Universidad Autónoma de Durango

MANUAL DE PRACTICAS

Bioquímica II

ASESOR EDUCATIVO: MC. MIGUEL ANGEL SANCHEZ RODRIGUEZ

1

REGLAMENTO DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

1. PARA INGRESAR AL LABORATORIO:

a) Deberá portar bata blanca larga.

b) Manual de prácticas de bioquímica.

c) Presentación personal de acuerdo a los reglamentos de la Universidad.

d) Solamente entrarán al laboratorio los alumnos que tengan práctica (no se

permiten visitas en horas de prácticas).

2. DENTRO DE LOS LABORATORIOS:

a) No se permite fumar ni tomar alimentos.

b) No sentarse en las mesas de trabajo.

c) Solamente se saldrá del laboratorio cuando todo el grupo correspondiente

termine su trabajo y tenga firmada su práctica.

RECOMENDACIONES: 1) Reporte inmediatamente a su profesor cualquier daño personal por leve

que sea.

2) Cuide de no contaminar los reactivos de trabajo.

3) No sacuda las pipetas.

4) Si utiliza ácido o álcalis fuertes, es mejor no pipetear directamente.

5) Mantenga siempre limpio su material de trabajo.

2

MATERIALES GENERALES PARA LAS PRACTICAS: 1) Guantes de látex

2) Cinta masking tape

3) Plumón

3

PRACTICA 1 GLUCOLISIS ANAEROBICA (FERMENTACIÓN)

Introducción

La Fermentación son cambios químicos en las sustancias orgánicas

producidos por la acción de las enzimas, llamadas fermentos, producidas por

organismos diminutos tales como moho, bacterias y levadura. El tipo de

fermentación más importante es la fermentación alcohólica, en donde la acción

de la cimasa segregada por la levadura convierte los azúcares simples, como la

glucosa y la fructosa, en alcohol etílico y dióxido de carbono.

Las levaduras son organismos anaeróbicos facultativos, o bien, que

pueden vivir sin oxígeno. Cuando hay oxígeno lo utilizan para la respiración, es

decir para oxidar la glucosa completamente y así obtener ATP.

En condiciones de anaerobiosis, las cepas de Sacharomyces cerevisae

(levaduras de la panificación) y otras especies de levaduras transforman la

glucosa en ácido pirúvico, siguiendo la secuencia de reacciones de la glicólisis.

Este proceso es común a la mayoría de los seres vivientes; pero aquí radica lo

específico de estas levaduras, son capaces de proseguir la degradación del

pirúvico hasta etanol, mediante el siguiente proceso:

4

Esto es una ventaja adaptativa para las levaduras, que pueden sobrevivir

en anaerobiosis. Pero solamente lo utilizan cuando no hay oxígeno disponible y

ello en relación con el bajo rendimiento energético de la fermentación alcohólica,

en comparación con el de la degradación oxidativa de la glucosa.

Investigación:___________________________________________________

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Objetivos:

1. Conocer la biología de las levaduras como responsables de las

fermentación alcohólica.

2. Observar un proceso fermentativo

3. Estudiar las reacciones de la fermentación alcohólica

4. Comprobar la formación de etanol, como producto final de la

fermentación.

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Materiales y Reactivos:

• Solución de levadura al 10%

• Solución de glucosa al 1% (1 g de glucosa en 100 ml de agua destilada)

• 2 matraces erlenmeyer de 125 ml

• 1 matraz de aforación de 100 ml

• 1 baño maría a 37ºC

• 1 bascula

• 1 tubo Durham

• 2 tubos de ensaye de 5 ml

• 1 tubo de ensaye de 15 ml y tapa

• 1 gradilla

• 1 pinzas para tubo de ensaye

• 2 pipeta de 10 o 5 ml

• 2 charolitas para pesado

• 1 espátula

• Reactivo de Fehling A

• Reactivo de Fehling B

• 300 ml agua destilada o agua potable (garrafón)

Procedimiento:

a) Preparación de material

1. Solución de levadura al 10%: Pesar 10 g de levadura y colocar en un

matraz de aforación de 100 ml. Aforar hasta 100 ml con agua

destilada. Agitar vigorosamente. Colocar en un matraz erlenmeyer de

125 ml. Asegúrese de etiquetar la solución.

2. Solución de glucosa al 1%: Pesar 1 g de glucosa y colocar en un

matraz de aforación de 100 ml. Aforar hasta 100 ml con agua

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destilada. Agitar vigorosamente hasta su disolución. Colocar en un

matraz erlenmeyer de 125 ml. Asegúrese de etiquetar la solución.

3. Baño maría a 37ºC: Colocar agua de la llave en un recipiente en un

vaso precipitado grande y colocarlo en un horno a la temperatura

deseada, regular dicho equipo hasta que la temperatura del agua

contenida en el vaso de precipitado alcance los 37ºC. Se recomienda

hacerlo con un día de anticipación. Otra opción seria usando un baño

maría con regulador de temperatura y termopar.

b) Fermentación

4. En un tubo de ensaye de 15 ml colocar 1/4 parte con solución de

glucosa al 1%.

5. Rellenar el tubo de ensaye con solución de levadura la cual se agita

vigorosamente antes de adicionarla (asegurarse que quede

completamente llenarlo).

6. Tape el tubo de ensaye y agite varias veces, esto se realiza invirtiendo

el tubo cuidadosamente.

7. Destapar el tubo y adicionar un tubo Durham invertido, nuevamente

cerrarlo y asegurarse de que el tubo Durham se llene de la solución,

esto se realiza invirtiendo el tubo y llenando el Durham

cuidadosamente (la agitación vigorosa del tubo de ensaye puede

provocar finas burbujas dentro de este que terminaran dentro de tubo

Durham y probablemente confundir la reacción de fermentación

esperada)

8. Colocar el tubo, en baño maría a 37ºC (si la temperatura difiere en ±

2ºC la enzima se desactivara y no se llevara la reacción).

9. La fermentación empezará cuando se observe un burbujeo,

procedente del CO2 producida por la enzima, el cual será retenido en

parte, por el tubo Durham invertido. Anotar sus observaciones.

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Observaciones:______________________________________________

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c) Determinación de presencia de glucosa en la muestra

1. Colocar 2 tubos de ensaye de 5 ml en la gradilla.

2. En uno de ellos, adicionar 3 ml de solución de glucosa al 1%. Etiquetar

el tubo.

3. Realizar la Prueba de Fehling (la prueba de Fehling la realizo en

Bioquímica I, pero si no lo recuerda, es el numeral d).

4. Esperamos que sea positiva, debido a la presencia de glucosa (Azúcar

reductor).

5. En el otro tubo de ensaye de 5 ml, colocar 3 ml de la solución

resultante del proceso de fermentación. Tener precaución de no

taponear la pipeta con la levadura contenida. Etiquetar el tubo.

6. Realizar la Prueba de Fehling.

7. Esperamos que la reacción sea negativa, ya que la glucosa se ha

consumido por las levaduras y se ha transformado en etanol, como se

ve en la reacción de fermentación.

8. Con esto comprobamos que había glucosa al principio del proceso y al

final ha desaparecido.

NOTA: si el tubo con la solución fermentada da positiva en la prueba

de Fehling, fue debido a que probablemente existió un error durante

su trabajo de laboratorio, como inactivación de la enzima, o la enzima

comprada era muy vieja, por lo que se sugiere repetir la fermentación.

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Observaciones:______________________________________________

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d) Prueba de Fehling

1. Tener 3 ml de muestra.

2. Añadir 1 mL de Fehling A y 1 mL de Fehling B. El líquido del tubo de

ensayo adquirirá un fuerte color azul.

3. Calentar el tubo al baño María o directamente en un mechero de

Laboratorio (teniendo debida precaución, ya que la ebullición provoca

la expulsión de la muestra hacia donde esta apuntado el tubo).

4. La reacción será positiva si la muestra se vuelve de color rojo-ladrillo.

5. La reacción será negativa si la muestra queda azul, o cambia a un

tono azul-verdoso.

Conclusiones:____________________________________________________

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Cuestionario:

1. ¿Qué es fermentación alcohólica?

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2. Cuáles son los productos finales de este tipo de fermentación?

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3. Menciona qué sustratos alimenticios pueden ser usados en la

fermentación alcohólica.

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4. Además de Sacharomyces cerevisae qué otros microorganismos pueden

producir fermentación.

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Bibliografía:______________________________________________________

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PRACTICA 2

SOLUCIONES HIPOTÓNICAS, HIPERTÓNICAS E ISOTÓNICAS RESPECTO AL GLÓBULO

ROJO Introducción

La presión osmótica es la fuerza con la cual una solución contenida en un

recipiente limitado por una membrana semipermeable atrae agua del

compartimiento vacío.

Esta fuerza depende del número de moléculas o partículas en solución,

sin importar su naturaleza o tamaño, así por ejemplo tiene la misma fuerza

osmótica una proteína con alto peso molecular que un ión hidrógeno con peso

atómico de uno.

Cuando nos referimos a la acción que tienen las moléculas o partículas

sobre la presión osmótica, las identificamos como osmoles; para fines prácticos

osmol es igual a un mol de cualquier compuesto (no ionizable).

Dos compartimientos separados por una membrana semipermeable,

respecto a la concentración de osmoles en ambos lados de la membrana son

varias posibilidades:

1. Que la concentración osmolar es igual en ambos lados de la membrana,

en este caso las soluciones son isotónicas entre sí, la fuerza con la que

atrae el agua una solución es igual a la fuerza con la que atrae el agua la

otra solución por lo que en conjunto a pesar de que si existe movimiento

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de agua no hay aumento o disminución de su volumen en algún lado de la

membrana.

2. Que una de las soluciones tenga mayor número de osmoles que la otra.

La que tiene mayor número de osmoles es hipertónica respecto a la

segunda, la cual es hipotónica respecto a la primera. La solución

hipertónica atrae con mayor fuerza el agua hasta llegar al equilibrio de las

fuerzas osmóticas, por aumento del volumen y mayor dilución del líquido

hipertónico.

Investigación:____________________________________________________

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Objetivos:

1. Realizar y observar el comportamiento de los eritrocitos ante soluciones

de diferente osmolaridad y aplicar dicha observación ante casos

hipotéticos de deshidratación.

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Materiales y Reactivos:

• 4 tubos de ensayo de 5 ml

• 1 pipetas de 5 o 10 mL

• 1 gradilla

• 1 vaso de precipitado de 100 ml

• 1 gotero

• 1 matraz de aforación de 100ml

• 1 matraz erlenmeyer de 100 ml

• 1 charolita para pesar

• Balanza

• Centrifugadora

• Solución de glóbulos rojos

• Solución de cloruro de sodio al 10 % (1.7 M)

• Solución de cloruro de sodio al 0.85 % (0.145 M)

• Solución de glucosa al 5 % (0.277 M)

• Agua destilada o agua potable (agua de garrafón)

Procedimiento:

a) Preparación de soluciones: 1. Solución de cloruro de sodio al 10%: Pesar 10 g de cloruro de sodio y

colocar en un matraz de aforación de 100 ml. Aforar con agua destilada

y disolver completamente. Colocar la solución en un matraz erlenmeyer

de 125 ml, teniendo la precaución de etiquetar la solución.

2. Solución de cloruro de sodio al 0.85%: Pesar 1.7 g de cloruro de sodio

y colocar en un matraz de aforación de 200 ml. Aforar con agua

destilada y disolver completamente. Colocar una parte de la solución

en un matraz erlenmeyer de 125 ml, el resto deséchela. Tenga la

precaución de etiquetar la solución.

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3. Solución de glucosa al 5%: Pesar 5 g glucosa y colocar en un matraz

de aforación de 100 ml. Aforar con agua destilada y disolver

completamente. Colocar la solución en un matraz erlenmeyer de 125

ml, teniendo la precaución de etiquetar la solución.

d) Preparación de las muestras:

1. Colocar 4 tubos de ensaye de 5 ml en una gradilla y numerar los 4 tubos

de ensaye del 1 al 4 con su cinta masking tape.

2. Al tubo 1 agregue 5 mL de la solución de NaCl al 10 %.

3. Al tubo 2 agregue 5 mL de la solución de NaCl al 0.85 %.

4. Al tubo 3 agregue 5 mL de la solución de glucosa al 5 %.

5. Al tubo 4 agregue 5 mL de la solución de agua destilada.

6. Añada a cada tubo 10 gotas de la solución de glóbulos rojos.

7. Agite y deje reposar por 5 minutos.

8. Centrifugue por 5 minutos y observe los resultados.

9. De igual forma se puede observar la muestra en el microscopio.

Observaciones:_________________________________________________

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Dibuje lo observado:

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Conclusiones:____________________________________________________

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Cuestionario:

1. ¿Cuál es la osmolaridad plasmática normal?

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2. ¿Cuál es la osmolaridad de la solución de cloruro de sodio al 10%?

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3. ¿Cual es la osmolaridad del agua destilada?

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Bibliografía:______________________________________________________

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PRACTICA 3 DETERMINACIÓN DE pH DE ALIMENTOS Y

BEBIDAS DE USO COTIDIANO EN EL HOGAR

Introducción

El pH es una medida de la acidez o alcalinidad de una sustancia, es decir,

es la medida de la concentración de iones hidrógenos presentes. Los valores de

pH se representan en una escala que va del 1 al 14 y la medición se efectúa

mediante un pH metro, con solución (mediante cambios de color) o papel

indicador.

Bioquímicamente se debe dar importancia en la protección contra las

variaciones en la concentración de iones hidrógeno en nuestro organismo

debido a que la célula produce más radicales ácidos que alcalinos como

producto del metabolismo de los alimentos. Por ejemplo, el metabolismo

completo de los carbohidratos, las grasas y algunos aminoácidos produce CO2,

lo cual origina H2CO3, que se ioniza en H+ y HCO3-.Se calcula que al día se

producen más de 800 g de CO2 que equivalen a 10000-15000 milimoles de H+.

Por otro lado, la combustión incompleta de los carbohidratos dá origen a

los ácidos pirúvico, láctico, acetoacético, entre otros.

De forma análoga, las grasas producen ácidos orgánicos (ácidos grasos),

y éstos CO2 y agua. Los aminoácidos, al desaminarse, se convierten en

cetoácidos que son metabolizados, igual que los carbohidratos y las grasas,

hasta CO2 y agua.

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Los alimentos en particular se clasifican de acuerdo a su pH : muy ácidos

o pocos ácidos. Entre los alimentos muy ácidos destacan los aderezos de

mayonesa industrial, conservas de vegetales a base de tomate, jugos cítricos de

pomelo o naranja.

Mientras que en el grupo de los alimentos pocos ácidos se encuentran el

pescado, la carne y el pollo. También dentro de esta clasificación se encuentra

las bebidas muy ácidas, las cuales se consideran las gaseosas de cola y el café

en donde su pH fluctúa en un rango de 3-4.

Investigación:____________________________________________________

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Objetivos:

1. Identificar los diferentes alimentos y bebidas ácidas y básicos de uso

común en el hogar.

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Materiales y Reactivos:

• Muestras de Alimentos.

Torta

Ceviche

Papas a la francesa

Botanas

Otras

• Muestras de Bebidas

Refresco de cola

Jugo de frutas

Leche

Agua embotellada

Otras

• Balanza

• Probeta de 100 ml

• 1 mortero con pistilo

• 1 agitador de vidrio

• 1 espátula

• 1 varilla de vidrio

• 1 charolita para pesado

• 1 vasos de precipitado de 250 mL

• 1 vasos de precipitado de 50 mL

• 1 pipeta de 10 ml

• Potenciómetro

• Tiras indicadoras de pH

• Detergente en polvo

• Guantes de látex

• Agua destilada o potable (agua de garrafón)

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Procedimiento:

1. Medición de pH en muestras de alimentos.

1. Pesar 30 g aproximadamente de muestra de alimento.

2. Colocarla en el mortero y molerla.

3. Adicionar 30 ml de agua destilada para ayudar la molienda hasta que la

muestra quede completamente molida (evite que queden grumos muy

grandes de muestra).

4. Colocar el alimento molido en un vaso de precipitado de 250 mL.

5. Enjuagar el mortero con 20 ml de agua destilada y adicionarla en el vaso

de precipitado de 250 mL.

6. Agitar muy bien la mezcla por unos minutos.

7. Realizar la lectura de pH en la parte acuosa de la muestra usando el

potenciómetro y la tira indicadora. Registrar ambas lecturas en el

recuadro final.

Nota: Si el potenciómetro queda impregnado con grasa de la muestra,

lave el equipo con abundante agua e inclusive introduzca dentro de una

solución jabonosa, para finalmente enjuagar nuevamente con abundante

agua. Asegúrese que el equipo quedo completamente limpio para la

siguiente lectura.

8. Realizar la lectura de pH de las muestras de aliemos del resto de los

equipos.

2. Medición de pH en muestras liquidas.

1. Colocar 40 mL de muestra en un vaso de precipitado de 50 ml.

2. Realizar la lectura de pH directamente en la muestra usando el

potenciómetro y la tira indicadora.

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3. Realizar la lectura de pH de las muestras liquidas del resto de los

equipos.

Resultados de pH de las muestras:

Muestra pH

Potenciómetro pH

Tira indicadora

Conclusiones:____________________________________________________

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Cuestionario:

1. ¿Qué es el pH?

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2. ¿A que se debe la acidez de los alimentos?

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3. ¿Qué ocasiona en el ser humano el consumo de alimentos con pH muy

ácido o muy básicos?

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4. A que se debe el cambio de pH en algunos alimentos durante su

descomposición.

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Bibliografía:______________________________________________________

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PRACTICA 4 SEPARACIÓN DE PIGMENTOS VEGETALES

POR CROMATOGRAFIA EN PAPEL

Introducción

La cromatografía es una técnica utilizada para separar o analizar mezclas

complejas de sustancias orgánicas. Existen varias técnicas relacionadas de las

cuales las más importantes son: cromatografía de columna, cromatografía de

papel o adsorción, cromatografía de capa delgada, cromatografía de gases e

intercambio de iones.

La cromatografía en papel, como todas las técnicas simples, ha

revolucionado la separación y detección de productos de reacción y la

determinación e identificación de compuestos. Esta técnica fue desarrollada en

1944 por Martin en Inglaterra, consiste en colocar en tiras de papel como

soporte de una fase estacionaria acuosa mientras que una fase móvil orgánica

se desplaza en la tira, gotas de la sustancia a separar cerca del punto donde

partirá el desplazamiento de la fase orgánica.

La relación de la distancia recorrida por el compuesto entre la distancia

que recorre el frente del solvente desde el sitio de aplicación se conoce como

valor Rf (relación de frentes) del compuesto. Bajo condiciones estrictamente

controladas el Rf es una constante importante para propósitos de identificación.

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Investigación:____________________________________________________

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Objetivo:

Extraer los pigmentos fotosintéticos y separarlos mediante una técnica

sencilla de cromatografía en papel.

Materiales y Reactivos:

• Hojas de espinaca

• Zanahoria

• Betabel

• 1 probeta

• Mortero y pistilo

• Embudo de vidrio chico

• Toallitas absorbentes (sanitas).

• Alcohol

• 3 caja Petri

• 3 hojas blancas tamaño carta

• Tijeras

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Procedimiento:

1. Lavar las hojas de espinacas, retirar los nervios y ponerlas en un

mortero, junto con 30 ml de alcohol.

2. Triturar la mezcla en el mortero con la ayuda del pistilo hasta que las

hojas se decoloren y el disolvente adquiera un color verde intenso.

3. Filtrar en un embudo con toallitas absorbentes (sanitas).

4. Colocar el filtrado en una caja Petri, y sobre ella colocar un rectángulo

de unos 15 centímetros de ancho por 10 centímetros de alto doblado

en V para que se mantenga en pie sobre la caja de Petri.

5. Dejar así el montaje y esperar unas horas. Los pigmentos se irán

separando según su adsorción. 6. Repetir la operación pero utilizando el betabel y la zanahoria.

Observaciones:_____________________________________________

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Conclusiones:____________________________________________________

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Cuestionario:

1. ¿Cuáles son los pigmentos fotosintéticos detectados en las hojas de

espinaca, en la zanahoria y en el betabel?

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2. Mencione porqué existe diferencias de altura entre las diferentes líneas

formadas por los pigmentos:

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3. Porqué es importante la técnica de cromatografía en papel?

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Bibliografía:______________________________________________________

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