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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIAINSTITUTO DE INVESTIGACIONES EN CIENCIAS VETERINARIAS
LABORATORIO DE SALUD PÚBLICA VETERINARIA
II Congreso Internacional de Leptospirosis,Sífilis y Borreliosis
"Espiroquetas Habana 2012"23 - 25 de abril de 2012
La Habana, Cuba
Borreliosis (Borrelia burgdorferi) y factores de riesgo en perros de una ciudad que sólo ha reportado garrapatas Rhipicephalus sanguineus en caninos, Mexicali, Baja
California, México
Luis Tinoco Gracia
SAPUVETNETRed auspiciada por el Grupo Alfa de la Unión Europea
Integrada por 16 países de América Latina y Europa
Mexicali, Baja California, México
Mexicali
INTRODUCCIÓN
BORRELIOSIS (ENFERMEDAD DE LYME):
Enfermedad inflamatoria multisistémica Transmitida por garrapatasZoonóticaDistribución mundial
ETIOLOGÍA: Complejo Borrelia burgdorferi sensu lato.
Norteamérica: B. burgdorferi sensu stricto (Johnson, 1984).Europa: B. afzelli y B. garinii (Berglund, 1995; Derdáková, 2003).Asia: B. japonica (Kawabata, 1993).
BANCO DE GENES National Center for Biotechnology Information (NCBI)
Ciclo biológico de I. scapularis relacionado con B. burgdorferi
Reservorio
Transmisión de borrelias al huésped por ninfas
Transmisión de borrelias al huésped por garrapata adulta
Otros vectores: I. pacificus, A. americanum, D. variabilis
Larvas
Huevos
BORRELIOSIS: Enfermedad inflamatoria multisistémica
Depresión, emaciación
Claudicación Garrapatas
ANTECEDENTES DE PREVALENCIA EN PERROS
Monterrey, Nuevo León:16% (136/850) a B. burgdorferi por IFA
(Salinas-Meléndez et al., 1999)
Mexicali, B. C.:6.6% (2/30) a B. burgdorferi por ELISA
(Romano et al., 1998)
8.2% (95% I.C. 1.5-13.3%) a B. burgdorferi por ELISA(Tinoco et al., 2007)
59.6% (56/94) a garrapatas (100% Rhipicephalus sanguineus)
(Tinoco et al., 2008)
ANTECEDENTES DE PREVALENCIA EN HUMANOS
Estados Unidos:Actualmente: 200,000 (CDC)
República Mexicana:
Por ELISA y Western blotDistrito Federal: 3.4%Noreste de la Rep. Mexicana: 6.2% (Gordillo et al., 2003)
Por PCR y Secuenciación (Flagelina y OspA)Distrito Federal: 4 pacientes (Gordillo et al., 2007)
OBJETIVOS
1. Estimar la prevalencia de B. burgdorferi por ELISA y PCR en perros atendidos en clínicas veterinarias y en perros capturados por los centros de control animal; y demostrar evidencia molecular en garrapatas por PCR, en Mexicali, Baja California, México.
2. Evaluar factores de riesgo asociados a B. burgdorferi en perros de la zona urbana de Mexicali, Baja California.
3. Demostrar la transmisión experimental de B. burgdorferi a través de la garrapata adulta R. sanguineus en perros.
MATERIAL Y MÉTODOS
FASES DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN
1. Monitoreo de B. burgdorferi.
2. Aislamiento de B. burgdorferi.
3. Estudio experimental de la transmisión de B. burgdorferi por R. sanguineus.
1. MONITOREO
MARCO MUESTRAL DEL AREA DE ESTUDIO
Establecimientos:a) 39 clínicas veterinarias de la ciudad de Mexicalib) 2 centros de control animal de Mexicali
Sujetos: (768) i) 384 Perros atendidos en clínicas veterinariasii) 384 Perros capturados por los centros de control animaliii) Garrapatas recolectadas de los animales muestreados
Muestreo sanguíneo y de garrapatas
a) Perros atendidos en clínicas veterinariasb) Perros capturados por los centros de control animalc) Garrapatas conservadas en tubos con etanol al 70% o
congeladas a -20°C.
DIAGNÓSTICO
1. PERROS
Serología: Borrelia burgdorferi ELISA® Helica Biosystems, Inc.PCR: Sangre y líquido sinovial
2. GARRAPATAS
PCR: Glándula salival e intestino.
Iniciadores: Fragmentos de genes codificantes de B. burgdorferi sensu latoa) Flagelina (FLA): 256 pb
b) Proteína A de la superficie externa (OspA): 345 pb
SEROLOGÍA DE Borrelia burgdorferi
PUNTO DE CORTE
> 1.6
1.0 – 1.5 Positivo
0.5 – 1.0
0.3 – 0.5 Corte
0.2 – 0.3 Negativo
0.1 – 0.2
<0.1
Densidad öptica
Sensibilidad = 95.8%Especificidad = 94.7%Punto de corte = 0.300 DO (Densidad
óptica)
1. Tamaño de muestra:2
d
Z)1(n
n = tamaño de muestra, resultando 384 por cada grupo de estudio. = estimador de varianza máxima 50 %Z = valor de tablas = 1.96d = precisión = 5 % (Scheafer et al., 1987)
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
2. Se estimó la prevalencia y su intervalo de confianza mediante el estimador Rogan-Gladen (Greiner y Gardner, 2000).
3. Para evaluar la asociación de los factores de riesgo con la seropositividad a B. burgdorferi se utilizaron la razón de probabilidades (Odds ratio, OR) y X2 de Mantel-Haenszel.
4. Todos los análisis estadísticos utilizando el paquete SAS (Statistical Analysis System) para Windows ver 8.2 (Walker, 1997; SAS, 2004).
Seroprevalencia ajustada de Borrelia burgdorferi ELISA® Helica Biosystems, Inc.
Perros atendidos en clínicas veterinarias: 24/384 6.8% (95% CI 3.5-8.9)
Perros capturados por los centro de control animal: 42/384 12.0% (95% CI 7.5-14.3)
Ambos grupos: 66/768 9.3% (95% CI 6.3-10.6)
RESULTADOS
FACTORES DE RIESGO
Perros de las clínicas veterinarias
Parámetro X2 P OR (95% IC )
Edad 5.2724 0.02 4.7 (1.1-20.6) Falta de programa preventivo 7.8519 0.005 4.9(1.4 -16.8)
EVIDENCIA MOLECULAR DE Borrelia burgdorferi - PCR
Manhattan, Kansas, 26 de septiembre de 2007
PCR de FLA en sangre de perros seropositivos
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
41 42 43 44 45 46 47 48 49
256 pb
256 pb
256 pb
EVIDENCIA MOLECULAR DE Borrelia burgdorferi - PCRManhattan, Kansas, 29 de septiembre de 2007
PCR de FLA en tejidos de perros seropositivos
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
256 pb
256 pb
EVIDENCIA MOLECULAR DE Borrelia burgdorferi - PCRManhattan, Kansas, 30 de septiembre de 2007
PCR de OspA en tejidos, coágulos sanguíneos y garrapatas de perros seropositivos
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
1. Marcador2. C+ N403. 506 Coágulos sanguíneos Sero+ FLA+4. 2032 Coágulos sanguíneos Sero+ FLA+5. 675 Coágulos sanguíneos Sero+ FLA+6. 1312 Coágulos sanguíneos Sero+ FLA+7. 1272 M, sinovial Sero+ FLA+8. 1326 M, sinovial Sero+ FLA+9. ENS1 M, sinovial Sero+ FLA+10. 39 CA M, sinovial Sero+ FLA+11. 1165 Garrapatas Sero+ FLA+12. 1346 Garrapatas Sero+ FLA+13. C-
345 pb
EVIDENCIA MOLECULAR DE Borrelia burgdorferi - PCR
M
1 2 3 4 5 6 7 P N M
Mexicali, B.C., 22 de octubre de 2007
PCR de FLA en tejidos de perros seropositivos
256 pb
EVIDENCIA MOLECULAR DE Borrelia burgdorferi - PCR
Mexicali, B.C., 19 de marzo de 2008
PCR de FLA en tejidos y garrapatas de perros seropositivos
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 P N MM. Marcador BioLadder 100• 889 Coágulos sanguíneos•2063 Coágulos sanguíneos•1272 Coágulos sanguíneos•1368 Garrapatas•1368 Garrapatas•1368 Garrapatas•1368 Garrapatas•1272 Vejiga•1272 Vejiga•1272 Vejiga •1272 VejigaP. Positivo
N. NegativoM. Marcador BioLadder 100
256 pb
EVIDENCIA DE Borrelia burgdorferi - SecuenciaciónManhattan, Kansas, 17 de octubre de 2007
Perro #1312 Muestra: Coágulo sanguíneo100% de identidad con OspA de Borrelia burgdorferi
TAACAATTTCTGACGATCTAGGTCAAACCACACTTGAAGTTTTCAAAGAAGATGGCAAAA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||TAACAATTTCTGACGATCTAGGTCAAACCACACTTGAAGTTTTCAAAGAAGATGGCAAAA
CACTAGTATCaaaaaaaGTAACTTCCAAAGACAAGTCATCAACAGAAGAAAAATTCAATG||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||CACTAGTATCAAAAAAAGTAACTTCCAAAGACAAGTCATCAACAGAAGAAAAATTCAATG
AAAAAGGTGAAGTATCTGAAAAAATAATAACAAGAGCAGACGGAACCAGACTTGAATACA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||AAAAAGGTGAAGTATCTGAAAAAATAATAACAAGAGCAGACGGAACCAGACTTGAATACA
CAGAAATTAAAAGCGATGGATCTGGAAAAGCTAAAGAGGTTTTAAAAGGCTATGTTCTTG||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||CAGAAATTAAAAGCGATGGATCTGGAAAAGCTAAAGAGGTTTTAAAAGGCTATGTTCTTG
AAGGAACTCTAACTGCTGAAAAAACAAC||||||||||||||||||||||||||||AAGGAACTCTAACTGCTGAAAAAACAAC
2. AISLAMIENTO
Medio de cultivo: BSK-H® SIGMA + suero de conejo (6%) + gelatina de cerdo (6%) + rifampicina (100 mg/L) + fosfomicina (50 mg/L) + anfotericina B (2.5 mg/L)
Fuente: Vejiga.Temperatura: 33°CComprobación de crecimiento: Microscopia de campo obscuroCriopreservación : -20°C (CryoCare Bacterial Preservers® Key Scientific Products)
Secuenciación: 99% Borrelia burgdorferi sensu stricto
3. TRANSMISION EXPERIMENTAL
3 perros sanos de 8 meses de edad, de talla mediana, pelaje corto.
a) Grupo A: 2 perros expuestos a R. sanguineus con B. burgdorferi.
b) Grupo B: 1 perro expuesto a R. sanguineus no infectadas.
Incubación y desarrollo de R. sanguineus
1. Recolección de hembras adultas repletas recién alimentadas.2. Preovoposición: 4 d.3. Ovoposición: 5 d.4. Incubación de huevos: 11 d.5. Ayuno: 3 d.6. Colocación de larvas en perros: 3 d.7. Muda de larvas a ninfas: 7 d.8. Ayuno: 3 d.9. Colocación de ninfas en perros: 4 d.10. Muda de ninfas a adultas: 11 d.11. Ayuno: 2 d.12. Inoculación de borrelias en hembras adultas: 1 d.13. Colocación de garrapatas adultas en perros: 7 d.
Total del ciclo: 61 d.
Incubación: 30°C con 80% de humedad.
CICLO DE R. sanguineus EN MEXICALI
Inoculación de B. burgdorferi en R. sanguineus
5 hembras adultas inoculadas/perro.
El inóculo fue por capilaridad con medio BSK-H y Borrelia burgdorferi.
Concentración: 1×108 espiroquetas/ml de BSK-H.
En cámara húmedad a 34°C durante 24 horas.
Exposición experimental en perros a R. sanguineus infectadas con B. burgdorferi
Colocación de 5 machos y 5 hembras adultas/perro.Duración: 7 días.
CONCLUSIONES
1. Seroprevalencia de 6.8% (95% IC 3.5-8.9%) a B. burgdorferi en perros atendidos en clínicas veterinarias.
2. Seroprevalencia de 12% (95% IC 7.5-14.3%) en perros capturados por los centros de control animal.
3. Perros ≥ 1 año de edad: OR= 2.7 (95% IC 1.2-6.1).
4. Perros que no tuvieron acceso a un programa preventivo: OR= 4.9 (95% IC 1.4-16.8).
5. Evidencias serológicas y moleculares confirman la existencia de B. burgdorferi en perros y garrapatas en donde sólo se han registrado R. sanguineus.
6. Hasta el momento no se ha comprobado la transmisión de B. burgdorferi por garrapatas adultas de R. sanguineus en perros utilizando el protocolo para Ixodes scapularis.
Modificación del protocolo de la transmisión experimental de B. burgdorferi a través de R. sanguineus:
1. Utilizar 5 µL de medio BSK-H con 1×108 espiroquetas/ml como inóculo en lugar de 20 µL.
2. Realizar la inoculación de borrelias incluyendo la fase de ninfa no sólo la adulta.
3. Inocular con borrelias a 30 garrapatas hembras en lugar de 5 por cada perro de experimentación.
GRACIASMexicali, Baja California, México