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UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA
UNIDAD ACADÉMICA DE INGENIERÍA QUÍMICA,
INDUSTRIAL, ALIMENTOS, BIOCOMBUSTIBLES,
BIOMOLECULAR Y BIOFARMACIA
Diagnóstico de Inmunoglobulinas por el Método de
Inmunodifusión Radial
Monografía previa a la obtención del
Título de Químico Farmaceuta.
AUTORA:
FANNY XIMENA PESÁNTEZ HINOSTROZA
DIRECTOR:
Q.F. XAVIER SANTAMARÍA
Cuenca – Ecuador
2011
Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ingeniería Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustible y Biofarmacia
Diagnóstico de Inmunoglobulinas por el Método de Inmunodifusión Radial Página I
DEDICATORIA
Esta Monografía la dedico a Dios y a mi familia. A mis
padres Patricio y Fani, por su cariño, ayuda y comprensiòn
a lo largo de toda mi vida, en donde me han enseñado a
levantarme siempre despuès de una caida y encarar los
problemas con dignidad y fortaleza, sin desfallecer en el
intento. A mis hermanos que con su constante apoyo y
amor me han dado las fuerzas para no abandonar las metas
que me he propuesto. A mis amigos que
incondicionalmente me han brindado su hombro para
alcanzar este éxito en mi vida. A la Universidad Catòlica
de Cuenca en la persona del Ing. Santiago Gomez, quien
me abrio sus puertas y me brindo su apoyo y contingencia,
quien confio en mi y espero nunca defraudarlo. De
corazòn muchas gracias a todos y que su vida este llena
simpre de Bendiciones.
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Diagnóstico de Inmunoglobulinas por el Método de Inmunodifusión Radial Página I
AGRADECIMIENTO
Al Q.F. Xavier Santamarìa director de monografía, que
gracias a sus conocimientos, apoyo, persistencia, paciencia
y correcta dirección he podido culminar con éxito esta
monografía. A cada uno de los catedráticos de la Unidad
Académica de Ingeniería Química, Industrial, Alimentos,
Biocombustibles y Biofarmacia de la Universidad Católica
de Cuenca, encabezada por el Ing. Santiago Gómez; por su
trato humano y su visión crítica de muchos aspectos
cotidianos de la vida, que nos ayudan a formarnos como
personas de bien. Para toda mi familia que por su apoyo
motivación y optimismo me han ayudado en momentos
difíciles de mi vida.
Para ellos, mi más sincero agradecimiento.
Página II
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Diagnóstico de Inmunoglobulinas por el Método de Inmunodifusión Radial Página I
INDICE
Capítulo I.
Inmunoglobulinas
1.1. Historia ............................................................................................................... 1
1.2. Estructura de las Inmunoglobulinas ................................................................... 2
1.2.1. Unidad Estructural Básica ................................................................... 2
1.2.1.1. Cadenas Ligeras ................................................................................ 4
1.2.1.2. Cadenas Pesadas ............................................................................... 5
1.2.1.3. Parte variable y constante de las cadenas ligeras y pesadas………..5
1.2.1.4. Moléculas adicionales a la unidad estructural básica ....................... 6
1.2.1.5. Estructura espacial de las inmunoglobulinas .................................... 6
1.3. Funciones de las Inmunoglobulinas ................................................................... 7
1.3.1. Unión antígeno anticuerpo ................................................................... 7
1.3.2. Fuerzas de unión Ag-Ac ...................................................................... 8
1.3.3. Avidez de la unión Ag-Ac ................................................................... 9
1.3.4. Especificidad de la unión Ag-Ac ......................................................... 9
1.3.5. Propiedades biológicas de las inmunoglobulinas ................................ 10
1.3.6. Opsonización. ...................................................................................... 10
1.4. Tipos de Inmunoglobulinas ................................................................................ 11
1.4.1. Inmunoglobulina G .............................................................................. 11
1.4.2. Inmunoglobulina A .............................................................................. 13
1.4.3. Inmunoglobulina M ............................................................................. 14
1.4.4. Inmunoglobulina D .............................................................................. 15
1.4.5. Inmunoglobulina E .............................................................................. 15
1.5. Propiedades y función de cada una de las inmunoglobulinas ............................ 17
1.5.1. Inmunoglobulina G .............................................................................. 17
1.5.2. Inmunoglobulina A .............................................................................. 18
1.5.3. Inmunoglobulina M ............................................................................. 19
1.5.4. Inmunoglobulina D .............................................................................. 19
1.5.5. Inmunoglobulina E .............................................................................. 19
Capítulo II.
Inmunodifusión radial o test de difusión en gel
2.1. Definición ........................................................................................................... 21
2.2. Preparación del gel de agarosa ........................................................................... 21
2.2.1. Procedimiento para preparar un gel al 1% (250 ml) ............................ 21
2.2.1.1. Materiales ......................................................................................... 21
2.2.1.2. Reactivos ........................................................................................... 22
2.2.1.3. Preparación de Soluciones ................................................................ 22
2.2.1.4. Protocolo de preparación de un gel de agarosa al 1% ...................... 23
2.3. Preparación y aplicación de las muestras ........................................................... 24
2.4. Inconvenientes de la inmunodifusión ................................................................. 25
2.5. Interpretación de resultados ................................................................................ 25
2.6. Características analíticas..................................................................................... 26
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Capítulo III.
Técnica para la cuantificación de inmunoglobulinas según el método de
inmunodifusión radial
3.1. Fundamento ........................................................................................................ 27
3.2. Composición de los reactivos ............................................................................. 27
3.3. Condiciones de temperatura ............................................................................... 27
3.4. Condiciones del suero control y muestras a investigar ...................................... 29
3.5. Técnica................................................................................................................ 31
3.6. Lectura de resultados .......................................................................................... 33
3.6.1. Lectura de resultados con la regla de lectura ....................................... 33
3.6.2. Lectura de resultados con lupa graduada ............................................. 34
3.7. Elaboración de la curva de calibración ............................................................... 35
3.8. Observaciones ..................................................................................................... 36
3.9. Niveles de inmunoglobulinas séricas en adultos jóvenes sanos por el método de
inmunodifusion radial ................................................................................................ 36
CONCLUSIONES ..................................................................................................... 39
BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................................... 44
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OBJETIVOS
Objetivo General
Investigar los temas relacionados con las Inmunoglobulinas, sus clases,
funciones, técnicas y procedimientos para su determinación adecuada.
Objetivos Específicos
Conocer los aspectos generales de las Inmunoglobulinas.
Conocer sobre la inmunodifusión radial o test de difusión en gel
Determinar la técnica para la cuantificación de inmunoglobulinas según
el método de inmunodifusión radial
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INTRODUCCIÓN
Los seres superiores defienden constantemente su integridad biológica frente a
agresiones, procedentes del exterior así como del propio organismo. De no ser así,
morirían como consecuencia de tumores e infecciones de bacterias, virus, hongos, etc.
Para que estos fenómenos de defensa se lleven a cabo, los organismos disponen de un
conjunto de elementos especiales, conocido como sistema inmune. La capacidad de
defensa se adquiere antes de nacer y se madura y consolida en los primeros años de la
vida fuera del seno materno.
Permanentemente el individuo está recibiendo contagios de elementos patógenos que,
de no existir el sistema inmune, invadirían toda la economía con la consiguiente muerte
del individuo. También el sistema inmune está protegiendo al individuo frente a la
formación y crecimiento de células neoplásicas. Sin embargo, hay multitud de casos en
los que los sistemas de defensa son en sí causa de enfermedad. En otros casos, por
razones todavía no muy bien conocidas, el sistema inmune reacciona frente a
componentes propios, que destruye, ocasionando graves trastornos, o incluso la muerte.
El punto clave del sistema inmune es su capacidad de reconocimiento específico de
cualquier tipo de molécula o partícula extraña. Para ello, el sistema inmune cuenta con
las inmunoglobulinas (Ig) y con los receptores de los linfocitos T (TCR), los cuales
exhiben tres importantes propiedades: su diversidad, su heterogeneidad y su
procedencia a partir de reordenaciones de genes.
Las inmunoglobulinas funcionan como la parte específica del complejo de las células B,
a nivel de membrana, que reconoce al antígeno y también como moléculas circulantes,
es decir anticuerpos secretados por las células plasmáticas procedentes de activación,
proliferación y diferenciación de células B. Estos anticuerpos se localizan en el suero,
en los líquidos tisulares (intersticiales) y recubriendo ciertos epitelios internos. Estas Ig
circulantes son los efectores de la rama humoral del sistema inmune, he aquí la
importancia de conocer las técnicas utilizadas en la actualidad para su determinación.
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CAPÍTULO I
INMUNOGLOBULINAS
1.1.Historia
La historia de las inmunoglobulinas arranca a finales del siglo XIX, en 1890 Emil Adolf
von Behring y Shibasaburo Kitasato describieron la actividad de los anticuerpos contra
la difteria y la toxina tetánica. Behring y Kitasato propusieron la teoría de la inmunidad
humoral, en donde un mediador presente en el suero sanguíneo podría reaccionar con
un antígeno extraño, dándole el nombre de anticuerpo.
En 1897 Paul Ehrlich propone la teoría de la cadena lateral de la interacción entre
antígeno y anticuerpo, lanza la hipótesis de que existían receptores en la superficie de
las células que se unían específicamente a toxinas y que esta reacción desencadenaba la
producción de anticuerpos.
En 1904, Almroth Wright sugiere que los anticuerpos solubles revestían las bacterias
para señalarlas para su fagocitosis y destrucción en un proceso denominado
opsonización.
En los años 1920, Michael Heidelberger y Oswald Avery descubren la naturaleza de los
anticuerpos(1) observando que los antígenos podían ser precipitados por ellos y
demostrando que éstos eran un tipo de proteínas.
A finales de los 1930 John Marrack examinó las propiedades bioquímicas de las
uniones antígeno-anticuerpo; en los años 1940 Linus Pauling confirmó la teoría de la
llave y la cerradura propuesta por Ehrlich mostrando que las interacciones entre
anticuerpos y antígenos dependían más de su forma que de su composición química.12
En 1948, Astrid Fagreaus descubrió que los linfocitos B en su forma de célula
plasmática eran responsables de la producción de anticuerpos.
(1) Marrack, JR (1938). Chemistry of antigens and antibodies (2nd ed. edición). London: His Majesty's
Stationery Office
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A principios de los 1960 se produce el principal avance, Gerald M. Edelman y Joseph
Gally sobre la cadena ligera y la comprensión de que ésta era idéntica a la proteína de
Bence Jones descrita en 1845 por Henry Bence Jones. Edelman continuó con el
descubrimiento de que los anticuerpos estaban compuestos por cadenas ligeras y
pesadas unidas por enlaces disulfuro.
Por las mismas fechas, Rodney Porter caracterizó las regiones de unión del anticuerpo
(Fab) y la cola del anticuerpo (Fc) en el tipo IgG. Conjuntamente, estos científicos
dedujeron la estructura y la secuencia completa de aminoácidos de la IgG.
Mientras la mayoría de estos primeros estudios se fijaron en las IgM e IgG, se
identificaron otros isotipos de inmunoglobulina en los años 1960: Thomas Tomasi
descubrió los anticuerpos secretados (IgA) y David Rowe y John Fahey identificaron la
IgD y la IgE fue identificada por Kikishige Ishizaka y Teruki Ishizaka como una clase
de anticuerpos implicados en reacciones alérgicas.
En 1975 César Milstein y Georges J.F. Köhler idean el método para la producción de
anticuerpos monoclonales. En 1976, los estudios genéticos revelaron la base de la vasta
diversidad de los anticuerpos al ser identificada la recombinación somática de los genes
de inmunoglobulina por Susumu Tonegawa.
1.2.Estructura de las Inmunoglobulinas
Las inmunoglobulinas son glicoproteínas formadas por cadenas polipeptídicas
agrupadas, en una o varias unidades estructurales básicas.
1.2.1. Unidad estructural básica.- Cada unidad está compuesta por cuatro cadenas
polipeptídicas unidas entre sí por puentes disulfuro y otras uniones de tipo no covalente.
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Las cuatro cadenas polipeptídicas de acuerdo su tamaño, son de dos tipos: de bajo peso
molecular (aproximadamente 22 KD) y de alto peso molecular (50-70 KD, dependiendo
del tipo de Ig). Los polipéptidos de bajo peso molecular reciben el nombre de cadenas
ligeras o cadenas L (Light) y las de alto peso molecular, cadenas pesadas o cadenas H
(Heavy).
Dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas se agrupan de tal manera que existe una
proximidad espacial entre los cuatro extremos amínicos de las cadenas ligeras y pesadas
por una parte, y entre los dos extremos carboxílicos de las cadenas pesadas por otra.
Esta estructura básica de las inmunoglobulinas puede ser fraccionada mediante la
utilización de enzimas (papaína, pepsina, etc.), como fue efectuado por Porter en 1959,
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obteniéndose diferentes tipos de fragmentos. El tratamiento con papaína produce la
ruptura específica de las cadenas H, en el espacio comprendido entre el puente disulfuro
que las une entre sí y los que las unen a las cadenas ligeras. Se obtienen tres fragmentos:
uno denominado Fc, que determina la actividad biológica, contiene el alotipo y
determina la clase y subclase de cadena pesada y dos denominados cada uno de ellos
Fab, que contienen el idiotipo y es por donde la molécula se une al antígeno.
1.2.1.1. Cadenas Ligeras.- Existen dos tipos de cadenas ligeras, estructuralmente
diferentes, que se conocen como cadenas ligeras tipo kappa (k) y cadenas ligeras tipo
lambda (l). La familia de genes que codifica para la cadena ligera k se localiza en el
cromosoma 2 y los loci de los genes homólogos que codifican para la cadena l, en el
cromosoma 22. En cada molécula de inmunoglobulina las dos cadenas ligeras son del
mismo tipo, k o bien l, pero nunca existe una de cada tipo en la misma
inmunoglobulina. Las cadenas ligeras están formadas por unos 200 aminoácidos con la
particularidad de que existen dos puentes disulfuro que unen grupos de unos cincuenta
aminoácidos. Concretamente la IgG1 posee 214 aminoácidos y su estructura secundaria
y terciaria están determinadas por dos puentes disulfuro intracatenarios que unen los
aminoácidos 23 con el 88 y 134 con el 193. A su vez, estas cadenas ligeras tienen otro
puente disulfuro intercatenario, por el cual cada una de ellas se une a una cadena pesada
para constituir la unidad básica de las inmunoglobulinas. Este puente se encuentra en el
último aminoácido (214) de la parte carboxílica para el tipo k y en el penúltimo para el
tipo l.(2)
(2)http://www.uco.es/grupos/inmunologia-molecular/inmunologia/tema03/etexto03.htm
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1.2.1.2. Cadenas pesadas.- Estas cadenas poseen unos cuatrocientos aminoácidos
estableciéndose entre algunos de ellos puentes disulfuro (intracatenarios) que asocian
unos 60 aminoácidos y que condicionan la estructura secundaria del polipéptido. Por
ejemplo, las cadenas pesadas de la IgG1 poseen 440 aminoácidos y los puentes
disulfuro unen el aminoácido 22 con el 96, el 144 con el 200, el 261 con el 321 y el 367
con el 425. Estas dos cadenas pesadas están unidas la una a la otra por puentes disulfuro
intercatenarios, ya indicados anteriormente, y que pueden ser de uno a cinco
dependiendo del tipo de inmunoglobulina. En estas cadenas pesadas, y a nivel de los
puentes disulfuro intercatenarios, hay una zona de unos 15 aminoácidos, de gran
flexibilidad debido a su estructura y constituye lo que se denomina zona bisagra por
donde se deforma la molécula de inmunoglobulina cuando se produce la unión con el
antígeno, facilitándose así su acoplamiento con éste. Los loci de los genes que codifican
para la cadena pesada se localizan en el brazo largo del cromosoma 14.(3)
1.2.1.3. Parte variable y constante de las cadenas ligeras y pesadas.-
Estructuralmente, las cadenas ligeras poseen dos partes: una corresponde al extremo
carboxílico que diferencia las cadenas ligeras en dos tipos k y l, y constituye la parte
constante de las cadenas ligeras (CL). La otra corresponde al extremo amínico, que es
muy variable y constituye la parte variable de las cadenas ligeras (VL) y corresponde a
la zona de interacción con el antígeno. Las partes constante y variable son prácticamente
de igual tamaño en las cadenas ligeras. También las cadenas pesadas poseen una parte
variable y otra constante. Aproximadamente el tercio del extremo amínico de estas
cadenas se caracteriza por ser estructuralmente muy variable, por lo que se conoce como
parte variable de las cadenas pesadas (VH). Aproximadamente los dos tercios del
extremo carboxílico de todas las cadenas pesadas de un mismo tipo de
inmunoglobulinas poseen una estructura idéntica. De ahí que esta parte de las cadenas
pesadas se conozca como parte constante de las cadenas pesadas (CH). Esta parte
constante es diferente según la clase de inmunoglobulina que consideremos,
determinando la existencia de cinco tipos de cadenas pesadas: g, a, m, d y e que definen
a su vez las cinco clases de inmunoglobulinas: IgG, IgA, IgM, IgD e IgE
respectivamente.
http://www.uco.es/grupos/inmunologia-Molecular/inmunologia/tema03/etexto03.htm
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1.2.1.4 Moléculas adicionales a la unidad estructural básica.- En las
inmunoglobulinas aparecen, además de las cuatro cadenas polipeptídicas básicas, un
componente glucídico (que representa el 2-14 % del peso total de la molécula) y en
algunas clases de inmunoglobulinas, glicoproteínas adicionales conocidas como cadena
J y pieza de secreción. La cadena J es una glicoproteína con un 12 % de azúcares y un
peso molecular de 15 kD que une, mediante puentes disulfuro, extremos Fc en la IgA e
IgM. La pieza de secreción es una glicoproteína de 58 kD de peso molecular que
sintetizan las células epiteliales de las mucosas y glándulas exocrinas.
1.2.1.5 Estructura espacial de las inmunoglobulinas.- Las inmunoglobulinas pueden
estar constituidas por unidades básicas simples, como es el caso de la IgG, IgD e IgE;
en forma de dímeros (dos unidades básicas unidas), como es el caso de la IgA, o incluso
por hasta cinco estructuras básicas unidas por sus extremos Fc como es el caso de la
IgM. Esto se debe a la cualidad que tienen las cadenas m y a de unirse entre sí. Esta
unión se realiza a través de la cadena J y mediante puentes disulfuro.
Las cadenas pesadas y ligeras están plegadas sobre sí mismo, cada uno de los dominios
de las cadenas está constituido a modo de “cilindros” en los que se encuentran plegados
en forma de sándwich dos grupos de cadenas proteicas, una con tres cadenas
polipeptídicas y la otra con cuatro, que presentan estructuras secundarias es de hoja
plegada b. Estas dos capas proteicas están alineadas paralelamente rodeando un espacio
interior en el que predomina la presencia de aminoácidos hidrófobos. La unión de esas
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dos capas se efectúa por puentes disulfuro. En las zonas constantes, las capas de cuatro
segmentos están en el exterior de la molécula y las de tres en el interior, mientras que en
las variables es al contrario; por lo demás, el modelo global de plegado guarda gran
semejanza entre los dominios variables y constantes. Sin embargo, las regiones
hipervariables constituyen tres bucles adicionales que no se someten al plegamiento del
resto del dominio.
1.3.FUNCIONES DE LAS INMUNOGLOBULINAS
La función esencial es la de unirse al antígeno, por lo tanto actúan como receptoras de
señales antigénicas o colaboran en la destrucción antigénica. La primera función se
presenta cuando las inmunoglobulinas se encuentran insertas en la membrana de los
linfocitos B (inmunoglobulinas de membrana), y la segunda requieren la colaboración del
complemento, macrófagos, neutrófilos y células NK, que tienen la propiedad de unir las
inmunoglobulinas por su extremo Fc.
1.3.1. Unión antígeno anticuerpo. Los epítopos de un antígeno pueden estar formados
por aminoácidos consecutivos en la secuencia de la proteína, como las proteínas se
encuentran normalmente dobladas sobre si mismas según lo que llamamos estructura
terciaria, en la mayoría de los casos los anticuerpos generados contra este tipo de epítopos
solo reconocerán a la proteína desnaturalizada o “linearizada” y por ello se les llama
epitopos lineales. En la mayoría de los casos los epítopos suelen estar formados por
aminoácidos del antígeno que solo se encuentran suficientemente cerca unos de otros en
la proteína nativa, es decir en la proteína que tiene estructura terciaria conservada, es decir
una conformación adecuada, por lo que a estos epítopos se les llama epitopos
conformacionales. Cuando se inmuniza con una proteína, se genera una serie de
anticuerpos dirigidos contra los distintos epítopos de la misma, todos esos anticuerpos se
encontraran circulando en el suero, una vez extraído, será el antisuero. El tipo de
anticuerpos que compondrán ese antisuero dependerá en gran medida de la forma en que
se haya preparado la proteína para la inmunización, si es desnaturalizada, solo existirán
epítopos lineales, mientras que si está en su estado nativo, coexistirán en el antisuero
anticuerpos que reconozcan epítopos conformacionales con otros que reconozcan
epítopos lineales. En el caso de anticuerpos monoclonales, todos los anticuerpos
procederán de un clon de células plasmáticas y por tanto estarán dirigidos contra un solo
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epítopo que será de un tipo u otro. La importancia radica, en que dependiendo del tipo de
epitopos que reconozcan los anticuerpos, las aplicaciones diagnosticas o de investigación
serán distintas. En general, los anticuerpos que reconocen epitopos lineales serán útiles
para técnicas de Western Blot (donde se analiza la proteína generalmente desnaturalizada)
mientras los que reconocen epítopos conformacionales lo serán para técnicas de
inmunofluoresencia, inmunoprecipitación, etc.
Las inmunoglobulinas se unen a los epitopos de los antígenos por sus sitios activos,
constituidos, por los segmentos variables de las cadenas pesadas y ligeras y donde
intervienen principalmente las regiones hipervariables. Esta zona de unión al epítopo se
conoce con el nombre de paratopo.
1.3.2. Fuerzas de unión Ag-Ac. La unión del antígeno (Ag) con el anticuerpo (Ac) o
inmunoglobulina es semejante a la que se establece entre la enzima y su substrato o entre
proteínas que pertenecen a cualquier vía de señalización intracelular. Esto se deben a la
formación de múltiples enlaces no covalentes (enlaces de hidrogeno, interacciones
electrostáticas, de Van der Waals e hidrófobas), cada uno de los cuales por si solos son
débiles, pero como se establecen múltiples interacciones, la fuerza total de la unión puede
ser muy elevada. El epítopo y el paratopo deben encajar perfectamente, dependiendo de
ello la “fuerza” de la interacción conocida con el nombre de afinidad. La afinidad es de
vital importancia, pues de ello dependerá tanto la utilidad diagnóstica y de investigación
de un anticuerpo como su importancia fisiopatológica. Al tratarse de uniones no
covalentes, la unión Ag/Ac será reversible de modo que se estarán formando y disociando
complejos constantemente de acuerdo con la siguiente ecuación:
KA
Ag + Ac = == Ag-Ac
KD
Donde ka representa la constante de velocidad y kd la de disociación.
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El momento en que la velocidades de asociación y disociación son igualen, es decir, que
el numero de complejos Ag/Ac que se formen sea el mismo que el que se disocie, se ha
llegado a una situación de equilibrio dinámico. Cuanto mayor sea la velocidad de
asociación y menor la de disociación mayor será la afinidad de la interacción de esa pareja
Ag/Ac.. En estas condiciones la concentración de antígeno que permite que la mitad de
los anticuerpos estén unidos a ellos y la otra mitad libre, medida en molaridad, se
denomina constante de disociación (KD) y es una medida directa de la afinidad de la
interacción. Cuanto menor sea la KD mayor será la afinidad puesto que indica que es
necesaria una menor concentración de antígeno para que la mitad de los anticuerpos estén
ocupados. La inversa de la KD es la constante de asociación (KA) cuyo valor es
directamente proporcional a la afinidad de la interacción. Un determinado anticuerpo
podrá unirse a más de un antígeno con afinidades distintas en cada caso.
1.3.3 Avidez de la unión Ag-Ac. El fenómeno de la unión Ag/Ac es en realidad mucho
más complejo, pues cada uno de los antígenos poseen varios epítopos distintos, por lo que
podrán unir más de un anticuerpo. Cada molécula de anticuerpo, por su parte, podrá unir
al menos dos moléculas de antígeno, una por cada Fab y en el caso de la IgM hasta diez
moléculas (las inmunoglobulinas IgM se ensamblan en unidades funcionales constituidas
por cinco moléculas de anticuerpo). En un antígeno, un determinado epítopo puede estar
representado varias veces siendo capaz de unir varias moléculas del mismo anticuerpo. La
fuerza total de la interacción que considera todas las interacciones epítopo/paratopo que
tienen lugar entre antígenos y anticuerpos multivalentes (con varios sitios de unión), se
denomina avidez y es mucho mayor que la suma de las afinidades pues las distintas
interacciones se estabilizan entre ellas. Estas interacciones multivalentes poseen una gran
importancia fisiopatológica por cuanto cuando se encuentren Ag y Ac en solución, como
es el caso del plasma o los tejidos, se formaran agregados constituidos por muchas
moléculas que denominamos Inmunocomplejos. A concentraciones equivalentes de Ag y
Ac estos inmunocomplejos serán de gran tamaño y podrán quedar atrapados en los
tejidos, iniciando una respuesta inflamatoria y dando lugar a las llamadas enfermedades
por depósito de inmunocomplejos.
1.3.4. Especificidad de la unión Ag-Ac. La unión entre el Ag y la Ig tiene una gran
especificidad, de tal manera que una Ig se unirá con mayor avidez, a un antígeno
determinado. En algunos casos la inmunoglobulina podrá unirse a antígenos con epítopos
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muy similares, aunque en este caso la afinidad de la unión es mucho menor, es posible
que un mismo epítopo se encuentre con dos antígenos diferentes en cuyo caso el
anticuerpo reaccionara con los dos antígenos, diciéndose entonces que existe una
reactividad cruzada.
La acción final de las inmunoglobulinas es destruir al antígeno y/o neutralizar los efectos
nocivos de los mismos. Para esto todas las inmunoglobulinas poseen, una característica
esencial y común, que es la de unirse específicamente al antígeno, esto depende, de sus
regiones hipervariables contenidas en el fragmento Fab. Tanto la neutralización como la
destrucción del antígeno, lo consiguen, dependiendo del tipo y manera de encontrarse el
antígeno y también del tipo de inmunoglobulina que interviene en cada caso utilizando
para ello, las regiones constantes y concretamente sus extremos Fc. Luego de la unión del
antígeno y la inmunoglobulina, puede anularse la acción del antígeno por neutralización,
precipitación o aglutinación del mismo. Así si la Ig es específica para una toxina
bacteriana, cuando se produce la unión Ag-Ac (toxina-antitoxina), quedan neutralizados
los efectos tóxicos de la toxina. Clásicamente (cuando no se conocía la estructura de las
inmunoglobulinas), se las denominase antitoxinas, precipitinas o aglutininas, en función
de la reacción que se detectaba en cada caso.
1.3.5. Propiedades biológicas de las inmunoglobulinas. La neutralización, precipitación
y aglutinación de los antígenos no son suficientes por sí solos para la destrucción y total
eliminación, requiere de la colaboración de otros elementos, como el sistema del
complemento, macrófagos, polimorfonucleares o células NK. Las inmunoglobulinas, al
detectar los antígenos y producirse la subsiguiente unión a ellos, actúan como trans-
ductores de la información de la presencia de los mismos que serían destruidos por el
complemento, macrófagos, los polimorfonucleares o células NK a los que dan
especificidad.
1.3.6 Opsonización. Al unirse el antígeno e inmunoglobulina G se da una serie de
cambios alostéricos en el extremo Fc de la IgG que hacen que se una a receptores que se
encuentran en la membrana de macrófagos y polimorfonucleares. A este fenómeno se le
denomina opsonización. Al producirse esta unión, los macrófagos se activan, iniciándose
el fenómeno de fagocitosis y subsiguiente destrucción de los complejos antígeno
anticuerpo por los procesos líticos intracelulares, propios de la acción de los enzimas
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contenidos en los lisosomas de estas células. Estos receptores pueden ser de distinta
naturaleza, conociéndose en la actualidad tres de estos receptores: FcgRI, FcgRII y
FcgRIII, conocidos en la actualidad como CD64, CD32 y CD16 respectivamente.
Además de en los macrófagos estos receptores se encuentran en otras células como
plaquetas, linfocitos B y NK. Cuando se produce la unión a células NK estas se activan y
lisan a las células portadoras del antígeno por un mecanismo conocido como
citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).
Si la inmunoglobulina que se une al antígeno es de las clases IgM o IgG, en sus extremos
Fc se producen ciertos cambios alostéricos y adquieren la propiedad de fijar y activar uno
de los componentes del complemento. Las fracciones activas del complemento poseen
diferentes acciones muy importantes en la defensa del organismo, una de las cuales es la
lisis celular llamado citotoxicidad que esta mediada por el complemento.
Las inmunoglobulinas tienen la capacidad de ser esenciales en el fenómeno de
reconocimiento del antígeno por parte de linfocitos B cuando se encuentran ligadas a la
membrana celular de estas células como inmunoglobulinas de membrana constituyendo
el receptor para el antígeno del linfocito B. Esta propiedad será estudiada extensamente en
capítulos posteriores.
Actualidad utilizando técnicas de Ingeniería Genética, se puede “construir” anticuerpos
monoclonales que contengan una especificidad determinada y que sean del isotipo que se
desees para que predominen unas u otras funciones biológicas.
1.4. TIPOS DE INMUNOGLOBULINAS
1.4.1. Inmunoglobulina G: Es la más abundante (80% del total de inmunoglobulinas).
Se une rápidamente con macrófagos y neutrófilos, provocando la destrucción del
microorganismo. Puede atravesar la barrera placentaria y se secreta en la leche
materna. Por ello, es responsable de la inmunidad fetal y la del recién nacido
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.
Representa más del 70 % de las Igs séricas totales. Las diferentes subclases se presentan
en proporciones muy diferentes, así la IgG1
es la subclase más frecuente (más del 60 %),
seguida de la IgG2
(aproximadamente un 18 %), mientras que IgG3
e IgG4se encuentran
en mucha menor proporción. Esta Ig posee capacidad neutralizante, precipitante, de fijar
complemento, de unirse a células NK y a macrófagos (opsonización) y es capaz de
atravesar activamente las membranas biológicas, incluida la placenta.
La propiedad de atravesar activamente las membranas biológicas es de sumo interés por
lo que, además de ejercer esta inmunoglobulina, su efecto en toda la “economía del
organismo”, lo hace también en el feto al atravesar la placenta desde la madre, merced a
la existencia de receptores para la porción Fc en el sincitiotrofoblasto.
Como el feto sólo sintetiza pequeñas cantidades de inmunoglobulinas, adquiere de este
modo la posibilidad de defensa, no solamente mientras se encuentra en el seno materno,
sino incluso durante la lactancia, período en el cual todavía no ha desarrollado la
capacidad total de síntesis de inmunoglobulinas.
Sin embargo, este paso de IgG desde la madre al feto no siempre es beneficioso para el
feto. De todos es sabido que cuando hay incompatibilidad del tipo Rh entre la madre y
el feto, se puede desarrollar el síndrome de eritroblastosis fetal como consecuencia de la
destrucción de glóbulos rojos fetales, de nefastas consecuencias si no se acude a tiempo.
Esto no se presentaría si la IgG no pasase de la madre al feto. La IgG se sintetiza
tardíamente tras un primer contacto con el antígeno, sin embargo, tras un segundo
contacto la mayoría de las Igs formadas pertenecen a esta clase (Respuesta Secundaria).
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1.4.2. Inmunoglobulina A: corresponde al 13% del total de inmunoglobulinas. Se
encuentra específicamente en secreciones serosas y mucosas, como son la leche o las
lágrimas. Actúa protegiendo la superficie corporal y los conductos secretores. Genera,
junto con la inmunoglobulina G, la inmunidad al recién nacido, al encontrarse en la
leche.
Esta inmunoglobulina posee capacidad neutralizante y precipitante, mientras que su
capacidad de fijar complemento y de opsonización son muy débiles, limitándose su
efecto a neutrófilos y no a macrófagos. La propiedad más importante de esta
inmunoglobulina viene determinada por su capacidad de unirse por el extremo Fc a la
pieza secretora, gracias a la cual puede ser secretada por las mucosas y glándulas
exocrinas, ejerciendo su acción más importante en la superficie de mucosas y líquidos
biológicos (sobre todo IgA2), tales como el liquido cefalorraquídeo, secreción bronquial,
lágrima, saliva, etc.
Esto es importante porque así protegen precisamente los puntos más vulnerables del
organismo, esto es, las puertas de entrada al mismo, como son ojos, boca, aparato
digestivo, sistema respiratorio, vagina, etc. No olvidemos que, por ejemplo, si
desplegamos la mucosa del aparato respiratorio, la superficie que cubriríamos es de
unos 300 m2, superficie que se encuentra en contacto directo con el exterior a través del
aire que se respira. Se deduce de ello que, sin duda, deben ser importantes los
mecanismos de defensa local entre los cuales la IgA tiene un papel esencial. Esta
inmunoglobulina se encuentra también en la leche materna.
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Los niveles de todas las inmunoglobulinas, a excepción de la IgG en recién nacidos son
muy bajos, siendo por tanto de gran significación el hecho de que la IgA se transfiera
desde la madre al lactante a través de la secreción láctea. De ahí que tengamos que
insistir en que los lactantes se amamanten en el mayor grado posible directamente por
las madres y no con leche de otros orígenes, a lo que actualmente existe excesiva
tendencia. La IgA recibida de la madre ejerce un importante papel de defensa a nivel de
todo el aparato digestivo. En ello parece que influyen las especiales características de
pH gástrico del lactante que es menos ácido que en el adulto y una especial resistencia
de esta inmunoglobulina frente al mismo, por lo que no se destruye a su paso por el
estómago.
1.4.3. Inmunoglobulina M: representa el 6% del total de inmunoglobulina. Aparece en
los linfocitos B naïve unida a su membrana plasmática. Se manifiesta en la respuesta
primaria activando el sistema del complemento.
Los anticuerpos del tipo IgM son los que más rápidamente se forman en respuesta a un
estímulo antigénico (Respuesta primaria). Esta Ig se caracteriza también por poseer
capacidad neutralizante, precipitante, aglutinante, fijar complemento, activar la
respuesta inmune, sin embargo no atraviesa activamente las membranas biológicas. Esta
última propiedad hace que esta inmunoglobulina ejerza su acción normalmente en los
espacios intravasculares. Representa del 5 al 10 % de las Igs séricas totales y junto a la
IgD es la más frecuentemente encontrada en la superficie de los linfocitos B como
inmunoglobulina de membrana.
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1.4.4. Inmunoglobulina D: aparece en muy baja concentración (1%). Son las primeras
inmunoglobulinas sintetizadas por los linfocitos B naïve. Su función puede estar
relacionada con la activación de estas células. Su estructura es similar a la estructura de
la inmunoglobulina G, aunque varía en la posición de los restos glucosídicos de las
cadenas proteicas.
La concentración de esta inmunoglobulina en suero es muy baja. Hasta fechas muy
recientes no se había demostrado que esta inmunoglobulina poseía capacidad de unirse a
antígenos, por lo que se dudaba de que actuase con función de anticuerpo. Sin embargo,
aunque actualmente se ha demostrado su acción de anticuerpo, no se conoce con
precisión cuáles son sus funciones específicas, aunque se piensa que colabora de forma
importante en la activación de linfocitos B al actuar como receptor en la superficie de
los mismos.
1.4.5. Inmunoglobulina E: se encuentra en concentraciones muy bajas en el suero y
secreciones al exterior (0'002%). Sin embargo, su concentración aumenta en los
procesos alérgicos.
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En muchos individuos alérgicos esta inmunoglobulina se presenta en grandes
cantidades. El estímulo para su síntesis puede proceder de una gran variedad de
antígenos, a los que en este caso se conocen como alérgenos. Estos alérgenos pueden
penetrar en el organismo a través de la piel o de las mucosas respiratoria, ocular, del
aparato digestivo, etc., así como por inyectables, como es el caso de la penicilina u otros
medicamentos. La vida media de la IgE en sangre periférica es de 24-48 horas.
No tiene capacidad de atravesar la placenta, por lo tanto, las reacciones de
hipersensibilidad inmediata no pueden transferirse de manera pasiva de la madre al feto.
Sin embargo, puede existir una predisposición de tipo familiar a padecer enfermedades
de naturaleza alérgica. Esta predisposición parece estar relacionada con una tendencia a
producir anticuerpos de tipo IgE en la respuesta secundaria frente a antígenos, en lugar
de IgG que sería la respuesta normal en individuos no alérgicos. La IgE se encuentra en
forma libre en sangre (Tabla 3.10) en donde se observa que los niveles cambian a lo
largo de la edad.
También la IgE se encuentra en otros líquidos biológicos así como unidos a basófilos y
células cebadas, gracias a la propiedad que tiene esta inmunoglobulina de unirse por su
extremo Fc a receptores de superficie presentes en dichas células. Estas células se
caracterizan por encontrarse en la piel y mucosas y por contener abundantes gránulos
citoplasmáticos, ricos en sustancias vasoactivas que liberan una vez se activan.
Se sabe que no todas las Inmunoglobulinas de una misma clase tienen idéntica estructura,
sino que dentro de las clases se pueden establecer subclases considerando la secuencia de
aminoácidos de la región constante de las cadenas H y el diferente número y situación de
los puentes disulfuro intercatenarios establecidos entre las cadenas pesadas. Así, la IgG
humana se divide en cuatro subclases (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) y la IgA e IgM en dos
(IgA1 e IgA2; IgM1 e IgM2) respectivamente.
Las regiones constantes de las cadenas pesadas de estas diferentes clases y subclases de
inmunoglobulinas se conocen, como veremos en el apartado siguiente, con el nombre de
variantes isotípicas y son las mismas en todos los individuos normales de la misma
especie.
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Aunque en los apartados anteriores se ha hecho mención a las propiedades y función de
las inmunoglobulinas, a continuación estudiaremos brevemente y por separado las
características funcionales más importantes de cada una de ellas.
1.5 PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE CADA UNA DE LAS
INMUNOGLOBULINAS
Aunque en los apartados anteriores se ha hecho mención a las propiedades y función de
las inmunoglobulinas, a continuación estudiaremos brevemente y por separado las
características funcionales más importantes de cada una de ellas.
1.5.1 Inmunoglobulina G.
Son las inmunoglobulinas más abundantes y representan más del 70 % de las Igs séricas
totales; las diferentes subclases se presentan en proporciones muy diferentes. La IgG1 es
la subclase más frecuente (más del 60 %), seguida de la IgG2 (aproximadamente un 18
%), mientras que IgG3 e IgG4 se encuentran en mucha menor proporción.
Esta Ig posee capacidad neutralizante, precipitante, de fijar complemento, de unirse a
células NK y a macrófagos (opsonización) y son capaces de atravesar activamente las
membranas biológicas. La propiedad de atravesar activamente las membranas biológicas
es de sumo interés por lo que, además de ejercer esta inmunoglobulina, su efecto en toda
la “economía del organismo”, lo hace también en el feto al atravesar la placenta desde la
madre, merced a la existencia de receptores para la porción Fc en el sincitiotrofoblasto.
Como el feto sólo sintetiza pequeñas cantidades de inmunoglobulinas, adquiere de este
modo la posibilidad de defensa, no solamente mientras se encuentra en el seno materno,
sino incluso durante la lactancia, período en el cual todavía no ha desarrollado la
capacidad total de síntesis de inmunoglobulinas.
Sin embargo, este paso de IgG desde la madre al feto no siempre es beneficioso para el
feto. De todos es sabido que cuando hay incompatibilidad del tipo Rh entre la madre y el
feto, se puede desarrollar el síndrome de eritroblastosis fetal como consecuencia de la
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destrucción de glóbulos rojos fetales, de nefastas consecuencias si no se acude a tiempo.
Esto no se presentaría si la IgG no pasase de la madre al feto.
La IgG se sintetiza tardíamente tras un primer contacto con el antígeno, sin embargo, tras
un segundo contacto la mayoría de las Igs formadas pertenecen a esta clase (Respuesta
Secundaria)
1.5.2 Inmunoglobulina A.
Esta inmunoglobulina posee capacidad neutralizante y precipitante, mientras que su
capacidad de fijar complemento y de opsonización son muy débiles, limitándose su efecto
a neutrófilos y no a macrófagos.
La propiedad más importante de esta inmunoglobulina viene determinada por su
capacidad de unirse por el extremo Fc a la pieza secretora, gracias a la cual puede ser
secretada por las mucosas y glándulas exocrinas, ejerciendo su acción más importante en
la superficie de mucosas y líquidos biológicos (sobre todo IgA2), tales como el liquido
cefaloraquideo, secreción bronquial, lágrima, saliva, etc. Esto es importante porque así
protegen precisamente los puntos más vulnerables del organismo, esto es, las puertas de
entrada al mismo, como son ojos, boca, aparato digestivo, sistema respiratorio, vagina,
etc. No olvidemos que, por ejemplo, si desplegamos la mucosa del aparato respiratorio, la
superficie que cubriríamos es de unos 300 m2, superficie que se encuentra en contacto
directo con el exterior a través del aire que se respira. Se deduce de ello que, sin duda,
deben ser importantes los mecanismos de defensa local entre los cuales la IgA tiene un
papel esencial.
Esta inmunoglobulina se encuentra también en la leche materna. Los niveles de todas las
inmunoglobulinas, a excepción de la IgG en recién nacidos son muy bajos, siendo por
tanto de gran significación el hecho de que la IgA se transfiera desde la madre al lactante
a través de la secreción láctea. De ahí que tengamos que insistir en que los lactantes se
amamanten en el mayor grado posible directamente por las madres y no con leche de
otros orígenes, a lo que actualmente existe excesiva tendencia.
La IgA recibida de la madre ejerce un importante papel de defensa a nivel de todo el
aparato digestivo. En ello parece que influyen las especiales características de pH gástrico
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del lactante que es menos ácido que en el adulto y una especial resistencia de esta
inmunoglobulina frente al mismo, por lo que no se destruye a su paso por el estómago.
1.5.3 Inmunoglobulina M.
Los anticuerpos del tipo IgM son los que más rápidamente se forman en respuesta a un
estímulo antigénico (Respuesta primaria). Esta Ig se caracteriza también por poseer
capacidad neutralizante, precipitante, aglutinante, fijar complemento, activar la respuesta
inmune, sin embargo no atraviesa activamente las membranas biológicas. Esta última
propiedad hace que esta inmunoglobulina ejerza su acción normalmente en los espacios
intravasculares.
Representa del 5 al 10 % de las Igs séricas totales y junto a la IgD es la más
frecuentemente encontrada en la superficie de los linfocitos B como inmunoglobulina de
membrana.
1.5.4 Inmunoglobulina D.
La concentración de esta inmunoglobulina en suero es muy baja. Hasta fechas muy
recientes no se había demostrado que esta inmunoglobulina poseía capacidad de unirse a
antígenos, por lo que se dudaba de que actuase con función de anticuerpo. Sin embargo,
aunque actualmente se ha demostrado su acción de anticuerpo, no se conoce con precisión
cuáles son sus funciones específicas, aunque se piensa que colabora de forma importante
en la activación de linfocitos B al actuar como receptor en la superficie de los mismos.
1.5.5 Inmunoglobulina E.
En muchos individuos alérgicos esta inmunoglobulina se presenta en grandes cantidades.
El estímulo para su síntesis puede proceder de una gran variedad de antígenos, a los que
en este caso se conocen como alergenos. Estos alergenos pueden penetrar en el
organismo a través de la piel o de las mucosas respiratoria, ocular, del aparato digestivo,
etc., así como por inyectables, como es el caso de la penicilina u otros medicamentos.
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La vida media de la IgE en sangre periférica es de 24-48 horas. No tiene capacidad de
atravesar la placenta, por lo tanto, las reacciones de hipersensibilidad inmediata no
pueden transferirse de manera pasiva de la madre al feto. Sin embargo, puede existir una
predisposición de tipo familiar a padecer enfermedades de naturaleza alérgica. Esta
predisposición parece estar relacionada con una tendencia a producir anticuerpos de tipo
IgE en la respuesta secundaria frente a antígenos, en lugar de IgG que sería la respuesta
normal en individuos no alérgicos.
La IgE se encuentra en forma libre en sangre en donde se observa que los niveles cambian
a lo largo de la edad. También la IgE se encuentra en otros líquidos biológicos así como
unida a basófilos y células cebadas, gracias a la propiedad que tiene esta
inmunoglobulina de unirse por su extremo Fc a receptores de superficie presentes en
dichas células. Estas células se caracterizan por encontrarse en la piel y mucosas y por
contener abundantes gránulos citoplasmáticos, ricos en sustancias vasoactivas que liberan
una vez se activan.
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CAPÍTULO II
INMUNODIFUSION RADIAL O TEST DE DIFUSION EN GEL
2.1 DEFINICIÓN
La inmunodifusión radial es una técnica de análisis inmunológico de tipo cuantitativo,
se basa en la formación de bandas de precipitación Ag-Ac en medios semisólidos
(generalmente de agarosa). La formación de inmunocomplejos se ve afectada por
variables como: pH, temperatura, fuerza iónica del medio, características propias del Ac
como afinidad y avidez y, la más importante, la concentración relativa de Ag y Ac. La
zona óptima de concentración para la formación del precipitado Ag-Ac se llama zona de
equivalencia.
La inmunodifusión puede ser simple (sólo se mueve el Ag o el Ac) o doble (se mueven
Ag y Ac). Para visualizar el resultado de la inmunodifusión, una vez terminada la
difusión se lava el gel y se tiñe con colorantes para proteínas (ej. Negro amido o azul
brillante de Coomassie).
Se utiliza para detectar la cantidad de anticuerpos IgG, IgM e IgA que hay en el suero
de un individuo. La técnica de inmunodifusión radial es lenta y poco sensible ya que
necesita mucha cantidad de anticuerpos (o antígeno) para que se formen complejos.
2.2 PREPARACION DEL GEL DE AGAROSA
Preparar cuba de electroforesis y cuna del gel. A los extremos abiertos de la cuna
cubrirlos con cinta de enmascarar 3M Rocket, cuidando de un trozo a lo largo de la
cinta sobresalga de la base de la cuna (0,5 cm). Frotar la base y el costado de la cuna en
contacto con la cinta para asegurar que toda la superficie este pegada. Colocar el peine
en la parte superior de la cuna. Colocar la cuna así preparada dentro de la cuba.(4)
2.2.1 PROCEDIMIENTO PARA PREPARAR UN GEL AL 1% (250 mL)
2.2.1.1. Materiales
Pipetas de 2-20uL y de 20-200uL
Cámara de electroforesis horizontal
Peines para las bandejas
(4) Fernández, E., Mora, J. y Agüero, O. Preparación de suero conejo poliespecífico anti-globulina humana. Resúmenes del IV Congreso Nacional
de Microbiología, Parasitología y Patología Clínica, Costa Rica, 1982; 163.
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Bandeja para la preparación del gel
Fuente de poder
Probetas de 50mL, 100mL y 1000mL
Botella de vidrio con más de dos veces el volumen de la solución de agarosa a
preparar.
Guantes de látex
Guantes para calor
2.2.1.2 Reactivos
Syber safe o Bromuro de etidio
Agarosa grado molecular
TBE 10X
Agua Destilada
2.2.1.3. Preparación de soluciones
A) Preparación de geles de agarosa de diferentes concentraciones (%) para
diferentes volúmenes
B) Preparación de un litro de TBE 10X
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2.2.1.4. Protocolo de preparación de un gel de agarosa al 1%
Prepare la bandeja sellando los bordes por presión o con cinta adhesiva (esto
depende del modelo de cámara utilizado) y póngale los peines.
Pese 2,5 gr. de agarosa.
Coloque la agarosa dentro de un envase de vidrio que contenga 250 mL de
buffer TBE 0,5X y caliente en el microondas o en el baño de María hasta su
completa disolución.
Cuando la solución de agarosa haya alcanzado una temperatura soportable por la
mano, agregue 2,5 ul de bromuro de etidio* (Solución madre 10 mg. mL-1) o 25
uL de SYBR Green *1 (dilución final de la solución comercial es 1 en 10.000).
Mezcle bien, agitando el recipiente en forma circular, evitando que se formen
burbujas en la solución.
Sirva la solución en la bandeja de corrida vertiendo la solución lentamente por
uno de los extremos de la bandeja y retire las burbujas que queden sobre el área
de corrida de las muestras con una punta limpia.
Deje polimerizar la agarosa
Para la corrida, llene el tanque de la cámara de electroforesis con buffer TBE
0,5X hasta cubrir el gel.
Conecte los electrodos de la cámara a la fuente de poder, gradúe el voltaje
deseado y corra las muestras.
Nota:
1. El bromuro de etidio es un fuerte agente mutágeno y posiblemente también
cancerígeno y teratógeno. Debe ser manipulado con extrema precaución en el
laboratorio. El uso de guantes, lentes de protección y bata de laboratorio es
obligatorio.
2. SYBR Green exhibe un efecto mutagénico mucho menor que el bromuro de
etidio, sin embargo, se recomienda el uso de protección personal durante su
manipulación.
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2.3 PREPARACION Y APLICACIÓN DE LAS MUESTRAS
Resuspender las muestras de ADN con 50 uL de buffer Tris 0,01M pH 7,5.
pipetear bien sobre las paredes, darles un spin down en la microcentrifuga.
Preparar un eppendorf nuevo para cada muestra, rotular.
Colocar en el 15 uL de muestra resuspendida, agregar 3 uL de buffer de carga
6X (15 uL + 3 uL = 18 uL tot.) para que así quede el buffer 1X de
concentración.
Nuevo spin down.
Sembrar en orden los 18 uL de muestra en la última calle sembrar marcador
supercoiled.
Colocar la tapa de la cuba, controlando que los bornes negativo y positivo
coinciden (rojo/rojo y negro/negro).
Conectar la cuba a la fuente de poder.
Voltaje de corrida, se calcula según una formula empírica.
Para evitar que la resistencia del gel eleve la temperatura y termine fundiendo la
agarosa, el límite de voltaje estará dado por la formula:
Voltaje total = 5Volts/cm x distancia lineal entre los bornes de la cuba.
(por ejemplo, si esa longitud es de 28 cm, entonces el voltaje máximo será de ~140-150
voltios, esta cifra es indicativa, no debe correrse a más de ese voltaje, pero puede
correrse a voltajes menores).
Activar la corrida y dejar correr una hora.
Sacar el gel de la cuba llevarlo al transiluminador, colocarlo allí y prender la luz
UV después de bajar la tapa acrílica, identificar las bandas que pudieran
aparecer.
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2.4 INCONVENIENTES DE LA INMUNODIFUSIÓN:
1. Es necesario que las concentraciones de Ag y Ac sean similares o de lo contrario no
se alcanza la equivalencia y no se forma el precipitado. El precipitado solo se forma en
el punto de equivalencia o cuando hay un ligero exceso de Ag.
2. Las moléculas más pequeñas migran con más rapidez que las de gran tamaño y
conforme la migración continúa el precipitado puede redisolverse y volverse a formar
de acuerdo con los cambios de concentración de Ag o Ac en el gel.
3. Si hay grandes cantidades de Ac, el antígeno no se difunde muy lejos antes de
alcanzar la equivalencia y el anillo es más grueso o espeso.(5)
2.5 INTERPRETACION DE RESULTADOS
Medir el anillo de precipitación, con un sistema que asegure un error máximo de 0.1
mm, al tiempo establecido de acuerdo al procedimiento aplicado y al tipo de proteina.
Procedimiento 1
Colocar en un papel milimetrado, el cuadrado de los anillos de precipitación y la
concentración de los controles utilizados. Se debe obtener una recta con una
intercepción comprendida entre 10-12 mm. Los valores de las muestras se obtienen por
interpolación.
Procedimiento 2
Colocar en papel milimetrado, el cuadrado de los anillos de precipitación frente al
logaritmo de la concentración de los controles utilizados. Se debe obtener una curva que
es prácticamente una recta para los valores bajos mientras que para los valores altos se
curva ligeramente. Los valores de las muestras se obtienen por interpolación.
Procedimiento 3
Leer sobre la tabla que se adjunta, los valores de concentración en función del diámetro
del anillo de precipitación. El suero de control, de utilizarse de acuerdo a este
procedimiento, deberá dar un anillo de precipitación que difiera como máximo 0.2 mm
del valor incluido en la tabla.
(5) Ouchterlony, O. y Nilsson, L.A. lmmunodiffusion and immunoelectrophoresis. IN: Weir, D.M. (Edit.) Handbook of
immunological methods, Vol. 1: mmunochemistry. Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1978
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2.6 CARACTERISTICAS ANALITICAS
Límites de medida
IgA 70-1050 mg/dl
IgG 300-3500 mg/dl
IgM 40-500 mg/dl
medida. - Precisión
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CAPÍTULO III
TECNICA PARA LA CUANTIFICACIÓN DE INMUNOGLOBULINAS SEGÚN
EL METODO DE INMUNODIFUSION RADIAL
3.1 FUNDAMENTO
La proteina a analizar, al difundir en gel de agarosa en el que se ha disuelto el
anticuerpo específico, forma un inmunocomplejo visible como un anillo alrededor del
pocillo de siembra. El diámetro de este anillo es proporcional a la concentración de la
proteina analizada.
Esta proporcionalidad esta en función del tiempo de migración. De hecho cuando la
migración ha terminado (72 horas para IgA e IgG y 96 horas para IgM), el cuadrado del
diámetro es linealmente proporcional a la concentración. Mientras que para tiempos
inferiores, el cuadrado del diámetro es logaritmicamente proporcional a la
concentración. En estos dos casos, es necesario construir una curva de calibración
utilizando al menos tres puntos de calibración.
Junto a la placa, se adjunta una tabla de correlación en la que a cada diámetro del
proceso de difusión terminado, viene asociada una concentración. (6) (7)
3.2 COMPOSICION DE LOS REACTIVOS
Placa de gel de agarosa que contiene el antisuero específico frente a las proteinas a
analizar.
3.3 CONDICIONES DE TEMPERATURA
- Las placas deben estar en refrigeración entre 2 a 8 ⁰ C
(6)Fahey et al., J. Immunol., 94: 84 (1965)
(7)Mancini et al., Immunochemistry, 2: 235 (1965)
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- En caso de congelarse las placas, descartar
-
- No colocar al fondo del congelador
-
- Colocarlo siempre en posición horizontal tanto en el transporte como en el
almacenamiento con la tapa hacia abajo, no dejar caer liquido.
- Nunca usar pocillos con líquido.
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-
3.4 CONDICIONES DEL SUERO CONTROL Y MUESTRAS A INVESTIGAR
- Usar sueros frescos
- No usar sueros lipémicos, hemolizados o que presenten partículas en suspensión.
- Utilizar pipetas de rango bajo igual o lijeramente superior a la cantidad que se
necesita dispensar ya que el uso de pipetas de rango alto pueden causar errores.
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- Utilizar micro tips en lugar de los tips amarillos comunes
-
- Usar técnica de pipeteo reverso (presionar el embolo hasta el último tope para
tomar la muestra y desplazarlo hasta el primero al dispensarlo, de esta manera
quedara algo de muestra en el tip que descarguemos.
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3.5 TÈCNICA
1.- Sembramos 5 ul del suero control y posteriormente sembramos las muestras a
investigar. No tocar los bordes de los pocillos al retirar la pipeta.
2.- Una vez realizada la siembra colocamos un pequeño pedazo de algodón humedecido
en el centro de la placa y cerramos.
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3.- Incubamos la placa en forma invertida a temperatura ambiente y en cámara húmeda.
4.- Evitar cambios de temperatura brusca durante la incubación ya que estos alteran la
prueba, en estos casos no se lee al tiempo indicado en el inserto pues es probable que
los diámetros sean inferiores o menores a los esperados por esa razón se deja difundir la
muestra 12 o 24 horas mas y leemos los resultados con una lupa graduada o una regla
de lectura.
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3.6 LECTURA DE RESULTADOS
3.6.1 LECTURA DE RESULTADOS CON LA REGLA DE LECTURA
1.- Centramos el pocillo a leer con la línea central vertical.
2.- Ubicar el halo en la parte superior de la regla donde las líneas oblicuas se encuentran
mas separadas.
3.- Bajamos la placa hasta que el borde exterior del halo toque las líneas laterales de la
regla, todo el halo debe quedar a la vista es decir que la línea de la regla debe apoyarse
en el borde del halo y no taparlo.
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4.- Se usa el valor del diámetro cuadrado que figura a la derecha de la línea horizontal
que esta más próxima al centro del pocillo.
5.- Se debe evitar el uso de una regla lineal común ya que el error que se comete es muy
grande.
3.6.2 LECTURA DE RESULTADOS CON LUPA GRADUADA
Con la lupa graduada la medición es más simple y más exacta.
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Una vez obtenido los diámetros de los halos, se usa la tabla de “diámetro versus
concentración que viene provista junto con la placa para encontrar las concentraciones
correspondientes a las muestras, primero se verificara si el control da los resultados
esperados y luego buscamos los valores de las muestras incógnitas.
3.7 ELABORACIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Durante los segundo seis meses de la vida útil de la placa, o si el control no diera los
resultados esperados deberemos construir nuestra propia curva de calibración, eliminado
de esta manera las fuentes de errores sistemáticos, como por ejemplo los generados por
las pipetas mal calibradas tiempos o temperaturas de incubación diferentes a los
indicados.
Obtendremos 3 puntos de la curva utilizando 3 pocillos de la placa
1.- Buscaremos el rango de trabajo de la placa, que está incluida en el inserto
2.- Buscaremos la concentración del suero control
3.- Se tratara de obtener 3 puntos de curva que abarquen la mayor parte del rango de
trabajo de la placa.
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4.- El primer punto lo realizamos haciendo una dilución al cuarto del suero control
5.- Para el segundo punto sembraremos el control puro
6.- El punto 3 lo obtendremos sembrando 3 veces el suero control en el mismo pocillo,
esperando que este difunda totalmente entre siembra y siembra-
7.- Al cabo de la incubación mediremos los halos y construiremos nuestra propia curva
graficando la curva con los datos de los 3 puntos en el papel milimetrado que viene
junto con la placa.
Es importante recordar que si la curva se realiza manualmente la ordena al origen de la
curva debe estar comprendida entre 10 y 12 ml2 , una vez dibujada la curva diámetro
cuadrado versus concentración podremos obtener las concentraciones de las muestras
incógnitas ingresando el valor del halo de cada una de estas.
3.8 OBSERVACIONES
El tiempo de difusión y por tanto el tiempo de lectura depende de la concentración y del
tipo de proteína analizada. Después de 72 horas o 96 horas, la difusión de cualquier
proteína a cualquier concentración habrá finalizado.
Para concentraciones no elevadas, es posible leer a tiempos notablemente inferiores (36
horas) aunque, en estos casos, es aconsejable realizar una nueva lectura después de 3-5
horas y comprobar que el diámetro del anillo de precipitación no ha variado y
seguidamente calcular la concentración. Si se ha producido una variación, repetir la
lectura después de otras 3-5 horas.
3.9 NIVELES DE INMUNOGLOBULINAS SERICAS EN ADULTOS JOVENES
SANOS POR EL METODO DE INMUNODIFUSION RADIAL
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CONCLUSIONES
Como finalización de este trabajo de investigación, he podido llegar a las siguientes
conclusiones:
De acuerdo con mi primer objetivo “Conocer los aspectos generales de las
Inmunoglobulinas” he concluido que las inmunoglobulinas son glicoproteínas
formadas por cadenas polipeptídicas agrupadas, en una o varias unidades
estructurales básicas, que sonr cuatro cadenas polipeptídicas unidas entre sí por
puentes disulfuro y otras uniones de tipo no covalente. Esta estructura básica de
las inmunoglobulinas puede ser fraccionada mediante la utilización de enzimas
(papaína, pepsina, etc.). El tratamiento con papaína produce la ruptura específica
de las cadenas H, en el espacio comprendido entre el puente disulfuro que las
une entre sí y los que las unen a las cadenas ligeras. Se obtienen tres fragmentos:
uno denominado Fc, que determina la actividad biológica, contiene el alotipo y
determina la clase y subclase de cadena pesada y dos denominados cada uno de
ellos Fab, que contienen el idiotipo y es por donde la molécula se une al
antígeno.
En las inmunoglobulinas aparecen, además de las cuatro cadenas polipeptídicas
básicas, un componente glucídico y en algunas clases de inmunoglobulinas,
glicoproteínas adicionales conocidas como cadena J y pieza de secreción. La
cadena J es una glicoproteína con un 12 % de azúcares y un peso molecular de
15 kD que une, mediante puentes disulfuro, extremos Fc en la IgA e IgM. La
pieza de secreción es una glicoproteína de 58 kD de peso molecular que
sintetizan las células epiteliales de las mucosas y glándulas exocrinas.
Presentan una estructura espacial en donde las inmunoglobulinas pueden estar
constituidas por unidades básicas simples, como es el caso de la IgG, IgD e IgE;
en forma de dímeros, como es el caso de la IgA, o incluso por hasta cinco
estructuras básicas unidas por sus extremos Fc como es el caso de la IgM. Esto
se debe a la cualidad que tienen las cadenas m y a de unirse entre sí. Esta unión
se realiza a través de la cadena J y mediante puentes disulfuro.
La función esencial de las inmunoglobulinas es la de unirse al antígeno, por lo
tanto actúan como receptoras de señales antigénicas o colaboran en la
destrucción antigénica. La primera función se presenta cuando las
inmunoglobulinas se encuentran insertas en la membrana de los linfocitos B
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(inmunoglobulinas de membrana), y la segunda requiere la colaboración del
complemento, macrófagos, neutrófilos y células NK, que tienen la propiedad de
unir las inmunoglobulinas por su extremo Fc.
Dentro de las propiedades biológicas de las inmunoglobulinas, tenemos que la
neutralización, precipitación y aglutinación de los antígenos no son suficientes
por sí solos para la destrucción y total eliminación, requiere de la colaboración
de otros elementos, como el sistema del complemento, macrófagos,
polimorfonucleares o células NK. Las inmunoglobulinas, al detectar los
antígenos y producirse la subsiguiente unión a ellos, actúan como trans-ductores
de la información de la presencia de los mismos que serían destruidos por el
complemento, macrófagos, los polimorfonucleares o células NK a los que dan
especificidad.
Existen varios tipos de inmunoglobulinas como son: la Inmunoglobulina G, que
es la más abundante (80% del total de inmunoglobulinas), la Inmunoglobulina A
que corresponde al 13% del total de inmunoglobulinas. Se encuentra
específicamente en secreciones serosas y mucosas, como son la leche o las
lágrimas, la Inmunoglobulina M que representa el 6% del total de
inmunoglobulina, la Inmunoglobulina D que aparece en muy baja concentración
(1%), la Inmunoglobulina E que se encuentra en concentraciones muy bajas en
el suero y secreciones al exterior (0'002%). Sin embargo, su concentración
aumenta en los procesos alérgicos.
“Conocer sobre la inmunodifusión radial o test de difusión en gel”, ha sido
planteado como mi segundo objetivo con el cual concluyo que, la
inmunodifusión radial (IDR) se basa en la difusión libre de la muestra en un gel
que contiene los anticuerpos contra la Ig que se desea cuantificar, lo que da lugar
a la formación de un anillo o círculo de precipitación alrededor del punto de
aplicación, cuya área guarda proporcionalidad con la concentración de antígeno
en la muestra.
Esta técnica se puede efectuar de dos formas. La primera, llamada de difusión
completa o de Mancini, permite la difusión total de la muestra (lo que implica un
tiempo de 48-72 horas para la lectura) y permite obtener una línea recta al
graficar el diámetro del anillo precipitado elevado al cuadrado contra la
concentración de lg. La segunda, denominada de difusión parcial o de Fahey,
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utiliza un tiempo de difusión restringido (4-18 horas) y proporciona una relación
lineal al graficar el diámetro del precipitado contra el logaritmo de la
concentración de lg. A pesar de que es un método más rápido que el descrito por
Mancini, su precisión es menor al compararla con el método de difusión
completa. Debido a su simplicidad y a que no requiere de equipo complejo, la
IDR se ha convertido en la técnica más utilizada para la cuantificación de lgs.
La principal desventaja de la IDR radica en el largo tiempo de lectura y en los
problemas que ocasionan las Igs poliméricas, cuya velocidad de difusión en el
gel depende del tamaño molecular. La cuantificación de las lgs séricas tiene
interés tanto desde el punto de vista clínico como de investigación.
Mi tercera objetivo “Determinar la técnica para la cuantificación de
inmunoglobulinas según el método de inmunodifusión radial” me ha
permitido determinar lo siguiente:
FUNDAMENTO: La proteina a analizar, al difundir en gel de agarosa en el que
se ha disuelto el anticuerpo específico, forma un inmunocomplejo visible como
un anillo alrededor del pocillo de siembra. El diámetro de este anillo es
proporcional a la concentración de la proteina analizada.
Esta proporcionalidad esta en función del tiempo de migración. De hecho
cuando la migración ha terminado (72 horas para IgA e IgG y 96 horas para
IgM), el cuadrado del diámetro es linealmente proporcional a la concentración.
Mientras que para tiempos inferiores, el cuadrado del diámetro es
logaritmicamente proporcional a la concentración. En estos dos casos, es
necesario construir una curva de calibración utilizando al menos tres puntos de
calibración.
Junto a la placa, se adjunta una tabla de correlación en la que a cada diámetro del
proceso de difusión terminado, viene asociada una concentración.
CONDICIONES DEL SUERO CONTROL Y MUESTRAS A
INVESTIGAR: Usar sueros frescos, no usar sueros lipémicos, hemolizados o
que presenten partículas en suspensión, utilizar pipetas de rango bajo igual o
ligeramente superior a la cantidad que se necesita dispensar ya que el uso de
pipetas de rango alto pueden causar errores, utilizar micro tips en lugar de los
tips amarillos comunes, usar técnica de pipeteo reverso (presionar el embolo
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hasta el último tope para tomar la muestra y desplazarlo hasta el primero al
dispensarlo, de esta manera quedara algo de muestra en el tip que descarguemos.
TÈCNICA
1.- Sembramos 5 ul del suero control y posteriormente sembramos las muestras a
investigar. No tocar los bordes de los pocillos al retirar la pipeta.
2.- Una vez realizada la siembra colocamos un pequeño pedazo de algodón
humedecido en el centro de la placa y cerramos.
3.- Incubamos la placa en forma invertida a temperatura ambiente y en cámara
húmeda.
4.- Evitar cambios de temperatura brusca durante la incubación ya que estos
alteran la prueba, en estos casos no se lee al tiempo indicado en el inserto pues
es probable que los diámetros sean inferiores o menores a los esperados por esa
razón se deja difundir la muestra 12 o 24 horas mas y leemos los resultados con
una lupa graduada o una regla de lectura.
LECTURA DE RESULTADOS CON LA REGLA DE LECTURA:
Centramos el pocillo a leer con la línea central vertical. Ubicar el halo en la parte
superior de la regla donde las líneas oblicuas se encuentran más separadas.
Bajamos la placa hasta que el borde exterior del halo toque las líneas laterales de
la regla, todo el halo debe quedar a la vista es decir que la línea de la regla debe
apoyarse en el borde del halo y no taparlo. Se usa el valor del diámetro
cuadrado que figura a la derecha de la línea horizontal que está más próxima al
centro del pocillo. Se debe evitar el uso de una regla lineal común ya que el error
que se comete es muy grande.
LECTURA DE RESULTADOS CON LUPA GRADUADA: con la lupa
graduada la medición es más simple y más exacta. Una vez obtenido los
diámetros de los halos, se usa la tabla de “diámetro versus concentración que
viene provista junto con la placa para encontrar las concentraciones
correspondientes a las muestras, primero se verificara si el control da los
resultados esperados y luego buscamos los valores de las muestras incógnitas.
ELABORACIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN:
1.- Buscaremos el rango de trabajo de la placa, que está incluida en el inserto
2.- Buscaremos la concentración del suero control
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3.- Se tratara de obtener 3 puntos de curva que abarquen la mayor parte del
rango de trabajo de la placa.
4.- El primer punto lo realizamos haciendo una dilución al cuarto del suero
control
5.- Para el segundo punto sembraremos el control puro
6.- El punto 3 lo obtendremos sembrando 3 veces el suero control en el mismo
pocillo, esperando que este difunda totalmente entre siembra y siembra
7.- Al cabo de la incubación mediremos los halos y construiremos nuestra propia
curva graficando la curva con los datos de los 3 puntos en el papel milimetrado
que viene junto con la placa.
OBSERVACIONES: El tiempo de difusión y por tanto el tiempo de lectura
depende de la concentración y del tipo de proteína analizada. Después de 72
horas o 96 horas, la difusión de cualquier proteína a cualquier concentración
habrá finalizado. Para concentraciones no elevadas, es posible leer a tiempos
notablemente inferiores (36 horas) aunque, en estos casos, es aconsejable
realizar una nueva lectura después de 3-5 horas y comprobar que el diámetro del
anillo de precipitación no ha variado y seguidamente calcular la concentración.
Si se ha producido una variación, repetir la lectura después de otras 3-5 horas.
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