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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE QUÍMICA DE ALIMENTOS
Evaluación del efecto del estado de madurez sobre el perfil de
compuestos funcionales en cuatro cultivares de mora (Rubus sp.)
Trabajo de Titulación presentado como requisito previo a la
obtención del Título de:
Química de Alimentos
AUTORA: Ana Cristina Cabrera Araujo
TUTOR: Dr. Iván Luis Tapia Calvopiña, Msc.
COTUTOR: Dr. Iván Rodrigo Samaniego Maigua, Msc.
Quito, 2019
ii
CESIÓN DE DERECHOS DE AUTOR
Yo, Ana Cristina Cabrera Araujo en calidad de autora del trabajo de investigación
“Evaluación del efecto del estado de madurez sobre el perfil de compuestos
funcionales en cuatro cultivares de mora (Rubus sp.)”, autorizo a la Universidad
Central del Ecuador a hacer uso de todos los contenidos que me pertenecen o parte de los
que contiene esta obra, con fines estrictamente académicos o de investigación.
Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la presente
autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los
artículos 5, 6, 8, 19 y demás pertinentes a la Ley de Propiedad Intelectual y su reglamento.
También, autorizo a la Universidad Central de Ecuador a realizar la digitalización y
publicación de este trabajo de investigación en el repositorio virtual, de conformidad con
lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.
Ana Cristina Cabrera Araujo
C.I. 1716898935
iii
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
DIRECCIÓN CARRERA DE QUÍMICA DE
ALIMENTOS
CONSTANCIA DE APROBACIÓN DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
Yo, Iván Luis Tapia, tutor designado por el Director de Carrera de Química de Alimentos
para la revisión de Proyecto de Tesis “Evaluación del efecto del estado de madurez
sobre el perfil de compuestos funcionales en cuatro cultivares de mora (Rubus sp.)”,
preparado por la señorita Cabrera Araujo Ana Cristina con cédula de identidad
1716898935, alumna de la carrera de Química de alimentos, Facultad de Ciencias
Químicas de la Universidad Central del Ecuador, CERTIFICO que dicho proyecto de
investigación cumple con todos los requisitos establecidos y ha sido APROBADO para
su ejecución.
Quito, 07 de enero de 2019
MSc. Iván Luis Tapia
TUTOR
C.I: 1708468358
iv
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
DIRECCIÓN CARRERA DE QUÍMICA DE
ALIMENTOS
CONSTANCIA DE APROBACIÓN DEL TRABAJO FINAL POR PARTE DEL
TRIBUNAL LECTOR-EVALUADOR
El tribunal constituido por: MSc Iván Tapia, Dra. Tamara Fukalova y Dr. Klever Parreño,
luego de revisar el trabajo de investigación cuyo tema es: “Evaluación del efecto del
estado de madurez sobre el perfil de compuestos funcionales en cuatro cultivares de
mora (Rubus sp.)”, previo a la obtención del título profesional de Químico de Alimentos
presentado por la estudiante Ana Cristina Cabrera Araujo, APRUEBA el trabajo
presentado.
Por la constancia de lo acentuado firman:
Dra. Tamara Fukalova
C.I. 1711908150
Dr. Klever Parreño
C.I. 0601619984
MSc. Iván Tapia
TUTOR
C.I. 1708468358
v
LUGAR DONDE SE REALIZÓ LA INVESTIGACIÓN
La presente investigación forma parte del Proyecto “Caracterización morfológica,
agronómica, molecular y agroindustrial de colecciones de trabajo de aguacate, tomate de
árbol, mora y durazno (cítricos en Portoviejo)”, que se encuentra alineado a los objetivos
del Plan Estratégico Institucional del Instituto Nacional de Investigaciones
Agropecuarias (INIAP). Las muestras se obtuvieron de una huerta del Programa de
Fruticultura ubicada en la Granja Experimental Tumbaco y los análisis correspondientes
se realizaron en el Laboratorio de Servicio de Análisis e Investigación en Alimentos y el
Área de Investigación y Desarrollo de Procesos y Productos en Alimentos del
Departamento de Nutrición y Calidad en la Estación Experimental Santa Catalina, del
INIAP.
La propiedad intelectual de los datos generados en este trabajo corresponde al
INIAP y a la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador.
vi
DEDICATORIA
“He peleado la buena batalla, he acabado la carrera, he guardado la fe”.
2 Timoteo 4:7-8
A Dios, mi mejor amigo y Padre Celestial
A mis padres David y Yolanda por su inagotable amor
vii
AGRADECIEMIENTOS
A Dios, por ser el dueño de mi vida, confianza, conocimientos y sabiduría, por no soltar
mi mano y guiarme en mis pasos de fe. Porque no sé a dónde voy, pero sé quién me
acompaña.
A mis padres, porque sacrificaron mucho por mí, me ayudaron a encontrar el equilibrio
entre el esfuerzo sin exceso y la tranquilidad sin descuido, protegieron mis valores y
fortalecieron mis debilidades. Los amo infinitamente.
A mis hermanas Paula y Elizabeth, porque no importa cuán diferente pueda ser nuestro
pensamiento mientras el amor que nos une sea el mismo, gracias porque me han
acompañado en mis momentos más alegres y más estresantes, juntas hemos pasado por
mucho, valoro cada momento a su lado.
A mi abuelita Bertita, quien con su sabiduría supo guiarme con cariño hasta el final. A
mi sobrino Jorgito, mi pequeño angelito, cuya sonrisa y compañía iluminó cada uno de
mis días en todo este proceso.
A mi tutor, lectores y docentes de la carrera, quiénes no solo transmitieron sus
conocimientos para mi formación profesional, sino también sus valores para mi
formación personal, gracias por sus enseñanzas, tiempo y experiencias, son parte de este
logro y de mi vida.
A la Estación Experimental Santa Catalina del INIAP, por darme el espacio para poder
realizar mi trabajo de investigación. Gracias a mi cotutor, el Dr. Iván Samaniego y a la Ing.
Beatriz Brito por encontrar la mejor manera de transmitirme sus conocimientos y guiarme
con paciencia en el desarrollo teórico y experimental, de igual forma agradezco a todas las
personas humildes y de gran corazón que tuve la bendición de conocer.
A Tissa Kannangara, Investigador Biólogo de Canadá, por su apoyo como un colaborador
externo de la investigación, cuyo aporte fue financiado por la institución CESO
(Canadian Executive Service Organization). Agradezco su amistad y la oportunidad de
compartir mis conocimientos y recibir sus enseñanzas a través del trabajo en equipo.
A mis amigas Alexa y Aleja, quiénes me brindaron una amistad llena de buenos momentos
caracterizados por su buen humor, son las protagonistas de muchos recuerdos alegres en mi
memoria. A mis amigas Tani, Moni y July, hermosas personas que Dios puso en mi camino
para enseñarme el valor de la amistad, cada una con talentos y habilidades diferentes han
llenado mi corazón de hermosos momentos de reflexión y diversión.
A mi mejor amiga Dianita, con quién construí una amistad de bendición a través de nuestra
fe en Dios, hemos hecho todo juntas hasta el final, es una persona en quien confío y agradezco
por ser parte no solo de este momento sino también de otros recuerdos.
viii
ÍNDICE DE CONTENIDO
INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 1
CAPÍTULO 1 ................................................................................................................... 2
1. EL PROBLEMA .......................................................................................................... 2
Planteamiento del Problema ............................................................................... 2
Formulación del Problema ................................................................................. 3
Preguntas de Investigación ................................................................................. 3
Objetivos de Investigación ................................................................................. 3
Justificación e Importancia de la Investigación ................................................. 4
CAPÍTULO II ................................................................................................................... 5
2. Marco teórico o de referencia ...................................................................................... 5
Antecedentes ...................................................................................................... 5
Fundamento teórico-científico ........................................................................... 6
Marco Legal ..................................................................................................... 20
Hipótesis ........................................................................................................... 21
Sistema de Variables ........................................................................................ 21
CAPÍTULO III ............................................................................................................... 23
3. METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN ......................................................... 23
Diseño de la Investigación ............................................................................... 23
Población y Muestra ......................................................................................... 24
Materiales y Métodos ....................................................................................... 25
Diseño experimental ......................................................................................... 33
Operacionalización de variables ....................................................................... 34
Técnicas e instrumentos de recolección de datos (IRD) .................................. 34
Técnicas de Procesamiento y Análisis de Datos .............................................. 39
CAPÍTULO IV ............................................................................................................... 41
4. RESULTADOS Y DISCUSIONES .......................................................................... 41
Fase I: Adaptación de las metodologías de análisis. ........................................ 41
Fase II: Evaluación de las propiedades físico-químicas y funcionales de los
cuatro cultivares de mora en tres estados de madurez .................................................... 56
CAPÍTULO V ................................................................................................................ 73
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ........................................................ 73
Conclusiones .................................................................................................... 73
Recomendaciones ............................................................................................. 75
BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 76
ANEXOS ........................................................................................................................ 80
ix
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 2-1: Clasificación taxonómica de la mora de Castilla según Romoleroux (1996) 8 Tabla 3-1. Curva de calibración para polifenoles totales .............................................. 29
Tabla 3-2: Curva de calibración para Flavonoides ........................................................ 30 Tabla 3-3: Curva de calibración para el método ABTS ................................................ 31 Tabla 3-4: Esquema del análisis de varianza (ANOVA) .............................................. 33 Tabla 3-5: Proceso de operacionalización de variable .................................................. 34 Tabla 3-6: Formato de evaluación de la linealidad para cada método .......................... 35
Tabla 3-7: Formato de evaluación de Exactitud para cada método .............................. 36 Tabla 3-8: Formato de evaluación del ensayo de Precisión para cada método ............. 36 Tabla 3-9: Factores en estudio para la caracterización físico-química de los cuatro
cultivares de mora en tres estados de madurez ............................................................... 38 Tabla 3-10: Factores en estudio para la evaluación de compuestos funcionales y
capacidad antioxidante de los cuatro cultivares de mora en tres estados de madurez ... 38
Tabla 3-11.Tratamientos obtenidos para evaluar el efecto del estado de madurez sobre
el perfil de compuestos funcionales en cuatro cultivares de mora (Rubus sp.) .............. 39 Tabla 4-1. Resultados promedio de la señal instrumental y la concentración medida para
el método de polifenoles totales ..................................................................................... 41 Tabla 4-2. Resultados del análisis de regresión lineal para la curva de calibración del
contenido de polifenoles totales ..................................................................................... 42 Tabla 4-3. Resultados del ensayo de repetibilidad del método de análisis para polifenoles
totales en mora ................................................................................................................ 44 Tabla 4-4. Resultados promedio de la señal instrumental y la concentración medida para
el método de flavonoides totales .................................................................................... 45
Tabla 4-5. Resultados del análisis de regresión lineal para la curva de calibración del
contenido de flavonoides totales .................................................................................... 46
Tabla 4-6. Resultados del ensayo de repetibilidad del método de análisis para
flavonoides totales en mora ............................................................................................ 47
Tabla 4-7. Resultados promedio de la señal instrumental y la concentración medida para
el método ABTS ............................................................................................................. 48 Tabla 4-8. Resultados del análisis de regresión lineal para la curva de calibración de la
capacidad antioxidante mediante ABTS ........................................................................ 49
Tabla 4-9. Resultados del ensayo de repetibilidad del método de análisis para capacidad
antioxidante (método ABTS) en mora ........................................................................... 51 Tabla 4-10. Resultados promedio de la señal instrumental y la concentración medida
para el método FRAP ..................................................................................................... 52 Tabla 4-11. Resultados del análisis de regresión lineal para la curva de calibración de la
capacidad antioxidante mediante FRAP ......................................................................... 53 Tabla 4-12. Resultados del ensayo de repetibilidad del método de análisis para capacidad
antioxidante (método FRAP) en mora ............................................................................ 54 Tabla 4-13. Resultados del ensayo de repetibilidad del método de análisis para
antocianinas totales en mora ........................................................................................... 56 Tabla 4-14. Caracterización química de los cuatro cultivares de mora (Rubus sp.) ...... 57 Tabla 4-15. Caracterización del color de los cuatro cultivares de mora (Rubus sp.) .... 60
Tabla 4-16. Compuestos funcionales en cuatro cultivares de mora (Rubus sp.) ........... 62 Tabla 4-17. Capacidad antioxidante y vitamina C de los cuatro cultivares de mora (Rubus
sp.) por estado de madurez ............................................................................................. 67
x
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 2-1: Flor de la mora de castilla ............................................................................ 7
Figura 2-2: Mora (Rubus glaucus Benth)........................................................................ 7
Figura 2-3: Estados de madurez de la mora de Castilla ................................................ 12
Figura 2-4: Estados de madurez de la mora Brazos ...................................................... 12
Figura 2-5: Requisitos físico-químicos de la INIAP Andimora 2013........................... 13
Figura 2-6: Tabla de color de la mora de Castilla ......................................................... 13
Figura 2-6:Estructura química básica de un flavonoide ................................................ 16
Figura 2-7:Estructura de los ácidos hidroxibenzóicos .................................................. 18
Figura 3-1: Proceso de secado de las muestras por liofilización. ................................. 28
Figura 3-2: Representación de la curva original de Horwitz Horn. .............................. 37
Figura 4-1: Curva de calibración promedio para la cuantificación del contenido de
polifenoles totales en mora ............................................................................................. 42
Figura 4-2: Porcentaje de extracción de polifenoles por ciclo de extracción en mora . 43
Figura 4-3: Curva de calibración promedio para la cuantificación de los flavonoides
totales en mora ................................................................................................................ 45
Figura 4-4: Porcentaje de extracción de flavonoides totales por ciclo de extracción, en
mora ................................................................................................................................ 47
Figura 4-5: Curva de calibración promedio para la cuantificación de la capacidad
antioxidante (método ABTS) en mora ........................................................................... 49
Figura 4-6: Porcentaje de extracción de la capacidad antioxidante (método ABTS) por
ciclo de extracción, en mora ........................................................................................... 50
Figura 4-7: Curva de calibración promedio para la cuantificación de la capacidad
antioxidante (método FRAP), en mora ........................................................................... 52
Figura 4-8: Porcentaje de extracción de la capacidad antioxidante (método FRAP) por
ciclo de extracción, en mora ........................................................................................... 54
Figura 4-9: Porcentaje de extracción de antocianinas totales por ciclo de extracción, en
mora ................................................................................................................................ 55
Figura 4-10: Relación entre el estado de madurez subjetivo y el índice de madurez
calculado, en cuatro cultivares de mora ......................................................................... 59
Figura 4-11: Representación 3D del color de cuatro cultivares de mora en tres estados
de madurez...................................................................................................................... 60
Figura 4-12: Evolución del contenido de polifenoles totales en función del estado de
madurez en mora ............................................................................................................ 62
Figura 4-13: Evolución del contenido de flavonoides totales en función del estado de
madurez en mora ............................................................................................................ 64
Figura 4-14: Evolución del contenido de antocianinas totales en función del estado de
madurez en mora ............................................................................................................ 65
Figura 4-15: Evolución de la capacidad antioxidante (ensayo ABTS) en función del
estado de madurez en mora ............................................................................................ 68
Figura 4-16: Evolución de la capacidad antioxidante (ensayo FRAP) en función del
estado de madurez en mora. ........................................................................................... 69
Figura 4-17: Evolución de Vitamina C en función del estado de madurez en mora .... 71
xi
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo 1: Árbol de Problemas ........................................................................................ 80
Anexo 2: Caracterización de variables ........................................................................... 80
Anexo 3: Análisis de varianza del contenido de sólidos solubles en cuatro cultivares de
mora (Rubus sp.) en tres estados de madurez ................................................................. 82
Anexo 4: Análisis de varianza de la acidez titulable en cuatro cultivares de mora (Rubus
sp.) en tres estados de madurez ...................................................................................... 82
Anexo 5: Prueba de significancia de Tukey para el contenido de sólidos solubles en
cuatro cultivares de mora (Rubus sp.) en tres estados de madurez ................................ 82
Anexo 6: Prueba de significancia de Tukey para la acidez titulable en cuatro cultivares
de mora (Rubus sp.) en tres estados de madurez ............................................................ 83
Anexo 7: Coordenadas cromáticas empleadas en el método CIE L*a*b* .................... 83
Anexo 8: Análisis de varianza de polifenoles totales en cuatro cultivares de mora (Rubus
sp.) en tres estados de madurez ...................................................................................... 84
Anexo 9: Prueba de significancia de Tukey para el contenido de polifenoles totales en
cuatro cultivares de mora (Rubus sp.) en tres estados de madurez ................................ 84
Anexo 10: Análisis de varianza de flavonoides totales en cuatro cultivares de mora
(Rubus sp.) en tres estados de madurez .......................................................................... 84
Anexo 11: Prueba de significancia de Tukey para el contenido de flavonoides totales en
cuatro cultivares de mora (Rubus sp.) en tres estados de madurez ................................ 85
Anexo 12: Análisis de varianza de antocianinas totales en cuatro cultivares de mora
(Rubus sp.) en tres estados de madurez. ......................................................................... 85
Anexo 13: Prueba de significancia de Tukey para el contenido de antocianinas totales en
cuatro cultivares de mora (Rubus sp.) en tres estados de madurez ................................ 86
Anexo 14: Análisis de varianza de la capacidad antioxidante (método ABTS) en cuatro
cultivares de mora (Rubus sp.) en tres estados de madurez ........................................... 86
Anexo 15: Prueba de significancia de Tukey para la capacidad antioxidante (método
ABTS) en cuatro cultivares de mora (Rubus sp.) en tres estados de madurez ............... 87
Anexo 16: Análisis de varianza de la capacidad antioxidante (método FRAP) en cuatro
cultivares de mora (Rubus sp.) en tres estados de madurez ........................................... 87
Anexo 17: Prueba de significancia de Tukey para la capacidad antioxidante (método
ABTS) en cuatro cultivares de mora (Rubus sp.) en tres estados de madurez ............... 88
Anexo 18: Análisis de varianza de la concentración de Vitamina C en cuatro cultivares
de mora (Rubus sp.) en tres estados de madurez ............................................................ 88
Anexo 19: Prueba de significancia de Tukey para la concentración de Vitamina C en
cuatro cultivares de mora (Rubus sp.) en tres estados de madurez ................................ 89
Anexo 20: Fotografías de los cultivares de mora (Rubus sp.) ....................................... 90
Anexo 21: Caracterización química de la mora (Rubus sp.) .......................................... 91
Anexo 22: Proceso de extracción de las muestras ......................................................... 93
Anexo 23: Reacción colorimétrica obtenida en la metodología para compuestos
funcionales y la capacidad antioxidante. ........................................................................ 94
Anexo 24: Evaluación de antocianinas .......................................................................... 95
Anexo 25: Evaluación de vitamina C ............................................................................ 96
xii
Anexo 26: Validación de los instrumentos de recolección de datos para el análisis físico-
químico ........................................................................................................................... 97
Anexo 27: Validación de los instrumentos de recolección de datos para el análisis de
compuestos funcionales .................................................................................................. 98
Anexo 28: Informe de resultados obtenidos en el Laboratorio LSAIA del INIAP ........ 99
xiii
“Evaluación del efecto del estado de madurez sobre el perfil de compuestos
funcionales en cuatro cultivares de mora (Rubus sp.)”
Autora: Srta. Ana Cristina Cabrera Araujo
Tutores: Dr. Iván Luis Tapia Calvopiña. Msc.
Cotutor: Dr. Iván Rodrigo Samaniego Maigua. Msc.
RESUMEN
En el presente trabajo de investigación, se evaluó el contenido total de
polifenoles, flavonoides, antocianinas, vitamina C y la capacidad antioxidante (método
ABTS y FRAP) en mora de Castilla (Rubus glaucus Benth), mora Colombiana (Rubus
glaucus Benth), INIAP Andimora (Rubus glaucus Benth) y mora tipo Brazos (Rubus
lanciniatus) en diferentes estados de madurez; procedentes de diversas plantas
localizadas en la Granja Experimental de Tumbaco del INIAP. Se correlacionó el estado
de madurez, definido por el porcentaje de viraje del color de cubrimiento de la fruta, con
el índice de madurez, calculado a partir del contenido de sólidos solubles y acidez en la
pulpa fresca, con el fin de establecer una medida cuantitativa del estado de madurez de
cosecha. En la pulpa liofilizada, se midió el color de las muestras mediante el método
colorimétrico CIELab; se cuantificó los compuestos funcionales y la capacidad
antioxidante por espectrofotometría UV/VIS, posterior a la adaptación de las
metodologías. Los cuatro cultivares de mora demostraron un mayor contenido de
compuestos funcionales y capacidad antioxidante en el estado de madurez E1 (25%),
destacándose la mora Colombiana con 81,10 ± 4,44 mg ác. gálico.g-1 para polifenoles,
19,15 ± 0,77 mg (+)-catequina.g-1 para flavonoides y 158,49 ± 2,11 mg ác
ascórbico.100g-1 para vitamina C; seguida de la INIAP Andimora con 76,43 ± 3,98 mg
ác.gálico.g-1, 14,20 ± 0,79 mg(+)-catequina.g-1 y 147,10 ± 1,77 mg ác ascórbico.100g-1.
Los cultivares que predominan por su elevada capacidad antioxidante son la mora
Colombiana con 1278,63 ± 141,14 y 1284,55 ± 62,79 µmol trolox.g-1 para ABTS y
FRAP, seguida de la INIAP Andimora con 929,30 ± 40,95 y 1124,22 ± 60,33 µmol
trolox.g-1 para ABTS y FRAP. El contenido total de antocianinas durante la maduración
aumenta en el estado E3 (100 %) para los frutos de cada cultivar de mora, alcanzando una
mayor concentración en la mora Colombiana y Castilla con 1226,44 ± 53,05 y 1089,70
± 104,23 mg cianidina-3-glucósido.100g-1, respectivamente. Se determinó que existe
relación entre el estado de madurez y el contenido de compuestos funcionales en los
frutos de cuatro cultivares de mora.
PALABRAS CLAVES: CULTIVARES / ESTADO DE MADUREZ / COMPUESTOS
FUNCIONALES / CAPACIDAD ANTIOXIDANTE.
xiv
“Evaluation of the effect of the ripening state on the profile of functional
compounds in four blackberry cultivars (Rubus sp.)”
Autora: Srta. Ana Cristina Cabrera Araujo
Tutores: Dr. Iván Luis Tapia Calvopiña. Msc.
Cotutor: Dr. Iván Rodrigo Samaniego Maigua. Msc.
ABSTRACT
In the present research work, the total content of polyphenols, flavonoids,
anthocyanins, vitamin C and antioxidant capacity was evaluated. The antioxidant activity
was measure by two methods (ABTS and FRAP), in Castilla’s blackberry (Rubus glaucus
Benth), Colombian’s blackberry (Rubus glaucus Benth), INIAP Andimora (Rubus
glaucus Benth) and Brazos (Rubus lanciniatus) in different states of maturity; from
various plants located in the Experimental farm of Tumbaco of INIAP. To ensure that
the samples were harvested under the required conditions, the state of maturity, defined
by the percentage of the coating color of the fruit, was correlated with the maturity index,
calculated from the content of soluble solids and acidity in the fresh pulp, in order to
establish a quantitative measure for the state of maturity. In the lyophilized pulp, the color
of the samples was measured by the CIELab colorimetric method. The functional
compounds and the antioxidant capacity were quantified by UV/VIS spectrophotometry,
after the adaptation of the methodologies. The four blackberry cultivars showed a higher
content of functional compounds and antioxidant capacity in the state of maturity E1 (25
%). The Colombian blackberry stand out with 81,10 ± 4,44 mg gallic acid.g-1 for
polyphenols, 19.15 ± 0.77 mg (+) - catechin.g-1 for flavonoids and 158.49 ± 2.11 mg
ascorbic acid.100g-1 for vitamin C; followed by INIAP Andimora with 76,43 ± 3,98 mg
gallic acid.g-1, 14,20 ± 0,79 mg (+)-catequina.g-1 y 147,10 ± 1,77 mg ác ascórbico.100g-
1. The cultivars that predominate for their high antioxidant capacity are the Colombian
blackberry with 1278.63 ± 141.14 and 1284.55 ± 62.79 μmol trolox.g-1 for ABTS and
FRAP, followed by the INIAP Andimora with 929,30 ± 40,95 y 1124,22 ± 60,33 µmol
trolox.g-1 for ABTS and FRAP. The total content of anthocyanins during ripening
increases in the E3 state (100%) for each blackberry cultivar, reaching a greater
concentration in the Colombian and Castilla blackberry with 1226.44 ± 53.05 and
1089.70 ± 104.23 mg cyanidin-3-glucoside.100g-1, respectively. It was determined that
there is a relationship between the state of maturity and the content of functional
compounds in the fruits of four blackberry cultivars.
KEY WORDS: CULTIVARS / MATURITY STATE / FUNCTIONAL COMPOUNDS
/ ANTIOXIDANT CAPACITY.
1
INTRODUCCIÓN
En el presente trabajo investigativo se evaluaron las características físico-
químicas, propiedades funcionales y la capacidad antioxidante atribuida a los frutos de
cuatro cultivares de mora, cosechados en tres estados de madurez; siguiendo las
especificaciones cualitativas detalladas en la Norma NTE INEN 2427:2016 y la fenología
de la mora de Castilla descrita en la Norma NTC 4106:1997. La intervención del hombre
en conjunto con la intervención de la naturaleza, han dado lugar al desarrollo de un gran
número de especies del género Rubus, cuya variabilidad genética converge en cultivares
e híbridos con características individuales (Viteri et al., 2016).
A partir del banco de mora que mantiene el INIAP, se identificó que el Ecuador
cultiva principalmente la mora de Castilla. Las especies del género Rubus glaucus con
variabilidad genética es escasa en el país, dentro de las especificaciones se incluyen dos
grupos de mora de Castilla, el primero representado por la mora tradicional con espinas
y el segundo grupo por la INIAP-Andimora 2013, cultivar mejorado sin espinas (Brito et
al., 2016). Por su parte, el cultivar Brazos da un fruto menos ácido originario de Texas y
la mora Colombiana representa otro cultivar con variabilidad genética obtenida de la
mora de Castilla (Rubus glaucus Benth) (Brito et al., 2016).
En el Capítulo I se planteó la problemática de la presente investigación, partiendo
de una previa recopilación de datos bibliográficos, se abordó el escaso conocimiento de
los compuestos funcionales predominantes en la mora en sus estados de madurez, donde
se incluyó el planteamiento, formulación, objetivos y justificación del problema.
En el Capítulo II se detalló el marco teórico, en donde se recopiló información de
referencia como fundamento guía para sustentar la investigación, en antecedentes se
incluyeron los artículos científicos y estudios que contribuyeron en el contenido y análisis
de resultados. La hipótesis y conceptualización de variables formaron parte del
fundamento teórico.
En el Capítulo III se planteó el diseño experimental del proyecto, en función de
un paradigma y nivel de investigación; a su vez, se hace mención sobre el material,
equipos, procedimientos, tipo de muestreo, instrumentos de recopilación de datos,
operacionalización de variables y el análisis estadístico adecuado para comprobar las
hipótesis previamente planteadas.
Por último, en el Capítulo IV se hizo referencia a los resultados y discusión de
datos obtenidos a partir de métodos estandarizados y previamente verificados mediante
la adaptación de las metodologías, en función de la linealidad, exactitud y precisión de
los análisis cuantitativos respectivos.
2
CAPÍTULO 1
1. EL PROBLEMA
Planteamiento del problema
El planteamiento del problema central se presenta en el Anexo 1.
El estilo de vida de las personas las lleva a adoptar hábitos alimenticios
relacionados con el tiempo que disponen para meditar conscientemente sobre la comida
que eligen. El auge y la crisis financiera someten a las personas a un estrés diario de
magnitud tal que su tiempo se encuentra a disposición de sus actividades laborales,
generando así problemas de salud relacionadas no solo con la comida rápida de mayor
accesibilidad sino también con el estrés. Es posible que las enfermedades
neurodegenerativas sean las más estudiadas en el contexto del estrés oxidativo (Coronado
H, Vega, Gutiérrez T, Vázquez F y Radilla V, 2015).
Desde un enfoque nutricional, el conocimiento sobre alimentos ricos en
antioxidantes ofrece una alternativa saludable al consumo de alimentos procesados de
fácil accesibilidad. Como consecuencia, se han realizado varios estudios vinculados con
la caracterización funcional en alimentos naturales y de consumo inmediato, entre ellos
se encuentran las frutas andinas cuyo perfil de compuestos funcionales forma parte de
diversas investigaciones. La mora, en especial la de Castilla (Rubus glaucus Benth), es
una fruta andina evaluada con potencial innovador en el mercado comercial, debido a
que los pigmentos naturales presentes contienen una capacidad antioxidante lo
suficientemente elevada como para inhibir sustancias reactivas de oxígeno (ERO) o
radicales libres (Santacruz, 2011). Países como Colombia han desarrollado estudios
sobre la evaluación de las propiedades antioxidantes y el perfil aromático durante la
maduración de la mora (Rubus glaucus Benth) y arándano (Vaccinium meridionale
Swart); Bernal, Melo y Díaz Moreno (2014) determinaron que estos frutos rojos son
fuentes naturales de antioxidantes, con un predominante grupo de ácidos fenólicos y
flavonoides, compuestos responsables del color característico.
A nivel nacional, el Ministerio de Salud Pública y el Instituto Nacional de
Estadística y Censo (INEC), evaluaron la prevalencia del consumo de alimentos
procesados (gaseosas y otras bebidas, comida rápida y snacks) en grupos poblacionales
de 10 a 19 años de edad; a través de la Encuesta Nacional de Salud y Nutrición
(ENSANUT), determinando un alto porcentaje de consumo, especialmente de bebidas
gaseosas (INEC, 2013).
En el país se han realizado investigaciones en provincias como Tungurahua con
respecto a la funcionalidad de cultivos vegetales desarrollados y mejorados por el INIAP,
con el fin de ofrecer información completa de variedades y cultivares con potencial
investigativo a nivel científico, industrial y de consumo (Llerena, Samaniego, Ramos y
3
Brito, 2014). El estudio mencionado involucró seis genotipos de frutas andinas y
tropicales, en donde se incluye la variedad sin espinas de mora de Castilla (Rubus glaucus
Benth) conocida como INIAP Andimora 2013, cosechadas en su estado de madurez
comestible; los resultados incluyen el contenido de polifenoles totales, carotenoides,
antocianinas y vitamina C.
Formulación del problema
¿La concentración de compuestos funcionales en los frutos de mora (Rubus sp.)
depende del tipo de cultivar y de su estado de madurez en la cosecha?
Preguntas de investigación
- ¿El color de cubrimiento de los frutos de los cultivares de mora tiene una relación
directa con los estados de madurez?
- ¿Cómo se evaluará la capacidad antioxidante y los compuestos funcionales?
- ¿Cuáles son las condiciones analíticas e instrumentales óptimas para el desarrollo
de la validación de los métodos en mora (Rubus sp.)?
- ¿Qué concentración de compuestos funcionales se encuentra en los frutos de
diferentes cultivares de mora (Rubus sp.)?
- ¿Qué relación existe entre el estado de madurez de cada tipo de cultivar y su
capacidad antioxidante?
Objetivos de investigación
Objetivo general.
Evaluar el efecto del estado de madurez sobre el perfil de compuestos funcionales
en cuatro cultivares de mora (Rubus sp.).
Objetivos específicos.
- Evaluar los parámetros del color, sólidos solubles y acidez titulable de la pulpa
de los frutos de cuatro cultivares de mora, cosechados en tres estados de madurez
25, 50 y 100 % de viraje de color de cubrimiento.
- Adaptar los métodos de análisis para la determinación de capacidad antioxidante
y compuestos funcionales (polifenoles, flavonoides, antocianinas) en mora.
- Cuantificar el contenido total de polifenoles, flavonoides, antocianinas, vitamina
C y capacidad antioxidante, en la pulpa liofilizada de los frutos de cuatro
cultivares de mora cosechados en tres estados de madurez.
- Establecer los cambios durante la maduración de la fruta de mora, en los
parámetros del color, capacidad antioxidante y contenido de compuestos
funcionales.
4
Justificación e importancia de la investigación
El presente proyecto tiene una connotación estrictamente investigativa, basada en
dar seguimiento a los cultivos mejorados por el INIAP, en donde se incluye
comparaciones entre cultivares, con el fin de visualizar si las modificaciones buscadas
lograron potencializar, mantener, disminuir o eliminar una característica esencial como
la resistencia a enfermedades, cambios morfológicos, fisicoquímicos, agronómicos o
moleculares del cultivar vegetal en estudio.
No obstante, todo trabajo investigativo se enfoca en lograr el bienestar humano,
satisfaciendo las necesidades y favoreciendo la salud. En la actualidad, diferentes
enfermedades han predominado y se han hecho más evidentes no solo a nivel nacional
sino a nivel mundial. Factores económicos, sociales y psicológicos han generado malos
hábitos alimenticios, el consumo de alcohol y tabaco son elementos cruciales en el
deterioro celular causado por la presencia creciente de especies reactivas de oxígeno
(EROS), en donde se incluyen los radicales libres.
La mora (Rubus sp.) aporta un elevado valor nutricional atribuido al contenido de
vitaminas, en especial la vitamina C, y minerales, lo que significa que su consumo
contribuye a la disminución del estrés oxidativo debido a su capacidad antioxidante. La
actividad antioxidante en el cuerpo humano engloba distintos órganos y mecanismos de
acción. La identificación de estos compuestos bioactivos en una fruta de alto consumo
nacional implica un aporte a la solución a un problema social como es el estrés habitual
al que está sujeta la población, mediante la utilización de recursos naturales propios del
país. Cabe recalcar que, el estudio adquiere profundidad debido a que la evaluación de la
concentración de los compuestos funcionales se relaciona con los frutos de distintos
cultivares de mora cosechados en diferentes estados de madurez.
La realización de la presente investigación se justifica también por la introducción
de oportunidades comerciales. El estado de madurez de la fruta que demuestre un mayor
contenido de compuestos funcionales y capacidad antioxidante determina el momento
óptimo de cosecha de los frutos de mora en función de su participación en el mercado.
Dependiendo de la concentración de los compuestos funcionales, se utilizaría la mora
madura para la comercialización de alimentos frescos de consumo inmediato y la mora
no madura en el desarrollo de nuevos productos. Por lo expuesto, el presente estudio se
basa en evaluar el efecto del estado de madurez sobre el perfil de compuestos funcionales
en los frutos de cuatro cultivares comerciales de mora (Rubus sp.).
5
CAPÍTULO II
2. MARCO TEÓRICO O DE REFERENCIA
Antecedentes
La factibilidad del proyecto de investigación se evalúa mediante diferentes
informes o artículos similares, cuyos análisis generan una base de guía en la evaluación
y comparación de resultados, debido a que sugiere información relevante que sustenta
este estudio.
La recopilación de información ha permitido encontrar diversas publicaciones
sobre la extracción, identificación y cuantificación de la concentración de compuestos
funcionales de la mora y su capacidad antioxidante atribuida al contenido de polifenoles;
no obstante, en la actualidad no se han reportado en el país estudios comparativos entre
los frutos de cuatro cultivares como son: la mora de Castilla (Rubus glaucus Benth), mora
Colombiana (Rubus glaucus Benth), variedad INIAP Andimora 2013 (Rubus glaucus
Benth) y la mora tipo Brazos (Rubus lanciniatus) acerca del contenido de componentes
bioactivos relacionados con el estado de madurez de la fruta.
A continuación, se citan algunos trabajos investigativos.
Wang, L.S., Stoner (2008), proponen un estudio referente a las actividades de las
antocianinas presentes en las bayas para prevenir enfermedades neurodegenerativas
(Alzheimer y Parkinson) y el cáncer. Destacan recientes estudios in vitro y sistemas de
tumores en animales basados en modelos in vivo, con posteriores estudios
epidemiológicos o de investigación. En los estudios in vitro se recalca que la estructura
fenólica de las antocianinas es la responsable de su actividad antioxidante. Dicho efecto
se ha evidenciado en los sistemas de cultivo de células de órganos como el colon, hígado
y células leucéicas. en estos sistemas de ensayo se demostró que las antocianinas han
generado diversos efectos antitóxicos y anticancerígenos; por la captación directa de las
especies reactivas de oxígeno (ROS) y reducción de compuestos oxidativos en el ADN.
Bernal, Melo y Díaz Moreno (2014), afirman que es un hecho que el contenido
fenólico de bayas, como la mora, se ve afectado por diferencias genéticas, condiciones
de pre y poscosecha, grado de madurez y contenido de sólidos solubles de la fruta, en su
estudio sobre la “Evaluación de las Propiedades Antioxidantes y el Perfil Aromático
Durante la Maduración de Mora (Rubus glaucus Benth) y Arándano (Vaccinium
meridionale Swartz)”, los resultados demostraron que conforme aumenta la maduración
de los frutos se incrementa la humedad y disminuye la acidez, a su vez, mediante el
método FRAP concluyeron que la mora presentó una menor capacidad antioxidante en
su estado de madurez de consumo o comercial, en comparación con el estado de madurez
que representa un fruto de color verde o inmaduro.
6
Con fines comparativos se revisó un proyecto de investigación con similares
requerimientos de análisis, en el cual se realiza un seguimiento de las propiedades físicas
y químicas de dos variedades de mora en cuatro estados de madurez. El estudio de
involucra el análisis de la composición funcional y capacidad antioxidante de la mora de
Castilla (Rubus glaucus Benth) y de la mora variedad Brazos (Rubus sp.) (Farinango,
2010).
También se han realizado investigaciones sobre la calidad y funcionalidad de
materiales vegetales desarrollados y mejorados por el INIAP, en donde se incluye la
caracterización agronómica, molecular, físico-química y de calidad de una colección de
mora, con el fin de ofrecer información completa de variedades y cultivares que tienen
potencial investigativo a nivel científico, industrial y de consumo (Llerena et al., 2014).
Fundamento teórico
Definición de cultivar.
El artículo 10 del Código Internacional de Nomenclatura para Plantas Cultivadas
(CINPC) de la edición de 1980, incluye textos jurídicos sobre variedades vegetales y
semillas, especificando en el primer párrafo la definición del término internacional de
cultivar, el cual se refiere a: “un conjunto de plantas cultivadas que está claramente
distinguido por ciertos caracteres (morfológicos, fisiológicos, citológicos, químicos u
otros), y que, al reproducirse (sexuada o asexuadamente), conserva sus caracteres
distintivos” (UPOV, ASOVEC, JUNAC y PROCIANDINO, 1996).
Como argumentación a lo mencionado, el CINPC añade por primera vez el
término cultivar (abreviatura del término inglés: cultivated variety) en 1953, definiéndose
concretamente en la octava edición como: “el conjunto de plantas que (a) han sido
seleccionadas por un atributo particular o combinación de atributos, (b) es distinto,
uniforme y estable en estas características y (c) cuando se propaga por los medios
adecuados retiene aquellas características.” (Calaza Martínez y Iglesias Díaz, 2016).
Descripción botánica.
La mora es un fruto polidrupo debido a que está formada por varias drupas
acopladas en forma de racimo. El Morus y el Rubus son los dos géneros más comunes
que producen moras como fruto. El morus procede de árboles denominados moreras y
morales; en cambio las moras del género rubus provienen de plantas sarmentosas y
espinosas conocidas como zarza (Rubio, 2014). El tipo de mora que se estudia en esta
investigación es la que pertenece al género Rubus, familia de las Rosáceas.
Las flores de la mora (figura 2-1) logran crecer hasta un diámetro de 2 cm y son
se caracterizan por su color blanco, presentan un receptáculo seco, sin embargo, la mora
7
que no proviene del monte tiene el receptáculo mejor desarrollado. Los pistilos
representan el mesocarpio que es la parte carnosa y comestible de las drupas mientras
que el endocarpio determina las pepitas que contiene las semillas (Rubio, 2014).
Figura 2-1: Flor de la mora de Castilla
Fuente: (Rubio, 2014).
Las también denominadas zarzas pertenecen al orden Rosales, familia Rosaceae,
género Rubus, nombre científico Rubus glaucus. Se encuentran aproximadamente 400
especies agrupadas en 12 subgéneros, distribuidas por el mundo. El subgénero donde se
incluye la mora es el Eubatus. Cabe recalcar que en el Ecuador se encuentran reportadas
21 especies del género Rubus. El crecimiento y desarrollo de la mora cultivada en la
sierra ecuatoriana se da de forma silvestre, en alturas que oscilan entre 2500 y 3000
msnm, debido a que, alturas superiores provocan problemas de heladas y alturas
inferiores generan problemas sanitarios atribuidos a la mosca de la fruta y ácaros
(Galarza, Garcés, Velásquez, Sánchez y Zambrano, 2016).
Figura 2-2: Mora (Rubus glaucus Benth)
Fuente: Cabrera, Ana (2019)
8
Clasificación taxonómica.
Tabla 2-1: Clasificación taxonómica de la mora de Castilla según Romoleroux
(1996)
Adaptado por: Cabrera, Ana (2019)
Origen de la mora.
Estas frutas son nativas de Asia y Europa, crecen en terrenos húmedos y en
algunos casos se pueden encontrar a 1500 metros de altitud. Maduran durante los meses
de verano y otoño. Existen más de 300 especies de mora, aunque sólo nueve tienen valor
comercial (EROSKI CONSUMER, 2017). Según Rubio (2014), la mora fue descubierta
por el alemán Karl Hartweg y descrita por George Bentham. En Latinoamérica la mora
se encuentra principalmente en las zonas tropicales altas de Ecuador, Panamá, Colombia,
Guatemala, México, Honduras y El Salvador, principalmente (Rubio, 2014).
Producción de mora en el Ecuador.
El Ecuador es un país con una amplia diversidad de ecosistemas y grandes
recursos fitogenéticos que se aprovechan para generar sostenibilidad en la productividad
y seguridad alimentaria (Galarza et al., 2016). La actividad frutícola de los valles del
Ecuador cuenta con las condiciones climáticas adecuadas para promover el desarrollo de
diversas frutas andinas con grandes expectativas de comercio (Bustamante, 2012). El
9
cultivo de la mora (Rubus sp.) tiene lugar en los valles del callejón interandino y en sus
estribaciones, a su vez, las provincias de Tungurahua, Cotopaxi, Imbabura, Pichincha,
Chimborazo y Bolívar representan las principales zonas de producción de esta fruta
(Jácome et al., 2016).
La producción nacional de mora evaluada desde el 2001 hasta el 2005 determina
una tendencia decreciente del 60 % (Jácome et al., 2016). No obstante, debido a la
creciente demanda del cultivo, la baja producción de los años mencionados no
significaron una barrera comercial en los años posteriores (SINAGAP, 2010). Con
respecto al comercio internacional, a partir del año 2004 se evidencia un decrecimiento
de las exportaciones debido a los bajos rendimientos obtenidos en la producción nacional.
Sin embargo, a pesar del declive anual de las exportaciones tanto en costo como en
toneladas de exportación, se resalta un auge a partir del año 2008, siendo los principales
destinos de las exportaciones ecuatorianas de mora, países como Estados Unidos,
España, Alemania y Holanda (CICO-CORPEI, 2009).
Por su parte, la mora (Rubus sp.) es una de las frutas con una gran acogida tanto
en el mercado nacional como internacional, debido a sus colores llamativos, sabor y
aroma característico y un importante valor nutricional (CICO-CORPEI, 2009); de igual
forma, representan una fuente natural de antioxidantes con un alto contenido de ácidos
fenólicos y flavonoides (Bernal et al., 2014).
Cultivares de mora (Rubus sp.).
La mora de Castilla (Rubus glaucus Benth), INIAP Andimora (Rubus glaucus
Benth), mora Brazos (Rubus lanciniatus) y mora Colombiana (Rubus glaucus Benth)
constituyen los cuatro cultivares de mora comerciales.
Mora de castilla (Rubus glaucus Benth).
Según Rubio (2014), la mora de Castilla (Rubus glaucus), fue descubierta por
Hartw y descrita por Benth. El nombre científico desemboca de las palabras rubus (rubí)
por el color rojo de sus frutos en cierta etapa de desarrollo y glaucus (glauco) por el color
verde claro de sus tallos (Cabezas, 2008).
Rubus glaucus Benth o mora de Castilla, conocida también como mora andina o
zarzamora, están constituidas por un conjunto de drupas que le confieren una forma
cónica al fruto (Rubio, 2014). Su tamaño varía entre tres a cuatro centímetros de largo y
poseen un diámetro que oscila de uno a tres centímetros, cuando la fruta no completa su
maduración presenta un color púrpura o morado brillante con un sabor agridulce,
mientras que cuando está totalmente madura manifiesta un color morado o negro brillante
y un sabor dulce. Los frutos de la mora de castilla se forman en racimos grandes al final
de cada rama principal (Rubio, 2014).
10
Variedad INIAP-Andimora 2013 (Rubus glaucus Benth).
El cultivar de mora sin espinas denominada INIAP-Andimora-2013, proviene de
una mutación de semilla sexual de mora de Castilla con espinas, identificada en los
semilleros de los segregantes donde se buscaba ampliar la variabilidad genética, la misma
se identificó y seleccionó en Píllaro-San Miguelito, provincia de Tungurahua en el año
2007; las plantas sin espinas fueron multiplicadas y distribuidas en tres localidades de
esta provincia, en un rango de altitud de 2810 a 2950 m y temperatura promedio de 12°C
a 14° C, para observar la permanencia de la característica específica como es la ausencia
de espinas (Viteri et al., 2016).
En el año 2010, se evaluaron los parámetros físico-químicos y de la calidad
poscosecha de 14 accesiones seleccionadas de la colección de mora, en donde el cultivar
sin espinas MA0100, que posteriormente se denominó INIAP-Andimora-2013, presentó
atributos mejorados en sus frutos como: alto contenido de sólidos solubles y vitamina C
(Brito et al., 2016). Entre las características que presenta el cultivar mejorado por el
INIAP, se incluyen a una baya formada por 110 a 120 drupillas con sus semillas adentro,
representando el 10 % de su peso, la ventaja comparativa más importante se refiere a que
alcanza un 2,62 % de acidez y 12,60° Brix que corresponde a un alto contenido de sólidos
solubles. Adicionalmente, representa una interesante fuente nutricional en la dieta
humana, de acuerdo con los valores para polifenoles totales de 6,08 mg.g-1 en base fresca
y 57,25 µmol equivalente trolox.g-1 en base seca (Brito, Espín, Vásquez, Martínez y
Montalvo, 2013), (Espín y Brito, 2014).
Mora Brazos (Rubus lanciniatus).
Aunque se han introducido al país cultivares e híbridos comerciales provenientes
principalmente de Estados Unidos, como el cultivar Brazos, originario de Texas, material
rústico, bien adaptado, fruto grande, sus características no han tenido una gran acogida
comercial debido su bajo contenido de sólidos solubles; lo que significa que, dicho
cultivar no ha logrado superar en calidad a la mora de Castilla, en consecuencia, se
encuentran cultivados en pequeñas extensiones (Viteri et al., 2016).
La mora Brazos (Rubus lanciniatus), fue una especie investigada en la
universidad de Texas (Estados Unidos) en el año de 1959, año en que los genetistas
desarrollaron una especie diferente de mora en base al cruzamiento de híbridos de alta
calidad, los cuales fueron: la Rubus caesius (dewberry) o mora pajarera y la Rubus idaeus
(raspberry) o también llamada frambuesa (Rubio, 2014). La tonalidad oscura próxima al
negro representa la característica principal de la variedad Brazos; un problema del cultivo
de esta variedad es su dificultad para adaptarse a los diferentes climas. En el cantón Oña
de la provincia del Azuay del Ecuador se registra el mayor cultivo de esta especie (Rubio,
2014).
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La norma NTE INEN 2427, determina que la variedad Brazos es un híbrido que
se diferencia principalmente de la mora de Castilla porque las drupas son de mayor
tamaño, su coloración es más obscura y brillante cuando está completamente madura, el
fruto es más alargado y el sabor es menos ácido (INEN, 2016).
Mora Colombiana (Rubus glaucus Benth).
La mora colombiana proviene de una mutación natural de la mora de Castilla
(Rubus glaucus Benth) cultivada en Colombia, por lo tanto, este cultivar presenta similar
información relacionada con la descrita para la mora de Castilla.
La principal especie de mora cultivada en Colombia es la R. glaucus, también
conocida como mora de Castilla. Colombia presenta una elevada variabilidad de esta
especie en función de tamaño, color y calidad del fruto; lo que posiblemente se produjo
por un proceso de selección a partir de plantas silvestres, en épocas anteriores (Grijalba,
Calderón y Pérez, 2010).
Estado de madurez de la mora.
El cambio de color es la característica más evidente producida durante la
maduración de la fruta, relacionado principalmente con la degradación de la clorofila
(desaparición del color verde) y la síntesis de los pigmentos específicos de la especie
correspondiente. Por tal razón, se puede emplear el color como una base subjetiva para
la determinación del estado de madurez, utilizando escalas visuales que ilustren el
porcentaje de cubrimiento del color superficial del fruto, como se manifiesta en la Norma
Técnica Colombiana 4106 del ICONTEC (1997) o mediante mediciones objetivas a
partir de equipos de colorimetría (FAO, 2003).
Madurez: La Norma NTE INEN 1751:96 (INEN, 2012) para frutas frescas,
define a la madurez como el estado de la fruta que presenta las condiciones apropiadas
para su cosecha, comercialización y consumo en fresco. De igual manera define a la
madurez fisiológica como la etapa del desarrollo de la fruta en el que se ha producido el
máximo crecimiento, acumulación de azúcares y alto contenido de humedad; y la
madurez comercial es la etapa en que la fruta posee características requeridas por el
mercado.
Por su parte, la Norma NTE INEN 2427 (INEN, 2016), especifica solo los
requisitos de maduración para los cultivares de mora de Castilla (Rubus glaucus Benth)
y Brazos (Rubus lanciniatus); las dos variedades presentan una escala de color
proporcional a su estado de madurez, que se utiliza como una guía en el proceso de
cosecha, presentadas con su descripción en las figuras 2-3 y 2-4, respectivamente.
12
Figura 2-3: Estados de madurez de la mora de Castilla
Fuente: (INEN, 2016)
- Color 0: Fruto de color verde completo o con pocas drupas marrones por efecto
sobre exposición a la luz con drupas bien formadas
- Color 1: Fruto de color verde claro con algunas drupas de color rosado o rojo
- Color 2: Fruto de color rojo con algunas drupas de color amarillo
- Color 3: Fruto de color rojo intenso con algunas drupas de color morado
- Color 4: Fruto de color morado oscuro casi negro
Figura 2-4: Estados de madurez de la mora Brazos
Fuente: (INEN, 2016)
- Color 0. Fruto de color amarillo verdoso con sus drupas bien formadas
- Color 1. Fruto de color amarillo verdoso con algunas drupas de color rosado.
- Color 2. Fruto de color rosado.
- Color 3. Fruto de color rojo claro
- Color 4. Fruto de color rojo oscuro
- Color 5. Fruto de color intenso, con algunas drupas de color morado
- Color 6. Fruto de color morado oscuro
Brito et al. (2013), reportaron los requisitos físico-químicos de la variedad de
mora de Castilla (Rubus glaucus Benth) sin espinas, denominada INIAP Andimora 2013,
según lo presentado en la figura 2-5.
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Figura 2-5: Requisitos físico-químicos de la INIAP Andimora 2013.
Fuente: (Brito et al., 2013)
La Norma Técnica Colombiana NTC 4106:1997 del El Instituto Colombiano de
Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC), establece una tabla de colores donde se
detalla la fenología de los frutos de mora de Castilla en base al proceso de maduración.
Figura 2-6: Tabla de color de la mora de Castilla
Fuente: (ICONTEC, 1997)
Composición nutricional de la mora.
La composición nutricional de la mora contribuye con información importante
sobre los componentes mayoritarios presentes en la fruta, sin procesar. Según el reporte
del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, en inglés USDA, sobre la
composición nutricional de la mora, se deduce que presenta un 88,15 % de humedad, el
contenido de carbohidratos totales es superior a los demás nutrientes con 9,61 %. Entre
los componentes esenciales, de interés se encuentran las antocianidinas, cuyo compuesto
mayoritario es la cianidina con un 99,95 % de contenido en la fruta (USDA, 2016).
Esta fruta se caracteriza por tener pigmentos naturales que le confieren el color
morado y corresponden a la presencia de antocianos y provitamina A. Los responsables
del sabor astringente de la mora en los primeros estados de madurez, cuando las drupas
están verdes, son los taninos, sin embargo, los ácidos orgánicos como el oxálico y el
málico también aportan a su sabor característico (Rubio, 2014).
14
Alimentos funcionales.
Los alimentos funcionales son aquellos que contienen niveles altos de nutrientes
y/o compuestos biológicamente activos que ofrecen beneficios para la salud en una o más
funciones del organismo, más allá de la nutrición básica, de forma que resulte relevante
ya sea para mejorar el estado de salud y bienestar o para reducir el riesgo de enfermedades
(Fernández y Sánchez, 2016).
En la actualidad el consumo de la mora se promueve por ser una rica fuente de
polifenoles, compuestos con una interesante actividad antioxidante debido a su función
neuralizante de radicales, la razón recae en la presencia de un anillo aromático (fenil)
unido a elementos estructurales con grupos hidroxilos (OH) en su estructura. El anillo
aromático genera un efecto inductivo (transmisión de cargas) en el hidrógeno del grupo
hidroxilo de los ácidos débiles. Por ende, tanto el anillo fenólico como los radicales
hidroxilos desempeñan una función importante en las propiedades antioxidantes de los
polifenoles (Peñarrieta, Tejeda, Mollinedo, Vila y Bravo, 2014).
Estrés oxidativo.
El metabolismo celular aerobio es un proceso oxidativo que impulsa la generación
de radicales libres y especies reactivas de oxígeno (EROS) de forma natural. No obstante,
el sistema de defensa antioxidante permite mantener un equilibrio redox siempre y
cuando las condiciones ambientales, estilos de vida o patologías no desencadenen un
exceso de radicales libres que den lugar al estrés oxidativo. El desequilibrio entre
especies oxidantes y antioxidantes se debe tanto a la sobreproducción de ERO como al
déficit de antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos. Este desbalance se conoce como
estrés oxidativo, mecanismo al que se le atribuye la incidencia de enfermedades
carcinógenas, cardiovasculares, diabetes, hipertensión, neurodegenerativas como
Alzheimer y Parkinson, así como un envejecimiento prematuro (Barea Álvarez, 2015).
Capacidad antioxidante.
Según, Barea Álvarez (2015), los antioxidantes biológicos se definen como
aquellas moléculas que cuando están presentes en bajas concentraciones respecto a las
biomoléculas que protegen, pueden prevenir o reducir la destrucción oxidativa de estas
biomoléculas. Los sistemas de defensa antioxidantes que operan en el organismo pueden
tener un origen endógeno (enzimático y no enzimático) o provenir de fuentes externas
como en la dieta.
Compuestos bioactivos de la mora (Rubus sp.).
Los compuestos bioactivos son los responsables del efecto funcional de la mora
para promover la buena salud humana, mediante la reducción del riesgo de cáncer,
15
enfermedades cardiovasculares y otras patologías (Peñarrieta, Tejeda, Mollinedo, Vila y
Bravo, 2014).
Compuestos fenólicos totales.
Los ácidos fenólicos derivan del ácido cinámico e hidroxicinámico y aparecen
generalmente como ésteres, son los responsables de la astringencia de las frutas,
especialmente de las frutas verdes, su contenido disminuye durante la maduración
(Primo, 1998). Los compuestos fenólicos son los pigmentos responsables de dar
coloración a la planta, hojas y frutos, atrayendo las aves e insectos, lo cual permite la
dispersión y polinización de las semillas; a su vez, actúan como mecanismos de defensa
de las plantas frente a condiciones de estrés ambiental (Häkkinen, 2000).
Los pigmentos fenólicos están constituidos por uno o más anillos aromáticos y un
sustituyente hidroxilo, como mínimo. Incluyen dos grupos: los ácidos fenólicos
(benzoico y cinámicos) y los flavonoides (flavonoides, antocianinas y taninos), ambos
grupos se diferencian en que los ácidos fenólicos tienen un solo anillo, mientras que los
flavonoides poseen dos anillos fenólicos. Los pigmentos fenólicos reaccionan con ácidos
orgánicos o azúcares para formar los flavonoides y antocianinas (Badui Dergal, 2006).
El componente fenólico mayoritario en las bayas son los taninos hidrolizables
(gálicos y elagitaninos) y antocianinas, ácidos hidroxicinámicos, flavonoles y flavan-3-
3-oles (Espín y Brito, 2014).
Polifenoles.
Los polifenoles son metabolitos secundarios de las plantas, sintetizados a partir
de carbohidratos por el ciclo del ácido Shikímico, y acumulados en la planta a través de
procesos que son controlados internamente y regulados por factores exógenos como las
condiciones ambientales (temperatura y luz), son los responsables de la astringencia,
amargura, color y sabor de las frutas, además de la estabilidad oxidativa de sus productos
derivados (Giné Bordonaba y Terry, 2011). Los polifenoles están constituidos por más
de un anillo aromático por molécula, unido a uno o más grupos hidroxilos. (Collado
González, 2011).
Los polifenoles se clasifican en dos grupos: los flavonoideos (pigmentos
ópticamente activos) y no flavonoideos (derivados del ácido hidroxicinámico y del ácido
benzoico) (Barea Álvarez, 2015).
Flavonoides.
Según, Peñarrieta et al. (2014), el término flavonoide viene del latín "flavus", que
significa amarillo, pertenecen al grupo de los polifenoles y comprenden varias clases de
16
sustancias naturales, entre las cuales están muchas de las que confieren el color amarillo,
naranja, rojo, violeta y azul, a muchas flores, hojas y frutos (Collado González, 2011).
Cabe recalcar que, los flavonoides y los ácidos fenólicos tienen un efecto antioxidante,
anti-alergénico, anti-inflamatorio, anti-viral y anti-carcinogénico (Häkkinen, 2000).
Los flavonoides y antocianinas son pigmentos fenólicos no nitrogenados solubles
en agua, metanol y etanol, contienen un núcleo flavilo, el mismo que se une a un azúcar
mediante un enlace β-glucosídico. Algunos flavonoides son precursores en la biosíntesis
de antocianinas y según su polimerización pueden tener estructuras simples o complejas
(Badui Dergal, 2006).
La estructura química básica de los flavonoides (Figura 2-6) consta de tres anillos:
benzopirano 2-fenil, un anillo dihidroxilados fenólicos en las posiciones 5 y 7,
(representado con la letra A), un segundo anillo fenólico generalmente mono-
hidroxilado, orto-dihidroxilados o vic- trihidroxilados (B), que pueden igualmente
contener grupos metoxi (O-CH3) como sustituyentes y un anillo heterocíclico con
oxígeno pirano, pirylium o de forma pirona (C) (Peñarrieta et al., 2014).
Figura 2-7: Estructura química básica de un flavonoide
Fuente: (Peñarrieta et al., 2014)
Antocianinas.
Las antocianinas (del griego anthos, flor y kyanos, azul) son una subclase de los
flavonoides conocidas como flavonoides azules. Son pigmentos vegetales no
nitrogenados que confieren el color rojo, anaranjado, azul y púrpura de las uvas,
manzanas, rosas, fresas y otros productos de origen vegetal. Su núcleo flavilo o aglucón
consta de dos anillos bencénicos y uno heterocíclico con oxígeno (Badui Dergal, 2006).
Las antocianidinas (agliconas) son la estructura básica de las antocianinas.
Cuando el núcleo central flavilo de la antocianidina se une con un azúcar se forman las
antocianinas, forma glicosilada (Santacruz, 2011). Las antocianidinas principales son: la
cianidina, pelargonidina, peonidina, delfinidina y malvidina. Cabe recalcar que, el color
depende del pH y de la formación de iones metálicos en la combinación de antocianidinas
(Peñarrieta et al., 2014).
17
El efecto del pH contribuye en la estabilidad de las antocianinas, debido a que el
núcleo de flavilo es deficiente en electrones es altamente reactivo y sensible a los cambios
de pH. Durante la maduración de las frutas el pH cambia en conjunto con el color. A
medida que el pH aumenta se pierde un protón del catión flavilo y se adquiere una
molécula de agua, generando estructuras quinoidales, principalmente a pH igual o
superior a 7,0, en estas condiciones la coloración tiende a ser azul (Badui Dergal, 2006).
Vitamina C.
El ácido L-ascórbico (LAA, vitamina C, ascorbato) es uno de los antioxidantes
hidrosolubles más eficaces, debido a su alta biodisponibilidad y baja toxicidad, presente
en frutas y hortalizas. Numerosos efectos beneficiosos para la salud se atribuyen al ácido
ascórbico, como su efecto antiaterogénico, anticancerígeno y efecto inmunomodulador.
La cantidad diaria recomendada es de 90 mg por día para hombres y 75 mg por día para
mujeres (Fernández y Sánchez, 2016).
Principio de las metodologías.
Los fundamentos metodológicos para los análisis de laboratorio se detallan a
continuación.
Análisis Físico-químicos.
2.2.13.1.1. Color.
La medición del color se realizó mediante la utilización de una Guía detallada por
X-Rite (2002), un fabricante de productos de medición y gestión de color que ofrece
colorímetros con filtros rojo, verde y azul para evaluar la respuesta del ojo humano al
color y la luz. Cuando un color se expresa en CIELab (Comunicación Internacional de
Iluminación), la L* define la claridad, a* denota el valor rojo/verde y b* el valor
amarillo/azul.
2.2.13.1.2. Sólidos solubles.
Se basa en la desviación del ángulo de la luz vinculado con el contenido de sólidos
solubles presentes en la muestra, en las frutas estos sólidos son atribuidos a la presencia
de azúcares, ácidos orgánicos, vitaminas y pigmentos (Brito y Vásquez, 2013).
2.2.13.1.3. Acidez titulable.
El método se basa en el cálculo de los ácidos orgánicos libres en jugos o extractos
de frutas, cuya presencia se mide neutralizando dichos ácidos con una base alcalina y
determinando el volumen necesario de base para alcanzar el pH del punto final. Se pesa
18
una cantidad determinada de muestra y se diluye con agua destilada a un volumen
establecido, posteriormente se titula con una solución de NaOH 0,1 N estandarizada hasta
observar el viraje de color correspondiente al pH 8,2 del indicador fenolftaleína (Brito y
Vásquez, 2013).
Análisis de compuestos funcionales.
2.2.13.2.1. Polifenoles totales.
El contenido de polifenoles totales, puede ser estimado mediante adaptaciones del
método estándar Folin-Ciocalteu’s. Este método de óxido-reducción se basa en la
reducción del volframato de fósforo en un complejo de molibdato de fósforo por la
oxidación de los compuestos fenólicos, dando como resultado una reacción colorimétrica
reflejada en el viraje del color amarillo a productos azulados, cuya absorbancia se mide
por espectrofometría UV/VIS a 760nm frente a una curva estándar de ácido gálico,
perteneciente a los ácidos hidroxibenzóicos, cuya estructura se ilustra en la figura 2-7.
Los resultados se expresan en mg ácido gálico.100g-1 muestra (Georgé, Brat, Alter y
Amiot, 2005).
Figura 2-8: Estructura de los ácidos hidroxibenzóicos
Fuente: (Peñarrieta et al., 2014)
2.2.13.2.2. Flavonoides totales.
La cuantificación de los flavonoides se realiza por espectrofotometría UV/VIS,
en donde la muestra previamente extraída con metanol al 70 %, se le adiciona una
solución de nitrito de sodio al 5 %, cloruro de aluminio al 10 %, hidróxido de sodio 1N
para generar la reacción colorimétrica (rosada), como consecuencia de la reacción de los
flavonoides con el cloruro de aluminio en medio básico. La absorbancia se mide a una
longitud de onda de 490nm frente a una curva estándar de (+)-catequina al 98 % (Cruz
Gallegos, 2012).
19
2.2.13.2.3. Antocianinas totales.
La cuantificación de las antocianinas se realiza considerando el pH del medio
como factor influyente en la estabilidad del color de las antocianinas, las mediciones se
realizan en el espectrofotómetro UV/VIS teniendo en cuenta que los espectros varían a
diferentes valores de pH, lo cual permite determinar si las antocianinas están o no
polimerizadas. Entonces, la concentración se calcula mediante la absorbancia resultante
a un pH diferencial dando dos bandas de absorción, una en la región UV (260-280nm) y
la otra en la región visible (490-550nm). Los resultados se expresan como antocianinas
monoméricas, generalmente como cianidina-3-glucósido (García et al., 2015).
2.2.13.2.4. Vitamina C.
La evaluación de vitamina C a partir del Test de Ácido Ascórbico, se basa en la
capacidad del ácido ascórbico de reducir el ácido fosfomolíbdico de color amarillo en un
compuesto azul de fosfomolibdeno, el mismo que se determina por reflectometría (Merck
KGaA, 2017).
Análisis de la capacidad antioxidante.
Para el análisis de la capacidad antioxidante de los extractos de fruta se utilizaron
dos métodos. La capacidad se expresa en equivalente trolox. El método ABTS se basa en
la medición de la habilidad del antioxidante para estabilizar los radicales libres ABTS•+
por una reacción de transferencia de electrones; mientras que el ensayo FRAP mide el
potencial de un antioxidante para reducir el complejo amarillo férrico a un complejo azul
ferroso mediante una donación de electrones en medio ácido (Garzón, Riedl y Schwartz,
2009).
D. Huang, Ou y Prior (2005), establecen que, en esencia no hay mucha diferencia
entre los ensayos ABTS y FRAP, excepto que ABTS se lleva a cabo en un medio neutro
(pH de 7,0) y FRAP en condiciones ácidas (pH de 3,6).
2.2.13.3.1. Método del poder de reducción del hierro III (FRAP).
El principio se basa en la capacidad del antioxidante de la muestra para reducir el
hierro férrico (Fe3+) a hierro ferroso (Fe2+) presente en un complejo con la 2,4,6-tri(2-
piridil)-s-triazina (TPTZ), a una longitud de onda entre 590-595 nm (Mesa-Vanegas I et
al., 2010). La unión del Fe2+ con el ligando genera un complejo de color azul marino o
azul verdoso. La absorbancia se mide para determinar la cantidad de hierro reducido, lo
cual se puede correlacionar con la cantidad de antioxidante (Pisoschi y Negulescu, 2012).
20
2.2.13.3.2. Método de decoloración del catión 2,2'-azino-bis- (3-etil benzotiazolin-6-
sulfonato de amonio) (ABTS).
El ensayo con el radical catiónico ABTS•+ permite medir la habilidad del
antioxidante para estabilizar el radical libre ABTS•+, por donación de hidrógenos. El
método se basa en promover la disminución de la absorbancia del catión radical dando
una disolución decolorada determinada espectrofotométricamente. El radical ABTS•+ se
forma por la pérdida de un electrón del átomo de nitrógeno del ABTS (Pisoschi y
Negulescu, 2012), como consecuencia de la oxidación del ABTS al mezclarse con
persulfato de potasio. En presencia del estándar trolox el átomo de nitrógeno atrapa un
átomo de hidrógeno, produciendo la decoloración de la solución. El radical ABTS•+ es un
cromóforo de color azul-verdoso que absorbe la luz a una longitud de onda de 734nm
(Mesa-Vanegas I et al., 2010).
Marco Legal
Constitución de la República del Ecuador de 2008.
Art. 13.- “Las personas y colectividades tienen derecho al acceso seguro y
permanente a alimentos sanos, suficientes y nutritivos; preferentemente producidos a
nivel local y en correspondencia con sus diversas identidades y tradiciones culturales”
(Asamblea Nacional, 2008).
Plan Nacional de Desarrollo 2017-2021-Toda una Vida.
Objetivo 5. Impulsar la productividad y competitividad para el crecimiento
económico sostenible de manera redistributiva y solidaria: Ecuador posee recursos
naturales cuya extracción, producción y comercialización de materia prima generará un
importante desarrollo económico (Gobierno Nacional del Ecuador, 2017).
- Política 5.2: Promover la productividad, competitividad y calidad de los
productos nacionales, como también la disponibilidad de servicios conexos y
otros insumos, para generar valor agregado y procesos de industrialización en
los sectores productivos con enfoque a satisfacer la demanda nacional y de
exportación.
- Política 5.6: Promover la investigación, la formación, la capacitación, el
desarrollo y la transferencia tecnológica, la innovación y el emprendimiento, la
protección de la propiedad intelectual, para impulsar el cambio de la matriz
productiva mediante la vinculación entre el sector público, productivo y las
universidades.
21
Normativa nacional.
La normativa nacional aporta información con respecto a los requisitos de
tolerancia, físico y de madurez de la mora. Sin embargo, el índice de madurez y los demás
requisitos mencionados están especificados únicamente para dos variedades
representativas: la mora de Castilla (Rubus glaucus Benth) y la mora Brazos (Rubus
lanciniatus).
Las normas existentes son las siguientes:
- NTE INEN 2427. (2016). Primer revisión. Frutas frescas. Mora. Requisitos.
- NTE INEN 1 751:96 Primera revisión. Frutas frescas. Definiciones y
clasificación.
- NTE INEN 2 337:2008 Primera Edición. Jugos, pulpas, concentrados, néctares,
bebidas de frutas y vegetales.
Hipótesis
Hipótesis de trabajo.
- Hi: Existe efecto del tipo de cultivar y el estado de madurez sobre el contenido
de compuestos funcionales en los frutos de cuatro cultivares de mora.
Hipótesis nula.
- Ho: No existe efecto del tipo de cultivar y el estado de madurez sobre el
contenido de compuestos funcionales en los frutos de cuatro cultivares de
mora.
Sistema de variables
La caracterización de las variables independientes y dependientes se presentan en
el Anexo 2.
Variables independientes.
- Cultivares de mora (Rubus sp.): Mora de Castilla (Rubus glaucus Benth),
mora Brazos (Rubus lanciniatus), mora Colombiana (Rubus glaucus Benth) y
la variedad INIAP Andimora-2013 (Rubus glaucus Benth).
22
- Estado de madurez de la mora en la cosecha: La selección se asoció con
un indicador subjetivo de color de cubrimiento basado en la fenología de la
fruta.
Variable dependiente.
- Caracterización fisicoquímica: sólidos solubles, acidez titulable, color,
índice de madurez.
- Contenido de compuestos funcionales: polifenoles totales, flavonoides
totales, antocianinas totales, vitamina C.
- Capacidad antioxidante: FRAP y ABTS
23
CAPÍTULO III
3. METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN
Diseño de la investigación
La presente investigación se considera de nivel explicativo, debido a que cuenta
con variables dependientes e independientes. En este tipo de estudios es imprescindible
la formulación de hipótesis que, de una u otra forma, pretenden explicar las causas del
problema en cuestión, dando lugar a la búsqueda de parámetros estadísticos en respuesta
a la hipótesis planteada. Dentro de los estudios de nivel explicativo se encuentran
investigaciones de tipo experimental (Jimenez, 1998). Por consiguiente, se determinan
los siguientes aspectos en el diseño de la investigación:
• Enfoque o paradigma: Cuantitativo
• Nivel de investigación: Según la naturaleza del proyecto, se lo define como un
estudio explicativo.
• Tipo de investigación: Debido a que se fundamenta en un análisis de campo con
base a la cosecha y maduración del fruto, se considera como una investigación de
tipo experimental, documental y de desarrollo.
- Experimental: Los cuatro cultivares de mora en tres diferentes estados de
madurez se sometieron a un análisis de las propiedades físico-químicas y
funcionales, para evaluar el efecto y la relación entre las variables en estudio.
- Documental: La presente investigación requirió de una exhaustiva revisión
bibliográfica referente al fundamento teórico y resultados experimentales que
apoyaron a la investigación, por lo tanto, la bibliografía incluyó artículos
científicos relacionados con el estudio de compuestos funcionales y capacidad
antioxidante, estudios de los cultivares de la mora andina, métodos de
cuantificación y beneficios del efecto antioxidante en la salud humana.
- Desarrollo: Se determinó que la investigación es también del tipo de
desarrollo, debido a que los resultados obtenidos deben demostrar perspectiva
de su uso.
24
Población y muestra
Población.
Para el presente estudio en colaboración con los técnicos del programa de
Fruticultura del INIAP, se colectaron muestras de frutas de 4 cultivares de mora: mora
de Castilla (Rubus glaucus Benth), mora Brazos (Rubus lanciniatus), mora Colombiana
y la variedad INIAP Andimora-2013, estas dos últimas obtenidas a partir de la mora de
Castilla. La colecta se realizó directamente de las plantas que corresponden a cada
cultivar localizados en la Granja del INIAP ubicada en Tumbaco, provincia de Pichincha,
teniendo en cuenta que cada cultivar se compone por una población de 15 plantas.
Muestra.
Se recolectaron 900g de los frutos de los cuatro cultivares de mora (Rubus sp.).
La fruta de mora se cosechó en tres estados de madurez, cuya selección se asoció con un
indicador subjetivo del color de cubrimiento basado en los grados de madurez
establecidos en la NTE INEN 2427:2016.
El primer estado de madurez (E1) representa aproximadamente el 25 % de viraje
del color de cubrimiento donde las bayas contienen drupas verdes en su mayoría y unas
pocas rojas o rosadas; el segundo estado de madurez (E2) se refiere a las bayas de mora
con el 50 % de viraje del color de cubrimiento donde la mayor cantidad de drupas son de
color rojo intenso y unas pocas de color morado; y el tercer estado (E3) es el 100 % de
viraje del color de cubrimiento con drupas moradas en su totalidad, casi negras.
Tipo de muestreo.
La investigación se desarrolló a partir de un muestreo no probabilístico, pues se
considera que la selección fue realizada de manera casual o al azar, sin la aplicación de
leyes matemáticas. Se colectaron para el estudio un total de 36 muestras, que
corresponden a los frutos de cuatro cultivares de mora en tres estados de madurez con
tres repeticiones (4x3x3).
Lugar de muestreo.
Las muestras de los frutos correspondientes a cada cultivar de mora fueron
colectadas en las diferentes etapas de maduración, directamente de las plantas que se
encuentran en una huerta de la Granja Experimental Tumbaco del INIAP, ubicada en la
parroquia de Tumbaco en la provincia de Pichincha.
25
Materiales y métodos
Materiales.
Materiales de laboratorio.
- Pipetas volumétricas 1, 5 y 10mL - Puntas para micropipetas
- Fundas de plástico - Frascos de vidrio color ámbar
- Etiquetas - Piceta
- Guantes de nitrilo - Balones ámbar 25mL
- Papeles adsorbentes
- Papel film
- Cajas Petri de vidrio de 55mm de
diámetro
- Viales de plástico - Espátula
- Frascos de plástico - Probetas de 25mL
- Tubos de centrifugación de 15mL - Vasos de precipitación de 50mL
- Gradillas - Balones aforados de 50mL
- Tubos de ensayo de 10mL - Bureta de 50mL
Reactivos.
- Metanol, grado p.a.
- Ácido clorhídrico, grado p.a.
- ABTS, diamonium salt (Sigma–
Aldrich pureza >98 %)
- Ácido fórmico, grado p.a. - Fosfato sodio monobásico grado p. a.
- Agua destilada - Fosfato de sodio dibásico grado p. a.
- Estándar Ácido gálico, grado p.a. - Persulfato de potasio, grado p.a.
- Reactivo Folin-Ciocalteu’s, grado
p.a.
- Fenolftaleína grado p.a.
- Estándar: trolox: 6-hidroxy- 2,5,7,8 -
tetramethylcroman-2-carboxylic acid
(Sigma Aldrich> 98 %)
- Carbonato de sodio, grado p.a. - Ferrocianida de potasio grado p.a.
- Hidróxido de sodio, grado p.a. - Ácido tricloroacético grado p.a.
- Catequina estándar (pureza 98 %) - Cloruro férrico grado p.a.
- Estándar: trolox: (Sigma Aldrich>
98 %)
- Nitrito de sodio, grado p.a.
- Acetato de sodio, grado p.a.
- Cloruro de aluminio, grado p.a. - Cloruro de potasio, grado p.a.
- Ácido oxálico, grado p.a.
Equipos.
- Balanza analítica de precisión 0.1mg
Shimadzu, Modelo AUX 220
- Baño María. Memmert modelo WNB
7-45
- Micropipeta 1000µL
- Agitador magnético
- Espectrofotómetro UV- VIS Shimadzu
Uv- 2600
26
- Vortex Multimixer LAB-LINE
INSTRUMENTS
- Micropipeta 1000µL y 5mL
- Baño ultrasónico Cole Parmer 8892-
MTH
- Reflectómetro, RQflex plus 10,
MERCK
- Molinillo eléctrico Moulinex - Potenciómetro Thermo scientific.
- Centrífuga Damon/TEC - Colorimetro Color TEC-PCMTm
- Congelador Indurama - Refractómetro digital, ATAGO
- Liofilizador Freezstar - Licuadora Osterizer Blender
Métodos.
Caracterización físico-química de la fruta.
En la caracterización físico-química de los frutos de cuatro cultivares de mora en
tres estados de madurez se evaluaron los siguientes parámetros: color, sólidos solubles
totales y acidez titulable.
3.3.2.1.1. Preparación de la muestra.
Las muestras de mora colectadas en la Granja de Tumbaco se sometieron a un
proceso de obtención de pulpa para los análisis físico-químicos de la fruta fresca, la
cantidad de fruta utilizada se especifica en cada metodología a continuación. Por su parte,
el color se realizó en la pulpa liofilizada. En primer lugar, se separó el pedúnculo de las
frutas dentro de las instalaciones de la Granja de Tumbaco y se procedió a realizar la
caracterización físico-química de la fruta fresca de acuerdo a las especificaciones de cada
metodología.
3.3.2.1.2. Determinación del color.
Para la medición del color de las muestras de fruta liofilizada se utilizó el método
colorimétrico CIE L*a*b* explicado por X-Rite (2002) y Konica Minolta (2002). En
primer lugar, se llenó una caja Petri de vidrio (55mm de diámetro) con pulpa liofilizada,
inmediatamente se tapó la muestra con papel film evitando la formación de burbujas y se
colocó la caja Petri en una superficie blanca para evitar interferencias. Posteriormente,
se ubicó el prisma del colorímetro Color Tec-PCMTm sobre la superficie de la caja y se
realizó al menos cinco lecturas en diferentes lugares de la misma. El colorímetro Color
Tec-PCMTm permite la evaluación del color con las coordenadas L, a, b de la muestra.
- L: describe la luminosidad o claridad
- a: determina el tono del color entre verde (-a*) y rojo (+a*).
- b: determina el tono del color entre amarillo (+b*) y azul (-b*).
27
3.3.2.1.3. Sólidos solubles (SS).
La concentración de sólidos solubles se determinó por refractometría utilizando
un refractómetro digital, según la metodología especificada por Brito y Vásquez (2013).
Se extrajo el jugo de la fruta de forma manual, se colocó de dos a tres gotas de jugo de
fruta sobre el prisma de la superficie, el porcentaje de sólidos solubles se mostró en la
pantalla del equipo, expresado en términos de º Brix.
3.3.2.1.4. Acidez titulable (AT).
La acidez titulable (Ec. 3-1) se determinó por titulación potenciométrica con una
solución alcalina estandarizada, basada en el método publicado por Blandón (2012). En
primera instancia, se pesó aproximadamente 30g de pulpa de fruta y se aforó con agua
destilada a un volumen de 200mL. Posteriormente, se tomó una alícuota de 20mL en un
vaso de precipitación de 25mL y se procedió a titular con una solución de hidróxido de
sodio 0,1 N hasta el pH 8,2, que corresponde al viraje de color del indicador fenolftaleína
(de transparente a rosado). Los resultados se reportaron en función del ácido orgánico
predominante en la muestra, en este caso el ácido cítrico.
𝑨𝑻 (%) =𝑽𝑵𝒂𝑶𝑯 (𝒎𝑳)∗𝑵∗𝒎𝒆𝒒∗𝑽𝑻 (𝒎𝑳)
𝑷𝑴 (𝒈)∗𝑽𝑨 (𝒎𝑳) Ec. 3-1
Donde, AT es la acidez titulable (g.100 g-1), VNaOH es el volumen de hidróxido de
sodio consumido en la titulación (mL), N es la normalidad del hidróxido de sodio, meq
son los miliequivalentes del ácido cítrico, VT es el volumen final (mL), PM es el peso de
la muestra (g) y VA es volumen de la alícuota (mL).
Evaluación de los compuestos funcionales y capacidad antioxidante.
3.3.2.2.1. Preparación de muestras.
Una vez realizada la colecta de las muestras, se separó el pedúnculo de cada fruto,
se empacaron en fundas ziploc y se almacenaron en congelación (-12 °C) en la Granja de
Tumbaco. Posteriormente, se transportaron conservando el frío y en ausencia de luz a los
laboratorios del Departamento de Nutrición y Calidad en la Estación Experimental Santa
Catalina del INIAP, para los diferentes análisis. En el laboratorio se almacenaron en
congelación (-12 °C) para su posterior liofilización (temperatura -30 °C y presión 0,1 Pa)
en un período de una semana.
Las muestras liofilizadas se molieron con un molinillo eléctrico Moulinex y
pasaron por un tamiz de acero inoxidable (malla de 355µm) para asegurar un tamaño de
partícula uniforme. Finalmente se envasaron las muestras en recipientes de plástico con
tapas herméticas, rotulados con el código del laboratorio y protegidas de la luz
28
El proceso de secado de los frutos de cuatro cultivares de mora (Rubus sp.) en los
tres estados de madurez, se visualiza en la figura 3-1.
Figura 3-1: Proceso de secado de las muestras por liofilización.
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
3.3.2.2.2. Análisis de polifenoles, flavonoides y capacidad antioxidante.
En cada una de las muestras en estudio se realizaron los análisis del perfil de
compuestos antioxidantes, para lo cual se determinó el contenido de polifenoles totales,
flavonoides totales y capacidad antioxidante, en un extracto obtenido con la solución de
metanol/agua/ácido fórmico 70/30/0,1 v/v/v.
- Proceso de extracción de compuestos antioxidantes
Para la extracción de los compuestos antioxidantes se pesó 0,3g de muestra seca
en tubos de centrifugación de plástico, se adicionó 5mL de la solución de extracción y se
homogenizó mediante agitación en un equipo vórtex por 5min. Posteriormente, se
sometió por 10 min en un baño ultrasonido y finalmente se centrifugó a 5000rpm por
10min. El sobrenadante (extracto) se colocó en un balón ámbar aforado de 25mL. Este
proceso se repitió de tres a cuatro veces para asegurar la extracción total de los
compuestos antioxidantes.
- Cuantificación de polifenoles totales (PT)
La cuantificación de los polifenoles totales se utilizó la metodología descrita por
Espín y Samaniego (2016). Para lo cual, se tomó en un tubo de ensayo de 15mL una
alícuota de 1mL de extracto diluido, se adicionó 6mL de agua destilada, 1mL de reactivo
Folin y Ciocalteu y se dejó en reposo por 3min. Posteriormente, se adicionó 2mL de
carbonato de sodio al 20 % y se calentó en baño María a 40° C por 2min. Esta reacción
3 Repeticiones por cada
tratamiento
1E3
29
forma un cromóforo color azul, el mismo que fue analizado por espectrofotometría
UV/VIS a una longitud de onda de 760nm.
La cuantificación se realizó por interpolación de la absorbancia correspondiente
a cada muestra en una curva de calibración realizada con ácido gálico, a partir de una
solución madre de 200mg ácido gálico.L-1 (Tabla 3-1).
Tabla 3-1. Curva de calibración para polifenoles totales
Los resultados se reportaron como polifenoles totales en mg ácido gálico.g-1.
Utilizando la ecuación 3-2.
𝑷𝑻 =𝐴−𝑏
𝑎∗
𝑉𝑇
𝑃𝑀∗ 𝐹𝐷 Ec. 3-2
Donde, PT son los polifenoles totales medidos en mg.g-1, A es la absorbancia, b
y a son el punto de corte y la pendiente de la curva de calibración, respectivamente; VT
es el volumen total (L), PM es el peso de la muestra (g) y FD es el factor de dilución.
- Cuantificación de flavonoides totales (FT)
El contenido de flavonoides totales se evaluó mediante el método desarrollado
por Zhishen, Mengcheng y Jianming (1999). Para lo cual, se tomó una alícuota de 1mL
del extracto diluido en un tubo de 15mL, se adicionó 4mL de agua destilada y se
homogenizó. A continuación, se adicionó 0,3mL de nitrito de sodio al 5 %, tras 5min de
espera se adicionó 0,3mL de cloruro de aluminio al 10 % y se dejó reposar otros 5min.
Consecutivamente, se añadió 2mL de NaOH 1N. obteniendo un cromóforo color rosado.
Finalmente, se aforó a 10mL con agua destilada y se analizó el complejo coloreado por
espectrofotometría UV/VIS a una longitud de onda de 490nm.
La cuantificación se realizó por interpolación de la absorbancia correspondiente
a cada muestra en una curva de calibración realizada con (+)-catequina, a partir de una
solución madre de 100mg (+)-catequina.L-1 (Tabla 3-2).
30
Tabla 3-2: Curva de calibración para Flavonoides
Los resultados se expresan como mg catequina.g-1. Utilizando la ecuación 3-3.
𝑭𝑻 =𝐴−𝑏
𝑎∗
𝑉𝑇
𝑃𝑀∗ 𝐹𝐷 Ec. 3-3
Donde, FT son los flavonoides totales en mg.g-1, A es la absorbancia, b y a son el
punto de corte y la pendiente de la curva de calibración, respectivamente; VT es el
volumen total (L), PM es el peso de la muestra (g) y FD es el factor de dilución.
- Determinación de la capacidad antioxidante por el método de decoloración del
catión 2,2- azinobis (3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS•+)
La evaluación de la capacidad antioxidante por el método ABTS se realizó
utilizando la metodología descrita por (Re et al., 1999). Para lo cual se mezcló en un
frasco ámbar una solución de ABTS•+ (7mM) con una solución de persulfato de potasio
(2,45mM) en una proporción 1:1 y se dejó reposar 16 horas. Al día siguiente, se midió la
absorbancia de la solución de trabajo, ABTS•+, previamente preparada y se diluyó con
buffer fosfato hasta obtener una absorbancia de 1,1 + 0,01 a 734nm. Posteriormente, se
colocó 200µL del extracto diluido en un tubo de ensayo de 15mL y se adicionó 3,8mL de
la solución de trabajo ABTS•+, se dejó en reposo por 45 min y finalmente se determinó la
absorbancia de las reacciones obtenidas mediante espectrofotometría UV/VIS a una
longitud de onda de 734nm.
La concentración de la muestra se obtuvo mediante la interpolación de la
absorbancia en una curva de calibración previamente elaborada con un estándar de trolox,
a partir de una solución madre de 2000 µmol trolox.L-1 (Tabla 3-3).
31
Tabla 3-3: Curva de calibración para el método ABTS
Los resultados se expresan como µmol trolox.g-1. Utilizando las ecuaciones 3-4
y 3-5.
𝐴𝐵𝑆 = 𝐴𝐵𝑆𝑆𝑇𝐼 − 𝐴𝐵𝑆𝑀45 − 𝐴𝐵𝑆𝐵 Ec. 3-4
𝑨𝑩𝑻𝑺 =𝐴−𝑏
𝑎∗
𝑉𝑇
𝑃𝑀∗ 𝐹𝐷 Ec. 3-5
Donde, ABS es la absorbancia neta de la muestra y/o patrón de trolox, ABSSTI es
la absorbancia de la solución de trabajo inicial, ABSM45 es la absorbancia de la muestra
a los 45min y ABSB es la absorbancia del blanco. Con respecto a la Ec.3-5, A es la
absorbancia, b y a son el punto de corte y la pendiente de la curva de calibración,
respectivamente; VT es el volumen total (L), PM es el peso de la muestra (g) y FD es el
factor de dilución.
- Determinación de la capacidad antioxidante por el método del poder de
reducción del hierro férrico (FRAP)
La reducción férrica/poder antioxidante (FRAP) fue determinada mediante el
método descrito por Babu, Gurumurthy, Borra y Cherian (2013). Para lo cual, se tomó
1mL de muestra en un tubo de ensayo de 15mL, se adicionó 2,5mL de buffer pH 6,6 y
2,5mL de una solución de ferrocianida de potasio al 1 %, se agitó y se incubó
inmediatamente en un baño María a 50° C por 20min. A continuación, se adicionó 2,5mL
de ácido tricloroacético al 10 %; 2,5mL de agua y 0,5mL de FeCl3 al 1%. Finalmente, se
homogenizó en un vórtex y tras 30min de reposo en la oscuridad, se formó el complejo
cloruro ferroso-ferrocianida de potasio color verde, el mismo que se determinó por
espectrofotometría UV/VIS a 700nm. La cuantificación se realizó por interpolación en
la curva de calibración establecida en el método ABTS (Tabla 3-3), con el uso de la Ec.3-
5. Los resultados se expresan como µmol trolox.g-1.
32
3.3.2.2.3. Cuantificación de antocianinas totales (AC)
La determinación del contenido de antocianinas totales (Ec. 3-6 y Ec. 3-7), se
realizó siguiendo la metodología desarrollada por (Rapisarda, Fanella y Maccarone,
2000). En primera instancia se ejecutó el proceso de extracción, para lo cual se pesó 0,3g
de muestra liofilizada, se adicionó 5mL de buffer pH 1,0 y se homogenizó por agitación
vórtex durante 5min. Posteriormente, se sometió por 10min en un baño ultrasónico y
finalmente se centrifugó a 5000rpm por 10min, separando el sobrenadante (extracto) de
los sólidos sedimentados y se colocó en un balón ámbar aforado a 25mL. Este proceso
se repitió de tres a cuatro veces para asegurar la extracción total de antocianinas.
Finalmente, la cuantificación de antocianinas se realizó de forma directa por
espectrofotometría UV/VIS a dos longitudes de onda, 450nm y 750nm. El procedimiento
se repitió de la misma forma utilizando un buffer pH 4,5.
𝐴 = [(𝐴1 − 𝐴2) − (𝐴3 − 𝐴4)] Ec. 3-6
𝑨𝑪 =𝐴
𝜀∗𝑏∗
𝑉𝑇
𝑃𝑀𝑊𝑀 ∗ 100 Ec. 3-7
Donde, AC es el contenido de antocianinas totales, en mg cinidin-3-
glucósido.100g-1, A es la diferencia de absorbancia entre pH 1,0 y pH 4,5; A1 es la
absorbancia a 510nm a pH 1,0 y A2 es la absorbancia a 700nm a pH 1,0; A3 es la
absorbancia a 510nm y pH 1,0 y A4 es la absorbancia a 700nm y pH 4,5; ԑ es el coeficiente
de absortividad del cloruro de cianidin-3-glucósido, b es el ancho de la celda (cm), VT
es el volumen total (mL), PM es el peso de la muestra (g) y WM es la masa molecular de
cloruro de cianidin-3-glucósido (g.mol-1).
3.3.2.2.4. Cuantificación de vitamina C (VC).
La determinación del contenido de vitamina C (Ec. 3-10) se realizó por
reflectometría, tomando como referencia el método descrito por Merck KGaA (2017).
Sin embargo, se utilizó ácido oxálico al 1 % como solvente en lugar de agua destilada
como indica el manual del reflectómetro RQ Flex 16970 para evitar interferencias en la
medición de la vitamina C en las muestras de mora.
Para el desarrollo del análisis, se pesó de 0,5 a 1g de fruta liofilizada y se aforó a
25mL con ácido oxálico al 1 %, se tomó en tubos de centrífuga una alícuota de 5mL y se
centrifugó por 10min a 5000rpm. A continuación, se sumergió la tirilla del test para el
ácido ascórbico en el sobrenadante de la solución, inmediatamente se colocó la tirilla con
la muestra en el reflectómetro RQ Flex 16970, se dejó reaccionar y se procedió a leer en
un tiempo de 5seg (duración de la señal acústica). El resultado se observó directamente
en la pantalla del equipo, expresado en mg.L-1 de ácido ascórbico. Para la cuantificación
correspondiente se utiliza la Ec.3-8.
33
𝑽𝑪 (𝑚𝑔
100𝑔𝑑𝑒 á𝑐. 𝑎𝑠𝑐ó𝑟𝑏𝑖𝑐𝑜) =
𝐿∗𝑉
𝑃𝑀 Ec. 3-8
Donde, VC es el contenido de vitamina C, en mg.100g-1, L es la lectura del
reflectómetro, en mg.L-1, V es el volumen final y PM es el peso de la muestra en gramos.
Diseño experimental
El cumplimiento de los objetivos determinados requirió de una división del
proyecto en dos fases:
- Fase I: Adaptación de las metodologías de análisis, que implica ensayos de
linealidad, exactitud y precisión para cada método.
- Fase II: Evaluación de las propiedades físico-químicas y funcionales de los
cuatro cultivares de mora en tres estados de madurez.
El análisis estadístico de los resultados de la Fase II, se realizó a través de un
diseño completamente al azar (DCA) en arreglo factorial 4 x 3 con tres repeticiones,
dando un total de 36 tratamientos. Con la finalidad de evaluar el efecto del estado de
madurez sobre los compuestos funcionales en frutos de cuatro cultivares de mora (Rubus
sp.) se realizó el análisis ANOVA propuesto en la Tabla 3-4.
Tabla 3-4: Esquema del análisis de varianza (ANOVA)
R: Repeticiones
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
34
Operacionalización de variables
Tabla 3-5: Proceso de operacionalización de variable
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
Técnicas e instrumentos de recolección de datos (IRD)
Fase I: Adaptación de las metodologías de análisis, que implica ensayos de
linealidad, exactitud y precisión por método.
Para la adaptación de las metodologías analíticas se utilizó espectrofotometría
UV/VIS dado que tanto los compuestos funcionales (polifenoles totales, antocianinas
totales y flavonoides totales) como la capacidad antioxidante (ABTS y FRAP) se mide a
partir de un método colorimétrico. La finalidad de la adaptación metodológica es
asegurar que los resultados generados sean confiables y reproducibles, para lo cual se
estableció ensayos para determinar la linealidad, exactitud como porcentaje de
recuperación y la precisión, expresada como la desviación estándar de la repetibilidad.
a. Linealidad
El rango lineal del método se determina mediante la relación entre la señal
analítica, en este caso la absorbancia, y la concentración de las soluciones estándar,
desarrolladas a partir de una solución madre. El proceso se realiza durante tres días por
triplicado para asegurar reproducibilidad y se evalúa mediante el coeficiente de
correlación (Tabla 3-6).
35
Tabla 3-6: Formato de evaluación de la linealidad para cada método
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
Para la evaluación de la regresión lineal se utilizaron los parámetros: Coeficiente
de correlación de la curva (r), pendiente de la curva (m), ordenada al origen (Lo),
desviación de la pendiente (Sm), desviación de la ordenada al origen (SLo), error típico
(Sy,x), límite de confianza de la pendiente (LCm), límite de confianza de la ordenada al
origen (LCLo).
r 𝒓 =
∑ 𝒙𝒚 − ∑ 𝒙 ∑ 𝒚/𝒏
[∑ 𝒙𝟐 −(∑ 𝒙)𝟐
𝒏 ]𝟏/𝟐
[∑ 𝒚𝟐 −(∑ 𝒚)𝟐
𝒏 ]𝟏/𝟐
Ec. 3-9
m 𝑚 =
𝑆𝑦𝑥
𝑆𝑥𝑥=
∑ 𝑥𝑦 − ∑ 𝑥 ∑ 𝑦/𝑛
∑ 𝑥2 −(∑ 𝑥)2
𝑛
Ec. 3-10
Lo 𝐿𝑜 =
∑ 𝑦 − 𝑚 ∑ 𝑥
𝑛= 𝑦 − 𝑚𝑥
Ec. 3-11
Sm
𝑆𝑚 = √𝑆2𝑦𝑥
∑ 𝑥2 −(∑ 𝑥)
2
𝑛
=𝑆𝑦𝑥
√𝑆𝑥𝑥
Ec. 3-12
SLo
𝑆𝐿𝑜 = 𝑆𝑚√∑ 𝑥2
𝑛
Ec. 3-13
Sy,x
𝑆𝑦,𝑥 = √∑(𝑦 − ��)2
𝑛 − 2
Ec. 3-14
LCm 𝐿𝐶𝑚: 𝑚 ± 𝑡. 𝑆𝑚 Ec. 3-15
LCLo 𝐿𝐶𝐿𝑜: 𝐿𝑜 ± 𝑡. 𝑆𝐿𝑜 Ec. 3-16
b. Exactitud
El ensayo de la exactitud se realizó estableciendo el número de ciclos de
extracción necesarios para extraer el 100 % de los compuestos funcionales a los que se
le atribuye la capacidad antioxidante, el análisis se realizó por triplicado y se utilizó una
36
muestra de mora liofilizada del estado E3 (100 %) elegida al azar, codificada como
C4E3R1 (Tabla 3-7).
Tabla 3-7: Formato de evaluación de Exactitud para cada método
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
Cálculo del porcentaje de extracción para cada ciclo de extracción.
% 𝐸𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑐𝑖ó𝑛 = 𝐶0
𝐶𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙𝑥100 Ec. 3-17
Donde, Co es la concentración obtenida para cada ciclo de extracción, CTotal
equivale a la sumatoria de la concentración obtenida en todos los ciclos de extracción.
c. Precisión
Para la evaluación de la precisión del método se utilizó la misma muestra
seleccionada para el ensayo de exactitud, codificada como C4E3R1. Para este proceso se
analizó seis veces la muestra elegida con el fin de asegurar el correcto ensayo de
repetibilidad. El estudio de precisión se realizó para cada metodología analítica. El
formato de evaluación se presenta en la Tabla 3-8.
Tabla 3-8: Formato de evaluación del ensayo de Precisión para cada método
PT: Polifenoles totales, FT: Flavonoides totals, AC: Antocianinas.
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
Para analizar la medida de dispersión de datos con respecto a una media, se
calculó: la media (X), desviación estándar (S) y el coeficiente de variación (CV).
37
𝑆 =√∑ (𝑥𝑖−𝑥)2𝑛
𝑖=1
𝑛−1 Ec. 3-18
𝐶𝑉 =𝑆
𝑋∗ 100 Ec. 3-19
Para determinar si el error se encuentra dentro de niveles aceptados, se comparan
los resultados de los coeficientes de variación con el RDAR (coeficientes de variación en
condiciones de reproducibilidad) determinados por la ecuación de Horwitz (Figura 3-2),
medida de referencia en el ensayo de precisión.
Figura 3-2: Representación de la curva original de Horwitz Horn.
Fuente: (Rivera y Rodríguez, 2011)
Fase II: Evaluación de las propiedades físico-químicas y funcionales de los
cuatro cultivares de mora en tres estados de madurez.
Etapa I: Caracterización físico-química de los frutos de cuatro cultivares
de mora en tres estados de madurez.
Para la presente investigación se realizó la caracterización físico-química de los
frutos en los cuatro cultivares de mora, determinándose la acidez titulable, sólidos
solubles (° Brix) y color. El formato del instrumento de recolección de datos se identifica
en la Tabla 3-9.
38
Tabla 3-9: Factores en estudio para la caracterización físico-química de los cuatro
cultivares de mora en tres estados de madurez
Cultivar Color de
cubrimiento
SS AT Color
° Brix % Ác. cítrico L a* b*
C1 Mora
Brazos
E1 25%
E2 50%
E3 100%
C2 Mora
Colombiana
E1 25%
E2 50%
E3 100%
C3 Mora de
Castilla
E1 25%
E2 50%
E3 100%
C4 INIAP-
Andimora
2013
E1 25%
E2 50%
E3 100% Viraje del color de cubrimiento determina el estado de madurez de cada cultivar. AT: Acidez titulable, SS:
Sólidos solubles.
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
Etapa II: Evaluación de los compuestos funcionales y capacidad
antioxidante de los frutos de cuatro cultivares de mora en tres estados de
madurez.
Para la presente investigación se determinaron como factores en estudio de los
frutos de cuatro cultivares de mora (mora de Castilla, Brazos, Colombiana e INIAP
Andimora 2013) y los tres estados de madurez diferentes (25 %, 50 % y 100 % viraje del
color de cubrimiento). La recolección de datos para la evaluación de los compuestos
funcionales y la capacidad antioxidante se indican en la Tabla 3-10.
Tabla 3-10: Factores en estudio para la evaluación de compuestos funcionales y
capacidad antioxidante de los cuatro cultivares de mora en tres estados de madurez
Cultivar Color
de
cubrimiento
PT FT AC ABTS FRAP VC
mg ác.
gálico.
g-1
mg(+)-
catequina.
g-1
mg
cianidin-
3-gluc.
100 g-1
µmol
trolox.
g-1
µmol
trolox.
g-1
mg ác
ascórbico.
100g-1
C1
Mora
Brazos
E1 25%
E2 50%
E3 100%
C2
Mora
Colombiana
E1 25%
E2 50%
E3 100%
39
Cultivar Color
de
cubrimiento
PT FT AC ABTS FRAP VC
mg ác.
gálico.
g-1
mg(+)-
catequina.
g-1
mg
cianidin-
3-gluc.
100 g-1
µmol
trolox.
g-1
µmol
trolox.
g-1
mg ác
ascórbico.
100g-1
C3
Mora de
Castilla
E1 25%
E2 50%
E3 100%
C4
INIAP-
Andimora
2013
E1 25%
E2 50%
E3 100%
PT: Polifenoles totales, FT: Flavonoides totales, AC: Antocianinas totales, VT: Vitamina C.
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
Técnicas de Procesamiento y Análisis de Datos
Tratamientos.
Los tratamientos constituyeron la combinación de los factores en estudio: frutos
de cultivares de mora cosechados y el estado de madurez, con sus respectivas repeticiones
de cosecha, como se demuestra en la Tabla 3-11.
Tabla 3-11.Tratamientos obtenidos para evaluar el efecto del estado de madurez sobre
el perfil de compuestos funcionales en cuatro cultivares de mora (Rubus sp.)
Análisis Estadístico.
El análisis estadístico de la cuantificación de compuestos funcionales y la
capacidad antioxidante, fue determinado mediante medidas de tendencia central (media,
desviación estándar y coeficiente de variación) a partir de Microsoft Excel 2016. La
40
evaluación del efecto del estado de madurez sobre los compuestos funcionales en frutos
de cuatro cultivares de mora (Rubus sp.), se realizó mediante el análisis de varianza
(ANOVA) utilizando el Software Statistica 10.
41
CAPÍTULO IV
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Fase I: Adaptación de las metodologías de análisis.
Los ensayos de exactitud y precisión se llevaron a cabo con una muestra de mora
del estado E3 (100 %) escogida al azar.
Polifenoles totales.
Linealidad
Para el estudio de linealidad se realizó una curva de calibración con mediciones
por triplicado en tres días diferentes, utilizando ácido gálico como estándar en
concentraciones de 0 a 100 mg.L-1, a partir de una solución madre de 200 mg.L-1. En la
Tabla 4-1, se presenta los resultados promedios de la absorbancia para cada
concentración medida.
Tabla 4-1. Resultados promedio de la señal instrumental y la concentración medida
para el método de polifenoles totales
Elaborado por: Cabrera, Ana; Camacho, Diana y Novoa, Tania (2019)
En función de los resultados presentados en la Tabla 4-1 se realizó un gráfico de
la concentración de polifenoles totales (mg.L-1) vs la absorbancia promedio, representado
en la Figura 4-1.
42
Figura 4-1: Curva de calibración promedio para la cuantificación del contenido de polifenoles
totales en mora
Elaborado por: Cabrera, Ana; Camacho, Diana y Novoa, Tania (2019)
En la Figura 4-1, se puede observar la tendencia lineal de la curva de calibración,
la misma que presenta un coeficiente de correlación lineal (r) de 0,9999, estableciéndose
que existe una alta correlación lineal entre la señal instrumental y la concentración, lo
que indica que el equipo presenta una buena resolución para este análisis. La Tabla 4-2,
presenta los resultados del estudio de regresión lineal realizada para la curva de
calibración promedio, con la cual se realizó la cuantificación del contenido de polifenoles
totales en frutos de los cuatro cultivares de mora.
Tabla 4-2. Resultados del análisis de regresión lineal para la curva de calibración del
contenido de polifenoles totales
Elaborado por: Cabrera, Ana; Camacho, Diana y Novoa, Tania (2019)
El análisis estadístico de prueba t de student para el coeficiente de correlación
lineal r demostró que existe una alta correlación lineal (a un nivel de confianza del 95 %)
entre la absorbancia y la concentración del estándar de ácido gálico. El valor de t
calculado (172,8601) es superior al valor de t teórico (3,1824).
43
En función de los resultados del análisis de regresión lineal para la curva de
calibración promedio, se estableció que las magnitudes de la pendiente (m) toma un valor
de 0,0109 L.mg-1 y de la ordenada al origen (Lo) de 0,0618; de igual manera los valores
de la desviación estándar de la pendiente (Sm) y de la ordenada al origen (SLo) fueron
de 0,0002 L.mg-1 y 0,0108; respectivamente. Utilizando estas desviaciones estándar para
el intercepto (ordenada al origen) y la pendiente se determinó los límites de confianza
para cada uno de ellos, estableciéndose que la pendiente puede estar en un rango de
0,0103 a 0,0115 L.mg-1 y el intercepto en el rango de 0,0239 a 0,0928; con un nivel de
confianza 95 %. El error típico (Sy, x) en la curva de calibración fue de 0,0151; este valor
corresponde a la incertidumbre de la medición por curva de calibración.
Exactitud
La exactitud del método se determinó como porcentaje de recuperación, se
estableció el número de ciclos de extracción necesarias para obtener el mayor porcentaje
de recuperación de polifenoles en mora. Este ensayo se realizó con la muestra C4E3R1 y
cada ciclo de extracción se realizó siguiendo el proceso de extracción especificado en el
punto 3.3.2.2.2 de la presente investigación. Posteriormente, en cada extracto se
cuantificó el contenido de polifenoles totales. Los resultados de este análisis se presentan
en la Figura 4-2.
Figura 4-2: Porcentaje de extracción de polifenoles por ciclo de extracción en mora
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
Con base a los resultados obtenidos en el ensayo de recuperación se estableció
que se necesitan cinco ciclos de extracción para obtener el 100 % de recuperación de los
polifenoles de la muestra liofilizada de mora.
44
Precisión
Para la determinación de la precisión del método, se realizó la extracción de los
polifenoles de la muestra de mora liofilizada C4E3R1 con seis repeticiones, siguiendo el
proceso de extracción especificado en el punto 3.3.2.2.2 de la presente investigación.
Posteriormente, se realizó la cuantificación utilizando la curva de calibración
previamente validada, los resultados de este ensayo se presentan en la Tabla 4-3.
Tabla 4-3. Resultados del ensayo de repetibilidad del método de análisis para
polifenoles totales en mora
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
El análisis de polifenoles totales realizado en la muestra de mora con seis
repeticiones presenta valores de coeficiente de variación de 4,84 %, estos resultados son
inferiores a los referenciales obtenidos en el gráfico de la ecuación de Horwitz, para el
nivel de concentración medido (mg.g-1), el mismo que indica que la variación máxima
permitida a este nivel es del 8 %. (Figura 3-2). Estos resultados demostraron que el
método garantiza una precisión adecuada.
Flavonoides totales.
Linealidad
Para el estudio de linealidad se realizó una curva de calibración por triplicado en
tres días diferentes, utilizando (+)-catequina como estándar en concentraciones de 0 a
100mg.L-1, a partir de una solución madre de 100mg (+)-catequina.L-1. En la Tabla 4-4
se presenta los resultados promedios de la absorbancia para cada concentración medida.
45
Tabla 4-4. Resultados promedio de la señal instrumental y la concentración medida
para el método de flavonoides totales
Elaborado por: Cabrera, Ana; Camacho, Diana y Novoa, Tania (2019)
En función de los resultados se realizó un gráfico de la concentración de
flavonoides totales (mg.L-1) vs la absorbancia promedio. Figura 4-3.
Figura 4-3: Curva de calibración promedio para la cuantificación de los flavonoides totales en mora
Elaborado por: Cabrera, Ana; Camacho, Diana y Novoa, Tania (2019)
En la Figura 4-3, se muestra una tendencia lineal de la curva de calibración, cuyo
coeficiente de correlación lineal (r) de 0,9989 establece que existe una alta correlación
lineal entre la señal instrumental y la concentración, lo cual indica que el equipo presenta
una buena resolución para ese análisis. En la Tabla 4-5, se presenta los resultados del
estudio de regresión lineal realizada con la curva de calibración promedio, la misma que
se utilizará para la cuantificación del contenido de flavonoides totales en los cuatro
cultivares de mora.
46
Tabla 4-5. Resultados del análisis de regresión lineal para la curva de calibración del
contenido de flavonoides totales
Elaborado por: Cabrera, Ana; Camacho, Diana y Novoa, Tania (2019)
El análisis estadístico de prueba t de student permitió reportar un valor de t
obtenido (43,3239) superior al valor de t teórico calculado (2,5706), lo cual demuestra
que existe una alta correlación lineal significativa entre la absorbancia y la concentración
del estándar de catequina (al 95 % de confianza).
Con base a los resultados del análisis de regresión lineal para la curva de
calibración promedio, se estableció que las magnitudes de la pendiente (m) toma un valor
de 0,0022 L.mg-1 y de la ordenada al origen (Lo) de 0,0725; de igual manera los valores
de la desviación estándar de la pendiente (Sm) y de la ordenada al origen (SLo) fueron
de 0,0001 L.mg-1 y 0,0031; respectivamente. Mediante estas desviaciones estándar para
el intercepto y la pendiente se determinó los límites de confianza para cada uno de ellos,
estableciéndose que la pendiente puede estar en un rango de 0,0021 a 0,0024 L.mg-1 y el
intercepto en el rango de 0,0645 a 0,0805 con un nivel de confianza del 95 %. El error
típico (Sy, x) en la curva de calibración fue de 0,0051, valor que corresponde a la
incertidumbre de la medición en las curvas de calibración.
Exactitud
Este ensayo se llevó a cabo con la muestra C4E3R1 y cada ciclo de extracción se
realizó siguiendo el proceso de extracción especificado en el punto 3.3.2.2.2 de la
presente investigación. Consecutivamente, en cada extracto se cuantificó el contenido de
flavonoides totales. Los resultados de este análisis se presentan en la Figura 4-4.
47
Figura 4-4: Porcentaje de extracción de flavonoides totales por ciclo de extracción, en mora
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
En función a los resultados obtenidos en el ensayo de recuperación se estableció
que se necesitan cinco ciclos de extracción para obtener el 100 % de recuperación de los
flavonoides de la muestra liofilizada de mora.
Precisión
Para el ensayo se utilizó la muestra liofilizada de mora C4E3R1 con seis
repeticiones y cada ciclo de extracción se realizó siguiendo el proceso de extracción
especificado en el punto 3.3.2.2.2 de la presente investigación. En función del método
propuesto para flavonoides totales; los resultados se presentan en la Tabla 4-6.
Tabla 4-6. Resultados del ensayo de repetibilidad del método de análisis para
flavonoides totales en mora
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
48
El análisis de flavonoides totales, realizado en la muestra de mora con seis
repeticiones, presenta un coeficiente de variación del 6,13 %, valor inferior comparado
con el referencial obtenido en la ecuación de Horwitz (Figura 3-2), el mismo que
establece que la variación máxima permitida para el nivel de concentración medido
(mg.g-1) es del 8%. Los resultados demostraron que el método presenta una precisión
adecuada.
Capacidad antioxidante por el método de decoloración del catión 2,2-
azinobis (3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS•+)
En el proceso de adaptación del metodo ABTS se incluyeron los ensayos:
Linealidad
Para el estudio de linealidad se realizó una curva de calibración por triplicado por
tres días diferentes, utilizando trolox como estándar en concentraciones de 0 a 600 µmol
trolox.L-1, a partir de una solución madre de 2000 µmol trolox.L-1. En la Tabla 4-7 se
presenta los promedios de los resultados de absorbancia para cada concentración medida
en los días respectivos.
Tabla 4-7. Resultados promedio de la señal instrumental y la concentración medida
para el método ABTS
Elaborado por: Cabrera, Ana; Camacho, Diana y Novoa, Tania (2019)
En función de los resultados presentados en la Tabla 4-7, se realizó un gráfico del
promedio de la concentración de la capacidad antioxidante medida en equivalente trolox
(µmol.L-1) vs la absorbancia promedio. Figura 4-5.
49
Figura 4-5: Curva de calibración promedio para la cuantificación de la capacidad antioxidante (método
ABTS) en mora
Elaborado por: Cabrera, Ana; Camacho, Diana y Novoa, Tania (2019)
La Figura 4-5, resalta una tendencia lineal de la curva de calibración, cuyo
coeficiente de correlación lineal (r) de 0,9996 establece que existe una alta correlación
lineal entre la señal instrumental y la concentración, la misma que está relacionada con
la resolución del equipo. En la Tabla 4-8, se presenta los resultados del estudio de
regresión lineal realizada con la curva de calibración promedio, la misma que se utilizó
para la cuantificación de la capacidad antioxidante en los cuatro cultivares de mora.
Tabla 4-8. Resultados del análisis de regresión lineal para la curva de calibración de la
capacidad antioxidante mediante ABTS
Elaborado por: Cabrera, Ana; Camacho, Diana y Novoa, Tania (2019)
El análisis estadístico de prueba t de student para el coeficiente de correlación
lineal r, resaltó un valor de t obtenido (56,4997) superior al valor de t teórico calculado
(2,7764), estableciendo que, a un nivel de confianza del 95 %, existe una alta correlación
lineal entre la absorbancia y la concentración del estándar trolox.
50
En función de los resultados del análisis de regresión lineal para la curva de
calibración promedio, se estableció que las magnitudes de la pendiente (m) toma un valor
de 0,0014 L.µmol-1 y de la ordenada al origen (Lo) de 0,0838; de igual manera los valores
de la desviación estándar de la pendiente (Sm) y de la ordenada al origen (SLo) fueron
de 0,00003 L.µmol-1 y 0,0117; respectivamente. Mediante estas desviaciones estándar
para el intercepto y la pendiente se determinó los límites de confianza para cada uno de
ellos, estableciéndose que la pendiente puede estar en un rango de 0,0013 a 0,0015
L.µmol-1 y el intercepto (ordenada al origen) en el rango de 0,0514 a 0,1162 con un nivel
de confianza del 95 %. El error típico (Sy, x) en la curva de calibración fue de 0,0146.
Exactitud
El ensayo de exactitud se desarrolló con la muestra de mora liofilizada C4E3R1 y
cada ciclo de extracción se realizó siguiendo el proceso de extracción especificado en el
punto 3.3.2.2.2. de la presente investigación. Posteriormente, en cada extracto se
cuantificó la capacidad antioxidante, cuyos resultados se presentan en la Figura 4-6.
Figura 4-6: Porcentaje de extracción de la capacidad antioxidante (método ABTS) por ciclo de
extracción, en mora
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
A partir de los resultados obtenidos en el ensayo de recuperación, se determinó
que se requiere cinco ciclos de extracción para obtener el 100 % de recuperación de los
antioxidantes de la muestra liofilizada de mora.
Precisión
La precisión del método se determinó a partir de un ensayo de repetibilidad; para
lo cual se evaluó la capacidad antioxidante de la muestra de mora liofilizada C4E3R1 con
seis repeticiones. Cada ciclo de extracción se realizó siguiendo el proceso de extracción
51
especificado en el punto 3.3.2.2.2 de la presente investigación. Los resultados de este
ensayo se presentan en la Tabla 4-9.
Tabla 4-9. Resultados del ensayo de repetibilidad del método de análisis para
capacidad antioxidante (método ABTS) en mora
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
El análisis de la capacidad antioxidante por el método ABTS, realizado en la
muestra de mora con seis repeticiones, presenta un coeficiente de variación del 5,30 %,
por su parte, la ecuación de Horwitz (Figura 3-2) resalta que la variación máxima
permitida para el nivel de concentración medido (µmol.g-1) es del 16 %; por consiguiente,
al presentar un coeficiente de variación inferior al máximo establecido por la referencia,
se deduce que el método garantiza que los datos obtenidos son precisos.
Capacidad antioxidante por el método del Poder de Reducción del Hierro
Férrico (FRAP).
Linealidad
La determinación de la linealidad del método de análisis, se realizó mediante una
curva de calibración por triplicado en tres días diferentes, utilizando trolox como estándar
en concentraciones de 0 a 700 µmol trolox.L-1, a partir de una solución madre de 2000
µmol trolox.L-1. En la Tabla 4-10, se presenta los promedios de los resultados de la
absorbancia para cada concentración medida en los días respectivos.
52
Tabla 4-10. Resultados promedio de la señal instrumental y la concentración medida
para el método FRAP
Elaborado por: Cabrera, Ana; Camacho, Diana y Novoa, Tania (2019)
En función de los resultados presentados en la Tabla 4-10, se realizó un gráfico
del promedio de la concentración de la capacidad antioxidante medida en equivalente
trolox (µmol.L-1) vs la absorbancia promedio. Figura 4-7.
Figura 4-7: Curva de calibración promedio para la cuantificación de la capacidad antioxidante (método
FRAP), en mora
Elaborado por: Cabrera, Ana; Camacho, Diana y Novoa, Tania (2019)
La Figura 4-7, determina una buena resolución del equipo con respecto al análisis,
evidenciado en la tendencia lineal de la curva de calibración, cuyo coeficiente de
correlación lineal (r) de 0,9972 establece que existe una alta correlación lineal entre la
señal instrumental y la concentración. En la Tabla 4-11, se presenta los resultados del
estudio de regresión lineal realizado para la curva de calibración promedio, la misma que
se utilizó para la cuantificación de la capacidad antioxidante (método FRAP) en los
cuatro cultivares de mora.
53
Tabla 4-11. Resultados del análisis de regresión lineal para la curva de calibración de
la capacidad antioxidante mediante FRAP
Elaborado por: Cabrera, Ana; Camacho, Diana y Novoa, Tania (2019)
En el análisis estadístico de prueba t de student para el coeficiente de correlación
lineal, el valor de t obtenido (22,4499) fue superior al valor de t teórico calculado
(2,5706), estableciendo que a un nivel de confianza del 95 %, existe una alta correlación
lineal r entre la absorbancia y la concentración del estándar trolox.
A partir de los resultados del análisis de regresión lineal para la curva de
calibración promedio, se estableció que las magnitudes de la pendiente (m) toma un valor
de 0,0014 L.µmol-1 y de la ordenada al origen (Lo) de 0,1524; de igual manera los valores
de la desviación estándar de la pendiente (Sm) y de la ordenada al origen (SLo) fueron
de 0,0001 L.µmol-1 y 0,0272; respectivamente. En función de las desviaciones estándar
obtenidas para el intercepto (ordenada al origen) y la pendiente, se determinó los límites
de confianza para cada uno de ellos; estableciéndose que la pendiente puede estar en un
rango de 0,0012 a 0,0015 L.µmol-1 y el intercepto en el rango de 0,0825 a 0,2223 con un
nivel de confianza del 95 %. El error típico (Sy, x) en la curva de calibración fue de
0,0360; valor que corresponde a la incertidumbre de la medición por curva de calibración.
Exactitud
La exactitud del método se reportó como porcentaje de recuperación. Cada ciclo
de extracción de la muestra C4E3R1 incluyó el procedimiento descrito en el punto
3.3.2.2.2 de la presente investigación. Posteriormente, en cada extracto se cuantificó la
capacidad antioxidante por el método FRAP, cuyos resultados se presentan en la Figura
4-8.
54
Figura 4-8: Porcentaje de extracción de la capacidad antioxidante (método FRAP) por ciclo de
extracción, en mora
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
En función de los resultados obtenidos en el ensayo de recuperación, se estableció
que se requieren cinco ciclos de extracción de los antioxidantes en una muestra liofilizada
de mora, para obtener el 100 % de recuperación.
Precisión
Para el ensayo de precisión se realizó la extracción de los antioxidantes de la
muestra C4E3R1 con seis repeticiones, los resultados de este ensayo se presentan en la
Tabla 4-12.
Tabla 4-12. Resultados del ensayo de repetibilidad del método de análisis para
capacidad antioxidante (método FRAP) en mora
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
El análisis de la capacidad antioxidante por el método FRAP, realizado en la
muestra de mora con seis repeticiones, presenta un coeficiente de variación del 7,85 %,
55
valor inferior comparado con el referencial obtenido en la ecuación de Horwitz (Figura
3-2), el mismo que establece que la variación máxima permitida para el nivel de
concentración medido (µmol trolox.g-1) es del 16 %. Los resultados demostraron que el
método presenta una precisión adecuada.
Antocianinas totales.
La confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos del análisis de
antocianinas totales se garantizó mediante el proceso de adaptación, en el cual se incluyó
ensayos de precisión y exactitud. Los respectivos ensayos para antocianinas totales se
realizaron a partir del método de pH diferencial, estableciéndose los resultados como mg
cianidina-3-glucósido.100g-1.
Exactitud
El ensayo de exactitud del método se reportó como porcentaje de recuperación,
en donde se estableció el número de ciclos de extracción necesarios para obtener el mayor
porcentaje de recuperación de antocianinas totales en la muestra de mora C4E3R1. Los
resultados de este estudio se presentan en la Figura 4-9.
Figura 4-9: Porcentaje de extracción de antocianinas totales por ciclo de extracción, en mora
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
En función de los resultados obtenidos en el ensayo de recuperación, se estableció
que se necesitan siete ciclos de extracción para obtener el 100 % de recuperación de
antocianinas totales de una muestra liofilizada de mora.
56
Precisión
Para la determinación de la precisión del método, se realizó un ensayo de
repetibilidad, para lo cual se determinó el contenido total de antocianinas en la muestra
liofilizada de mora C4E3R1 con seis repeticiones. Los resultados de este ensayo se
presentan en la Tabla 4-13.
Tabla 4-13. Resultados del ensayo de repetibilidad del método de análisis para
antocianinas totales en mora
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
El análisis de antocianinas totales realizado en la muestra de mora con seis
repeticiones, presenta un coeficiente de variación del 3.53 %, valor inferior comparado
con el referencial obtenido en la ecuación de Horwitz (Figura 3-2), el mismo que
establece que la variación máxima permitida para el nivel de concentración medido (mg
cianidina-3-glucósido.g-1) es del 8 %. Los resultados demostraron que el método presenta
una precisión adecuada.
Fase II: Evaluación de las propiedades físico-químicas y funcionales de los frutos
de cuatro cultivares de mora en tres estados de madurez
Etapa I: Caracterización físico-química de frutos de los cuatro cultivares de
mora en tres estados de madurez.
Caracterización química: Sólidos solubles y acidez titulable.
Dentro de esta etapa, con la finalidad de establecer el índice de madurez de frutos
de las muestras de cada cultivar de mora tomadas para el estudio, se evaluó el contenido
de sólidos solubles (° Brix) y la acidez titulable. Los resultados de estos análisis se
presentan en la Tabla 4-14.
57
Tabla 4-14. Caracterización química de los cuatro cultivares de mora (Rubus sp.)
*Media reportada en base fresca ± desviación estándar (n=3).
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
Observando los resultados de la Tabla 4-14, se estableció que el contenido de
sólidos solubles se incrementa conforme cambia el color de cubrimiento de amarillo a
morado, lo cual se relaciona directamente con el incremento del índice de madurez, por
lo cual, con base a los resultados obtenidos se determina que a medida que aumenta el
estado de madurez también aumenta el contenido de azúcares y disminuye la acidez en
los frutos de cuatro cultivares estudiados.
Con la información obtenida se determinó que, según el estado de madurez los
azúcares aumentan en 3,49; 4,77; 5,95 y 6,18° Brix para mora Brazos, Colombiana,
Andimora y Castilla, respectivamente. Por otro lado, la acidez disminuye en 2,09; 1,99;
1,16 y 1,98 % para la mora de Castilla, Andimora, Colombiana y Brazos,
respectivamente. Resultados que se relacionan con lo realizado por Farinango (2010)
para la fruta en diferentes estados de madurez, donde los sólidos solubles de la mora
Brazos aumentó en 2,62° Brix y la mora de Castilla en 3,52° Brix; mientras que la acidez
disminuyó en 0,85 % y en 2,05 % para Brazos y Castilla, respectivamente.
El análisis de varianza ANOVA de los resultados a un nivel de confianza del 95
%, permitió establecer que existe un efecto del estado de madurez sobre el contenido de
azúcares y acidez titulable (p<0,05), (ver Anexo 3 y 4, respectivamente).
58
La prueba simultánea de Tukey permitió agrupar los resultados numéricamente,
en donde los números diferentes implican diferencia significativa. La prueba realizada
para el contenido de sólidos solubles (Anexo 5), demostró que existe diferencia
significativa en el contenido de azúcares entre los tres estados de madurez; no obstante,
al 100 % de viraje del color de cubrimiento (E3) la mora de Castilla y Andimora no
presentaron diferencia significativa. Al 25 % y 50% no se evidencian diferencias
significativas en el contenido de azúcares entre cultivares, a su vez, todos los cultivares
reflejan un bajo contenido de sólidos solubles (de 6,08 ± 0,075 a 6,32 ± 0,135° Brix).
De igual manera, el análisis de varianza ANOVA al 95 % de confianza para la
variable acidez titulable (Anexo 6), estableció que existe un efecto del estado de madurez
sobre la acidez (p<0,05), lo que corrobora que este parámetro disminuye en función de
la maduración. La prueba de Tukey para separación de medias permitió establecer que
en el estado E1 (25 %) la mora de Castilla y Andimora presentaron el mayor contenido
de acidez (5,28 ± 0,15 y 4,95 ± 0,26 %, respectivamente), mientras que en el estado E3
(100 %), la mora Colombiana y Brazos el menor contenido (2,82 ± 0,11 y 1,58 ± 0,03,
respectivamente).
Considerando los requisitos físico-químicos en la madurez de consumo (100% de
viraje del color de cubrimiento) de la mora de Castilla y la mora tipo Brazos,
especificados en la Norma NTE INEN 2427:2016; se estableció que estos cultivares
cumplen con el límite mínimo de sólidos solubles totales, el cual es de 9,0 y 7,0° Brix,
respectivamente. El límite máximo de acidez titulable en la norma, en función del estado
de madurez comestible es del 2,70 % para Castilla y 2,1 % para Brazos. La mora Brazos
se encuentra dentro límite máximo permitido, mientras que la mora de Castilla supera
ligeramente el valor referencial de la norma.
Los parámetros físico-químicos obtenidos en este estudio para la variedad INIAP
Andimora, son comparables con los resultados obtenidos por Brito et al. (2013), quienes
reportaron que durante la maduración de esta fruta los sólidos solubles se incrementan
hasta 12,60° Brix, mientras que la acidez disminuye hasta 2,62 % de ácido cítrico.
En la Figura 4-10, se presenta la correlación que existe entre el estado de madurez
al que se cosechó la fruta (definido por el viraje del color de cubrimiento) y el índice de
madurez calculado en función de los análisis de laboratorio (relación SS/AT), cuyos
resultados se reportaron en la Tabla 4-14. Este análisis se realizó con la finalidad de
cuantificar el estado de madurez (definido como una medida cualitativa).
59
Figura 4-10: Relación entre el estado de madurez subjetivo y el índice de madurez calculado, en cuatro
cultivares de mora
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
Los coeficientes de correlación (r) obtenidos varían entre 0,9890; 0,9942; 0,9866
y 0,9946 para los cultivares Brazos, Colombiana, Castilla y Andimora, respectivamente;
lo que confirma que existe una alta correlación entre el porcentaje de viraje del color de
cubrimiento y el índice de madurez calculado.
Caracterización física: Color.
En la Tabla 4-15, se presentan los resultados del análisis de color por el método
colorimétrico CIELab, en pulpa liofilizada de cada uno de los frutos de cuatro cultivares
de mora en los tres estados de madurez. El diagrama del Anexo 7 facilita la comprensión
del espacio de color establecido por los parámetros cromáticos L, a*, b*.
R² = 0,9781
R² = 0,9884
R² = 0,9893
R² = 0,9734
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
0 25 50 75 100 125
Ind
ice
Mad
ure
z (S
S/A
T)
Estado de Madurez (% color de cubrimiento)
C1 Brazos
C2 Colombiana
C3 Castilla
C4 Andimora-2013
Lineal (C1 Brazos)
Lineal (C2 Colombiana)
Lineal (C3 Castilla)
Lineal (C4 Andimora-2013)
60
Tabla 4-15. Caracterización del color de los cuatro cultivares de mora (Rubus sp.)
Media ± desviación estándar (n=3), en muestra liofilizada. Los parámetros cromáticos L, a* y b* son
adimensionales
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
A partir de las coordenadas cromáticas L, a*, b* obtenidas en el análisis de color,
se realizó un gráfico tridimensional, en donde los ejes del plano X, Y, Z representan las
coordenadas cromáticas (Figura 4-11), en el mismo se evidencia la distribución espacial
de las muestras de los cuatro cultivares en función de su color y el estado de madurez.
Figura 4-11: Representación 3D del color de los frutos de cuatro cultivares de mora en tres estados de
madurez
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
61
En la Figura 4-11, Los valores de L (Luminosidad) definen la intensidad del color
de la muestra, en este caso, se determinó que la luminosidad de la pulpa de la fruta tiende
a disminuir conforme se incrementa su maduración. El color pasa de una tendencia
amarilla en el estado E1 (25 %) a una tonalidad rojiza en el estado E2 (50 %) y terminar
con un tono morado en el estado de madurez E3 (100 %), en concordancia con lo
mencionado por Tosun, Ustun y Tekguler (2008). Estos resultados confirman que el
estado de madurez de las muestras está relacionado con el color de la fruta, mientras
avanza el proceso de maduración se tiende a producir una coloración rojiza hasta morada.
De igual manera, confirma los estudios realizados por Llerena (2014), en los
cuales se indica que existe una correlación entre el color y el contenido de compuestos
funcionales, puesto que a medida que se pierde el color verde atribuido a la degradación
de la estructura de la clorofila, se produce la biosíntesis de pigmentos como los
carotenoides y antocianinas que confieren coloraciones anaranjadas, rojas y violetas
(Wills, McGlasson, Graham y Joyce, 2007).
Etapa II: Evaluación de los compuestos funcionales y capacidad
antioxidante de frutos de los cuatro cultivares de mora en tres estados de
madurez.
Se evaluó el contenido total de polifenoles, flavonoides, antocianinas y capacidad
antioxidante mediante espectrofotometría UV/VIS, por su parte la evaluación de
vitamina C se realizó por reflectometría.
Caracterización del contenido de polifenoles totales, flavonoides totales y
antocianinas.
En la Tabla 4-16, se presentan los resultados promedio del contenido total de
polifenoles, flavonoides y antocianinas en los frutos de cuatro cultivares de mora por
cada estado de madurez.
62
Tabla 4-16. Compuestos funcionales en cuatro cultivares de mora (Rubus sp.)
*Media reportada en base seca ± desviación estándar (n=3).
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
4.2.2.1.1. Polifenoles totales.
En función de los resultados presentados en la Tabla 4-16, se estableció que
durante el proceso de maduración el contenido de polifenoles totales decrece en un 38,37
%; 44,29 %; 19,45 % y 39,57 % para mora Brazos, Colombiana, Castilla y Andimora,
respectivamente (Figura 4-12).
Figura 4-12: Evolución del contenido de polifenoles totales en función del estado de madurez en mora
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
0 25 50 75 100 125
PT
(m
g á
cid
o g
álic
o.g
-1)
Estado de madurez (% de color de cubrimiento)
Brazos
Colombiana
Castilla
Andimora
63
La representación gráfica de los datos obtenidos permitió demostrar que, en los
frutos de cuatro cultivares de mora, el contenido de polifenoles tiende a disminuir
significativamente desde el estado de madurez E1 (25 %) hasta el E2 (50 %),
permaneciendo casi constante entre el estado E2 (50 %) y E3 (100 %). Lo cual se genera
como consecuencia de las reacciones bioquímicas en la fruta, dado que los ácidos
fenólicos son más abundantes en las primeras fases del desarrollo de la fruta, es decir, en
las frutas verdes (Primo, 1998).
En el estado E3 (100 %) el contenido de polifenoles totales fue de 31,59 ± 1,03;
45,18 ± 0,97; 44,68 ± 2,28 y 46,19 ± 1,02 mg ác. gálico.g-1 para mora Brazos,
Colombiana, Castilla y Andimora, respectivamente. Para el cultivar de Castilla, los
resultados son bajos con relación a los reportados por Vasco, Ruales y Kamal-eldin
(2008) de 21,67 mg ác.gálico.g-1 en base húmeda (correspondiente a 182,87 mg
ác.gálico.g-1 en base seca); así como para los obtenidos por W. Llerena, Samaniego,
Ramos y Brito (2014) de 63,52 mg ác.gálico.g-1 en base seca. No obstante, los resultados
obtenidos en esta investigación son superiores a los determinados por Garzón, Riedl y
Schwartz (2009) de 24,81 mg ác.gálico.g-1 en base seca.
De igual manera, para la mora Brazos y Castilla, Farinango (2010) analizó el
contenido de polifenoles por grado de madurez según la tabla de color del ICONTEC,
estableciendo que existe un descenso del contenido de polifenoles totales para la mora
Brazos de 69,37 a 54,21 y de 94,11 a 64,19 mg ác.gálico.g-1 para Castilla, lo cual difiere
con la disminución reportada para el cultivar Brazos de 51,26 a 31,59 y de 55,47 a 44,68
mg ác.gálico.g-1 para la mora de Castilla.
El análisis de varianza ANOVA de los resultados estableció que existe un efecto
del estado de madurez y del cultivar sobre el contenido de polifenoles totales (p<0,05)
(Anexo 8), confirmando que el contenido promedio de polifenoles varía en función de
los diferentes estados de madurez y el cultivar, por lo tanto, los resultados muestran las
diferencias que pueden encontrarse en el mismo género Rubus y que pueden asociarse
con las características genéticas de cada cultivar y las condiciones post-cosecha (Bernal
et al., 2014).
Los resultados de la prueba de Tukey (α = 0,05) reportados en el Anexo 9,
demostraron que existe diferencia significativa en el contenido de polifenoles totales en
función del estado de madurez y el tipo de cultivar de mora. El mayor contenido de
polifenoles, para los cuatro cultivares de mora, se manifiesta en el estado de madurez E1
(25 %), en donde no existe diferencia significativa entre los cultivares Colombiana y
Andimora, así como entre la mora de Castilla y Brazos; siendo la mora Colombiana el
cultivar con mayor contenido de polifenoles totales (81,096 ± 4,44 mg ác.gálico.g-1),
seguida de la INIAP Andimora (76,43 ± 3,98 mg ác.gálico.g-1), mora de Castilla (55,47
± 1,34 mg ác.gálico.g-1) y Brazos (51,26 ± 2,46 mg ác.gálico.g-1), al 25% de color de
cubrimiento.
64
4.2.2.1.2. Flavonoides totales.
Los resultados que se ilustran en la Figura 4-13, establecieron que el contenido
de flavonoides totales disminuye durante el proceso de maduración, al igual que los
polifenoles. Estos antioxidantes decrecen en un 41,71 %; 35,77 %; 9,65 % y 24,30 %
para mora Brazos, Colombiana, Castilla y Andimora, respectivamente.
Figura 4-13: Evolución del contenido de flavonoides totales en función del estado de madurez en mora
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
Los resultados obtenidos permitieron determinar que los flavonoides tienden a
disminuir en una menor proporción en comparación con los polifenoles, a su vez se
encuentran en menor concentración puesto que son parte de los polifenoles y su
contenido varía en función de su estado de madurez y el tipo de cultivar; confirmando
estudios reportados por Häkkinen (2000), en los cuales se indica que la acumulación de
compuestos fenólicos varía notablemente en función del estado fisiológico de la fruta,
como consecuencia del equilibrio entre la biosíntesis y el metabolismo. De igual forma,
la variación del contenido fenólico entre especies de un mismo género está vinculado con
el tipo de variedad o cultivar, condiciones de crecimiento y el estado de madurez.
El análisis de varianza ANOVA al 95 % de confianza, estableció que existe un
efecto del estado de madurez y el cultivar sobre el contenido de flavonoides totales
(p<0,05) (Anexo 10). Siendo congruente con lo mencionado en numerosas
investigaciones, donde se confirma que las concentraciones de compuestos fenólicos son
generalmente más altas en tejidos jóvenes de las frutas, es decir, en sus primeras fases de
desarrollo o maduración (Häkkinen, 2000).
La prueba de Tukey (α = 0,05) reportada en el Anexo 11, permitió establecer que
el contenido promedio de flavonoides en el estado de madurez E1 (25 %) es mayor,
sobresaliendo la mora Colombiana con una concentración de 19,15 ± 0,77, seguida de la
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
0 25 50 75 100 125
FT
(m
g c
ateq
uin
a.g
-1)
Estado de madurez (% viraje de color de cubrimiento)
Brazos
Colombiana
Castilla
Andimora
65
Andimora con 14,20 ± 0,79, Brazos con 13,76 ± 0,11 y Castilla con 11,19 ± 0,94 mg (+)-
catequina.g-1.
4.2.2.1.3. Antocianinas totales.
En la Figura 4-14, se presentan los resultados del contenido promedio de
antocianinas totales en función del estado de madurez para los cuatro cultivares de mora.
Figura 4-14: Evolución del contenido de antocianinas totales en función del estado de madurez en mora
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
La representación gráfica para los frutos de cuatro cultivares de mora, permitió
determinar que el contenido de antocianinas se incrementa en función del estado de
madurez. Estos resultados confirman estudios reportados por Häkkinen (2000), en los
cuales se indica que este tipo de biomoléculas se sintetizan durante la maduración, como
consecuencia de la biosíntesis e inactivación de los compuestos fenólicos; para el caso
de frutos rojos se incrementa el contenido de estos compuestos fenólicos debido a la
acumulación de las antocianinas al final de su estado de madurez,
El análisis de varianza ANOVA al 95 % de confianza, estableció que existe un
efecto del estado de madurez y el tipo de cultivar sobre el contenido de antocianinas
totales (p<0,05) (Anexo 12). Confirmando que el contenido promedio de antocianinas
totales incrementa de 67,56 a 863,89 mg cianidina-3-glucósido.100g-1 para la mora
Brazos, de 140,22 a 1226,44 mg.100g-1 para la mora Colombiana, de 102,32 a 1089,70
mg.100g-1 para la mora de Castilla y de 111,40 a 926,53 mg.100g-1 para la INIAP
Andimora.
La prueba de Tukey (α = 0,05) reportada en el Anexo 13, permitió determinar que
en el estado E3 (100 %) el contenido de antocianinas totales es mayor que en el estado E2
(50 %) y E1 (25 %), de igual manera se estableció que en el estado de madurez E3 (100%),
0,00
200,00
400,00
600,00
800,00
1000,00
1200,00
1400,00
0 25 50 75 100 125AC
(m
g c
ianid
ina-
3-g
lucó
sid
o.1
00
g-1
)
Estado de madurez (% viraje de color de cubrimiento)
Brazo
Colombiana
Castilla
Andimora
66
el contenido promedio de este tipo de biomoléculas es mayor en la mora Colombiana y
la mora de Castilla (1226,44±53,05 y 1089,70±104,23 mg cianidina-3-glucósido.100g-1,
respectivamente). En comparación con lo reportado por otros investigadores, la
concentración de antocianinas es superior a la obtenida por Garzón et al. (2009) de 45 ±
7.07 mg cianidina-3-glucósido.100g-1 en base fresa (correspondiente a 379,75 mg
cianidina-3-glucósido.100g-1 en base seca) para la mora Andina (Rubus glaucus Benth).
Por otro lado, el cultivar INIAP Andimora en el estado E3 (100 %) demostró una
concentración total de antocianinas de 926,53 ± 28,81 mg cianidina-3-glucósido.100g-1,
resultado inferior al reportado por W. Llerena et al. (2014) de 1416,69 ± 158,71 mg
cianidina-3-glucósido.100g-1 en base seca para dicho cultivar.
Adicionalmente, para la mora Brazos y Castilla, Farinango (2010) analizó el
contenido de antocianinas por grado de madurez según la tabla de color del ICONTEC,
estableciendo que existe un aumento del contenido de antocianinas para la mora Brazos
de 54,65 a 340,30 mg cianidina-3-glucósido.100g-1 y de 120,93 a 603,14 mg cianidina-
3-glucósido.100g-1 para Castilla, lo cual es inferior a los valores obtenidos en la presente
investigación para estos cultivares, especificados en la Tabla 4-16.
Evaluación de la capacidad antioxidante y vitamina C.
En la Tabla 4-17, se observan los datos resultantes de la evaluación de la
capacidad antioxidante por dos diferentes métodos de análisis (ABTS y FRAP); así como
el contenido de vitamina C en los cuatro cultivares de mora por estado de madurez.
67
Tabla 4-17. Capacidad antioxidante y vitamina C de los frutos de cuatro cultivares de
mora (Rubus sp.) por estado de madurez
*Media reportada en base seca ± desviación estándar (n=3).
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
4.2.2.2.1. Capacidad antioxidante mediante el ensayo ABTS.
Los resultados presentados en la Tabla 4-17, establecieron que la capacidad
antioxidante determinada mediante el ensayo ABTS disminuye con la maduración de la
fruta. El método ABTS se ha utilizado ampliamente para evaluar la capacidad
antioxidante total, tanto en sistemas acuosos como lipofílicos, teniendo en cuenta que el
efecto de la actividad antioxidante depende de la solubilidad de los antioxidantes (W.
Huang, Zhang, Liu y Li, 2012).
En función del estado de madurez, la capacidad antioxidante por este método
decrece en un 45,38 %; 54,44 %; 6,18 % y 36,21 % para mora Brazos, Colombiana,
Castilla y Andimora, respectivamente. Los resultados se ilustran en la figura 4-15.
68
Figura 4-15: Evolución de la capacidad antioxidante (ensayo ABTS) en función del estado de madurez
en mora
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
La representación gráfica permitió determinar que la capacidad antioxidante
disminuye durante la maduración en los frutos de cuatro cultivares de mora, no obstante,
la tendencia con la que disminuye es diferente, resultados corroborados por Garzón et al.
(2009), quienes señalan que los factores como la variedad, condiciones de crecimiento,
madurez, almacenamiento, entre otros, podrían influir en el contenido de polifenoles,
antocianinas y capacidad antioxidante.
Häkkinen (2000), manifiesta que el contenido fenólico total disminuye
progresivamente en la mora y la frambuesa conforme la fruta madura. Lo cual puede
contribuir al hecho de que la capacidad antioxidante está relacionada no solo al contenido
de antocianinas sino a otros ácidos fenólicos que disminuyen con la maduración.
El análisis de varianza ANOVA al 95 % de confianza, estableció que existe un
efecto del estado de madurez y el tipo de cultivar de mora sobre la capacidad antioxidante
(p<0,05) (Anexo 14). Durante la maduración de la fruta, la actividad antioxidante
disminuye de 630,61 a 344,42 µmol.g-1 para la mora Brazos, de 1278,63 a 582,59 µmol.g-
1 para la mora Colombiana, de 701,62 a 658,28 µmol.g-1 para la mora de Castilla y de
929,30 a 592,76 µmol.g-1 para la INIAP Andimora. La mora Colombiana y la INIAP
Andimora fueron los cultivares con mayor capacidad antioxidante en el estado E1 (25 %)
con 1278,63 ± 141,14 µmol trolox.g-1 y 929,30 ± 40,95 µmol trolox.g-1, respectivamente.
La prueba de Tukey (α = 0,05) reportada en el Anexo 15, indica que el valor
promedio de la capacidad antioxidante para mora Colombiana presentó diferencia
significativa entre todos los estados de madurez, mientras que la Andimora solo presentó
diferencia significativa entre el estado E1 (25 %) frente al estado E2 (50 %) y E3 (100 %)
y la mora Brazos no presentó diferencia significativa entre el estado E1 (25 %) y E2 (50
%), pero sí frente al estado E3 (100 %).
0,00
200,00
400,00
600,00
800,00
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1200,00
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0 25 50 75 100 125
AB
TS
(um
ol
Tro
lox•g
-1)
Estado de madurez (% viraje de color de cubrimiento)
Brazos
Colombiana
Castilla
Andimora
69
En un estudio realizado por Vasco et al. (2008), se reportó la capacidad
antioxidante de 5,5 mmol.100g-1 en base fresca, correspondiente a 464,1 µmol trolox.g-1
en base seca para la mora de Castilla (Rubus glaucus Benth) en su estado de madurez
comestible; el resultado es inferior al obtenido para la mora de Castilla (658,28 ± 31,30
µmol.g-1), Colombiana (582,59 ± 23,45 µmol.g-1) e INIAP Andimora (592,76 ± 25,37
µmol.g-1) en el estado E3 (100 %).
Adicionalmente, para la mora Brazos y Castilla, Farinango (2010) analizó la
capacidad antioxidante por grado de madurez según la tabla de color del ICONTEC,
confirmando que existe un descenso de la actividad antioxidante para la mora Brazos de
711,91 a 531,62 µmol trolox.g-1 y de 762,02 a 559,25 µmol trolox.g-1 para Castilla, lo
cual es similar a los valores obtenidos en la presente investigación, especificados en la
Tabla 4-17.
4.2.2.2.2. Capacidad antioxidante mediante el ensayo FRAP.
En la Figura 4-16, se presenta los resultados del análisis de la capacidad
antioxidante por el método FRAP para los cuatro cultivares de mora en sus diferentes
estados de madurez.
Figura 4-16: Evolución de la capacidad antioxidante (ensayo FRAP) en función del estado de madurez
en mora.
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
La representación gráfica de los resultados permitió determinar que la capacidad
antioxidante por el ensayo FRAP disminuye durante la maduración en los cuatro
cultivares de mora, al igual que lo obtenido por el ensayo ABTS. En función del estado
de madurez, la capacidad antioxidante decrece en un 52,81%; 56,16%; 28,90% y 41,70%
para la mora Brazos, Colombiana, Castilla y Andimora, respectivamente.
0,00
200,00
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600,00
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0 25 50 75 100 125
FR
AP
(um
ol
TE
•g-1
)
Estado de madurez (% viraje de color de cubrimiento)
Brazos
Colombiana
Castilla
Andimora
70
El análisis de varianza ANOVA al 95 % de confianza, estableció que existe un
efecto del estado de madurez y el tipo de cultivar de mora sobre la capacidad antioxidante
(p<0,05) (Anexo 16). Durante la maduración, la actividad antioxidante disminuye de
717,13 a 338,43 µmol.g-1 en la mora Brazos, 1284,55 a 563,08 µmol.g-1 para la mora
Colombiana, de 771,05 a 548,23 µmol.g-1 para la mora de Castilla y de 1124,22 a 655,43
µmol.g-1 para la INIAP Andimora.
La prueba de Tukey (α = 0,05) reportada en el Anexo 17, indica que en el estado
de madurez E1 (25 %) los cuatro cultivares contienen una mayor capacidad antioxidante,
la misma que disminuye progresivamente conforme madura la fruta. En el estado E1
(25%) existe diferencia significativa entre los cultivares Colombiana y Andimora, con
excepción de la mora de Castilla y Brazos. En el estado de madurez E2 (50 %) y E3
(100%) se determinó un decrecimiento de la actividad antioxidante con respecto al estado
E1 (25 %), en donde, para ambos casos, solo la mora Brazos demuestra diferencia
significativa con respecto a los demás cultivares. Al 25 % de color de cubrimiento, la
mora Colombiana y la INIAP Andimora presentaron una mayor capacidad antioxidante
de 1284,55 ± 62,79 µmol trolox.g-1 y de 1124,22 ± 60,33 µmol trolox.g-1,
respectivamente, similar a lo reportado por el ensayo ABTS.
En un estudio sobre los compuestos fenólicos totales y la capacidad antioxidante
de las principales frutas del Ecuador, Vasco et al. (2008) determinó una capacidad
antioxidante de 6,2 mmol trolox.100g-1 en base fresca (correspondiente a 523,21 µmol
trolox.g-1 en base seca) para la mora de Castilla (R. glaucus Benth) en su estado de
madurez comestible, valor similar a los obtenidos en la presente investigación para el
estado E3 (100 %), para la mora de Castilla (548,23 ± 45,29 µmol trolox.g-1) y
Colombiana (563,08 ± 6,48 µmol trolox.g-1) e inferior al obtenido para la INIAP
Andimora (655,43 ± 29,17 µmol trolox.g-1).
4.2.2.2.3. Vitamina C.
Los resultados presentados en la Figura 4-17, establecieron que la concentración
de vitamina C, expresada en mg ác. ascórbico.100g-1, varía durante el proceso de
maduración.
71
Figura 4-17: Evolución de Vitamina C en función del estado de madurez en mora
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
La representación gráfica de los resultados permitió establecer que el contenido
de vitamina C disminuye en los primeros estados de madurez, entre el estado E1 (25 %)
y E2 (50 %) y posteriormente aumenta entre el estado E2 (50 %) y E3 (100 %). Primo
(1998), manifiesta que a pesar de que se han citado muchas excepciones, las proporciones
más elevadas de ácido ascórbico en los frutos se encuentran antes de su completa
maduración, lo que se confirma con los resultados reportados en la presente
investigación.
El análisis de varianza ANOVA al 95 % de confianza, estableció que existe un
efecto del estado de madurez y el tipo de cultivar de mora sobre la concentración de
vitamina C (p<0,05) (Anexo 18). Durante la maduración, el contenido de ácido ascórbico
disminuye de 107,69 a 92,96 mg ác. ascórbico.100g-1 para la mora Brazos, de 158,49 a
131,96 mg ác. ascórbico.100g-1 para la mora Colombiana, de 140,18 a 139,39 mg ác.
ascórbico.100g-1 para la mora de Castilla y de 147,10 a 138,53 mg ác. ascórbico.100g-1
para la INIAP Andimora.
La prueba de Tukey (α = 0,05) reportada en el Anexo 19, indica que en el estado
de madurez E1 (25 %) de frutos de los cuatro cultivares presentaron un mayor contenido
de vitamina C, la misma que disminuye en el estado de madurez E3 (100 %). En el estado
E1 (25 %) existe diferencia significativa entre el cultivar Brazos y los demás cultivares;
por su parte, la mora Colombiana y la INIAP Andimora no reportaron diferencia
significativa frente a la mora de Castilla. En el estado de madurez E2 (50 %) y E3 (100
%) se determinó que solo la mora Brazos presentó diferencia significativa frente a los
demás cultivares y a su vez representa al cultivar con menor concentración de ácido
ascórbico.
0,00
20,00
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60,00
80,00
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Vit
. C
(m
g á
c. a
scó
rbic
o•1
00
g-1
)
Estado de madurez (% viraje de color de cubrimiento)
Brazos
Colombiana
Castilla
Andimora
72
En un estudio relacionado con la mora Andina (Rubus glaucus Benth), Garzón et
al. (2009), reportó un contenido de vitamina C de 10,1 ± 1,42 mg ác. ascórbico.100g-1
(correspondiente a 85,23 mg.100g-1 en base seca) en la mora madura, mientras que W.
Llerena et al. (2014) determinó una cantidad de 100,49 ± 11,19 mg ác. ascórbico.100g-1
en base seca para la INIAP Andimora; resultados que son inferiores a los reportados en
la Tabla 4-17 de esta investigación.
73
CAPÍTULO V
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Conclusiones
• Al evaluar los parámetros del color, sólidos solubles y acidez titulable de la pulpa
de frutos de cuatro cultivares de mora en tres estados de madurez, se determinó
que a medida que aumenta el estado de madurez se incrementa el contenido de
sólidos solubles y disminuye la acidez para los cuatro cultivares de mora.
• La correlación entre el estado de madurez (viraje del color de cubrimiento) y el
índice de madurez, aseguró que las muestras se analizaron en las condiciones de
madurez requeridas para el estudio de la evolución de los compuestos
funcionales.
• Los parámetros del color de la pulpa evaluados por el método colorimétrico CIE
L, a*b, determinaron que para cada estado de madurez E1 (25 %), E2 (50 %) y E3
(100 %), los frutos de los cuatro cultivares de mora tienden al color amarillo (a*),
rojo (a*) y morado (b*), respectivamente.
• En la adaptación de las metodologías, los análisis presentaron una excelente
linealidad determinada por el coeficiente de correlación lineal (r) de 0,9999;
0,9989; 0,9996 y 0,9972, para el contenido total de polifenoles, flavonoides,
ABTS y FRAP, respectivamente. El ensayo de exactitud estableció que se
necesitan cinco ciclos de extracción para obtener el 100 % de recuperación de los
compuestos funcionales y los antioxidantes en la muestra de mora. Además, se
determinó que los métodos presentaron una acertada precisión, debido a que
según las concentraciones medidas se obtuvo un coeficiente de variación de
4,84% para polifenoles totales (mg ác.gálico.g-1); 6,13 % para flavonoides totales
(mg (+)-catequina.g-1); 3,53 % para antocianinas totales (mg cianidina-3-
glucósido.100g-1); para capacidad antioxidante ABTS y FRAP (µmol trolox.g-1)
de 5,13 % y 7,85 %, respectivamente.
• Partiendo del estado de madurez E1 (25 %) al estado E3 (100 %), el contenido
total de polifenoles, flavonoides y capacidad antioxidante decrece, los cuatro
cultivares presentaron una mayor concentración de compuestos funcionales y
capacidad antioxidante en el estado de madurez E1 (25 %), donde se reportó que
el contenido promedio de polifenoles por cultivar de mora disminuye en el
siguiente orden Colombiana>INIAP Andimora>Castilla>Brazos; con respecto a
los flavonoides totales el decrecimiento sucede de la siguiente manera
Colombiana>INIAP Andimora>Brazos>Castilla, en relación a la capacidad
74
antioxidante la disminución ocurre en el orden siguiente
Colombiana>Andimora>Castilla >Brazos en los dos métodos.
• El contenido total de antocianinas durante la maduración aumenta en el estado E3
para cada cultivar de mora en el siguiente orden
Colombiana>Castilla>Andimora>Brazos; alcanzando una mayor concentración
para la mora Colombiana y Castilla con 1226,44 ± 53,05 y 1089,70 ± 104,23 mg
cianidina-3-glucósido.100g-1, respectivamente.
• La concentración de vitamina C disminuye entre el estado E1 (25 %) y E2 (50 %),
aumentando entre el estado E2 (50 %) y E3 (100 %), demostrándose que en el
estado E1 los frutos de los cuatro cultivares de mora presentaron un elevado
contenido de vitamina C, el mismo que disminuye en el siguiente orden
Colombiana>Andimora>Castilla>Brazos.
• Se estableció los cambios que existen durante la maduración de la fruta de mora
en función de los parámetros del color y el contenido de compuestos funcionales,
determinándose que los más significativos se relacionan con la disminución de
los polifenoles, así como de la capacidad antioxidante y el aumento de
antocianinas, relacionadas con el color morado característico en el estado de
madurez E3.
• Los frutos de cuatro cultivares de mora presentaron un mayor contenido de
polifenoles, flavonoides, vitamina C y capacidad antioxidante en el estado E1,
destacándose la mora Colombiana con 81,10 ± 4,44 mg ác. gálico.g-1 para
polifenoles, 19,15 ± 0,77 mg (+)-catequina.g-1 para flavonoides y 158,49 ± 2,11
mg ác ascórbico.100g-1 para vitamina C; seguida de la INIAP Andimora con
76,43 ± 3,98 mg ác.gálico.g-1, 14,20 ± 0,79 mg(+)-catequina.g-1 y 147,10 ± 1,77
mg ác ascórbico.100g-1.
• Los frutos de los cultivares de mora que destacaron por su elevada capacidad
antioxidante son la mora Colombiana con 1278,63 ± 141,14 y 1284,55 ± 62,79
µmol trolox.g-1, seguida de la INIAP Andimora con 929,30 ± 40,95 y 1124,22 ±
60,33 µmol trolox.g-1 para ABTS y FRAP, respectivamente.
• El análisis de varianza ANOVA (95 %), permitió determinar que existe un efecto
del tipo de cultivar y el estado de madurez sobre el perfil de compuestos
funcionales, donde la actividad antioxidante está atribuida no solo al contenido
de antocianinas sino a otros compuestos fenólicos.
75
Recomendaciones
• Se recomienda evaluar los compuestos funcionales y la capacidad antioxidante
de la mora desde la primera fase de maduración, en donde las drupas de la fruta
sean totalmente verdes, con un 0 % de viraje de color de cubrimiento, con la
finalidad de profundizar la investigación.
• Realizar un estudio sobre la identificación y la biodisponibilidad del compuesto
fenólicos que le confieren una alta capacidad antioxidante a la mora en su estado
de madurez al 25 % de viraje del color de cubrimiento.
• Es importante estudiar la estabilidad de los compuestos funcionales y la
capacidad antioxidante durante diferentes épocas de cosecha, para establecer si
existen diferencias debido a las condiciones ambientales, períodos de cosecha o
el manejo agronómico en las variedades comerciales de mora.
76
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80
ANEXOS
Anexo 1: Árbol de Problemas
Anexo 2: Caracterización de variables
Variables independientes: Cultivares de mora (Rubus sp.) y estados de madurez de
cosecha
81
Variables dependientes: Concentración de compuestos funcionales y características
fisicoquímicas
82
Anexo 3: Análisis de varianza del contenido de sólidos solubles en cuatro cultivares de
mora (Rubus sp.) en tres estados de madurez
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
Anexo 4: Análisis de varianza de la acidez titulable en cuatro cultivares de mora (Rubus
sp.) en tres estados de madurez
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
Anexo 5: Prueba de significancia de Tukey para el contenido de sólidos solubles en
cuatro cultivares de mora (Rubus sp.) en tres estados de madurez
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
83
Anexo 6: Prueba de significancia de Tukey para la acidez titulable en cuatro cultivares
de mora (Rubus sp.) en tres estados de madurez
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
Anexo 7: Coordenadas cromáticas empleadas en el método CIE L*a*b*
Fuente: (Konica Minolta, 2002)
84
Anexo 8: Análisis de varianza de polifenoles totales en cuatro cultivares de mora (Rubus
sp.) en tres estados de madurez
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
Anexo 9: Prueba de significancia de Tukey para el contenido de polifenoles totales en
cuatro cultivares de mora (Rubus sp.) en tres estados de madurez
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
Anexo 10: Análisis de varianza de flavonoides totales en cuatro cultivares de mora
(Rubus sp.) en tres estados de madurez
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
85
Anexo 11: Prueba de significancia de Tukey para el contenido de flavonoides totales en
cuatro cultivares de mora (Rubus sp.) en tres estados de madurez
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
Anexo 12: Análisis de varianza de antocianinas totales en cuatro cultivares de mora
(Rubus sp.) en tres estados de madurez.
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
86
Anexo 13: Prueba de significancia de Tukey para el contenido de antocianinas totales en
cuatro cultivares de mora (Rubus sp.) en tres estados de madurez
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
Anexo 14: Análisis de varianza de la capacidad antioxidante (método ABTS) en cuatro
cultivares de mora (Rubus sp.) en tres estados de madurez
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
87
Anexo 15: Prueba de significancia de Tukey para la capacidad antioxidante (método
ABTS) en cuatro cultivares de mora (Rubus sp.) en tres estados de madurez
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
Anexo 16: Análisis de varianza de la capacidad antioxidante (método FRAP) en cuatro
cultivares de mora (Rubus sp.) en tres estados de madurez
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
88
Anexo 17: Prueba de significancia de Tukey para la capacidad antioxidante (método
ABTS) en cuatro cultivares de mora (Rubus sp.) en tres estados de madurez
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
Anexo 18: Análisis de varianza de la concentración de Vitamina C en cuatro cultivares
de mora (Rubus sp.) en tres estados de madurez
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
89
Anexo 19: Prueba de significancia de Tukey para la concentración de Vitamina C en
cuatro cultivares de mora (Rubus sp.) en tres estados de madurez
Elaborado por: Cabrera, Ana (2019)
90
Anexo 20: Fotografías de los cultivares de mora (Rubus sp.)
Fotografía 1: Mora Brazos (Rubus lanciniatus)
Fotografía 2: Mora Colombiana (Rubus glaucus Benth)
Fotografía 3: Mora de Castilla (Rubus glaucus Benth)
91
Fotografía 4: INIAP Andimora 2013 (Rubus glaucus Benth)
Anexo 21: Caracterización química de la mora (Rubus sp.)
Fotografía 1: Evaluación de sólidos solubles
De izq. a der. Muestra en el estado E1 (25%), refractómetro digital.
Fotografía 2: Evaluación de acidez titulable
De izq. a der: Muestras en el estado E1, E2 y E3, diluída en agua destilada para la
determinación de acidez titulable, titulación potenciométrica.
92
Anexo 21: Preparación de muestras para evaluacion del color, compuestos funcionales y
la capacidad antioxidante
Fotografía 1: Proceso de liofilización de las muestras
De izq. a der. Muestras congeladas y depositadas en recipientes de aluminio dentro del
liofilizador marca Freezstar.
Fotografía 2: Reducción de partícula
Fotografía 3: Envasado de las muestras
De izq. a der. Muestra liofilizada en el estado E1 (25%), E2 (50%) y E3 (100%)
Moler Tamizar
93
Fotografía 2: Evaluación del color de las muestras
De izq. a der. Calibración del colorímetro Color Tec-PCMTm. Muestra en caja Petri.
Se ejerce presión sobre la muestra para establecer una superficie lisa. Se ubica el
prisma sobre la superficie de la muestra para tomar la lecturas.
Anexo 22: Proceso de extracción de las muestras
Figura 1: Proceso de extracción con metanol al 70%
De izq. a der, empezando desde arriba. Muestra liofilizada y pesada en tubos de
centrifugación, homogenización en un vórtex Multimixer, agitación en baño
ultrasónico y centrifugación.
94
Figura 1: Muestras protegidas de la luz
De izq. a der. Muestras extraídas en el estado E1 (25 %), E2 (50 %) y E3 (100%),
muestras protegidas de la luz.
Anexo 23: Reacción colorimétrica obtenida en la metodología para compuestos
funcionales y la capacidad antioxidante.
Fotografía 1: Reacciones colorimétricas
Análisis de polifenoles totales Análisis de flavonoides totales
Ensayo ABTS: De izq. a der. Preparación
del ABTS•+ (abs: 1,1), reacción
colorimétrica.
Ensayo FRAP
95
Fotografía 2: Espectrofotómetro V-2600
Medición de los compuestos funcionales y la capacidad antioxidante en el
espectrofotómetro UV/VIS.
Anexo 24: Evaluación de antocianinas
Figura 1: Ultracentrifugación de las muestras extraídas
De izq. a der. Muestras protegidas de la luz, viales con muestra para el proceso de
ultracentrifugación, posterior a la extracción con buffer pH 1,0 y pH 4,5.
Figura 2: Lecturas en el espectrofotómetro V-2600
De izq. a der. Balones aforados con las muestras extraídas en las diferentes condiciones
de pH; muestras por triplicado analizadas por espectrofotometría UV/VIS.
96
Anexo 25: Evaluación de vitamina C
Figura 1: Preparación de muestras
De izq. a der. Peso de las muestras liofilizadas, dilución de muestras con ácido oxálico
al 1%.
Figura 2: Test del Ácido Ascórbico
Medición de vitamina C utilizando un reflectómetro RQ Flex 16970
97
Anexo 26: Validación de los instrumentos de recolección de datos para el análisis físico-
químico
98
Anexo 27: Validación de los instrumentos de recolección de datos para el análisis de
compuestos funcionales
99
Anexo 28: Informe de resultados obtenidos en el Laboratorio LSAIA del INIAP
100
