuevas CL. Peptides for in vivo target-specific cancer imaging. Mini Rev Med Chem. 2010 Jan;10(1):87-97. 3. Santos-Cuevas CL , Ferro-Flores G, Rojas-Calderón EL, García-Becerra R, Ordaz-Rosado D, Arteaga de Murphy C, Pedraza-López M. 99mTc-N2S2-Tat(49-57)-bombesin internalized in nuclei of prostate and breast cancer cells: kinetics, dosimetry and effect on cellular proliferation. Nucl Med Commun. 2011 Apr;32(4):303-13. 4. Registro de patente: Clara Leticia Santos-Cuevas , Guillermina Ferro-Flores, Flor de María Ramírez de la Cruz 99mTc-Tat-Bombesina como un nuevo radiofármaco para la detección temprana de cáncer de mama. MX/a/2010/003829 Registrada.
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Ilustración esquemática de las múltiples modalidades para la detección específica por imagen de cáncer de mama in vivo con péptidos conjugados a quantum dots, nanopartículas metálicas, fluorocromos de infrarrojo cercano o radionúclidos.
11
Figura 2 Estructura calculada por MM3 del complejo Tc-(EDDA)-HYNIC-BN (E= 105 Kcal/mol).
19
Figura 3 Estructura química de los quelantes más comunes utilizados para acoplar análogos de la BN a varios radionúclidos.
20
Figura 4 Representación esquemática de la longitud de trayectoria de la radiación α, β y Auger, en un medio celular y subcelular (escala arbitraria). El mayor depósito de energía de un electrón Auger ocurre muy cerca de unos pocos nm, mientras que la de la radiación α y β, ocurre en trayectorias de 40-80 µm y 0.1-10 mm respectivamente.
33
Figura 5 Transiciones radiativas y no radiativas en procesos orbitales internos atómicos. No existen transiciones CK en los orbitales K.
36
Figura 6 Representación esquemática de la relación entre la distancia del sitio de decaimiento y la energía depositada en el ADN. Se puede observar que si se mueve el sitio de irradiación del núcleo a la superficie celular, la energía depositada al ADN se reduce significativamente.
42
Figura 7 Catástrofe mitótica producida por irradiación. Las células control normalmente contienen un único núcleo redondo (izquierda). Célula irradiada con múltiples núcleos (punta de flecha) y micronúcleo (flecha) (derecha).
47
Figura 8 Estructura de la molécula HYNIC-Lys3-BN. 96
Figura 9 Estructura de la molécula N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN.
97
Figura 10 (A) Confórmero más estable de la molécula del péptido híbrido N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN modelada utilizando CONFLEX. (B) Confórmero más estable de la molécula del péptido híbrido Tc(O)N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN modelada utilizando CONFLEX. Se muestra la geometría expandida del sitio de quelación del Tc(O): [Tc(O)N2S2].
100
Figura 11 (A) HPLC de exclusión molecular, se representa el cromatrograma-UV 3D del péptido Tat-BN. (B) Radiocromatograma de 99mTc-Tat-BN 2 h posteriores al radiomarcado.
101
Figura 12 Radiocromatogramas HPLC en fase reversa de 99mTc-Tat-BN recién marcado y 24 horas posteriores a la preparación (a temperatura ambiente).
102
Figura 13 HPLC de exclusión molecular. La línea sólida representa el cromatograma UV (280 nm) de las proteínas del suero humano y la línea punteada corresponde al radiocromatograma de 99mTc-N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN después de incubarlo en suero humano a 37°C durante 2 h.
103
Figura 14 Internalización dependiente del tiempo de 99mTc-Tat-BN y 99mTc-BN en células de cáncer PC3 (A), MCF7 (B) y MDA-MB231 (C).
105
Figura 15 Biocinética del 99mTc-Tat-BN en membrana, citoplasma y núcleo en células de cáncer PC3 (A), MCF7 (B) y MDA-MB231 (C).
107
Figura 16 Análisis inmunohistoquímico del Tat-BN en células PC3. A) Imagen control sin Tat-BN incubadas con anti-Tat y anticuerpo secundario marcado con fluorescencia B) Células incubadas con Tat-Bn, anti-Tat y anticuerpo secundario marcado con fluorescencia. CF: imagen contraste de fase, E: excitación a λ=488 nm. El péptido Tat-BN se localizó en el núcleo de las células, como indican las flechas.
111
Figura 17 Análisis inmunohistoquímico del Tat-BN en células MCF7. A) Imagen control sin Tat-BN incubadas con anti-Tat y anticuerpo secundario marcado con fluorescencia B) Células incubadas con Tat-Bn, anti-Tat y anticuerpo secundario marcado con fluorescencia. CF: imagen contraste de fase, E: excitación a λ=488 nm. El péptido Tat-BN se localizó en el núcleo de las células, como indican las flechas.
112
Figura 18 Análisis inmunohistoquímico del Tat-BN en células MDA-MB231. A) Imagen control sin Tat-BN incubadas con anti-Tat y anticuerpo secundario marcado con fluorescencia B) Células incubadas con Tat-Bn, anti-Tat y anticuerpo secundario marcado con fluorescencia. CF: imagen contraste de fase, E: excitación a λ=488 nm. El péptido Tat-BN se localizó en el núcleo de las células, como indican las flechas.
113
Figura 19 Efecto del Tat-BN y 99mTc-Tat-BN sobre la proliferación celular: la proliferación se correlaciona directamente con la concentración de ADN (ng/mL).
115
Figura 20 Captación de (A) 99mTc-Tat-BN y (B) en tumores inducidos de la línea celular de cáncer de próstata humano PC3 en ratones atímicos 2 h posteriores a la administración de los radiofármacos.
118
Figura 21 Estructura de la molécula N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN.
137
Figura 22 (A) Confórmero más estable de la molécula del péptido híbrido N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN modelada utilizando CONFLEX. (B) Confórmero más estable de la molécula del péptido híbrido Re(O)N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN modelada utilizando CONFLEX. Se muestra la geometría expandida del sitio de quelación del Re(O): [Re(O)N2S2].
139
Figura 23 Influencia de la concentración del péptido sobre la pureza radioquímica de marcado del Tat-BN (pH=3, [tartrato] = 106 mg/mL, [ácido ascórbico] = 4.35 mg/mL, 18°C).
141
Figura 24 Influencia de la concentración de ácido ascórbico sobre la pureza radioquímica de marcado del Tat-BN (pH=3, [tartrato] = 106 mg/mL, 18°C).
141
Figura 25 (A) HPLC de exclusion molecular, se representa el cromatrograma-UV 3D del péptido Tat-BN. (B) Radiocromatograma de 188Re-Tat-BN 2 h posteriores al radiomarcado.
142
Figura 26 HPLC de exclusión molecular. La línea sólida representa el cromatograma UV (280 nm) de las proteínas del suero humano y la línea punteada corresponde al radiocromatograma de 188Re-Tat-BN después de incubarlo en suero humano a 37°C durante 2 h.
143
Figura 27 Internalización dependiente del tiempo de 188Re-Tat-BN en células de cáncer PC3 (A), MCF7 (B) y MDA-MB231 (C).
146
Figura 28 Biocinética del 188Re-Tat-BN en membrana, citoplasma y núcleo en células de cáncer PC3 (A), MCF7 (B) y MDA- MB231 (C).
148
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Incidencia y distribución de GRPr en carcinomas de mama primarios.
15
Tabla 2 Propiedades de la radiación emitida de algunos radionúclidos terapéuticos.
34
Tabla 3 Ejemplos de emisores de electrones Auger. 38
Tabla 4 Requisitos principales para radioterapia dirigida que utiliza emisores de electrones Auger.
39
Tabla 5 Características de las rutas de muerte celular. 44
Tabla 6 Diseño factorial experimental utilizado para el marcado de Tat-BN con 188Re.
82
Tabla 7 Gradiente de concentración de la fase móvil.
83
Tabla 8 Geometría y volumen de citoplasma y núcleo de las células PC3, MCF7 y MDA-MB231.
91
Tabla 9 Composición elemental de una célula humana, utilizada para generar el archivo de material de la simulación por el método Monte Carlo.
91
Tabla 10 Espectro de radiación promedio del 99mTc utilizado como fuente en la simulación por el método Monte Carlo.
92
Tabla 11 Espectro de radiación promedio del 188Re utilizado como fuente en la simulación por el método Monte Carlo.
93
Tabla 12 Distancias de enlace de los complejos calculados Tc(O)-N2S2-Tat-Lys3-BN utilizando los métodos semiempíricos MM3 aumentado y Conflex.
99
Tabla 13 Captación celular de 99mTc-Tat-BN y 99mTc-BN en diferentes líneas de cáncer (% del total de actividad ± Desviación estándar (DS)).
104
Tabla 14 Modelo biocinético y numero total de desintegraciones de 99mTc-Tat-BN en células de cáncer PC3.
108
Tabla 15 Modelo biocinético y numero total de desintegraciones de 99mTc-Tat-BN en células de cáncer MCF7.
109
Tabla 16 Modelo biocinético y numero total de desintegraciones de 99mTc-Tat-BN en células de cáncer MDA-MB231.
109
Tabla 17 Biodistribución del 99mTc-Tat-BN en ratones sanos BALB/c a diferentes tiempos post administración del radiofármaco (n=3 en cada tiempo).
116
Tabla 18 Biodistribución de 99mTc-BN y 99mTc-Tat-BN en ratones atímicos con tumores inducidos PC3, 2 h posteriores a la administración de los radiofármacos (n=3).
117
Tabla 19 Dosis absorbida de 99mTc-Tat-BN en células PC3. 120
Tabla 20 Dosis absorbida de electrones de CI y Auger del 99mTc en citoplasma y núcleo de células PC3 y porcentaje de contribución a la dosis total absorbida de radiación.
120
Tabla 21 Porcentaje de absorción y de subabsorción de las emisiones del espectro de 99mTc utilizado en la simulación por el método Monte Carlo en células PC3, cuando la fuente se localizó en el centro del núcleo.
121
Tabla 22 Dosis absorbida de 99mTc-Tat-BN en células MCF7.
121
Tabla 23 Dosis absorbida de electrones CI y Auger del 99mTc en citoplasma y núcleo de células MCF7 y porcentaje de contribución a la dosis total absorbida de radiación.
122
Tabla 24 Porcentaje de absorción y de subabsorción de las emisiones del espectro de 99mTc utilizado en la simulación por el método Monte Carlo en células MCF7, cuando la fuente se localizó en el centro del núcleo.
122
Tabla 25 Dosis absorbida de 99mTc-Tat-BN en células MDA-MB23.
123
Tabla 26 Dosis absorbida de electrones CI y Auger del 99mTc en citoplasma y núcleo de células MDA-MB231 y porcentaje de contribución a la dosis total absorbida de radiación.
123
Tabla 27 Porcentaje de absorción y de subabsorción de las emisiones del espectro de 99mTc utilizado en la simulación por el método Monte Carlo en células MDA-MB231, cuando la fuente se localizó en el centro del núcleo.
124
Tabla 28 Dosis absorbida (Gy/Bq) de 99mTc-Tat-BN en núcleo y citoplasma de células de cáncer.
124
Tabla 29 Promedio del porcentaje de contribución a la dosis absorbida en citoplasma y núcleo de las células PC3, MCF7 y MDA-MB231 de electrones CI y Auger de 99mTc.
125
Tabla 30 Promedio del porcentaje de absorción y subabsorción de energía de electrones CI y Auger de 99mTc en citoplasma y núcleo de las células PC3, MCF7 y MDA-MB231.
125
Tabla 31 Distancias de enlace del los complejos calculado Re(O)-N2S2-Tat-Lys3-BN utilizando los métodos semiempíricos MM3 aumentado y CONFLEX.
138
Tabla 32 Captación celular de 188Re-Tat-BN en las líneas celulares de cáncer PC3, MCF7 y MDA-MB231 (% del total de actividad ± DS).
145
Tabla 33 Modelo biocinético y número total de desintegraciones de 188Re-Tat-BN en células de cáncer PC3.
149
Tabla 34 Modelo biocinético y número total de desintegraciones de 188Re-Tat-BN en células de cáncer MCF7.
150
Tabla 35 Modelo biocinético y número total de desintegraciones de 188Re-Tat-BN en células de cáncer MDA-MB231.
150
Tabla 36 Biodistribución de 188Re-Tat-BN en ratones sanos BALB/c a diferentes tiempos post administración del radiofármaco (n=3 en cada tiempo).
152
Tabla 37 Dosis absorbida de 188Re-Tat-BN en células PC3. 154
Tabla 38 Dosis absorbida de radiación β, electrones de CI y Auger del 188Re en citoplasma y núcleo de células PC3 y porcentaje de contribución a la dosis total absorbida de radiación.
154
Tabla 39 Porcentaje de absorción y de subabsorción de las emisiones del espectro de 188Re utilizado en la simulación por el método Monte Carlo en células PC3, cuando la fuente se localizó en el centro del núcleo.
155
Tabla 40 Dosis absorbida de 188Re-Tat-BN en células MCF7.
155
Tabla 41 Dosis absorbida de radiación β, electrones de CI y Auger del 188Re en citoplasma y núcleo de células MCF7 y porcentaje de contribución a la dosis total absorbida de radiación.
156
Tabla 42 Porcentaje de absorción y de subabsorción de las emisiones del espectro de 188Re utilizado en la simulación por el método Monte Carlo en células MCF7, cuando la fuente se localizó en el centro del núcleo.
156
Tabla 43 Dosis absorbida de 188Re-Tat-BN en células MDA-MB231.
157
Tabla 44 Dosis absorbida de radiación β, electrones de CI y Auger del 188Re en citoplasma y núcleo de células MDA-MB231 y porcentaje de contribución a la dosis total absorbida de radiación.
157
Tabla 45 Porcentaje de absorción y de subabsorción de las emisiones del espectro de 188Re utilizado en la simulación por el método Monte Carlo en células MDA-MB231, cuando la fuente se localizó en el centro del núcleo.
158
Tabla 46 Dosis absorbida (Gy/Bq) de 188Re-Tat-BN en núcleo y citoplasma de células de cáncer.
158
Tabla 47 Promedio del porcentaje de contribución a la dosis absorbida en citoplasma y núcleo de las células PC3, MCF7 y MDA-MB231 de radiación β, electrones CI y Auger de 188Re.
159
Tabla 48 Promedio del porcentaje de absorción y subabsorción de energía de radiación β, electrones CI y Auger de 188Re en citoplasma y núcleo de las células PC3, MCF7 y MDA-MB231.
159
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
1
Capítulo 1
Introducción y Objetivos
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
2
1. 1. Introducción Las técnicas de obtención de imágenes moleculares, directa o indirectamente,
monitorean y registran la distribución espacio-temporal de procesos
moleculares o celulares para aplicaciones bioquímicas, biológicas, diagnósticas
o terapéuticas. En el caso de la medicina nuclear, el blanco molecular debe
unirse a una sustancia radiomarcada (radiofármaco) de forma altamente
específica. Las moléculas bioactivas radiomarcadas que se unen a receptores
específicos pueden ser anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, péptidos,
análogos de DNA y oligonucleótidos antisentido (antisense), entre otros [1].
En los últimos años se ha demostrado la utilidad diagnóstica de los péptidos
radiomarcados para la detección específica de diversas neoplasias, para ello
se utilizan herramientas desarrolladas por la biología molecular pero con
métodos aplicables in vivo [2-4].
El grupo de neuropéptidos llamados bombesinas (BN) comprende un gran
número de péptidos originalmente aislados de la piel de batracios y estimulan
las contracciones del músculo liso y regulan la temperatura. Posteriormente se
encontró que además están ampliamente distribuidos en células neurales y
endócrinas humanas [5,6].
Las principales BNs de origen mamífero son dos: el péptido liberador de la
gastrina (GRP) y la neuromedina B (NMB). Los receptores del péptido liberador
de la gastrina (GRPr) se encuentran distribuidos en muchos órganos pero se
sobre-expresan en la membrana de las células malignas, especialmente las de
cáncer de mama y de próstata y en las células de cáncer metastásicas a
ganglios linfáticos axilares y pélvicos [7,8].
La BN se unen específicamente al GRPr y este enlace es el fundamento para
marcar la BN con radionúclidos emisores de radiación gamma o positrones (Ej. 99mTc, 111In, 18F) para la obtención in vivo de imágenes de los GRPr por
técnicas de medicina nuclear molecular [6-9]. Es importante mencionar que
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
3
después de la interacción receptor-ligante (GRPr-BN) en la membrana celular,
una parte del complejo es internalizado al citoplasma celular [10].
En el ámbito de la química de radiofármacos existe, el interés por desarrollar
análogos de la BN marcados con 188Re. El 188Re es un radionúclido emisor de
radiación gamma, útil en la obtención de imágenes gammagráficas, pero
también es emisor de radiación β. Una biomolécula dirigida a un receptor
específico de una célula de cáncer marcada con un radionúclido emisor de
partículas β, tiene el potencial para ser utilizada en la radioterapia de blancos
moleculares [11,12-14].
Idealmente un radiofármaco debería depurarse rápidamente de la sangre,
acumularse en el sitio blanco y la radiactividad no unida a los sitios receptores
eliminarse rápidamente por vía renal, tanto por razones dosimétricas como
para mejorar el contraste de la imagen. La excreción hepatobiliar produce dosis
absorbida de radiación innecesaria al paciente y aumenta la radiación de fondo
que interfiere con la calidad de las imágenes.
Los análogos de la BN marcados con 188Re y la mayoría de los derivados
radiomarcados con 111In y 99mTc hasta ahora reportados, presentan como vía
principal de eliminación la excreción hepatobiliar, lo que hasta cierto punto ha
limitado su aplicación en la práctica clínica [8,15-29, 12-14].
Evidentemente la diferencia en la lipofilia de los diferentes complejos está
fuertemente influenciada por el compuesto o compuestos químicos que se
utilicen en la esfera de coordinación del radiometal. Recientemente se reportó
la preparación y evaluación preclínica del conjugado [99mTc]EDDA/HYNIC-Lys3-
BN (99mTc-BN) como un radiofármaco con rápida depuración renal y específico
para detectar a partir de una imagen gammagráfica, la expresión y
sobreexpresión de proteínas GRPr [6]. El diagnóstico y tratamiento de
enfermedades por nuevos mecanismos que involucren el transporte eficiente
de fármacos a blancos moleculares específicos intracelulares es de grán
interés en el ámbito médico-farmacéutico.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
4
El dominio básico de la proteína Tat del VIH-1, es decir el Tat (49-57), es un
péptido que penetra o atraviesa fácilmente la membrana celular por lo que,
conjugado a diferentes fármacos, proteínas, péptidos y nanopartículas, actúa
como un “caballo de Troya” al incrementar de forma significativa la
internalización celular de los diferentes fármacos o biomoléculas [36-45]. Por lo
tanto, un nuevo conjugado del tipo [99mTc]N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN
(99mTc-Tat-BN) podría incrementar de manera significativa la internalización del
radiofármaco y con ello el contraste de las lesiones cancerosas en las
imágenes y mejoraría la sensibilidad y especificidad de los estudios
diagnósticos. Si se considera que la internalización se incrementará, las
emisiones de electrones Auger del 99mTc, podrían jugar un papel fundamental
en la energía depositada dentro de la célula (dosis de radiación absorbida) con
un posible efecto sinérgico en la terapia del cáncer si se activan por ejemplo
rutas apoptóticas. Por otro lado, si la biocinética y la especificidad de la Lys3-
BN unida al Tat(49-57) es favorable, un conjugado del tipo [188Re]N2S2-Tat(49-
57)-Lys3-BN (188Re-Tat-BN) podría ser potencialmente útil en radioterapia de
blancos moleculares.
1.2. Objetivo General
Preparar, caracterizar y comparar la cinética y dosimetría celular in vitro e
in vivo de los radiofármacos de 99mTc-BN y 99mTc-Tat-BN como agentes de
diagnóstico para la detección temprana y específica de cáncer de próstata y de
mama por técnicas de imagenología en medicina nuclear molecular. Asimismo
evaluar el potencial del radiofármaco 188Re-Tat-BN como un posible agente
para radioterapia de blancos moleculares.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
5
1.3. Objetivos específicos
1. Obtener los radiofármacos 99mTc-BN, 99mTc-Tat-BN y 188Re-Tat-BN con
purezas radioquímicas mayores al 90 %.
2. Evaluar la estabilidad en suero humano y la unión a proteínas séricas
mediante cromatografía líquida de alta eficiencia de los complejos 99mTc-BN, 99mTc-Tat-BN y 188Re-Tat-BN.
3. Evaluar la captación específica in vitro de 99mTc-BN, 99mTc-Tat-BN y 188Re-Tat-BN en células de cáncer de las líneas PC3 (próstata humano),
MCF7 (mama humano) y MDA-MB231 (mama humano).
4. Evaluar la cinética de internalización in vitro de 99mTc-BN, 99mTc-Tat-BN y 188Re-Tat-BN en células tumorales PC3, MCF7 y MDA-MB231.
5. Estimar y comparar la dosimetría de los radiofármacos 99mTc-BN
y 99mTc-Tat-BN por el método Monte Carlo empleando el código
PENELOPE 2008 en células tumorales PC3, MCF7 y MDA-MB231 a partir
de los datos cinéticos experimentales.
6. Estimar la dosimetría del radiofármaco 188Re-Tat-BN en células de cáncer
por el método Monte Carlo (código PENELOPE 2008) a fin de calcular por
simulación el potencial terapéutico de un conjugado de Lys3-BN
radiomarcado con un emisor β.
7. Evaluar la biodistribución en ratones sanos BALB/c de los complejos 99mTc-BN, 99mTc-Tat-BN y 188Re-Tat-BN.
8. Evaluar la biocinética de los complejos 99mTc-BN y 99mTc-Tat-BN en ratones
atímicos con tumores inducidos con células PC3.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
6
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Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
9
Capítulo 2
Marco Teórico
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
10
2.1. Péptidos específicos para imagen de cáncer in vivo
Los análogos de péptidos reguladores representan una clase de moléculas
desarrolladas para marcar específicamente células de cáncer. Estos péptidos
controlan y modulan la función de casi todos los órganos vitales y procesos
metabólicos, incluyendo neuropéptidos que están en el cerebro, péptidos de
hormonas intestinales, así como péptidos presentes en el sistema vascular
(péptidos vasoactivos) y sistema endócrino [1].
Los receptores de péptidos reguladores, son proteínas que se sobreexpresan
en numerosas células de cáncer humano. Estos receptores se han utilizado
cómo blancos moleculares para péptidos radiomarcados con el fin de localizar
tumores. Los resultados clínicos alcanzados durante la última década con
imágenes de tumores neuroendócrinos que sobreexpresan somatostatina han
sido útiles en el estudio de otros péptidos para detectar cáncer asociado con
receptores de péptidos, como el péptido liberador de la gastrina (GRPr),
colecistoquinina, ligantes de péptidos para receptores de integrina o
neurotensina. La mejora en los análogos de péptidos permite obtener imágenes
clínicas específicas y terapia para diferentes tipos de tumores, incluyendo,
mama, próstata, pulmón, intestino, páncreas y tumores cerebrales [2, 3, 4]. La
imagen molecular comprende el monitoreo no invasivo de procesos funcionales
y espaciotemporales a nivel molecular y celular en humanos y otros sistemas
vivos. Las técnicas de imagen, tales como la resonancia magnética (RMI), la
tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT), la tomografía
por emisión de positrones (PET), y la imagen por fluorescencia óptica (OI) se
han utilizado para monitorear dichos procesos (figura 1).
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
11
Figura 1. Ilustración esquemática de las múltiples modalidades para la
detección específica por imagen de cáncer de mama in vivo con péptidos
conjugados a quantum dots, nanopartículas metálicas, fluorocromos de
infrarrojo cercano o radionúclidos.
2.1.1. Análogos de la somatostatina
La somatostatina es un péptido cíclico compuesto de 14 aminoácidos y juega
un papel importante en la secreción de hormonas, como la del crecimiento,
insulina y glucagón. Los cinco subtipos de receptores que se han encontrado
reconocen a la somatostatina. El octreótido (OC) se desarrolló como un
análogo de la somatostatina para la supresión de hipersecreción y para
controlar los síntomas de enfermedades de origen neuroendócrino. El OC
contiene 8 aminoácidos que retienen un enlace interno entre el disulfuro que
restringe la geometría de los cuatro aminoácidos de reconocimiento biológico y
es estable contra la degradación enzimática in vivo. Los adenomas pituitarios y
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
12
varios tumores de origen neuroendócrino sobreexpresan receptores de
somatostatina como los carcinomas de páncreas, feocromocitomas, carcinoma
medular de tiroides, paragangliomas, gastrinoma, neuroblastoma, meningioma
y cáncer de pulmón de células pequeñas. En la imagenología de cáncer
basada en somatostatina, un análogo de la somatosatina se une a un agente
quelante bifuncional que puede enlazar a un elemento radiactivo como el 111In y 99mTc para SPECT o 18F y 68Ga para PET. Actualmente el Tyr3-OC (TOC) es
utilizado en la práctica clínica como un complejo estable para detección de
tumores neuroendócrinos por técnicas de medicina nuclear molecular [5-9]. El
radiofármaco 99mTc-Depreotido desarrollado como un análogo del OC en 1996
por Pearson y cols [10] ha sido aprobado recientemente para su uso en
humanos en EUA y Europa por sus buenos resultados en el diagnóstico de
ganglios pulmonares [11,12].
2.1.2. Análogos del péptido liberador de la gastrin a
El péptido bombesina (BN, 14 aminoácidos) pertenece a un grupo grande de
neuropéptidos con muchas funciones biológicas. El equivalente en el humano
es el péptido liberador de la gastrina (GRP, 27 aminoácidos) y los GRPr están
sobreexpresados en la membrana celular de varios tumores malignos. El GRP
difiere de la BN en sólo 10 residuos carboxi-terminales y esto explica la
actividad biológica similar de los dos péptidos. La unión específica que
presenta la BN a los GRPr es la base para marcar a la BN con radionúclidos
tales como el 68Ga, 64Cu, 18F y 99mTc para imagen nuclear [15-22]. El subtipo 2
del receptor de la BN está sobreexpresado en varios tumores humanos como el
de mama, próstata, y pulmón de células pequeñas y cáncer de páncreas [21-
23]. Aproximadamente 30 diferentes péptidos radiomarcados (agonistas o
antagonistas) se han desarrollado en los últimos años [1, 24, 25].
La función principal de las hormonas peptídicas GRP y BN es liberar a la
gastrina secretada a la sangre por el tracto gástrico. Otras funciones del GRP y
BN son: actuar sobre tejidos periféricos y sistema nervioso central, estimular la
liberación de hormonas gastrointestinales, aumentar las concentraciones de
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
13
gastrina plasmática, polipétido pancreático, glucagon, insulina, péptido gástrico-
inhibidor y mantener los ciclos circadianos [26-28].
La BN tiene la siguiente secuencia de 14 aminoácidos: pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-
Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-CONH2. Los últimos 7 de la porción del
carbono terminal representan la porción biológicamente activa [26].
Los 4 tipos de receptores de BN que se han identificado son: el GRPr,
frecuentemente expresado en tumores malignos, el receptor de la neuromedina
B (NMBr) y los receptores BB3 (BB3r) y el BB4 (BB4r), estos dos últimos con
afinidad mayor para la BN que para el GRP. El GRPr y el NMBr determinan la
acción de los péptidos semejantes a la BN en los mamíferos. Sin embargo,
solamente se había estudiado la farmacología del GRPr debido a la falta de un
ligante apropiado. Recientemente se ha informado que la BN marcada con 125I,
la 125I-[D Tyr6-beta-Ala11-Phe13-Nle14]-BN(6-14) se une con gran afinidad a
todos los receptores mencionados y es utilizada para estudios farmacológicos
[29].
El agonista GRP/BN es introducido al interior de la célula una vez que se ha
unido a sus receptores de membrana. Estos receptores son reciclados o
degradados mientras que el GRP/BN permanece en el espacio perinuclear. Por
lo tanto, la BN conjugada a la 2-pirrolino-doxorubicina, se ha reportado como
un agente citotóxico para quimioterapia dirigida que, inyectada a ratones
desnudos con tumores de próstata humana inducidos, produce resultados
satisfactorios en el tratamiento de este cáncer [30]. Asimismo, la BN
radiomarcada permanecerá en el tejido blanco por largos períodos dando como
resultado una acumulación de la radiactividad en tejidos ricos en GRPr
positivos (GRPr+), sin daño significativo a las células y tejidos circundantes.
De acuerdo con Reubi y cols se encontraron GRPr con alta densidad en:
1) Carcinomas prostáticos invasivos (30/30) y en casos de lesiones
proliferativas intraepiteliales prostáticas (26/26), mayormente en neoplasias
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
14
intraepiteliales prostáticas [31]. Metástasis óseas provenientes de cánceres
prostáticos andrógeno-independientes (4/7). Contrariamente, los GRPr,
ausentes en tejido prostático normal, fueron identificados en sólo algunas
próstatas hiperplásicas, y localizados en muy poca densidad en tejido glandular
y localmente en tejido estromal [31].
2) Células de mama epiteliales neoplásicas en dos tercios de los
carcinomas ductales invasivos y carcinomas ductales in situ [32].
Las metástasis de los ganglios linfáticos provenientes de carcinomas primarios
que expresaban el GRPr fueron todos positivos, mientras que el tejido
linforeticular adyacente fue negativo y sin embargo estos receptores estuvieron
presentes en ductos y lóbulos provenientes de muestras de tejido no
neoplásico, la hiperexpresión del GRPr en carcinomas mamarios, sugiere que
estos tumores pueden servir como blanco para análogos del GRP y BN [32].
La tabla 1 resume la incidencia y distribución de los GRPr en carcinomas de
mama primario en un estudio realizado por Gugger y Reubi [33].
Reubi y cols [34] analizaron los subtipos de los GRPr en 161 tumores
cancerosos humanos por medio de una BN marcada con 125I (125I-[D-Tyr6,beta-
Ala11,Phe13Nle14]BN(6-14)) que identifica los 4 subtipos de receptores.
Encontraron que 12/12 tumores de próstata, 41/57 tumores de mama y 5/5
gastrinomas expresaban predominantemente el GRPr; en cuanto a carcinoides:
11/24 intestinal, 1/26 bronquial y 1/1 carcinoide del timo presentaban NMBr;
9/26 carcinoides bronquiales y 4/9 tumores de cáncer pulmonar de células
pequeñas expresaban de preferencia, BB3r y de ellos 3/9 también expresaban
GRPr. Igualmente 6/16 carcinomas renales expresaban GRPr y 4 de ellos
también expresaban BB3r. Finalmente 2/10 sarcomas de Ewing expresaban
solamente BB3r. Con este primer estudio por medio de técnicas de unión
específica para detectar diferentes receptores expresados en tumores Reubi y
cols concluyen que estos tumores pueden ser diagnosticados y tratados con
análogos de la BN radiomarcados [34].
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
15
Tabla 1. Incidencia y distribución del GRPr en carcinomas de mama primarios
[33].
GRPr
Tipos Histopatológicos n Incidencia Distribución en el tejido
Carcinomas Invasivos
� IDC
� ILC
� Carcinoma Tubular
� Carcinoma Mucinoide
o Subtotal
46
4
1
1
52
29/46
1/4
1/1
1/1
32/52
Heterogéneo 16/29
Heterogéneo
Homogéneo
Heterogéneo
Heterogéneo 18/32
Carcinomas in situ
� DCIS
o Solo
o Concomitante con
IDC
� LCIS concomitante
con ILC
o Subtotal
4
13
2
19
2/4
9/13
1/2
12/19
Heterogéneo 2/2
Heterogéneo 6/9
Homogéneo
Heterogéneo 8/12
Total de neoplasias
estudiadas 71
44/71
(62%)
Heterogéneo 26/44
(59%)
El ligante convencional 125I-[Tyr4]BN muestra resultados similares que con la
BN no marcada, en cuanto a afinidad y al número de receptores a los que se
une. Al sustituir el 125I por radionúclidos emisores de radiaciones gamma y β
positivas y negativas (99mTc, 111In, 64Cu, 131I, 188Re, 177Lu, 149Pr, 153Sm) se
obtienen radiofármacos específicos análogos de BN utilizados en medicina
nuclear para el diagnóstico y/o terapia de tumores GRPr+ [13,15,17,19,20,34-
44].
El GRPr se encuentra involucrado en el crecimiento fetal de los pulmones [27] y
en el desarrollo de enfermedades pulmonares [45]. Las células de distintos
carcinomas de vías respiratorias producen y secretan GRP, además de
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
16
expresar receptores con alta afinidad para péptidos análogos de la BN [46].
Persinger y cols encontraron que el gen del GRPr se localiza en el cromosoma
X y que en las vías respiratorias humanas se expresa de manera abundante,
siendo ésta más predominante en personas fumadoras. Sus resultados
sugieren que el gen del GRPr está expresado más frecuentemente en mujeres
que en hombres y que la expresión de éste gen se activa más temprano en
mujeres como respuesta a la exposición al tabaco. La presencia de dos copias
que expresan el gen GRPr en mujeres puede ser un factor que incrementa su
susceptibilidad a la inducción de cáncer por tabaco [47].
Otro estudio hecho por Fleischman y cols demuestran que el tejido uterino
normal expresa al GRPr en el miometrio, glándulas secretoras endometriales y
vasos sanguíneos endometriales [48].
Halmos y cols demostraron que existe una relación directa y significativa (p <
0.005) entre los GRPr y los niveles de los receptores esteroideos [49,21].
Kahan y cols encontraron que una terapia con antagonistas de la BN, redujo el
tamaño de carcinomas mamarios inoculados en ratones atímicos [50].
Se han preparado diversos análogos de la BN radiomarcada para ser utilizados
como radiofármacos en medicina nuclear con la finalidad de detectar tumores
malignos y para estadificar cánceres mamarios y de próstata, así como para
identificar ganglios linfáticos afectados [3], como: 99mTc-diaminedithiol-[Lys3]BN (99mTc-DADT-[Lys3]BN) [51], 99mTc(I)-2-
picolylamine-N,N-diacetic acid-5-aminovaleric acid-BN (99mTc(I)-PADA-AVA-
BN), 99mTc-Cys-6-amino-n-hexanoic acid-BN [52,14,40], 99mTc(CO)3-pyrazolyl-
BN(7-14)NH2, [53], 99mTc-HYNIC-β-Ala-BN(7-14)NH2 y 99mTc-HYNIC-5-AVA-
BN(7-14)NH2, [41].
Muchos de los análogos de la BN marcados con 99mTc tienden a acumularse en
el hígado e intestino como resultado de su alta lipofilia y eliminación
hepatobiliar. La alta acumulación de radioactividad puede interferir durante la
detección de cánceres GRPr+ y sus metástasis en áreas abdominales [3].
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
17
El análogo de la BN, Demobesin-1 que contiene un quelante –N4- para su
unión estable con el 99mTc ha sido reportado como selectivo para el GRPr y
presenta eliminación mínima hepatobiliar [54].
Recientemente se han reportado nuevos agonistas de la BN como el 99mTc-
Demobesin-3, 4 y 5 y se demostró durante los estudios in vivo una captación e
internalización rápida a células tumorales PC3. La 99mTc-Demobesin-3 y 4 se
excretaron principalmente por vía renal [43].
Lin y cols reportaron otro análogo de la BN radiomarcado, [DTPA, Lys3(99mTc-
Pm-DADT), Tyr4]BN, que tiene poca eliminación hepatobiliar. Los estudios in
vivo con este radiofármaco mostraron gran afinidad a las células de cáncer
PC3. Los estudios de biodistribución en ratones normales mostraron muy baja
acumulación de radioactividad en el hígado e intestinos. Asimismo la captación
en el páncreas fue significativa ya que es un órgano que expresa GRPr [44].
El análogo de la BN radiomarcado, [111In-DTPA-Pro1, Tyr4]BN, demostró en
estudios preclínicos de medicina nuclear que se capta en tumores GRPr+.
Además de mostrar una gran afinidad y rápida internalización in vitro e in vivo
en células con GRPr [55].
El radiofármaco, RP527 marcado con 99mTc se ha estudiado en humanos y
mostró una captación específica en tumores de mama (4/6) y carcinomas de
próstata (1/4). En todos los casos se observó una alta eliminación hepatobiliar
[56-57].
El [188Re(NS3)(L-X-BBN(7-14))] mostró afinidad por el GRPr en el rango
nanomolar como se demostró por pruebas in vitro de unión competitiva al
utilizar células humanas de cáncer de próstata PC3. Las pruebas de
internalización y externalización in vitro indicaron que aproximadamente el 65%
del conjugado [99mTc(NS3)(L2-betaAla-BBN(7-14))] estaba unido en la
superficie o internalizado en las células PC3. Las pruebas de biodistribución de
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
18
[99mTc(NS3)(L-betaAla-BBN(7-14))] en ratones normales mostraron mínima
acumulación en páncreas normal (tejido que expresa al GRPr con alta
densidad en modelos murinos) y eliminación tanto hepatobiliar como renal [58].
Estudios con diferentes análogos de BN radiomarcada en más de 50 pacientes
con cáncer de mama, colorectal y de próstata, se pudo detectar invasión
tumoral en ganglios linfáticos pélvicos y captación en lecho prostático [38]. En
un estudio de 15 pacientes con lesiones mamográficas y a quienes se les
realizó biopsia y/o cirugía, el radiofármaco 99mTc-Leu13-BN diagnosticó
correctamente 12 de 15 cánceres de mama, mientras que 3 estudios
gammagráficos fueron negativos y correspondieron a 3 lesiones benignas.
Asimismo Scopirano y cols diagnosticaron 8 de 8 cánceres primarios de
próstata y detectaron correctamente invasión tumoral en ganglios linfáticos
pélvicos en 3 pacientes no detectados por tomografía computarizada y
resonancia magnética con el radiofármaco análogo de la BN, 99mTc[Leu13] BN
que además presentó eliminación hepatobiliar y renal [38].
Ferro-Flores y cols conjugaron al quelante bifuncional HYNIC (ácido 6-
hidrazinopiridina-3- carboxílico) y al coligante EDDA (ácido etilendimino-N,N –
diacético) a la BN para preparar 99mTc-EDDA/HYNIC-[Lys3]-BN. La utilización
de HYNIC le dio al radiofármaco propiedades menos lipofílicas y
consecuentemente baja eliminación hepatobiliar y principalemente excreción
renal [18]. La estructura del radiofármaco, calculada por mecánica molecular y
por cálculos mecánico-cuánticos, se representa en la figura 2. Además García
Garayoa y cols recientemente mostraron que la introducción de un espaciador
hidrofílico entre la secuencia peptídica y el complejo de unión al 99mTc puede
reducir la alta lipofilicidad y mejorar la relación tumor-tejido no blanco [59].
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
19
Figura 2. Estructura calculada por MM3 del complejo Tc-(EDDA)-HYNIC-BN
(E= 105 Kcal/mol)
Después del diagnóstico, estadificación y localización del tumor se han utilizado
análogos de péptidos marcados con 111I como sustitutos para determinar la
biodistribución y dosimetría de radiofármacos terapéuticos marcados con
radiometales tales como 90Y. El DTPA (ácido dietilen triamino pentaacético) y
DOTA (ácido 1, 4, 7,10-tetraazaciclododecano-N, N’,N’, N’’-tetraacético) se han
utilizado como sistemas quelantes acoplados a análogos de la BN para terapia
[60]. Los radiofármacos como el [111In-DTPA-Pro,Tyr4]BN [61, 62], se han
reportado con alta afinidad a tumores GRPr+, rápida depuración de tejidos no
blanco y sangre vía renal. La sustitución del quelante DTPA por DOTA en el
mismo conjugado mostró efectos favorables en la afinidad por los GRPr [62].
Recientemente M. de Jong y cols sintetizaron un nuevo análogo de la BN
acoplado a DTPA, [111In-DTPA-ACMpip5,Tha6,βAla11,Tha13,Nle14]BN(5-14)
(Cmp 3), con limitada estabilidad en suero humano, pero alta captación in vivo
en tumores GRPr+ en estudios con animales [63].
Muchos de los estudios con nuevos análogos de la BN se enfocan en el
sistema quelante-DOTA por sus opciones multipropósito como SPECT, PET y
radioterapia con péptidos radiomarcados (PRRT) [64-71]. Por ejemplo, el
DOTA-PESIN (DOTA-PEG4-BN(7-14)) demostró ser un compuesto muy
prometedor. A pesar de tener afinidad moderada por los GRPr, presentó buena
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
20
captación in vivo en estudios animales [65]. La eliminación del compuesto fue
vía renal, con rápida depuración de tejidos negativos a GRPr, pero muy alta
acumulación en riñones, que no pudo ser reducida a través de la co-inyección
de lisina (figura 3).
Otro análogo de la BN utilizado como quelante al DOTA es el 177Lu-AMBA [71].
Este radiofármaco mostró alta captación en tumores GRPr+ en estudios
animales y con una razón tumor-fondo favorable. El tratamiento del tumor in
vivo con éste compuesto resultó en una sobrevida prolongada del ratón y
disminuyó la tasa de crecimiento del tumor comparado con los ratones control.
También se excretó via renal, con alta acumulación en los riñones a pesar de la
co-inyección de lisina, debido probablemente a la falta de lisinas en la
secuencia peptídica.
Figura 3. Estructura química de los quelantes más comunes utilizados para
acoplar análogos de la BN a varios radionúclidos [73].
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
21
La aplicación de péptidos análogos de la BN radiomarcados en pacientes aún
está muy limitado [56, 72, 73]. Sin embargo los desarrollos recientes en la
síntesis de nuevos análogos de la BN están promoviendo su utilización en
estudios clínicos.
2.1.3. Péptidos ligantes de colecistoquinina (CCK) y receptores de
gastrina
La colecistoquinina (CCK) y la gastrina actúan como neurotransmisores en el
sistema nervioso central, como reguladores de varias funciones en el tracto
gastrointestinal y como estimuladores de los factores de crecimiento en varios
tumores, como el cáncer de colon y el cáncer gástrico. Estructuralmente están
relacionados ya que ambos tienen los mismos cinco aminoácidos carbono-
terminal (-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2), que es el sitio activo para la unión con el
receptor de colecistoquinina-2 (CCK-2r). El CCK-2r se ha identificado en la
membrana celular de carcinomas medulares de tiroides (92%) mientras que se
encuentra ausente en cáncer de tiroides diferenciado. Específicamente la
minigastrina marcada con 99mTc ha mostrado una alta afinidad in vivo por los
CCK-2r [2, 74, 75]. Aproximadamente 13 diferentes péptidos marcados con 99mTc o 111In se han reportado recientemente como radiofármacos dirigidos a
los CCKr [22].
2.1.4. Péptidos ligantes de la integrina αvβ3: Marcadores de angiogénesis
tumoral
La angiogénesis representa la formación de nuevos capilares por crecimiento
celular a partir de microvasos ya existentes [76]. Las integrinas son receptores
de adhesión celular capaces de convertir la unión de ligantes extracelulares en
la activación de procesos intracelulares (señalización de fuera hacia adentro)
así como de emplear procesos intracelulares para activar respuestas celulares
(señalización de adentro hacia fuera). La integrina α(v)β(3) está involucrada en
la angiogénesis tumoral y producción de metástasis. La unión específica a
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
22
integrinas αvβ3 de péptidos que contienen residuos de Arg-Gly-Asp (RGD) se
han empleado para radiomarcar péptidos RGD útiles como agentes de imagen
específicos para tumores.
Varios péptidos que contienen RGD se han sintetizado y se ha encontrado que
restringiendo la movilidad del RGD en un pentapéptido cíclico, se incrementa la
afinidad in vitro. Estos datos sugieren que el sitio de unión en el receptor αvβ3
es limitado.
El monómero c-RGDyV (ciclo-Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Val) se marcó primero en
1999 por Haubner y cols con 125I [77]. Este compuesto relativamente lipofílico
tuvo una rápida depuración tumoral y excreción hepatobiliar. La alta
acumulación de actividad en el hígado e intestino limitó su aplicación. La
glicosilación del péptido RGD disminuyó la lipofilicidad y consecuentemente la
captación hepática [78]. El mismo glicopéptido se marcó entonces con 18F [79-
80].
Los ligantes de péptidos para receptores αvβ3 marcados con 99mTc, 18F o 68Ga
son el c-RGDyK y el c-RGDfK (ciclo-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys) en ambas formas,
como monómeros o como dímeros [81-87]. En estos péptidos la cadena lateral
de la lisina provee funcionalidad a la amina primaria para acoplarse con
agentes quelantes bifuncionales. Para mejorar la especificidad de los sistemas
multiméricos RGD se han diseñado más de 30 derivados de RGD marcados
con 18F, 64Cu, 68Ga o 99mTc [24, 88-90]. Es importante mencionar que los
péptidos RGD no pertenecen a la familia de péptidos reguladores, pero son
importantes porque pueden marcar vasos neoangiogénicos a través de los
receptores de integrinas.
2.1.5. Péptidos ligantes para receptores de neurote nsina
La neurotensina (NT) es un péptido lineal de 14 aminoácidos que se encuentra
en altas concentraciones en el íleon e hipotálamo, e induce varios efectos
fisiológicos tales como hipotensión, analgesia, contracción gástrica e
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
23
incremento en la permeabilidad vascular. Los receptores de neurotensina están
expresados en el cáncer de próstata y cáncer de páncreas [2,91]. El
neuropéptido-Y análogo marcado con 99mTc (NPY) también es útil en la
detección de sarcomas [92,93].
2.1.6. Péptidos de internalización Tat
El diagnóstico y tratamiento de enfermedades por métodos novedosos se
incrementaría con un transporte eficiente del fármaco al núcleo de las células.
Los péptidos de internalización (PPs) son fármacos utilizados en la imagen
molecular y están basados en dos péptidos, el VIH Tat (Tat; Arg-Lys-Lys-Arg-
Arg-Gln-Arg-Arg-Arg) y el péptido homeodominio antennapedia (Ant; Arg-Gln-
Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys) [94]. El péptido
derivado VIH Tat es un péptido pequeño básico llamado “caballo de Troya”
porque se ha utilizado para transportar una gran variedad de moléculas al
interior de las células, como, nanopartículas, proteínas, péptidos y ácidos
nucleicos. El dominio de transducción o región que le da las propiedades de
internalización parece estar confinado en una pequeña secuencia de
aminoácidos básica Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg y es conocido como
Tat(49-57) [94-97]. Los radiofármacos híbridos, como por ejemplo el 99mTc-N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN han demostrado que aumenta la captación en
células de cáncer y consecuentemente el contraste en la imagen de tumores de
cáncer de mama [98]. Los péptidos Tat no pertenecen a la familia de péptidos
reguladores.
Las secuencias de localización nuclear (NLS) se han utilizado para llevar al
núcleo de células de cáncer a algunos anticuerpos como el anticuerpo
monoclonal anti–CD33 HuM195, modificado con una secuencia NLS y marcado
con 111In (emisor de electrones Auger). El 111In-NLSHuM195 se probó en
células de leucemia mieloide y mostró internalización nuclear del radiofármaco
donde los electrones Auger emitidos fueron letales [99]. Otro anticuerpo
monoclonal utilizado con NLS y emisores Auger fue el traztusumab marcado
con 111In sobre células de cáncer de mama HER2/neu+ y células de cáncer de
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
24
mama resistentes a traztusumab. Costantini y cols demostraron el potencial
citotóxico de este agente terapéutico contra dichas células [97,100].
2.2. Sistemas multifuncionales con péptidos para la imagen óptica
La imagen nuclear está limitada por varios factores tales como el tiempo
necesario en la adquisición de datos, el costo del equipo, la exposición a la
radiactividad, la necesidad de contar con personal altamente capacitado [101].
La imagen óptica de fluoróforos alojados en tejido no sano, en tiempo real, no
radiactiva tiene alta resolución [102]. Dentro de todas las técnicas de imagen
óptica investigadas, es de particular interés la imagen basada en fluorescencia
infrarroja (NIR, longitud de onda de 700-1000nm) por ser no invasiva in vivo,
por su absorción y dispersión relativamente bajas en tejido y por su mínima
autofluorescencia de luz NIR [103]. Esto es debido a la hemoglobina (principal
absorbedor de luz infrarroja), agua y lípidos (principales absorbedores de luz
infrarroja) que tienen los coeficientes de absorción más bajos en la región de
infrarrojo cercano [104,105]. Por lo tanto áreas de tejido más profundas son
accesibles para desplegarse en una imagen tomográfica de señales ópticas
(FMT) [106-113] e imagen de reflectancia por fluorescencia (FRI) [114-116].
Estas aplicaciones para imagen molecular in vivo emplean longitudes de onda
de infrarrojo cercano. Los métodos de imagen por fluorescencia generalmente
son superiores en términos de sensibilidad y facilidad en su empleo [104]. Sin
embargo, la imagen por fluorescencia de infrarrrojo cercano en animales
pequeños no puede ser extrapolada directamente a una imagen in vivo en
pacientes debido a su limitada profundidad de penetración de la señal óptica (<
7 mm por imagen de resonancia por fluorescencia y < 20 cm por tomografía
molecular por fluorescencia) [104].
2.2.1. Fluorocromos de infrarrojo cercano
Los colorantes fluorescentes orgánicos son los fluorocromos más utilizados.
Los colorantes como el isotiocianato de fluoresceina (FITC) y el éster
diacetatosuccinimidil de carboxifluoresceina (CFSE) se han utilizado para
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
25
varias aplicaciones biológicas como el marcado de anticuerpos con
fluorescencia y moléculas que se usan para marcar células u organelos [117].
Sin embargo, pierden rápido su fluorescencia por la exposición a la luz y por lo
tanto, no son útiles para observaciones de bioimagen por periodos largos de
tiempo. La mayoría de los colorantes orgánicos tienen un espectro de emisión
relativamente estrecho. La longitud de onda de emisión/excitación está
comúnmente afectada por los cambios en el ambiente químico local (por
ejemplo, el pH, la interacción de iones, etc.).
La intensidad de la fluorescencia de algunos colorantes como la cianina cambia
de acuerdo con la reacción específica con óxido nítrico, que es una molécula
involucrada en la regulación de mecanismos fisiológicos y fisiopatológicos
[118].
En el caso específico de péptidos, el compuesto marcado con fluorescencia de
infrarrojo cercano, RGD con afinidad a receptores de integrinas, internalización
celular y otras características se están estudiando para mejorar la sensibilidad
y especificidad para detectar tumores con angiogénesis. La combinación de la
interacción específica del péptido RGD / integrina con la detección por
fluorescencia de infrarrojo cercano puede ser aplicada en la imagen no invasiva
de la expresión de integrinas y monitorear la eficacia de tratamientos anti-
integrinas.
Chen y cols [119] mostraron que el conjugado Cy5.5-RGD tiene afinidad por la
integrina αvβ3 (IC(50) = 58.1± 5.6 nmol/L). Otros resultados demostraron que el
Cy5.5- conjugado al péptido RGD monómero, dímero o tetrámero son
adecuados para la imagen de la expresión de integrinas [120].
También se ha logrado observar la expresión de αvβ3 en un modelo de tumor
cerebral ortotópico con un sistema de imagen óptica 3D (IVIS 200) después de
la administración del monómero Cy5.5-RGD [121].
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
26
Las imágenes de fluorescencia del pentapéptico cíclico RGD marcado con
Cy5.5 [122], adquiridas vía un dispositivo de detección intensificador acoplado
a una carga, concluyen que los análisis farmacocinéticos in vivo basados en la
imagen óptica dinámica pueden ser potencialmente útiles en la medicina
molecular.
Wu y cols [123] marcaron RGD monómero, dímero y tetrámero con Cy7. El
tetrámero Cy7-RGD fue el que mostró mayor afinidad por la integrina, mayor
acumulación de actividad en el tumor y el mejor contraste tumor-tejido no
blanco.
Waldeck y cols [124] reportaron que el Cy5.5-RGD combinado con métodos de
imagen óptica de infrarrojo cercano, permite una imagen específica de la
expresión de integrinas αvβ3 en macrófagos adquiridos de lesiones vasculares
y pude servir para estimar la actividad inflamatoria a partir de la unión de
macrófagos en lesiones ateroescleróticas.
En 2007 Ma y cols desarrollaron el fármaco fluorescente Alexa Fluor 680-G-G-
G-BN(7-14)NH2 y demostraron la habilidad de este nuevo conjugado de marcar
específicamente células de cáncer de mama de la línea T47D en ratones por
imágenes de fluorescencia [125].
2.2.2. Quantum Dots
Los quantum dots (QDs) o nanocristales son nanopartículas semiconductoras
fluorescentes (2-10 nm) con muchas propiedades ópticas únicas como, mostrar
fluorescencia brillante, son resistentes a la fotodecoloración y presentan un
ancho de banda de emisión estrecha [126-129]. Su longitud de onda de
emisión de fluorescencia puede ir de 400 nm a 2000 nm al cambiar tanto el
tamaño de partícula como la composición química, a temperatura ambiente.
Las partículas están hechas generalmente de cientos a miles de átomos (~200-
10,000 átomos) de elementos del grupo II y VI (por ejemplo CdSe y CdTe) o
elementos de los grupos III y V (por ejemplo InP y InAs) [130]. Como el cadmio
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
27
es potencialmente tóxico, Gao y cols [131] desarrollaron una clase de
conjugados con QDs que contienen un copolímero para protección in vivo y
múltiples moléculas PEG para mejorar la biocompatibilidad y circulación
(figura 1). Los QDs que son solubles en agua se pueden unir a péptidos
utilizando protocolos de bioconjugación estándar, como el acoplamiento de
maleimida-activada-QDs a grupos tiol [132]. Los QDs también pueden actuar
como sensores para detectar la presencia de biomoléculas con diseños que
incorporan donadores o receptores de energía. Por ejemplo, los QDs pueden
adaptarse para detectar la presencia del azúcar maltosa, al conjugar la proteína
que se une a la maltosa a la superficie del nanocristal [133].
Recientemente Cai y Chen reportaron un procedimiento detallado para la
preparación de QDs-RGD con PEG comercial [67]. Shah y cols [134] utilizaron
QDs-RGD para marcar células madre mesenquimatosas durante la replicación
y diferenciación en células osteogénicas, condrogénicas y adipogéncias. Young
y Rozengurt [135] demostraron que los conjugados de QDs-BN pueden marcar
receptores acoplados a proteína G en ratones, sugiriendo que la tecnología de
QDs puede ser adaptada para monitorear in vivo la unión del ligante a su
receptor.
Los QDs conjugados al péptido VIH Tat se unen rápido a las células y se
internalizan vía endocitosis. Ruan y cols utilizaron un sistema modelo de QDs-
Tat para examinar la captación celular y el transporte intracelular de
nanoparticulas en células vivas [136]. Dowdy y cols obtuvieron imágenes
dinámicas de fluorescencia y reporaron que el fármaco QDs-Tat se internalizó
por macropinositosis [137]. El QDs-Tat se unió a la superficie interna de
vesículas y quedó atrapado en organelos intracelulares. Un descubrimiento
importante es que los QDs unidos a las vesículas son transportados
activamente a lo largo de las trayectorias de los microtubos a una región
perinuclear asimétrica llamada centro de organización microtubular [138].
Además, se encontró que los QDs-Tat se unen fuertemente a membranas
celulares. Este resultado no solo brinda nuevos conocimientos del mecanismo
mediante el cual el péptido Tat transporta moléculas al interior de la célula, sino
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
28
que también, es un importante desarrollo de moléculas dirigidas conjugadas a
nanopartículas para marcar organelos intracelulares y adquisición de
imágenes.
2.2.3. Nanopartículas de oro
Las nanopartículas de oro (AuNPs) son inertes y no tóxicas debido a que el
Au(0) es captado por células humanas pero no causa citotoxicidad aguda [137].
Otra ventaja es que son de fácil síntesis [139]. Hay dos propiedades de las
nanopartículas que son muy relevantes: la resistencia a la oxidación y un
plasmón de resonancia visible [140]. El plasmón de resonancia para
nanoesferas de oro ordinarias se encuentra en 520 nm, en la mitad del
espectro visible, pero puede desplazarase hacia el rojo a la región de infrarrojo
cercano de 800 a 1200 nm y se han unido a moléculas biológicas para lograr
que interaccionen con un blanco biológico especifico. La conjugación de
moléculas a una AuNP se realiza por medio de una reacción espontánea de un
tiol (Cys) o una amina primaria con la superficie de la AuNP. Los tioles son las
moléculas estabilizadoras más importantes para las AuNPs de cualquier
tamaño. El uso de tioles conlleva a la formación de un enlace fuerte Au-S
[139,141]. La fluorescencia de las AuNPs se presenta desde el plasmón de
resonancia de superficie y se puede aumentar, apagar o disminuir según el
tamaño de la AuNP, la naturaleza de la capa unida a la AuNP, así como el
medio que rodea a la AuNp. Idealmente, la eficiencia de la energía transferida
de la AuNP a la capa orgánica solo depende de la extensión de la
superposición de la banda de emisión de la capa y de la banda de resonancia
del plasmón de superficie de la nanopartícula, que puede ser trasladada en una
transferencia de energía de resonancia de fluorescencia [142]. La emisión de
fluorescencia es muy importante en un estudio de AuNP conjugadas a péptidos
debido a que en general los péptidos contienen residuos aromáticos que
transfieren su energía a la AuNP de la siguiente manera: del nivel de
fluorescencia (péptido) al nivel de fosforescencia (péptido) y al nivel de
resonancia del plasmón de superficie (AuNP). La luz absorbida reemitida por lo
general está en el rango del infrarrojo cercano. Si la emisión de fluorescencia
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
29
de infrarrojo cercano no se apaga o se enmascara por la luminiscencia de
fondo, en particular en tejidos.
Surujpaul y cols [142] prepararon un sistema multifuncional de nanoparticulas
de oro conjugadas al péptido TOC y fue caracterizado por TEM, espectroscopia
UV-Vis, infraroja y de fluorescencia. Los espectros de emisión de fluorescencia
de AuNP y AuNP-TOC se obtuvieron ambos en solución y en tejido tumoral
AR42J de ratones. Los analisis de fluorescencia en tejido revelaron el
reconocimiento del conjugado AuNP-TOC por un tumor neuroendocrino. Los
resultados abren la posibilidad de utilizar AuNP-TOC en bioimagen.
De La Fuente y cols prepararon AuNPs conjugadas a la secuencia de
aminoácidos del péptido Tat para transportar NPs al núcleo de la célula [143] y
AuNP-RGD para posibles aplicaciones foto terapéuticas [144].
2.3. Sistemas multifuncionales con nanopartículas d e óxido de hierro
conjugadas a péptidos para imagen por resonancia ma gnética
Las NPs producen efectos multivalentes debido a las interacciones simultáneas
múltiples entre la superficie de la nanopartícula y la superficie de la célula
mientras que las señales en la imagen nuclear son el resultado de las
propiedades biológicas de péptidos únicos radiomarcados.
La técnica de imagen por resonancia magnética MRI es una modalidad no
invasiva capaz de brindar imágenes anatómicas de alta resolución.
Básicamente esta técnica utiliza el contraste del tejido que es generado a partir
de señales de resonancia magnética nuclear (NRM) recibidas de los núcleos de
hidrogeno localizados en diferentes ambientes fisiológicos de sistemas vivos.
La modalidad de MRI se puede extender a través del uso de NPs magnéticas
que mejoren la diferenciación entre tejido maligno y tejido sano. Las NPs de
óxido de hierro tienen propiedades magnéticas y se han estudiado para
aplicaciones biomédicas por su excelente biocompatibilidad y fácil síntesis [145
a 151]. El requerimiento principal de la MRI es la captación eficiente de NPs
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
30
magnéticas en las células y cuando una célula esta suficientemente cargada
con material magnético la MRI puede ser utilizada para seguimiento de la
célula.
Recientemente se conjugaron NPs de óxido de hierro superparamagnéticas
cubiertas de dextrán (CLIO) marcadas con Cy5.5 a aminoacidos carbono-13
terminal BN, mostrando que la BN-CLIO (Cy5.5) tiene la habilidad para marcar
y visualizar tumores en un modelo de adenocarcinoma ductal pancreático por
MRI [152].
Montet y cols [118] prepararon cRGD-CLIO (Cy5.5)-NPs y evaluaron la
expresión celular de integrinas en carcinoma de mama humano, la
farmacocinetica y la vasculariación tumoral. Los resultados indicaron que las
RGD-NPs magnetofluorescentes se dirigieron a las células tumorales que
expresaban integrinas in vivo y fueron detectadas por imagen de reflectancia
de fluorescencia, tomografía molecular de fluorescencia e imagen por
resonancia magnética. Estas imágenes permitieron analizar la naturaleza de la
vascularización del tumor, la vida media en sangre de las NPs (180 min) y la
depuración sanguínea (lenta).
La modificación de la superficie de agentes de contraste superparamagneticos
unidos al péptido Tat es una técnica efectiva para marcar magnéticamente el
interior de las células [153]. Las NPs de óxido de hierro superparamagneticas
ultrapequeñas (USPIO) se conjugaron al péptido Tat para marcar células T
CD4+. La captación en las células se determinó con espectrometría de plasma
acoplada por inducción de emisión óptica para medir el contenido de hierro. En
las células se detectó hierro cuando se utilizó USPIO-Tat-NPs. Además, se
demostró que las células T CD4+ retuvieron su función proliferativa y
regulatoria in vitro y no se observaron diferencias en su comportamiento
transmigratorio. El conjugado mostró potencial como agente de contraste para
MRI. Otro estudio en el mismo campo mostró la viabilidad de utilizar MRI para
monitorear células T in vivo con CLIO-Tat-NPs. Los cambios en la intensidad
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
31
de la imagen del bazo causados por el compuesto se midieron por MRI [154,
155].
2.4. Péptidos para imagen molecular con técnicas mu ltimodales
La imagen molecular representa el futuro de la imagen diagnóstica, ha
evolucionado desde la imagen anatómica funcional, así como los avances en
genética, biología molecular y celular, química y física. Diferentes técnicas de
imagen son, en general, complementarias más que competitivas. Agentes de
imagen dirigidos con doble marcaje permiten la validación cruzada y
comparación directa, por ejemplo, entre la imagen nuclear y la imagen óptica
de fluorescencia o MRI y fluorescencia, o imagen trimodal nuclear-MRI-
fluorescencia.
Por ejemplo, el SPECT y el PET brindan información funcional pero insuficiente
información anatómica. La tomografía computarizada (CT) es una técnica de
imagen tomográfica que utiliza una fuente de rayos x externa para producir
datos anatómicos tridimensionales. Los sistemas SPECT-CT y PET-CT
actualmente se utilizan en la práctica clínica, combinan una cámara gamma y
un sistema de transmisión de Rx integrado, montado en el mismo gantry
[156,157]. La ventaja de estos sistemas es la habilidad de adquirir una imagen
anatómica con CT y una imagen funcional con SPECT o PET secuencialmente.
La modalidad dual PET-NIR con péptidos fluorescentes ha sido reportada
recientemente por CAI y cols [158]. La imagen PET-NIRF se ha utilizado para
medir tejido fluorescente y la inmunofluorescencia se realizó con células
tumorales de bioglastoma humano U87MG implantados en ratones para
cuantificar la captación tumoral y en órganos principales de 64Cu-DOTA-QD-
RGD. Se obtuvo una excelente correlación lineal entre las mediciones de la
imagen PET in vivo y aquellas mediciones realizadas con la imagen NIRF ex
vivo y el tejido fluorescente homogeneizado [158]. Los autores concluyeron que
este fármaco con función dual redujo significativamente la toxicidad y supera la
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
32
limitante de penetración en tejido de la imagen óptica, requisito para la imagen
dirigida cuantitativa en tejido profundo [158].
La imagen tomográfica molecular fluorescente (FMT) puede monitorear la
función molecular en animales vivos con fármacos dirigidos fluorescentes
específicos. Sin embargo, los métodos de imagen macroscópicos tales como el
FMT generalmente muestran pocos detalles anatómicos. Para superar esto
McCann y cols [159] reportaron una técnica de imagen cuantitativa, estructural
y funcional al combinar FMT y MRI. Los autores demostraron que la imagen
FMT-MRI puede producir imágenes multimodales tridimensionales de cerebros
de ratones vivos indispensables para monitorear la morfología tumoral y la
actividad de las proteasas. La imagen tumoral FMT/MRI combinada brinda un
parámetro diagnóstico in vivo, que refleja los cambios histológicos en los
tumores y es alterado significativamente por la quimioterapia sistémica. La
imagen FMT/MRI combinada con fármacos dirigidos moleculares fluorescentes
puede ser útil para el desarrollo de fármacos para tumores cerebrales y otras
aplicaciones de imágenes neurológicas y somáticas [159].
La síntesis y caracterización in vivo de 18F-CLIO fue reportada por Devarag y
cols [160]. Estas NPs pueden detectar de manera muy precisa los ganglios
linfáticos. Las imágenes PET/MRI in vivo pueden identificar claramente
ganglios linfáticos pequeños (1mm) junto con información anatómica precisa.
La fluorescencia de infrarrojo cercano tiene el potencial de proporcionar
imágenes rápidas a bajo costo y no radioactivas de cáncer de mama. Bhushan
y cols [161] desarrollaron un sistema de detección de microcalcificaciones en
cáncer de mama utilizando la modalidad dual SPECT/fluorescencia/NIR.
2.5 Radioterapia de blancos moleculares
Los radionúclidos que emiten partículas β de alta energía, son útiles para el
tratamiento de tumores voluminosos y en este caso, el rango corto de las
partículas puede compensar la pobre penetración de la molécula en una masa
tumoral que posiblemente muestre heterogeneidad en la expresión del receptor
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
33
blanco. Por otro lado las partículas β de alta energía no son eficientes para
destruir células individuales de cáncer o micrometástasis, debido a que la
mayor energía asociada al decaimiento radiactivo se deposita fuera de la célula
maligna. Tomando en cuenta lo anterior los emisores de partículas β de baja
energía con mayor interés para su uso en radioterapia de blancos moleculares
son el 177Lu, 161Tb, 67Cu, entre otros. [162, 163,164].
Debido al rango de penetración en el tejido de la radiación β, se produce un
efecto cruzado, que alcanza una mayor proporción de células tumorales a
pesar de la distribución heterogénea del radiofármaco (figura 4). Otra ventaja
de la terapia con radiación β es la disponibilidad de varios radionúclidos que
emiten radiación con energías baja media y alta (tabla 2). Estas energías tienen
rangos de penetración en tejido desde 0.1 hasta 10 mm [165].
Figura 4. Representación esquemática de la longitud de trayectoria de la
radiación α, β y Auger, en un medio celular y subcelular (escala arbitraria). El
mayor depósito de energía de un electrón Auger ocurre muy cerca de unos
pocos nm, mientras que la de la radiación α y β, ocurre en trayectorias de
40-80 µm y 0.1-10 mm respectivamente [165].
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
34
Tabla 2. Propiedades de la radiación emitida de algunos radionúclidos
terapéuticos [165].
Radiación β- α Electrones
Auger
Energía Baja Media Alta Muy alta Muy baja
Ejemplos 169Er 131I 90Y 211At 125I
177Lu 186Re 188Re 213Bi 123I
67Cu 153Sm 32P 212Bi 111In
199Au 111Ag 89Sr 149Tb 55Fe
33P 64Cu 67Ga
Rango promedio
en tejido (mm) 0.1-0.3 0.3-1 1-5 0.03-0.08 <0.001
Característica LET bajo y fuego cruzado LET alto LET alto
Adecuado para
tratamiento de: Masas tumorales
Células
individuales y
agrupadas
Células
individuales y
agrupadas
LET = Transferencia Lineal de Energía (keV/µm)
Los electrones Auger que se emiten durante la captura electrónica o
decaimiento por transición isomérica, también se consideran partículas
adecuadas para la inactivación de células malignas. Estas partículas, debido a
su alto rendimiento por decaimiento, son en extremo radiotóxicas si en sus
trayectorias chocan con el ADN. Entonces, existe una alta probabilidad de que
induzcan rompimiento de varias dobles hebras e inactivación de las células
[165-167]. El mayor reto de utilizar electrones Auger para terapia es su rango
corto que los hace eficientes solo si el decaimiento radiactivo ocurre muy cerca
del ADN. Por esta razón un agente terapéutico con emisiones Auger debe de
internalizarse a la célula maligna, llegar al núcleo e idealmente incorporarse al
ADN.
Varios radionúclidos utilizados en medicina nuclear decaen por captura
electrónica y/o conversión interna (201Tl, 123I, 111In, 67Ga, 99mTc, etc.) como
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
35
consecuencia de la vacante generada en los orbitales atómicos internos por
estos tipos de decaimineto se emiten varios electrones Auger. Muchos de estos
electrones tienen energías muy bajas (∼ 20-500eV) con rangos en el orden de
las dimensiones subcelulares en tejido. Por lo tanto, el depósito de alta energía
muy localizada ocurre alrededor del sitio de decaimiento. El radionúclido que
más se ha utilizado para investigar los efectos de los electrones Auger es el 125I, el cual emite varios electrones de baja energía. [168].
El efecto Auger es causado por una vacante en la capa electrónica interna,
preferentemente en el orbital K, que perturba la estabilidad de la energía del
átomo. Cuando se recupera el balance de energía, un gran número de
electrones de baja energía y rayos x característicos se emiten de diferentes
capas electrónicas del átomo.
El término “electrones Auger” es un nombre conceptual para diferentes
transiciones (Auger, Coster-Kronig y super Coster-Kronig). Generalmente se
puede decir que las transiciones Auger ocurren entre los orbitales (L→K, M→L
etc). Debido a que cada orbital con más de dos electrones se puede dividir en
diferentes niveles de energía (la estructura fina), las transiciones entre los
electrones del mismo orbital también pueden ocurrir (transiciones Coster-
Kronig). La energía del electrón emitido es igual a la diferencia de energía entre
los orbitales involucrados. Por lo tanto, un gran número de combinaciones se
traducirá en un espectro de energía del electrón Auger compuesto de varios
electrones monoenergéticos de intensidad variable.
Los decaimientos por captura electrónica o conversión interna son las
principales fuentes de electrones Auger. Experimentalmente es importante
distinguir entre lo que puede ser un incremento normal en la dosis celular y el
efecto biológico Auger. Las energías electrónicas cercanas al potencial de
ionización (< 30 ev) tendrán un efecto limitado y los electrones con energías
mayores a 5 keV con un rango aproximado de 1 µm no contribuirán al efecto
local. La mayoría de los electrones Auger tendrán energías de
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
36
aproximadamente 20 keV, que es una energía ideal para ser totalmente
depositada dentro del tamaño de una célula [169].
2.5.1. Proceso Auger
Cuando los radionúclidos decaen por captura electrónica o conversión interna,
se crea una vacante en las órbitas atómicas internas del átomo residual.
Posteriormente el átomo excitado experimenta una serie de transiciones hasta
que alcanza el estado basal. Estas transiciones son de dos tipos: procesos
radiativos y no radiativos. Las transiciones radiativas, las cuales predominan
por vacantes en el orbital K, resultan en la emisión de rayos x característicos
(figura 5). Hay varias transiciones no radiativas, las más comunes son de los
tipos Auger, Coster-Kronig (CK) y super Coster-Kronig (super CK) (figura 5).
Cada una resulta en la expulsión de un electrón orbital. Estos procesos son
altamente probables cuando la vacante esta situada más allá del orbital L. En la
transición Auger, la vacante inicial en el orbital principal menor se llena con un
electrón proveniente del orbital principal superior y otro electrón es expulsado
del orbital principal superior. Mientras que en la transición CK, la vacante
originada en el orbital principal es llenada con un electrón del mismo orbital
principal y el electrón expulsado será del orbital principal superior. Finalmente,
en el caso de la transición super CK la vacante y los dos electrones están todos
en el mismo orbital principal [168].
Figura 5. Transiciones radiativas y no radiativas en procesos orbitales internos
atómicos. No existen transiciones CK en los orbitales K.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
37
Las transiciones radiativas mueven la vacante al orbital principal superior sin
cambio en el número de vacantes, mientras que las no radiativas incrementan
el número de vacantes por uno. Por lo tanto, como las vacantes más internas
se filtran hacia el orbital de valencia, se desarrolla un fenómeno de cascada
que corresponde a la multiplicación de la vacante y la emisión de numerosos
electrones de baja energía, conocidos como electrones Auger. Generalmente
varios electrones Auger son emitidos para cada vacante del orbital interior
primario. Muchos de estos tienen muy bajas energías (menos de unos cientos
de eV), con valores intermedios de transferencia lineal de energía (LET) (10-25
keV/µm) y rangos extremadamente cortos (varios nm) en tejido biológico. Dado
que la cascada se completa dentro de ∼10-15 s, la región de las inmediaciones
del átomo es colmada de electrones Auger y como consecuencia se obtienen
densidades de energía local muy altas [168].
Varios radionúclidos emiten radiación Auger pero los de mayor interés para
tratamiento son el 125I, 123I y 201Tl (tabla 3). El 55Fe emite una gran cantidad de
radiación en forma de electrones Auger, pero no califica para la terapia en
humanos ya que tiene una vida media de 2.7 años. Para el 99mTc la energía de
radiación Auger liberada por decaimiento es menor del 1%, mientras que para
el 125I, 123I y 201Tl es de 3.7% a 19.9% [165].
De acuerdo con la AAPM (American Association of Physicists in Medicine) el 99mTc emite un promedio de 4 electrones Auger y 1.1 electrones CI por
decaimiento. Los electrones emitidos presentan energías de alrededor de 0.9
keV y 15.4 keV por decaimiento, respectivamente, con un cálculo de energía
total por decaimiento de 142.6 keV (incluyendo las contribuciones del rayo
gamma). El porcentaje total de energía Auger por decaimiento es 0.6 % y de CI
es 10.8 % [168].
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
38
Tabla 3. Ejemplos de emisores de electrones Auger [165].
Electrones Energía
(keV) % de energía*** Radionúclido
Auger/dec CI/dec Auger/dec* CI/dec* Total/dec** Auger/dec CI/dec
T1/2
55Fe 5.1 0 4.2 0 5.8 71.9 0 27a
67Ga 4.7 0.3 6.3 28.1 201.6 3.1 13.9 78h
99mTc 4.0 1.1 0.9 15.4 142.6 0.6 10.8 6h
111In 14.7 0.2 6.8 25.9 419.2 1.6 6.2 67h
123I 14.9 0.2 7.4 20.2 200.4 3.7 10.1 13h
125I 24.9 0.9 12.2 7.2 61.4 19.9 11.8 59.4d
201Tl 36.9 1.1 15.3 30.2 138.5 11.0 21.8 73h
dec = decaimiento, *AAPM TG6, **incluidas las contribuciones de rayos x y rayos gamma ***energía
Auger o CI en % del total de energía/ decaimiento.
2.5.2. Efecto Auger en la terapia de blancos molecu lares
La radioterapia dirigida que utiliza electrones Auger presenta múltiples ventajas
y retos. Durante la última década, el 99mTc ha sido utilizado como un agente en
imagen diagnóstica y recientemente se ha analizado su potencial como agente
terapéutico. Las propiedades físicas de 99mTc junto con su gran disponibilidad a
través de un generador in situ pueden representar un nuevo e importante
campo en la radioterapia dirigida.
Los tres requisitos principales para una radioterapia dirigida efectiva que utiliza
emisores de electrones Auger, se muestran en la tabla 4.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
39
Tabla 4. Requisitos principales para radioterapia dirigida que utiliza emisores
de electrones Auger [165].
REQUISITO DESCRIPCIÓN
Selectividad y especificidad. La alta especificidad y selectividad
evitará la toxicidad de los tejidos sanos
alrededor del tumor.
Irradiaciones internas consecutivas La habilidad de desarrollar múltiples
ciclos de tratamiento en el tiempo. A
diferencia de la quimioterapia, la
radioterapia usualmente no provoca una
respuesta inmune.
Reducir la heterogeneidad en la
captación tumoral.
Que el blanco de la radiación se una a la
mayoría de las células de cáncer vivas.
El efecto del fuego cruzado de la
radiación β puede tener ventajas en
tumores grandes, pero no en pequeños.
Una vez localizado cerca del núcleo de las células, la efectividad terapéutica de
los emisores de electrones Auger ocurre principalmente debido a la extensiva
fragmentación del ADN que es difícil de reparar. Esto se puede explicar
basándose en el rango de los electrones Auger (que es de orden de nm) y en la
densidad de ionización de estos electrones [170]. De hecho, de acuerdo con
Buchegger y cols, la dosis absorbida local dentro del tejido tumoral después de
la irradiación con 125I es 22000 veces mayor que con una fuente externa de
70 Gy, utilizada en radioterapia externa. A pesar de estas ventajas la terapia
dirigida con electrones Auger muestra algunas limitaciones y retos,
especialmente al considerar terapia de tumores sólidos como a) Tiempos
largos de retención del trazador en el flujo sanguíneo, que conllevan a una
dosis absorbida más alta en la médula ósea (uno de los tejidos más
radiosensibles); b) Baja penetración en ciertas áreas tumorales que resulta en
dosis absorbidas no uniformes [169].
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
40
Debido a que los electrones Auger tienen un rango corto, presentan toxicidad
baja a la medula ósea en comparación con partículas β y α.
De acuerdo con Sofou, la principal restricción en la radioterapia dirigida es la
limitación de la toxicidad de la dosis absorbida en el tejido, que es el resultado
de la acumulación significativa de los portadores del radionúclido en órganos
vitales no blanco. Esto resulta en niveles de toxicidad que prohiben la
administración de dosis altas para alcanzar dosis absorbidas letales en el sitio
tumoral [171]. Algunas posible soluciones incluyen a) Marcado directo en un
solo paso con biomoléculas que resulten en una mejor biodistribución;
b) Estrategias para detener la angiogénesis sin afectar tejido sano;
c) Normalización de la vasculatura tumoral para permitir mayor penetración y
reducir la captación heterogénea en el tumor.
2.5.3. Rango de las partículas y proximidad al ADN
El rango de las partículas y la proximidad al ADN son dos características vitales
cuando el objetivo es la radioterapia dirigida. Las partículas β emitidas por el 90Y presentan un rango promedio de 215 células, mientras que las del 131I
irradian 40 células y el 211As (emisor de partículas α) irradia solo 3 [172]. Los
electrones Auger permiten que la radioterapia dirigida sea más eficiente con
daño mínimo a tejido sano debido a su corto rango, por lo que la radiotoxicidad
de los electrones Auger (cerca del 90%) se crea por mecanismos indirectos,
especialmente el denominado efecto bystander.
El efecto bystander es un fenómeno que ocurre cuando las células con daño
radiobiológico inducen muerte celular en células no irradiadas a través de la
liberación de citosinas y radicales libres [169]. Boyd demostró que el 123I indujo
la liberación de citotoxicinas bystander, lo cual sugiere el posible uso de 123I-
MIBG (metaiodobenzilguanidina) para el tratamiento de pacientes con tumores
neurales. [173]. Chen mostró la ausencia de citotoxicidad en tejidos sanos
próximos cuando utilizó el complejo regulador del poro nuclear para transportar
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
41
una proteína del citoplasma al núcleo. Este complejo poro nuclear permitió la
penetración de moléculas con diámetro menor de 40 a 60 kDa por difusión
pasiva, y para moléculas con dimensiones mayores requirió transporte activo
[99]. Los efectos tóxicos de emisores de electrones de baja energía se han
asociado no solo con la unión covalente entre el radioisótopo y el ADN celular,
sino también con la toxicidad proveniente de las moléculas unidas al emisor de
electrones Auger. Estudios recientes han mostrado que algunas moléculas son
capaces de penetrar al núcleo celular y no necesitan unirse covalentemente al
ADN para inducir radiotoxicidad [169]. Buchegger utilizó nucleótidos
radiomarcados y enfrentó algunas limitaciones, incluyendo la incorporación al
ADN durante la fase S del ciclo celular [165]. Esto puede significar que no solo
el rango y la proximidad al ADN son factores clave en la radioterapia dirigida,
también influye la fase del ciclo celular. La incubación con tiempos
suficientemente largos para cubrir de 2 a 3 ciclos celulares se utilizaron para
estudios in vitro y la administración del fármaco para sincronizar todas las
células a la misma fase del ciclo [165].
Los estudios en tejidos y células han mostrado que una vez que el emisor de
electrones Auger está en el citoplasma se observan efectos similares a
aquellos inducidos por radiaciones de LET bajo. Cuando se introducen cerca
del ADN, las curvas de sobrevivencia serán similares a aquellas obtenidas con
partículas α de LET alto [174]. De acuerdo con Boswell y cols, la tasa de dosis
absorbida en la célula cuando se irradia con 99mTc, 123I, 111In, 67Ga y 201Tl es de
94, 21, 18, 74 y 76 veces mayor, respectivamente, cuando la irradiación ocurre
en el núcleo, que cuando ocurre en la membrana celular (figura 6) [175].
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
42
Figura 6. Representación esquemática de la relación entre la distancia del sitio
de decaimiento y la energía depositada en el ADN. Se puede observar que si
se mueve el sitio de irradiación del núcleo a la superficie celular, la energía
depositada al ADN se reduce significativamente.
De acuerdo con Buchegger el depósito de energía de electrones de emisores
Auger ocurre en esferas de 1 a 2 nm de diámetro y una vez incorporados al
ADN, la energía depositada en la doble hebra puede ser igual o mayor de
1 MGy.
Los electrones emitidos CI (aún cuando decaigan en el citoplasma celular)
pueden alcanzar el núcleo y por lo tanto el ADN. Sin embargo, estos electrones
presentan una eficacia radiobiológica (RBE) similar a la de partículas β y
rayos x. Estos electrones depositan de 106 – 109 cGy en un volumen de
algunos nm3 alrededor del sitio de decaimiento. Por otro lado, los electrones
emitidos por captura electrónica presentan LET alto y por lo tanto mayores
valores de eficacia radiobiológica [169].
La AAPM propuso valores de RBE cercanos a 10 para efectos determinísticos
de electrones Auger y 20 para efectos estocásticos. Estos valores solo aplican
para electrones Auger obtenidos por captura electrónica, debido a que aquellos
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
43
adquiridos por conversión interna se clasifican como radiación de LET bajo y
por lo tanto presentan un factor de peso de 1 [165].
2.5.4. Muerte celular inducida por radiación
La radiación ionizante utilizada en la terapia contra el cáncer deposita su
energía en el ADN del núcleo celular, produce rupturas simples y dobles en las
hebras del ADN, que si no es capaz de repararse produce la muerte celular.
Además, la radiación induce daño en la membrana celular, que puede activar
rutas de muerte celular.
En los últimos años, se ha hecho evidente que tomar en cuenta sólo la
inducción de apoptosis y necrosis como efecto radioterapéutico de los agentes
anticancerígenos, es insuficiente. Por lo tanto, se han considerado también, la
catástrofe mitótica y la autofagia basados en los criterios morfológicos, debido
a la falta de equivalencia entre las alteraciones estructurales y las
características bioquímicas de la muerte celular. Además se ha incluido en esta
clasificación la senescencia (vejez celular), que es un tipo de muerte celular
proliferativa que puede ser inducida por radiación (tabla 5) [176].
Efecto del P
éptido Tat(49-57) sobre la B
iocinética y Dosim
etría de Radiofárm
acos Análogos de la B
ombesina
44
Tabla 5. C
aracterísticas de las rutas de muerte celular.
Apoptosis Necrosis Catástrofe mit ótica Autofagia Senescencia
Reducción del volumen celular y nuclear
Hinchazón citoplasmática y de organelos celulares
Formación de una “Célula Gigante”
Vacuolización masiva del citoplasma (formación de autofagosomas)
Aplastamiento, incremento del tamaño celular
Invaginación, mantenimiento de la integridad de la membrana
Pérdida de la integridad de la membrana
Separación fallida de los cromosomas durante la mitosis
Los hidrolasas lisosomales digieren el contenido celular y lo reciclan para uso interno
Acumulación de heterocromatina foci
Condensación de la cromatina, fragmentación nuclear, fragmentación del ADN cromosomal
Degradación aleatoria del ADN
Micronucleación, multinucleación
Granularidad Incremento de la actividad de la β-galactocidasa
Sin respuesta inmune Respuestas inmunes Ejecutada vía apoptosis retardada o necrosis retardada
Métodos de detección: Annexina marcada Ensayos de fragmentación del ADN Ensayos de la activación de caspasa
Métodos de detección: Permeabilidad temprana a colorantes vitales Microscopía eletrónica
Métodos de detección: Visualización de células multinucleares y células con micronúcleos
Métodos de detección: Localización de LC3
Métodos de detección: Senectud asociada a la actividad de β-galactocidasa
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45
2.5.5. El papel de la apoptosis en la radioterapia dirigida
La respuesta tumoral a la radiación de partículas depende de múltiples factores
que incluyen la dosis absorbida, la tasa de dosis, la penetración tumoral del
radiofármaco, la localización intracelular del radionúclido y la radiosensibilidad
del tumor.
Los daños al ADN estimulan diferentes rutas celulares, como el arresto del ciclo
celular para reparar los daños (de la fase G1 a la fase S y de la Fase G2 a la
mitosis) o con lleva a la muerte celular programada, conocida como apoptosis.
La apoptosis es un mecanismo de muerte celular asociado con un proceso
inflamatorio nulo o mínimo que ocurre durante la embriogénesis y cuando
algunos agentes adversos arriesgan el futuro celular. Todas las rutas
apoptóticas muestran transducción de señales proteínicas. En el caso de los
daños inducidos por radiación, el gen P53 tiene un papel crucial. Además se
sabe que las células linfoides son más susceptibles de entrar en apoptosis,
mientras que las células epiteliales (que también sufren arresto celular),
generalmente mueren debido a la reproducción fallida después de una o varias
divisiones celulares. La eficacia de la radiación para inducir muerte celular
depende también de la tasa de dosis y de la densidad de ionización [169].
Los procesos apoptóticos se pueden observar en diferentes tumores,
especialmente dentro de áreas hipóxicas cerca de zonas necróticas. Las
proteasas cisteina-acido aspártico (conocidas como caspasas) se activan
durante la apoptosis, son responsables de la perturbación del citoesqueleto
celular, el aglutinamiento de la cromatina, la ruptura del ADN intranucleosomal,
y finalmente la desintegración celular en pequeños remanentes de membrana,
que serán removidos por macrófagos [170].
Urashima y cols estudiaron la apoptosis radioinducida y observaron que el
proceso apoptótico provocado por la radiación gamma después de una
exposición a 125I parece activar la caspasa 3 sin correlación con la
radiosensibilidad de la célula, sin embargo una vez que el 125I se incorpora al
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ADN, la apoptosis parece ser dependiente de la dosis y se correlaciona con la
radiosensibilidad celular vía la caspasa 3. Este estudio señala algunas
diferencias entre la irradiación que utiliza rayos gamma y electrones Auger.
Además demostró que dependiendo del lugar del sitio donde ocurra el depósito
de energía se, pueden activar diferentes rutas apoptóticas [177].
2.5.6. La necrosis en la radioterapia dirigida
La necrosis es considerada generalmente como la muerte celular accidental, no
regulada [178]. Cuando la necrosis es inducida, se produce rápidamente la
permeabilización de la membrana plasmática, lo que conduce a la salida del
contenido celular y la inducción de la inflamación. Además, la necrosis carece
de marcadores bioquímicos específicos y sólo puede detectarse mediante
microscopía electrónica. La necrosis es usualmente definida como un tipo de
muerte celular que implica la ruptura de la membrana plasmática, sin las
características de la apoptosis (picnosis, contracción de la célula y la formación
de cuerpos apoptóticos) y sin riesgos de vacuolización autofágica [179]. Las
principales características de la necrosis incluyen el aumento en el volumen
celular (oncosis), que finalmente culmina en la ruptura de la membrana
plasmática y el desmantelamiento desorganizado de organelos hinchados. La
necrosis inducida por radiación se puede subdividir en necrosis temprana y
necrosis tardía. La necrosis temprana es una muerte celular ultra-rápida, que
es inducida dosis altas de irradiación es decir, más de 100 Gy [180]. La
necrosis tardía es una muerte celular lenta y uno de los mecanismos por los
cuales se ejecuta la catástrofe mitótica [181].
2.5.7. La catástrofe mitótica inducida por radiació n
La catástrofe mitótica es la muerte célular que ocurre dentro de la mitosis o
como resultado de la mitosis aberrante [179]. La mitosis anormal tiene
diferentes rutas que inducen cambios que incluyen a la anafase, rezago del
material cromosomal y mitosis multipolares (figura 7) [182, 183]. Además no se
produce la separación cromosomal correcta ni división celular, lo que conlleva a
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la formación de células gigantes con morfología nuclear aberrante, con
múltiples núcleos o varios micronúcleos [184, 185, 186, 187, 188]. La división
de estas células puede formar colonias abortivas, que viven varias horas o días
pero eventualmente mueren por necrosis o apoptosis retardada.
Figura 7. Catástrofe mitótica producida por irradiación. Las células control
normalmente contienen un único núcleo redondo (izquierda). Célula irradiada
con múltiples núcleos (punta de flecha) y micronúcleo (flecha) (derecha) [184].
Las células después de irradiarlas entran prematuramente en mitosis, con ADN
dañado que induce aberraciones cromosomales que culminan en la catástrofe
mitótica. Esto aplica para radiaciones de diferentes densidades de ionización y
tasas de dosis.
2.5.8. Cuantificación del efecto Auger
En la radioterapia es común utilizar dosis absorbida como el parámetro
relacionado con los efectos biológicos y los resultados terapéuticos. El uso de
diferentes características de la radiación es tratado con el concepto de
efectividad biológica relativa (RBE = RELATIVE BIOLOGICAL
EFFECTIVENESS), donde el efecto biológico de la radiación a prueba se
compara con aquella radiación de LET bajo. Los electrones individuales son
principalmente radiación de LET bajo (energía < 10 keV/µm). Solo una
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pequeña fracción de los electrones Auger tendrá LET entre 10 y 30 keV/µm y
poco incremento de RBE. El efecto biológico Auger se explica entonces como
el efecto colectivo de varios electrones de LET bajo que darán una producción
más efectiva de varios rompimientos de doble hebra del ADN y por lo tanto el
valor de RBE será comparado con el de la radiación de LET alto (como los
emisores α).
Un problema al utilizar dosis absorbida junto con el efecto Auger es que nos
limitamos a confiar en los cálculos tanto de la fuente (rendimiento de electrones
Auger de baja energía) y en cómo la energía es absorbida, debido a que es
casi imposible medir estos parámetros en condiciones fisiológicas. El potencial
de ionización de la molécula de ADN y la habilidad de los electrones Auger de
ocasionar rompimientos de la doble hebra varía dependiendo de las
condiciones químicas y fisiológicas [189].
2.6. Metodología de cálculo de dosis absorbida de r adiación
En dosimetría interna la cantidad principal de interés es la dosis absorbida y la
dosis equivalente. La dosis absorbida (D) está definida como D=dЄ/dm, donde
dЄ es la energía promedio impartida por la radiación ionizante a la materia de
masa dm. La unidad de D es el Gray (Gy).
La dosis equivalente (H) es la dosis absorbida multiplicada por un factor de
calidad (Q), y es la estimación de la efectividad de diferentes tipos de radiación
de causar efectos biológicos: H = DQ. Debido a que el factor de calidad es
adimensional, las unidades de esta cantidad son las mismas que la D, sin
embargo la unidad especial es el Sievert (Sv) [190].
Entonces la ecuación general para la dosis absorbida en un órgano es:
mEnAkDi
iii
==== ∑∑∑∑ φφφφ~ ec 2.1
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49
Donde:
D Es la dosis absorbida (Gy)
A~
Es la dosis acumulada (MBq·s)
n Es el número de radiaciones con energía E emitida por transición nuclear
E Es la energía de emisión (MeV)
Φ Es la fracción de energía absorbida en el blanco
m Es la masa de la región del blanco (Kg)
k Es la constante de proporcionalidad (kg/MBq·s MeV)
La aplicación terapéutica de los radionúclidos, especialmente los emisores de
partículas α en medicina nuclear y la utilización reciente de haces de protones y
haces de partículas cargadas en radioterapia ha destacado la necesidad de un
formalismo dosimétrico bien definido y acompañado por cantidades con nombres
especiales correspondientes, aplicable a efectos determinísticos. Se han
propuesto varias soluciones, por ejemplo la NCRPM (National Council on
Radiation Protection and Measurements) y la ICRP (International Commission on
Radiological Protection) han propuesto la unidad Gray- Equivalente (Gy-Eq) para
referirse a la dosis absorbida ponderada por la efectividad radiobiológica [191,
192]. En 2007 la ICRP propuso el uso Gy como la unidad de dosis absorbida
ponderada por efectividad radiobiológica para efectos biológicos determinísticos.
En el campo de la terapia de haces de protones, el término “dosis equivalente”
se ha utilizado con la unidad Gy-Eq o Cobalto-Gray-Equivalente (CGE)
[193,194].
En el contexto de la terapia de haces iónicos, un grupo de trabajo en conjunto
con la IAEA (International Atomic Energy Agency) y la ICRU (International
Commission on Radiation Units and Measurements), propusieron un formalismo
para resolver la cuestión de las cantidades y unidades usadas para predecir
efectos determinísticos de la radiación ionizante. Este grupo introdujo la cantidad
de dosis isoefectiva (DIsoE), que fue definida como el producto de las dosis
absorbida (D) y un factor de ponderación isoefectivo (wIsoE). Este factor de peso
se definió para considerar todos los factores que pueden influir en los efectos
determinísticos clínicos asociados con una dosis absorbida dada. En la terapia
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
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con radionúclidos se podría incluir este factor pero no estaría limitado al tipo de
radiación, la tasa de dosis y la distribución espacial de la dosis absorbida [195].
La condición de irradiación de referencia para determinar wIsoE fue definida para
fotones que depositan 2 Gy en el tejido por fracción y 5 fracciones por semana.
Se recomendó que la dosis isoefectiva se expresara en Gy [195].
A pesar de que wIsoE es similar en su concepto a la efectividad radiobiológica,
este difiere en que la radiación de referencia está bien definida y
tradicionalmente ha sido utilizada en la terapia con medicina nuclear como el
estándar para predecir consecuencias biológicas probables de una dosis
absorbida particular. De la misma manera, el comité MIRD (Medical Internal
Radiation Dose) recomienda que el formalismo de dosis isoefectiva se adopte
para su uso en medicina nuclear terapéutica. No obstante, el comité MIRD
recomienda que para corresponder con el formalismo establecido para efectos
estocásticos, la dosis isoefectiva sea expresada en una nueva unidad especial
conocida como el barendsen (Bd).
Se recomendó la utilización de este nombre en reconocimiento a las
contribuciones hechas por Gerrit W. Barendsen a la radiobiología de radiación
de LET alto [195].
2.6.1. Sistema MIRD para cálculo de dosis interna
La ecuación para la dosis absorbida en el sistema MIRD es aparentemente
simple: SAD~==== [190]. En este esquema la radiación ionizante deposita energía
en un blanco, pero es independiente del tiempo. Los volúmenes blanco son
modelos anatómicos de órganos humanos y cuerpo entero. La D se define
como el producto de los factores dependientes del tiempo (biocinéticos) por
aquellos factores independientes del tiempo (físicos).
SAD~==== ec 2.2
mEnkSi
iii
==== ∑∑∑∑ φφφφ ec 2.3
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
51
Los factores biocinéticos corresponden a la actividad acumulada à y los
factores físicos son el tipo y energía de la emisión, masa del blanco, fracción de
la energía depositada en el blanco por la partícula emitida, geometría de la
fuente y del blanco, distribución de la fuente etc. (S).
Existen una variedad de métodos conocidos como modelos
radiofarmacocinéticos que describen el comportamiento del vector que acarrea
a la fuente radiactiva dentro de un organismo, mediante los cuales se puede
conocer la actividad acumulada.
2.6.2. Modelos radiofarmacocinéticos
Un modelo radiofarmacocinético, es la descripción matemática de la
distribución biológica de algún radiofármaco en función del tiempo, desde su
introducción al cuerpo hasta su eliminación biológica o física [196]. Se dividen
en tres tipos:
1. Empíricos o de integración directa
2. Analíticos o análisis de regresión por “mínimos cuadrados”
3. Compartimentales o modelo compartimental
2.6.2.1. Modelos empíricos
Al utilizar la metodología de los radiotrazadores, puede obtenerse una serie de
medidas de concentración del radionúclido en los diferentes tejidos y graficarlas
en función del tiempo post-administración. Las curvas resultantes de actividad-
tiempo pueden ser caracterizadas como un modelo farmacocinético empírico,
puesto que es una descripción matemática de la distribución del radionúclido
incorporado cuya información derivó de la medición directa [197].
El área bajo la curva actividad vs tiempo puede ser evaluada por métodos de
integración numérica simples y obtener la actividad acumulada (~A ), parámetro
biocinético necesario para el cálculo de la dosis absorbida. Sin embargo, la
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precisión de tal integración es completamente dependiente del adecuado
cálculo de la fracción (o porcentaje) de actividades acumuladas en los órganos
fuente y en las muestras de excreta. Es importante tomar suficientes muestras
de la distribución y la retención del radiofármaco durante el transcurso del
estudio.
El sistema MIRD fue desarrollado principalmente para su uso en la estimación
de dosis de radiación recibida por pacientes cuando se les administra un
radiofármaco.
2.6.2.2. Modelos analíticos
Para superar la limitante de los métodos empíricos, en cuanto a extrapolar
razonablemente un dato más allá del último tiempo de lectura, los datos
biológicos obtenidos pueden ajustarse a una función analítica, también
conocida como “función de distribución”. En el modelo analítico queda implícito
que la curva de actividad vs tiempo puede ser ajustada a una función
dependiente del tiempo antes de la primera medición y después de la última
medición. Los procesos biológicos siguen una cinética de primer orden, por lo
que las curvas de actividad vs tiempo pueden ajustarse a una suma de
exponenciales, así: [197]
(((( )))) t
j
jhh
jheAtq )(
)(
λλλλ∑∑∑∑==== ec 2.4
Donde:
qh(t) = es la función de distribución de la región fuente rh, que es la actividad
corregida por decaimiento radiactivo (Bq) en la región fuente rh al tiempo t post-
administración del radiofármaco; Ah(j) es la actividad (Bq) para el j-ésimo
componente exponencial en la región fuente rh al tiempo t=0; y λh(j) es la
constante de eliminación efectiva (h-1) del j-ésimo componente exponencial de
la curva actividad vs tiempo en la región fuente, que es la fracción de la
actividad eliminada por unidad de tiempo para el j-ésimo componente
exponencial de la curva actividad vs tiempo.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
53
Los datos de actividad vs tiempo al ser graficados en papel semilogarítmico (la
actividad se grafica en la escala logarítmica de las ordenadas y el tiempo en la
escala aritmética de las abscisas), producen un segmento lineal para cada
componente de la función de distribución qh(t) y el número de componentes
exponenciales corresponde al número de segmentos lineales identificables, de
esta forma, se puede obtener, por arreglo de mínimos cuadrados, la función
correspondiente [197].
Si se incorpora la función de distribución en la expresión de actividad
acumulada, esta puede escribirse como:
∫∞
=∞0
)(),0(~
dttqeA h
tλ ec 2.5
Evaluando la integral resultante para el modelo biexponencial antes propuesto:
)2(
)2(
)1(
)1(~
h
h
h
h AAA
λλλλλλλλ++++==== ec 2.6
Y en términos generales:
∑∑∑∑====∞∞∞∞j jh
jhAA
)(
)(),0(
~
λλλλ ec 2.7
2.6.2.3. Modelos compartimentales
En este modelo el sistema biológico es tratado como compartimentos
interconectados como un ensamble de unidades físicas y químicas idénticas.
Cada ensamble corresponde a la entidad anatómica identificable (ej. un órgano
como el hígado), la entidad fisiológica identificable (ej. sistema retículo
endotelial) o la entidad física identificable (ej. agua del espacio extracelular).
Sin embargo, referirse a la entidad identificable o un compartimento discreto es
únicamente conceptual. El modelo compartimental está caracterizado por el
número de compartimentos y por las probabilidades de transición, o
velocidades de intercambio, entre los compartimentos, lo cual puede ser
representado matemáticamente como el grupo de ecuaciones diferenciales
ordinarias acopladas [197, 198].
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
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2.7. Dosimetría celular
La biodistribución y las medidas cinéticas de radiofármacos en pacientes son
difíciles de lograr. Una dosimetría de alta calidad de radiofármacos emisores de
rayos gamma o positrones sigue siendo muy difícil de desarrollar en un entorno
clínico estándar. Para dosimetría de radiación Auger, es esencial el
conocimiento del porcentaje de células que están marcadas en los tejidos
individuales. Además la irradiación Auger más importante ocurriría solo para
emisores asociados al ADN. En contraste con las células marcadas, las células
no blanco estarían mínimamente o no irradiadas por los decaimientos de
electrones Auger [165].
Dado que la actividad acumulada en un órgano es conocida como la dosis
promedio de radiación absorbida nuclear, se puede calcular, si se estima el
porcentaje de radiación Auger asociado al ADN. Los valores S para dichas
situaciones ya se conocen [199]. Para la estimación del riesgo de efectos
estocásticos a largo plazo, un factor de calidad (wR) de 20 se puede aplicar
para radiación Auger asociada al núcleo celular. Esto puede generar el
estimado del riesgo de la dosis de radiación para un paciente expuesto a un
procedimiento diagnóstico de medicina nuclear con emisores de electrones
Auger [91].
Para los cálculos de lo efectos citotóxicos determinísticos de la radiación
Auger, el conocimiento de la dosis de radiación absorbida nuclear promedio en
un órgano es insuficiente. Es esencial tener el estimado del porcentaje de
células que son marcadas con radiacióm y conocer las tasa de captación del
radiofármaco dentro de estas células. Asimismo, la consideración de los
efectos de los emisores de radiación Auger con tiempos de vida media largo,
tal como el 125I, las células con captación insuficiente pueden evitar
citotoxicidad por la división celular [200]. La división celular produce dilución de
los decaimientos de radiación Auger en múltiples células hijas. Igualmente si se
considera la sobrevivencia clonal, la probabilidad de sobrevivencia de al menos
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una de varias células hijas será mayor que aquella de una sola célula madre
expuesta al mismo número de decaimientos Auger. El manejo dosimétrico
preciso de la división celular durante la radiación Auger de larga duración es
por lo tanto muy compleja. Esta requiere la atención al retraso de la división
celular provocado por la irradiación continua que causa rompimientos de la
doble hebra en el ADN. Estos rompimientos inducen señales de detención del
ciclo en diferentes puntos control que permiten la reparación.
Los efectos biológicos de la radiación Auger han sido medidos con 125I o 123I-IdUrd. La vida media de 123I permite que la mayoría de su emisión de
radiación Auger ocurra en un día, mientras que la duplicación celular de
tumores ocurre frecuentemente de uno a varios días. En contraste, debido a la
vida media larga del 125I (60 días), la liberación de energía ocurrirá durante
varios días o semanas siempre que el radiofármaco permanezca asociado al
ADN. Para el 125I-IdUrd se calculó que con 120 decaimientos de radiación
Auger que ocurrieron cercanos al ADN se logró esterilizar una célula [201].
Este cálculo está basado en el conocimiento del tiempo que tarda una división
celular normal y el tiempo de división bajo condiciones de irradiación Auger.
2.7.1. Esquema MIRD celular
El formalismo matemático mediante el cual se calcula la dosis absorbida en
una célula es el mismo que se emplea en dosimetría interna (descrito arriba)
entonces:
)(~
hkh rrSAD ←⋅= ec. 2.8
Donde à es la actividad acumulada y S es la dosis absorbida en la región
blanco rk por unidad de actividad acumulada en la región fuente rh. Los valores
S usados en el cálculo se encuentran en el MIRD celular y existen para
diferentes dimensiones celulares que contienen distribuciones de radiactividad
en el núcleo, citoplasma o membrana [202].
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2.8. Simulación Monte Carlo
El método Monte Carlo es una forma genérica de nombrar procedimientos
matemáticos o métodos numéricos cuya característica común es la utilización
de números generados aleatoriamente y el muestreo de distribuciones de
probabilidad. Se hace uso de variables aleatorias definidas en un espacio
dimensional finito y se calcula su valor esperado [203]. La principal limitación
del método Monte Carlo es la obtención de suficiente precisión en los
resultados. Entre más precisión se requiere, más eventos o muestreos deben
hacerse y eso, en problemas complejos, lleva a utilizar mucho tiempo de
cómputo. Existen opciones para reducir esos tiempos, como los métodos de
reducción de varianza, la utilización de modelos simplificados o la subdivisión
del problema en partes menos complejas.
La simulación Monte Carlo del transporte de radiación se basa en que la
trayectoria de una partícula es vista como una secuencia aleatoria de
desplazamientos libres que terminan con un evento de interacción donde la
partícula cambia su dirección de movimiento, pierde energía y puede generar
partículas secundarias. Todo ello se realiza al aplicar las leyes de la física,
sobre las funciones de probabilidad determinadas por las secciones eficaces
adecuadas, dependiendo del medio, la energía de la partícula y la disposición
geométrica del sistema [204,205].
Los códigos de simulación Monte Carlo desarrollados para el transporte de
radiación, contienen modelos de interacción para definir las funciones de
distribución de probabilidad para las distintas variables aleatorias que
intervienen en cada proceso y permiten obtener valores promedio de
observables de interés como pueden ser la posición de las partículas después
de cada interacción, el momento y las pérdidas de energía de las partículas
primarias o las secundarias generadas en algunas interacciones [206].
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
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2.8.1. Códigos de simulación del transporte de radi ación
Entre los códigos o programas de simulación Monte Carlo para el transporte de
partículas en medios materiales están: EGS4, EGSnrc, PENELOPE, NOREC,
MCNP y GEANT.
El MCNP fue desarrollado en Los Alamos, E.U. para simular solo neutrones; sin
embargo, actualmente puede utilizarse para simular hasta 36 tipos de
partículas en intervalos de energías de unos keV hasta el orden de cientos de
MeV en materiales muy diversos [207].
El GEANT fue elaborado en el CERN (European Organization for Nuclear
Research) para aplicaciones con altas energías y se puede utilizar para simular
haces de diferentes tipos de partículas (muones, piones, neutrinos, etc.), desde
energías de unos cuantos cientos de eV hasta cientos de TeV para algunas
partículas.
El NOREC es específico para aplicaciones de microdosimetría, pero su manejo
es difícil y está limitado a simular en agua fotones y electrones.
Con PENELOPE se pueden simular cascadas de fotones, electrones y
positrones en casi cualquier medio material sólido, líquido o gaseoso, en
geometrías que pueden definirse con superficies cuádricas, es decir
determinadas por una ecuación de segundo grado. Este código originalmente
fue desarrollado para simular electrones, lo cual se puede hacer evento por
evento, si son de baja energía [208].
Una vez seleccionado el sistema a simular, se hace un modelo geométrico y se
genera un archivo (o tarjetas de entrada), en el lenguaje o formato del código;
se definen los materiales que rellenan los volúmenes definidos y se generan los
archivos de dichos materiales de acuerdo al formato requerido. Básicamente
para cada material se introducen los elementos químicos que lo forman, el
porcentaje en peso atómico de cada elemento y su densidad. Se establecen las
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condiciones iniciales de las fuentes como son la energía, posición, tipo de
partícula, número de partículas y se declaran las energías de corte o absorción.
Finalmente se estipula el grado de detalle con que debe efectuarse la
simulación y dependiendo del código, se establecen los proceso de interacción
necesarios e incluso alguna teoría física específica para la simulación.
2.8.2. Código de simulación Monte Carlo PENELOPE
PENELOPE (acrónimo del ingles PENetretion and Energy LOss of Positrons
and Electrons y fotones en la actualidad) es un código Monte Carlo de
propósito general capaz de simular cascadas de fotones y electrones en el
rango de unos pocos cientos de eV hasta 1 GeV en casi cualquier medio
material amorfo cuya composición química sea conocida. PENELOPE destaca
frente a otros códigos por su descripción del transporte de interfaces materiales
y el transporte de partículas de baja energía [209].
PENELOPE es un paquete de subrutinas, controladas por un programa
principal que controla la evolución de las historias de las partículas y acumula
en contadores las magnitudes de interés en cada aplicación concreta. Estas
subrutinas están escritas en el lenguaje de programación FORTRAN77 y son
distribuidas por la Agencia de Energía Nuclear de la Organización para la
Cooperación y el Desarrollo Económico (Nuclear Energy Agency, NEA-OECD).
Sus autores son Francesc Salvat y José M. Fernández-Varea de la Facultad de
Física de la Universidad de Barcelona y Josep Sempau del Instituto de
Técnicas Energéticas de la Universidad Politécnica de Cataluña [209].
La simulación de electrones y positrones con PENELOPE incluye los siguientes
tipos de interacciones:
• Dispersión elástica fuerte (θ > θc).
• Dispersión inelástica fuerte (θ > θc).
• Emisión por Bremsstrahlung (radiación de frenado).
• Interacción Delta.
• Interacción artificial débil (θ < θc).
• Ionización de capas internas.
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• Aniquilación (sólo para positrones).
• Interacciones auxiliares (mecanismos adicionales de interacción que pueden
ser definidos por el usuario, por ejemplo, interacciones fotonucleares).
La simulación de fotones incluye los siguientes tipos de interacciones:
• Dispersión elástica (Rayleigh).
• Dispersión inelástica.
• Efecto fotoeléctrico.
• Producción de pares.
• Interacción Delta.
• Interacciones auxiliares.
Cada interacción puede dar lugar a partículas secundarias, las cuales serán
simuladas posteriormente. Por ejemplo, la aniquilación de un positrón dará
lugar a dos fotones gamma y el efecto fotoeléctrico dará lugar a un electrón
libre. Para poder emplear PENELOPE se debe construir un programa principal,
el cual se encargará de ir llamar de manera adecuada a las subrutinas de
PENELOPE, e irá almacenando la información sobre las trayectorias de las
partículas simuladas. Este programa principal debe dar a PENELOPE unos
ficheros de entrada con información sobre la geometría del sistema y de los
materiales a utilizar. También debe de proporcionar a las subrutinas de
PENELOPE los parámetros necesarios para su funcionamiento, como son: tipo
de partícula a simular, posición y dirección de la misma. Mediante el uso
adecuado de estas herramientas de simulación, el usuario puede crear el
entorno de simulación que le permita realizar los estudios deseados. En este
trabajo se ha empleado como programa principal el penmain, que viene
incluido con PENELOPE, ligeramente modificado para poder calcular la
atenuación y la energía depositada por haces de electrones de bajas energías
tras atravesar un determinado espesor del material estudiado (membrana,
citoplasma y núcleo celular). PENELOPE incluye la subrutina para la
generación de series de números aleatorios que está basada en el algoritmo
que se debe a L’Ecuyer [210] y produce números reales de 32 bits
uniformemente distribuidos en un intervalo abierto entre cero y uno. Su periodo
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
60
es del orden de 1018 s, lo que es infinito para efectos prácticos en simulaciones.
[209].
Los ficheros fuente necesarios para realizar la simulación con PENELOPE son
los siguientes [209]:
• Penmain.f: Es el programa principal, que se encarga de llamar a todas las
subrutinas de PENELOPE y almacena la información sobre las trayectorias de
las partículas simuladas.
• PENELOPE.f: Es el paquete básico de subrutinas que se necesita para la
simulación de cascadas de fotones, electrones o positrones en cualquier
medio.
• Pengeom.f: Paquete de subrutinas que realiza el seguimiento de las
partículas a través de la geometría definida.
• Penvared.f: Paquete de subrutinas encargado de reducir las incertidumbres
estadísticas.
• Timer.f: Subrutina que permite controlar el tiempo de ejecución del programa.
• Pengenerator.f: Subrutina encargada de generar el fichero de geometría en el
formato adecuado para que lo pueda leer PENELOPE.
2.8.2.1. Geometría del sistema
La geometría del sistema que se desea simular debe ser definida en un formato
adecuado para que lo lea PENELOPE.
El sistema quedará definido por cuerpos formados cada uno de un solo
material, cada uno de estos se forma mediante superficies que quedan
definidas mediante cuadricas; es decir, cada una de ellas debe venir dada por
la siguiente ecuación:
0),,( 0
222 =++++= AIzIzIyIxIzyxF zzzyyxx ec 2.9
Por lo tanto, para definir una determinada superficie con PENELOPE se
necesita dar valores de 1, -1 o 0 a los coeficientes Ixx, Iyy, Izz, Iz y A.I0, así como
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61
decidir el tamaño que tendrán las superficies en las tres direcciones del espacio
y siempre que sea necesario incluir un valor que traslade respecto al origen a la
superficie definida.
PENELOPE tiene una sencilla aplicación que permite visualizar las superficies
llamada “gview3d.exe”. Esta permite comprobar que el archivo de la geometría
está escrito de forma correcta y que corresponde al modelo que deseamos
simular [209].
2.8.2.2. Definición de materiales
Toda la información de los materiales involucrados en la simulación debe de
estar recopilada en un archivo que el usuario debe construir siguiendo normas
concretas. Se incluyen tablas de propiedades físicas y de secciones eficaces.
El archivo de materiales se crea mediante la aplicación llamada “material.exe”,
tras ejecutarla se introducen los datos sobre el material como su composición
química y densidad. Asimismo, PENELOPE dispone de una lista de 280
materiales para los cuales sólo se introduce su referencia y se obtiene el
archivo de materiales directamente. Cuando se trata de materiales
compuestos, la aplicación aproxima la sección eficaz a la suma de las
secciones eficaces de cada elemento al ponderar su proporción en la molécula.
De la misma manera que el archivo de geometría debe seguir las reglas de
sintaxis, todos los materiales deben ir concatenados en el registro de los
materiales. [209]
De esta manera PENELOPE les asocia un número que es el que se debe de
utilizar en el archivo de geometría, identificándose así de que material está
compuesto cada cuerpo.
2.8.2.3. Descripción del programa principal
Como se indicó anteriormente, el programa principal que se va a emplear en
este trabajo es el programa penmain, ligeramente modificado para poder
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
62
calcular la atenuación y la energía depositada por haces de electrones al
atravesar un determinado espesor del material estudiado.
El cuerpo de nuestro programa principal y PENELOPE están conectados
mediante una serie de variables globales que deben estar completamente
definidas. PENELOPE va a buscar en el programa principal los valores de
todas estas variables antes de empezar la simulación. Estas son [209]:
• KPAR: Tipo de partículas que se está simulando (1 – electrón, 2 – fotón, 3 –
positrón)
• E: Energía en eV que posee la partícula en ese momento.
• X, Y, Z: Coordenadas espaciales (en cm).
• U, V, W: Cosenos directores que marcaran la dirección de las partículas.
• WGHT: Peso útil cuando se usan las técnicas de reducción de varianza.
• IBODY: Cuerpo en el que se encuentra la partícula
• MAT: Material en el que se encuentra la partícula.
• ILB (5): Vector de 5 componentes que describe el origen de las partículas
secundarias.
También se debe incluir en el programa principal una serie de valores
relacionados con el transporte de radiación que influirán directamente en la
precisión y rapidez de la simulación.
• DSMAX (M): Proporciona la distancia máxima entre dos eventos duros. El
parámetro M define esta distancia para cada material.
• EABS (KPAR, M): Valor de la energía para la cual podemos considerar que la
partícula se absorbe localmente. PENELOPE distingue entre colisiones duras y
blandas. Las colisiones duras son aquellas cuya pérdida de energía está por
encima de un cierto valor mientras que las blandas son las que se encuentran
por debajo. En el programa principal también se especifican estos límites para
cada material mediante las siguientes variables:
• C1 (M): Indica el recorrido libre medio entre eventos elásticos duros para cada
material.
• C2 (M): Determina la fracción máxima de energía que se puede perder entre
dos colisiones duras consecutivas.
• Wcc (M): Energía de corte en eV para colisiones inelásticas.
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• Wcr (M): Energía de corte para emisión de Bremsstrahlung.
Como ya se ha comentado anteriormente, el programa principal se apoya en
una serie de funciones y subrutinas de PENELOPE, que son las siguientes:
• PEINIT: Subrutina que lee los archivos de los diferentes materiales y
secciones eficaces que serán empleadas.
• GEOMIN: Lee el archivo de geometría.
• TIME0 y TIMER: Usados para poner el contador de tiempo a 0 y para ponerlo
en marcha.
• LOCATE: Determina el cuerpo que contiene el punto con las coordenadas (X,
Y, Z). Los valores de salida son:
- IBODY: Cuerpo en el que se mueve la partícula
- MAT: Material en dicho cuerpo
• CLEANS: Inicializa la lista de partículas secundarias. Debe de ser llamada
antes de comenzar la simulación de cada partícula primaria.
• START: Pone en marcha la simulación de una partícula.
• JUMP: Calcula el recorrido libre desde el punto de salida hasta la posición del
siguiente evento de interacción y la probabilidad de ocurrir de los distintos tipos
de interacciones. El valor de salida es:
- DS: Recorrido libre de la partícula.
• STEP: Esta subrutina parte de las coordenadas y dirección iniciales y
haciendo uso de la distancia recorrida calcula las coordenadas finales.
Además, devuelve el cuerpo y el material en que se encuentra finalmente la
partícula.
• KNOCK: Simulación de los eventos de interacción. Los parámetros de salida
son:
- DE: Energía depositada por la partícula en el material
- ICOL: Tipo de interacción sufrida por la partícula
- (U, V, W): Nueva dirección de la partícula
• SECPAR: Devuelve las condiciones iniciales de la siguiente partícula
secundaria y la elimina de la lista de partículas secundarias. El valor de salida
es:
- LEFT: Número de partículas secundarias restantes en la lista en el
momento que se llama a la subrutina.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
64
2.9. Microdosimetría
En microdosimetría [211, 212] la cantidad estocástica análoga a la D en un
volumen V se define como la energía específica (z),
mVz
ερε == ec 2.10
Donde ρ es la densidad del material que está contenido en V.
El valor promedio de la dosis absorbida D en V que es igual a z que es el valor
promedio de la distribución de probabilidad )(zf en V. Si hacemos incidir un
electrón en un volumen infinitamente pequeño este prácticamente atravesaría
ese volumen sin depositar energía. Por lo general V es una esfera y por
consiguiente es necesario conocer su radio. Para grandes dosis absorbidas la
forma de )(zf es una campana alrededor del valor promedio de V. Suponiendo
que V es suficientemente pequeño de tal forma que la dosis absorbida sea
constante independientemente del tipo de radiación, entonces,
zDm 0lim
→= ec 2.11
A partir de )(zf se puede conocer D pero no es posible el proceso inverso por
lo que se tienen que definir cantidades microdosimétricas específicas.
Otra cantidad microdosimétrica muy útil es la energía lineal definida como:
ly 1ε
= ec 2.12
Donde 1ε es la energía impartida en un solo evento y l es el diámetro promedio
de un volumen. En el caso donde V es una esfera,
3
2dl = ec 2.13
La frecuencia de evento ( *Φ ) es el número promedio de eventos en un sitio
(de región esférica) por unidad de dosis absorbida. Es decir, *Φ , es el
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recíproco de otra cantidad llamada energía absorbida específica promedio
( .Fz ). Y la función de proximidad )(xt la cual se refiere a la distribución de
distancias entre dos puntos donde se depositó energía en la materia irradiada.
En cuanto a los aspectos espaciales de la microdosimetría, z está sujeta a tres
diferentes tipos de fluctuaciones;
- Variación en el número de eventos en el sitio
- Variación en el número de colisiones que ocurren en esos eventos
- Variaciones en la energía localmente depositada en colisiones
individuales
Estas variaciones aumentan conforme el tamaño de volumen blanco se reduce,
ya que si el volumen es demasiado pequeño se incrementa la probabilidad de
que no ocurra ningún evento en ese sitio tan pequeño [212].
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
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Capítulo 3
Marco Metodológico
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3.1. Obtención de los radiofármacos [ 99mTc]EDDA/HYNIC-Lys 3-BN
(99mTc-BN), [ 99mTc]N2S2-Tat(49-57)-Lys 3-BN (99mTc-Tat-BN) y
[188Re]N2S2-Tat(49-57)-Lys 3-BN (188Re-Tat-BN)
3.1.1. Síntesis de HYNIC-Lys 3-BN
El ácido hidrazinonicotínico (HYNIC) se conjugó, en medio acuoso y a pH 9.0,
al grupo ε-amino del residuo de Lys3 en la región N-terminal de la BN utilizando
como precursor al succinimidil-N-Boc-HYNIC. Alternativamente se utilizó la
reacción en medio no acuoso con dimetilformamida (DMF) utilizando el
precursor N-Boc-HYNIC y como activador del grupo carbonilo al
hexafluorofosfato O-(7-azabenzotriazolil)-1,1,3,3 tetrametiluronium (HATU). El
proceso de purificación se realizó mediante cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC) y extracción en fase sólida (SepPack cartridge C-18) [27]. El
péptido HYNIC-BN (Pyr-Gln-Lys (HYNIC)-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-
His-Leu-Met-NH2, peso molecular: 1726.9 g/mol) fue sintetizado por PiChem
(Graz, Austria) con una pureza > 98 % analizada por HPLC en fase reversa y
espectrometría de masas.
3.1.2 Síntesis de N 2S2-Tat(49-57)-Lys 3-BN
El péptido Tat(49-57) se conjugó a la secuencia de amino ácidos Gly-
Cys(Acm)-Gly-Cys(Acm)-NH2 para producir un péptido del tipo Tat(49-57)-
espaciador-N2S2 (El N2S2 es el sitio de quelación del péptido para unirse al 99mTc). Por otro lado, la Lys3-BN se conjugó al reactivo maleimidopropil (MPA)
y el sitio Lys-MPA se utilizó como posición de unión para formar un tioéter con
la Cys del péptido Tat(49-57)-espaciador-N2S2. Los análisis por HPLC,
espectrometría de masas y análisis de aminoácidos se realizaron. En esta
parte del proyecto se contó con el apoyo de una compañía farmacéutica
(Bachem, CA, USA). Se obtuvo un certificado que indica que tiene una pureza
química >90% y un peso molecular de 3779.5 g/mol, pero la propuesta y el
diseño de la estructura del péptido híbrido es de este grupo de trabajo.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
80
3.1.3. Modelado Molecular
La estructura de la molécula del péptido N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN se construyó
tomando en cuenta la valencia, el tipo de unión, carga e hibridación. Las
energías mínimas (cálculos utilizando campos de fuerza de Mecánica
Molecular 3, MM3 aumentados) y el confórmero con menor energía (formalismo
CONFLEX) asociado a la geometría óptima de esta estructura se calcularon
utilizando el programa de cómputo para Windows® CAChe Pro 5.02 y/o 5.04
(Fujitsu Ltd., 2000-2001). De la aplicación secuencial de los métodos MM3
aumentado/CONFLEX se obtuvieron los confórmeros más estables para las
estructuras de los complejos N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN, Tc(O)N2S2-Tat(49-57)-
Lys3-BN y Re(O)N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN.
3.1.4. Procedimiento de radiomarcado de HYNIC-Lys 3-BN con 99mTc
La formulación liofilizada [1] se preparó disolviendo 1 mg de HYNIC-Lys3-BN en
1 ml de etanol al 10%, y se agregó a una solución de EDDA (ác.
etiléndiaminodiacético)-tricina-manitol. El cloruro estanoso (1.6 ml) se adicionó
bajo una atmósfera de nitrógeno. La mezcla se esterilizó por filtración en
membrana (Millipore, 0.22 µm) y se colocó 1 ml en 80 viales preesterilizados y
se liofilizaron por 24 h. A los estuches se les hicieron pruebas de esterilidad y
apirogenicidad. El procedimiento de radiomarcado se realizó adicionando 1 mL
de buffer de fosfatos 0.2 M y pH 7 a la formulación liofilizada e inmediatamente
740-1110 MBq (1 mL) de pertecneciato de sodio, obtenido de un generador
GETEC de 99Mo/99mTc (ININ, México). La solución se dejó reaccionar en un
baño seco a 92°C por 15 min. Todos los reactivos f ueron adquiridos en Sigma-
Aldrich Chemical Co. y utilizados como se recibieron.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
81
3.1.5 Procedimiento de radiomarcado de N 2S2-Tat(49-57)-Lys 3-BN con 99mTc
La desprotección de los grupos acetamidometil (Acm) y el proceso de
radiomarcado del N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN, se realizaron en un solo paso por
reducción del pertecneciato de sodio con cloruro estanoso en presencia de
acetato de amonio y tartrato de sodio a temperatura ambiente. Fue necesario
tener un pH de 9.5 para desacetilar las cadenas laterales Cys14(Acm) y
Cys16(Acm) del péptido Tat(49-57)-espaciador-N2S2 que es necesario para la
unión del tecnecio [2-4].
El N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN (1 mg) se disolvió en 200 µl de agua inyectable
(Pisa®, México), se agregaron 10 µL de esta solución a 25 µL de 99mTc-pertecneciato de sodio (185 MBq), se adicionaron 7 µL de una mezcla de
desprotección (50 mg/mL de tartrato de sodio en 0.1 M NH4OH/NH4CH3COOH,
pH 9.5) y 3 µL de solución reductora (0.5 mg de SnCL2/mL en 0.05 M HCl), la
mezcla final se incubó por 20 min a temperatura ambiente. El 99mTc-pertecneciato de sodio se obtuvo de un generador GETEC 99Mo/99mTc
(ININ-México). El resto de los reactivos se adquirieron de Sigma-Aldrich
Chemical Co. y se utilizaron tal como se recibieron.
3.1.6. Procedimiento de radiomarcado de N 2S2-Tat(49-57)-Lys 3-BN con 188Re
El 188Re es ligeramente más rico en electrones respecto al 99mTc, por ello el
potencial de oxidación es mayor y tiende a ser inestable con diferentes agentes
quelantes. Sin embargo, complejos del tipo [Re=O]N2S2 son altamente estables
cuando se conjugan a diversas biomoléculas. La desprotección de los grupos
Acm y el proceso de radiomarcado del N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN, se realizó en
un solo paso por reducción del pertecneciato de sodio con cloruro estanoso a
pH ácido (2-4) y en presencia de tartrato de sodio [5,6].
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
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El 188Re-perrenato de sodio se obtuvo de un generador de 188W/188Re
(Polatom). Los demás reactivos se adquirieron de Sigma-Aldrich Chemical Co.
y se utilizaron como fueron recibidos.
El N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN (1 mg) se disolvió en 200 µL de agua inyectable
(Pisa®, Mexico). El ácido ascórbico (2 o 0 mg, utilizado como antioxidante) se
disolvió junto con el tartrato de sodio (816 mg) en 5 ml de solución de cloruro
estanoso (SnCl2 en 0.06 M HCl).
La solución de 188Re-perrenato de sodio (100 µL, 40 MBq) se ajustó a pH de 1,
se agregó a la solución del péptido junto con 300 µL de la solución de cloruro
estanoso-tartrato de sodio. El pH de la mezcla de reacción se midió y se dejó
reaccionar por 0.5, 1, 2, 3, 4, 5 ó 24 h a temperatura ambiente ó 92°C. El
diseño factorial del experimento se muestra en la tabla 6 [5,6].
Tabla 6. Diseño factorial experimental utilizado para el marcado de Tat-BN con
188Re*.
Clase Niveles Valores
[Tat-BN] (mg/mL) 3 0.12, 0.29, 0.54
[Ácido ascórbico] (mg/mL) 2 0, 4.35
Temperatura (°C) 2 18, 92
Tiempo de incubación (h) 7 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 24
* Variable dependiente: pureza radioquímica.
3.1.7. Evaluación de la pureza radioquímica de 99mTc-Tat-BN y 188Re-Tat-BN
Los análisis de pureza radioquímica se realizaron por cromatografía
instantánea de capa fina en gel de sílica (ITLC-SG, Gelman Sciences),
extracción en fase sólida (cartuchos Sep-Pack C-18) y por HPLC de fase
reversa.
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Los análisis de ITLC-SG se efectuaron utilizando dos diferentes fases moviles:
2-butanona para determinar la cantidad de 99mTcO4- libre (Rf = 1, Rf = relación
de frentes o factor de retención y es la distancia recorrida por el soluto entre la
distancia recorrida por el solvente) y citrato de sodio 0.1 M con pH 5 para
establecer el porcentaje de 99mTc-tartrato y 99mTcO4- (Rf = 1). El valor de Rf del
péptido radiomarcado en cada sistema fue de 0.0.
Los cartuchos Sep-Pak se preacondicionaron con 5 mL de etanol seguidos de
5 mL de HCl 1 mM de aire. Una alícuota de 0.1 mL del péptido radiomarcado
se cargó en el cartucho previamente acondicionado, seguido de 5 mL de HCl
1 mM para eluir el 99mTcO4- libre y el 99mTc-tartrato. El péptido radiomarcado se
eluyó con 3 mL de etanol:solución salina (1:1 v/v) mientras que el 99mTc
reducido y el coloide formado quedaron en el cartucho.
Los análisis por HPLC se llevaron a cabo con el sistema Waters® usando el
software Millenium® con dos detectores, el de radiactividad y el de UV
arreglados en línea y la columna YMC ODS-AQ S5 (5 µm, 4.6 mm x 250 mm).
El gradiente se corrió a la tasa de flujo de 1 mL/min con las condiciones
siguientes: ácido trifluoroacético (TFA) 1% en agua (fase A) y TFA 1 % en
acetonitrilo (fase B). El gradiente utilizado se muestra en la tabla 7.
Tabla 7. Gradiente de concentración de la fase móvil
Tiempo
(min)
Flujo
(mL/min)
%
Fase A
%
Fase B
0 0 0 0
1 – 3 1 100 0
3 – 20 1 50 50
20 – 23 1 30 70
23 – 30 1 100 0
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En este sistema los tiempos de retención para 99mTcO4- libre, 99mTc-Tat-BN y
188Re-Tat-BN fueron 3-4 min y 10-11 min (para ambos radiofármacos)
respectivamente.
3.1.8. Estabilidad en suero humano
Para estimar la estabilidad en suero humano de 99mTc-Tat-BN y 188Re-Tat-BN
se utilizó el análisis por HPLC de exclusión molecular y el de ITLC-SG. Una
solución de 50 µL de péptido radiomarcado (0.5 µL/50 µg) se incubó a 37°C
con 1 mL de suero humano fresco. La estabilidad radioquímica se determinó a
partir de muestras para análisis de 10 µL tomadas a diferentes tiempos desde
20 min hasta 24 h. Un cambio en el perfil de radiactividad del HPLC hacia
pesos moleculares altos indica unión a proteínas, mientras que picos de bajo
peso molecular muestra catabolitos marcados o unión a cisteina del suero.
3.1.9. Desafío a la cisteina
La estabilidad de los radiofármacos 99mTc-Tat-BN y 188Re-Tat-BN se probó a
través de su unión a la cisteina. Una solución fresca de cisteina se preparó
(10 mg/mL en PBS 0.1 M, pH 7.0) y se diluyó para tener diferentes
concentraciones. Posteriormente, 10 µL de cada solución se mezcló con 90 µL
del péptido radiomarcado (20 µM). Las relaciones molares de cisteina:péptido
fueron 5:1, 50:1 y 500:1. Los tubos de prueba se incubaron a 37°C por 1 h y se
analizó la pureza radioquímica por ITLC-SG.
3.2. Pruebas in vitro 3.2.1. Líneas celulares
Células de cancer de próstata PC3 y células de carcinoma mamario MCF7 y
MDA-MB231 se obtuvieron originalmente de ATCC (USA). Las células se
cultivaron a 37°C, con atmósfera de CO 2 al 5 % y humedad de 100 % en medio
RPMI (medio “Roswell Park Memorial Institute”) suplementado con 10% de
suero bovino fetal y antibióticos (estreptomicina, 100 µg/mL).
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
85
3.2.2. Prueba de internalización y unión no específ ica
Las células PC3, MCF7 o MDA-MB231 suministradas en medio fresco se
diluyeron para tener 1x106 células/tubo y se incubaron con aproximadamente
200,000 cpm de 99mTc-BN (péptido total 0.3 nmol), 99mTc-Tat-BN ó 188Re-Tat-BN (BN total 0.3 nmol) por triplicado a 37°C durante 0.083, 2, 4, 6 y
24 h. Los tubos de ensayo se centrifugaron (3 min, 500 g), se lavaron dos
veces con buffer de fosfato salino (PBS), y se determinó la actividad en el
botón celular en un detector de centelleo tipo pozo. La radiactividad en el botón
celular representó tanto el péptido externalizado (unido a la superficie celular)
como el péptido internalizado. Se tomó una alícuota con la actividad inicial que
significó el 100% y entonces se calculó la actividad captada en las células.
La actividad del péptido externalizado se removió con 1 mL de solución de
ácido acético 0.2 M/NaCl 0.5 M que se utilizó para resuspender el botón. Los
tubos de ensayo se centrifugaron, lavaron con PBS, volvieron a centrifugar y la
actividad en el botón se consideró como la internalización.
El botón celular se resuspendió con NaOH 1 M para lisar las células, se
centrifugó y lavó con PBS. La actividad del sobrenadante constituyó la
captación en el citoplasma. La unión no específica se determinó en paralelo
pero en presencia de Lys3-BN 10 µM (Bachem USA) para bloquear a los GRPr
en la membrana celular.
3.2.3. Internalización nuclear de 99mTc-Tat-BN
La distribución de 99mTc-Tat-BN en citoplasma y núcleo se estudió en las
células PC3, MCF7 y MDA-MB231. Las células se incubaron con el
radiofármaco durante 0.5, 1, 2, 4, 6 o 24 h, posteriormente, se separó el
citoplasma y el núcleo usando un estuche de extracción nuclear (Chemicon
International Inc., CA, USA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las
células se lavaron con 1 mL de ácido acético 0.2 M/NaCl 0.5 M. Los tubos de
ensaye se centrifugaron (250 x g), se lavaron con PBS, se volvieron a
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centrifugar y la actividad del botón se midió en un detector de centelleo de tipo
pozo (contador gamma) y se consideró como el 100 % de la actividad
internalizada. El botón celular se resuspendió con la solución de lisis
citoplasmático. Para obtener la suspensión de células lisadas, la suspensión de
células se aspiró y se expulsó utilizando una jeringa con una aguja de calibre
27 y se centrifugó a 8000 x g durante 20 min a 4°C. El sobrenadante que
contenía la porción citosólica de las células lisadas se midió en un contador
gamma. El botón con la fracción nuclear del lisado de células se resuspendió
en la solución de extracción nuclear y después de lisar los núcleos la
suspensión se centrifugó a 1600 x g durante 5 min a 4°C. el extracto nuclear
fue el sobrenadante y en el botón permanecieron las membranas. La
radiactividad en la fracción con el extracto nuclear y el botón se midieron en un
contador gamma y se calcularon los porcentajes de actividad en cada
compartimento subcelular a diferentes tiempos.
3.2.4. Modelo Biocinético
Los porcentajes de actividad obtenidos a diferentes tiempos de los
radiofármacos en la membrana, citoplasma y núcleo de las células de cáncer
se usaron para elaborar las curvas de actividad-tiempo de 99mTc. La biocinética
subcelular de 188Re-Tat-BN se calculó a partir del comportamiento biológico de 99mTc-Tat-BN (q(t) vs t), considerando el tiempo de vida media físico del 188Re
(e-λt , donde λ= ln2/17h). Los datos de la cinética de los radiofármacos se
ajustaron a una función exponencial utilizando el código OLINDA/EXM [7]. Al
integrar sobre el tiempo la actividad, como el número de desintegraciones por
unidad de tiempo, se obtiene el número total de desintegraciones (N = Bq·s) en
la membrana, citoplasma o núcleo expresado por unidad de actividad inicial
internalizada en las células de cáncer (ec 3.1).
∫∫∫∫−−−−====
tt dtteAN
00 )(λλλλ ec 3.1.
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3.2.5. Análisis estadístico
Las diferencias entre los datos de los experimentos in vitro se evaluaron por la
prueba de t de Student. Dicha prueba se refiere al análisis estadístico de la
comparación de dos medias, es decir, se comparan dos grupos (normalmente
dos tratamientos) con relación a una variable de eficacia cuantitativa.
3.2.6. Localización in vitro del Tat-BN internalizado en las células de
cáncer por inmunocitoquímica
Las células de cáncer PC3, MCF7 y MDA-MB231 (1x105/pozo) se cultivaron a
37°C, una atmósfera de CO 2 al 5 % y humedad al 100 % en medio RPMI
suplementado con suero bovino fetal y antibióticos (estreptomicina 100 µg/mL)
en portaobjetos de vidrio tipo pozo. Las células se incubaron con 5 mL de Tat-
BN diluido en 1 mL de medio RPMI por 1 h.
Posterior al tratamiento las células fueron enjuagadas con PBS frío, se fijaron
con formaldehído al 4%, se permeabilizaron con Triton X-100 al 25% y se
lavaron con PBS. Después de incubarlas a temperatura ambiente durante
30 min con BSA (albúmina de suero bovino) al 1% en PBS, las células se
incubaron por 1 h a temperatura ambiente con el anticuerpo primario VIH Tat
(1:500) (Abcam Inc., UK) y luego con el anticuerpo secundario (1:700)
conjugado con fluoróforos (Anticuerpo secundario de oveja IgG – H&L (FITC);
Abcam Inc., UK). Después del marcado con los anticuerpos primario y
secundario, las células se enjuagaron con PBS previo al montaje en los
portaobjetos (ProLong Gold; Molecular Probes). Los controles negativos
incluyeron células sin tratamiento con Tat-BN y/o sin anticuerpo primario.
Las imágenes del Tat-BN internalizado en las tres líneas de células de cáncer
marcadas por inmunofluorescencia se realizaron en un microscopio confocal
Zeiss LSM510 META, con un objetivo 40x/0.75Ph2 Plan-Neofluar, y un filtro BP
500-530 IR y una longitud de onda 488 nm, 20 %.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
88
3.2.7. Efecto del 99mTc-Tat-BN sobre la proliferación celular
El efecto antiproliferativo del 99mTc-Tat-BN en las células de cáncer PC3, MCF7
o MDA-MB231 se evaluó utilizando un estuche de ensayos de proliferación
celular CyQuant® (Molecular Probes, Invitrogen). El estuche utiliza un colorante
verde fluorescente patentado que muestra un aumento en la fluorescencia
cuando se une a los ácidos nucleares celulares. Una curva estándar de
referencia se creó para convertir los valores de fluorescencia a cantidad de
ADN utilizando un ADN bacteriófago-λ y siguiendo el protocolo del fabricante.
Aproximadamente 1x103 células de las líneas PC3, MCF7 o MDA-MB231 se
sembraron por pozo en microplacas de cultivo de 96 pozos. Las células se
cultivaron por 24 h y el medio de crecimiento se remplazó por medio fresco
conteniendo dos concentraciones diferentes de los fármacos Tat-BN (1.3 y 2
µM) o 99mTc-Tat-BN (14 MBq/nmol, 1.3 µM (3.6 MBq) y 2.0 µM (5.5 MBq))
(n=6). Para los controles positivos y negativos se utilizaron células incubadas
con medio sin estímulo (células sin tratamiento como control negativo) o con
astemizol 2.5 µM como agente antiproliferativo (control positivo) (n=6) [8]. Las
células se cultivaron durante 6 días a 37°C y el me dio se remplazó al día 3
utilizando una segunda dosis de estímulo de Tat-BN (1.3 y 2.0 µM) o 99mTc-Tat-
BN (7 MBq/nmol, 1.3 µM (1.8 MBq) y 2 µM (2.8 MBq). En el día 6, las células
fueron congeladas durante 30 min (-70°C), descongel adas y lisadas al agregar
la solución de CyQuant® con el marcador verde fluorescente. La fluorescencia
se midió directamente a una excitación/emisión máxima de 480/520 nm. La
absorbancia de los pozos se midió en un lector de microplacas (Bio-Tek,
Sinergy HT). Finalmente, las absorbancias de los pozos se correlacionaron con
las concentraciones de ADN (ng/mL) utilizando la curva estándar.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
89
3.3. Pruebas in vivo
3.3.1. Estudios de Biodistribución
Los estudios de biodistribución y captación tumoral en ratones se realizaron de
acuerdo con las reglas y regulaciones de la Norma Oficial Mexicana
062-ZOO-1999.
Ratones sanos BALB/c de 6 semanas de edad se utilizaron para los estudios
de biodistribución. En la vena de la cola se les inyectó 1.11 MBq (30 µCi) en
0.04 mL de 99mTc-Tat-BN. Los ratones (n=3) se sacrificaron a las 0.25, 0.5, 2, 4,
y 24 h posteriores a la inyección. Muestras de corazón, pulmón, hígado, bazo,
páncreas, riñones, intestinos, músculo, hueso y sangre se tomaron, colocaron
en tubos de plástico previamente pesados. La actividad se determinó en un
detector centelleador tipo pozo (Canberra) junto con 6 alícuotas de 0.5 mL del
estándar diluido que representó el 100% de la actividad inyectada. El promedio
de las actividades se utilizó para obtener el porcentaje de actividad inyectada
por gramo de tejido (%AI/g).
3.3.2. Inducción de tumores en ratones atímicos
Los ratones atímicos machos (20-22 g) que se utilizaron se mantuvieron en
jaulas estériles con camas de aserrín, temperatura y humedad constante y
periodos de luz/obscuridad 12/12 h. Se les proporcionó a los ratones acceso ad
libitum a alimentos y agua (standard PMI 5001 feed).
Los tumores de próstata se indujeron en la parte trasera superior de 4 ratones
atímicos de 6-7 semanas de edad vía una inyección subcutánea de células
PC3 (1x106) suspendidas en 0.2 mL de PBS. Los sitios de inyección se
observaron a intervalos regulares para verificar la formación y progresión
tumoral.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
90
3.3.3. Imágenes Los ratones atímicos con tumores implantados se sacrificaron 2 h posteriores a
la administración en la vena de la cola de los radiofármacos 99mTc-Tat-BN o 99mTc-BN (3 MBq en 0.04 mL). Las imágenes se tomaron con una gamma
cámara utilizando un colimador tipo pinhole. Finalmente, se llevó a cabo la
disección completa de los órganos para determinar el porcentaje de actividad
inyectada por gramo de tejido (%AI/g) como se describe anteriormente.
3.4. Dosimetría subcelular
La dosis absorbida de radiación depositada en el núcleo de las células PC3,
MCF7 y MDA-MB231 de 99mTc-Tat-BN o 188Re-Tat-BN se estimó por el método
Monte Carlo utilizando el programa Penmain del código PENELOPE 2008. La
geometría y tamaño de las células y núcleo se construyó a partir de las
imágenes de inmunofluorescencia (n=50) y las dimensiones promedio se
determinaron utilizando el Software Zeiss LSM Image Examiner (Carl Zeiss
AG). Los volúmenes de los compartimentos subcelulares se calcularon (tabla 8)
y la composición elemental de la membrana, citoplasma y núcleo se obtuvo de
la literatura (tabla 9) [9,10].
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
91
Tabla 8. Geometría y volumen del citoplasma y núcleo de las células PC3,
MCF7 y MDA-MB231.
Volumen ( µm3) Línea celular
Citoplasma Núcleo Geometría
PC3 (Longitud promedio 80 x 33 µm, profundidad 20 µm: núcleo 23 x
17 µm)*
23048 3568
MCF7 (Longitud promedio 56 x 22 x 49 µm, profundidad 14 µm:
núcleo 16 x 11 µm)*
10239 1112
MDA-MB231 (Longitud promedio 66 x 32 µm, profundidad 17 µm: núcleo 18 x
14 µm)*
16114 1770
*Zeiss LSM Image Examiner Software (Carl Zeiss AG)
Tabla 9. Composición elemental de una célula humana, utilizada para generar
el archivo de material de la simulación por el método Monte Carlo [9,10].
Elementos H C N O P S Otros (Porcentaje en peso)
Núcleo
celular 10.6 9.0 3.2 74.2 2.6 0.4 ---------------
Citoplasma
y
Membrana
10.0 18.0 3.0 65.0 1.0 0.25
Ca(1.5), k(0.35), Na(0.15),
Mg(0.05), Cu, Zn, Se, Mo, F,
Cl, I, Mn, Co, Fe (todos 0.70)
Li, Sr, Al, Si, Pb, V, As, Br
(todos 0.001)
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
92
La simulación de la fuente se realizó utilizando todas las emisiones de
electrones de CI y Auger (incluidos los Coster-Kroning y Super-Coster-Kroning)
del espectro de 99mTc reportado por la AAPM (tabla 10) [11]. La fuente de 188Re
se simuló utilizando las emisiones β con mayor probabilidad de ocurrencia,
electrones CI de más alta probabilidad de emisión y los electrones Auger del
espectro reportado por el Laboratorio Nacional Henri Bequerel de Francia
(tabla 11) [12].
Tabla 10. Espectro de radiación promedio del 99mTc utilizado como fuente en la
simulación por el método Monte Carlo.
Emisión Energía promedio
(MeV) Yield/decaimiento
IC 1 M,N… 1.82E-03 9.91E-01
IC 2 K 1.19E-01 8.43E-02
IC 2 L 1.37E-01 1.36E-02
IC 2 M;N… 1.40E-01 2.50E-03
IC 3 K 1.22E-01 5.90E-03
IC 3 L 1.40E-01 2.50E-03
Auger KLL 1.53E-02 1.26E-02
Auger KLX 1.78E-02 4.70E-03
CK LLX 4.29E-05 1.93E-02
Auger LMM 2.05E-03 8.68E-02
Auger LMX 2.32E-03 1.37E-02
Auger LXY 2.66E-03 1.20E-03
CK MMX 1.16E-04 7.47E-01
Auger MXY 2.26E-04 1.10E+00
CK NNX 3.34E-05 1.98E+00
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
93
Tabla 11. Espectro de radiación promedio del 188Re utilizado como fuente en la
simulación por el método Monte Carlo.
Emisión Energía promedio
(MeV) Yield/decamiento
β 204.30E-03 4.4E-03
β 345.33E-03 6.30E-03
β 527.78E-03 1.65E-02
β 728.88E-03 2.56E-01
β 795.41E-03 7.11E-01
Auger L 6.88E-03 6.95E-02
Auger K 57.107E-03 2.10E-03
CE K 81.17E-03 4.88E-02
CE L 143.10E-03 5.70E-02
CE M 152.50E-03 1.44E-02
La energía depositada (MeV) por desintegración por gramo del núcleo celular
se convirtió a Gy (J/Kg)/desintegración (Bq·s) y la D en el núcleo producida por 99mTc-Tat-BN o 188Re-Tat-BN se calculó multiplicando los Gy/Bq·s por el
número total de desintegraciones (N) que ocurrieron en el núcleo por unidad de
radiactividad (Bq) internalizada, basado en los resultados de la biocinética
experimental. Las contribuciones a la D en el núcleo provenientes de la
captación de los radiofármacos en la membrana y citoplasma también se
calcularon para obtener la D total al núcleo por cada Bq internalizado en las
células de cáncer PC3, MCF7 o MDA-MB231 (Gy/Bq). Los porcentajes de
absorción de cada emisión (espectro, electrones Auger y CI) en cada región
subcelular se calcularon de la siguiente manera:
100*odecaimient por emitida Energía
célula la en absorbida Energía% ====Absorción ec 3.2.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
94
100*célula la en absorbida Energíasubcelular región la en absorbida Energía
% ====ónSubabsorci ec 3.3.
3.5. Referencias
[1] Ferro-Flores, G., Arteaga de Murphy, C., Rodriguez-Cortes, J., Pedraza-Lopez, M.,
Ramirez-Iglesias, M.T., Preparation and evaluation of 99mTc- EDDA/HYNIC-[Lys3]-bombesin for imaging of GRP receptor-positive tumours. Nucl. Med. Commun. 27, 371–376 2006.
[2] Bogdanov, A., Tung, C.-H., Bredow, S.,Weissleder, DNA binding chelates for nonviral gene delivery imaging. Gene Ther. 8, 515–522 R., 2001.
[3] Zhang, X., Cai,W., Cao, F., Schreibmann, E.,Wu, Y.,Wu, J.C., Xing, L., Chen, X., 18F-labeled bombesin analogs for targeting GRP receptor-expressing prostate cancer. J. Nucl. Med. 47, 492–501. 2006.
[4] Zhang, Y.-M., Tung, C.H., He, J., Liu, N., Yanachkov, I., Liu, G., Rusckowski, M., Vanderheyden, J.L., Construction of a novel chimera consisting of achelator-containing Tat peptide conjugated to amorpholino antisense oligomerfor technetium-99m labeling and accelerating cellular kinetics. Nucl. Med. Biol.33, 263–269. 2006.
[5] L.Meléndez Alanfort, G. Ferro Flores, C. Arteaga de Murphy, M. Pedraza-López, M.A. González Zavala, J.I. Tendilla, L. García Salinas Labeling peptides with rhenium-188., Int. J. Pharm. 1999.
[6] Ferro-Flores G, Torres-Garcia E, Garcia-Pedroza L, Arteaga de Murphy C, Pedraza-Lopez M, Garnica-Garza H. An efficient, reproducible and fast preparation of 188Re-anti-CD20 for the treatment of non-Hodgkin's lymphoma. Nucl Med Commun 26:793-799 2005.
[7] Stabin MG, Sparks RB, Crowe E. OLINDA/EXM: The second-generation personal computer software for internal dose assessment in nuclear medicine. J Nucl Med.; 46:1023-7, 2005.
[8] Garcia-Ferreiro RE, Kerschensteiner D, Major F, Monje F, Stumer W, Pardo LA. Mechanism of block of hEag1 K+ channels by imipramine and astemizole. J Gen Physiol.;124:301-17, 2004.
[9] ICRU 44, 1989. Tissue substitutes in radiation dosimetry and measurement. ICRU Report 44- International Commission on Radiation Units and Measurements. , Rodwell V.
[10] Organic Chemistry: The Elemental Basis of Life. John Wiley & Sons Inc. USA, 1979.
[11] Howell R. Radiation Spectra for Auger-Electron Emitting Radionuclides: Report 2 of AAPM Nuclear Medicine Task Group No. 6. Med Phys. 19:1371-83. 1992.
[12] Decay Data Evaluation Project www.nucleide.org/DDEP_WG/DDEPdata.htm BNM-CEA/LNHB-Table de Radionucléides-CEA ISBN 2 7272 0200 8 188 75 Re, LBNL /E. Browne 2002.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
95
Capítulo 4
RESULTADOS
99mTc-N2S2-Tat(49-57)-BN
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
96
4.1 Diseño y preparación 4.1.1 HYNIC-Lys 3-BN En la figura 8 se observa el diseño de la molécula, con el sitio de
reconocimiento biológico de la BN y la zona de quelación con el 99mTc a través
del quelante bifuncional HYNIC.
Figura 8. Estructura de la molécula HYNIC-Lys3-BN.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
97
4.1.2 N2S2-Tat(49-57)-Lys 3-BN En la figura 9 se observa el diseño del N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN. Por un lado
tiene la secuencia de aminoácidos de la Lys3-BN, que contiene el sitio de
reconocimiento específico para su unión con los GRPr, por otro lado, tiene al
péptido Tat(49-57) que le permite a la molécula internalizarse al citoplasma y
llegar hasta el núcleo celular y finalmente el sitio de quelación con el 99mTc.
Figura 9. Estructura de la molécula N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
98
4.2 Modelaje Molecular: Diseño de (Acm) 2S2N2-Tat-Lys 3-BN, Tc(O)S 2N2-
Tat-Lys 3-BN por cálulos semiempíricos
Un buen modelaje molecular genera estructuras que son similares a aquellas
que se obtienen experimentalmente. Sin embargo, este parecido puede verse
afectado por el tamaño, la carga y la movilidad de las moléculas, por ejemplo,
péptidos grandes y cargados. Teniendo en cuenta estas características, el
péptido híbrido N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN (figura 10) se diseñó con cálculos
semiempíricos para estudiar la posibilidad de su formación. Las energías
mínimas de la estructura y confórmero más estables fueron 271 y 233 kcal/mol,
respectivamente. El complejo oxo-Tc que se formó con el péptido híbrido se
modeló considerando dos factores de este tipo de sitio quelante:
a) Los dos tioles terminales S2(Acm)2 se pueden ionizar si se remueve el
acetamindometil de los grupos protectores [13, 14].
b) Los grupos amina pueden fácilmente disminuir la pérdida de protones [14].
Entonces se espera que el sitio de quelación forme un complejo coordinado
[N2S2]4- alrededor del núcleo de [Tc(O)]3
+, formando de esta manera un
complejo con carga negativa cinco-coordinado. Con base en esto se calculó la
molécula del complejo peptídico [TcO(N2S2)]-1-Tat(49-57)-Lys3-BN (figura 10)
utilizando el confórmero más estable de la molécula del péptido híbrido. La
energía mínima de la estructura optimizada fue 300 kcal/mol y la del
confórmero más estable igual a 262 kcal/mol. En la tabla 12 se dan algunos
parámetros geométricos de este complejo.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
99
Tabla 12. Distancias de enlace de los complejos calculados Tc(O)-N2S2-Tat-
Lys3-BN utilizando los métodos semiempíricos MM3 aumentado y Conflex.
Compuesto Geometría Distancias de
enlace (Å)
Radio del enlace
Tc-N1: 2.314
RN = 1.003
Tc-N2: 2.308 RS = 1.003
Pirámide cuadrada
distorcionada
Tc-S1: 2.618 TcN2/TcO =1.04
Tc-S2: 2.611 TcS1/TcO = 1.19
Tc=O: 2.210
[99mTc(O)-(N2S2)]-1-Tat-Lys3-BN
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
100
Figura 10. (A) Confórmero más estable de la molécula del péptido híbrido N2S2-
Tat(49-57)-Lys3-BN modelada utilizando CONFLEX. (B) Confórmero más
estable de la molécula del péptido híbrido Tc(O)N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN
modelada utilizando CONFLEX. Se muestra la geometría expandida del sitio
de quelación del Tc(O): [Tc(O)N2S2].
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
101
4.3 Evaluación de la pureza radioquímica de 99mTc-N2S2-Tat(49-57)-Lys 3-BN
(99mTc-Tat-BN)
Los resultados de la pureza radioquímica de 99mTc-Tat-BN obtenidos por ITLC,
Sep-Pak y HPLC (figura 11) mostraron una pureza radioquímica promedio de
92 ± 2 % (n>30) y permaneció estable hasta las 24 h sin purificación posterior
al radiomarcado (figura 12). La actividad específica promedio fue de
14 MBq/nmol.
Figura 11. (A) HPLC de exclusión molecular, se representa el cromatrograma-
UV 3D del péptido Tat-BN. (B) Radiocromatograma de 99mTc-Tat-BN 2 h
posteriores al radiomarcado.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
102
Figura 12. Radiocromatogramas HPLC en fase reversa de 99mTc-Tat-BN recién
marcado y 24 horas posteriores a la preparación (a temperatura ambiente).
4.4 Estabilidad en suero humano de 99mTc-Tat-BN
La pureza radioquímica del 99mTc-Tat-BN después de la incubación en suero
humano por 1 h fue > 90%, después de 3 y 24 h disminuyó a 82 % y 65 %
respectivamente. La unión a proteínas fue 36.4 ± 2.7 a las 2 h sin trasquelación
del 99mTc a la cisteina (figura 13).
4.5 Desafío a la cisteina
Después de incubar el radiofármaco con cisteina a 37°C con relaciones
molares 5:1, 50:1 y 500:1 de cisteina:péptido, los análisis por ITLC mostraron
que la radiactividad disociada de 99mTc-Tat-BN, 7, 16 y 41% respectivamente
indicando una estabilidad radiofarmacéutica adecuada.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
103
Figura 13. HPLC de exclusión molecular. La línea sólida representa el
cromatograma UV (280 nm) de las proteínas del suero humano y la línea
punteada corresponde al radiocromatograma de 99mTc-Tat-BN después de
incubarlo en suero humano a 37°C durante 2 h .
4.6 Pruebas in vitro
4.6.1 Captación in vitro de 99mTc-Tat-BN
Los resultados de la prueba in vitro mostraron captación en las tres líneas
celulares, PC3, MCF7 y MDA-MB231, cuya especificidad se comprobó al inhibir
la captación con la incubación previa con BN fría (tabla 13). En general la unión
en las células bloqueadas fue menor al 3% del total de actividad para 99mTc-BN
y menor al 9% para el 99mTc-Tat-BN en todos los tiempos. Esto comprueba la
especificidad in vitro de ambos radiofármacos por los GRPr que se localizan en
la membrana de las tres líneas celulares, debido a que ambos compuestos
tienen BN.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
104
Sin embargo, se observa una mayor captación del radiofármaco 99mTc-Tat-BN,
ya que es un híbrido que contiene BN, que se une específicamente a los GRPr
de la membrana, pero además, aumenta la captación e internalización debido
al péptido Tat que tiene la capacidad de internalizar la molécula al citoplasma
celular e incluso llegar hasta el núcleo.
Tabla 13. Captación celular de 99mTc-Tat-BN y 99mTc-BN en diferentes líneas de
cáncer (% del total de actividad ± Desviación estándar (DS)).
PC3 MCF7 MDA-MB231 Tiempo
(h) Tat-BN Hynic-BN Tat-BN Hynic-BN Tat-BN Hynic-BN
0.083 22.01 ± 2.08 10.29 ± 1.47 19.27 ± 3.55 7.83 ± 0.71 24.33 ± 2.82 5.91 ± 0.26
1 21.43 ± 2.91 8.59 ± 0.59 17.43 ± 1.13 6.79 ± 0.45 19.43 ± 1.3 5.48 ± 0.21
2 24.88 ± 2.12 12.85 ± 0.90 18.27 ± 2.14 8.97 ± 0.92 15.98 ± 1.07 5.06 ± 0.57
4 28.10 ± 3.86 17.62 ± 1.86 13.15 ± 1.27 7.48 ± 0.30 14.40 ± 1.79 4.16 ± 0.39
6 25.43 ± 1.79 9.63 ± 0.47 12.65 ± 0.94 7.98 ± 0.22 13.60 ± 0.96 4.19 ± 0.52
24 23.91 ± 1.53 8.21 ± 0.64 12.30 ± 1.16 2.32 ± 0. 49 14.24 ± 0.34 3.43 ± 0.27
4.6.2 Internalización celular de 99mTc-Tat-BN
El aumento en la internalización del radiofármaco 99mTc-Tat-BN, comparado
con el 99mTc-BN, se muestra en las gráficas de internalización de las tres líneas
celulares (figura 14). El máximo de internalización en las células PC3 (figura 14
(A)) y MCF7 (figura 14 (B)) se alcanza entre las 2 y 4 horas de incubación, pero
en las células MDA-MB231 (figura 14 (C)) tiene un comportamiento distinto ya
que disminuye la internalización celular al paso del tiempo y muestra un
máximo de internalización en los primeros minutos de incubación. Estos
resultados comprueban que éste péptido híbrido, tiene la capacidad de
penetrar la membrana celular.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
105
Figura 14. Internalización dependiente del tiempo de 99mTc-Tat-BN y 99mTc-BN
en células de cáncer PC3 (A), MCF7 (B) y MDA-MB231 (C).
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
106
4.6.3 Biodistribución subcelular de 99mTc-Tat-BN
Los porcentajes de actividad internalizada de 99mTc-Tat-BN en cada
compartimento subcelular a diferentes tiempos, se observan en la figura 15
para células PC3, MCF7 y MDA-MB231.
La mayor captación del radiofármaco se produce en el núcleo de las tres líneas
celulares, seguido por el citoplasma y finalmente la membrana. Estos
resultados comprueban que además de la especificidad del radiofármaco
(debido a la BN) hacia las células que sobre expresan el GRPr (PC3, MCF7 y
MDA-MB231), las características que le da el péptido Tat al radiofármaco
híbrido, evidencian la internalización del 99mTc-Tat-BN al citoplasma. Asimismo,
la NLS con la que cuenta el mismo péptido permite que la molécula se mueva
hasta el núcleo a través de los poros perinucleares [12]. Algunas diferencias en
la captación e internalización pueden deberse al origen clonal de las células, al
número de pases que hayan tenido al momento de la realización del
experimento, así como a la diferencia en el número de receptores que expresa
cada línea celular.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
107
Figura 15. Biocinética del 99mTc-Tat-BN en membrana, citoplasma y núcleo de
células de cáncer PC3 (A), MCF7 (B) y MDA-MB231 (C).
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
108
4.6.4 Modelos biocinéticos subcelulares de 99mTc-Tat-BN
En la tablas 14, 15 y 16 se muestran los modelos biocinéticos del 99mTc-Tat-BN
en membrana, citoplasma y núcleo de las células de cáncer PC3, MCF7 y
MDA-MB231 respectivamente. Así como el número total de desintegraciones
(N = Bq·s) por cada Bq de 99mTc captado en la célula, que ocurrieron en cada
compartimento subcelular a tiempo infinito al integrar sobre el tiempo, cada
modelo biocinético.
Tabla 14. Modelo biocinético y numero total de desintegraciones de 99mTc-Tat-BN en células de cáncer PC3.
Región celular
Modelo Biocinético A(t) [Bq]
(N) Número total de
desintegraciones [Bq·s]
Membrana 956.0
31.163.84.41)(2
0427.085.0847.0
====
++++++++==== −−−−−−−−−−−−
R
eeetA ttt
3229
Citoplasma 998.0
4.274.315.45)(2
295.0137.0579.0
====
++++++++−−−−==== −−−−−−−−−−−−
R
eeetA ttt
8766
Núcleo 994.0
9.634.548.91)(2
321.0123.0628.0
====
++++++++−−−−==== −−−−−−−−−−−−
R
eeetA ttt
17826
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
109
Tabla 15. Modelo biocinético y numero total de desintegraciones de 99mTc-Tat-BN en células de cáncer MCF7.
Región celular
Modelo Biocinético A(t) [Bq]
(N) Número total de
desintegraciones [Bq·s]
Membrana 987.0
74.202.48.63)(2
0747.0075.01.1
====
++++++++==== −−−−−−−−−−−−
R
eeetA ttt
5338
Citoplasma 998.0
4.5965.860)(2
285.00871.0508.0
====
++++++++−−−−==== −−−−−−−−−−−−
R
eeetA ttt
6826
Núcleo 990.0
7.819.45103)(2
327.0103.0630.0
====
++++++++−−−−==== −−−−−−−−−−−−
R
eeetA ttt
19151
Tabla 16. Modelo biocinético y numero total de desintegraciones de 99mTc-Tat-BN en células de cáncer MDA-MB231.
Región celular
Modelo Biocinético A(t) [Bq]
(N) Número total de
desintegraciones [Bq·s]
Membrana 1
4.1983.68.19)(2
277.00948.031.2
====
++++++++−−−−==== −−−−−−−−−−−−
R
eeetA ttt
4810
Citoplasma 976.0
35.57.2582.1)(2
0848.00847.0353.0
====
++++++++==== −−−−−−−−−−−−
R
eeetA ttt
13380
Núcleo 1
3.128.41188)(2
0784.0183.083.6
====
++++++++−−−−==== −−−−−−−−−−−−
R
eeetA ttt
12880
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
110
Como se observa en las tablas anteriores la mayoría de los modelos
biocinéticos muestran que el mayor número de desintegraciones del 99mTc
ocurren en el núcleo de las tres líneas celulares de cáncer.
El mayor número de desintegraciones que ocurren en el citoplasma de las
células MDA-MB231 con respecto a las del citoplasma de las células MCF7
(tablas 15 y 16) puede estar asociado con una mayor actividad lisosomal en las
MDA-MB231, porque el proceso de internalización del complejo BN/GRPr
involucra atrapamiento por parte de los lisosomas [15].
4.6.5 Localización in vitro del Tat-BN internalizado en las células de
cáncer por inmunocitoquímica
Las imágenes obtenidas por microscopía confocal de las células PC3, MCF7 y
MDA-MB231 se observan en las figuras 16, 17 y 18. Estas imágenes
demuestran que el Tat-BN se internalizó en el núcleo de las tres líneas
celulares de cáncer utilizadas en este estudio. En las imágenes control (A) (sin
Tat-BN), el anticuerpo secundario marcado con fluorescencia se internalizó al
citoplasma, pero no al núcleo. Cuando las células fueron estimuladas con el
péptido Tat-BN e incubadas con el anticuerpo primario Anti-Tat y el anticuerpo
secundario marcado con fluorescencia, se observó la fluorescencia en el
núcleo (B) demostrando la internalización nuclear del Tat-BN.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
111
Figura 16. Análisis inmunohistoquímico del Tat-BN en células PC3. A) Imagen
control sin Tat-BN incubadas con anti-Tat y anticuerpo secundario marcado con
fluorescencia B) Células incubadas con Tat-BN, anti-Tat y anticuerpo
secundario marcado con fluorescencia. CF: imagen contraste de fase,
E: excitación a λ=488 nm. El péptido Tat-BN se localizó en el núcleo de las
células, como indican las flechas.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
112
Figura 17. Análisis inmunohistoquímico del Tat-BN en células MCF7. A) Imagen
control sin Tat-BN incubadas con anti-Tat y anticuerpo secundario marcado con
fluorescencia B) Células incubadas con Tat-BN, anti-Tat y anticuerpo
secundario marcado con fluorescencia. CF: imagen contraste de fase,
E: excitación a λ=488 nm. El péptido Tat-BN se localizó en el núcleo de las
células, como indican las flechas.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
113
Figura 18. Análisis inmunohistoquímico del Tat-BN en células PC3. A) Imagen
control sin Tat-BN incubadas con anti-Tat y anticuerpo secundario marcado con
fluorescencia B) Células incubadas con Tat-BN, anti-Tat y anticuerpo
secundario marcado con fluorescencia. CF: imagen contraste de fase,
E: excitación a λ=488 nm. El péptido Tat-BN se localizó en el núcleo de las
células, como indican las flechas.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
114
4.6.6 Efecto del 99mTc-Tat-BN sobre la proliferación celular
El efecto del 99mTc-Tat-BN en la proliferación celular a diferentes
concentraciones (5.4 o 8.1 MBq) se estudió en células de cáncer (figura 19).
Como se muestra en la figura 19, el 99mTc-Tat-BN (5.4 MBq) inhibió
significativamente la proliferación de células MDA-MB231 (35.80 %), MCF7
(45.71 %) y PC3 (52.98 %) con respecto a las células no tratadas (p < 0.05).
Sin embargo, en presencia de 1.3 y 2.0 µM de Tat-BN se observó incremento
en la proliferación celular debido a la actividad mitogénica del Tat [16] y esta
puede ser la razón por la cual aparentemente 8.1 MBq (2.0 µM de Tat) de 99mTc
no es más efectivo que 5.4 MBq (1.3 µM de Tat) para reducir la concentración
de ADN. No obstante, se puede deducir que en el caso del radiofármaco 99mTc-
Tat-BN el efecto antiproliferativo del 99mTc (por electrones CI y Auger)
prevalece sobre el efecto mitogénico del Tat (figura 19).
La actividad mitogénica del Tat puede explicar también la baja concentración
de ADN que se obtiene con astemizol (inhibidor del proceso de proliferación
celular) comparado con el del 99mTc-Tat-BN en las células PC3 y MDA-MB231.
Sin embargo, la proliferación en células MCF7 fue similar con 99mTc-Tat-BN que
con el tratamiento con astemizol. Estos datos se correlacionan bien con los
resultados de la biocinética (Tablas 14, 15 y 16) del radiofármaco.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
115
Figura 19. Efecto del Tat-BN y 99mTc-Tat-BN sobre la proliferación celular: la
proliferación se correlaciona directamente con la concentración de ADN
(ng/mL).
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
116
4.7 Pruebas in vivo
4.7.1 Estudios de Biodistribución in vivo de 99mTc-Tat-BN
La biodistribución del 99mTc-Tat-BN se muestra en la tabla 17. Se observa
excreción renal predominantemente pero también se presenta eliminación
hepatobiliar. Los pulmones presentaron captación del radiofármaco debido a
que los GRPr están expresados de manera natural en dicho órgano [17]. Sin
embargo, el páncreas mostró mayor captación que otros órganos no excretores
como el bazo, músculo, e incluso pulmones debido a la presencia de los GRPr,
indicando que la BN actúa como el sitio de reconocimiento biológico específico.
Tabla 17. Biodistribución del 99mTc-Tat-BN en ratones sanos BALB/c a
diferentes tiempos post administración del radiofármaco (n=3 en cada tiempo).
% AI/g (promedio ± DS) Órgano
0.25 h 0.5 h 2 h 4 h 24 h
Sangre
Corazón
Pulmones
Hígado
Bazo
Páncreas
Riñones
Intestino
Músculo
Hueso
7.81±2.62
2.43±0.78
2.68±0.94
4.91±1.57
1.28±0.40
2.89±1.01
16.87±4.85
3.70±1.49
1.47±0.26
2.44±0.79
6.02±2.59
1.62±0.63
2.26±0.44
3.97±1.70
0.80±0.30
2.65±0.77
22.99±8.57
11.30±7.71
1.28±0.70
1.74±0.60
1.12±0.17
0.33±0.07
0.60±0.08
2.03±0.04
0.35±0.05
1.87±0.11
29.02±2.78
2.06±0.33
0.58±0.23
0.42±0.05
1.00±0.03
0.32±0.03
0.56±0.04
2.11±0.32
0.55±0.17
1.43±0.24
27.72±2.18
2.05±0.98
0.43±0.14
0.78±0.26
0.07±0.02
0.09±0.10
0.09±0.03
0.52±0.17
0.23±0.07
0.21±0.04
8.45±0.81
0.17±0.08
0.03±0.02
0.19±0.17
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
117
4.7.2 Imágenes de ratónes atímicos con tumores indu cidos PC3
La tabla 18 muestra la biodistribución en ratones atímicos con tumores
inducidos de la línea celular de cáncer de próstata humano PC3. Las razones
tumor/sangre, tumor/músculo y páncreas/sangre para el 99mTc-BN fueron de
4.4, 7 y 8.2 respectivamente y 3.2, 8 y 1.4 para el 99mTc-Tat-BN
respectivamente. Las imágenes in vivo muestran captación en el tumor. La
disección completa de los órganos remarcó la captación del 99mTc-Tat-BN
(figura 20 (A)) y 99mTc-BN (figura 20 (B)) en el tumor de células PC3. La razón
tumor/músculo obtenida a partir de las cuentas por pixel de la imagen
correspondientes a 99mTc-BN fue de 7 y de 8.5 para 99mTc-Tat-BN,
demostrando que diferencia entre los dos radiofármacos utilizados no es
estadísticamente significativa.
Tabla 18. Biodistribución de 99mTc-BN y 99mTc-Tat-BN en ratones atímicos con
tumores inducidos PC3, 2 h posteriores a la administración de los
radiofármacos (n=3).
% AI/g (Promedio ± DS) Órgano
99mTc-BN 99mTc-Tat-BN
Sangre 0.40±0.03 1.22±0.16
Corazón 0.25±0.02 0.43±0.08
Pulmón 0.50±0.04 0.54±0.07
Hígado 0.85±0.04 2.14±0.05
Bazo 0.40±0.05 0.42±0.04
Páncreas 3.29±0.21 1.69±0.12
Riñones 23.5±1.21 28.12±2.18
Intestino 0.85±0.13 1.96±0.23
Músculo 0.25±0.03 0.48±0.05
Tumor 1.75±0.11 3.84±0.25
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
118
Figura 20. Captación de (A) 99mTc-Tat-BN y (B) 99mTc-BN en tumores inducidos
de la línea celular de cáncer de próstata humano PC3 en ratones atímicos 2 h
posteriores a la administración de los radiofármacos (la disección de los
órganos remarcó la captación en los tumores).
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
119
4.8 Dosis absorbida celular de 99mTc-Tat-BN
Al estimar la dosis absorbida de 99mTc-Tat-BN, utilizando el método Monte
Carlo, con el código PENELOPE 2008, se pudo obtener la dosis absorbida en
cada compartimento subcelular por cada desintegración del radionúclido
(Gy/Bq·s), y al multiplicarlo por el número total de desintegraciones (Bq·s) se
obtuvieron los Gy/Bq la dosis absorbida en el núcleo y citoplasma celular
normalizado por cada unidad de actividad captada en la célula (Bq) (Tablas 19,
22 y 25 en células PC3, MCF7 y MDA-MB231 respectivamente).
También se obtuvieron las contribuciones de cada emisión (electrones Auger y
CI) a la dosis absorbida total en cada compartimento subcelular (Tablas 20, 23
y 26 en células PC3, MCF7 y MDA-MB231 respectivamente).
Del mismo modo a partir de la energía total emitida de cada tipo de emisión
(electrones Auger o CI), así como de la energía total emitida del espectro
completo utilizado (electrones Auger y CI) y de la porción de energía absorbida
en el núcleo y citoplasma de las células simuladas, se calculó el porcentaje de
absorción y subabsorción en la célula, de las ecuaciones 3.2 y 3.3 (Tablas 21,
24 y 27 en células PC3, MCF7 y MDA-MB231 respectivamente).
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
120
4.8.1 Dosis absorbida de 99mTc-Tat-BN en células PC3
Tabla 19. Dosis absorbida de 99mTc-Tat-BN en células PC3.
Posición
de la
fuente
Blanco Dosis Absorbida
(Gy/Bq ·s)
Dosis Absorbida
(Gy/Bq)
Núcleo 2.25E-06 ± 2.25E-08 4.02E-02 ± 4.00E-04
Citoplasma 2.21E-05 ± 4.90E-08 1.94E-01 ± 4.30E-04
Membrana
Citoplasma
1.44E-06 ± 2.36E-08 4.65E-03 ± 7.63E-05
Total 2.58E-05 ± 9.51E-08 Total 2.39E-01 ± 9.06E-04
Núcleo 1.39E-04 ± 2.90E-07 2.47E+00 ± 5.17E-03
Citoplasma 2.43E-06 ± 5.99E-08 2.13E-02 ± 5.25E-04
Membrana
Núcleo
1.13E-06 ± 4.12E-08 3.64E-03 ± 1.33E-04
Total 1.42E-04 ± 3.91E-07 Total 2.50E+00 ± 5.83E-03
Tabla 20. Dosis absorbida de electrones CI y Auger del 99mTc en citoplasma y
núcleo de células PC3 y porcentaje de contribución a la dosis total absorbida
de radiación.
Blanco Tipo de
emisión
Dosis Absorbida
(Gy/Bq ·s)
% de
contribución
CI 1.92E-05 ± 3.15E-08 74.47 Citoplasma
Auger 6.41E-06 ± 3.70E-08 24.83
CI 1.01E-04 ± 8.88E-08 70.82 Núcleo
Auger 4.04E-05 ± 2.06E-07 28.40
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
121
Tabla 21. Porcentaje de absorción y de subabsorción de las emisiones del
espectro de 99mTc utilizado en la simulación por el método Monte Carlo en
células PC3, cuando la fuente se localizó en el centro del núcleo.
Espectro Electrones CI Electrones Auger
Blanco
subcelular
%
Absorción
%
Subabsorción
%
Absorción
%
Subabsorción
%
Absorción
%
Subabsorción
Citoplasma 1.99 9.19 2.06 12.21 0.00 0.00
Núcleo 18.97 87.54 14.10 83.40 99.83 100.00
Membrana 0.71 3.27 0.74 4.39 0.00 0.00
Total 21.67 16.91 99.83
4.8.2 Dosis absorbida de 99mTc-Tat-BN en células MCF7
Tabla 22. Dosis absorbida de 99mTc-Tat-BN en células MCF7.
Posición
de la
fuente
Blanco Dosis Absorbida
(Gy/Bq ·s)
Dosis Absorbida
(Gy/Bq)
Núcleo 4.09E-06 ± 4.26E-08 7.84E-02 ± 8.15E-04
Citoplasma 4.80E-05 ± 1.01E-07 3.27E-01 ± 6.90E-04
Membrana
Citoplasma
4.71E-06 ± 5.72E-08 2.51E-02 ± 3.05E-04
Total 5.68E-05 ± 2.01E-07 Total 4.31E-01 ± 1.81E-03
Núcleo 4.25E-04 ± 8.82E-07 8.13E+00 ± 1.69E-02
Citoplasma 6.55E-06 ± 1.64E-07 4.47E-02 ± 1.12E-03
Membrana
Núcleo
2.92E-06 ± 1.04E-07 1.56E-02 ± 5.56E-04
Total 4.34E-04 ± 1.15E-06 Total 8.19E+00 ± 1.86E-02
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
122
Tabla 23. Dosis absorbida de electrones CI y Auger del 99mTc en citoplasma y
núcleo de células MCF7 y porcentaje de contribución a la dosis total absorbida
de radiación.
Blanco Tipo de
emisión
Dosis Absorbida
(Gy/Bq ·s)
% de
contribución
CI 4.16E-05 ± 5.80E-08 73.29 Citoplasma
Auger 1.50E-05 ± 1.01E-07 26.41
CI 3.03E-04 ± 2.05E-07 69.83 Núcleo
Auger 1.29E-04 ± 6.83E-07 29.83
Tabla 24. Porcentaje de absorción y de subabsorción de las emisiones del
espectro de 99mTc utilizado en la simulación por el método Monte Carlo en
células MCF7, cuando la fuente se localizó en el centro del núcleo.
Espectro Electrones CI Electrones Auger
Blanco
subcelular
%
Absorción
%
Subabsorción
%
Absorción
%
Subabsorción
%
Absorción
%
Subabsorción
Citoplasma 1.61 7.86 1.66 10.54 0.62 0.62
Núcleo 18.10 88.52 13.29 84.50 99.26 99.38
Membrana 0.74 3.63 0.78 4.96 0.00 0.00
Total 20.44 15.73 99.87
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
123
4.8.3 Dosis absorbida de 99mTc-Tat-BN en células MDA-MB231
Tabla 25. Dosis absorbida de 99mTc-Tat-BN en células MDA-MB231.
Posición
de la
fuente
Blanco Dosis Absorbida
(Gy/Bq ·s)
Dosis Absorbida
(Gy/Bq)
Núcleo 3.04E-06 ± 3.04E-08 3.91E-02 ± 3.92E-04
Citoplasma 3.14E-05 ± 6.93E-08 4.20E-01 ± 9.27E-04
Membrana
Citoplasma
2.01E-06 ± 3.21E-08 9.66E-03 ± 1.54E-04
Total 3.64E-05 ± 1.32E-07 Total 4.69E-01 ± 1.47E-03
Núcleo 2.71E-04 ± 5.69E-07 3.49E+00 ± 7.33E-03
Citoplasma 3.31E-06 ± 9.46E-08 4.44E-02 ± 1.27E-03
Membrana
Núcleo
1.34E-06 ± 6.08E-08 6.43E-03 ± 2.92E-04
Total 2.76E-04 ± 7.25E-07 Total 3.54E+00 ± 8.89E-03
Tabla 26. Dosis absorbida de electrones CI y Auger del 99mTc en citoplasma y
núcleo de células MDA-MB231 y porcentaje de contribución a la dosis total
absorbida de radiación.
Blanco Tipo de
emisión
Dosis Absorbida
(Gy/Bq ·s)
% de
contribución
CI 2.69E-05 ± 4.14E-08 73.91 Citoplasma
Auger 9.29E-06 ± 5.63E-08 25.48
CI 1.93E-04 ± 1.33E-07 70.15 Núcleo
Auger 8.13E-05 ± 4.14E-07 29.48
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
124
Tabla 27. Porcentaje de absorción y de subabsorción de las emisiones del
espectro de 99mTc utilizado en la simulación por el método Monte Carlo en
células MDA-MB231, cuando la fuente se localizó en el centro del núcleo.
Espectro Electrones CI Electrones Auger
Blanco
subcelular
%
Absorción
%
Subabsorción
%
Absorción
%
Subabsorción
%
Absorción
%
Subabsorción
Citoplasma 1.88 8.95 1.99 12.21 0.09 0.09
Núcleo 18.40 87.86 13.59 83.36 99.75 99.91
Membrana 0.67 3.18 0.72 4.43 0.00 0.00
Total 20.94 16.30 99.83
4.8.4 Resumen de dosis absorbida de 99mTc-Tat-BN en células de cáncer
Tabla 28. Dosis absorbida (Gy/Bq) de 99mTc-Tat-BN en núcleo y citoplasma de
células de cáncer.
Dosis Absorbida (Gy/Bq) Línea Celular
Citoplasma Núcleo
PC3 0.2389 ± 0.0009 2.4973 ± 0.0058
MCF7 0.4309 ± 0.0018 8.1918 ± 0.0185
MDA 0.4688 ± 0.0014 3.5437 ± 0.0088
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
125
Tabla 29. Promedio del porcentaje de contribución a la dosis absorbida en
citoplasma y núcleo de las células PC3, MCF7 y MDA-MB231 de electrones CI
y Auger de 99mTc.
Blanco Tipo de
emisión
% de contribución a la
Dosis Absorbida
CI 73.89 ± 0.40 Citoplasma
Auger 25.57 ± 0.56
CI 70.27 ± 0.37 Núcleo
Auger 29.24 ± 0.56
Tabla 30. Promedio del porcentaje de absorción y subabsorción de energía de
electrones CI y Auger de 99mTc en citoplasma y núcleo de las células PC3,
MCF7 y MDA-MB231.
Espectro Electrones CI Electrones Auger Blanco
subcelular %
Absorción
%
Subabsorción
%
Absorción
%
Subabsorción
%
Absorción
%
Subabsorción
Citoplasma 1.82 ± 0.15 8.67 ± 0.54 1.90 ± 0.16 11.66 ± 0.74 0. 23 ± 0.25 0.23 ± 0.25
Núcleo 18.49 ± 0.32 87.97 ± 0.36 13.66 ± 0.29 83.75 ± 0.50 99.61 ± 0.24 99.76 ± 0.26
Membrana 0.71 ± 0.03 3.36 ± 0.18 0.75 ± 0.02 4.59 ± 0.24 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00
Total 21.02 ± 0.43 16.31 ± 0.39 99.85 ± 0.02
Podemos observar que las dosis absorbidas en el núcleo se calcularon como la
suma de las contribuciones de la dosis producida por la actividad de la
membrana al núcleo (N←M), más la dosis del citoplasma al núcleo (N←C),
más la del núcleo al núcleo (N←N). Por ejemplo en las células MCF7, la
contribución a la dosis absorbida en el núcleo de la actividad en la membrana
fue de 0.0155 ± 0.0005 Gy/Bq, la dosis absorbida del citoplasma al núcleo fue
de 0.0447 ± 0.0011 Gy/Bq y la dosis absorbida de núcleo a núcleo fue de
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
126
8.1315 ± 0.0168 Gy/Bq, entonces la dosis absorbida total en el núcleo de las
células MCF7 fue de 8.1918 ± 0.0185 Gy por unidad de actividad unida a la
célula (1Bq).
Es importante mencionar que en general una dosis aguda de 2 Gy puede matar
al 50% de una muestra de células in vitro, pero es necesaria una dosis aguda
de 100 Gy para matar a todas las células. Los electrones CI del 99mTc
depositan 13.66 ± 0.29 % del total de energía que emiten por desintegración
dentro de las dimensiones del núcleo celular. No obstante, en todos los casos
el promedio de la contribución a la dosis absorbida en el núcleo celular de los
electrones CI fue de 70.26 ± 0.36% y de los electrones Auger fue de 29.23 ±
0.55%, debido a la baja energía y rendimiento de emisión por decaimiento de
los electrones Auger. Estos resultados quieren decir que, por ejemplo en las
células PC3 (total de dosis absorbida al núcleo = 2.49 Gy/Bq), la dosis
absorbida al núcleo por contribución Auger fue de 0.73 Gy/Bq, mientras que por
contribución de electrones CI fue de 1.75 Gy/Bq. A pesar de que la mayor
contribución a la dosis absorbida al núcleo de las células fue de los electrones
CI, los electrones Auger son los que tienen mayor probabilidad de causar daño
al ADN.
4.9 Discusión y Conclusiones Las energías mínimas calculadas para el péptido híbrido Tat-BN son
adecuadas para esta estructura molecular, debido a su tamaño, la complejidad
y la carga del péptido, se imponen repulsiones estéricas y electrostáticas contra
su estabilización a bajas energías mínimas. Sin embargo, la comparación de su
energía mínima (271 kcal/mol) con aquellas estructuras calculadas por otros
autores de péptidos como el UBI(29-41) [18], Tat-Scr [19], 90 y 72-90 kcal/mol,
respectivamente, sugieren que el péptido híbrido tiene que ser estable.
Además, la conformación adquirida por la molécula del péptido no interfiere con
el sitio de reconocimiento específico de la BN. Estos resultados apoyan la
propuesta de que la preparación del péptido híbrido es viable y mantiene su
especificidad.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
127
La estructura peptídica de [TcO(N2S2)]-1-Tat(49-57)-Lys3-BN adquirió en el sitio
de quelación una geometría piramidal cuadrada con el grupo oxo en la posición
apical de la pirámide y el Tc cerca del plano formado por los donadores N2S2
como se muestra en la figura 10. Esta geometría se ha observado por
difracción de rayos x en otros complejos neutrales cinco-coordinados de Tc(O)
o compuestos cargados como los complejos cinco-coordinados Tc(O)N2S2
cargados negativamente [13,14]. La energía mínima de estos complejos no
difiere significativamente del complejo híbrido antes de la coordinación a
[Tc(O)]3+.
En general el radiofármaco 99mTc-Tat-BN no mostró las mejores características
radioquímicas como el 99mTc-BN previamente reportado [1], debido a que el
radiofármaco híbrido (con el péptido Tat(49-57)) mostró menor pureza
radioquímica (>95% para 99mTc-BN) y menor estabilidad en cisteina y suero
humano. Estos resultados se explican debido a que el quelante bifuncional
HYNIC junto con los coligantes han demostrado ser altamente estables para el
marcado de péptidos [20,21]. Sin embargo, la región de unión al Tc que consta
de Gly-Gly-Cys-NH2 o Cys-Gly-Cys-NH2 péptido (para formar un ligante –N2S2-
o -N3S-) se ha utilizado exitosamente para preparar complejos estables con el
Tc=O3+, sin producir alteraciones en la bioactividad de la molécula de acuerdo
con los resultados obtenidos en este trabajo [22-24].
El 99mTc-Tat-BN se une a proteínas plasmáticas en aproximadamente 20% más
que el 99mTc-BN. Estos resultados indican que a pesar de que ambos
radiofármacos contienen BN y están marcados con 99mTc, las cargas positivas
del Tat debido a las argininas y lisinas que contiene en su secuencia de
aminoácidos, tiende a interactuar de modo más rápido y fuerte con las
proteínas, además de que el Tat no está dirigido a un receptor específico [11,
12]. Esta propiedad catiónica es necesaria para penetrar la membrana celular y
localizar al núcleo [25], pero estas características pueden tener efectos en la
tasa de depuración sanguínea por la unión a proteínas plasmáticas así como al
aumento en la interacción e internalización en células y tejido sano (por
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
128
ejemplo, células plasmáticas, bazo e hígado). Aunque la captación en células
de cáncer fue significativamente mayor para 99mTc-Tat-BN que con 99mTc-BN, la
mayor actividad en sangre del primero, no produce incremento significativo en
el contraste de la imagen tumoral en ratones (figura 20).
La captación máxima de ambos radiofármacos en células de cáncer se
presentó a los mismos tiempos, en PC3 a las 4 h (99mTc-Tat-BN, 17.62±1.86%; 99mTc-BN, 28.1±2.86%), en MCF7 a las 2 h (99mTc-BN, 8.97±0.92%; 99mTc-Tat-BN, 18.27±2.14%) y en MDA-MB231 a los 5 min (99mTc-BN,
5.91±0.26%; 99mTc-Tat-BN, 24.33±2.82%) con diferencias sólo atribuibles a la
expresión de GRPr. Es importante mencionar que a pesar de que ambas líneas
celulares, MCF7 y MDA-MB231, son derivadas de cáncer de mama, las
primeras son estrógeno dependientes y las segundas estrógeno
independientes y se ha reportado que la expresión de GRPr es dependiente de
la expresión de receptores de estrógenos en etapas tempranas del cáncer de
mama [26].
La eliminación de los radiofármacos en los tiempos posteriores se debe al
hecho de que el proceso de internalización del complejo BN/GRPr involucra su
captura final por los lisosomas al unirse, donde en el caso de los péptidos son
rápidamente degradados. Debido a la degradación inmediata de los lisosomas,
no se espera que haya acumulación de la radiactividad en las células [15].
En medicina nuclear los receptores proteínicos celulares se consideran blancos
moleculares. En general, la internalización celular fue por medio de un receptor
específico con el 99mTc-BN y en el caso del 99mTc-Tat-BN el 9% del total de
actividad fue no específica como se demostró en los resultados de los
experimentos de células con los GRPr bloqueados debido a la NLS del Tat [12].
Los estudios de biodistribución mostraron una depuración sanguínea lenta del 99mTc-Tat-BN, se observó lo contrario en órganos no blanco, sin embargo, la
captación máxima se presentó en riñones indicando que la excreción fue
principalmente renal.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
129
Estos resultados coinciden con la biodistribución del 99mTc-BN donde la
eliminación fue principalmente renal y la captación en órganos no blanco fue
baja con depuración sanguínea más rápida. Aunque ambos radiofármacos
mostraron buena localización del tumor de células PC3 en ratones atímicos. No
obstante el 99mTc-Tat-BN mostró ligera mejora en la razón tumor/músculo de
8.5 comparada con 7 para el 99mTc-BN.
La captación alta de 99mTc-Tat-BN en riñones y órganos no blanco muestra la
necesidad de utilizar un mejor método para reducir la radiactividad de fondo
que se puede lograr con la co-administración de una infusión de aminoácidos
lisina-arginina como se ha reportado previamente para otros péptidos
radiomarcados [27].
Cálculos de dosis absorbida a nivel subcelular utilizando el método Monte Carlo
han sido reportados previamente, sin embargo se han utilizado modelos de
células esféricas con radios de 1 a 10 µm [28, 29]. Las geometrías y tamaños
de las células utilizadas en este estudio son bastantes diferentes de las esferas
ideales (tabla 8, figuras 16, 17 y 18) y estos parámetros son factores críticos al
evaluar la fracción de energía absorbida de los electrones sobre las
dimensiones nucleares. El hecho de considerar los datos radiofarmacocinéticos
subcelulares, obtenidos experimentalmente en este trabajo, también es un
factor crítico para mejorar la exactitud en los cálculos de dosis absorbida
celular. Aunque se espera que las dimensiones de las células de cáncer in vivo
sean un poco más pequeñas que las muestras in vitro, la cinética de
intenalización nuclear debe ser la misma.
Los electrones Auger de baja energía han sido considerados como las
partículas más adecuadas para la inactivación de células individuales malignas.
Sin embargo, en el caso del 99mTc, los electrones de conversión interna
emitidos con el más alto rendimiento por decaimiento (99.9 – 88 %) y la menor
energía (por ejemplo 1.82 keV) depositan, en promedio, 13.66 % de su energía
sobre las dimensiones del núcleo celular (elipsoides de 23 x 17 µm a 16 x 11
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
130
µm) y fueron los principales contribuyentes a la dosis absorbida nuclear
(70-26 %). Por lo tanto, estas partículas (electrones CI) pueden ser
extremadamente radiotóxicos si fueran capaces de ponerse en contacto con el
ADN.
Lundqvist y cols [30] han demostrado que es importante distinguir entre lo que
puede ser un incremento normal en la dosis celular y el efecto biológico Auger.
Las energías de los electrones cercanas al potencial de ionización (< 30 eV)
solo tendrán un efecto biológico insignificante y los electrones con energías
menores a 5 keV no contribuirán al efecto local. Por ejemplo un electrón Auger
con energía de aproximadamente 20 keV es ideal para que deposite toda su
energía dentro de las dimensiones de una célula humana, pero estará lejos del
ADN y no tendrá impacto en el ADN local que usualmente está asociado al
efecto biológico Auger, lo cual ocurre dentro de nanómetros cúbicos.
Recientemente Tavares y Tavares [31] calcularon que los electrones CKMMX
(todas las transiciones Coster Kronig-CK y super CK del orbital M) del 99mTc y
los electrones Auger MXY (todas las transiciones Auger del orbital M) si están
cercanos al ADN tienen un potencial terapéutico comparable al de las
partículas α del 211At (LET alto).
Los resultados presentados aquí demostraron que el 99mTc-Tat-BN se
internalizó en células de cáncer con reconocimiento específico por GRPr. En
general, los análisis inmunohistoquímicos mostraron incremento en la
abundancia del Tat-BN en el núcleo, evento que se asoció con la inhibición de
la proliferación celular como resultado de los electrones Auger y CI de baja
energía del 99mTc-Tat-BN dentro del núcleo.
El efecto biológico de los electrones Auger y CI de baja energía no es la única
propiedad terapéutica posible del 99mTc-Tat-BN porque la dosis absorbida de
radiación puede también causar daño a membranas y organelos de tal manera
que se inicie la señalización de rutas apoptóticas dentro de las células [32, 33].
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
131
El ligante CD95 es un miembro de la familia de citosinas relacionadas con el
factor de necrosis tumoral y se ha encontrado tanto en forma soluble como
unido a la membrana. Varios estudios han demostrado que la activación del
receptor de la muerte celular y de su receptor, induce apoptosis. Freisen y cols
[33] reportaron que después de la irradiación de células de leucemia, se
detectó una sobre regulación del ligante CD95 y de su receptor, junto con la
consecuente activación de las caspasas. Además, el daño mitocondrial debido
a la irradiación, resulta en la perturbación del potencial de membrana
mitocondrial, liberación del citocromo c y activación de la caspasa 9. También
se ha demostrado que la incorporación de 125I (24.9 electrones
Auger/decaimiento) en el ADN induce apoptosis vía la caspasa 3 [34]. El efecto
bystander de la radiación igualmente juega un papel importante en la
radioterapia de blancos moleculares con electrones Auger [35].
Es notable mencionar que la prueba de proliferación utilizando ADN provee un
indicador más exacto del número relativo de células, pero puede reflejar tanto
el arresto del ciclo celular como la apoptosis; por lo tanto, la evaluación del
efecto pro-apoptótico del 99mTc-Tat-BN y del Tat-BN deben ser tomados en
cuenta y requieren más investigación.
Los péptidos con NLS se han utilizado exitosamente para transportar diferentes
moléculas al núcleo celular [36-39]. Se ha demostrado que la conjugación de
un NLS a 111In-HuM195 (anti-CD33) y a 111In-trastuzumab (anti-HER2)
incrementa considerablemente la captación nuclear en células de cáncer de
mama y de leucemia, aumentando así su toxicidad [36,37]. Es posible que en
todos estos radiofármacos híbridos, las cargas positivas del Tat(49-57) o de
cualquier péptido con NLS, una interacción electrostática con el ADN cargado
negativamente, produce toxicidad celular a partir de un efecto biológico Auger y
no solo por el simple incremento en la dosis absorbida macroscópica.
Es importante mencionar que una de las ventajas de utilizar 99mTc (T1/2= 6h)
con respecto al 111In (T1/2= 67h) es su vida media corta; el 99mTc es capaz de
producir un mayor número de desintegraciones en unas pocas horas y alcanzar
dosis absorbidas más altas por unidad de tiempo.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
132
El radiofármaco híbrido 99mTc-Tat-BN puede ser utilizado en radioterapia de
blancos moleculares como parte de un esquema de terapia combinada. La
resistencia a múltiples fármacos (MDR) en células de cáncer es el desarrollo
simultáneo de resistencia a varios agentes anti-cancerígenos; un mecanismo
de acción MDR es el aumento en el flujo de agentes quimioterapéuticos por
transporte de proteínas. La expresión de la proteína de resistencia en el cáncer
de mama media este flujo de salida del fármaco como MDR [40]. Los análogos
de la BN citotóxicos en combinación con otros péptidos han sido utilizados
exitosamente para inhibir la proliferación de células de cáncer con MDR [40-
42]. Como un ejemplo de terapia combinada, Constantini y cols [43]
demostraron que el 111In-NLS-Trastuzumab puede matar células de cáncer de
mama resistentes al trastuzumab a través de la emisión de electrones Auger en
combinación con methotrexate para radiosensibilización de las células.
Por lo tanto, se puede concluir que el 99mTc-Tat-BN se ha desarrollado como un
radiofármaco híbrido compuesto de un péptido de internalización y con la
capacidad de reconocimiento específico (Tat conjugado a la BN), al producir
una molécula radiomarcada estable capaz de atravesar la barrera lipofílica de
la membrana plasmática, con alta internalización a células de cáncer GRPr+.
Por lo tanto este híbrido puede ser útil para la obtención de imágenes de
cáncer de próstata y mama. La presencia del Tat(49-57) transportó
eficientemente al radiofármaco al núcleo de células PC3 y células de cáncer de
mama MCF7 y MDA-MB231, donde el rango de nanómetros a micrómetros de
los electrones Auger y de conversión interna reducen significativamente la
proliferación celular depositando dosis absorbidas de 0.142 mGy/Bq·s a
0.434 mGy/Bq·s. El radiofármaco puede ser utilizado como un agente
terapéutico en cáncer de mama y próstata como parte de un esquema de
terapia combinada.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
133
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Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
136
Capítulo 5
Resultados
188Re-N2S2-Tat(49-57)-BN
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
137
5.1 Diseño y preparación
El fármaco N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN se diseñó y preparó como se muestra en
la figura 21. Cuenta con la Lys3-BN que contiene el sitio de reconocimiento
específico para unirse con los GRPr, tiene al péptido Tat(49-57) para
internalizar a la molécula al citoplasma e incluso hasta el núcleo y tiene el sitio
de quelación con el 188Re.
Figura 21 Estructura de la molécula N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
138
5.2 Modelaje Molecular: Diseño de Re(O) 2S2N2-Tat-Lys 3-BN por cálculos
semiempíricos
El complejo oxo-renio que se formó con el péptido híbrido, se modeló
considerando dos factores de este tipo de sitio quelante:
a) Los dos tioles terminales S2(Acm)2 se pueden ionizar si se remueve el
acetamindometil de los grupos protectores [12,13].
b) Los grupos amina pueden fácilmente disminuir la pérdida de protones [13].
Se espera que el sitio de quelación forme un complejo coordinado [N2S2]4-
alrededor del núcleo de [Re(O)]3+, de esta manera se forma un complejo con
carga negativa cinco-coordinado. La molécula del complejo
[ReO(N2S2)]-1-Tat(49-57)-Lys3-BN se calculó (figura 22) con el confórmero más
estable de la molécula del péptido híbrido. La energía mínima de la estructura
optimizada fue de 300 kcal/mol y la del confórmero más estable igual a
262 kcal/mol. En la tabla 31 se dan algunos parámetros geométricos de este
complejo.
Tabla 31. Distancias de enlace de los complejos calculado
Re(O)-N2S2-Tat-Lys3-BN utilizando los métodos semiempíricos MM3
aumentado y CONFLEX.
Compuesto Geometría Distancias de
enlace (Å)
Radio del enlace
Re-N1: 2.314 RN = 1.003
Re-N2: 2.308 RS = 1.003
Pirámide cuadrada
distorcionada
Re-S1: 2.618 ReN2/ReO =1.04
Re-S2: 2.611 ReS1/ReO =1.19
[188Re(O)-(N2S2)]-1-Tat-Lys3-BN
Re=O: 2.210
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
139
Figura 22. (A) Confórmero más estable de la molécula del péptido híbrido
N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN modelada utilizando CONFLEX. (B) Confórmero más
estable de la molécula del péptido híbrido Re(O)N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
140
modelada utilizando CONFLEX. Se muestra la geometría expandida del sitio
de quelación del Re(O): [Re(O)N2S2].
5.3 Evaluación de la pureza radioquímica de 188Re-N2S2-Tat(49-57)-Lys 3-BN
(188Re-Tat-BN)
Las mejores condiciones para el marcado de Tat-BN con 188Re fueron con
50 µL de péptido (figura 23) ya que al incrementar la concentración de péptido
fue posible estabilizar el perrenato reducido que puede ser reoxidado
fácilmente a 188ReO4-. El factor que más afectó la pureza radioquímica fue el
pH=3, debido a que es necesario marcar en condiciones ácidas que permitan
una reacción redox Re7+/Re5+ reversible [14].
Al utilizar altas concentraciones de cloruro estanoso y grandes cantidades del
ligante débil (tartrato de sodio [tartrato] = 106 mg/mL) se estabiliza al ión
estanoso y al perrenato reducido en la solución. Los 2 mg de ácido ascórbico
sirvieron como antioxidante, porque ayudan al complejo a permanecer estable
hasta las 24 h (figura 24), como Zamora y cols reportaron para la preparación
de 188Re-RC-160 (un análogo de la somatostatina por el método de marcado
directo con tartrato estanoso) [15].
El mejor marcado del Tat-BN con 188Re se llevó a cabo a temperatura ambiente
ya que al calentarlo a 92°C la pureza radioquímica, una hora después de
agregarle el perrenato de sodio, disminuyó de 92% a 74%. A pesar de que
otros autores han marcado péptidos a 92°C y 100°C c on buenos resultados, el
proceso depende de cada molécula [16]. Con el sistema de HPLC y el detector
de radiactividad se obtienen el cromatograma y radiocromatograma asociado
con tiempos de retención de 3-4 min y 10-11 min para 188ReO4- libre y 188Re-
Tat-BN, respectivamente (figura 25). La actividad específica promedio fue de
0.60 MBq/nmol.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
141
0 1 2 3 4 5 24
50
60
70
80
90
100
Pur
eza
radi
oquí
mic
a de
18
8 Re-
Tat
-BN
Tiempo de Reacción (h)
[Tat-Bn] = 0.12 mg/mL [Tat-Bn] = 0.29 mg/mL [Tat-Bn] = 0.54 mg/mL
Figura 23. Influencia de la concentración del péptido sobre la pureza
radioquímica de marcado del Tat-BN (pH=3, [tartrato] = 106 mg/mL, [ácido
ascórbico] = 4.35 mg/mL, 18°C).
0 1 2 3 4 5 2420
30
40
50
60
70
80
90
100
Pur
eza
radi
oquí
mic
a de
18
8 Re-
Tat
-BN
Tiempo de reacción (h)
[Acido ascórbico] = 0 mg/mL [Acido ascórbico] = 4.35 mg/mL
Figura 24. Influencia de la concentración de ácido ascórbico sobre la pureza
radioquímica de marcado del Tat-BN (pH=3, [tartrato] = 106 mg/mL, 18°C).
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
142
La pureza radioquímica del compuesto 188Re-Tat-BN fue de 95 ± 1% (n>30)
obtenida por ITLC, Sep-Pak y análisis por HPLC y se mantuvo estable hasta
las 24 h (figura 25).
Figura 25. (A) HPLC de exclusión molecular, se representa el cromatrograma-
UV 3D del péptido Tat-BN. (B) Radiocromatograma de 188Re-Tat-BN 2 h
posteriores al radiomarcado.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
143
5.4 Estabilidad en suero humano de 188Re-Tat-BN
La pureza radioquímica del 188Re-Tat-BN en suero humano después de 1 h de
incubación a 37°C fue de 95% y disminuyó a 91% y 74 % después de 2 y 24 h
respectivamente. La unión a proteínas fue de 41.2 ± 2.7% a las 2 h sin
trasquelación hacia la cisteina (figura 26).
Figura 26. HPLC de exclusión molecular. La línea sólida representa el
cromatograma UV (280 nm) de las proteínas del suero humano y la línea
punteada corresponde al radiocromatograma de 188Re-Tat-BN después de
incubarlo en suero humano a 37°C durante 2 h.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
144
5.5 Desafío a la cisteina
Después de incubar el radiofármaco con cisteina a 37°C en relaciones molares
de 5:1, 50:1 y 500:1 de cisteina:péptido, los análisis por ITLC mostraron que la
radiactividad disociada de 188Re-Tat-BN fue 12, 19 y 40% respectivamente,
indicando una estabilidad radiofarmacéutica adecuada.
5.6 Pruebas in vitro
5.6.1 Captación in vitro de 188Re-Tat-BN
En la prueba de captación in vitro se muestran diferentes comportamientos en
las tres líneas celulares. En las células PC3 y MDA-MB231 la captación fue
incrementando con el tiempo, sin embargo, en las células MCF7 fue
disminuyendo. Se muestra un incremento del 40% en los tiempos de 2, 4 y 6
horas para las células MDA-MB231, que se debe al aumento en el número de
los GRPr, tal vez por el tratamiento que recibieron al momento de cultivarlas.
Sin embargo en las células MCF7, no se observa tanta captación ya que el
número de GRPr es menor que el de las PC3, que muestran una captación
máxima de 27.23% (tabla 32). La unión del radiofármaco fue específica para
GRPr, la captación inespecífica fue menor del 7% en todos los tiempos.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
145
Tabla 32. Captación celular de 188Re-Tat-BN en las líneas celulares de cáncer
PC3, MCF7 y MDA-MB231 (% del total de actividad ± DS).
Tiempo (h) PC3 MCF7 MDA-MB231
0.083 20.39 ± 0.91 16.35 ± 1.03 18.33 ± 1.04
0.25 22.44 ± 2.57 12.80 ± 0.51 23.92 ± 0.40
0.5 23.51 ± 1.25 11.55 ± 0.89 24.50 ± 1.43
1 27.23 ± 0.26 10.40 ± 0.63 29.85 ± 1.35
2 27.22 ± 1.78 10.84 ± 0.52 40.18 ± 2.03
4 25.86 ± 0.38 10.05 ± 1.38 50.18 ± 2.13
6 24.16 ± 2.27 8.99 ± 0.43 50.55 ± 3.84
24 22.8 ± 3.52 7.47 ± 0.98 40.71 ± 1.23
5.6.2 Internalización celular de 188Re-Tat-BN
La internalización celular de 188Re-Tat-BN resultó ser muy similar en
comportamiento en las líneas celulares PC3 y MDA-MB231 (figura 27 (A) y (C))
ya que en ambas se incrementó con el tiempo, sin embargo, en las células
MCF7 (figura 27 (C)) se observa una gráfica más lineal, con un máximo a las
4 h y disminuyendo muy poco hasta las 24 h. La diferencia se observa en los
porcentajes de internalización del radiofármaco, ya que las MDA-MB231 y las
PC3 inician a las 0.83 h en 9.19 ± 0.25% y 9.44 ± 0.35% respectivamente, pero
a las 2 h las células MDA-MB231 llegan hasta un 25.46 ± 2.01%, llegando a las
6 h a 33.07 ± 3.93% y las PC3 alcanzan su máxima internalización a las 6 h
pero con 19.76 ± 1.44%.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
146
Figura 27. Internalización dependiente del tiempo de 188Re-Tat-BN en células
de cáncer PC3 (A), MCF7 (B) y MDA-MB231 (C).
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
147
La sobreexpresión de receptores de péptidos en tumores humanos es de gran
interés para la obtención de imagen y terapia de cáncer, lo cual se consigue
exitosamente con una máxima internalización y retención de la radiactividad
por las células tumorales. En este estudio se observa la internalización del
radiofármaco 188Re-Tat-BN en las tres líneas celulares. El radiofármaco
presentó un flujo de salida de actividad limitado en todas las líneas de células
tumorales durante el periodo de investigación (24h), presumiblemente debido a
que los GRPr participan en el atrapamiento del trazador en los lisosomas y la
consiguiente degradación por proteasas lisosomales [17-18].
5.6.3 Biodistribución subcelular de 188Re-Tat-BN
La biodistribución subcelular del 188Re-Tat-BN en células PC3, MCF7 y MDA-
MB231 se presenta en la figura 28, donde parecido a lo que sucede con el 99mTc-Tat-BN, el mayor porcentaje de captación del radiofármaco ocurre en el
núcleo de las tres líneas celulares. La diferencia que se presenta en la
internalización entre el 99mTc-Tat-BN y el 188Re-Tat-BN, puede deberse a la
acidez con que se lleva a cabo el marcado de Tat-BN con 188Re, lo que provoca
que la molécula se divida y existan dos marcados, uno de 188Re-Tat-BN que es
el que se internaliza y otro de 188Re-BN que permanece en la membrana
celular.
La internalización del radiofármaco híbrido marcado con 188Re es posible por el
número de aminoácidos básicos presentes en el péptido Tat que interacciona
con los grupos cargados de la bicapa fosfolipídica de la membrana celular,
indicando que el Tat permite que el compuesto llegue al citoplasma y una vez
ahí la NLS permite que se internalice hasta el núcleo celular [19].
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
148
Figura 28. Biocinética del 188Re-Tat-BN en membrana, citoplasma y núcleo en
células de cáncer PC3 (A), MCF7 (B) y MDA-MB231 (C).
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
149
5.6.4 Modelos biocinéticos subcelulares de 188Re-Tat-BN
En las tablas 33, 34 y 35 se muestran los modelos biocinéticos del 188Re-Tat-BN en membrana, citoplasma y núcleo de las células de cáncer PC3,
MCF7 y MDA-MB231 respectivamente, así como el número total de
desintegraciones (Bq·s) de 188Re que ocurrieron en cada compartimento
subcelular
Tabla 33. Modelo biocinético y número total de desintegraciones de 188Re-Tat-BN en células de cáncer PC3.
Región celular Modelo Biocinético A(t) [Bq]
(N) Número total de
desintegraciones [Bq·s]
Membrana 958.0
563.004.21.50)(2
032.00321.0838.0
====
++++++++==== −−−−−−−−−−−−
R
eeetA ttt
5076
Citoplasma 999.0
507.206.57)(2
218.00392.0466.0
====
++++++++−−−−==== −−−−−−−−−−−−
R
eeetA ttt
22824
Núcleo 997.0
727.488.94)(2
244.00401.0561.0
====
++++++++−−−−==== −−−−−−−−−−−−
R
eeetA ttt
48240
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
150
Tabla 34. Modelo biocinético y número total de desintegraciones de 188Re-Tat-BN en células de cáncer MCF7.
Región celular Modelo Biocinético A(t) [Bq]
(N) Número total de
desintegraciones [Bq·s]
Membrana 987.0
11.356.58.63)(2
0365.00366.011.1
====
++++++++==== −−−−−−−−−−−−
R
eeetA ttt
10620
Citoplasma 998.0
408.173.50)(2
256.0039.051.0
====
++++++++−−−−==== −−−−−−−−−−−−
R
eeetA ttt
18504
Núcleo 995.0
9.545.608.92)(2
341.00395.0655.0
====
++++++++−−−−==== −−−−−−−−−−−−
R
eeetA ttt
55800
Tabla 35. Modelo biocinético y número total de desintegraciones de 188Re-Tat-BN en células de cáncer MDA-MB231.
Región celular Modelo Biocinético A(t) [Bq]
(N) Número total de
desintegraciones [Bq·s]
Membrana 1
1.113.1620)(2
039.0278.005.2
====
++++++++−−−−==== −−−−−−−−−−−−
R
eeetA ttt
11988
Citoplasma 997.0
8.168.3222)(2
0306.00886.0314.0
====
++++++++−−−−==== −−−−−−−−−−−−
R
eeetA ttt
30564
Núcleo 1
5.367.188.80)(2
0397.0217.088.4
====
++++++++−−−−==== −−−−−−−−−−−−
R
eeetA ttt
35604
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
151
Podemos observar que el mayor número de desintegraciones ocurren en el
núcleo celular. Estos resultados son teóricos debido a que no se obtuvieron
experimentalmente, sino a partir de los datos biocinéticos del 99mTc-Tat-BN,
considerando la vida media del 188Re y los modelos biocinéticos hasta 72 h, lo
que incrementa de manera significativa el número de desintegraciones en cada
compartimento subcelular.
Las diferencias en captación e internalización que se observan entre las tres
líneas celulares, tiene relación con el número de GRPr que se expresan en la
membrana celular, que a su vez se relaciona con la expresión de receptores
esteroideos de cada tipo celular, como se mencionó anteriormente, las células
PC3 son andrógeno independientes, las células MCF7 son células estrógeno
dependientes y las MDA-MB231 son estrógeno independientes.
5.7 Pruebas in vivo
5.7.1 Estudios de Biodistribución in vivo de 188Re-Tat-BN
La biodistribución de 188Re-Tat-BN en ratones sanos BALB/c se observa en la
tabla 36, se muestra una lenta depuración sanguínea, eliminación hepatobiliar,
pero principalmente renal. Además de presentar captación en órganos con
GRPr como pulmón y páncreas, indicando la especificidad de la BN su
receptor.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
152
Tabla 36. Biodistribución de 188Re-Tat-BN en ratones sanos BALB/c a
diferentes tiempos post administración del radiofármaco (n=3 en cada tiempo).
% ID/g (promedio ± DS) Tejido
0.25 h 0.5 h 2 h 4 h 24 h
Sangre 8.16 ± 2.35 8.86 ± 2.26 5.26 ± 0.81 3.50 ± 0.31 1.59 ± 1.00
Corazón 2.28 ± 0.63 3.01 ± 1.74 2.78 ± 1.12 1.55 ± 0.24 1.37 ± 0.58
Pulmón 2.64 ± 1.07 3.89 ± 1.14 3.55 ± 1.02 1.92 ± 0.41 1.97 ± 0.42
Hígado 8.31 ± 3.36 14.19 ± 4.14 11.41 ± 3.02 5.10 ± 0.85 3.09 ± 0.75
Baso 1.93 ± 0.77 5.14 ± 0.03 3.69 ± 1.51 1.34 ± 0.54 2.08 ± 0.87
Páncreas 2.38 ± 0.99 5.91 ± 1.24 2.82 ± 0.69 1.98 ± 0.34 1.32 ± 1.00
Riñón 15.17 ± 6.53 36.39 ± 6.61 18.60 ± 4.69 13.11 ± 1.69 5.12 ± 1 .00
Intestino 4.39 ± 1.59 12.64 ± 8.94 7.26 ± 2.60 3.32 ± 0.96 1.08 ± 0.73
Músculo 0.98 ± 0.43 3.47 ± 1.09 0.97 ± 0.05 1.07 ± 0.51 0.05 ± 0.05
Hueso 1.29 ± 0.76 10.40 ± 5.97 1.42 ± 0.24 3.35 ± 2.28 2.12 ± 2.83
A pesar de la especificidad de la BN por sus receptores, que se encuentran
expresados de manera natural en páncreas y pulmones, el péptido Tat, debido
a su naturaleza catiónica, que es necesaria en la interacción con la bicapa
fosfolipídica de la membrana celular para permitir la internalización del
Tat-fusión-péptido al citoplasma y la localización nuclear, esta misma
característica afecta la tasa de depuración sanguínea, ya que se une a las
proteínas plasmáticas y células en general sin importar su tipo.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
153
5.8 Dosis absorbida celular de 188Re-Tat-BN
En las tablas 37, 40 y 43 están los resultados de la dosis absorbida en
citoplasma y núcleo en las células PC3, MCF7 y MDA-MB-231
respectivamente, por cada desintegración (Gy/Bq·s) del 188Re, al multiplicarlo
por el número total de desintegraciones (Bq·s) de obtuvieron las dosis
absorbidas en los compartimentos subcelulares normalizado por unidad de
actividad captada en las células (Gy/Bq).
En las tablas 38, 41 y 44 se muestran las contribuciones de cada emisión β,
electrones CI y Auger a la dosis absorbida en citoplasma y núcleo de las
células PC3, MCF7 y MDA-MB231.
Los porcentajes de absorción y subabsorción en la célula (ecuaciones 3.2 y
3.3) obtenidos a partir de la energía total emitida en cada desintegración y de la
energía absorbida en el núcleo y citoplasma de cada tipo de emisión se
observa en las tablas 39, 42 y 45 en células PC3, MCF7 y MDA-MB231
respectivamente.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
154
5.8.1 Dosis absorbida de 188Re-Tat-BN en células PC3
Tabla 37. Dosis absorbida de 188Re-Tat-BN en células PC3.
Posición
de la
fuente
Blanco Dosis Absorbida
(Gy/Bq ·s)
Dosis Absorbida
(Gy/Bq)
Núcleo 1.42E-05 ± 2.37E-08 0.6833 ± 0.0011
Citoplasma 2.52E-05 ± 3.01E-08 0.5755 ± 0.0007
Membrana
Citoplasma
7.78E-06 ± 2.35E-08 0.0395 ± 0.0001
Total 4.72E-05 ± 7.73E-08 Total 1.2983 ± 0.0019
Núcleo 1.34E-04 ± 1.38E-07 6.4671 ± 0.0066
Citoplasma 1.46E-05 ± 6.90E-08 0.3343 ± 0.0016
Membrana
Núcleo
6.86E-06 ± 4.72E-08 0.0348 ± 0.0002
Total 1.56E-04 ± 2.54E-07 Total 6.8362 ± 0.0085
Tabla 38. Dosis absorbida de radiación β, electrones CI y Auger del 188Re en
citoplasma y núcleo de células PC3 y porcentaje de contribución a la dosis total
absorbida de radiación.
Blanco Tipo de
emisión
Dosis Absorbida
(Gy/Bq ·s)
% de
contribución
β 3.53E-05 ± 6.38E-08 74.87
CI 8.21E-06 ± 1.10E-08 17.42 Citoplasma
Auger 3.64E-06 ± 2.51E-09 7.72
β 1.10E-04 ± 2.16E-07 70.51
CI 2.37E-05 ± 3.23E-08 15.21 Núcleo
Auger 2.22E-05 ± 5.84E-09 14.28
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
155
Tabla 39. Porcentaje de absorción y de subabsorción de las emisiones del
espectro de 188Re utilizado en la simulación por el método Monte Carlo en
células PC3, cuando la fuente se localizó en el centro del núcleo.
Radiación β Electrones CI Electrones Auger Blanco
subcelular %
Absorción
%
Subabsorción
%
Absorción
%
Subabsorción
%
Absorción
%
Subabsorción
Citoplasma 0.22 38.32 2.89 40.28 2.50 2.92
Núcleo 0.27 48.32 3.22 44.91 82.13 95.89
Membrana 0.08 13.36 1.06 14.81 1.02 1.19
Total 0.56 7.18 85.65
5.8.2 Dosis absorbida de 188Re-Tat-BN en células MCF7
Tabla 40. Dosis absorbida de 188Re-Tat-BN en células MCF7.
Posición
de la
fuente
Blanco Dosis Absorbida
(Gy/Bq ·s)
Dosis Absorbida
(Gy/Bq)
Núcleo 2.63E-05 ± 4.45E-08 1.4687 ± 0.0025
Citoplasma 4.76E-05 ± 5.50E-08 0.8803 ± 0.0010
Membrana
Citoplasma
2.29E-05 ± 4.98E-08 0.2432 ± 0.0005
Total 9.68E-05 ± 1.49E-07 Total 2.5922 ± 0.0040
Núcleo 3.13E-04 ± 3.35E-07 17.4433 ± 0.0187
Citoplasma 3.67E-05 ± 1.79E-07 0.6797 ± 0.0033
Membrana
Núcleo
1.89E-05 ± 1.29E-07 0.2008 ± 0.0014
Total 3.68E-04 ± 6.42E-07 Total 18.3238 ± 0.0233
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
156
Tabla 41. Dosis absorbida de radiación β, electrones CI y Auger del 188Re en
citoplasma y núcleo de células MCF7 y porcentaje de contribución a la dosis
total absorbida de radiación.
Blanco Tipo de
emisión
Dosis Absorbida
(Gy/Bq ·s)
% de
contribución
β 7.26E-05 ± 1.26E-07 75.03
CI 1.61E-05 ± 1.89E-08 16.63 Citoplasma
Auger 8.07E-06 ± 4.09E-09 8.34
β 2.46E-04 ± 5.52E-07 66.90
CI 5.15E-05 ± 7.59E-08 13.97 Núcleo
Auger 7.04E-05 ± 1.48E-08 19.12
Tabla 42. Porcentaje de absorción y de subabsorción de las emisiones del
espectro de 188Re utilizado en la simulación por el método Monte Carlo en
células MCF7, cuando la fuente se localizó en el centro del núcleo.
Radiación β Electrones CI Electrones Auger Blanco
subcelular %
Absorción
%
Subabsorción
%
Absorción
%
Subabsorción
%
Absorción
%
Subabsorción
Citoplasma 0.21 42.26 2.77 43.89 2.13 2.52
Núcleo 0.22 43.03 2.52 39.92 81.57 96.44
Membrana 0.07 14.72 1.02 16.19 0.88 1.04
Total 0.50 6.32 84.59
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
157
5.8.3 Dosis absorbida de 188Re-Tat-BN en células MDA-MB231
Tabla 43. Dosis absorbida de 188Re-Tat-BN en células MDA-MB231.
Posición
de la
fuente
Blanco Dosis Absorbida
(Gy/Bq ·s)
Dosis Absorbida
(Gy/Bq)
Núcleo 1.98E-05 ± 3.20E-08 0.7062 ± 0.0011
Citoplasma 3.42E-05 ± 3.90E-08 1.0439 ± 0.0012
Membrana
Citoplasma
1.04E-05 ± 3.18E-08 0.1252 ± 0.0004
Total 6.44E-05 ± 1.03E-07 Total 1.8753 ± 0.0027
Núcleo 2.23E-04 ± 2.36E-07 7.9454 ± 0.0084
Citoplasma 1.97E-05 ± 1.07E-07 0.6028 ± 0.0033
Membrana
Núcleo
8.06E-06 ± 6.68E-08 0.0966 ± 0.0008
Total 2.51E-04 ± 4.10E-07 Total 8.6448 ± 0.0125
Tabla 44. Dosis absorbida de radiación β, electrones CI y Auger del 188Re en
citoplasma y núcleo de células MDA-MB231 y porcentaje de contribución a la
dosis total absorbida de radiación.
Blanco Tipo de
emisión
Dosis Absorbida
(Gy/Bq ·s)
% de
contribución
β 4.82E-05 ± 8.51E-08 74.83
CI 1.10E-05 ± 1.43E-08 17.04 Citoplasma
Auger 5.24E-06 ± 3.19E-09 8.13
β 1.71E-04 ± 3.51E-07 67.97
CI 3.60E-05 ± 4.95E-08 14.36 Núcleo
Auger 4.44E-05 ± 9.23E-09 17.67
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
158
Tabla 45. Porcentaje de absorción y de subabsorción de las emisiones del
espectro de 188Re utilizado en la simulación por el método Monte Carlo en
células MDA-MB231, cuando la fuente se localizó en el centro del núcleo.
Radiación β Electrones CI Electrones Auger Blanco
subcelular %
Absorción
%
Subabsorción
%
Absorción
%
Subabsorción
%
Absorción
%
Subabsorción
Citoplasma 0.21 42.26 2.77 43.89 2.13 2.52
Núcleo 0.22 43.03 2.52 39.92 81.57 96.44
Membrana 0.07 14.72 1.02 16.19 0.88 1.04
Total 0.50 6.32 84.59
5.8.4 Resumen de dosis absorbida de 188Re-Tat-BN en células de cáncer
Tabla 46. Dosis absorbida (Gy/Bq) de 188Re-Tat-BN en núcleo y citoplasma de
células de cáncer.
Dosis Absorbida (Gy/Bq) Línea Celular
Citoplasma Núcleo
PC3 1.2983 ± 0.0019 6.8362 ± 0.0085
MCF7 2.5922 ± 0.0040 18.3238 ± 0.0233
MDA 1.8753 ± 0.0027 8.6448 ± 0.0125
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
159
Tabla 47. Promedio del porcentaje de contribución a la dosis absorbida en
citoplasma y núcleo de las células PC3, MCF7 y MDA-MB231 de radiación β,
electrones CI y Auger de 188Re.
Blanco Tipo de
emisión
% de contribución a
la Dosis Absorbida
β 74.91 ± 0.08
CI 17.03 ± 0.26 Citoplasma
Auger 8.06 ± 0.23
β 68.46 ± 1.36
CI 14.51 ± 0.46 Núcleo
Auger 17.03 ± 1.83
Tabla 48. Promedio del porcentaje de absorción y subabsorción de energía de
radiación β, electrones CI y Auger de 188Re en citoplasma y núcleo de las
células PC3, MCF7 y MDA-MB231.
Radiación β Electrones CI Electrones Auger Blanco
subcelular %
Absorción
%
Subabsorción
%
Absorción
%
Subabsorción
%
Absorción
%
Subabsorción
Citoplasma 0.20 ± 0.02 40.31 ± 1.33 2.65 ± 0.24 41.89 ± 1.33 2.12 ± 0.26 2.50 ± 0.30
Núcleo 0.22 ± 0.03 44.23 ± 2.73 2.63 ± 0.40 41.15 ± 2.51 81.67 ± 0.31 96.40 ± 0.34
Membrana 0.08 ± 0.00 15.46 ± 1.89 1.06 ± 0.03 16.96 ± 1.95 0.94 ± 0.06 1.10 ± 0.06
Total 0.50 ± 0.04 6.34 ± 0.56 84.72 ± 0.62
Como se describe en el capítulo anterior las dosis absorbidas totales tanto en
el núcleo y en el citoplasma de las tres líneas celulares proviene de la suma de
las contribuciones de las actividades en membrana, citoplasma y núcleo al
blanco subcelular.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
160
Las dosis absorbidas por desintegración del 188Re son menores que las del 99mTc, debido a que las energías de la radiación β se emite en un espectro de
energías, por consiguiente, las emisiones de más baja energía son las que
contribuirían mayormente a la dosis subcelular, debido a su corto alcance. Sin
embargo, la probabilidad de emisión de β de baja energía es muy baja, no
obstante, son las que más contribuyen a la dosis absorbida tanto en el
citoplasma (74.91 ± 0.08 %), como en el núcleo (68.46 ± 1.36 %). Los
electrones CI contribuyen más que los electrones Auger a la dosis absorbida en
el citoplasma. Pero en el núcleo el efecto es inverso, es decir la mayor
contribución a la dosis absorbida en el núcleo de las células se debe a los
electrones Auger, cuya diferencia en el rango a nivel celular con respecto a los
electrones CI y radiación β, permite que depositen la mayoría de su energía
dentro de los límites de tamaño del núcleo celular.
5.9 Discusión y conclusiones
La simulación de la molécula a través de MM3 permite optimizar la geometría
molecular utilizando mecánica molecular clásica. El sistema encuentra la
geometría óptima por medio del movimiento sistemático de todos los átomos en
la muestra química hasta que la fuerza neta que actúa en cada átomo se
aproxima a cero. Conflex genera confórmeros de baja energía de una
molécula con cualquier forma. Los cálculos se realizaron con un metal sin ser
específicamente Tc o Re, así que la energía mínima calculada de 271 kcal/mol
apoyan la preparación del péptido híbrido y demuestra que la capacidad de
reconocimiento específico del péptido no se afecta por la formación del
complejo Re(O)N2S2. Sin embargo, la estabilidad del quelante mismo
[Re(O)(N2S2)]-1 puede afectarse aunque no significativamente.
Las diferencias observadas en la captación de 188Re-Tat-BN entre las líneas
celulares MDA-MB231 y MCF7, puede deberse a que a pesar de que ambas
son células de cáncer de mama, las primeras son estrógeno independientes y
las segundas son estrógeno dependientes y esta condición afecta la cantidad
de GRPr que se expresan en la membrana celular. En el caso específico de
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
161
estas dos líneas celulares, Halmos y cols, demostraron que ambas tienen
GRPr y ambas tienen sitios de unión de alta y baja afinidad, siendo incierta la
razón de esta característica. Sin embargo, hace la aclaración de que la
expresión de GRPr parece estar relacionada a su origen clonal [20]. Pero en
este estudio se demostró que los GRPr están presentes en ambas líneas
celulares, pero en concentraciones distintas ya que ambas captaron al
radiofármaco y cuando se bloquearon los GRPr, se observa el efecto debido
sólo al Tat, que fue menor del 7% de captación.
De acuerdo con Tetsu Yano y cols, la BN o el GRP pueden actuar como
factores de crecimiento a través de los receptores de BN o GRPr en algunos
cánceres de mama humanos. Además de reportar que la expresión de GRPr
puede disminuir o aumentar, de acuerdo al suero del medio que se utilice en
los cultivos celulares. Tetsu Yano y cols obtuvieron como resultado que las
células MCF7 no respondieron a la BN, aunque otros autores han reportado lo
contrario y las células MDA-MB231 mostraron una gran afinidad por la BN en
los sitios de unión del GRPr, mismo resultado publicado por Miyazaki M y cols
[21-23]. Estas diferencias entre varios reportes acerca de la presencia o no del
GRPr en las células de cáncer de mama MCF7 se pueden atribuir a la
diferencia del clon celular y las condiciones de cultivo utilizadas en los
experimentos.
Las células de cáncer de próstata humano PC3 andrógeno independientes
sobre expresan el GRPr, por lo que se observa alta captación del radiofármaco.
A pesar de que de Visser y cols reportaron que la alta densidad del GRPr sólo
se observaba en células de tumores PC3 de próstata andrógeno dependientes,
es decir, sólo en etapas tempranas del desarrollo del cáncer. Stangelberger y
Ferro Flores y cols reportaron que las células PC3 mostraban GRPr con alta
afinidad por la BN [24, 25].
Es importante mencionar que además de la unión específica e internalización
del radiofármaco 188Re-Tat-BN a los GRPr debido a las características del
péptido BN, el péptido Tat, aumenta la internalización celular debido a que su
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
162
secuencia de aminoácidos facilita el transporte intracelular directo de la
biomolécula a través de la barrera de la membrana plasmática de manera
independiente de los receptores. El Tat se internaliza al citoplasma celular sin
importar el tipo de célula y puede transducir eficientemente en casi el 100% de
las células, tanto in vitro, como in vivo sin toxicidad aparente. Esta
internalización del Tat-BN depende de la interacción entre las cargas negativas
de los fosfolípidos de la membrana celular y los aminoácidos cargados
positivamente (argininas y lisinas) de la secuencia del péptido Tat [26, 27].
Cornelissen y cols, reportaron que debido a la poca especificidad del Tat y el
efecto que esto tiene en la biodistribución de Tat-fusión-proteína o -péptido
radiomarcado, la dosis absorbida en el tejido sano como los riñones o el
hígado, disminuiría si se administrara el péptido híbrido intratumoralmente que
si se hiciera intravenosamente [28]. Del mismo modo se puede reducir la
captación y por lo tanto la dosis absorbida en tejido no blanco, a través de la
aplicación de la infusión de aminoácidos catiónicos, es decir, arginina-lisina,
antes y después de la aplicación de 188Re-Tat-BN ya que bloquea sitios de
captación del Tat, permitiendo actuar de manera predominante a la BN, como
Bodei y cols recomiendan [29].
Existen varios estudios realizados con éxito para el radiomarcado de BN con 188Re, así como pruebas in vitro e in vivo de éstos mismos radiofármacos,
como el [188Re(H2O)(CO)3-ácido diaminopropiónico-SSS-BN(7-14)NH2] probado
con células de cáncer de próstata PC3 [30], el [188Re-N3S-5-Ava-BBN(7-
14)NH2] que mostró alta especificidad por los GRPr pero eliminación renal y
hepatobiliar importante [31] y [M(L(2)-BBN)(L(1)-acr)(CO)(3)] que mostró
captación e internalización en células PC3 pero no internalización nuclear [32].
Sin embargo, las ventajas del 188Re-Tat-BN respecto a éstos radiofármacos,
son, en primer lugar, el péptido híbrido, que tiene especificidad molecular al
unirse por medio de la BN a los GRPr sobreexpresados en células de cáncer
de mama y próstata. Tiene también el Tat que le da la capacidad de aumentar
su internalización celular y le da la característica de localización nuclear y
además, el radiomarcado con 188Re que le permite ser utilizado como un
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
163
radiofármaco para diagnóstico por la emisión gamma de 150 keV y como
agente terapéutico por la emisión β, de electrones Auger y CI.
El 188Re es un radionúclido con excelentes propiedades físicas y químicas que
ha sido utilizado para marcar muchas moléculas terapéuticas, incluyendo
anticuerpos monoclonales y péptidos. La ventaja que tiene sobre otros
radionúclidos es su disponibilidad a través de un generador de 188W/188Re. Sin
embargo, el uso de 90Y o 177Lu para terapia es más común porque tienen una
química más simple que la del 188Re. No obstante, estudios clínicos y
preclínicos han demostrado que la terapia que utiliza 188Re tiene propiedades
dosimétricas y farmacocinéticas favorables [10]. Varias moléculas como
anticuerpos monoclonales, péptidos, fosfonatos, liposomas o coloides se han
marcado con 188Re con propiedades similares a las mostradas por el 188Re-Tat-BN.
Actualmente los radionúclidos más utilizados en la clínica para
radioinmunoterapia son el 188Re, 131I y el 90Y, mientras que el 177Lu y el 90Y son
usados en la radioterapia mediada por un receptor peptídico. Sin embargo, en
este trabajo el 188Re se utilizó para marcar un péptido híbrido, dirigido a un
receptor específico expresado en la membrana de células de cáncer de
próstata y mama y capaz de internalizar al radiofármaco hasta el núcleo; lo que
le brinda características adecuadas para el tratamiento molecular en medicina
nuclear.
Un radionúclido con vida media física larga depositará más energía por
decaimiento que uno con vida media corta, considerando que ambos tienen la
misma actividad inicial e igual biocinética en el tejido blanco. Además hay una
diferencia importante en la tasa de dosis dependiente del tiempo de ambos
radionúclidos. En general, por razones biológicas, las tasas de dosis más altas
entregadas en tiempos de tratamiento cortos son más efectivas. Por lo tanto,
un radionúclido con vida media más corta tendrá mayor efectividad biológica
que uno con energía de emisión similar pero con vida media más larga [10, 33].
En este contexto el 188Re tiene ventaja sobre el 177Lu y 131I durante el primer día
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
164
de tratamiento. Así mismo, el que éste radiofármaco se internalice hasta el
núcleo permite que además de aprovechar la emisión β por efecto del fuego
cruzado, aumente su efectividad radiobiológica por la acción de los electrones
Auger cercanos al ADN.
Uusijarvi y cols estimaron la tasa de dosis absorbida en tumores dividida entre
la tasa de dosis absorbida en el tejido normal (TND), para diferentes tamaños
de tumores en un modelo matemático del cuerpo humano. Los valores TND
medios y máximos (medio/max) para el 188Re, localizado en el núcleo o en el
citoplasma, fueron de 8/123, para 177Lu en el núcleo fue de 15/25 y en
citoplasma de 14/25, concluyendo que los valores TND para emisores β no se
afectan por una distribución subcelular del radionúclido pero sí para emisores
de electrones Auger como es el caso del 188Re [10, 33].
Otra de las ventajas del 188Re es que tiene una emisión gamma de 150 keV, lo
que permite obtener imágenes cuantitativas en una gammacámara para la
evaluación de estimaciones biocinéticas y dosimétricas.
Los tumores sólidos son resistentes a la apoptosis, sin embargo el mecanismo
por el cual la irradiación β induce la muerte celular es a través de la
sobrerregulación del ligante CD95 y su receptor, con la consecuente activación
de caspasas, además del daño resultante a las mitocondrias. [10] Por lo que el
radiofármaco 188Re-Tat-BN presenta ventajas tanto como emisor gamma para
diagnóstico, emisor β en la terapia de tumores sólidos y emisor Auger y CI en la
muerte celular por su cercanía al ADN.
El efecto bystander de la radiación también juega un papel importante en la
radioterapia, que resulta de los efectos de células irradiadas y no irradiadas.
Algunos estudios han propuesto la posible existencia de mediadores solubles
producidos por las células después de la irradiación, pueden afectar a células
no irradiadas [35].
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
165
A pesar de la baja emisión Auger y CI que presenta el 188Re, tienen una
importante aportación a la dosis absorbida nuclear, de 17 y 14.5%
respectivamente, mientras que en el citoplasma es de 8 y 17%
respectivamente. Sin embargo, la mayor aportación a la dosis absorbida ocurre
por la emisión β del radionúclido, ya que aunque se conocen las emisiones
máximas y promedio, este tipo de emisión ocurre en un espectro de energías,
por lo tanto las emisiones β de menor energía son las que depositan en su
mayoría o en su totalidad la energía dentro los limites nucleares y
citoplasmáticos. Contrariamente a lo que ocurre con el radiofármaco 99mTc-Tat-BN, el 188Re-Tat-BN tiene menor dosis absorbida por desintegración,
que al multiplicarla por el número total de desintegraciones tenemos mayor
dosis absorbida por unidad de actividad captada por la célula en el caso del
radiofármaco marcado con 188Re que con 99mTc, debido a la biocinética y las
diferencias en el tiempo de vida media física de los radiofármacos.
La contribución debida al efecto de fuego cruzado por las emisiones β del 188Re
a la dosis absorbida es de aproximadamente 30% si el radiofármaco se
encontrara en la superficie celular según los estudios realizados por Torres
García y cols. [36]
Entonces se puede concluir que en medicina nuclear molecular para terapia
mediada por un receptor peptídico, como en este caso el GRPr, muestra que
los estudios preclínicos farmacocinéticos del 188Re-Tat-BN son favorables
aunque no los mejores para un estudio clínico completo. Sin embargo el hecho
de que éste radionúclido emisor de electrones Auger y CI sea capaz de
internalizarse al núcleo y citoplasma de células de cáncer es un avance
importante para la terapia de radiación por medicina nuclear molecular.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
166
5.10 Referencias
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Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
169
Capítulo 6
Conclusiones generales y trabajo a futuro
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
170
6.1 Conclusiones Generales
Los radiofármacos 99mTc-Tat-BN y 188Re-Tat-BN se diseñaron a partir de
radioconjugados híbridos cuyas energías mínimas (~300kcal/mol) permiten
estructuras moleculares termodinámicamente estables. La conformación
adquirida por la molécula peptídica no interfiere con el sitio de reconocimiento
específico de la BN. Estos resultados apoyan la propuesta de que la
preparación de los radiofármacos es viable y mantienen su especificidad.
La región para quelar al 99mTc o 188Re consta de la secuencia de aminoácidos
Cys-Gly-Cys-NH2 (para formar el ligante -N2S2-) y se utilizó con éxito para
preparar complejos estables con dichos metales sin alterar la actividad
biológica de la molécula.
Los radiofármacos híbridos utilizados en este trabajo mostraron unión
significativa a células de cáncer PC3 (próstata), MCF7 (mama) y MDA-MB231
(mama) aunque con diferentes afinidades debido a las diferencias en la
expresión del GRPr que depende de la expresión de receptores esteroideos en
etapas tempranas del cáncer de próstata o mama. Las diferencias en captación
también pueden atribuirse al origen clonal de cada línea celular.
Los radiofármacos 99mTc-Tat-BN y 188Re-Tat-BN además de mostrar alta
especificidad por los GRPr de células de cáncer PC3, MCF7 y MDA-MB231
debido al péptido BN, se internalizan al citoplasma celular a través de la barrera
de la membrana plasmática por efecto del péptido Tat. La secuencia de
aminoácidos de localización nuclear (NLS, Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-
Arg) con que cuenta el Tat transporta a la biomolécula hasta el núcleo celular a
través de los poros perinucleares, donde por efecto de las cargas negativas de
los grupos fosfato del ADN y las cargas positivas los aminoácidos lisina y
arginina del péptido Tat, se produce una interacción electrostática entre los
radiofármacos y el ADN. Los análisis inmunohistoquímicos mostraron
incremento en la abundancia del Tat-BN en el núcleo, este resultado se asoció
con la inhibición de la proliferación celular como consecuencia de los
electrones Auger y CI de baja energía del 99mTc-Tat-BN dentro del núcleo (PC3
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
171
(52.98%), MCF7 (45.71%) y MDA-MB231 (35.80%) con respecto a células no
expuestas).
Las cargas positivas del Tat (aminoácidos argininas y lisinas) interactúan más
fácilmente con las proteínas, ya que el péptido no está dirigido a un receptor
específico, por lo que los radiofármacos híbridos utilizados en este trabajo se
unen a proteínas plasmáticas aproximadamente 20% más que el radiofármaco
sin Tat. La propiedad catiónica del péptido Tat le permite penetrar la membrana
celular y localizar al núcleo, pero estas características afectan la tasa de
depuración sanguínea así como la unión e internalización de los radiofármacos
en células no blanco. Sin embargo, la captación en células de cáncer aumentó
significativamente para los radiofármacos 99mTc-Tat-BN y 188Re-Tat-BN
comparado con la captación de 99mTc-BN.
La mayor actividad en sangre que se observó en los estudios de biodistribución
en ratones para el 99mTc-Tat-BN comparado con el 99mTc-BN no afectó
significativamente el contraste de la imagen tumoral en ratones. El 99mTc-Tat-BN mostró una mayor captación y contraste en el tumor de células
PC3 inoculadas en ratones atímicos respecto al 99mTc-BN. Los estudios de
biodistribución mostraron que la máxima acumulación de actividad se presenta
en los riñones, indicando que la excreción biológica fue principalmente por vía
renal.
Los cálculos de dosis absorbida a nivel subcelular utilizando el método Monte
Carlo que se realizaron en este trabajo son originales. A diferencia de otros
cálculos reportados previamente, las geometrías y tamaños de las células
utilizadas en este estudio se diseñaron a partir de las imágenes microscópicas
reales de las mismas células que difieren significativamente de los modelos de
células esféricas. Estos parámetros son factores críticos al evaluar la fracción
de dosis absorbida de los electrones sobre las dimensiones nucleares. Los
datos radiofarmacocinéticos a nivel subcelular que se obtuvieron
experimentalmente y que se utilizaron para el cálculo de dosis absorbida en las
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
172
regiones del citoplasma y núcleo celular también fueron un factor crítico para
mejorar la exactitud en los cálculos de dosis absorbida.
Los electrones Auger de baja energía, emitidos por el 99mTc y el 188Re se
consideran como las partículas más adecuadas para la inactivación de células
de cáncer, sin embargo, los electrones CI emitidos por el 99mTc y la emisión β
de baja energía del espectro de 188Re fueron los principales contribuyentes a la
dosis absorbida en el núcleo celular. El 188Re-Tat-BN produce una menor dosis
absorbida por desintegración respecto al radiofármaco 99mTc-Tat-BN. Cuando
se multiplican los Gy/Bq·s por el número total de desintegraciones (Bq·s) se
obtiene mayor dosis absorbida normalizada por unidad de actividad (Bq)
captada en la célula para el caso del 188Re que con 99mTc debido a la
biocinética y a las diferencias en el tiempo de vida media física de los
radionúclidos.
El efecto biológico de los electrones Auger, CI y la radiación β de los
radiofármacos 99mTc-Tat-BN y 188Re-Tat-BN no solo incluye el daño al ADN si
se encuentran en el núcleo celular, la dosis absorbida de radiación también
puede causar daño a membranas y organelos, de tal manera que se inicie la
señalización de rutas apoptóticas dentro de las células. La prueba de
proliferación celular refleja el arresto del ciclo celular, la apoptosis y otros
métodos de muerte celular por efecto de la energía depositada. Por lo tanto, es
necesario evaluar la ruta específica de muerte celular producida por estos
radiofármacos.
Los radiofármacos híbridos 99mTc-Tat-BN y 188Re-Tat-BN pueden ser utilizados
en el diagnóstico y la radioterapia de blancos moleculares como parte de un
esquema de terapia combinada, ya que cuentan con un sitio de reconocimiento
específico (BN) para células de cáncer de próstata PC3 y de mama MCF7 y
MDA-MB231, además de contar con un péptido de internalización (Tat) que le
permite a las moléculas radiomarcadas atravesar la barrera lipofílica de la
membrana plasmática. Por las características físicas de ambos radionúclidos 99mTc y 188Re, los radiofármacos desarrollados en este trabajo son útiles para la
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
173
obtención de imágenes de cáncer de próstata y mama y para producir muerte
celular, ya que depositan dosis absorbidas en el núcleo celular de
0.142 mGy/Bq·s a 0.434 mGy/Bq·s para el caso del 99mTc-Tat-BN y de
0.156 mGy/Bq·s a 0.368 mGy/Bq·s para el caso del 188Re-Tat-BN.
6.2 Relevancia y trabajo a futuro
La utilización de los radiofármacos 99mTc-Tat-BN y 188Re-Tat-BN no se limita a
imágenes nucleares o a la radioterapia de blancos moleculares. Estos
radiofármacos podrían conjugarse a otras moléculas como los fluorocromos de
infrarrojo cercano o los nanocristales semiconductores (“quantum dots”) para
obtener imágenes moleculares ópticas de fluorescencia y para imágenes
nucleares como métodos complementarios que permitan validar el diagnóstico
de cáncer o monitoreo in vivo de la unión del ligante a su receptor. El péptido
híbrido Tat-BN o cada péptido por separado (Tat o BN) se podrían conjugar a
estos mismos sistemas para ser utilizados en la obtención de imágenes
dinámicas ópticas y observar la captación celular o el transporte intracelular de
nanopartículas en células vivas o el mecanismo de acción propio del péptido
Tat, BN o Tat-BN en las células.
El modo natural de interacción entre los GRPr y la BN involucra múltiples sitios
de unión, por tanto, la afinidad a GRPr de los radiofármacos 99mTc-Tat-BN y 188Re-Tat-BN podría mejorarse utilizando sistemas multivalentes. Es decir, la
unión de decenas o centenas de moléculas de péptidos a la superficie de por
ejemplo, una nanopartícula de oro (AuNP) produciría un sistema multivalente
capaz de incrementar la unión de las AuNP-Tat-BN a sus receptores. Dado que
las AuNPs ocasionan destrucción celular térmica irreversible cuando son
irradiadas con un láser, los radiofármacos unidos a AuNPs preparados como
sistemas multivalentes permitirían, además de la obtención de imágenes
diagnósticas, la posibilidad de aplicarlos en terapias combinadas, es decir,
radioterapia por efecto de los electrones de baja energía Auger, CI ó radiación
β y termoterapia por efecto de las AuNPs.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
174
La secuencia de aminoácidos Tat(49-57) internaliza eficazmente a los
radiofármacos al núcleo celular, pero también produce un efecto mitogénico. Se
propone utilizar otras NLS como por ejemplo, los aminoácidos Pro-Lys-Lys-Lys-
Arg-Lys-Val a fin de disminuir significativamente el efecto mitogénico e
incrementar de manera significativa la muerte celular.
Las modificaciones propuestas (secuencias de aminoácidos, unión a moléculas
ópticas y formación de sistemas multivalentes) como trabajo a futuro, podrían
mejorar las propiedades farmacocinéticas de los radiofármacos 99mTc-Tat-BN y 188Re-Tat-BN para ser utilizados en pruebas clínicas que conduzcan a la
obtención de productos eficaces y seguros que puedan aplicarse de manera
cotidiana en el diagnóstico y terapia de cáncer de mama y próstata por técnicas
de Medicina Nuclear Molecular.
Efecto del Péptido Tat(49-57) sobre la Biocinética y Dosimetría de Radiofármacos Análogos de la Bombesina
175
Anexos
Author's personal copy
C.L. Santos-Cuevas et al. / International Journal of Pharmaceutics 375 (2009) 75–83 83
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82 C.L. Santos-Cuevas et al. / International Journal of Pharmaceutics 375 (2009) 75–83
Fig. 7. Uptake of (A) 99mTc-N2S2-Tat(49–57)-Lys3-BN (99mTc-Tat-BN) and (B) 99mTc-EDDA/HYNIC-Lys3-BN (99mTc-BN) in tumor PC3 cells in athymic mouse 2 h after radiophar-maceutical administration (mice with dissection of internal viscera to highlight tumor uptake).
99mTc-Tat-BN binds to plasmatic proteins approximately 20%more than 99mTc-BN. These data indicate that in spite of the factthat both radiopharmaceuticals contain BN and are labeled with99mTc, the positive charges of Tat due to arginines and lysines con-tained in its amino acid sequence, tend to interact faster and in astrong way with proteins, besides that it is not targeted to a spe-cific receptor (Costantini et al., 2008; Cornelissen et al., 2008). Thiscationic property is necessary to penetrate the cell membrane andlocalize the nucleus (Drin et al., 2003), but these characteristicscan have an effect in blood elimination rate by binding to plasmaticproteins as well as increasing interaction and internalization in cellsand healthy tissue (e.g. plasmatic cells, spleen and liver). Althoughcancer cell uptake was significantly higher for 99mTc-Tat-BN withrespect to 99mTc-BN, the higher activity in blood for the first onedid not produce a very high increase in the contrast of tumor imagein mice (Fig. 7).
The maximum uptake of both radiopharmaceuticals was pre-sented at the same times in all cancer cells, in PC3 at 4 h (99mTc-BN,17.62 ± 1.86%; 99mTc-Tat-BN, 28.1 ± 2.86%), in MCF7 at 2 h (99mTc-BN, 8.97 ± 0.92%; 99mTc-Tat-BN, 18.27 ± 2.14%) and in MDA-MB231at 5 min (99mTc-BN, 5.91 ± 0.26%; 99mTc-Tat-BN, 24.33 ± 2.82%) withdifferences only attributed to GRP-r cell expression. In this point itis important to mention that although MCF7 and MDA-MB231 areboth breast cancer cell lines, the first one is estrogen-dependentand the latter is estrogen-independent, and it has been suggestedthat the GRP-r expression is estrogen-dependent in the early stagesof breast carcinoma (Halmos et al., 1995). The elimination of theradiopharmaceuticals in the following times is due to the fact thatthe internalization process of the ligand/GRP-r complex involveslysosomes final trapping upon binding, where, in the case of thepeptides, are quickly degraded. Due to this immediate lysosomedegradation, no radioactivity accumulation in cells was expected(La Bella et al., 2002).
Receptor proteins in cells are considered targets in molecularnuclear medicine. In general cell internalization was receptor spe-cific with 99mTc-BN and in the 99mTc-Tat-BN case 9% of total activitywas non-specific as demonstrated uptake results in GRP-r blockedcell experiments because of Tat nuclear localizing sequence (NLS)(Costantini et al., 2008).
In this work the nucleus of the cytoplasm was not separatedto quantify nuclear internalization. Nevertheless it was considerednecessary to carry out this test with the purpose of estimating cel-lular dosimetry because of 99mTc-auger electron emission.
Biodistribution studies showed a slow blood clearance for 99mTc-Tat-BN, the contrary was observed in non-target organs, however,maximum uptake was observed in kidneys indicating principal
renal excretion. These results coincide with 99mTc-BN biodistri-bution studies where excretion is mainly renal and uptake innon-target organs was lower with faster blood clearance. Neverthe-less both radiopharmaceuticals showed good tumor localization forPC3 cells in athymic mice. However 99mTc-Tat-BN showed a slightlybetter tumor/muscle ratio of 8.5 compared to 7 for 99mTc-BN.
High 99mTc-Tat-BN uptake in kidneys and in non-target organsshows the need for an improved method for reducing radioactivitybackground which could be done by the co-administration of a coldlysine–arginine infusion as previously reported for other peptide-radiopharmaceuticals (Bodei et al., 2003).
5. Conclusions
99mTc-N2S2-Tat(49–57)-Lys3-BN has been developed as a hybridradiopharmaceutical composed of a penetrating peptide with spe-cific targeting moiety (Tat conjugated to BN) producing a stablelabeled molecule able to overcome the lypophilic cell membranebarrier with higher internalization in GRP-receptor positive cancercells with respect to 99mTc-EDDA/HYNIC-Lys3-BN. Therefore, thishybrid is potentially useful in breast and prostate cancer imaging.
Acknowledgements
This study was supported by the CONACyT-SALUD-69051-Mexico and the International Atomic Energy Agency (Contract No.14539/RO).
References
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Fig. 6. Uptake of 99mTc-N2S2-Tat(49–57)-Lys3-BN (99mTc-Tat-BN) and 99mTc-EDDA/HYNIC-Lys3-BN (99mTc-BN) in the cytoplasm of (A) PC3, (B) MCF7 and (C) MDA-MB231cancer cell lines.
Table 4
Biodistribution in nude mice with induced PC-3 tumors 2 h after administration of99mTc-N2S2-Tat(49–57)-Lys3-BN (99mTc-Tat-BN) (n = 3) or 99mTc-EDDA/HYNIC-Lys3-BN (99mTc-BN) (n = 3).
Tissue % IA/g (mean ± SD)
99mTc-BN 99mTc-Tat-BN
Blood 0.40 ± 0.03 1.22 ± 0.16Heart 0.25 ± 0.02 0.43 ± 0.08Lung 0.50 ± 0.04 0.54 ± 0.07Liver 0.85 ± 0.04 2.14 ± 0.05Spleen 0.40 ± 0.05 0.42 ± 0.04Pancreas 3.29 ± 0.21 1.69 ± 0.12Kidney 23.5 ± 1.21 28.12 ± 2.18Intestine 0.85 ± 0.13 1.96 ± 0.23Muscle 0.25 ± 0.03 0.48 ± 0.05Tumor 1.75 ± 0.11 3.84 ± 0.25
4. Discussion
The minimum energies of the calculated hybrid peptide are ade-quate for its molecular structure since the large size, complexityand high charge of this peptide impose steric and electrostaticrepulsions against its stabilization at lower minimum energies.However, the comparison of its minimum energy (271 kcal/mol) tothose reported for other calculated structures of smaller chargedpeptides like UBI(29–41) (Melendez-Alafort et al., 2003), Tat-Scr(Ferro-Flores et al., 2004), 90 and 72–90 kcal/mol, respectively, sug-gested that the hybrid peptide has to be stable. In addition, theconformation acquired by the peptide molecule does not interferewith the recognition capability of BN. These facts supported theproposal that the preparation of the hybrid peptide has to be viableand the specificity maintained.
[TcO(N2S2)]−1-Tat(49–57)-Lys3-BN peptide structure acquiredin the chelating site a distorted square pyramidal geometrywith the oxo group at the apical position of the pyramid andTc about the center of the plane formed by the N2S2 donors(see expanded segment of the molecule, Fig. 2B). This geome-try has been found by X-ray diffraction for other five-coordinateTc(O) complexes neutral or charged compounds like negativelycharged five coordinate Tc(O)N2S2 complexes (Bandoli et al., 2001;Canney et al., 1993). The minimum energy of this complex doesnot differ significantly from that of the hybrid peptide beforecoordination to [Tc(O)]3+. This evidence together the geometricalarrangement acquired by the complexed hybrid peptide (Fig. 2B)demonstrate that the recognition capability of the peptide islittle affected by the formation of the Tc(O)N2S2 complex. How-ever, the stability of the [Tc(O)(N2S2)]−1 chelate itself could beaffected.
In general 99mTc-Tat-BN did not show the excellent radio-chemical characteristics as that previously reported for 99mTc-BN(Ferro-Flores et al., 2006b), since the first one showed slightlylower radiochemical purity (>95% for 99mTc-BN) and lower sta-bility in cysteine and human serum. These results were expectedsince HYNIC core with additional co-ligands has demonstratedto be highly stable for labeling peptides (Liu and Edwards,1999; Decristoforo et al., 2000). Nevertheless, the technetium-binding region consisting of Gly-Gly-Cys-NH2 or Cys-Gly-Cys-NH2
peptide (to form a –N2S2– or –N3S– ligand) has been suc-cessfully used to prepare stable complexes with the Tc = O3+
core producing minimum alteration of the molecule bioac-tivity in agreement with results obtained in this research(Bogdanov et al., 2001; Francesconi et al., 2004; Zhang et al.,2006b).
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Table 299mTc-N2S2-Tat(49–57)-Lys3-BN (99mTc-Tat-BN) and 99mTc-EDDA/HYNIC-Lys3-BN (99mTc-BN) cell uptake in different cancer cell lines (% of total activity ± SD).
Time (h) PC3 MCF7 MDA-MB231
99mTc-Tat-BN 99mTc-BN 99mTc-Tat-BN 99mTc-BN 99mTc-Tat-BN 99mTc-BN
0.083 22.01 ± 2.08 10.29 ± 1.47 19.27 ± 3.55 7.83 ± 0.71 24.33 ± 2.82 5.91 ± 0.261 21.43 ± 2.91 8.59 ± 0.59 17.43 ± 1.13 6.79 ± 0.45 19.43 ± 1.30 5.48 ± 0.212 24.88 ± 2.12 12.85 ± 0.90 18.27 ± 2.14 8.97 ± 0.92 15.98 ± 1.07 5.06 ± 0.574 28.10 ± 3.86 17.62 ± 1.86 13.15 ± 1.27 7.48 ± 0.30 14.40 ± 1.79 4.16 ± 0.396 25.43 ± 1.79 9.63 ± 0.47 12.65 ± 0.94 7.98 ± 0.22 13.60 ± 0.96 4.19 ± 0.52
24 23.91 ± 1.53 8.21 ± 0.64 12.30 ± 1.16 2.32 ± 0.49 14.24 ± 0.34 3.43 ± 0.27
Table 3
Biodistribution of 99mTc-N2S2-Tat(49–57)-Lys3-BN in healthy Balb-C mice at different times after radiopharmaceutical administration (n = 3 in each time).
Tissue % IA/g (mean ± SD)
0.25 h 0.5 h 2 h 4 h 24 h
Blood 7.81 ± 2.62 6.02 ± 2.59 1.12 ± 0.17 1.00 ± 0.03 0.07 ± 0.02Heart 2.43 ± 0.78 1.62 ± 0.63 0.33 ± 0.07 0.32 ± 0.03 0.09 ± 0.10Lungs 2.68 ± 0.94 2.26 ± 0.44 0.60 ± 0.08 0.56 ± 0.04 0.09 ± 0.03Liver 4.91 ± 1.57 3.97 ± 1.70 2.03 ± 0.04 2.11 ± 0.32 0.52 ± 0.17Spleen 1.28 ± 0.40 0.80 ± 0.30 0.35 ± 0.05 0.55 ± 0.17 0.23 ± 0.07Pancreas 2.89 ± 1.01 2.65 ± 0.77 1.87 ± 0.11 1.43 ± 0.24 0.21 ± 0.04Kidneys 16.87 ± 4.85 22.99 ± 8.57 29.02 ± 2.78 27.72 ± 2.18 8.45 ± 0.81Intestine 3.70 ± 1.49 11.30 ± 7.71 2.06 ± 0.33 2.05 ± 0.98 0.17 ± 0.08Muscle 1.47 ± 0.26 1.28 ± 0.70 0.58 ± 0.23 0.43 ± 0.14 0.03 ± 0.02Bone 2.44 ± 0.79 1.74 ± 0.60 0.42 ± 0.05 0.78 ± 0.26 0.19 ± 0.17
Table 4 shows biodistribution in mice with induced PC-3 tumors.Tumor-to-blood, tumor-to-muscle and pancreas-to-blood ratios for99mTc-BN were 4.4, 7 and 8.2, respectively, and 3.2, 8 and 1.4for 99mTc-Tat-BN correspondingly. In vivo images showed a cleartumor uptake and a dissection process to eliminate internal vis-
cera, highlighted the 99mTc-BN and 99mTc-Tat-BN uptake in tumorPC-3 cells (Fig. 7). The tumor/muscle ratio obtained from imagecounts per pixel corresponding to 99mTc-BN was 7 and for 99mTc-Tat-BN was 8.5, demonstrating a minimal difference between thetwo.
Fig. 5. Time dependent internalization of 99mTc-N2S2-Tat(49–57)-Lys3-BN (99mTc-Tat-BN) and 99mTc-EDDA/HYNIC-Lys3-BN (99mTc-BN) in (A) PC3, (B) MCF7 and (C) MDA-MB231 cancer cell lines.
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Table 1
Bond distances of the calculated Tc(O)-N2S2-Tat-Lys3-BN complex using Augmented MM3 and CONFLEX semiempirical procedures.
Compound Geometry Bond distances (Å) Bond distance ratio
[99mTc-(N2S2DADS]−1 Square pyramida Tc-N1: 2.002 RN = 1.009Tc-N2: 1.984 RS = 1.006Tc-S1: 2.300 TcN2/TcO = 1.190Tc-S2: 2.286 TcS1/TcO = 1.38Tc = O: 1.667
[(99mTc(O)-(N2S2))−1-Tat-Lys3-BN Distorted square pyramid Tc-N1: 2.314 RN = 1.003Tc-N2: 2.308 RS = 1.003Tc-S1: 2.618 TcN2/TcO = 1.04Tc-S2: 2.611 TcS1/TcO = 1.19Tc = O: 2.210
a By X-ray diffraction (Canney et al., 1993).
TAT(49–57)-Lys3-BN peptide complex was calculated (Fig. 2B) usingthe most stable conformer of the hybrid peptide molecule. The min-imum energy of the optimized structure was 300 kcal/mol and thatof the most stable conformer equal to 262 kcal/mol. In Table 1 aregiven some geometrical parameters of this complex.
3.2. Evaluation of 99mTc-Tat-BN radiochemical purity and stability
The results obtained by ITLC, Sep-Pak and HPLC analyses showeda mean radiochemical purity for 99mTc-Tat-BN of 92 ± 2% (n > 30)and remains stable after 24 h without post-labeling purification(Fig. 3). The average specific activity was 14 MBq/nmol. After 1 hin human serum the radiochemical purity remained >90% anddecreased to 82% and 65% after 3 and 24 h, respectively. Proteinbinding was 36.4 ± 2.7 at 2 h without 99mTc transchelation to cys-teine (Fig. 4). After incubation with 5:1, 50:1 and 500:1 molar ratiosof cysteine to peptide, ITLC analysis revealed that the radioactivitydissociated from 99mTc-Tat-BN was 7%, 16% and 41%, respectively,indicating adequate radiopharmaceutical stability towards cysteinepresent in blood.
3.3. In vitro uptake
The in vitro results showed an important uptake in the threecancer cell lines PC3, MCF7 and MDA-MB231 which is inhibitedsignificantly by pre-incubation with cold bombesin (Table 2). Ingeneral cell binding in blocked cells was less than 3% of total activityfor 99mTc-BN and less than 9% for 99mTc-Tat-BN in all cell lines andduring all times. This confirmed in vitro specificity of both radio-pharmaceuticals for GRP receptors found in cell membranes of the
Fig. 3. Reverse phase HPLC radiochromatograms of 99mTc-N2S2-Tat(49–57)-Lys3-BNafter labeling, and 24 h after preparation (kept at room temperature).
three cell lines due to the fact that both compounds contain BN.However, the hybrid 99mTc-Tat-BN shows a higher uptake (p < 0.05)due to Tat’s capacity to internalize the molecule into the cytoplasmand even into the nucleus (Costantini et al., 2008).
Internalization increase of 99mTc-Tat-BN compared with that of99mTc-BN in the cell lines is shown in Fig. 5, demonstrating thatthe hybrid peptide has the ability to penetrate the cell membrane.Maximum internalization is reached in PC3 and MCF7 cells between2 and 4 h after incubation. However MDA-MB231 cells showed adistinct pattern where cellular internalization reaches a maximumduring the first few minutes decreasing with time.
The percentage activity in cytoplasm of the total internal activity(Fig. 6) shows a great difference between both radiopharmaceu-ticals. Most of 99mTc-BN remains in the cell membrane while99mTc-Tat-BN is released in the cytoplasm, where it can be internal-ized into the nucleus because of its amino acid nuclear localizationsequence (NLS) (Costantini et al., 2008).
3.4. Biodistribution and imaging
99mTc-Tat-BN biodistribution is shown in Table 3. Renal excre-tion is predominantly observed but hepatobiliary clearance is alsopresent. GRP-r receptors are naturally expressed in lungs show-ing radiopharmaceutical uptake (Shriver et al., 2000). However,pancreas shows higher uptake than non-excretory organs such asspleen, muscle and even lungs because of its GRP-r expression,indicating that BN acts as the targeting vector.
Fig. 4. Size-exclusion HPLC. Solid line represents the UV-chromatogram (280 nm)of human serum proteins and dotted line the radiochromatogram of 99mTc-N2S2-Tat(49–57)-Lys3-BN 2 h after incubation in human serum at 37 ◦C.
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obtain the percentage of injected activity per gram of tissue% IA/g.
2.9.1. Tumor induction in athymic mice
Athymic male mice (20–22 g) were kept in sterile cages withsterile wood-shavings bed, constant temperature, humidity, noiseand 12:12 light periods. Water and feed (standard PMI 5001 feed)were given ad libitum.
Prostate tumors were induced by subcutaneous injection of PC-3cells (1 × 106) resuspended in 0.2 mL of phosphate-buffered saline,into the upper back of four 6–7-week-old nude mice. Injection siteswere observed at regular intervals for tumor formation and pro-gression.
2.9.2. Imaging
The nude mice with the implanted tumors were sacrificed andscanned with a gamma camera with a pinhole collimator 2 h after99mTc-Tat-BN or 99mTc-BN administration in the tail vein (3 MBq in0.04 mL). Finally, complete dissection was carried out to determinepercentage of injected activity per gram of tissue % IA/g as describedabove.
3. Results
3.1. Design of (Acm)2S2N2-Tat-Lys3-bombesin and
Tc(O)S2N2-Tat-Lys3-bombesin by semiempirical calculations
A good molecular modeling yields structures which are similarto those obtained experimentally. However, this similarity couldbe affected by the size, charge and mobility of the molecule, e.g. inthe case of big and charged peptides. Without forgetting this fact,the hybrid N2S2-Tat(49–57)-Lys3-BN peptide (Fig. 2A) was designedusing semiempirical calculations to investigate the feasibility of itsformation. The minimum energies of its most stable structure andconformer were 271 and 233 kcal/mol, respectively.
The technetium-oxo complex formed with this hybrid peptidewas also modeled considering two well-known facts of this typeof chelating site: (1) the two terminal thiols S2(Acm)2 are able tobe ionized by removing the acetamidomethyl protecting groups(Canney et al., 1993; Bandoli et al., 2001), (2) the amide groups eas-ily undergo deprotonation (Bandoli et al., 2001). Then it is expectedthat the chelating site yields a [N2S2]4− coordination around the[Tc(O)]3+ core forming this way a negative charged five-coordinatecomplex. Based on the latter, the molecule of the [TcO(N2S2)]−1-
Fig. 2. (A) The most stable conformer of the modeled N2S2-Tat(49–57)-Lys3-BN hybrid peptide molecule using CONFLEX. (B) The most stable conformer of the modeledTc(O)N2S2-Tat(49–57)-Lys3-BN hybrid peptide molecule using CONFLEX. The expanded geometry of the Tc(O) chelate: [Tc(O)N2S2]−1 is given for clarity.
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Fig. 1. General scheme of the N2S2-Tat(49–57)-Lys3-BN hybrid peptide.
2.6. Cysteine challenge
99mTc-Tat-BN was tested for instability towards cysteine. A freshcysteine solution was prepared (10 mg/mL in 0.1 M PBS, pH 7.0) anddiluted to different concentrations. Then 10 �L of each cysteinesolution was mixed with 90 �L of 20 �M of the labeled peptidesolutions. The molar ratios of cysteine to peptide were 5:1, 50:1and 500:1. Each test tube was incubated at 37 ◦C and radiochemicalpurity analyzed 1 h later by ITLC.
2.7. Preparation of 99mTc-EDDA/HYNIC-Lys3-BN (99mTc-BN)
As previously reported, a lyophilized formulation containingHYNIC-Lys3-BN, EDDA, tricine, and stannous chloride was prepared(Ferro-Flores et al., 2006b). The radiolabeling procedure was car-ried out by adding 1 mL of 0.2 M phosphate buffer pH 7.0 to thefreeze-dried kit formulation and immediately 740–1110 MBq (1 mL)of 99mTc-pertechnetate followed by incubation in boiling water for15 min. Radiochemical purity was also evaluated by reverse phaseHPLC and ITLC.
2.8. In vitro kinetic studies
2.8.1. Cell lines
Human prostate cancer cell PC-3 line and human breast carci-noma cell lines MDA-MB231 and MCF7 were originally obtainedfrom ATCC (USA). The cells were routinely grown at 37 ◦C, with5% CO2 atmosphere and 100% humidity in RPMI medium supple-mented with 10% newborn calf serum and antibiotics (100 �g/mLstreptomycin).
2.8.2. Internalization assay and non-specific binding
PC-3 or MDA-MB231 or MCF7 cells supplied in fresh mediumwere diluted to 1 × 106 cells/tube and incubated with about200,000 cpm of 99mTc-BN (0.3 nmol total peptide) or 99mTc-Tat-BN(0.3 nmol total bombesin) in triplicate at 37 ◦C for 0.083, 2, 4, 6 and
24 h. The test tubes were centrifuged (3 min, 500 g), washed twicewith phosphate buffer saline (PBS), and the activity of the cell pelletdetermined in a crystal scintillation well type detector. Radioactiv-ity in the cell pellet represents both externalized peptide (surfacebound) and internalized peptide. An aliquot with the initial activitywas taken to represent 100%, and the cell uptake activity was thencalculated.
The externalized peptide activity was removed with 1 mL of0.2 M acetic acid/0.5 M NaCl solution added to the resuspendedcell pellet. The test tubes were centrifuged, washed with PBS, re-centrifuged, and pellet activity was considered as internalization.The cell pellet was re-suspended with 1 M NaOH to break up themembranes, centrifuged and washed with PBS. The supernatantactivity represents cytoplasm uptake. Non-specific binding wasdetermined in parallel but in presence of 10 �M Lys3-BN (Bachem-USA) (blocked receptor cells).
2.8.3. Statistical analysis
Differences between the in vitro cell data for BN-radiopharmaceuticals were evaluated with the Student t-test.
2.9. Biodistribution studies
Biodistribution and tumor uptake studies in mice were carriedout according to the rules and regulations of the Official MexicanNorm 062-ZOO-1999.
Healthy 6-week-old Balb-C mice were used for biodistribu-tion studies. 99mTc-Tat-BN, 1.11 MBq (30 �Ci) in 0.04 mL wasinjected in a tail vein. The mice (n = 3) were sacrificed at0.25, 05, 2, 4 and 24 h post-injection. Whole heart, lung,liver, spleen, pancreas, kidneys, intestines, muscle, bone andblood samples were saline rinsed, paper blotted and placedinto pre-weighed plastic test tubes. The activity was deter-mined in a well-type scintillation detector (Canberra) alongwith six 0.5 mL aliquots of the diluted standard representing100% of the injected activity. Mean activities were used to
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ceutical with high stability in human serum, specific cell receptorbinding and rapid internalization. Biodistribution data in miceshowed rapid blood clearance, with predominant renal excretionand specific binding towards GRP receptor-positive tissues such aspancreas and PC-3 tumors (Ferro-Flores et al., 2006b). Images ofGRP-r expression in breast cancer patients demonstrated distinctradioactivity accumulation in malignant tissue (Santos-Cuevas etal., 2008).
Targeted entry into cells is an increasingly important researcharea. Disease diagnoses and treatment by novel methods wouldbe greatly enhanced by efficiently transporting materials to livingcell nuclei. Penetrating peptides are emerging as attractive drugdelivery tools. The HIV Tat-derived peptide is a small basic pep-tide called “trojan horse” for successfully delivering a large varietyof cargoes into cells such as nanoparticles, proteins, peptides andnucleic acids. The “transduction domain” or region conveying cellpenetrating properties appears to be confined to a small stretchof basic amino acids with the sequence RKKRRQRRR and knownas Tat(49–57) (Koch et al., 2003; Dietz and Bähr, 2004; Deshayeset al., 2005; Zhang et al., 2006b; Hu et al., 2007; Jain et al., 2007;Youngblood et al., 2007; Chen and Harrison, 2007; Cornelissen etal., 2008).
Therefore, a new hybrid radiopharmaceutical of type 99mTc-N2S2-Tat(49–57)-Lys3-bombesin (99mTc-Tat-BN) would signifi-cantly increase cancer cell uptake and consequently image contrastof cancer tumors and their metastases, improving sensitivity andspecificity of diagnostic studies in breast cancer.
The aim of this research was to prepare and assess in vitro
and in vivo uptake kinetics in GRP receptor-positive cancer cells of99mTc-Tat-BN and to compare its cellular internalization with thatof 99mTc-BN.
2. Experimental
2.1. Design and preparation of hybrid N2S2-Tat(49–57)-Lys3-BN
peptide
Tat(49–57) peptide (H-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-NH2) was conjugated to Gly-Gly-Cys-Gly-Cys(Acm)-Gly-Cys(Acm)-NH2 to produce the Tat(49–57)-spacer-N2S2 peptide(H-Arg1-Lys2-Lys3-Arg4-Arg5-Gln6-Arg7-Arg8-Arg9-Gly10-Gly11-Cys12-Gly13-Cys14(Acm)-Gly15-Cys16(Acm)-NH2). The sequenceGly13-Cys14(Acm)-Gly15-Cys16(Acm)-NH2 was added for use as thespecific N2S2 chelating site for 99mTc (Fig. 1).
Lys3-bombesin (Pyr-Gln-Lys-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Vla-Gly-His-Leu-Met-NH2) was conjugated to maleimidopropyl (MPA)through Lys3 and the MPA group used as the branch position form-ing a thioether with the Cys12 side chain of Tat(49–57)-spacer-N2S2
peptide (Fig. 1). Synthesis, HPLC analysis, Mass Spectral Analysis(MALDI), Amino Acid Analysis (AAA) and peptide content deter-mination were carried out in the Bachem Laboratories obtaininga certified white powder product with chemical purity >90% andmolecular weight of 3779.5 g/mol (Bachem, CA, USA).
2.2. Molecular modeling
The N2S2-Tat(49–57)-Lys3-BN peptide molecule was built takinginto account valence, bond type, charge and hybridization. The min-imum energies (Molecular Mechanics calculations by AugmentedMM3 procedure) and the lowest energy conformer (CONFLEX pro-cedure) associated to the optimized geometry of its structure werecalculated using the CAChe Pro 5.02 and/or 5.04 program pack-age for windows® (Fujitsu Ltd., 2000–2001). Sequential applicationof Augmented MM3/CONFLEX procedures yielded the most stableconformers for the N2S2-Tat(49–57)-Lys3-BN and for Tc(O)N2S2-Tat(49–57)-Lys3-BN structures.
2.3. Technetium-99 labeling of N2S2-Tat(49–57)-Lys3-BN
99mTc-pertechnetate was obtained from a GETEC 99Mo/99mTcgenerator (ININ-Mexico). All the other reagents were purchasedfrom Sigma–Aldrich Chemical Co., and used as received.
Acetamidomethyl (Acm) groups deprotection and N2S2-Tat(49–57)-Lys3-bombesin labeling were accomplished in one stepby pertechnetate reduction with stannous chloride in ammoniumacetate and sodium tartrate presence at room temperature. Alka-linity (pH 9.5) was necessary to de-acetylate Cys14(Acm) andCys16(Acm) side chains of TAT(49–57)-spacer-N2S2 peptide that areessential for oxotechnetate binding (Bogdanov et al., 2001; Zhanget al., 2006a,b).
One milligram of N2S2-Tat(49–57)-Lys3-BN was dissolved in200 �L of injectable water (Pisa®, Mexico). Ten microliters ofthis solution were added to 25 �L of sodium 99mTc-pertechnetate(185 MBq) followed by 7 �L of deprotection mixture (50 mg/mLsodium tartrate in 0.1 M NH4OH/NH4CH3COOH, pH 9.5) and3 �L of reducing solution (0.5 mg SnCl2/mL in 0.05 M HCl).The final mixture was incubated for 20 min at room tempera-ture.
2.4. Evaluation of 99mTc-N2S2-Tat(49–57)-Lys3-BN
(99mTc-Tat-BN) radiochemical purity
Radiochemical purity analyses were performed by instant thin-layer chromatography on silica gel (ITLC-SG, Gelman Sciences),solid phase extraction (Sep-Pak C-18 cartridges) and reverse phasehigh-performance liquid chromatography (HPLC).
ITLC-SG analysis was accomplished using 2 different mobilephases: 2-butanone to determine the amount of free 99mTcO4
−
(Rf = 1) and 0.1 M sodium citrate pH 5 to determine 99mTc-tartrateand 99mTcO4
− (Rf = 1). Rf value of the radiolabeled peptide in eachsystem was 0.0.
The Sep-Pak cartridges were preconditioned with 5 mL ofethanol followed by 5 mL of 1 mM HCl and 5 mL of air. An aliquot of0.1 mL of the labeled peptide was loaded on the preconditioned Sep-Pak cartridge followed by 5 mL of 1 mM HCl to elute free 99mTcO4
−
and 99mTc-tartrate. The radiolabeled peptide was eluted with 3 mLof ethanol:saline (1:1) mixture and the hydrolyzed-reduced 99mTcor 99mTc-colloid remained in the cartridge.
HPLC analyses were carried out with a Waters instrumentrunning Millennium software with both radioactivity and UV-photodiode array in-line detectors and YMC ODS-AQ S5 column(5 �m, 4.6 mm × 250 mm). The gradient was run at a flow rateof 1 mL/min with the following conditions: 0.1% trifluoroaceticacid (TFA)/water (solvent A) and 0.1% TFA/acetonitrile (solventB). The gradient started with 100% solvent A for 3 min, changedto 50% solvent A over 10 min, was maintained for 10 min,changed to 30% solvent A over 3 min and finally returned to100% solvent A over 4 min. In this system retention times forfree 99mTcO4
−, and 99mTc-Tat-BN were 3–4 min and 10–10.5 min,respectively.
2.5. Serum stability
Size exclusion HPLC analysis and a ITLC-SG were used to esti-mate serum stability of 99mTc-Tat-BN. A 50 �L volume of labeledpeptide solution (0.5 �g/50 �L) was incubated at 37 ◦C with 1 mLof fresh human serum. Radiochemical stability was determinedfrom samples of 10 �l taken at different times from 20 min to24 h for analysis. A shift of the HPLC radioactivity profile to highermolecular weight indicates protein binding, while lower-molecularweight peaks indicate labeled catabolites or serum cysteinebinding.
Author's personal copy
International Journal of Pharmaceutics 375 (2009) 75–83
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International Journal of Pharmaceutics
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Design, preparation, in vitro and in vivo evaluation of99mTc-N2S2-Tat(49–57)-bombesin: A target-specific hybrid radiopharmaceutical
Clara L. Santos-Cuevas a,b, Guillermina Ferro-Flores a,∗, Consuelo Arteaga de Murphy c,Flor de M. Ramírez a, Myrna A. Luna-Gutiérrez a,b, Martha Pedraza-López c,Rocío García-Becerra c, David Ordaz-Rosado c
a Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares, Mexicob Universidad Autónoma del Estado de México, Mexicoc Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán, Mexico
a r t i c l e i n f o
Article history:
Received 24 December 2008Received in revised form 11 April 2009Accepted 14 April 2009Available online 22 April 2009
Keywords:
Radiolabeled bombesinHybrid radiopharmaceuticalPeptide-receptor imagingTat-bombesin
a b s t r a c t
The gastrin-releasing peptide receptor (GRP-r) is over-expressed in various human tumors. Recently,99mTc-EDDA/HYNIC-Lys3-bombesin (99mTc-BN) was reported as a radiopharmaceutical with specific cellGRP-r binding and images in breast cancer patients demonstrated distinct radioactivity accumulation inmalignant tissue. The HIV Tat-derived peptide has been used to deliver a large variety of cargoes into cells.Therefore, a new hybrid radiopharmaceutical of type 99mTc-N2S2-Tat(49–57)-Lys3-bombesin (99mTc-Tat-BN) would increase cell uptake. The aim of this research was to prepare and assess in vitro and in vivo
uptake kinetics in cancer cells of 99mTc-Tat-BN and to compare its cellular internalization with that of99mTc-BN. Structures of N2S2-Tat-BN and Tc(O)N2S2-Tat-BN were calculated by an MM procedure. 99mTc-Tat-BN was synthesized and stability studies carried out by HPLC and ITLC-SG analyses in serum andcysteine solutions. In vitro internalization was tested using human prostate cancer PC-3 cells and breastcarcinoma cell lines MDA-MB231 and MCF7. Biodistribution was determined in PC-3 tumor-bearing nudemice. Results showed a minimum energy of 271 kcal/mol for N2S2-Tat-BN and 300 kcal/mol for Tc(O)N2S2-Tat-BN. 99mTc-Tat-BN radiochemical purity was >90%. In vitro studies demonstrated stability in serum andcysteine solutions, specific cell receptor binding and internalization in three cell lines was significantlyhigher than that of 99mTc-BN (p < 0.05). The tumor-to-muscle radioactivity ratio was 8.5 for 99mTc-Tat-BNand 7 for 99mTc-BN. Therefore, this hybrid is potentially useful in breast and prostate cancer imaging.
© 2009 Elsevier B.V. All rights reserved.
1. Introduction
Molecular imaging is defined as the visualization, characteri-zation and measurement of biological processes at the molecularand cellular levels in humans and other living systems (Thakurand Lentle, 2005). Cancer imaging techniques using radiotrac-ers targeted to specific receptors have yielded successful resultsdemonstrating the utility of such approaches for developing specificradiopharmaceuticals.
Regulatory peptide receptors are over-expressed in numeroushuman cancer cells. These receptors have been used as molecu-lar targets for radiolabeled peptides to localize cancer tumors. Theuseful clinical results achieved during the last decade with somato-statin receptor-expressing neuroendocrine tumor imaging, have
∗ Corresponding author at: Departamento de Materiales Radiactivos, InstitutoNacional de Investigaciones Nucleares, Carretera México-Toluca S/N, La Marquesa,Ocoyoacac, Estado de México, C.P. 52750, Mexico. Tel.: +52 55 53297200x3863;fax: +52 55 53297306.
E-mail addresses: ferro [email protected], [email protected](G. Ferro-Flores).
been extended to the study of other radiopeptides to target alterna-tive cancer-associated peptide receptors such as gastrin-releasingpeptide, cholecystokinin, peptide ligands for integrin receptors orneurotensin. The improvement of radiopeptide analogues allowsspecific clinical imaging of different tumor types, including breast,prostate, intestine, pancreas and brain tumors (Ferro-Flores et al.,2006a; de Visser and Verwijnen, 2008).
The bombesin (BN) peptide was isolated from frog skin andbelongs to a large group of neuropeptides with many biologicalfunctions. The human equivalent is the gastrin-releasing peptide(GRP, 27 amino acids) and its receptors (GRP-r) are over-expressedin the tumor cell membrane in an early stage of carcinogenesis (Luiet al., 2003). GRP and BN differ by only 1 of 10 carboxy-terminalresidues and this explains the similar biological activity of the twopeptides (Reubi, 2003). The strong-specific BN–GRP-r binding is thebasis for labeling BN with radionuclides (Baidoo et al., 1998; La Bellaet al., 2002; Varvarigou et al., 2002; Smith et al., 2003; Faintuch etal., 2005; Nock et al., 2005; Lin et al., 2005; Alves et al., 2006; Zhanget al., 2006a; Garcia-Garayoa et al., 2007; Kunstler et al., 2007).
99mTc-EDDA/HYNIC-Lys3-BN (99mTc-BN) obtained fromlyophilized kit formulations has been reported as a radiopharma-
0378-5173/$ – see front matter © 2009 Elsevier B.V. All rights reserved.doi:10.1016/j.ijpharm.2009.04.018
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Received: August 25, 2009 Revised: November 16, 2009 Accepted: November 16, 2009
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tumours and is significantly altered for example by systemic chemotherapy. Combined FMT/MR imaging of fluorescent molecular probes could be valuable for brain tumour drug development and other neurological and somatic imaging applications [137].
The synthesis and in vivo characterization of an 18
F-CLIO was reported by Devaraj et al. [138]. This particle consists of cross-linked dextran molecules held together in core-shell formation by a superparamagnetic iron oxide core and functionalized with the radionuclide
18F in high yield via
“click” chemistry. Such nanoparticles could accurately detect lymph nodes (LNs), which are critical for assessing cancer metastasis. In vivo PET/MRI images could clearly identify small (~1 mm) LNs along with precise anatomical information.
NIR fluorescence has the potential to provide rapid, inexpensive, and nonradioactive population-based screening for breast cancer. Bhushan et al. [139] developed a system for detection of breast cancer microcalcifications using a dual-modality SPECT/NIR fluorescent probe.
Two or more different peptides can be bound to one AuNP. In our group we have obtained radiolabelled gold nanoparticles conjugated to two different peptides, one to be used as a bifunctional chelating agent to link the radionuclide and the other one as regulatory peptide analogue:
99mTc-GGC-AuNP-bombesin. This system could
be useful for imaging breast cancer (data not published).
5. SUMMARY AND CONCLUSIONS
Labelled regulatory peptides, as well as RGD and Tat peptides, have far-reaching potential for the study of cellular processes at the single-molecule level, high-resolution cellular imaging, long-term in vivo observation of cell tracking, tumour targeting, and specific cancer diagnostic. Medical imaging modalities such as MRI, SPECT and PET can identify tumours non-invasively, but they do not provide a visual guide during surgery. Nanoparticle probes can endow imaging techniques with enhanced signal, sensitivity and better spatial resolution. For example, the development of magnetic or radioactive QD-peptides could give a visual guide during surgery.
Several molecular imaging strategies using multicom-ponent nanoparticles conjugated to peptides for multimodal imaging techniques are poised for rapid clinical application. Major areas of research are focused on development of molecular, functional and genetic imaging tools, aided by new information technology and image fusion/integration capabilities. Undoubtedly, multimodal imaging techniques using target-specific peptides will enhance the ability to accurately diagnose and evaluate the efficacy of different cancer therapies.
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Montet et al. [118] prepared cRGD-CLIO(Cy5.5) nano-particles and evaluated the BT-20 human breast carcinoma cell integrin expression, nanoparticle pharmacokinetics and tumour vascularisation. Results indicated that magneto-fluorescent RGD nanoparticles were targeted to v 3-expressing tumour cells in vivo and were detectable by fluorescence reflectance imaging, fluorescence molecular tomography, and magnetic resonance imaging. Factors permitting the imaging of tumour integrins included the vascularised nature of the BT-20 tumour, the long nanoparticle blood half-life (180 min), and the ability of nanoparticles to slowly escape from the vasculature.
Surface modification of superparamagnetic contrast agents with the HIV-1 Tat peptide is an effective technique for intracellular magnetic labelling, because the conjugation of the Tat peptide to nanoparticles facilitates their cellular uptake [129]. Ultrasmall superparamagnetic iron oxide (USPIO) nanoparticles have been conjugated to the HIV Tat peptide to label CD4+ T cells. The number of Tat peptide molecules per nanoparticle was estimated to be from 15 to 45. Uptake in CD4+ T cells was determined using inductively coupled plasma optical emission spectrometry to measure iron content. Iron was detected in cells when USPIO-Tat nanoparticles were used, but no uptake was observed when unconjugated USPIO nanoparticles were used. Furthermore, it was demonstrated that labelled CD4+ T cells retained their proliferative and regulatory function invitro and, similarly, no differences were observed in their transmigratory behaviour. The imaging potential of this contrast agent for MRI was evaluated, and USPIO-Tat provided effective contrast enhancement in vitro, while the unlabelled cells did not yield any contrast [130].
Another study in the same field addressed the feasibility of using MRI to monitor T cells in vivo. CLIO–Tat nanoparticles were conjugated to cells and results indicated that labelling of T cells with more than 8000 ng/ml of magnetic nanoparticles did not affect activation, proliferation or upregulation functions. A group of six B6 mice were injected intravenously with a suspension of T cells loaded with 8000 ng/mL of CLIO–Tat. Changes in spleen image intensity caused by the agent were measured by MRI, thereby proving that these particles can be used to analyze T-cell distribution events in vivo [131, 132].
Superparamagnetic nanoparticles of maghemite ( -Fe2O3) have been encapsulated with an Arg-containing cell-penetrating peptide (RRRRRRRRCK–FITC). The FITC was conjugated to observe the intracellular translocation of magnetic nanoparticles into human mesenchymal stem cells, and cellular internalization was examined using a confocal laser scanning microscope (CLSM). Nanoparticles were effectively adsorbed onto the membrane of stem cells. Cell
incubation with NP–peptide conjugates did not show significant cytotoxicity up to 200 g/ml of IONP concentrations [133].
4. MULTIMODAL TECHNIQUES FOR MOLECULAR IMAGING
Molecular imaging represents the future of diagnostic imaging: it evolves from both anatomic and functionalimaging as well as advances in genomics, cell and molecularbiology, chemistry, and physics. Different imaging tech-niques are, in general, complementary rather than compe-titive. Dual-labelled targeting imaging agents, allow cross validation and direct comparison for example between nuclear (the goldstandard) and fluorescence optical image, or MRI and fluorescence, or trimodal nuclear- MRI- fluorescence.
For example, SPECT and PET provide functional information but lack the anatomical information. Computer tomography (CT) is a tomographic imaging technique that uses external X-ray source to produce 3-dimensional anatomic image data. The SPECT/CT and PET/CT systems, currently used in the clinical practice, combine a gammacamara and an integrated X-ray transmission system mounted on the same gantry [134, 135]. The advantage of SPECT/CT or PET/CT is the ability to acquire an anatomic image with CT and a functional image with SPECT or PET sequentially.
In the same direction, a dual-modality PET/NIR fluore-scent peptide has been recently reported by Cai et al. [136]. A QD with an amine-functionalized surface was modified with RGD (90 peptides per QD) and 1,4,7,10-tetraaza-cyclodocecane-N,N',N'',N'''-tetraacetic acid (DOTA) chelators for integrin v 3-targeted PET/NIRF imaging. PET/NIRF imaging, tissue homogenate fluorescence mea-surement, and immunofluorescence staining were performed with U87MG human glioblastoma tumour-bearing mice to quantify the
64Cu-DOTA-QD-RGD uptake in tumour and
major organs. Excellent linear correlation was obtained between the results measured by in vivo PET imaging and those measured by ex vivo NIRF imaging and tissue homogenate fluorescence. Histologic examination revealed that
64Cu-DOTA-QD-RGD targets primarily the tumour
vasculature through a RGD-integrin interaction, with little extravasation. Authors concluded that this dual-function probe has significantly reduced potential toxicity and overcomes the tissue penetration limitation of optical imaging, requisite for quantitative targeted imaging in deep tissue [136].
Fluorescent molecular tomographic (FMT) imaging can monitor molecular function in living animals using specific fluorescent probes. However, macroscopic imaging methods such as FMT generally exhibit low anatomical details. To overcome this, McCann et al. [137] reported a quantitative technique to image both structure and function by combining FMT and MRI. Authors demonstrated that FMT/MR imaging can produce three-dimensional, multimodal images of living mouse brains indispensable to serial monitoring of tumour morphology and protease activity. Combined FMT/MR tumour imaging provides a unique in vivodiagnostic parameter, which reflects histological changes in
92 Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 2010, Vol. 10, No. 1 Ferro-Flores et al.
[105]. Ruan et al. have recently used QDs-Tat as a model system to examine the cellular uptake and intracellular transport of nanoparticles in living cells [106]. The authors obtained dynamic fluorescence imaging. Results indicated that the peptide-conjugated QDs are internalized by macropinocytosis, in agreement with the recent work of Dowdy et al. [107]. It is interesting, that the internalized QDs-Tat are bound to the inner surface of vesicles and trapped in intracellular organelles. An important finding is that the QD-loaded vesicles are actively transported along microtubule tracks to an asymmetric perinuclear region called the microtubule organizing centre (MTOC) [108]. Furthermore, it was found that QDs-Tat strongly bind to cellular membrane structures. These results not only provide new insight into the mechanisms of Tat peptide-mediated delivery, but also are important for the development of nanoparticles probes for intracellular targeting and imaging.
2.3 Carbon Nanotubes
Single-walled carbon nanotubes (SWNTs) show physical properties that make them promising candidates for biological applications. However SWATs conjugated to peptides have only been studied in nuclear and photoacustic imaging. Liu et al. investigated the biodistribution of
64Cu
labelled SWNTs conjugated to PEG and RGD in mice with induced tumours by PET, ex vivo biodistribution and Raman spectroscopy. Results showed a high tumour conjugate accumulation attributed to the multivalent effect of the SWNTs [109]. The SWNT-RGD probe was also used as a photoacoustic molecular imaging agent in living mice [110].
2.4 Gold Nanoparticles
Gold nanoparticles (AuNPs) are inert and non-toxic, since Au(0) gold cores are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity [111]. A second advantage is their easy synthesis [112]. There are two gold-nanoparticle properties that are most relevant: resistance to oxidation and plasmon resonance with light [113]. The plasmon resonance for ordinary gold nanospheres is at 520 nm, in the middle of the visible spectrum, but this can be red-shifted into the near infrared region (NIR) from 800 to 1200 nm. Further versatility is imparted by their readily functionalization with biological molecules to make them interact with a specific biological target. The conjugation of molecules to one AuNP is by means of the spontaneous reaction of a thiol (Cys) or a primary amine with the AuNP surface. Thiols are the most important type of stabilizing molecules for AuNPs of any size. It is an accepted assumption that the use of thiols leads to the formation of strong Au–S bonds [112, 114].
The fluorescence of AuNP rises from the surface plasmon resonance and can be enhanced, quenched or photobleached by the AuNP size, the nature of bounded cap to AuNP as well as the surrounding of the capped-AuNP. Ideally, the efficiency of the energy transfer to the AuNP from its organic cap only depends on the extent of the overlap of the cap band emission and the surface plasmon resonance band of the nanoparticle, which would be translated in a fluorescence resonance energy transfer (FRET) [115]. Fluorescence emission is very important in the study of AuNP conjugated to peptides since in general
peptides contain aromatic residues which transfer their energy to the AuNP following the pathway: fluorescence level (peptide) to phosphorescence level (peptide) to surface plasmon resonance level (AuNP) and the absorbed light re-emitted, usually in the NIR range or close to- if the NIR fluorescence emission is not quenched or masked by the luminescence background in particular, in tissues.
Surujpaul et al. [115] prepared a stable multifunctional system of gold nanoparticles (AuNP) conjugated to [Tyr
3]Octreotide (TOC) peptide which was characterized by
TEM, UV–Vis, infrared and fluorescence spectroscopy. AuNP and AuNP-TOC fluorescence emission spectra were obtained both in solution and in murine AR42J-tumour tissues. The fluorescence analyses in tissue revealed the recognition of the AuNP-TOC conjugate by the neuroendocrine tumour because of the lower energy position of the fluorescence resonance (692 nm) with respect to that of the AuNP in the same tumour tissue (684 nm). The emission band observed in the near infrared region (692 nm) opens the possibility for using AuNP-TOC in bioimaging. More than 500 TOC peptides can be bound to one 20 nm AuNP.
De La Fuente et al. have successfully prepared AuNPs functionalized with the Tat protein-derived peptide sequence GRKKRRQRRR in order to transport the NPs to the cell nucleus [116], and AuNP-RGD for possible phototherapeutic applications [117].
3. IRON OXIDE NANOPARTICLES CONJUGATED TO PEPTIDES FOR MRI
The quest for more potent and selective tumour-targeted diagnostic and therapeutic agents, and the widespread interest in nanotechnology have led to recent proposals that targeted nanoparticle-based pharmaceuticals might be designed to fit this need [118]. Nanoparticles offer two key advantages as targeted agents: nanoparticle geometry consisting of a core, typically with thousands of detectable atoms (iron and gold) and a coating, typically consisting of targeting peptides, antibodies or any molecule with biological activity. Nanoparticles produce multivalent effects due to multiple simultaneous interactions between the surface of the nanoparticle and the surface of the cell, whereas signals in nuclear imaging are the result of biological properties of single radiolabelled peptides.
The MRI technique is a non-invasive imaging modality capable of providing high resolution anatomical images. Basically, it uses the tissue contrast that is generated from the nuclear magnetic resonance (NMR) signals received from hydrogen nuclei located in different physiological environments in living systems. MRI can be expanded through the use of magnetic nanoparticles which improve the differentiation between malignant and healthy tissue. Iron oxide nanoparticles have magnetic properties and have been extensively investigated for biomedical applications due to their excellent biocompatibility and easy of synthesis [119-125]. The main requirement for MRI is the efficient capture of the magnetic nanoparticles by the cell and, when a cell is sufficiently loaded with magnetic material, MRI can also be used for cell tracking [126-127].
Peptides for In Vivo Target-Specific Cancer Imaging Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 2010, Vol. 10, No. 1 91
injection of Cy5.5 dye alone showed nonspecific binding [77].
Wang et al. [78] worked with a cyanine labelled cyclic RGD pentapeptide. The tumour-to-background ratios for human Kaposi's sarcoma in mice injected with Cy5.5-c(KRGDf) and Cy5.5 were 5.5 and 1.5, respectively [78]. Gurfinkel et al. [79] obtained dynamic fluorescence images from a subcutaneous human Kaposi's sarcoma tumour model in mice immediately following the intravenous injection of Cy5.5-c(KRGDf). The fluorescence images, acquired via an intensified charge-coupled device detection system, were used in conjunction with a pharmacokinetic model to determine kinetic properties of target binding in the presence and absence of a competitive ligand (free c(KRGDf)). Results indicated that the conjugate dye behaves similarly in normal tissue to the free Cy5.5 while it possesses increased uptake in tumour tissue. Authors concluded that in vivopharmacokinetic analysis based on dynamic optical imaging may be potentially useful in molecular medicine.
Mono-, di-, and tetrameric RGD peptides were synthe-sized and conjugated with Cy7 by Wu et al. [80]. The integrin specificity of these fluorescent probes was tested invitro for receptor binding assay and fluorescence microscopy and in vivo for subcutaneous U87MG tumour targeting. The tetrameric Cy7-RGD peptide probe with the highest integrin affinity showed the highest tumour activity accumulation and strongest tumour-to-normal tissue contrast.
Waldeck et al. [81] reported that Cy5.5-RGD, combined with near-infrared optical imaging methods, allows the specific imaging of v 3 integrin expression on macro-phages recruited to vascular lesions and may serve to estimate macrophage-bound inflammatory activity of athero-sclerotic lesions.
The development of fluorescent molecules using dicar-boxylic acid-containing carbocyanine fluorophore (cypate)-RGD with high and selective tumour uptake in vivo for optical tumour imaging in mice has also been reported [82, 83]. Such fluorescent molecules not only accelerate the screening of new compounds for lead discovery and opti-mization at cellular levels, but they are also advantageous in tracking, visualizing, and quantifying target specific fluorescent probes in vivo for distribution and metabolism studies. Recently, the evaluation of novel NIR fluorescent multimeric RGD systems based on the simplest RGD motif and cypate showed a remarkable increase in binding affinity respect to the monomer cypate-RGD-NH2. In vivo non-invasive optical imaging showed that the compounds were retained in A549 human non-small-cell lung tumour tissue [84].
Red-region fluorescent dye doped silica nanoparticles (FSiNPs) have also been reported for molecular in vivoimaging. In these nanoparticles, cyanine derivative mole-cules are covalently bound to silica matrix to avoid the dye leaking out nanoparticles in bio-applications. Wu et al. [85] reported the targeting and optical imaging of MDA-MB-231 human breast cancer cells using RGD peptide-labelled FSiNPs. Tissue images demonstrated that the high v 3expression level of the MDA-MB-231 tumours in nude mice was clearly visible and the tumour fluorescence reached maximum intensity at 1 h postinjection [85].
In 2007 Ma et al. developed the fluorescent probe Alexa Fluor 680-G-G-G-Bombesin[7-14]NH2 and demonstrated the ability of this new conjugate to specifically target T-47D breast cancer tissue in mice by fluorescence images [86].
2.2 Quantum Dots
Quantum dots (QDs) or nanocrystals are fluorescent semiconductor nanoparticles (2-10 nm) with many unique optical properties including bright fluorescence, resistance to photobleaching, and a narrow emission bandwidth [87-90]. Their fluorescence emission wavelength can be continuously tuned from 400 nm to 2000 nm by changing both the particle size and chemical composition, at room temperature. Their quantum yields are as high as 85 %. The particles are generally made from hundreds to thousands of atoms (~200-10,000 atoms) of group II and VI elements (e.g. CdSe and CdTe) or group III and V elements (e.g. InP and InAs) [91]. Recent advances have allowed the precise control of particle size, shape and internal structure (core-shell, gradient alloy or homogenous alloy) [92-99]. As cadmium is potentially toxic, Gao et al. [100] developed a class of QD conjugates that contains an amphiphilic triblock copolymer for in vivo protection and multiple PEG molecules for improving biocompatibility and circulation. To make QDs more useful for in vivo imaging, they need to be effectively, specifically and reliably directed to a specific organ or disease site without alteration. Specific targeting can be achieved by attaching targeting molecules to the QD surface. Peptides and peptide analogues are suitable targeting ligands, as large numbers of these molecules can be linked to the surface of a single QD, Fig. (1) [67].
Water-soluble QDs may be cross-linked to peptides using standard bioconjugation protocols, such as the coupling of maleimide-activated QDs to thiol groups [101]. QDs can also act as sensors to detect the presence of biomolecules using intricate probe designs incorporating energy donors or acceptors. For example, QDs can be adapted to sense the presence of the sugar maltose by conjugating the maltose binding protein to the nanocrystal surface [102].
Recently, a detailed procedure for the preparation of QDs-RGD using commercially available PEG-coated QDs was reported by Cai and Chen [67]. A thiolated-RGD peptide was conjugated to QDs through 4-maleimidobutyric acid N-succinimidyl ester. Prior to in vivo imaging of human glioblastoma tumours which was successful in mice, competitive cell binding assay and live cell staining were carried out to confirm the successful attachment of the RGD peptides to the QD surface.
Shah et al. [103] used QDs-RGD for labelling of human mesenchymal stem cells (hMSCs) during self-replication and multilineage differentiations into osteogenic, chondrogenic, and adipogenic cells. Authors concluded that QDs-RGD is an effective probe for long-term labelling of stem cells.
Young and Rozengurt [104] demonstrated that QDs-bombesin conjugates can label the bombesin-preferring G protein-coupled receptors (GPCR) in living mice, suggesting that QDs technology can be adapted to monitor in vivoligand binding to GPCRs.
QDs conjugated to the HIV Tat peptide, were quickly bound to cells and become internalized via endocytosis
90 Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 2010, Vol. 10, No. 1 Ferro-Flores et al.
tissues close to the surface of the skin and tissues accessible by endoscopy and intraoperative visua-lization [67].
2.1 Near-Infrared Fluorochromes
Organic fluorescent dyes are the most commonly used fluorochromes. Dyes such as fluorescein isothiocyanate (FITC) and carboxyfluorescein diacetatesuccinimidyl ester (CFSE) have been used for various biological applications, such as fluorescent-labelled antibodies and molecules that are used to stain cells or organelles [68]. However, they are prone to rapid photobleaching (fast photochemical destruc-tion of a fluorophore by the light exposure) and, thus, are unsuitable for extended periods of bioimaging observations. Most organic dyes have a relatively broad emission spec-trum. Emission/excitation wavelength is often affected by changes in local chemical environment (e.g., pH, interacting ions,etc.). Because of this, exogenously administered fluoro-chromes that fluoresce in the NIR region [60-71] such as cyanine (Cy) dyes, are now finding increasingly application in fluorescence imaging, but when the emitted light wavelength is beyond =850 nm their quantum yield is low (low brightness) with low photostability [72, 73] (Fig. 2). However, the commercial available near-IR carboxyfluore-scein (Near-IR CF
TM dyes Biotum, USA), with absorption
and emission wavelengths between 650 and 800 nm, is reported to be significantly brighter and more stable than other commercial dyes of similar wavelength, Fig. (2). CF750 is so bright and can be excited at 633 nm (i.e., at the shoulder wavelength of the absorption maximum) but still emits stronger fluorescence at ~770 nm than APC-based tandem dyes, i.e. Cy7. It is possible to find in the near future interesting NIR fluorescence images using this new dye.
Fluorescence intensity of some cyanine dyes changes upon specific reaction with nitric oxide, which is an important signalling molecule involved in the regulation of a wide range of physiological and pathophysiological mechanisms, and many disorders [74].
In the particular case of peptides, novel NIR fluorescent arginine-glycine-aspartic acid (RGD) compounds with imp-roved receptor binding affinity, cellular internalization, and other activities are being studied to improve the sensitivity and specificity of tumour targeting. The combination of the specificity of RGD peptide/integrin interaction with near-infrared fluorescence detection may be applied to non-invasive imaging of integrin expression and monitoring anti-integrin treatment efficacy providing near real-time mea-surements.
Chen et al. [75] showed that the Cy5.5-RGD conjugate exhibits affinity for v 3 integrin (IC(50) = 58.1 ± 5.6 nmol/L). In vivo imaging with a prototype three-dimensional small-animal imaging system visualized subcutaneous U87MG glioblastoma xenograft with a broad range of concentrations of fluorescent probe administered via the tail vein. Tumour uptake was blocked by unlabelled c(RGDyK) demonstrating the Cy5.5-RGD specificity [75]. Authors also synthesized Cy5.5-conjugated mono-, di-, and tetrameric RGD peptides to investigate the effect of multimerisation of RGD peptide on integrin avidity and tumour targeting efficacy. All three peptide-dye conjugates had integrin specific uptake both in vitro and in vivo. Among them, tetramer displayed the highest tumour uptake and tumour-to-normal tissue ratio from 0.5 to 4 h postinjection. Tumour-to-normal tissue ratio for Cy5.5-conjugated RGD monomer, dimer, and tetramer were found to be 3.18 ± 0.16, 2.98 ± 0.05, and 3.63 ± 0.09, respectively, at 4 h postinjection. These results suggested that Cy5.5-conjugated monomeric, dimeric, and tetrameric RGD peptides are all suitable for integrin expression imaging [76].
The v 3 expression has also been assessed in an orthotopic brain tumour model by using a three-dimensional optical imaging system (IVIS 200) after administration of monomeric Cy5.5-RGD. NIRF imaging showed the highest tumour uptake and tumour to normal brain tissue ratio at 2 h postinjection (2.64 ± 0.20). Tumour uptake of Cy5.5-RGD was effectively blocked by using unlabelled c(RGDyK) and
Fig. (2). Absorption spectra of Cy7 and CF750 NIR-dyes, before (t=0) and after (t=30 min) exposure to sunlight. (Biotum, USA).
Peptides for In Vivo Target-Specific Cancer Imaging Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 2010, Vol. 10, No. 1 89
growth factors in several tumours, such as colon and gastric cancers. They are structurally related in that they have the same C-terminal five amino acids (-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2), which is the active site for binding to cholecystokinin-2 (CCK-2) receptor. CCK-2 receptor protein has been iden-tified in cell-membranes of medullary thyroid carcinomas (92 %), whereas it is absent in differentiated thyroid cancers. Specifically,
99mTc-labelled minigastrin has shown a high
affinity for the CCK-2/gastrin-receptors in vivo [1,27,28]. Approximately 13 different peptides labelled with
99mTc or
111In have been recently reported to target CCK-B receptors
[14].
1.4 Peptide Ligands for Integrin v 3: Markers of Tumour Angiogenesis
“Angiogenesis represents the formation of new capilla-ries by cellular outgrowth from existing microvessels” [29]. Integrins are cell-adhesion receptors able to convert extra-cellular ligand binding into activation of intracellular pro-cesses (outside-in signalling) as well as employing intra-cellular processes to activate cellular responses (inside-out signalling). The alpha(v)beta(3) ( v 3) integrin is involved in tumour induced angiogenesis and tumour metastasis. The high binding specificity to v 3 integrins of peptides containing Arg-Gly-Asp (RGD) residues has been used to radiolabel RGD peptides useful as tumour specific imaging agents.
A considerable number of synthetic peptides containing RGD have been developed. It has been found that constraining the RGD mobility in a cyclised pentapeptide increased the potency in vitro. These data suggest that the binding site in the v 3 receptor is limited.
Monomeric c-RGDyV (cyclic-Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Val) peptide was first labelled in 1999 by Haubner et al. with
125I
[30]. This relatively lipophilic compound had rapid tumour washout and unfavourable hepatobiliary excretion. The resulting high liver and intestinal activity accumulation limited its further application. Glycosylation of the RGD peptide decreased the lipophilicity and, consequently, the hepatic uptake [31]. The same glycopeptides was then labelled with
18F [32-33].
The peptide ligands for v 3 receptors mostly used in the labelling with
99mTc,
18F or
68Ga are c-RGDyK and c-RGDfK
(cyclic-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys) in both forms, as mono-mers or as dimers [34-40]. In these peptides the lysine side chain provides primary amine functionality for coupling bifunctional chelating agents. To improve targeting effi-ciency multimeric RGD systems have been design and more than 30 RGD derivatives labelled with
18F,
64Cu,
68Ga or
99mTc have been developed [14, 41-43]. It is important to
mention that RGD peptides do not belong to the regulatory peptide family, but are important since they can target neoangiogenic vessels through integrin receptors.
1.5 Peptide Ligands for Neurotensin Receptors
Neurotensin (NT) is a 14 amino acid linear peptide that is found in high concentration in the ileum and hypothalamus, and induces various physiologic effects such as hypotension, analgesia, gut contraction, and an increase of vascular permeability. Receptors of neurotensin are expressed in
pancreatic and prostate cancer [1, 44]. 99m
Tc-labelled neuro-peptide-Y (NPY) analogues are also useful for detecting sarcomas [45, 46].
Another receptors such as melanocortin-1 (MC1R), vasointestinal peptide (VPAC-1), glucagon-like-peptide-1 (GLP-1) and chemokine 4 (CXCR4) have also been targeted in vivo with radiolabelled peptides and recently discussed [14, 43].
1.6 Tat Penetrating Peptides
Targeted entry into cells is an increasingly important research area. Diagnoses and treatment of disease by novel methods would be greatly enhanced by efficiently transpor-ting materials to living cell nuclei. Penetrating peptides (PPs) are attractive drug delivery tools. The PPs used in molecular imaging are mainly based on two peptides, HIV Tat peptide (TATp; RKKRRQRRR) and antennapedia homeodomain peptide (Antp or “penetrating”; RQIKIWFQNRRMKWKK) [47]. The HIV Tat-derived peptide is a small basic peptide called “trojan horse” because it has been successfully used to deliver a large variety of cargoes into cells such as nanoparticles, proteins, peptides and nucleic acids. The “transduction domain” or region conveying cell penetrating properties appears to be confined to a small stretch of basic amino acids with the sequence RKKRRQRRR and known as Tat(49-57) [47-50]. Hybrid radiopharmaceuticals, as for example
99mTc-N2S2-Tat(49-57)-Lys
3-Bombesin, have dem-
onstrated a significant increasing cancer cell uptake and consequently image contrast of breast cancer tumours [51]. Tat peptides do not belong to the regulatory peptide family.
2. PEPTIDES FOR OPTICAL IMAGING
Nuclear imaging is limited by several factors such as time consuming data acquisition, expensive equipment, exposure to radioactivity, the need for highly skilled person-nel [5]. Optical imaging offers real-time, nonradioactive, and, depending on the technique, high-resolution imaging of fluorophores embedded in diseased tissues [52]. Of the various optical imaging techniques investigated to date, near-infrared (NIR, 700-1000 nm wavelength) fluorescence-based imaging is of particular interest for non-invasive in vivoimaging because of the relatively low tissue absorption, scatter, and minimal autofluorescence of NIR light [53]. This is because haemoglobin (the primary absorber of visible light), water and lipids (the primary absorbers of infrared light) have their lowest absorption coefficients in the NIR region [54,55]. Deeper tissue areas are thus accessible for tomographic display of the optical signals. Advanced fluore-scence imaging techniques, such as fluorescence molecular tomography (FMT) [56-63] and fluorescence reflectance imaging (FRI) [64-66], commonly employ NIR wavelengths for in vivo molecular imaging applications. Fluorescence imaging methods are generally superior in terms of sensitivity and ease of use [54]. However, NIR fluorescence imaging in small animals cannot be directly scaled up to invivo imaging in patients due to the limited optical signal penetration depth ( 7 mm by fluorescence resonance imag-ing and 20 cm by fluorescence molecular tomography) [54]. In clinical settings, fluorescence imaging is relevant for
88 Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 2010, Vol. 10, No. 1 Ferro-Flores et al.
1.1 Somatostatin Analogues
Somatostatin is a cyclic peptide comprised of 14 amino acids and plays an important role in the secretion of hormones, such as growth hormone, insulin and glucagon. It is now recognized that there are five somatostatin receptor subtypes. Octreotide (OC) was developed as a somatostatin analogue for hypersecretion suppression to control the symptoms of neuroendocrine diseases. OC contains eight amino acids retaining an internal disulfide crosslink to constrain the geometry of the four essential amino acids, and is stable against enzymatic degradation in vivo. Pituitary adenomas and several neuroendocrine, tumours over-express somatostatin receptors such as: carcinoid, pancreas, pheo-chromocytomas, medullary thyroid carcinoma, paragan-gliomas, gastrinoma, glucagonoma, neuroblastoma, menin-gioma, insulinoma and small cell lung cancer. In somato-statin-based cancer imaging, a stable somatostatin analo- gue is linked to a bifunctional chelating agent that can bind radioactive elements such as,
111In and
99mTc for SPECT or
18F and
68Ga for PET. Radiolabelled Tyr
3-OC (TOC) is
currently used in the clinical practice as a stable complex to detect neuroendocrine tumours by molecular imaging in nuclear medicine [6-10].
99mTc-Depreotide, a radiolabelled
OC analogue developed in 1996 by Pearson et al. [11], has been recently approved for human use in USA and Europe because of its successful results in the diagnosis of solitary pulmonary nodules [12, 13]. A detailed list of 145 peptides labelled with
99mTc,
18F,
68Ga,
111In,
64Cu or
86Y (29 to target
somatostatin receptors) already investigated in clinical studies and those developed during the last five years (agonist and antagonist) has been recently reviewed [1,14].
1.2 Bombesin/Gastrin-Releasing Peptide Analogues
The small peptide bombesin (BN, 14 amino acids) was isolated from frog skin and it belongs to a large group of neuropeptides with many biological functions. The human equivalent is the gastrin-releasing peptide (GRP, 27 amino acids) and its receptors (GRP-r) are over-expressed in the tumour cell membrane. GRP differs from bombesin in only one of the 10 carboxy-terminal residues and this explains the similar biological activity of the two peptides. The strong, specific BN-GRP-r binding is the basis for labelling BN with radionuclides such as
68Ga,
64Cu,
18F and
99mTc for nuclear
imaging [15-22]. BN receptor subtype 2 (GRP receptor) is over-expressed in various human tumours including breast, prostate, small cell lung and pancreatic cancer, Fig. (1) [23-25]. Approximately 30 different radiolabelled peptides (agonist or antagonist) to target GRP-R have been recently reviewed [1,14,26].
1.3 Peptide Ligands for Cholecystokinin (CCK) and Gastrin receptors
Cholecystokinin (CCK) and gastrin act as neurotrans-mitters in the central nervous system, as regulators of various functions in the gastrointestinal tract, and as stimulatory
Fig. (1). Schematic illustration of the multiple modalities for in vivo target-specific cancer imaging with peptides conjugated to quatum dots,
metallic nanoparticles, near-infrared fluorochromes or radionuclides.
Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 2010, 10, 87-97 87
1389-5575/10 $55.00+.00 © 2010 Bentham Science Publishers Ltd.
Peptides for In Vivo Target-Specific Cancer Imaging
G. Ferro-Flores*,1
, F. de M. Ramírez2, L. Meléndez-Alafort
3 and C.L. Santos-Cuevas
1,4
1Department of Radioactive Materials. Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares, Estado de México, Mexico
2Department of Chemistry. Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares, Estado de México, Mexico
3Deparment of Pharmaceutical Science, Facoltà di Farmacia, Università di Padova, Italy
4Faculty of Medicine, Universidad Autónoma del Estado de México, Mexico
Abstract: Molecular imaging comprises non-invasive monitoring of functional and spatiotemporal processes at molecular
and cellular levels in living systems. Advanced imaging techniques can monitor such processes. Peptide receptors over-
expressed in tumours can be targeted by peptides conjugated to radionuclides, near-infrared fluorochromes, metallic
nanoparticles or quantum dots for target-specific cancer imaging.
Key Words: Peptides, molecular imaging, quantum-dots, nanoparticles.
INTRODUCTION
Regulatory peptide analogues represent a class of molecules developed for specific cancer targeting. In spite of having a relatively short history of about 2 decades, they are now receiving increasing interest, as they often are advan-tageously compared with immunotargeting using antibodies [1]. These peptides control and modulate the function of almost all key organs and metabolic processes and include neuropeptides which are present in the brain, gut peptide hormones, as well as peptides present in vascular (vasoactive peptides) and endocrine systems [2].
Regulatory peptide-receptors are proteins over-expressed in numerous human cancer cells. These receptors have been used as molecular targets for labelled peptides to localize tumours. The useful clinical results achieved during the last decade with somatostatin receptor-expressing neuroendo-crine tumour imaging, have been useful for the study of other peptides to target alternative cancer-associated peptide receptors such as gastrin-releasing peptide, cholecystokinin, peptide ligands for integrin receptors or neurotensin. The improvement of peptide analogues allows specific clinical imaging and therapy of different tumour types, including breast, prostate, lung, intestine, pancreas and brain tumours [1,3,4]. Therefore, specific cancer targeting through selective peptides for diagnostic and therapeutic purposes is consi-dered to be a promising strategy in oncology.
Molecular imaging comprises non-invasive monitoring of functional and spatiotemporal processes at molecular and cellular levels in humans and other living systems. Imaging techniques such as magnetic resonance imaging (MRI), single photon emission computed tomography (SPECT),
*Address correspondence to this author at the Departamento de Materiales
Radiactivos, Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares, Carretera
México-Toluca S/N., La Marquesa, Ocoyoacac, Estado de México, C.P.
52750, México, Tel: + (52) (55)-53297200 ext. 3863; Fax. + (52) (55)-
53297306; E-mail: [email protected],
positron emission tomography (PET) and optical fluore-scence imaging (OI) have been used to monitor such processes. The present review affords an overview of the most outstanding in vivo peptides for cancer imaging using the different medical diagnostic techniques such as those mentioned above, which rely mostly on the use of radio-peptides and peptides conjugated to near-infrared fluorochro-mes, metallic nanoparticles or quantum dots (nanocrystals).
1. COMMON PEPTIDES USED AS RADIOLABELLED DIAGNOSTIC AGENTS
The term molecular imaging implies the in vivo charac-terization and measurement of biologic processes at cellular and molecular levels. In contrast to conventional diagnostic imaging, endeavours to probe the molecular abnormalities that are the basis of disease rather than to image the end effects of these molecular alterations [5].
Molecular biology, cell biology and imaging technology gave birth to molecular imaging as it is today. Three diffe-rent non-invasive in vivo imaging technologies have been developed in parallel (MRI, OI, Nuclear Imaging), and peptide-specific targeting of a particular cell receptor can be imaged with a paramagnetic, fluorescent, or radionuclide-labelled probe. The convergence of these disciplines is the key of the molecular imaging success story and constitutes the source for further advances in the field.
Nuclear imaging is an established clinical molecular imaging modality that offers good sensitivity deep in tissue. Radiolabelled peptides (for PET and SPECT imaging) pro-duce signals constantly through the decay of a radionuclide, whereas some probes produce signals only when they interact with its target (e.g., near-infrared fluorescent probes for optical imaging). Most radiolabelled peptides are administered at doses free of pharmacologic side effects (nonpharmacological nanogram levels) as compared with peptides for MRI and optical techniques that are usually dosed in mass levels (typically micrograms to milligrams).
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99mTc-Tat-BN: dosimetry and effect on DNA Santos-Cuevas et al. 313
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all of which remains in the membrane [7]. Biodistribu-
tion studies in mice with PC3 tumours showed that the
tumour-to-muscle radioactivity ratio was 8.5 for 99mTc-
Tat-BN and 7 for 99mTc-BN [7]. It has been calculated
that the nuclear-absorbed dose from 99mTc-BN located in
the MCF7 membrane is 0.09Gy/Bq (data not published)
and, therefore, is approximately two orders of magnitude
lower than that of 99mTc-Tat-BN (8.19Gy/Bq) interna-
lized in the cell nucleus.
NLS peptides have been successfully used to route
different molecules to the cell nucleus [29–32]. It has
been shown that NLS conjugation to 111In-HuM195
(anti-CD33) and 111In-trastuzumab (anti-HER2) anti-
bodies considerably increases their nuclear uptake in
leukaemia and breast cancer cells, enhancing their
toxicity [29,30]. It is possible that in all of these hybrid
radiopharmaceuticals, the positive charges of Tat (49-57)
or of any NLS peptide generate an electrostatic interac-
tion with the negatively charged DNA, producing cell
toxicity from a biological Auger effect and not only from
a simple increase in the macroscopic absorbed dose. It
is important to point out that an advantage of 99mTc
(T1/2=6h) with respect to 111In (T1/2=67h) is its
shorter half-life; 99mTc is able to produce a higher number
of disintegrations in a few hours and reach higher
absorbed doses per unit of time.
The 99mTc-Tat-BN hybrid radiopharmaceutical could be
used in targeted radiotherapy as part of a combined
therapy scheme. Multidrug resistance (MDR) in cancer
cells is the simultaneous development of resistance to a
variety of antitumour agents; one MDR mechanism of
action is the increased efflux of chemotherapeutic agents
by transport proteins. The expression of breast cancer
resistance protein mediates this drug efflux-type of MDR
[33]. Cytotoxic analogues of bombesin in combina-
tion with other peptides have been successfully used
to inhibit cancer cell proliferation in MDR cancer cells
[33–35]. As an example of combined therapy, Costantini
et al. [30] have shown that 111In-NLS-trastuzumab can
kill trastuzumab-resistant breast cancer cell lines through
the emission of Auger electrons in combination with
methotrexate for cell radiosensitization.
ConclusionThe presence of Tat(49-57) in 99mTc-Tat-BN efficiently
routed radiopharmaceuticals to the nuclei of PC-3 cells
and breast carcinoma cell lines, MDA-MB231 and MCF7,
in which the nanometre-to-micrometre range Auger and
IC electrons significantly reduced the cellular prolifera-
tion when depositing from 0.142 to 0.434mGy/decay.
The hybrid could be potentially useful in breast and
prostate cancer therapy as part of a combined therapy
scheme.
AcknowledgementThis study was supported by the National Council of Science
and Technology (CONACyT-SALUD-69051-Mexico).
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312 Nuclear Medicine Communications 2011, Vol 32 No 4
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The results presented herein show that 99mTc-Tat-BN
was internalized in cancer cells with specific recognition
for GRP-r. In general, immunohistochemical analyses
showed an increased Tat-BN abundance in the nucleus,
an event that was associated with the inhibition of cellu-
lar proliferation, mainly as a result of Auger and low-
energy IC electrons from 99mTc-Tat-BN inside the nuclei.
The biological effect of Auger and low-energy IC elect-
rons is not the only therapeutic property possible for99mTc-Tat-BN because the cellular radiation dose can also
damage membranes and organelles and initiate signalling
of apoptotic pathways within the cells [25,26]. The CD95
ligand is a member of the family of Tumour necrosis
factor-related cytokines and is found in both soluble and
membrane-bound forms. A number of studies have shown
that activation of the death receptor CD95 system
induces apoptosis. Friesen et al. [26] reported that after
irradiation of leukaemia cells, upregulation of the CD95
ligand and the CD95 receptor was detected, along
with the consequent activation of caspases. In addition,
irradiation-mediated mitochondrial damage resulted in
the perturbation of the mitochondrial membrane poten-
tial, cytochrome c release and caspase-9 activation. It has
also been shown that the incorporation of 125I (24.9 Auger
electrons/decay) into the DNA induces apoptosis through
caspase 3 [27]. The bystander effect of radiation also plays
an important role in Auger-targeted radiotherapy [28].
It is noteworthy to mention that the proliferation assay
using DNA provides an accurate indication of the relative
cell number, but may reflect both cell cycle arrest and
apoptosis; therefore, the evaluation of a proapoptotic
effect of 99mTc-Tat-BN and Tat-BN should be taken into
account and deserves further investigation.
Earlier, we have shown that the conjugation of 99mTc-BN
with Tat peptide produces a significant increase in can-
cer cell internalization, compared with 99mTc-BN, nearly
Fig. 5
150MDA-MB231
100
50
0
∗
∗ ∗
80
MCF7
40
0
DN
A c
oncentr
ation (
ng
/ml)
∗∗
∗
60
PC3
30
0
Untreated 2.5 µmol/l 1.3 µmol/l 2.0 µmol/l
Tat-BNAstemizolecells
5.4 MBq 8.1 MBq
∗
∗∗
99mTc-Tat-BN
Effect of Tat-BN and 99mTc-Tat-BN on cancer cell proliferation. Proliferation is correlated directly with DNA concentration (ng/ml). 99mTc-Tat-BNsignificantly inhibited cell proliferation. *Statistically significant difference (P<0.05) vs. control (untreated cells)
99mTc-Tat-BN: dosimetry and effect on DNA Santos-Cuevas et al. 311
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The Tat mitogenic activity could also explain the lower
DNA concentration obtained with astemizole (inhibitor
of the cellular proliferation process) compared with that
of 99mTc-Tat-BN in PC-3 and MDA-MB231 cells.
However, the proliferation in MCF7 cells was similar
with 99mTc-Tat-BN and with astemizole treatment.
These data correlate well with the kinetic and absorbance
dose results, which indicate that a higher number of
disintegrations, and therefore a higher absorbed dose,
occur in the MCF7 nucleus (Table 4).
DiscussionAbsorbed doses at the subcellular level using Monte Carlo
methods have been reported earlier. However, spherical
cell models with a radius of 1–10 mm were assumed
[21,22]. Cancer cell geometries and sizes are quite differ-
ent from ideal spheres (Table 1, Figs 2–4), and geo-
metry and size are considered critical factors for assessing
the IC absorbed-energy fraction over nuclear dimensions.
The consideration of radiopharmaceutical subcellular kine-
tics from the experimental data is also a critical factor to
improve accuracy in cellular radiation-absorbed dose cal-
culations. Although dimensions of cancer cells in vivo are
expected to be somewhat smaller than in vitro, the kine-
tics of nuclear internalization are expected to be the same.
Low-energy Auger electrons have traditionally been
considered to be the most suitable particles for the
inactivation of single-spread malignant cells. However, in
the case of 99mTc, IC electrons emitted with the highest
yield per decay (99.9–88%) and the lowest energy (i.e.
1.82 keV), deposited, on average, 13.66% of their energy
over the nuclear dimensions (ellipsoids from 23� 17–
16� 11 mm) and were the principal contributors to the
nuclear-absorbed dose (70.26%). Therefore, these parti-
cles (IC) could be extremely radiotoxic if they were able
to contact DNA. Lundqvist et al. [23] have shown that
it is important to distinguish between what might be a
normal increased cellular dose and the biological Auger
effect. Electron energies close to the ionization potential
(< 30 eV) will only have a marginal biological effect, and
electrons above 5 keV will not contribute to the local
effect. For example, an Auger electron with an energy of
approximately 20 keV is ideal for full deposition within
the size of a mammalian cell, but it will be far from
the DNA and will not have the local DNA impact that
is usually associated with the biological Auger effect,
which occurs within cubic nanometres. Recently, Tavares
and Tavares [24] calculated that 99mTc CKMMX [all
M-shell Coster–Kronig (CK) and super CK transitions,
where one of the two new vacancies (X) is in the M-shell]
electrons and Auger MXY [all M-shell Auger transitions,
where neither of the two new vacancies (X, Y) is in the
M-shell] near the DNA have a therapeutic potential
comparable to 211At a particles (high linear energy
transfer).
Fig. 4
Tat-BNis not observedin the nucleus
Tat-BNis observed inthe nucleus
CF
20 µm
CF
20 µm
20 µm
E
20 µm
E
(a)
(b)
Immunohistochemical analysis of Tat-BN in MDA-MB231 cells. (a) Control: without Tat-BN and anti-Tat, followed by fluorescence-labelled secondantibody anti-Tat. (b) Cells incubated with Tat-BN and anti-Tat followed by fluorescence-labelled second antibody anti-Tat. CF: phase contrast image,E: cell excitation at l=488nm. Tat-BN was located in the nucleus of cancer cells, as indicated by arrows.
310 Nuclear Medicine Communications 2011, Vol 32 No 4
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unit (1 Bq) captured by the cell (Gy/Bq) was calculated
as a sum of dose contribution from membrane activity to
nucleus (N’M), and dose from cytoplasm to nucleus
(N’C), and dose from nucleus to nucleus (N’N). For
example, in MCF7, the dose contribution from mem-
brane activity to the nucleus was 0.0155±0.0005Gy/Bq;
the dose from cytoplasm to the nucleus was 0.0447
±0.0011Gy/Bq and the dose from the nucleus to the
nucleus was 8.1315±0.0168Gy/Bq, so that the total dose to
the MCF7 nucleus was 8.1918±0.0185Gy per cell-bound
activity unit (1 Bq). 99mTc-Tat-BN-absorbed doses in the
cytoplasm and nucleus of PC-3, MCF7 and MDA-MB231
cells are shown in Table 4. It is important to mention
that, in general, a 2Gy acute dose will kill 50% of an in-
vitro cell sample but a 100Gy acute dose is necessary to
kill all of them. The IC electrons of 99mTc deposited
13.66±0.29% of their emitted energies, whereas Auger
electrons deposited 99.61± 0.24% of their emitted
energies over the cell nucleus dimensions. Nevertheless,
in all cases, the average contribution to the total absorbed
dose in the cell nuclei was 70.26±0.36% of IC electrons
and 29.23±0.55% of Auger electrons because of the low
Auger energy and yield per decay. These results mean
that, for example, in PC3 cells (total nucleus absorbed
dose=2.49Gy/Bq), the nuclear-absorbed dose by Auger
contribution is 0.73Gy/Bq, whereas the nuclear-absorbed
dose by IC contribution is 1.75Gy/Bq. Although the main
absorbed dose is from IC electrons, the DNA damage
probability is higher from Auger electrons (discussed
below).
The effects of 99mTc-Tat-BN on cellular proliferation at
different concentrations (5.4 or 8.1MBq) were tested on
cancer cells (Fig. 5). As shown in Fig. 5, 99mTc-Tat -BN
(5.4MBq) significantly inhibited cell proliferation on
MDA-MB231 (35.80%), MCF7 (45.71%) and PC-3
(52.98%) with respect to that of untreated cells (P<
0.05). However, in the presence of 1.3 and 2.0mmol/l of
Tat-BN cell growth was observed in cells because of the
well-known mitogenic activity of Tat [20] and this may be
the reason by which apparently 8.1MBq (2.0 mmol/l Tat)
of 99mTc is not more effective than 5.4MBq (1.3 mmol/l
Tat) in reducing DNA concentration. Nevertheless, it can
be deduced that in the 99mTc-Tat-BN radiopharmaceu-
tical, the antiproliferative effect of 99mTc (Auger and IC
electrons) prevails over the Tat mitogenic effect (Fig. 5).
Fig. 3
Tat-BNis not observedin the nucleus
Tat-BNis observed inthe nucleus
CF
20 µm
CF
20 µm
20 µm
E
20 µm
E
(a)
(b)
Immunohistochemical analysis of Tat-BN in MCF7 cells. (a) Control: without Tat-BN and anti-Tat followed by fluorescence-labelled second antibody-anti-Tat. (b) Cells incubated with Tat-BN plus anti-Tat followed by fluorescence-labelled second antibody anti-Tat. CF: phase contrast image, E: cellexcitation at l=488nm. Tat-BN was located in the nucleus of cancer cells, as indicated by arrows.
99mTc-Tat-BN: dosimetry and effect on DNA Santos-Cuevas et al. 309
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Table 4 Total disintegrations and mean absorbed doses in cancer cells per cell-bound activity unit (Bq) for 99mTc-Tat-BN obtained fromexperimental biokinetic data and Monte Carlo simulation (Penelope, 2008)
N=Total disintegrations per Bq
N ¼
Z
t
0
AðtÞdt
0
@
1
A
Absorbed dose (Gy/Bq)
Cell line Membrane Cytoplasm Nucleus Cytoplasm Nucleus
PC3 3229 8766 17826 0.2389±0.0009 2.4973±0.0058MCF7 5338 6826 19 151 0.4309±0.0018 8.1918±0.0185MDA-MB231 4810 13380 12880 0.4688±0.0014 3.5437±0.0088
Fig. 2
Tat-BNis not observedin the nucleus
Tat-BNis observed inthe nucleus
CF
20 µm
CF
20 µm
20 µm
E
20 µm
E
(a)
(b)
Immunohistochemical analysis of Tat-BN in PC3 cells. (a) Control: without Tat-BN and anti-Tat followed by fluorescence-labelled second antibody-anti-Tat. (b) Cells incubated with Tat-BN and anti-Tat followed by fluorescence-labelled second antibody-anti-Tat. CF: phase contrast image, E: cellexcitation at l=488 nm. Tat-BN was located in the nucleus of cancer cells, as indicated by arrows.
Table 3 Biokinetic model of 99mTc-Tat-BN internalized in cancer cells
A(t) =Activity as a function of time
Cell line Membrane Cytoplasm Nucleus
PC3 41:4e� 0:847t þ 8:63e� 0:850t þ 1:31e� 0:0427t
R2 ¼ 0:956
� 45:5e� 0:579t þ 31:4e� 0:137t þ 27:4e� 0:295t
R2 ¼ 0:998
� 91:8e� 0:628t þ 54:4e� 0:123t þ 63:9e� 0:321t
R2 ¼ 0:994
MCF7 63:8e� 1:1t þ 4:02e� 0:075t þ 2:74e� 0:0747t
R2 ¼ 0:987
� 60e� 0:508t þ 8:65e� 0:0871t þ 59:4e� 0:285t
R2 ¼ 0:998
� 103e� 0:630t þ 45:9e� 0:103t þ 81:7e� 0:327t
R2 ¼ 0:990
MDA-MB231 � 19:8e� 2:31t þ 6:83e� 0:0948t þ 19:4e� 0:277t
R2 ¼ 1
1:82e� 0:353t þ 25:7e� 0:0847t þ 5:35e� 0:0848t
R2 ¼ 0:976
� 188e� 6:83t þ 41:8e� 0:183t þ 12:3e� 0:0784t
R2 ¼ 1
308 Nuclear Medicine Communications 2011, Vol 32 No 4
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The absorbance of the wells was measured in a micro-
plate reader (Bio-Tek, Sinergy HT, Nova Biotech, El
Cajon, California, USA). Finally, the well absorbances
were correlated with DNA concentrations (ng/ml) using
the standard curve.
Subcellular dosimetry
The radiation-absorbed doses delivered to the nucleus of
PC3, MCF7 and MDA cells from 99mTc-Tat-BN were esti-
mated by Monte Carlo methodology using the Penmain
programme of Penelope 2008 code. The geometry and
size of the cells and nuclei were built from cell immuno-
fluorescent images (n=50), and the average dimen-
sions were determined using the Zeiss LSM Image
Examiner Software (Carl Zeiss AG, Jena, Germany).
The volumes of the subcellular compartments were cal-
culated (Table 1), and the elemental compositions of the
membrane, cytoplasm and nucleus were obtained from
the literature [16,17]. In the source simulation, all
emission of IC and Auger electrons (including Coster–
Kronig and super Coster–Kronig) of 99mTc spectrum
presented in the Auger Electron Dosimetry AAPM Report
were used [3]. The deposited energy (MeV) per dis-
integration and per gram of cell nucleus was converted to
grays (J/kg)/disintegration, and the nucleus absorbed
doses for 99mTc-labelled Tat-BN were calculated by
multiplying the grays/disintegration by the total number
of disintegrations (N) that occurred in the nucleus per
internalized radioactivity unit (becquerel), based on the
experimental biokinetic results described above. Con-
tributions to nuclear-absorbed doses from 99mTc-labelled
Tat-BN localized in membrane and cytoplasm were also
calculated to obtain the total nucleus absorbed dose per
internalized becquerel (Gy/Bq).
ResultsThe radiochemical purity of 99mTc-Tat-BN was 94±2%,
as obtained with good correlation by ITLC, Sep-Pak
and HPLC analysis without postlabelling purification
(n>30). 99mTc-Tartrate determined by ITLC was less
than 2%. The average specific activity was 14MBq/nmol.
As can be seen in Table 2, 99mTc-Tat-BN was internalized
with specific recognition for GRP-r that are overexpressed
in PC3, MCF7 and MDA-MB-MB231 cancer cells
because there were significant differences in the percen-
tage of internalization between blocked and unblocked
cells (P<0.05). Although MCF7 and MDA-MB231 are
both breast cancer cell lines, the difference in cell
internalization can be related to the fact that MCF7 are
oestrogen-dependent and MDA-MB231 are oestrogen-
independent cell lines; it has been suggested that the
GRP-r expression is oestrogen-dependent in the early
stages of breast carcinoma [18].
In-vitro kinetics showed that 59.77, 61.15 and 41.45%
of total disintegrations per cell-bound 99mTc-Tat-BN acti-
vity unit (1 Bq) occurred in the nucleus of PC-3, MCF7,
and MDA-MB231 cells, respectively (Tables 3 and 4).99mTc-Tat-BN average residence times (N/Ao) in cell
nuclei were 4.95 h (PC-3), 5.31 h (MCF7) and 3.57 h in
MDA-MB231. The higher number of disintegrations that
occur in the MDA-MB231 cytoplasm with respect to that
of MCF7 cytoplasm (Table 4) could be associated with
the higher MDA-MB231 lysosomal activity because the
internalization process of the ligand/GRP-r complex in-
volves some trapping by lysosomes [19].
Confocal microscopy images seen in Figs 2–4 show that
Tat-BN is internalized in the nuclei of the three cancer
cell lines used in this study. In control images (without
Tat-BN), the fluorescence-labelled second antibody-anti-
Tat conjugate is internalized to the cytoplasm but not to
the nucleus. When the Tat-BN peptide was added and
followed by anti-Tat antibody and the second fluores-
cence-labelled antibody, fluorescence was observed in the
nuclei, showing Tat-BN nucleus internalization.
99mTc-Tat-BN-absorbed doses delivered to the nuclei
were 0.142mGy/disintegration (PC-3), 0.434mGy/disin-
tegration (MCF7) and 0.276mGy/disintegration (MDA-
MB231). The total nuclear absorbed dose per activity
Table 1 Geometry and volume of the cytoplasm and nuclei of PC3,MCF7 and MDA-MB231 cells
Volume (mm3)
Cell line Cytoplasm Nucleus Geometry
PC3(Average length 80�33 mm,depth 20 mm; nucleus23�17mm)
23 048 3568
MCF7(Average length56�22�49mm, depth14 mm; nucleus 16�11 mm)
10239 1112
MDA-MB231(Average length 66�32 mm,depth 17mm; nucleus18�14 mm)
16 114 1770
Table 2 Internalization of 99mTc-Tat-BN in unblocked and blockedcancer cells at 2 h (% of total activity± s.d.)
Internalization
Cell line Unblocked Blockeda
PC3 23.89±2.14* 2.15±0.18*MCF7 16.50±0.51* 1.48±0.17*MDA-MB231 12.65±0.78* 1.24±0.08*
s.d., standard deviation.aBlocked cells were incubated with an additional GRP-r blocking dose of Lys3-BN to determine the nonspecific binding of radioactivity.*Statistically significant difference (P<0.05) between blocked and unblocked.
99mTc-Tat-BN: dosimetry and effect on DNA Santos-Cuevas et al. 307
Copyright © Lippincott Williams & Wilkins. Unauthorized reproduction of this article is prohibited.
Nuclear internalization of 99mTc-N2S2-Tat(49-57)-
Lys3-BN99mTc-Tat-BN distribution in the cytoplasm and nucleus
was studied in PC3, MCF7 and MDA-MB231 cells. After
incubation of the cells with radiopharmaceuticals for 0.5,
1, 2, 4, 6 or 24 h, the nuclei and cytoplasm were separated
using a Nuclear Extraction Kit (Chemicon Internati-
onal Inc., California, USA) following the manufacturer’s
protocol. The cells were washed with 1ml of 0.2mol/l
acetic acid/0.5mol/l NaCl. The test tubes were centri-
fuged (250� g), washed with PBS and recentrifuged. The
pellet activity was measured in a crystal scintillation well-
type detector (g-counter) and considered to be 100% of
the internalized activity. The cell pellet was resuspended
with a cytoplasmic lysis buffer (with dithiothreitol and
protease inhibitor cocktail). The cell suspension was
drawn up and ejected out of a syringe with a small 27-
gauge needle to disrupt cell suspension. The suspension
was centrifuged at 8000� g for 20min at 41C, and the
supernatant containing the cytosolic portion of the cell
lysate was measured in a g-counter. The pellet containing
the nuclear portion of the cell lysate was resuspended in
the nuclear extraction buffer (with dithiothreitol and pro-
tease inhibitor cocktail), and after nuclear disruption, the
suspension was centrifuged at 16 000� g for 5min at 41C.
The supernatant was the nuclear extract; the membranes
remained in the pellet. The radioactivity in the nuclear
extract fraction and the pellet were measured in a g-
counter, and the percentage of activity in each subcellular
compartment at different times was calculated.
Biokinetic model
The activity percentages in the membrane, cytoplasm
and nucleus of cancer cells were used to derive 99mTc
time–activity curves for each subcellular compartment.
The OLINDA/EXM code allows the user to enter kinetic
data and fit it to one or more exponential terms [14].
Activity, as the number of disintegrations per unit time
and integrated over time, gives the total number of
disintegrations (N) in the membrane, cytoplasm or
nucleus expressed per unit of initial activity internalized
in the cancer cells (Eq. 1).
N ¼
Z
t
0
A0e� ltðtÞdt ð1Þ
Statistical analysis
Differences between the in-vitro cell data were evaluated
with the Student’s t-test.
In-vitro immunocytochemistry localization
of internalized Tat-BN
The PC3, MCF7 and MDA-MB231 cells (1� 105/well)
were grown at 371C, with 5% CO2 atmosphere and 100%
humidity in the RPMI medium supplemented with 10%
newborn calf serum and antibiotics (100 mg/ml strepto-
mycin) in glass well slides. The cells were incubated with
5ml of Tat-BN diluted with 1ml of the RPMI medium
for 1 h.
After treatment, the cells were immediately rinsed in ice-
cold PBS, fixed in 4% formaldehyde, permeabilized in
0.25% Triton X-100, and washed in PBS. After 30-min
incubation at room temperature in 1% bovine serum
albumin in PBS, the cells were incubated for 1 h at room
temperature with HIV Tat primary antibody (Abcam Inc.,
Cambridge, UK) and then with fluorophore-conjugated
secondary antibody (sheep immunoglobulin G secondary
antibody – heavy and light chains, (fluorescein isothio-
cyanate); Abcam Inc., UK). After primary and secondary
antibody labelling, the cells were rinsed with PBS before
mounting onto slides (ProLong Gold; Molecular Probes,
Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, California, USA).
The negative controls included non-Tat-BN-treated cells
and/or omission of primary antibodies.
Images in the three cell lines of immunofluorescently
labelled internalized Tat-BN were taken using a Zeiss
LSM510 META confocal microscope using a Plan-
Neofluar 40� /0.75Ph2 objective, a BP 500-530 IR filter
and a wavelength of 488 nm, 20%.
Effect of 99mTc-N2S2-Tat (49-57)-Lys3-BN on cellular
proliferation
The effect of 99mTc-Tat-BN on cellular proliferation was
evaluated using a CyQuant cell proliferation assay kit
(Molecular Probes, Invitrogen). The kit uses a proprietary
green fluorescent dye that exhibits strong fluorescence
enhancement when it is bound to cellular nucleic acids.
A reference standard curve was created for converting
fluorescence values into DNA content using bacterioph-
age l DNA and following the manufacturer’s protocol.
Approximately 1� 103 PC3, MCF7 or MDA-MB231 cells
were dispensed into wells (96-well culture plate). The
cells were cultured for 24 h, and the growth medium
was replaced with a fresh medium containing two dif-
ferent concentrations of Tat-BN (1.3 and 2.0 mmol/l) or99mTc-Tat-BN [14MBq/nmol, 1.3 mmol/l (3.6MBq) and
2.0 mmol/l (5.4MBq); n=6]. Negative and positive
controls included incubating cells in the growth medium
without any stimulus (untreated cells as negative control)
or with the antiproliferative agent, astemizole [15] at
2.5 mmol/l (positive control; n=6). The cells were cul-
tured for 6 days at 371C, and the growth medium with or
without the pharmaceuticals was replaced on day 3 using
a second stimulus dose of Tat-BN (1.3 and 2.0 mmol/l) or99mTc-Tat-BN (7MBq/nmol, 1.3 and 2.0 mmol/l). On day
6, the cells were frozen for 30min ( – 701C), thawed and
lysed by the addition of the buffer containing CyQuant
green fluorescent dye. Fluorescence was measured
directly at excitation/emission maxima of 480/520 nm.
306 Nuclear Medicine Communications 2011, Vol 32 No 4
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solvent A for 3min, changed to 50% solvent A over 10min,
was maintained for 10min, changed to 30% solvent A over
3min and finally returned to 100% solvent A over 4min.
Using this system retention times for free 99mTcO4– and
99mTc-tartrate were 3–4 and 10–11min for 99mTc-Tat-BN.
In-vitro kinetic studies
Cell lines
The human prostate cancer cell PC-3 line and human
breast carcinoma cell lines MCF7 and MDA-MB231 were
originally obtained from American Type Culture Collec-
tion (USA). The cells were routinely grown at 371C, with
a 5% CO2 atmosphere and 100% humidity in a RPMI
medium supplemented with 10% newborn calf serum and
antibiotics (100 mg/ml streptomycin).
Internalization assay and nonspecific binding
The PC-3, MCF7 or MDA-MB231 cells supplied in
a fresh medium were diluted to 1� 106 cells/tube
(approximately 0.5ml) and incubated with approximately
3MBq of 99mTc-Tat-BN (10 ml, 0.3 nmol total peptide) in
triplicate at 371C for 2 h. The test tubes were centrifuged
(3min, 500� g) and washed twice with a phosphate-
buffered saline (PBS), and the activity of the cell pellet was
determined in a crystal scintillation well-type detector.
Radioactivity in the cell pellet represents both externalized
peptide (surface-bound) and internalized peptide (internal
membrane-bound radioactivity). An aliquot with the initial
activity was taken to represent 100%, and the cell uptake
activity with respect to this value was then calculated.
The externalized peptide activity was removed with 1ml
of 0.2mol/l acetic acid/0.5mol/l NaCl solution added
to the resuspended cell pellet. The test tubes were
centrifuged, washed with PBS, and recentrifuged, and the
remaining pellet activity was considered to be the
internalized peptide. Nonspecific binding was deter-
mined in parallel, using 0.04mmol/l Lys3-BN (Bachem)
and blocked receptor cells.
Fig. 1
99mTc-Tat(49-57)-Lys3-BN
H3N+
H3N+
+NH2
+NH2
+NH2
+NH2
+NH2
+NH2
NH2
NH2
Lys3-BN
NH2
NH
H2N
H2N
H2N
H2N
H2N
H2N
H2N
H2NH2N
HN HN
O
Tat (49-57) Spacer M = 99mTcChelating site (N2S2)
O
O O O
O
OO O
O
O N
O
O
O
S S
NO
O
OO
M
N
MAPO
O
O
O
O
O
OO O
O
OO
O
O
O
O
O
O
O
OS
S
O
HN
HN
HN
HN
HN
HN
HN
HN
HN
HN
NH
NH
NH N
H
NH
HN
HN
HN
NH
NH
NH
NH
NH
NH
NH
HN
HN
HN
NH
NH
NH
N
HN
HN
H2N
General scheme of the N2S2-Tat (49-57)-Lys3-BN hybrid peptide labelled with technetium-99m.
99mTc-Tat-BN: dosimetry and effect on DNA Santos-Cuevas et al. 305
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Auger energy of 0.90 keV/decay and IC electron energy
of 15.40 keV/decay, which represent 11.4% of the total99mTc energy release per decay [2,3].
The receptors overexpressed on the surface of cancer
cells represent promising targets for cancer diagnosis or
therapy. The gastrin-releasing peptide receptor (GRP-r)
is a seven-transmembrane G-protein coupled receptor
that is overexpressed on primary prostate, breast cancer
and lymph node metastases [4,5]. Bombesin is a tetra-
decapeptide that binds with high affinity to the GRP-r.
Specifically, the Lys3-bombesin analogue labelled with99mTc through diaminedithiol, hydrazinonicotinamide or
N2S2-chelator has been reported as a radiopeptide with
high stability in the human serum, specific cell receptor
binding and rapid internalization [5–7]. Biodistribution
data in mice showed rapid blood clearance with pre-
dominant renal excretion and specific binding towards
GRP-r-positive PC-3 prostate tumours [6,7]. Images of
GRP-r expression in patients with breast cancer using99mTc-hydrazinonicotinamide-Lys3-bombesin have shown
distinct radioactivity accumulation in malignant tissue [8].
Although radiolabelled bombesin analogues have been
successfully applied in preclinical, targeted radiotherapy,
the targets were restricted almost exclusively to the cell
membrane [9–11]. Current challenges are conjugating
biomolecules with cell-penetrating peptides and/or nu-
clear localization peptide sequences (NLSs) to promote
their internalization and routing to the cell nucleus.
Tat (49-57) is a peptide derived from the transcription
protein transactivator of the HIV-1 virus that has a
membrane translocation domain and an NLS [12,13].
A hybrid radiopharmaceutical of type 99mTc-N2S2-Tat
(49-57)-bombesin (99mTc-Tat-BN) could significantly
increase cancer cell internalization. Internalizing IC and
Auger electrons in the nucleus of a malignant cell would
increase the effectiveness of targeted radiotherapy.
The aim of this study was to assess the in-vitro nuclear
internalization kinetics of 99mTc-Tat-bombesin in GRP-r-
positive cancer cells and to evaluate the radiation-
absorbed dose at the subcellular level associated with
the observed effect on cancer cell DNA proliferation.
Materials and methodsDesign and preparation of hybrid N2S2-Tat (49-57)-Lys
3-
BN peptide
Tat (49-57) peptide (H-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-
Arg-NH2) was conjugated to Gly-Gly-Cys-Gly-Cys(Acm)-
Gly-Cys(Acm)-NH2 to produce the Tat (49-57)-spacer-N2S2peptide (H-Arg1-Lys2-Lys3-Arg4-Arg5-Gln6-Arg7-Arg8-Arg9-
Gly10-Gly11-Cys12-Gly13-Cys14(Acm)-Gly15-Cys16(Acm)-NH2).
The sequence Gly13-Cys14(Acm)-Gly15-Cys16(Acm)-NH2
was added for use as the specific N2S2 chelating site for99mTc (Fig. 1).
Lys3-bombesin (Pyr-Gln-Lys-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Vla-
Gly-His-Leu-Met-NH2) was conjugated to a maleimidopropyl
moeity through Lys3, and the maleimidopropyl group was
used as the branch position to form a thioether with
the Cys12 side chain of Tat (49-57)-spacer-N2S2 peptide
(Fig. 1). Synthesis, high-performance liquid chromato-
graphy (HPLC) analysis, matrix-assisted laser desorption/
ionization mass spectral analysis (MALDI), amino acid
analysis and peptide content determination were carried
out in the Bachem Laboratories (Bachem, California,
USA) to ultimately obtain a certified white powder
product with a chemical purity of more than 90% and a
molecular weight of 3779.5 g/mol.
Radiolabelling of N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN
99mTc-pertechnetate was obtained from a GETEC 99Mo/99mTc
generator (ININ, Ocoyoacac, Mexico).
99mTc-labelled Tat-BN was prepared as detailed by
Santos-Cuevas et al. [7]. One milligram of N2S2-Tat(49-
57)-Lys3-BN was dissolved in 200 ml of injectable water
(Pisa, Mexico). Ten microlitres of this solution were
added to 25ml of sodium 99mTc-pertechnetate (185MBq),
followed by 7 ml of acetamidomethyl group deprotection
mixture (50mg/ml sodium tartrate in 0.1mol/l NH4OH/
NH4CH3COOH, pH 9.5) and 3 ml of reducing solution
(0.5mg SnCl2/ml in 0.05mol/l HCl). The final mixture
was incubated for 20min at room temperature.
Evaluation of 99mTc-N2S2-Tat(49-57)-Lys3-BN
radiochemical purity
Radiochemical purity analyses were performed by instant
thin-layer chromatography on silica gel (ITLC-SG; Gelman
Sciences, Pall Corporation, Port Washington, New York,
USA), solid phase extraction (Sep-Pak C-18 cartridges)
and reverse-phase HPLC.
ITLC-SG analysis was accomplished using two different
mobile phases: saline solution to determine the amount
of free 99mTcO4– (Rf=1) and 0.1mol/l of sodium citrate
(pH 5) to determine 99mTc-tartrate (Rf=1). The Rf value
of the radiolabelled peptide in each system was 0.0.
The Sep-Pak cartridges were preconditioned with 5ml of
ethanol followed by 5ml of 1mmol/l HCl and 5ml of air.
An aliquot of 0.1ml of the labelled peptide was loaded
onto the preconditioned Sep-Pak cartridge followed by
5ml of 1mmol/l HCl to elute-free 99mTcO4– and 99mTc-
tartrate. The radiolabelled peptide was eluted with 3ml
of acidified ethanol (0.001N HCl); hydrolysed/reduced99mTc remained in the cartridge.
HPLC analyses were carried out with a Waters instrument
running Millennium software (Waters Corp., Milford,
Massachusetts, USA) with both radioactivity and ultra-
violet photodiode array in-line detectors and a YMC
ODS-AQ S5 column (5 mm, 4.6� 250mm). A gradient
using 0.1% trifluoroacetic acid/water as solvent A and
0.1% trifluoroacetic acid/acetonitrile as solvent B was run
at a flow rate of 1ml/min. The gradient began at 100%
304 Nuclear Medicine Communications 2011, Vol 32 No 4
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99mTc-N2S2-Tat (49-57)-bombesin internalized in nucleiof prostate and breast cancer cells: kinetics, dosimetryand effect on cellular proliferationClara L. Santos-Cuevasa,b, Guillermina Ferro-Floresa, Eva L. Rojas-Calderona,Rocıo Garcıa-Becerrac, David Ordaz-Rosadoc, Consuelo Arteaga de Murphyc
and Martha Pedraza-Lopezc
Background The gastrin-releasing peptide receptor
(GRP-r) is overexpressed in prostate and breast cancers.
technetium-99m-bombesin (99mTc-BN) has been reported
as a radiopharmaceutical with specific cell GRP-r binding.
The HIV Tat (49-57)-derived peptide has been used to
deliver a large variety of molecules to cell nuclei. A new
hybrid radiopharmaceutical of type 99mTc-N2S2-Tat(49-57)-
Lys3-BN (99mTc-Tat-BN) internalized in cancer cell nuclei
could act as an effective system of targeted radiotherapy
using Auger and internal conversion electron emissions
near DNA.
Aim The aim of this study was to assess the in-vitro
nucleus internalization kinetics of 99mTc-Tat-BN in GRP
r-positive cancer cells and to evaluate the subcellular-level
radiation-absorbed dose associated with the observed
effect on cancer cell DNA proliferation.
Methods 99mTc-Tat-BN in-vitro internalization kinetics
were evaluated in human prostate cancer PC-3 cells and
breast carcinoma cell lines MCF7 and MDA-MB231. Nuclei
from cells were isolated using a nuclear extraction kit.
Total disintegration in each subcellular compartment was
calculated by the integration of experimental time–activity
kinetic curves. Nucleus internalization was corroborated by
confocal microscopy images using immunofluorescently
labelled Tat–BN. The PENELOPE code was used to
simulate and calculate the absorbed dose by the
contribution of Auger and internal conversion electrons
in the cytoplasm and nucleus using geometric models
built from immunofluorescent cell images. A cell
proliferation kit was used to evaluate DNA concentration
after cancer cell incubation with 99mTc-Tat-BN.
Results The results showed that 59.7, 61.2 and 41.5% of
total disintegration per unit of 99mTc-Tat-BN activity (1Bq)
bound to the cell occurred in the nucleus of PC-3, MCF7
and MDA-MB231, respectively. The 99mTc-Tat-BN absorbed
doses delivered to nuclei were 0.142mGy/decay (PC-3),
0.434mGy/decay (MCF7) and 0.276mGy/decay (MDA-
MB231). 99mTc-Tat-BN produced a significant decrease in
PC-3 (52.98%), MCF7 (45.71%) and MDA-MB231 (35.80%)
cellular proliferation with respect to untreated cells.
Conclusion The hybrid radiopharmaceutical could be
potentially useful as a therapeutic agent for prostate and
breast cancers. Nucl Med Commun 32:303–313 �c 2011
Wolters Kluwer Health | Lippincott Williams & Wilkins.
Nuclear Medicine Communications 2011, 32:303–313
Keywords: hybrid radiopharmaceutical, peptide-receptor therapy,radiolabelled bombesin, subcellular dosimetry, Tat-bombesin
aInstituto Nacional de Investigaciones Nucleares, bUniversidad Autonoma delEstado de Mexico, Estado de Mexico and cInstituto Nacional de CienciasMedicas y Nutricion Salvador Zubiran, Mexico D.F., Mexico
Correspondence to Guillermina Ferro-Flores, PhD, Departamento de MaterialesRadiactivos Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares Carretera Mexico-Toluca S/NLa Marquesa, Ocoyoacac, Estado de Mexico, C.P. 52750, MexicoTel: + 52 55 53297200 x3863; fax: + 52 55 53297306;e-mail: [email protected]; [email protected]
Received 8 September 2010 Revised 19 October 2010Accepted 19 October 2010
IntroductionAs interest in targeted therapies for cancer increases,
radionuclides stand out not only for their ability to be
detected by external scintigraphy, but also for their
therapeutic capacity [1]. The objective is to deliver a
maximum radiation dose to tumour areas in a selective and
localized manner, generating a therapeutic effect because
of energy deposition from charged particle emissions. At
the single-cell level, short-range charged particles, such
as a, internal conversion (IC) electrons and Auger elec-
trons, impart a dense ionizing energy deposition pattern
associated with increased radiobiological effectiveness.
However, they must be able to penetrate the cytoplasm
and reach the nucleus, which is considered to be the most
radiosensitive component of the cell. Auger and IC
electron emitters that can be targeted to the DNA of
tumour cells represent an attractive system of radiation
therapy because of their high linear energy transfer within
nuclear dimensions (4–26 keV/mm) [2]. In contrast to
a radiation, Auger and IC radiation are of low toxicity
when decaying outside the cell nucleus, such as in the
cytoplasm or outside the cells during blood transport.
Technetium-99m (99mTc) is the most frequently used radio-
nuclide for in-vivo diagnostic imaging studies because
of its monoenergetic g rays of 140 keV and easy complex
formation with a large number of ligands. 99mTc produces
Original article
0143-3636 �c 2011 Wolters Kluwer Health | Lippincott Williams & Wilkins DOI: 10.1097/MNM.0b013e328341b27f
Copyright © Lippincott Williams & Wilkins. Unauthorized reproduction of this article is prohibited.