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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE QUÍMICA FARMACÉUTICA
Actividad antibacteriana y antioxidante del aceite esencial extraído del tronco y
corteza de la especie Handroanthus chrysanthus (Guayacán).
Proyecto de Investigación presentado como requisito previo a la obtención del título de:
QUÍMICA FARMACÉUTICA
AUTOR: Verónica Elizabeth Tovar Caisapanta
TUTOR: PhD. María Gabriela Leal Reverol
Quito, Abril 2018
ii
Dedicatoria
Dedicado a mi Madre por ser mi soporte y mi inspiración en cada paso que doy en mi
vida, por su apoyo incondicional y por haberme enseñado que no hay obstáculo que
impida alcanzar las metas propuestas.
iii
Agradecimiento
Quiero agradecer primeramente a Dios por sus bendiciones y por haberme dado la fuerza
necesaria de llegar hasta aquí, a mi Madre que siempre ha sido y será mi más grande
admiración, el motivo de ser mejor cada día, por estar conmigo en cada paso que doy y
por la confianza depositada en mí.
A toda mi familia, mis abuelitos, mis tías, mis primas, en especial a mi Tía Graciela que
ha sido un gran apoyo durante todo el transcurso de mi vida, y a mi hermano Jorge que
ha estado en cada situación difícil.
A Mauro por haber llegado a mi vida en el momento indicado, por ser mi amigo, mi
compañero y por ser esa personita que ha estado brindándome su apoyo y recordándome
lo lejos que puedo llegar, por los lindos momentos compartidos durante esta etapa.
A mi tutora Dra. Gabriela Leal por haberme permitido llevar a cabo este trabajo de
investigación y por el apoyo brindado para su realización. A mis maestros que nos han
sabido guiar durante toda nuestra formación profesional, a mis tribunales el MSc. Trosky
Yánez y sobre todo a la Dra. Dayana Borja por todo el apoyo brindado durante esta etapa.
A mis amig@s con los que compartí mi vida estudiantil, por haberme brindado siempre
su apoyo, en los buenos y malos momentos en especial a Jenny y Evelyn que han formado
parte de toda esta trayectoria.
Y finalmente a la Universidad Central del Ecuador, principalmente a la Facultad de
Ciencias Químicas que ha sido como mi segundo hogar.
iv
v
vi
vii
LUGAR DONDE SE REALIZÓ LA INVESTIGACIÓN
La investigación se llevó a cabo en las instalaciones de la Facultad de Ciencias
Químicas de la Universidad Central del Ecuador, en los laboratorios de éste
establecimiento como son: los laboratorios de Productos naturales, Microbiología y
Química Analítica y además en los laboratorios de Investigación de la Facultad de
Ingeniería Química de esta Universidad.
viii
Índice de contenidos
Introducción .................................................................................................................... 1
Capítulo I ......................................................................................................................... 3
1. El problema ............................................................................................................. 3
1.1. Planteamiento del problema ............................................................................. 3
1.2. Formulación del problema ................................................................................ 4
1.2.1. Preguntas de investigación ......................................................................... 4
1.3. Objetivos de la investigación ............................................................................ 5
1.3.1. Objetivo general. ........................................................................................ 5
1.3.2. Objetivos específicos. ................................................................................. 5
1.4. Importancia y justificación de la investigación ................................................ 5
Capítulo II ....................................................................................................................... 8
2. Marco teórico .......................................................................................................... 8
2.1. Antecedentes ..................................................................................................... 8
2.2. Fundamento teórico ........................................................................................ 10
2.2.1. Farmacognosia .............................................................................................. 10
2.2.2. Producto natural ............................................................................................ 10
2.2.3. Metabolitos primarios y secundarios ........................................................... 11
2.2.4. Aceites esenciales ......................................................................................... 12
2.2.4.1. Distribución de aceites esenciales ......................................................... 13
2.2.4.2. Composición química de los aceites esenciales .................................... 14
2.2.4.3. Rendimiento de aceites esenciales ......................................................... 14
2.2.4.4. Propiedades Organolépticas de los aceites esenciales. .......................... 15
2.2.4.5. Propiedades físicas de los aceites esenciales. ........................................ 15
2.2.5. Métodos de extracción de aceites esenciales. ............................................... 16
2.2.5.1. Destilación con agua o Hidrodestilación. .............................................. 16
2.2.5.2. Extracción por fluidos supercríticos ...................................................... 18
2.2.6. Propiedades Fitoterapéuticas de los aceites esenciales................................. 19
2.2.6.1. Actividad antibacteriana ........................................................................ 20
2.2.6.2. Actividad antioxidante ........................................................................... 24
2.2.7. Caracterización de aceites esenciales. .......................................................... 27
2.2.7.1. Tipos de análisis de aceites esenciales. ................................................. 28
2.2.8. Descripción botánica de Handroanthus chrysanthus (Guayacán). .............. 29
2.3. Fundamento legal ........................................................................................... 31
2.4. Hipótesis ......................................................................................................... 32
2.4.1. Hipótesis alternativa. (Hi) ........................................................................... 32
ix
2.4.2. Hipótesis Nula. (Ho) ................................................................................... 32
2.5. Sistema de variables ........................................................................................... 32
2.5.1. Etapa 1: Extracción del aceite ...................................................................... 32
2.5.1.1. Variable dependiente: ............................................................................ 33
2.5.1.2. Variable independiente .......................................................................... 33
2.5.2. Etapa 2: Caracterización del aceite ............................................................... 33
2.5.3. Etapa 3: Evaluación de actividad antibacteriana .......................................... 33
2.5.3.1. Variable dependiente: ............................................................................ 33
2.5.3.2. Variable independiente: ......................................................................... 33
2.5.3. Etapa 4: Evaluación de actividad antioxidante ............................................. 33
2.5.4.1. Variable dependiente ............................................................................. 33
2.5.4.2. Variable independiente .......................................................................... 33
Capítulo III: .................................................................................................................. 34
3. Marco metodológico ............................................................................................. 34
3.1. Diseño de la Investigación .............................................................................. 34
3.2. Población ........................................................................................................ 34
3.3. Muestra o materia prima ................................................................................. 35
3.4. Métodos .......................................................................................................... 35
3.4.1. Reactivos, materiales y equipos ................................................................. 35
3.4.2. Desarrollo experimental ............................................................................. 38
3.4.3. Parte procedimental .................................................................................... 39
3.4.3.1. Etapa I: Extracción del aceite esencial. .............................................. 39
3.4.3.2. Etapa II: Caracterización del aceite. ................................................... 43
3.4.3.3. Etapa III: Evaluación de la actividad antibacteriana .......................... 44
3.4.3.4. Etapa IV: Evaluación de la actividad antioxidante del aceite esencial48
3.5. Diseño experimental ....................................................................................... 50
3.5.1. Etapa I: Extracción del aceite ..................................................................... 50
3.5.1.1. Operacionalización de las Variables Etapa I. ................................. 51
3.5.1.2. Factores y dominio experimental de la etapa I. .................................. 51
3.5.1.3. Técnicas de análisis e interpretación de resultados ............................ 52
3.5.2. Etapa II: Caracterización del aceite. ........................................................... 52
3.5.3. Etapa III: Evaluación de la actividad antibacteriana del aceite esencial. ... 53
3.5.3.1. Operacionalización de las Variables Etapa III. .................................. 53
3.5.3.2. Factores y dominio experimental de la etapa III. ............................... 53
3.5.3.3. Técnicas de análisis e interpretación de resultados ............................ 54
3.5.4. Etapa IV: Evaluación actividad antioxidante del aceite ............................. 56
3.5.4.1. Operacionalización de las Variables Etapa IV ................................... 56
3.5.4.2. Factores y dominio experimental de la etapa IV. ............................... 57
3.5.4.3. Técnicas de análisis e interpretación de resultados ............................ 58
3.6. Técnicas e Instrumentos de Recolección de Datos (IRD). ............................. 58
x
Capítulo IV .................................................................................................................... 59
4. Análisis y discusión de resultados ....................................................................... 59
4.1. Etapa I: Extracción del aceite esencial ........................................................... 59
4.1.1. Control de calidad de la materia prima ....................................................... 59
4.1.2. Extracción por Hidrodestilación ................................................................. 60
4.1.3. Extracción con Fluidos supercríticos .......................................................... 62
4.2. Etapa II: Caracterización del aceite esencial .................................................. 64
4.2.1. Porcentaje de rendimiento .......................................................................... 64
4.2.2. Características organolépticas .................................................................... 65
4.2.3. Características físico-químicas ................................................................... 66
Índice de refracción ............................................................................ 66
4.3.2.2. Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas ........... 66
4.3. Etapa III: Evaluación de la actividad antibacteriana del aceite ...................... 73
4.3.1. Evaluación de la actividad antibacteriana en el aceite obtenido por
Hidrodestilación ..................................................................................................... 74
4.3.2. Evaluación de la actividad antibacteriana en el aceite obtenido por fluidos
supercríticos ............................................................................................................ 75
Análisis estadístico de actividad antibacteriana. ................................ 76
4.4. Etapa IV: Evaluación de la actividad antioxidante del aceite. ....................... 80
4.4.1. Evaluación del porcentaje de inhibición en el estándar de referencia Trolox.
80
Condiciones espectrofotométricas ...................................................... 80
4.4.2. Evaluación del porcentaje de inhibición en el Aceite obtenido por
Hidrodestilación ..................................................................................................... 83
4.4.3. Evaluación del porcentaje de inhibición en el Aceite obtenido con Fluidos
supercríticos ............................................................................................................ 85
4.4.4. Comparación del estándar de referencia Trolox y los aceites. ................... 87
4.4.5. Análisis estadístico de la actividad antioxidante ........................................ 89
Capítulo V ..................................................................................................................... 92
5. Conclusiones y Recomendaciones ....................................................................... 92
5.1. Conclusiones ................................................................................................... 92
5.2. Recomendaciones ........................................................................................... 93
6. Referencias ............................................................................................................ 94
7. Anexos .................................................................................................................. 101
xi
Índice de anexos
Anexo A: Árbol de problemas ...................................................................................... 101
Anexo B: Diagrama de flujo para la metodología realizada ........................................ 102
Anexo C: Categorización de variables ......................................................................... 104
Anexo D: Matriz de Operacionalización de Variables ................................................. 105
Anexo E: Instrumento de recolección de datos ............................................................ 107
Anexo F: Autorización de propiedad de la muestra ..................................................... 109
Anexo G: Certificación de la muestra .......................................................................... 110
Anexo H: Perfiles cromatograficos de las muestras de aceite ...................................... 111
Anexo I: Certificados de los reactivos utilizados. ........................................................ 113
Anexo J: Figuras de la experimentación por etapas ..................................................... 114
Índice de ecuaciones
Ecuación 2.1: Cálculo del porcentaje de inhibición ....................................................... 27
Ecuación 3.1: Cálculo del porcentaje de rendimiento .................................................... 43
Índice de figuras
Figura 2.1: Elementos básicos del metabolismo primario y secundario. ....................... 11
Figura 2.2: Aceites esenciales. ....................................................................................... 12
Figura 2.3: Equipo de clevenger empleado para la determinación del contenido de aceite
esencial. .................................................................................................................. 17
Figura 2.4: Diagrama esquemático del sistema de extracción de fluido supercrítico. (1)
bomba de CO2, (2) bomba modificadora, (3) celda de extracción, (4) celda de
fraccionamiento I, (5) celda de fraccionamiento II, (6) válvula. ............................ 18
Figura 2.5: Perforación de agar. ..................................................................................... 20
Figura 2.6: Placa para microdilución .............................................................................. 21
Figura 2.7: Staphylococcus aureus ................................................................................. 22
Figura 2.8: Pseudomonas aeruginosa ............................................................................ 23
Figura 2.9: Estructura química de la Ceftriaxona ........................................................... 23
Figura 2.10: Vitamina E y su análogo Trolox. ............................................................... 26
Figura 2.11: Reacción del 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH). ................................... 26
xii
Figura 2.12: Equipo Cromatografía de gases acoplado a Espectrometría de masas. ..... 29
Figura 2.13: Handroanthus chrysanthus ........................................................................ 31
Figura 3.1: Muestras de la especie Handroanthus chrysanthus ..................................... 39
Figura 3.2: Obtención de aserrín mediante máquina de aserradero ............................... 39
Figura 3.3: Secado y licuado de la muestra .................................................................... 40
Figura 3.4: Tamizaje de la muestra y pesaje de las fracciones ....................................... 41
Figura 3.5: Proceso de extracción por Hidrodestilación................................................. 41
Figura 3.6: Equipo de extracción con fluidos supercríticos ........................................... 42
Figura 3.7: Frascos preparados para Cromatografía de gases acoplado a espectrometría
de masas. ................................................................................................................. 44
Figura 3.8: Diluciones seriadas en la placa de microtitulación ...................................... 45
Figura 3.9: Concentraciones de los aceites ..................................................................... 45
Figura 3.10: Preparación del medio Mueller hinton ....................................................... 46
Figura 7.1: Aceites extraídos por los dos métodos ....................................................... 114
Figura 7.2: Equipo de CG-EM ..................................................................................... 114
Figura 7.3: Solubilidad del aceite obtenido por fluído y Microdilución en placa ........ 114
Figura 7.4: Halos de inhibición medidos frente a S. aureus y P. aeruginosa............... 115
Figura 7.5: Preparación de diluciones del estándar y aceites ....................................... 115
Figura 7.6: Agitación de los tubos y lectura de las absorbancias ................................. 115
Índice de tablas
Tabla 2-1: Partes de la planta utilizadas para extraer aceite esencial. ............................ 13
Tabla 2-2: Rendimientos según el estado de la planta.................................................... 15
Tabla 2-3: Métodos de extracción de aceite esencial. .................................................... 16
Tabla 2-4: Susceptibilidad antimicrobiana del control positivo, ceftriaxona ................. 24
Tabla 2-5: Susceptibilidad antimicrobiana de la Ceftriaxona frente a las diferentes cepas
bacterianas .............................................................................................................. 24
Tabla 2-6: Parámetros de caracterización de aceites esenciales. .................................... 27
Tabla 2-7: Jerarquía taxonómica .................................................................................... 29
Tabla 3-1: Reactivos ....................................................................................................... 35
Tabla 3-2: Materiales ...................................................................................................... 36
Tabla 3-3: Equipos ......................................................................................................... 37
Tabla 3-4: Parámetros de control de calidad de la materia prima de corteza de canela. 40
Tabla 3-5: Volúmenes para la curva de calibración con trolox ...................................... 49
Tabla 3-6: Volúmenes de las muestras de aceite. ........................................................... 49
Tabla 3-7 : Operacionalización de Variables Etapa I. .................................................... 51
Tabla 3-8: Factores y Niveles Experimentales de la etapa 1. ......................................... 51
Tabla 3-9: Tabla para recolección de datos de la etapa I................................................ 52
Tabla 3-10 : Operacionalización de Variables Etapa III. ............................................... 53
xiii
Tabla 3-11: Factores y Niveles Experimentales de la etapa III. ..................................... 54
Tabla 3-12: Tabla ANOVA para el modelo bifactorial con replicación. ....................... 55
Tabla 3-13: Operacionalización de Variables Etapa IV. ................................................ 56
Tabla 3-14. Factores y Niveles Experimentales de la etapa IV ...................................... 57
Tabla 3-15: Tabla para recolección de datos de la etapa IV. .......................................... 57
Tabla 3-16: Modelo univariante ..................................................................................... 58
Tabla 4-1: Parámetros de control de calidad de la materia prima del tronco y corteza de
Handroanthus crysanthus ....................................................................................... 59
Tabla 4-2: Miligramos de aceite esencial extraído por Hidrodestilación ....................... 61
Tabla 4-3: Miligramos de aceite esencial extraído con fluidos supercríticos. ................ 62
Tabla 4-4: Porcentaje de rendimiento de las muestras de aceite esencial ...................... 64
Tabla 4-5: Características organolépticas del aceite esencial extraído por
hidrodestilación. ..................................................................................................... 65
Tabla 4-6: Características organolépticas del aceite esencial extraído por fluidos
supercríticos ............................................................................................................ 65
Tabla 4-7: Determinación del índice de refracción ........................................................ 66
Tabla 4-8: Compuestos determinados por CG-EM en el aceite esencial extraído por
hidrodestilación ...................................................................................................... 67
Tabla 4-9: Compuestos determinados por CG-EM en el aceite esencial extraído por
fluidos supercríticos ................................................................................................ 70
Tabla 4-10: Concentración mínima inhibitoria de los aceites esenciales ....................... 73
Tabla 4-11: Halos de inhibición del aceite esencial obtenido por Hidrodestilación ...... 74
Tabla 4-12: Halos de inhibición del aceite esencial obtenido con Fluidos supercríticos 75
Tabla 4-13: Esquema de diseño experimental para comparación de factores ................ 76
Tabla 4-14: Análisis de varianza de dos factores ........................................................... 77
Tabla 4-15: Datos de la curva de calibración con Trolox............................................... 81
Tabla 4-16: Resultados del % de inhibición con el trolox .............................................. 82
Tabla 4-17: Resultados de absorbancias del aceite obtenido por hidrodestilación ........ 83
Tabla 4-18: Resultados del porcentaje de inhibición del aceite obtenido por
Hidrodestilación ..................................................................................................... 84
Tabla 4-19: Resultados de absorbancias del aceite obtenido con fluidos supercríticos . 85
Tabla 4-20: Resultados del porcentaje de inhibición del aceite obtenido con fluidos
supercríticos ............................................................................................................ 86
Tabla 4-21: Comparación de concentraciones ............................................................... 87
Tabla 4-22: Comparación de porcentajes de inhibición de los aceites y el estándar ..... 88
Tabla 4-23: Datos del porcentaje de inhibición de las fuentes de actividad antioxidante
................................................................................................................................ 89
Tabla 4-24: Análisis univariante..................................................................................... 89
xiv
Índice de gráficos
Gráfico 4.1: Barras de error de medias obtenidas del contenido de aceite esencial
extraído por hidrodestilación con los dos tamaños de partícula. ............................ 62
Gráfico 4.2: Barras de error de medias obtenidas del contenido de aceite esencial
extraído con fluidos supercríticos con los dos tamaños de partícula. ..................... 63
Gráfico 4.3: Gráfico de perfil entre las medias marginales de los halos de inhibición y
las cepas bacterianas ............................................................................................... 78
Gráfico 4.4: Gráfico de perfil entre las medias marginales de los halos de inhibición y
las concentraciones ................................................................................................. 78
Gráfico 4.5: Gráfico de perfil entre el halo de inhibición frente a la cepa y la
concentración .......................................................................................................... 79
Gráfico 4.6: Longitud de onda máxima para el estándar trolox ..................................... 80
Gráfico 4.7: Curva de calibración del estándar trolox .................................................... 81
Gráfico 4.8: Porcentaje de inhibición vs Volumen del trolox uL ................................... 82
Gráfico 4.9: Porcentaje de inhibición vs volumen de aceite uL. .................................... 84
Gráfico 4.10: Porcentaje de inhibición vs volumen de aceite uL ................................... 86
Gráfico 4.11: Comparación entre el estándar trolox y los aceites obtenidos ................. 88
Gráfico 4.13: Gráfico de perfil de medias marginales de los porcentajes de inhibición
frente a los aceites y el estándar ............................................................................. 90
Gráfico 4.14: Diagrama de barras de error del porcentaje de inhibición frente a los
aceites y el estándar de referencia. ......................................................................... 91
Gráfico 7.1: Perfil cromatográfico del aceite esencial con tamaño 0,5 mm por
hidrodestilación .................................................................................................... 111
Gráfico 7.2: Perfil cromatográfico del aceite esencial con tamaño 2,0 mm por
hidrodestilación .................................................................................................... 111
Gráfico 7.3: Perfil cromatográfico del aceite esencial con tamaño 0,5 mm por fluidos
supercríticos .......................................................................................................... 112
Gráfico 7.4: Perfil cromatográfico del aceite esencial con tamaño 2,0 mm por fluidos
supercríticos .......................................................................................................... 112
Gráfico 7.5: Certificado del reactivo estándar Trolox. ................................................. 113
Gráfico 7.6: Certificado del reactivo DPPH ................................................................. 113
xv
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE QUÍMICA FARMACÉUTICA
Tema: Actividad antibacteriana y antioxidante del aceite esencial extraído del
tronco y corteza de la especie Handroanthus chrysanthus (Guayacán).
AUTOR: Verónica Elizabeth Tovar Caisapanta
TUTOR: PhD. Maria Gabriela Leal
Resumen
El presente proyecto de investigación tuvo como propósito la evaluación de las
actividades antibacteriana y antioxidante del aceite esencial extraído del tronco y corteza
de la especie Handroanthus chrysanthus, el cual se realizó en cuatro etapas, en la primera
etapa se obtuvo el aceite esencial mediante extracción sólido-líquido por hidrodestilación
y extracción con fluidos supercríticos, en la segunda etapa se realizó la caracterización
del aceite mediante características organolépticas y ensayos físico-químicos, en la tercera
etapa se realizaron pruebas de solubilidad y con el mejor solvente se evaluó la actividad
antibacteriana mediante el método de difusión en agar por perforación frente a cepas de
Staphylococcus aureus (ATCC 25923) y Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), y en
la cuarta etapa se evaluó la actividad antioxidante mediante el método del radical DPPH,
al culminar con la investigación se concluye que el aceite obtenido por fluidos
supercríticos tuvo mejor rendimiento de extracción (88,1 ± 7,8 mg por cada 100 g de
muestra), así como también en su composición contiene esteroles como el stigmasterol,
además presenta actividad antibacteriana frente a Staphylococcus aureus (ATCC 25923)
a una concentración de 50mg/ml, por otra parte, los aceites esenciales extraídos por ambos
métodos no presentaron actividad antioxidante representativa.
Palabras clave: ACEITE ESENCIAL, Handroanthus chrysanthus, ACTIVIDAD,
ANTIBACTERIANA, ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE.
xvi
Antibacterial and antioxidant activity of the essential oil extracted from the trunk
and bark of the species Handroanthus chrysanthus (Guayacan).
Abstract
The purpose of this research project was to evaluate the antibacterial and antioxidant
activities of the essential oil extracted from the trunk and bark of the species
Handroanthus chrysanthus. This research was carried out in four stages. In the first stage,
the essential oil was obtained by a solid -liquid extraction using hydrodistillation and
extraction with supercritical fluids. In the second stage, the characterization of the oil was
executed through a process of organoleptic characteristics and physical-chemical tests. In
the third stage, solubility tests were made, and antibacterial activity was evaluated with
the best solvent through the method of diffusion in agar by perforation against strains of
Staphylococcus aureus (ATCC 25923) and Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853).
Finally, the antioxidant activity was evaluated by the DPPH radical method. To conclude,
this investigation determines that the oil obtained by supercritical fluids had a better
extraction performance (88.1 ± 7,8 mg per 100 g of sample), in the composition of oil
presents sterols as stigmasterol, the oil presents antibacterial activity against
Staphylococcus aureus (ATCC 25923) at a concentration of 50mg / ml, on the other hand,
the essential oils extracted by both methods did not show representative antioxidant
activity.
Key words: ESSENTIAL OIL, Handroanthus chrysanthus, ACTIVITY
ANTIBACTERIAL, ACTIVITY ANTIOXIDANT.
1
Introducción
En la presente investigación se evaluaron las actividades antibacteriana y
antioxidante en el aceite esencial que fue extraído del tronco y corteza de la especie
Handroanthus chrysanthus (Guayacán) mediante la extracción por hidrodestilación y por
fluidos supercríticos.
Con el pasar de los años la necesidad del hombre por curar enfermedades ha
permitido que se continúe haciendo uso de la medicina ancestral por su poder curativo,
en la actualidad se reconocen innumerables especies de plantas con fuentes de
compuestos biológicamente activos, entre ellos los aceites esenciales que por su
constitución de componentes químicos pueden brindar un aporte al desarrollo de la salud,
ya que encontrar fuentes naturales con posible actividad antibacteriana y antioxidante es
uno de los objetivos primordiales en investigaciones relacionadas, debido a la alta
resistencia a los antibacterianos y procesos oxidativos que afectan a la salud.
El primer capítulo describe el problema del proyecto de investigación, en el cual
se establece la importancia de las actividades antibacteriana y antioxidante en aceites
esenciales, su composición y el uso de la medicina ancestral a través de los años. Se
detallan los factores importantes que influyen en la calidad del aceite esencial como es la
identificación correcta de la especie. Una vez formulado el problema y establecidos los
objetivos, se indica la justificación e importancia del proyecto, esto con el fin de
establecer si el aceite esencial extraído del tronco y corteza de la especie Handroanthus
chrysanthus presenta actividad antibacteriana y antioxidante.
En el segundo capítulo se detallan las referencias bibliográficas en las cuales se
basa el fundamento teórico que permitió la aplicación del tema de investigación. Se
detallan la Farmacognosia, características químicas y físicas de los aceites esenciales, así
como también los métodos de extracción más usados y las técnicas de evaluación de
actividades antibacteriana y antioxidante.
2
En el tercer capítulo se planteó el diseño y la metodología de la investigación, con
lo cual se estableció el enfoque, el tipo y nivel. Se fijó la muestra, los materiales y los
equipos con los cuales se trabajó durante toda la investigación. Se desarrolló el diseño
experimental, la matriz de operacionalización de variables y el instrumento de recolección
de datos.
En el cuarto capítulo se analizó cuidadosamente todos los resultados obtenidos en
las diferentes etapas de investigación mediante cálculos, tablas y gráficos que permitan
una adecuada interpretación de los datos obtenidos durante toda la investigación.
En el quinto capítulo se establecen las conclusiones obtenidas con el desarrollo
experimental realizado, en el cual se específica que el aceite esencial obtenido por fluidos
supercríticos presenta actividad antibacteriana, así también se resumen los principales
resultados obtenidos en base a los objetivos y se plantean las respectivas
recomendaciones.
3
Capítulo I
1. El problema
1.1. Planteamiento del problema
El uso de la medicina ancestral durante años ha sido una alternativa para el
tratamiento de diversas molestias y terapias, su popularidad se mantiene debido a razones
históricas y culturales. Actualmente se reconocen innumerables especies de plantas con
fuentes de compuestos biológicamente activos, incrementando el interés científico de
obtener información acerca de propiedades fitoterapéuticas tales como: las actividades
antibacteriana y antioxidante.
Debido a que surge la resistencia a los antimicrobianos se considera una
problemática de interés en temas de salud pública a nivel mundial, en consecuencia, es
de gran importancia y reto de mayor índole la búsqueda de compuestos con actividad
antibacteriana, por lo cual se plantea el estudio de especies pertenecientes a la
biodiversidad ecuatoriana con potencial para el aislamiento de posibles antibióticos.
Diversos estudios realizados hasta la fecha como el reportado por Franco y colaboradores
(2013) indican que los extractos etanólicos obtenidos de dos especies del género Tabebuia
presentan actividad antiinflamatoria, antioxidante y antibacteriano, de ahí la alternativa
terapéutica del estudio en plantas pertenecientes a la familia Bignoniaceae. (Franco L,
Castro J, Ocampo Y, Pájaro I y Díaz F, 2013)
La especie Tabebuia chrysantha, actualmente denominada Handroanthus
chrysanthus, ampliamente diseminada en las regiones sub-tropicales del país, representa
una buena alternativa ya que ha sido poco estudiada tanto desde el punto de vista de sus
constituyentes como de sus actividades biológicas, el tronco y corteza por presentar
propiedades aromáticas.
Por otro lado, la oxidación celular y el estrés oxidativo están directamente
relacionados con la génesis de gran cantidad de patologías como aquellas provocadas por
4
el envejecimiento celular, daños genéticos que producen mutaciones y aceleran algunos
procesos de cáncer y la diabetes; daños cerebrales como la demencia senil, enfermedad
de Parkinson y Alzheimer, desarreglos inmunológicos y enfermedades autoinmunes. Por
lo que encontrar fuentes que contengan actividad antioxidante ayudaría a prevenir dichas
patologías debido a que pueden reaccionar con especies reactivas de oxígeno impidiendo
el daño oxidativo a componentes vitales tales como ADN o membranas de la célula.
(Hernandez, 2007)
Los aceites esenciales por su mezcla compleja de componentes como terpenos,
principalmente monoterpenos y sesquiterpenos, los fenilpropanoides y compuestos
alifáticos de cadena corta es que pueden cumplir diversas funciones en propiedades
terapéuticas (Cañigueral S y Vila R, 2007), sin embargo contienen principios volátiles
que pueden ser alterados durante su procesamiento por lo que la elección del método
adecuado para su extracción y el tratamiento inicial de la muestra es fundamental.
El estudio de la especie Handroanthus chrysanthus como fuente de aceite esencial
con posibles propiedades terapéuticas abre camino al desarrollo de productos como los
antibacterianos o antioxidantes que pueden aportar a un mejor tratamiento y calidad de
vida. Por lo cual proponer un tratamiento adecuado de las muestras fue prioridad para la
obtención de un aceite esencial ya que se pudo aplicar técnicas adecuadas para evaluar
las actividades antibacteriana y antioxidante.
1.2. Formulación del problema
¿El aceite esencial extraído del tronco y corteza de Handroanthus chrysanthus
presenta actividades antibacteriana y antioxidante.?
1.2.1. Preguntas de investigación
- ¿Cómo garantiza la calidad de la materia prima?
5
- ¿Con cuál de los métodos de extracción de aceite esencial utilizados se obtiene
mejor rendimiento y calidad?
- ¿Qué características y propiedades presenta el aceite esencial extraído del
tronco y corteza de la especie Handroanthus chrysanthus?
- ¿El aceite esencial extraído del tronco y corteza de la especie Handroanthus
chrysanthus presenta actividad antibacteriana?
- ¿El aceite esencial extraído del tronco y corteza de la especie Handroanthus
chrysanthus presenta actividad antioxidante?
1.3. Objetivos de la investigación
1.3.1. Objetivo general.
Evaluar la actividad antibacteriana y antioxidante del aceite esencial extraído del
tronco y corteza de la especie Handroanthus chrysanthus.
1.3.2. Objetivos específicos.
- Realizar un estudio de parámetros de calidad de la materia prima
- Extraer el aceite esencial del tronco y corteza de Handroanthus chrysanthus
mediante Hidrodestilación y Fluidos supercríticos.
- Caracterizar calidad y rendimiento de los aceites esenciales extraídos por
Hidrodestilación y Fluidos supercríticos
- Evaluar si el aceite esencial extraído del tronco y corteza de Handroanthus
chrysanthus presenta actividad antibacteriana
- Determinar si el aceite esencial extraído del tronco y corteza de Handroanthus
chrysanthus presenta actividad antioxidante.
1.4. Importancia y justificación de la investigación
“Los aceites esenciales son fracciones líquidas volátiles que contienen mezclas
complejas de varias sustancias químicas biosintetizadas por las plantas que dan el aroma
característico a flores, árboles, frutos, hierbas, especias, semillas y a productos de origen
animal” (Delgado J, Sánchez M y Bonilla C, 2016). La calidad final de los productos
fitoterápeuticos depende de factores importantes que van desde la identificación correcta
de la especie, el manejo del cultivo, la cosecha y el beneficio. En los últimos años, el
6
estudio de los aceites esenciales ha cobrado importancia debido a sus diferentes
aplicaciones terapéuticas, por lo que resulta, de gran interés en la aplicación industrial ya
sea en productos naturales o productos farmacéuticos.
Debido a la importancia que adquieren ciertos componentes presentes en los
aceites esenciales y a las diversas investigaciones del género Tabebuia en medicina
tradicional como el de Flores (2017) donde indica que la especie Tabebuia rosea conocida
también como “lapacho” presentó actividad antioxidante en el extracto etanólico por
medio del método de DPPH en cromatografía en capa fina, además, en un estudio
presentado por García y López (2015), indica que en el extracto acuoso de corteza interna
de Tabebuia rosea mostró poseer actividad antiinflamatoria y en el extracto metanólico
de hojas de Tabebuia. rosea presentó actividad anticancerígena y antioxidante. Por lo
anteriormente expuesto es que se planteó a Tabebuia chrysantha, actualmente
Handroanthus chrysanthus como especie de estudio ya que pertenece al mismo género.
(Flores, 2017)
A nivel mundial uno de los más altos desafíos es la resistencia que producen los
microorganismos a ciertos medicamentos antimicrobianos, por lo que encontrar fuentes
que contengan componentes con funcionalidades es un avance y un aporte al ámbito
industrial para la elaboración de productos naturales y productos farmacéuticos que
contengan beneficios y sean alternativas para diversos tratamientos, así como también
encontrar fuentes naturales de antioxidantes permitiría mejorar la calidad de vida y
prevenir el desarrollo de procesos oxidativos que es un problema para la salud debido a
que nuestro organismo tiene que soportar un exceso de radicales libres durante años.
(Avello, M y Suwalsky, M, 2006)
En la actualidad no se dispone de datos reales que denoten el valor de la difusión
del uso de las plantas o de los principios activos en los sistemas de salud correspondientes
a diferentes países. Sin embargo, la Organización Mundial de la Salud, estima que quizá
un 80% de la población mundial, principalmente de los países en vías de desarrollo, confía
en las medicinas tradicionales para solucionar las principales necesidades de la salud
7
(Mata R, 2012), por lo cual se puede afirmar que mayormente las terapias tienen como
base el uso de las plantas o de sus principios activos, debido a esto el estudio de
actividades antibacteriana y antioxidante en aceites esenciales resultó motivador e
innovador pues es un plus para el uso en diferentes aplicaciones del campo industrial.
Para obtener resultados satisfactorios en cuanto a la extracción del aceite esencial
y para poder evaluar mediante técnicas específicas las actividades antibacteriana y
antioxidante fue necesario un adecuado tratamiento de la materia prima certificada, así
como también la aplicación de métodos de extracción que favorecieron su rendimiento,
puesto que algunas sustancias son volátiles y pueden verse afectadas e interferir en las
técnicas evaluativas de la actividad biológica de dicho aceite.
El trabajo también se halla justificado porque forma parte de uno de los temas de
investigación de Proyectos Semilla III que se lleva a cabo en la Universidad Central del
Ecuador, con los docentes de la Facultad de Ciencias Químicas, docentes de otras
Facultades y sus alumnos.
8
Capítulo II
2. Marco teórico
2.1. Antecedentes
Se han reportado estudios en extractos etanólicos de la corteza de Tabebuia rosea
y Tabebuia ochracea, en los cuales se evidenció significativa actividad antiinflamatoria
y antioxidante, así como también ambas especies de Tabebuia presentaron importante
actividad antibacteriana frente a Staphylococcus aureus ATCC25923. (Franco L, Castro
J, Ocampo Y, Pájaro I y Díaz F, 2013) Lo que constituye un reporte que valida dichas
actividades en el uso popular de la medicina ancestral de las diferentes especies, así como
punto de partida para investigaciones en especies del mismo género como la Tabebuia
chrysantha, actualmente Handroanthus chrysanthus perteneciente a la familia
Bignoniaceae.
Según el estudio presentado por Ramírez y colaboradores (2013) la familia
Bignoniaceae se ha usado en la medicina tradicional para tratar úlceras, sífilis, problemas
gastrointestinales, candidiasis, cáncer, diabetes, prostatitis y alergias. La especie ha tenido
un uso tradicional en la zona cafetera como antiinfecciosa. El “taheebo” (producto
obtenido de la corteza de los árboles del género Tabebuia), es usado como astringente,
antiinflamatorio, antibacteriano, antifúngico y laxante, por lo cual es considerada como
una de las familias de interés para la investigación de actividades biológicas en sus
diferentes especies. (Ramirez A, Isaza G y Pérez J, 2013)
Existen varios estudios de la familia Bignoniaceae, entre ellas un estudio in vitro
de la actividad antiinflamatoria en diferentes extractos de n-butanol y cloroformo
obtenidos a partir de la corteza interna de la especie Tabebuia chrysantha mostrando
mayor actividad anti-inflamatoria en el extracto clorofórmico, por lo que Velazquez y
Posada (2013) recomiendan evaluar la actividad antioxidante y antibacteriana de los
extractos de Tabebuia chrysantha. (Velazquez S y Posada V., 2013)
9
En la investigación presentada por Pérez y colaboradores (2007) se evaluó la
actividad antibacteriana en extractos metanólico, clorofórmico y éter de petróleo de las
hojas de las especies Phenax rugosus y Tabebuia chrysantha frente a Staphylococcus
aureus, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Proteus vulgaris y Pseudomona
aeruginosa en el cual se evidenció leve actividad antibacteriana con los extractos
metanólicos de ambas plantas por lo que recomiendan el metanol como un solvente
adecuado para futuras investigaciones de estas plantas que busquen aislar sus principios
activos. (Pérez J, Isaza G y Acosta S, 2007)
La especie de Tabebuia chrysantha a través de sus investigaciones in vitro ha
presentado actividad antiinflamatoria, sin embargo hay pocos reportes desde el punto de
vista de sus componentes químicos responsables de diferentes actividades biológicas por
lo cual Jiménez (2016) llevó a cabo un estudio dentro del Grupo Polifenoles en la
Universidad Tecnológica de Pereira en la caracterización química del extracto
clorofórmico que permitió concluir que el extracto evaluado puede contener compuestos
como taninos, lactonas sesquiterpénicas, glicósidos cardiotónicos, alcaloides, saponinas
y posibles fenoles, sin embargo recomienda más estudios de caracterización en extractos
obtenidos de diferentes partes de la especie de Tabebuia chrysantha. (Jimenez, 2016)
Además, el estudio realizado por Flores (2017) en las hojas de la especie Tabebuia
rosea perteneciente a la familia Bignoniaceae, identificó por medio de tamizaje
fitoquímico en el extracto etanólico; flavonoides, antocianinas y saponinas, además este
mismo extracto etanólico presentó actividad antioxidante por medio del método de DPPH
en cromatografía en capa fina, lo cual son aportes considerables para el análisis de otras
especies y en diferentes partes de la planta. (Flores, 2017)
Por lo anteriormente expuesto fue importante el estudio del aceite esencial
extraído del tronco y corteza de la especie Handroanthus chrysanthus mediante métodos
de extracción por Hidrodestilación o con Fluidos supercríticos, así mismo la evaluación
de actividades antibacteriana y antioxidante que a futuro son de gran ayuda en el campo
industrial para nuevas alternativas antimicrobianas.
10
2.2. Fundamento teórico
2.2.1. Farmacognosia
Su etimología deriva de los vocablos griegos PHARMAKON (remedio) y
GNOSIS (conocimiento), por lo que la Farmacognosia es una ciencia multidisciplinaria
cuyo objetivo fundamental es el estudio de los productos naturales con propiedades
medicinales (Mata R, 2012).
La historia de la farmacognosia es incierta pues hace años una mezcla entre magia,
religión y una incipiente ciencia médica quedó en manos del llamado “chamán”,
conocedor de las propiedades curativas de las plantas, actualmente las áreas de la
investigación farmacognósica continúa ampliándose y ya se incluyen los aspectos de la
biología celular y molecular en relación con productos naturales, la etnobotánica, la
fitoterapia y fitoquímica entre otros (Hernández, A, 2002).
2.2.2. Producto natural
Es todo producto de origen orgánico o inorgánico, que se halle en la naturaleza y
que pueda ser aislado o procesado por el hombre. Este término no debe ser aplicado a
productos cuya estructura molecular haya sido modificada (Mata R, 2012).
La importancia de los productos naturales radica en la propia función biológica en
la que son biosintetizados. Sin lugar a duda los productos naturales son estructuras
biológicamente validadas a través de la co-evolución con el resto de los seres vivos. En
sentido amplio un producto natural está formado por todos los compuestos de la
naturaleza mientras que en sentido más restrictivo un producto natural sólo es un
metabolito secundario (Gutiérrez, A y Estevez A, 2009).
11
2.2.3. Metabolitos primarios y secundarios
El conjunto de reacciones químicas que tienen lugar en un organismo constituye
el metabolismo. La mayor parte del carbono, del nitrógeno y de la energía termina en
moléculas comunes a todas las células, necesarias para su funcionamiento y el de los
organismos. Se trata de aminoácidos, nucleótidos, azúcares y lípidos, presentes en todas
las plantas y desempeñando las mismas funciones. Se denominan metabolitos primarios
(Fig. 2.1). (Ávalos A y Pérez E, 2009)
Figura 2.1: Elementos básicos del metabolismo primario y secundario.
Fuente: (Ávalos A y Pérez E, 2009)
Los metabolitos secundarios además de no presentar una función definida en los
procesos fotosintéticos, respiratorios, asimilación de nutrientes, transporte de solutos o
síntesis de proteínas, carbohidratos o lípidos, difieren también de los metabolitos
primarios en que ciertos grupos presentan una distribución restringida en el reino vegetal,
es decir, no todos los metabolitos secundarios se encuentran en todos los grupos de
plantas. Se sintetizan en pequeñas cantidades y no de forma generalizada, es importante
destacar que también reciben la denominación de productos naturales y tienen un
importante y significativo valor medicinal y económico, derivado éste último de su uso
en la industria cosmética, alimentaria y farmacéutica. (Ávalos A y Pérez E, 2009)
Se agrupan en cuatro clases principales: (Ávalos A y Pérez E, 2009)
Terpenos: entre los que se encuentran hormonas, pigmentos o aceites esenciales.
Compuestos fenólicos: cumarinas, flavonoides, lignina y taninos.
12
Glicósidos: saponinas, glicósidos cardiacos, glicósidos cianogénicos y
glucosinolatos.
Alcaloides.
El grupo de los terpenos, como antes se menciona, incluye hormonas (giberelinas
y ácido abscísico), pigmentos carotenoides (carotenos y xantofilas), esteroles (ergosterol,
sitosterol, colesterol), derivados de los esteroles (glicósidos cardiacos), latex y aceites
esenciales (proporcionan el olor y el sabor característico de las plantas). Aunque las
citoquininas y las clorofilas no son terpenos, contienen en su estructura una cadena lateral
que es un terpeno. A la vista de esta variedad de compuestos, es evidente que muchos
terpenos tienen un importante valor fisiológico y comercial. (Ávalos A y Pérez E, 2009)
2.2.4. Aceites esenciales
Bruneton (2001) indica que en la 8va edición de la Farmacopea francesa (1965),
define a los aceites esenciales (esencias = aceites volátiles) (Fig. 2.2) como: “productos
de composición generalmente muy compleja que contienen los principios volátiles que se
encuentran en los vegetales más o menos modificados durante su preparación”.
Los aceites esenciales pueden almacenarse en todos los órganos vegetales como
hojas, flores, cortezas, leños, raíces y frutos, sin embargo aunque todos los órganos de
una misma especie tengan aceite esencial la composición de dicho aceite puede variar
según su localización. (Bruneton, J, 2001)
Figura 2.2: Aceites esenciales.
Fuente: (ECOVIDASANA, 2013)
13
Ávalo y Pérez (2009) mencionan que los aceites esenciales contienen terpenos,
éstos terpenoides son comercialmente interesantes por su uso como aromas y fragancias
en alimentación y cosmética, o por su importancia en la calidad de productos agrícolas.
Otros compuestos terpenoides tienen importancia medicinal por sus propiedades
anticarcinogénicas, antiulcerosas, antimalariales, antimicrobianas, etc.
2.2.4.1. Distribución de aceites esenciales
Los aceites esenciales se encuentran ampliamente distribuidos en unas 60 familias
de plantas entre las cuales se incluyen las Compuestas, Labiadas, Lauráceas, Mirtáceas,
Pináceas, Rosáceas, Rutáceas, Umbelíferas, etc. (Martinez A., 2003) Se les puede
encontrar en diferentes partes de la planta de las cuales se puede extraer aceite esencial
como se observa en la Tabla 2.1.
Tabla 2-1: Partes de la planta utilizadas para extraer aceite esencial.
Aceite esencial Parte de la planta utilizada
Ciprés, jara Ramas
Lavanda, lavandín Sumidades floridas
Menta, hierba limón, eneldo Planta entera
Geranio, petitgrain Hojas
Neroli, rosa, ylang, ylang Flor
Limón, naranja, mandarina Flavedo (capa externa del fruto)
Romero, tomillo, ajedrea, mejorana Planta entera con flor
Melisa Planta fresca
Abeto de Siberia Acículas
Manzanilla Flor seca
Canela Corteza
Cedro Madera
Lima Fruto entero
Clavo Botones florales
Vetiver Raíz
Mostaza Semillas
Fuente: (Ortuño, M, 2006)
14
2.2.4.2. Composición química de los aceites esenciales
Los aceites esenciales son mezclas complejas y muy variables de constituyentes
que pertenecen, de manera casi exclusiva, a dos grupos caracterizados por orígenes
biogenéticos distintos: el grupo de terpenoides, mono-sesquiterpenos, y compuestos
aromáticos derivados del fenilpropano, poco frecuente. (Bruneton, J, 2001) Aunque en
los aceites esenciales tanto los mono-, los sesquiterpenos y los fenilpropanos se les
encuentra en forma libre, más recientemente se han investigado los que están ligados a
carbohidratos, ya que se considera que son los precursores inmediatos del aceite como
tal. (Martinez A., 2003)
Los aceites esenciales dependiendo de su método de extracción pueden ser
extraídos acompañados de ceras o esteroles que son sustancias que se encuentran de forma
natural en el mundo animal (por ejemplo, colesterol, que es el principal y el más
importante), en el mundo vegetal (por ejemplo, sitosterol) y en hongos y levaduras (por
ejemplo, ergosterol), siendo el más abundante el sitosterol (o beta-sitosterol), seguido por
el campesterol y el estigmasterol. (Meco J, Fuster V y Alberich R, 2016)
2.2.4.3. Rendimiento de aceites esenciales
De una planta a otra el rendimiento de un aceite cambia mucho, puede variar desde
0,01% en flores de jazmín y rosa hasta el 4-6% en semillas de cilantro, anís o coriandro.
En promedio las plantas aromáticas herbáceas poseen de 0,5-2% de aceite esencial.(Tabla
2-2) Muchos factores inciden sobre la composición y el rendimiento de aceite esencial en
la planta entre los principales se encuentra la localización geo-climática, tipo de suelo,
estado de desarrollo de la planta e inclusive la hora de cosecha, entre otros. (Stashenko,
2009)
15
Tabla 2-2: Rendimientos según el estado de la planta.
Especie Rendimiento Estado de la
planta
poleo 1,5% Oreado
Orégano
romero
0,2%
0,6%
Fresca
fresca
romero 0,88% seca
albahaca 0,6% fresca
albahaca 1,11% seca
cedrón 1% seca
manzanilla 0,4% flores secas
Fuente: (Stashenko, 2009)
2.2.4.4. Propiedades Organolépticas de los aceites esenciales.
Estas propiedades se miden a través de análisis sobre las sensaciones que
producen, éste análisis sensorial parte de cuatro parámetros básicos tales como color, olor,
sabor y textura. El color es un indicador de las reacciones químicas que se producen, el
olor es considerada una de las más difíciles de definir y caracterizar ya que viene dada
por distintas sustancias volátiles presentes, bien de manera natural o procedente de su
procesado, el sabor es identificado por las papilas gustativas de la lengua que son capaces
de identificar sabores como dulce, salado, amargo y ácido, y la textura es una propiedad
que evalúan los estudios reológicos, que se centran en el análisis de aspectos como la
viscosidad, el grosor, la dureza o la rigidez. (Chavarrías, 2016)
2.2.4.5. Propiedades físicas de los aceites esenciales.
Los aceites esenciales se caracterizan por sus propiedades físicas como densidad,
viscosidad, índice de refracción y actividad óptica. Los aceites esenciales son líquidos a
temperatura ambiente, volátiles, lo que les diferencia de los aceites fijos, muy raramente
son coloreados. En general, su densidad es inferior a la del agua. Poseen un índice de
refracción elevado y la mayoría desvían la luz polarizada. Son liposolubles y solubles en
los disolventes orgánicos habituales. Aunque son muy poco solubles en agua pueden ser
arrastrados en el vapor de ella, sin embargo son solubles como para comunicarle un olor
neto (Bruneton, J, 2001).
16
2.2.5. Métodos de extracción de aceites esenciales.
Bruneton (2001) indica que los aceites esenciales se consideran mezclas
complejas de sustancias orgánicas volátiles, de origen vegetal, que en su mayoría se
obtienen por destilación, sin embargo, menciona que en la norma AFNOR NF T 75-006
(febrero 1998) un aceite esencial es un producto obtenido a partir de una materia prima
vegetal ya sea por arrastre de vapor, o bien por procedimientos mecánicos a partir del
epicarpio de los citrus, o por destilación en seco. (Bruneton, J, 2001) En la Tabla 2.3 se
observa los métodos utilizados para la obtención de aceite esencial.
Tabla 2-3: Métodos de extracción de aceite esencial.
Tipo de Método Procedimiento Productos obtenidos
Métodos
directos
- Extrusión Aceites esenciales cítricos
- Exhudación Gomas, resinas, bálsamos
Destilación
- Directa
Aceites esenciales y aguas
aromáticas
- Arrastre con vapor de agua
- Destilación – maceración
(liberación enzimática de
agliconas en agua caliente)
Extracción
con
solventes
- Solventes volátiles Infusiones y resinoides
alcohólicos
Concretos y absolutos
- Solventes fijos (grasas y
aceites)
Absolutos de pomadas
Absolutos de enflorados
- Extracción con fluidos en estado supercrítico
Fuente: (SENA, 2007)
2.2.5.1. Destilación con agua o Hidrodestilación.
La Hidrodestilación consiste en poner a hervir agua, bien sea por fuego directo,
camisa de vapor o camisa de aceite, en la cual se ha sumergido previamente el material
vegetal, preferiblemente en polvo, con el objeto de que el vapor de agua ejerza su acción
en el mayor número posible de partículas vegetales. (SENA, 2007)
Éste sistema de extracción tiene el inconveniente de que la temperatura que se
emplea provoca que algunos compuestos presentes en las plantas se degraden y se
17
pierdan. En general, los aceites producidos por destilación en agua son de menor calidad
por las siguientes razones: algunos componentes son sensibles a la hidrólisis, mientras
que otros, son susceptibles de polimerización, los compuestos oxigenados tienden a ser
parcialmente solubles en el agua de destilación, por lo que es imposible la remoción
completa de estos compuestos y los tiempos requeridos de destilación son demasiado
largos, lo cual se asocia a un detrimento de la calidad del aceite obtenido. (SENA, 2007)
Determinación del contenido de aceite esencial de un material vegetal.
Flores (2010) indica que el método utilizado tradicionalmente esta descrito en la
Farmacopea Europea (2005), y que se basa en efectuar una hidrodestilación de un peso
conocido de material vegetal y recoger el aceite esencial en un tubo graduado (1ml
dividido en 0,01 ml), que se encuentra en un colector especialmente diseñado para esto.
El equipo está compuesto de un balón, donde se deposita la materia prima molida y una
cantidad conocida de agua pura. Se le calienta constantemente, el aceite esencial con el
agua presente se evapora continuamente. Un condensador va acoplado al balón y una
conexión en forma de D, permite acumular y separar el aceite esencial de la mezcla
condensada, tal como se observa en la figura 2.3.
Figura 2.3: Equipo de clevenger empleado para la determinación del contenido de aceite esencial.
Fuente: (Cerpa, 2007)
18
2.2.5.2. Extracción por fluidos supercríticos
Los fluidos supercríticos presentan propiedades intermedias entre un gas y un
líquido como la densidad elevada que es próxima a la de un líquido, baja viscosidad que
es cercana a la del gas y un coeficiente de difusión superior al del líquido. Estas
características favorecen su penetración en diferentes matrices y la solubilización de los
solutos (Castaños, 2015).
Consiste en utilizar como material de arrastre sustancias químicas en condiciones
especiales de temperatura y presión. El material vegetal se corta en trozos pequeños, se
licua y se empaca en una cámara de acero inoxidable por donde se hace circular un líquido
supercrítico, en este caso CO2. Los aceites esenciales se solubilizan y el líquido
supercrítico CO2 que actúa como solvente extractor se elimina por descompresión
progresiva hasta alcanzar la presión y temperatura ambiente, para finalmente obtener un
aceite puro (Fig. 2.4) (SENA, 2007).
Figura 2.4: Diagrama esquemático del sistema de extracción de fluido supercrítico. (1) bomba de
CO2, (2) bomba modificadora, (3) celda de extracción, (4) celda de fraccionamiento I, (5) celda de
fraccionamiento II, (6) válvula.
Fuente: (Castaños, 2015)
Usando CO2, en particular, el tratamiento es a temperatura moderada y es posible
lograr una alta selectividad de micro-componentes valiosos en productos naturales. La
selectividad del CO2 también es apropiada para la extracción de aceites esenciales,
pigmentos, carotenoides antioxidantes, antimicrobianos y sustancias relacionadas, que
19
son usadas como ingredientes para alimentos, medicinas y productos de perfumería y que
son obtenidas de especias, hierbas y otros materiales biológicos (García, 2017).
Entre las ventajas de la extracción por fluidos supercríticos se encuentran: el
tiempo de extracción se reduce, se obtienen rendimientos mayores, es posible seleccionar
sustancias y la composición de extracción, además se requiere menos energía.
La principal desventaja es que ceras cuticulares y compuestos de alto peso
molecular son extraídos junto con el aceite esencial. (Peredo A, García P y López A,
2009)
2.2.6. Propiedades Fitoterapéuticas de los aceites esenciales.
Desde la antigüedad la fitoterapia ha sido un medio fundamental para el hombre
en el manejo de enfermedades, y es empleada por miles de personas en el mundo entero,
en el tratamiento de un gran número de afecciones entre las que se destacan diferentes
tipos de infecciones. La necesidad del hombre por curar sus enfermedades lo ha dirigido
a las plantas y a su capacidad curativa; práctica que se ha mantenido a lo largo de los
siglos (Gutiérrez, A y Estevez A, 2009).
Entre los componentes destacados de los aceites esenciales están los terpenos,
principalmente monoterpenos y sesquiterpenos, los fenilpropanoides, y los compuestos
alifáticos de cadena corta. Esta diversidad estructural determina que los aceites esenciales
puedan tener actividades farmacológicas muy variadas: antimicrobiana, expectorante,
espasmolítica, carminativa, colerética y colagoga, antiinflamatoria, analgésica, sedante,
estimulante del sistema nervioso central, etc. Estas actividades biológicas explican, total
o parcialmente, el uso terapéutico de muchas drogas vegetales, por lo que Gutiérrez y
Estevez (2009) indica que en un estudio realizado por la FDA (Food and Drug
Administration) entre los años de 1981 y el 2008 el 57.7% de nuevos fármacos aprobados
son de productos naturales, razón por la cual es importante el estudio de los mismos, entre
ellos los aceites esenciales.
20
2.2.6.1. Actividad antibacteriana
La potencia o actividad antibacteriana se define como la habilidad específica o
capacidad de un producto de lograr su efecto planeado y se basa en la medición de algún
atributo del producto, por ejemplo, su efecto inhibitorio frente a un determinado
microorganismo (halo de inhibición), normalmente métodos microbiológicos. La
potencia debe ser una propiedad o un atributo medible y definible para un producto
biológico o semisintético. (Pedraza, P y Castellanos H, 2009).
Para lograr un correcto tratamiento de las infecciones provocadas por los
microorganismos, es necesario desarrollar métodos apropiados debido a que los
microorganismos son capaces de inducir resistencia al antimicrobiano que se ha utilizado
contra él durante un periodo largo de tiempo, entre los métodos se encuentran: métodos
de dilución, métodos de difusión en agar (antibiograma o por perforación en gel), método
de bioautografía, y cámara hermética (Parra, 2017).
Métodos de evaluación de actividad antibacteriana
Método de Difusión en agar por perforación.
Este método consiste básicamente en incorporar al medio de cultivo el antibiótico
o el microorganismo en concentración conocida para que luego de solidificado el medio,
se adicione la contraparte en una perforación producida con un sacabocado (Fig. 2.5) y
de esta manera observar la inhibición de crecimiento en forma de halos. Una de las
grandes ventajas de ésta técnica de evaluación de actividad antimicrobiana es que requiere
de muy pequeñas cantidades de extracto o aceite a evaluar y ofrecen la posibilidad de
ensayar varias sustancias contra un mismo microorganismo (Parra, 2017).
Figura 2.5: Perforación de agar.
Fuente: (Parra, 2017)
21
Una de las cepas de prueba generalmente utilizadas son Staphylococcus aureus
(ATCC 25923) y Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853).(Salud, n.d.)
Microdilución en placa
La microdilución es una técnica basada en la actividad inhibitoria, se utiliza para
determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) que se define como la mínima
concentración de antimicrobiano que inhibe el crecimiento visible de un microorganismo
después de 24 horas de incubación a 37°C. Esta técnica se realiza en una policubeta de
poli-estireno que contiene 96 pocillos de fondo cónico o redondo (Fig. 2.6), cada pocillo
contiene volumen aproximado de 300uL. Una placa puede contener de 7 a 8 diluciones
de 12 diferentes agentes antibacterianos, usando una celdilla como control positivo (caldo
+ inóculo), otra como control negativo (sólo caldo) y también una para el control de la
estabilidad del antibacteriano usando una concentración ya conocida. Para evitar la
desecación se debe sellar cada policubeta con su tapa plástica o plástico adhesivo. El
tiempo de incubación para la mayoría de los microorganismos es de 16-20 hs, tanto para
la técnica en macro o micro a 35±2°C. (R, Carmilema S y Delgado, 2010)
Figura 2.6: Placa para microdilución
Fuente: (Mexicalexpo)
Cepas de prueba
Staphylococcus aureus: pertenece a la familia Staphylococcaceae. Es Gram
positivo, aunque las cepas viejas o los microorganismos fagocitados se tiñen como Gram
negativo. Tiene forma de coco y puede aparecer en parejas, en cadenas o en racimos. Su
tamaño oscila entre 0,8 a 1,5 micras de diámetro, es inmóvil y algunas cepas producen
una cápsula externa mucoide que aumenta su capacidad para producir infección. En
22
relación con su metabolismo, es anaerobio facultativo, coagulasa positivo, catalasa
positivo y oxidasa negativo. (INSHT, 2012)
Staphylococcus aureus (Fig. 2.7) es el que causa más infecciones, entre ellas:
infecciones en la piel, neumonía, intoxicación por alimentos, síndrome del shock tóxico
e intoxicación sanguínea (bacteremia). Las infecciones en la piel son las más comunes.
(Pahissa A, 2009)
Figura 2.7: Staphylococcus aureus
Fuente: (Pahissa A, 2009)
Pseudomonas aeruginosa: pertenece a la familia Pseudomonaceae. Se trata de un
bacilo recto o ligeramente curvado Gram negativo, con un tamaño de 2–4 x 0,5-1 micras,
y móvil gracias a la presencia de un flagelo polar. En relación con su metabolismo, es
aerobio (aunque puede desarrollarse en condiciones anaerobias utilizando nitrato),
catalasa positivo y oxidasa positivo. Se caracteriza por producir una variedad de
pigmentos, como la piocianina (de color azul verdoso), la pioverdina (pigmento
fluorescente de color verde amarillento) y la piorrubina (de color rojo). (Instituto nacional
de seguridad e higiene en el trabajo, INSHT, 2016)
P. aeruginosa (Fig. 2.8) es un patógeno oportunista suele manifestarse como:
infecciones dérmicas, neumonía, otitis externa, infección ocular, es responsable de
numerosos casos de infección nosocomial, afectando principalmente a individuos
inmunocomprometidos, con quemaduras graves, heridas quirúrgicas, neutropenia o con
infecciones pulmonares subyacentes. (Instituto nacional de seguridad e higiene en el
trabajo, INSHT, 2016)
23
Figura 2.8: Pseudomonas aeruginosa
Fuente: (Instituto nacional de seguridad e higiene en el trabajo, INSHT, 2016)
Control positivo
Ceftriaxona (Fig. 2.9) es un antibiótico betalactámico que pertenece a las
cefalosporinas de tercera generación con acción bactericida de amplio espectro contra
numerosos microorganismos gramnegativos y grampositivos. Destaca por su vida media
prolongada y, en consecuencia, su administración puede ser cada 24 h. Inhibe en forma
selectiva la síntesis de la pared celular en los microorganismos susceptibles, acción
derivada de su unión a proteínas específicas localizadas en las membranas citoplásmicas
de las bacterias, y que impide las reacciones de transpeptidación (transpeptidasas). La
ceftriaxona no se metaboliza en el organismo. Una parte de ella se elimina sin cambios
por filtración glomerular en la orina y el resto en la bilis. Su vida media sérica es de 6 a 8
h. (Rodriguez R, 2013)
Figura 2.9: Estructura química de la Ceftriaxona
Fuente: Wikimedia Commons
24
Criterios de interpretación
Según los nuevos criterios de interpretación de la CLSI (The Clinical &
Laboratory Standards Institute) la suceptabilidad antimicrobiana de la ceftriaxona frente
a microorganismos patógenos viene dada de la siguiente manera en las tablas 2-4 y 2-5.
Tabla 2-4: Susceptibilidad antimicrobiana del control positivo, ceftriaxona
Agente Disco difusión (mm) Concentración mínima
inhibitoria (ug/ml)
S I R S I R
Ceftazidima ≥21 18-20 ≤17 ≤4 8 ≥16
Ceftriaxona ≥23 20-22 ≤19 ≤1 2 ≥4
Cefotaxima ≥26 23-25 ≤22 ≤1 2 ≥4
S: sensible; I: intermedio; R: resistente
Fuente: (Comité de Resistencia Bacteriana e IAAS ACIN y otros, 2013)
Tabla 2-5: Susceptibilidad antimicrobiana de la Ceftriaxona frente a las diferentes cepas
bacterianas
Cepas
bacterianas
CEFTRIAXONA
Difusión en disco (mm) Concentración
mínima
inhibitoria
(ug/ml) S I R
Escherichia
coli
≥23 20-22 ≤19 ≥0,125
Pseudomonas
aeruginosa
≥21 14-20 ≤13 ≥16
Staphylococcus
aureus
≥14 11-13 ≤10 ≥4
S: sensible; I: intermedio; R: resistente
Fuente: (Secretaria distrital de salud, 2010)
2.2.6.2. Actividad antioxidante
Cada vez son más abundantes los estudios que afirman que varias especies de
origen vegetal son capaces de producir gran cantidad de fracciones químicas que actúan
como antioxidantes para controlar el estrés oxidativo causado por la radiación solar, el
oxígeno y otros factores; y que pueden servir de fuente para la obtención de nuevos
compuestos antioxidantes. (Altamirano, I, 2015)
25
Los antioxidantes derivados de las plantas se pueden clasificar en dos grupos
como: los antioxidantes endógenos que son biosintetizados por el propio organismo, y
los antioxidantes exógenos que son aquellos que ingresan a través de la dieta como: la
vitamina C (ácido ascórbico), vitamina E (tocoferoles) y vitamina A (beta-caroteno)
(Altamirano, I, 2015).
Tocoferoles (Vitamina E)
Son antioxidantes de origen lipofílico que se localizan exclusivamente en los
plastos y se biosintetizan solamente en plantas, en algunas algas y cianobacterias. Todos
los tocoferoles son moléculas anfipáticas es decir que poseen una región hidrofóbica que
se encuentra asociada a las membranas y una región polar que permanece en la superficie
de éstas; por lo que interactúan con los grupos acilos de los lípidos poliinsaturados,
estabilizan las membranas, secuestran y atenúan varias ROS, especialmente •O2 y •OH.
Entre ellos la vitamina E. (Altamirano, I, 2015)
Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid) es un análogo
de la vitamina E (Fig. 2.10) soluble en agua. Es un antioxidante como la vitamina E y se
utiliza en aplicaciones biológicas o bioquímicas para reducir el estrés oxidativo o daño.
La actividad antioxidante no puede ser medida directamente, pero puede determinarse por
los efectos del compuesto antioxidante en un proceso de oxidación controlado (Tovar, J,
2013)
Entre los métodos utilizados para determinar la actividad antioxidante se
encuentran método del radical DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidracilo), ensayo de
decoloración del catión radical ABTS (2,2'-azino-bis- (3-etil benzotiazolin-6-sulfonato de
amonio), ensayo ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) y la capacidad
antioxidante total de plasma (FRAP) (Tovar, J, 2013).
26
Figura 2.10: Vitamina E y su análogo Trolox.
Fuente: Sigma-Aldrich Merck
Método del radical 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH).
El método DPPH está entre los ensayos de captación de radicales libres, siendo el
más rápido y simple. También de un costo inferior en comparación con otros modelos.
La molécula 1,1-difenil-2-picril-hidrazilo (DPPH) es conocida como un radical libre
estable debido a la deslocalización de un electrón desapareado sobre la molécula
completa, por lo cual la molécula no se dimeriza, como es el caso de la mayoría de los
radicales libres. La deslocalización del electrón también intensifica el color violeta
intenso típico del radical, el cual absorbe en metanol a 514 nm. Cuando la solución de
DPPH reacciona con el sustrato antioxidante (Trolox) que puede donar un átomo de
hidrógeno como se muestra en la figura 2.11, el color violeta se desvanece. El cambio de
color es monitoreado espectrofotométricamente y es utilizado para la determinación de
los parámetros para las propiedades antioxidantes (Tovar, J, 2013).
El modelo que explica la actividad de un compuesto como antirradical se ejemplifica
con el siguiente gráfico:
Figura 2.11: Reacción del 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH).
Fuente: (Castañeda C, Ramos E y Ibañez B, 2008)
27
La actividad antioxidante se expresa como porcentaje de inhibición lo cual
corresponde a la cantidad de radical DPPH neutralizado por el extracto a una determinada
concentración, de acuerdo a la siguiente ecuación:
Ecuación 2.1: Cálculo del porcentaje de inhibición
Fuente: (Castillo, M, 2010)
2.2.7. Caracterización de aceites esenciales.
Para la utilización de los aceites esenciales es necesario cumplir con ciertos
parámetros de caracterización, debido a que la composición y calidad de un aceite
esencial varía de una especie vegetal a otra, dentro del mismo género de la planta, y
también dentro de la misma especie dependiendo del clima, región de cultivo, la madurez
de la planta, etc. (Rodas, 2012) Se deben tomar en cuenta los siguientes parámetros
analíticos (Tabla 2.6) en la caracterización de los aceites esenciales:
Tabla 2-6: Parámetros de caracterización de aceites esenciales.
1. Características
organolépticas Color
Olor
Sabor
Apariencia
2. Determinaciones
físicas
Densidad
Punto de congelación
Índice de refracción
Poder rotatorio
Solubilidad en etanol
Punto de inflamación
Rango de destilación
3. Índices químicos
Índice de acidez
Índice de éster
Índice de saponificación
Índice de acetilo
Índice de fenoles
% 𝐼𝑁𝐻𝐼𝐵𝐼𝐶𝐼Ó𝑁 = %𝐼 =(𝐴 − 𝐴1)
𝐴𝑥 100
A = Absorbancia del blanco
A1 = Absorbancia del sistema (muestra)
28
4. Características
cromatográficas Perfil cromatográfico por CG
Cuantificación de los principales componentes
5. Características
espectroscópicas Ultravioleta – visible
Infrarrojo
6. Otras
determinaciones Porcentaje de humedad del material vegetal
Pesticidas
Materiales pesados
7. Identificación de
compuestos
mayoritarios
CG – EM
CL – EM
CG x CG
Fuente: (Montoya Cadavid, 2010)
2.2.7.1. Tipos de análisis de aceites esenciales.
A continuación, se detallan los diferentes tipos de análisis que se realizan a los
aceites esenciales:
Características organolépticas.
Se describe el olor, color, sabor y textura de los aceites obtenidos, puesto que estas
características físicas contribuyen a la definición de la calidad y además orientan sobre
las posibles aplicaciones industriales. (Montoya, G, 2010)
Características físico-químicas.
Índice de refracción: El índice de refracción de un aceite esencial con respecto
al del aire, corresponde a la razón del seno del ángulo de incidencia al seno del ángulo de
refracción emitido, de un rayo de luz que pasa del aire al aceite. Aunque los valores
representados por el índice de refracción de los aceites esenciales oscilan entre límites
muy pequeños, se practica su determinación porque puede señalar adulteraciones y
envejecimientos de los mismos. (Montoya, G, 2010)
Cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas: La asociación
de las dos técnicas, GC (“Gas Chromatography”) y MS (“Mass Spectrometry”) da lugar
a una técnica combinada GC-MS (Fig. 2.12) que permite la separación e identificación
de mezclas complejas. La utilización de la cromatografía de gases acoplada a un
espectrómetro de masas requiere sistemas especiales de conexión. En principio, se trata
29
de dos técnicas que trabajan en fase gaseosa y necesitan una muy pequeña cantidad de
muestra para su análisis, por lo que son muy compatibles. El único obstáculo serio a la
hora de realizar su acoplamiento es que el efluente que emerge de la columna
cromatográfica sale a presión atmosférica y debe introducirse en el interior del
espectrómetro de masas que trabaja a alto vacío. Actualmente, el acoplamiento directo
resulta fácil cuando se utiliza la cromatografía de gases capilar, que es el caso más
habitual. (Gutiérrez, Droguet, & Odeur, 2002).
Figura 2.12: Equipo Cromatografía de gases acoplado a Espectrometría de masas.
Fuente: (Gutiérrez, Droguet, & Odeur, 2002).
2.2.8. Descripción botánica de Handroanthus chrysanthus (Guayacán).
Handroanthus chrysanthus conocido como guayacán amarillo y anteriormente
como Tabebuia chrysantha. es nativo de México, Centroamérica, el norte de
Sudamérica, Ecuador y Perú.
Jerarquía Taxonómica.
Tabla 2-7: Jerarquía taxonómica
REINO PLANTAE
PHYLUM Magnoliophyta
CLASE Magnoliopsida
ORDEN Lamiales
CLASIFICACIÓN
SUPERIOR
Tabebuia
FAMILIA Bignoniaceae
GÉNERO Handroanthus
ESPECIE Handroanthus chrysanthus (Jacq.) S.O.Grose
Fuente: (Catalogoflora)
Nombre científico: Handroanthus chrysanthus
30
Nombre común: Guayacán
Nombres relacionados: Guayacán amarillo (Fig. 2.13)
Sinónimia: Bignonia chrysantha Jacq, Bignonia chrysantha Jacq, Handroanthus
chrysanthus subsp. Chrysanthus, Tabebuia chrysantha (Jacq.) G.Nicholson, Tabebuia
rufescens J.R.Johnst., Tecoma chrysantha (Jacq.) DC., Tecoma evenia Donn.Sm.,
Tecoma palmeri Kraenzl. (Catalogoflora)
Etimología: Handroanthus: género creado por J.R. Mattos en 1970 para diferenciar parte
de las espécies del género Tabebuia. El nombre Handroanthus fue un honor al botánico
brasileño Oswaldo Handro (1908-1986). (Catalogoflora)
chrysanthus: epíteto latíno que significa (‘con flores de color dorado’).
Variedades
Handroanthus chrysanthus subsp. meridionalis (A.H.Gentry) S.O.Grose
Handroanthus chrysanthus subsp. pluvicola (A.H.Gentry) S.O.Grose
(Catalogoflora)
Distribución geográfica: Esta especie habita en laderas, planicies, hondonadas del
bosque seco. Crece entre 0-2 000 msnm, en las provincias de Bolívar, Chimborazo, El
Oro, Esmeraldas, Guayas, Loja, Los Ríos, Manabí, Morona Santiago, Napo, Pastaza,
Pichincha y Sucumbíos (Ministerio del Ambiente, 2012)
Tipo de bosque: Bosque seco pluvioestacional, bosque seco andino y bosque siempre
verde de tierras bajas de la Amazonía.
Descripción botánica: Árbol caducifolio, entre 12-20 m de altura y 20-40 cm de DAP.
Fuste recto, escasamente ramificado, copa amplia, extendida e irregular. Corteza fisurada
pardo-oscuro. Fuste cilíndrico, copa amplia extendida e irregular. Hojas palmadas
compuestas, opuestas, ápice agudo y bordes aserrados, de 5 foliolos, de 6-12 cm de
longitud, envés áspero y ligeramente pubescente por el envés. Flor tubular, 5 cm de
longitud, con pedúnculo, cáliz de 5 sépalos cafés; corola de 5 pétalos amarillos, en
inflorescencia racimosa. (Ministerio del Ambiente, 2012).
Usos: Esta especie da una de las maderas más pesadas y duraderas. Madera de valor y
buena calidad, y muy resistente al comején. Usada en ebanistería, carpintería. Partes para
vehículos; carrocerías, carruajes, vagones, ejes de carreta, etc. Instrumentos musicales;
31
arcos para violín. Artículos deportivos; cañas para pesca. Se utiliza en sistemas
silvopastoriles, linderos, como sombra y ornamental. Se ha encontrado que el extracto de
la corteza se usa como medicina, las flores en infusión se usan como tratamiento de la
hepatitis y la corteza en cocción ayuda a aliviar la osteoporosis (forestal, 2012).
Figura 2.13: Handroanthus chrysanthus
Fuente: (Ministerio del Ambiente, 2012).
2.3. Fundamento legal
Constitución de la República del Ecuador
Expedida por la Asamblea Constituyente-Montecristi 2008
Publicada: Registro Oficial No. 449
Fecha de publicación 20-oct-2008
Última modificación: 13-Julio-2011
Art. 14. Se reconoce el derecho de la población a vivir en un ambiente sano y
ecológicamente equilibrado, que garantice la sostenibilidad y el buen vivir, sumak
kawsay. Se declara de interés público la preservación del ambiente, la conservación de
los ecosistemas, la biodiversidad y la integridad del patrimonio genético del país, la
prevención del daño ambiental y la recuperación de los espacios naturales degradados.
32
USP-39
Valoraciones microbiológicas.
En las condiciones adecuadas, la actividad (potencia) de los antibióticos puede
demostrarse por su efecto inhibidor sobre los microorganismos. La reducción en la
actividad microbiana puede ser difícil de demostrar por métodos químicos. En la
Farmacopea de los Estados Unidos (USP) para los que la valoración microbiológica es el
método analítico estándar se utilizan dos técnicas generales: la valoración en cilindro-
placa (o en placa) y la valoración turbidimétrica (o en tubo).
2.4. Hipótesis
2.4.1. Hipótesis alternativa. (Hi)
El aceite esencial extraído del tronco y corteza de la especie Handroanthus
chrysanthus presenta actividad antibacteriana.
El aceite esencial extraído del tronco y corteza de la especie Handroanthus
chrysanthus presenta actividad antioxidante.
2.4.2. Hipótesis Nula. (Ho)
El aceite esencial extraído del tronco y corteza de la especie Handroanthus
chrysanthus no presenta actividad antibacteriana.
El aceite esencial extraído del tronco y corteza de la especie Handroanthus
chrysanthus no presenta actividad antioxidante.
2.5. Sistema de variables
El presente proyecto de investigación consta de 4 etapas:
2.5.1. Etapa 1: Extracción del aceite
Extracción del aceite esencial del tronco y corteza de Handroanthus chrysanthus
mediante los métodos de Hidrodestilación y de Fluidos supercríticos previamente
aplicando los parámetros de calidad de la materia prima.
33
2.5.1.1. Variable dependiente:
Rendimiento del aceite
2.5.1.2. Variable independiente
Tamaño de partícula (dos tamaños)
2.5.2. Etapa 2: Caracterización del aceite
Se realizó mediante el análisis de parámetros de caracterización del aceite tales
como características organolépticas (color, olor y textura) y características físico-
químicas como índice de refracción y cromatografía de gases acoplado a
espectrofotometría de masas, a continuación, se seleccionó una muestra de aceite de cada
método de extracción.
2.5.3. Etapa 3: Evaluación de actividad antibacteriana
Se evaluó la actividad antibacteriana en la muestra de aceite seleccionado en cada
método de extracción mediante el método de difusión en agar por perforación utilizando
como control positivo la ceftriaxona (1mg/ml), previamente se realizaron pruebas de
solubilidad con etanol, Propilenglicol y glicerina.
2.5.3.1. Variable dependiente:
Antibacteriano (Halo de inhibición)
2.5.3.2. Variable independiente:
Tipo de cepa (S. aureus y P. aeruginosa)
Concentración de aceite (1mg/ml, 20mg/ml y 50mg/ml)
2.5.3. Etapa 4: Evaluación de actividad antioxidante
Se evaluó la actividad antioxidante en la muestra de aceite seleccionado en cada
método de extracción mediante el método del radical DPPH para lo cual se utilizó como
estándar de referencia Trolox.
2.5.4.1. Variable dependiente
Antioxidante (porcentaje de inhibición)
2.5.4.2. Variable independiente
Tipo de muestra (muestra de aceite y estándar de referencia Trolox)
34
Capítulo III:
3. Marco metodológico
3.1. Diseño de la Investigación
La presente investigación correspondió a un estudio de la siguiente forma: un
paradigma cuantitativo ya que se aplica métodos experimentales con técnicas
previamente desarrolladas y aprobadas, el nivel de investigación es explicativo pues la
hipótesis y variables se establecieron de las preguntas de investigación por lo que tiene la
característica de causa efecto, permitiendo manipular las diferentes variables
independientes como son: tamaño de partícula en la obtención del aceite, tipo de cepa y
concentración para evaluar la actividad antibacteriana y su tipo de muestra en la actividad
antioxidante, estableciendo un diseño que permitió probar y medir variables, su enfoque
sigue una línea de investigación en el área de productos naturales y microbiología.
Los tipos de investigación que se utilizaron son:
Investigación bibliográfica o documental: ya que estudia los problemas con el
propósito de profundizar y ampliar el conocimiento sobre el tema en cuestión, apoyándose
de trabajos previos e información de medios electrónicos o impresos de investigaciones
anteriores.
Investigación de laboratorio: ya que permite desarrollar en un lugar que se puede
controlar las variables de forma artificial puesto que se carece de las características
propias del ambiente natural.
3.2. Población
Para el presente estudio se describió como población a la especie certificada como
es Handroanthus chrysanthus y como muestra, a una parte del tronco y corteza de dicha
especie. (anexo G)
35
3.3. Muestra o materia prima
La muestra fue parte de las ramas de la especie mencionada se obtuvo
directamente de una propiedad en la cual fue sembrada ubicada en Salinas de Montenuevo
donde el propietario autorizó la entrega. (anexo F)
3.4. Métodos
El diagrama procedimental de todos los ensayos experimentales se encuentra
detallado en el Anexo B.
3.4.1. Reactivos, materiales y equipos
Tabla 3-1: Reactivos
Reactivos Marca Grado CAS #
Etanol 96 % EMSURE® Merck Analítico 64-17-5
Agua destilada - - -
Heptano Merck Analítico 142-82-5
Metanol Merck Analítico 67-54-1
Solución salina DISPROQUIM Analítico -
Medio de cultivo
Mueller Hinton
HIMEDIA - Ref. M1084-100G
Medio de cultivo
TSA
BD - Ref. 211043
TROLOX SIGMA-ALDRICH Analítico 53188-07-1
Cetfriaxona IMEXFAR - -
Radical DPPH SIGMA-ALDRICH Analítico 1898-66-4
36
Tabla 3-2: Materiales
Materiales Marca Descripción
Papel empaque - -
Guantes Nitrilo Talla S
Regla - 100cm
Marcador para vidrio - Color negro
Papel film - -
Papel aluminio - -
Fundas plásticas - grandes
Fundas herméticas - Tamaño pequeña y mediana
Frascos ámbar - Volumen 100 ml
Papel filtro - Cualitativo
Espátula - pequeña
Crisoles - Pequeños
Desecador - Capacidad de 4 crisoles
Mechero bunsen - -
Pinza - Para mechero
Juego de tamices SARGENT Y CO Malla de 0,18 mm; 0.5cm y
2,0mm
Manguera de agua Fisher scientific -
Soporte universal - -
Pinzas para soporte - -
Termómetro ALL FRANCE RANGO (-20 a +110) ± 0,1
°C
Cajas petri INSUMEDIC,
Caricia Plástico-medianas
Sacabocados - Metal
Hisopos - -
Gradilla - Capacidad de 10 tubos
Asa - metálica
Matraz erlenmeyers KIMAX Capacidad 500 y 1000ml
Balón de extracción KIMAX Capacidad 1000 ml
Balón aforado PIREX, KIMAX Capacidad 10, 20, 50ml
Aparato clevenger Schott duran -
Vasos de precipitación BOECO-
Germany
Capacidad 100, 250, 500 y
1000ml
Tubos de ensayo KIMAX Capacidad 15ml
Agitador de vidrio KIMAX -
Pipetas KIMAX Capacidad 1, 10ml
Micropipetas ------------- Capacidad 20-200u, 1000uL
Columna de enfriamiento de
bolas BOECO -
37
Tabla 3-3: Equipos
Equipo Marca Descripción
Cortadora de
aserradero Hurtado HNS -
Estufa MEMMERT
- Modelo: UNB 500
- Resolución: 0,5°C
- Rango T: 20-220°C
Mufla Sybron thermolyne -
Balanza analítica METTLER
TOLEDO - Modelo AL 204
Microscopio -
Licuadora doméstica
- TO speed
- METTLER
- DENVER
INSTRUM
ENT
- Modelo PJ360
Cocineta HACEB - Serie: G- 042332883
Evaporador rotativo BUCHI
- Modelo: B-490
- Capacidad: Matraces de
25, 100,250 y 500 ml.
Fluidos supercríticos Spe-ed SFE
System
- Serie 1500
- Solvente: CO2
Cromatograma de
gases acoplado a
masas (cg-em)
Agilent
Tecnologies -
Refractómetro de abbé - Zona de muestra inferior
Espectrofotómetro Varian Cary® 50
Bio UV-vis
- Software: CaryWinUV
Versión 3.00(182)
Refrigeradora ELTACHI -
Autoclave Wisd –
LABORATORY
INSTRUMENTS
-
Balanza de dos platos OHAUS®
- Modelo: Harvard Trip
- Intervalo de operación
1-5000± 0,1 g
Incubadora - -
Cabina de aire estéril - -
38
Agitador magnético Thermolyne
SYBRON -
Microrganismos de prueba
Cepas Numeración Código
Staphylococcus aureus ATCC 25923 PSBS002
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 PSBS003
3.4.2. Desarrollo experimental
La presente investigación se encuentra dividida en cuatro etapas:
- Etapa I: Obtención, identificación, homogeneización, control de calidad de
materia prima, secado y extracción del aceite esencial del tronco y corteza de la
especie Handroanthus chrysanthus (Guayacán) mediante hidrodestilación y
fluidos supercríticos.
- Etapa II: Caracterización del aceite esencial obtenido por los diferentes métodos,
como características organolépticas (color, olor y textura) y características físico-
químicas como índice de refracción y cromatografía de gases acoplado a
espectrofotometría de masas.
- Etapa III: Evaluación de la actividad antibacteriana en la muestra de aceite
esencial obtenido en cada método de extracción mediante el método de difusión
en agar por perforación utilizando como control positivo la ceftriaxona,
previamente se realizó pruebas de solubilidad con etanol, propilenglicol y
glicerina.
- Etapa IV: Evaluación de la actividad antioxidante en la muestra de aceite
seleccionado en cada método de extracción mediante el método del radical DPPH
para lo cual se utilizó como estándar de referencia el Trolox.
39
3.4.3. Parte procedimental
3.4.3.1. Etapa I: Extracción del aceite esencial.
Obtención.
Figura 3.1: Muestras de la especie Handroanthus chrysanthus
La muestra (tronco y corteza) de la especie Handroanthus chrysanthus se obtuvo
en forma de troncos de las ramas en papel film, fueron recolectadas en la propiedad
Caisapanta ubicada en Salinas de Montenuevo. A la muestra obtenida se realizó
tratamiento de desinfección con rocio de etanol etílico para posterior proceso.
Identificación
Junto con la muestra se obtuvo hojas de la especie de estudio, de las cuales se
seleccionaron las hojas sanas y limpias, se desinfectó, se agregó en comercio y se entregó
a la Botánica Carmita Reyes para el boucher e identificación (Véase anexo G).
Troceado y Homogeneizado
Figura 3.2: Obtención de aserrín mediante máquina de aserradero
40
Se realizó la correspondiente limpieza de la máquina de aserradero modelo C45A,
a continuación, se llevó las muestras y una por una se pasó por la máquina para la
obtención de aserrín al finalizar se recolectó en fundas plásticas.
Control de calidad de la materia prima
Refiriendo a la metodología MGA-FH 0040 de la Farmacopea Herbolaria de los
Estados Unidos Mexicanos tomando como referencia la corteza de canela (tabla 3-4), ya
que aún no se encuentra establecido para la corteza o tronco de Handroanthus
chrysanthus, se realizó la descripción macroscópica de la muestra previamente
desinfectada y de una parte de aserrín se realizó la descripción microscópica,
determinación del porcentaje de cenizas totales y adicionalmente la humedad.
Tabla 3-4: Parámetros de control de calidad de la materia prima de corteza de canela.
DEFINICIÓN Consiste en la corteza seca de las ramas jóvenes.
DESCRIPCIÓN
MACROSCÓPICA
La corteza tiene un grosor aproximado de 0,2 mm a 0,8
mm y se presenta como fragmentos tubulares aislados
o embutidos unos de otros. Cara externa lisa, de color
pardo amarillento, con leves cicatrices que señalan la
posición de las hojas y de las yemas axilares, provista
de finas estrías, longitudinales blanquecinas y sinuosas.
Cara interna ligeramente más oscura y estriada
longitudinalmente. Fractura limpia y fibrosa. Olor
característico.
DESCRIPCIÓN
MICROSCÓPICA
Polvo de color amarillento o café rojizo. Examinar al
microscopio utilizando glicerol al 50%. El polvo
muestra las siguientes características diagnosticas:
abundantes gránulos de almidón. Los fragmentos de
súber están ausentes o son muy escasos.
CENIZAS TOTALES No más de 6%
Secado
Figura 3.3: Secado y licuado de la muestra
41
La muestra obtenida en forma de aserrín se agregó en cajas de papel empaque, se
pesó y se dejó secar al ambiente hasta que el peso se mantenga constante, a continuación,
se licuó para disminuir el tamaño de partícula.
Tamizado
Figura 3.4: Tamizaje de la muestra y pesaje de las fracciones
La muestra licuada se pasó por un juego de tamices de tamaño 0,18mm; 0,5mm y
2,0mm de las cuales se tomaron el tamaño de partícula 0,5 y 2mm. De cada tamaño de
partícula se pesaron 10 fracciones de 100 gramos, 5 fracciones de cada tamaño para la
extracción por hidrodestilación y las fracciones restantes para la extracción por fluidos
supercríticos, cada fracción se almacenó en fundas de cierre herméticas correctamente
rotuladas.
Extracción por Hidrodestilación
Figura 3.5: Proceso de extracción por Hidrodestilación
42
Se inició con las fracciones de tamaño de partícula de 0,5mm, se armó el equipo
para la extracción previamente agregando 2 ml de heptano en el embudo de separación
que se encuentra en el aparato de clevenger, se agregó la muestra en un balón de 1L junto
con 800ml de agua destilada y un núcleo de ebullición, se procedió a extraer durante 6
horas a partir de su ebullición (Fig. 3.5), al finalizar el tiempo de extracción se apagó las
cocinetas y se recolectó la fase orgánica en frascos de vidrio previamente pesados, se dejó
evaporar el heptano, se volvió a pesar y se almacenó el aceite esencial en la refrigeradora
de marca Eltachi, se repitió el proceso hasta terminar las 10 fracciones de muestra.
Extracción con Fluidos supercríticos
Figura 3.6: Equipo de extracción con fluidos supercríticos
Se inició con las fracciones de tamaño de partícula de 2mm, se prendió el equipo
y se abrió la válvula del tanque de gas de CO2, se agregó la muestra en el cilindro
correspondiente y se incorporó en el equipo asegurando que no haya escape de presión,
se pesó el frasco recolector de aceite y se añadió en el equipo, se ajustó las condiciones
de extracción a 45°C al interior, 325 Bar y 60°C al exterior, a continuación, se ajustan las
temperaturas hasta llegar a las condiciones, pasado el tiempo se ajusta la velocidad de
flujo y se procede a realizar la extracción durante 2 horas, finalmente se pesó el frasco
recolector y se almacenó en la refrigeradora, se repitió el proceso con cada una de las
fracciones (Fig. 3.6).
43
3.4.3.2. Etapa II: Caracterización del aceite.
Una vez obtenidas las muestras de aceite mediante los dos métodos de extracción:
Hidrodestilación y Fluidos supercríticos con diferentes tamaños de partícula se midieron
los siguientes parámetros:
Porcentaje de rendimiento
Para ello se utilizó la ecuación 3.1, se tomó en cuenta los gramos de aceite esencial
extraído hasta agotamiento de la muestra y se relacionó con la cantidad de muestra vegetal
inicial.
% 𝑅 =𝑚𝑙 𝑜 𝑔 𝑑𝑒 𝑎𝑐𝑒𝑖𝑡𝑒 𝑒𝑠𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎𝑙 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎í𝑑𝑜
𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑣𝑒𝑔𝑒𝑡𝑎𝑙 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙∗ 100
Ecuación 3.1: Cálculo del porcentaje de rendimiento
A continuación, se midieron los parámetros de caracterización de los aceites
obtenidos, entre ellos parámetros organolépticos y físico-químicos.
Características organolépticas
Se realizó en cada frasco de aceite esencial mediante análisis sensorial como el
olfato para determinar el olor, la vista para determinar el color y el tacto para determinar
la textura.
Características físico-químicas.
Índice de refracción: se utilizó un refractómetro de ABBÉ, para ello se ajustó la
escala colocando de 1 a 2 gotas de agua destilada en la superficie del prisma principal con
una jeringa. Para medir el índice de refracción de los aceites se abrió el prisma secundario
y se colocó una gota de la muestra en el centro de la superficie del prisma, se cerró
cuidadosamente el prisma secundario, se observó por el ocular, se giró la perilla de
compensación de color hasta que aparezca una línea clara y definida en el campo de
visión, se giró la perilla de medición alineando la línea delimitadora con las líneas de
intersección y se leyó en la escala superior el índice de refracción.
Cromatografía de gases acoplada a Espectrometría de masas: Una vez obtenidas
las muestras de aceites se encendió el equipo de cromatografía de marca Agilet technologies,
44
se ajustó a las condiciones para aceites esenciales, se agregó en frascos de cromatografía
disueltas en 2ml de cloroformo (Fig. 3.7) y se realizaron las corridas durante una hora, se
determinó los componentes en el aceite, mismos que se observan en la tabla 4-7 y 4-8.
Figura 3.7: Frascos preparados para Cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas.
3.4.3.3. Etapa III: Evaluación de la actividad antibacteriana
Para la evaluación de la actividad antibacteriana y antioxidante se utilizaron los
aceites con mejor rendimiento, es decir los aceites obtenidos por los métodos de
hidrodestilación y fluidos supercríticos con el tamaño de partícula de 0,5mm.
Microdilución en placa
Se realizó la microdilución para determinar la concentración mínima inhibitoria y
seleccionar las 3 concentraciones que se evaluaron en el método de difusión en agar por
perforación, para ello se realizó de acuerdo con algunos lineamientos descritos por la
CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) presentes en el trabajo de Suquillo V,
(2017) con algunas modificaciones.
Se prepararon 10 diluciones seriadas de cada aceite esencial en las placas de
microtitulación. La distribución de los pocillos en la placa de microtitulación se muestran
en la figura 3.8. Desde el pocillo 2 hasta el 10 se colocó 100 uL de medio líquido caldo
de mueller hinton previamente esterilizado y en el pocillo 1 se puso 200 uL del aceite
esencial a determinada concentración. Con la ayuda de una micropipeta se cogió 100 uL
del pocillo 1 y se añadió al pocillo 2, luego se tomó 100 uL del pocillo 2 y se colocó en
el pocillo 3, se repitió este procedimiento hasta llegar al pocillo 10. Se colocó 200 uL y
100 uL de medio líquido caldo mueller hinton en los pocillos 11 y 12 respectivamente.
Se inocularon todos los pocillos, excepto los controles de esterilidad (pocillo 11). Se
cubrió la placa de microtitulación con papel film para evitar la evaporación del medio de
cultivo y del aceite esencial. Se incubó la placa de microtitulación hasta que se observó
45
crecimiento en el pocillo control de crecimiento a 35 °C por 24 horas. Se determinó la
concentración mínima inhibitoria como la concentración más baja que produce una
inhibición visual del crecimiento. (De haber un solvente presente en la concentración
agregar en otro pocillo junto con el caldo y cepa como control)
Figura 3.8: Diluciones seriadas en la placa de microtitulación
De acuerdo a las diluciones se obtiene las siguientes concentraciones para cada pocillo
en la figura 3.9.
Figura 3.9: Concentraciones de los aceites
46
Preparación de medios de cultivo
Figura 3.10: Preparación del medio Mueller hinton
Se prepararon los medios de cultivo: Tripteína Soya Agar para crecimiento
bacteriano y Mueller Hinton para la susceptibilidad antimicrobiana.
Tripteína Soya Agar: Se disolvió 10 gramos del medio en 250ml de agua
destilada, se mezcló completamente y se dejó reposar por 5 minutos, se calentó agitando
suavemente hasta ebullición po 2 minutos, se esterilizó en el autoclave de marca Wisd a
121°C durante 1 hora, a una temperatura aproximada de 40°C se repartió el medio en
cajas Petri y se dejó solidificar. Para el control de calidad se dejó una caja en la incubadora
a 35°C por 24 horas y se observó que no haya crecimiento.
Mueller Hinton Agar: Se disolvió 40 gramos del medio en un litro de agua
destilada, se mezcló completamente y se dejó reposar por 5 minutos, se calentó agitando
suavemente hasta ebullición po 2 minutos, se esterilizó en el autoclave de marca Wisd a
121°C durante 1 hora, a una temperatura aproximada de 40°C se repartió el medio en
cajas Petri cumpliendo con los siguientes parámetros antes de su utilización:
- Espesor: debe ser de 4mm, es decir se debe colocar una cantidad de medio entre
25-30ml en plcas de 85-100mm de diamétro interno. Cuando existe un espesor
mayor a 4 mm, se genera un diámetro de halo de inhibición menor (falsa
resistencia) mientras que en un espesor menor a 4mm se genera un diámetro de
halo de inhibición mayor (falsa sensibilidad).
47
Cultivo de Cepas ATCC bacterianas
Se realizó el cultivo de las cepas bacterianas en los medios TSA previamente
preparados, para ello a partir de las cepas bacterianas activadas se tomó con un asa de
inoculación 2 a 3 colonias aisladas y se estrió en el medio solidificado, se incubó de 18-
24 horas. Una vez utilizadas las cepas deben ser cubiertas, cerradas las cajas Petri y
guardadas en refrigeración a una temperatura aproximada de 8°C.
Preparación de la escala Mac farland.
A partir de las cepas bacterianas Staphylococcus aureus y Pseudomonas
aeruginosa anteriormente preparadas en TSA se tomó una colonia con un asa y se inoculó
directamente en un tubo de 9 ml con solución salina al 0,85%. Se ajustó el inoculo a una
turbidez 0,5 MacFarland que equivale a 1.5 x 108 ufc/ml, leyendo en un espectrofotómetro
a 594nm para confirmar el valor de la escala que debe presentar una absorbancia entre
0,08-0,1.
Preparación del control positivo
Como control positivo se utilizó la ceftriaxona para ello se pesó 1mg y se disolvió
en 1ml de agua estéril obteniendo una concentración de 1mg/ml.
Preparación de la muestra
Con la muestra de aceite esencial obtenida en tamaño de partícula 0,5mm por
Hidrodestilación se realizó la solubilidad en glicerina, etanol y Propilenglicol,
posteriormente se prepararon las 3 concentraciones establecidas 1mg/ml, 20mg/ml y
50mg/ml en etanol, el cual presentó mayor solubilidad. De la misma manera con el aceite
obtenido por fluidos supercríticos.
48
Método de difusión en agar por perforación.
Se desinfectó una cabina, todo el área de trabajo con etanol para crear un ambiente
estéril, a continuación se procedió aplicar el método, se introdujo un hisopo estéril dentro
de la suspensión bacteriana Staphylococccus aureus (0,5 MacFarland) previamente
preparada, se rotó por las paredes del tubo para eliminar el exceso de líquido, se inoculo
en las cajas del medio Mueller Hinton Agar con la técnica de hisopado, se dejó secar por
5 minutos, pasado el tiempo se realizó 4 perforaciones en el medio con ayuda de un
sacabocado, para el control positivo (ceftriaxona 1mg/ml), la muestra de aceite obtenido
por Hidrodestilación y fluidos supercríticos a la concentración de 1mg/ml y el solvente
(etanol), se rotuló correctamente, luego con ayuda de una micropipeta se agregó 100uL
de las muestras en cada perforación y se llevó a la incubadora de bacterias a 37°C durante
24 horas, una vez finalizado el tiempo se midieron los halos de inhibición. Se repitió el
procedimiento para cada concentración y con la cepa Pseudomonas aeruginosa por
triplicado.
3.4.3.4. Etapa IV: Evaluación de la actividad antioxidante del aceite
esencial
Método del radical DPPH
Preparación del radical DPPH.
Para la presente evaluación se realizó el método planteado por Coronel (2017)
mediante el método del radical DPPH con algunas modificaciones, para ello se preparó
una solución patrón de 2,2-difenil-1-picril hidrazilo (DPPH) en metanol grado analítico
por lo que se pesó 3mg del reactivo y se aforó a 50ml, se conservó en la oscuridad durante
15 min hasta su uso. Se realizó un barrido espectral con la solución preparada para
determinar la longitud de onda máximo, la cual fue de 517 nm.
Curva de calibración
Preparación del estándar trolox
Se realizó una solución madre para lo cual se pesó 0,9 mg de reactivo trolox y se aforó a
10 ml con metanol grado analítico, a continuación, para la curva de calibración se
49
realizaron diluciones tomando alícuotas de la solución madre presentados en la tabla 3-5
en tubos de ensayo cubiertos de papel aluminio.
Tabla 3-5: Volúmenes para la curva de calibración con trolox
Volumen Trolox (uL)
(0,09 mg/ml)
Volumen DPPH (ml)
(0,06 mg/ml)
Volumen metanol
(ml)
0 Blanco 1,5 2,5
1 25 1,5 2,475
2 75 1,5 2,425
3 100 1,5 2,400
4 150 1,5 2,350
Los tubos preparados se sometieron agitación a 200rpm durante 30 minutos y se
realizó las lecturas de absorbancia a 517nm, este procedimiento se repitió hasta encontrar
una curva de calibración con coeficiente de correlación lo más cercano a 1.
Preparación de la muestra de aceite esencial.
Para realizar el análisis del aceite se preparó una solución con cada muestra de
aceite obtenida por los diferentes métodos, el aceite extraído con fluidos supercríticos se
pesó 5mg y se aforo a 10ml con metanol grado analítico mientras que el aceite extraído
por hidrodestilación se pesó 12mg y se aforó a 10ml con el mismo metanol y se procedió
a preparar en tubos de ensayo cubiertos de papel aluminio como se presenta en la tabla 3-
6 por separado.
Tabla 3-6: Volúmenes de las muestras de aceite.
Volumen aceite (uL) Volumen DPPH (ml)
(0,06mg/ml)
Volumen metanol
(ml)
0 Blanco 1,5 2,5
1 250 1,5 2,475
2 750 1,5 2,425
3 1000 1,5 2,400
4 1500 1,5 2,350
50
Los tubos preparados se llevaron agitación a 200rpm durante 30 minutos y se
realizó las lecturas de las absorbancias, este procedimiento se realizó por triplicado con
cada muestra de aceite.
A continuación, se realizó el cálculo del porcentaje de inhibición con la ecuación
2.1 tanto para la muestra de aceite obtenido con fluidos supercríticos como por
hidrodestilación.
Nota: Los certificados de los reactivos DPPH y estándar Trolox se encuentran en el anexo
I.
3.5. Diseño experimental
En la presente investigación se aplicó un diseño en las diferentes etapas.
En la primera etapa se realizó la extracción del aceite esencial de tronco y corteza
de Handroanthus chrysanthus tomando en cuenta la muestra en 2 tamaños de partícula
0,5 y 2 mm, mediante 2 métodos de extracción (hidrodestilación y fluidos supercríticos),
en la segunda etapa se realizó ensayos de parámetros de caracterización del aceite y se
seleccionó una muestra en cada método de extracción, en la tercera etapa se evaluó la
actividad antibacteriana mediante el método de difusión en agar por perforación y en la
cuarta etapa finalmente se evaluó la actividad antioxidante mediante el método del radical
DPPH.
3.5.1. Etapa I: Extracción del aceite
En esta etapa se realizó la extracción del aceite esencial utilizando dos métodos
de extracción tales como extracción por Hidrodestilación y extracción con Fluidos
supercríticos se opta por aplicar un diseño de bloques, mismo que en cada bloque se
realizó una comparación de sus niveles haciendo uso de la prueba de t, con cinco replicas.
La hipótesis nula establece que la media del rendimiento (medias de los niveles
del factor) es igual mientras que la hipótesis alternativa establece que es diferente, esto
para cada método de extracción.
Hipótesis nula: HO: U1 = U2
Hipótesis alternativa: Hi: U1 ≠ U2
51
3.5.1.1. Operacionalización de las Variables Etapa I.
Tabla 3-7 : Operacionalización de Variables Etapa I.
FACTOR O
VARIABLE NIVELES
INDICADOR (VARIABLE
DEPENDIENTE)
Tamaño de partícula 0,5 mm
2,0 mm
Rendimiento de extracción (mg de
aceite por cada 100g de muestra)
3.5.1.2. Factores y dominio experimental de la etapa I.
Codificación factores (variable independiente)
Tamaño de partícula de la muestra extraída por Hidrodestilación.: FACTOR A
El tamaño de partícula utilizado para la extracción es:
Tamaño 1 = 0,5 mm = H
Tamaño 2 = 2.0 mm.= F
Tabla 3-8: Factores y Niveles Experimentales de la etapa 1.
Factor
CODIFICACIÓN
Nivel (+) Nivel (-)
A Tamaño de partícula H F
El factor y el nivel es analizado mediante la prueba t en cada bloque, siendo el
factor el tamaño de partícula con sus niveles, de igual manera para el aceite obtenido
con Fluidos supercríticos.
52
Tabla 3-9: Tabla para recolección de datos de la etapa I.
Aceite esencial extraído por Hidrodestilación/Fluidos supercriticos
Tamaño de partícula 0,5mm Tamaño de partícula 2,0mm
(mg/100g de muestra) (mg/100g de muestra)
H1 F1
H2 F2
H3 F3
H4 F4
H5 F5
�̅� �̅�
DESV. S. DESV. S.
3.5.1.3. Técnicas de análisis e interpretación de resultados
Se realizará una prueba t de significancia de medias al 95%; Prueba t para dos
muestras independientes, donde se aplicará las siguientes ecuaciones
𝑡 =�̅�1 − �̅�2
𝑆𝑋1𝑋2 ∗ √2
𝑛
𝑆𝑋1𝑋2 = √1
2(𝑆𝑋1
2 + 𝑆𝑋22 )
3.5.2. Etapa II: Caracterización del aceite.
En esta etapa no se aplicó un diseño experimental debido a que se aplicaron
parámetros de caracterización que se encuentran en la tabla 2-6, así como también se tomó
en cuenta los mg de aceite por cada 100 gramos de muestra obtenidos de la etapa I para
el cálculo del porcentaje de rendimiento.
53
3.5.3. Etapa III: Evaluación de la actividad antibacteriana del aceite
esencial.
En esta etapa se aplicó el método de microdilución en placa para obtener la
concentración mínima inhibitoria, se realizó pruebas de solubilidad con tres solventes
tales como etanol, Propilenglicol y glicerina, con el solvente de mejor solubilidad (etanol)
se evaluó la actividad antibacteriana mediante el método de difusión en agar por
perforación frente a dos cepas Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa, a 3
concentraciones de 1mg/ml, 20mg/ml y 50 mg/ml por lo que se hará uso de un diseño
por bloques, en cada bloque se aplicó un diseño a x b (2x3) de análisis de varianza
(ANOVA) que permitió evaluar la importancia de varios factores al comparar las medias
de la variable de respuesta en los diferentes niveles de los factores.
3.5.3.1. Operacionalización de las Variables Etapa III.
Tabla 3-10 : Operacionalización de Variables Etapa III.
FACTOR O
VARIABLE
NIVELES INDICADOR (VARIABLE
DEPENDIENTE)
Tipo de cepa Staphylococcus aureus
Pseudomonas
aeruginosa
Poder de inhibición bacteriano
comparado con un control
positivo (ceftriaxona). (Halo de
inhibición en mm)
Concentración de
aceite
1mg/ml
20mg/ml
50mg/ml
3.5.3.2.Factores y dominio experimental de la etapa III.
Codificación factores (variable independiente)
Tipo de cepa: FACTOR A
El tipo de cepa utilizado para la evaluación antibacteriana es:
Staphylococcus aureus = S
Pseudomonas aeruginosa = Q
54
Concentración de aceite: FACTOR B
Al 1mg/ml = H
Al 20mg/ml = I
Al 50mg/ml = J
Tabla 3-11: Factores y Niveles Experimentales de la etapa III.
FACTOR B
F
A
C
T
O
R
A
H
1mg/ml
I
20mg/ml
J
50mg/ml
S. aureus (S)
SHr1 SIr1 SJr1
SHr2 SIr2 SJr2
SHr3 SIr3 SJr3
P. aeruginosa
(Q)
QHr1 QIr1 QJr1
QHr2 QIr2 QJr2
QHr3 QIr3 QJr3
NOTA: Este diseño estadístico fue aplicado para cada microorganismo de prueba ATCC,
siendo la variable respuesta la actividad antibacteriana mediante la medición del halo de
inhibición después de 24 horas de incubación, mismo que se realizó 3 repeticiones y 6
tratamientos (2x3) (r).
De la misma manera se aplica para el aceite esencial extraído por Fluidos
supercríticos.
3.5.3.3.Técnicas de análisis e interpretación de resultados
Para la recolección de datos en este estudio e interpretación de la actividad
antibacteriana mediante la medición del halo de inhibición se realizó el análisis de
varianza completamente al azar con 3 repeticiones, para ello se tomó en cuenta la tabla
3-11. (Porras, 2000)
55
Tabla 3-12: Tabla ANOVA para el modelo bifactorial con replicación.
F.V. S.C. G.L. C.M. Fexp
Factor A SCA a - 1 CMA CMA/CMR
Factor B SCB b - 1 CMB CMB/CMR
Interacción SC(AB) (a - 1) ( b – 1) CM(AB) CM(AB)/CMR
Residual SCR ab (r – 1) CMR
TOTAL SCT abr - 1 CMT
Fuente: (Porras, 2000)
Hipótesis general:
La hipótesis nula establece que todas las medias de la población (medias de los
niveles de los factores) son iguales, mientras que la hipótesis alternativa establece que al
menos una es diferente.
Hipótesis nula: HO: U1 = U2 = U3 = U4 =
Hipótesis alternativa: Hi: U1 ≠ U2 ≠ U3 ≠ U4 ≠
Hipótesis de estudio en cada factor
- Para el factor A (Tipo de cepa):
𝐻o: 𝐸𝑓𝑒𝑐𝑡𝑜 𝐴 = 0
𝐻1: 𝐸𝑓𝑒𝑐𝑡𝑜 𝐴 ≠ 0
𝐻o: El tipo de cepa no ejerce ningún tipo de actividad antibacteriana (halo de inhibición).
𝐻1: El tipo de cepa ejerce actividad antibacteriana (halo de inhibición).
- Para el factor B (Concentración de aceite)
𝐻o: 𝐸𝑓𝑒𝑐𝑡𝑜 𝐵 = 0
𝐻1: 𝐸𝑓𝑒𝑐𝑡𝑜 𝐵 ≠ 0
𝐻o: La concentración del aceite no influye en la actividad antibacteriana (halo de
inhibición).
𝐻1: La concentración del aceite influye en la actividad antibacteriana (halo de inhibición).
56
- Para la interacción AB (Tipo de cepa - Concentración de aceite):
𝐻o: 𝐸𝑓𝑒𝑐𝑡𝑜 𝐴𝐵 = 0
𝐻1: 𝐸𝑓𝑒𝑐𝑡𝑜 𝐴𝐵 ≠ 0
𝐻o: No hay interacción entre los factores A y B.
𝐻1: Hay interacción entre los factores A y B.
3.5.4. Etapa IV: Evaluación actividad antioxidante del aceite
Se realizó mediante el método del radical DPPH teniendo como variable
independiente la muestra de análisis y como variable respuesta la actividad antioxidante
(porcentaje de inhibición frente al radical DPPH), para ello se optó por el diseño por
bloques en el cual se realizó una comparación entre los porcentajes de inhibición del
radical libre del aceite (dos muestras de aceite por el diferente método de extracción) y el
estándar de referencia utilizado como es el Trolox mediante el diseño de varianza
univariante.
3.5.4.1. Operacionalización de las Variables Etapa IV
Tabla 3-13: Operacionalización de Variables Etapa IV.
FACTOR O
VARIABLE
NIVELES INDICADOR (VARIABLE
DEPENDIENTE)
FUENTE DE
ACTIVIDAD
ANTIOXIDANTE
Aceite esencial obtenido
por Hidrodestilación
Aceite esencial obtenido
por fluidos supercríticos
Estándar de referencia
trolox
Porcentaje de inhibición frente al
radical DPPH
57
3.5.4.2. Factores y dominio experimental de la etapa IV.
Codificación factor (variable independiente)
Fuente de actividad antioxidante: FACTOR A
La fuente de actividad antioxidante comparativa es:
Aceite obtenido por Hidrodestilación = M
Aceite obtenido por fluidos supercríticos = N
Estándar de referencia trolox = O
Tabla 3-14. Factores y Niveles Experimentales de la etapa IV
Fuente de variación
CODIFICACIÓN
Aceite de
Hidrodestilación
Aceite de
fluidos
supercríticos
Estándar de referencia
trolox
Comparación M N O
Tabla 3-15: Tabla para recolección de datos de la etapa IV.
ACEITE ESENCIAL
(Hidrodestilación / Fluidos
supercríticos) (% de inhibición
de radicales)
ESTÁNDAR DE
REFERENCIA Trolox (% de
inhibición de radicales)
Volumen
(uL)
Repeticiones Media Volumen
(uL)
Repeticiones Media
Curva de
calibración en
Hidrodestilación
Blanco 1 2 3 - Blanco 1 2 3 -
25 - - - - 25 - - - -
75 - - - - 75 - - - -
100 - - - - 100 - - - -
150 - - - - 150 - - - -
58
Se realizó cada tratamiento por triplicado y se aplica un diseño univariante que
compara la actividad antioxidante de los aceites esenciales obtenidos frente a un estándar
de referencia (trolox).
3.5.4.3.Técnicas de análisis e interpretación de resultados
Se realizó un análisis de variación unifactorial con un nivel de confianza del
95%.
Tabla 3-16: Modelo univariante
F.V. S.C. G.L. C.M. Fexp
Factor A SCA a - 1 CMA CMA/CMR
Residual SCR ab (r – 1) CMR
TOTAL SCT abr - 1 CMT
La hipótesis nula establece que no hay diferencia significativa entre las fuentes de
actividad antioxidante (aceite esencial obtenido de Hidrodestilación y Fluidos
supercríticos) y el estándar (trolox), mientras que la hipótesis alternativa establece que si
hay diferencia significativa.
Hipótesis nula: HO: U1 = U2 = U3
Hipótesis alternativa: Hi: U1 ≠ U2 ≠ U3
3.6. Técnicas e Instrumentos de Recolección de Datos (IRD).
Para la recolección de datos se usará la técnica de observación, mediante el
instrumento de guía de observación del anexo D.
Técnica de observación: Implica principalmente establecer la relación de una señal
emitida por un instrumento utilizado durante la experimentación.
59
Capítulo IV
4. Análisis y discusión de resultados
El análisis de los resultados obtenidos se realiza en cada etapa desde el control
de calidad de la materia prima (tronco y corteza de Handroanthus chrysanthus).
Además, los datos obtenidos se describieron y analizaron con el uso del software
especializado IBM® SPSS® Statistics versión 20.
4.1. Etapa I: Extracción del aceite esencial
4.1.1. Control de calidad de la materia prima
En la tabla 4-1 se observan los resultados de los parámetros de control de calidad
de la materia prima entre ellos la descripción macroscópica, microscópica, humedad y
cenizas totales planteados en la metodología MGA-FH 0040 de la Farmacopea Herbolaria
de los Estados Unidos Mexicanos.
Tabla 4-1: Parámetros de control de calidad de la materia prima del tronco y corteza de
Handroanthus crysanthus
DEFINICIÓN Consiste en la corteza seca de las ramas jóvenes.
Descripción
macroscópica
La corteza tiene un grosor aproximado de
0,5 mm a 0,8 mm y se presenta en capas
muy finas pegadas. La cara externa con
leves cicatrices que señalan presencia de
yemas axilares, presentan estrías
longitudinales algo blanquecinas y
sinuosas. La cara interna amarillenta lisa,
fractura limpia y fibrosa con olor
característico a madera.
Descripción
microscópica
Polvo de color amarillento o pardo. Al
examinar al microscopio con glicerol al
60
50% se observó fibras incoloras y paredes
ligeramente punteadas.
Humedad 35,06 + 35,62 + 35,03 =
35,24%
Cenizas
totales
0,51 + 1,10 + 1,21 =
0,94%
Fuente: (Farmacopea, 2013)
Según los parámetros establecidos en la Farmacopea herbolaria de los Estados
Unidos Mexicanos para la corteza de canela (tabla 3-4), que es la que se tomó como
referencia ya que para el tronco y corteza de Handrohanthus chrysanthus aún no se
establecen, cumplen dichos requisitos excepto la humedad ya que este parámetro fue
adicional para determinar la humedad (35,24%) de la muestra ya que se encontraba fresca,
sin embargo la temperatura en el método utilizado podría interferir debido a que en la
humedad determinada puede estar el aceite esencial.
4.1.2. Extracción por Hidrodestilación
La masa del aceite esencial obtenida por Hidrodestilación reflejada en la tabla 4-
2, a diferente tamaño 0,5 mm y 2 mm tiene una notoria diferencia en contenido por cada
100 gramos de muestra, dando como mejor rendimiento con el tamaño 0,5 mm.
61
Tabla 4-2: Miligramos de aceite esencial extraído por Hidrodestilación
Aceite esencial extraído por Hidrodestilación
Tamaño de partícula 0,5mm Tamaño de partícula 2,0mm
(mg/100g de muestra) (mg/100g de muestra)
H1 30,0 F1 24,0
H2 33,0 F2 23,0
H3 37,0 F3 15,0
H4 27,0 F4 22,0
H5 46,0 F5 25,0
�̅� 34,6 �̅� 21,8
DESV.
S.
7,37 DESV.
S.
3,96
El análisis estadístico realizado con un nivel de confianza del 95%, indica lo
siguiente:
Son muestras en las cuales su contenido de aceite tiene homogeneidad de
varianzas según la prueba de Levene (F = 1,730; p > 0,05)
La prueba t para muestras independientes indica que si hay diferencia
estadística significativa entre el contenido de aceite obtenido por cada
tamaño de partícula (t = 3,421; gl = 8; p < 0,05)
El contenido de aceite esencial obtenido se ve influenciado por el tamaño de
partícula como se observa en el gráfico 4.1, con el tamaño 0,5 mm se obtiene un mejor
rendimiento, pero con una dispersión del contenido muy alto, mientras que con el tamaño
2 mm disminuye el rendimiento, pero aumenta su homogeneidad, dicha influencia según
Navarro F y Costa J, (1993) se debe a que al disminuir el tamaño de partícula aumenta la
superficie de contacto del solvente y la fase sólida.
62
Gráfico 4.1: Barras de error de medias obtenidas del contenido de aceite esencial extraído por
hidrodestilación con los dos tamaños de partícula.
4.1.3. Extracción con Fluidos supercríticos
La masa del aceite obtenida por Fluidos supercríticos en el cual se utilizó como
solvente CO2 a diferente tamaño 0,5 mm y 2 mm se ve reflejada en la tabla 4-3 donde se
observa la diferencia en contenido por cada 100 gramos de muestra, dando como mejor
rendimiento con el tamaño 0,5 mm.
Tabla 4-3: Miligramos de aceite esencial extraído con fluidos supercríticos.
Aceite esencial extraído con fluidos supercríticos
Tamaño de partícula 0,5mm Tamaño de partícula 2,0mm
(mg/100g de muestra) (mg/100g de muestra)
H1 84,8 F1 67,4
H2 81,0 F2 60,4
H3 91,2 F3 50,1
H4 83,4 F4 90,2
H5 100,3 F5 65,2
�̅� 88,14 �̅� 66,66
DESV.
S.
7,78 DESV.
S.
14,75
63
El análisis estadístico realizado con un nivel de confianza del 95%, indica lo
siguiente:
Son muestras en las cuales su contenido de aceite tiene homogeneidad de
varianzas según la prueba de Levene (F = 0,577; p > 0,05)
La prueba t para muestras independientes indica que si hay diferencia
estadística significativa entre el contenido de aceite obtenido por cada
tamaño de partícula (t = 2,881; gl = 8; p < 0,05)
Al igual que el contenido de aceite esencial obtenido por hidrodestilación se ve
influenciado por el tamaño de partícula en cuanto al aumento de superficie de contacto
en el sistema de extracción como se observa en el gráfico 4.2, sin embargo, con el tamaño
0,5 mm se obtiene un mejor rendimiento y aumenta su homogeneidad, mientras que con
el tamaño 2 mm disminuye el rendimiento y presenta mayor dispersión de contenido, lo
que indica que el método de extracción por fluidos supercríticos es más viable de
aplicación.
Gráfico 4.2: Barras de error de medias obtenidas del contenido de aceite esencial extraído con
fluidos supercríticos con los dos tamaños de partícula.
64
4.2. Etapa II: Caracterización del aceite esencial
4.2.1. Porcentaje de rendimiento
Con los datos obtenidos en la etapa I y mediante el uso de la ecuación 3.1 se
obtuvieron los siguientes resultados de porcentaje de rendimiento (tabla 4-4).
Tabla 4-4: Porcentaje de rendimiento de las muestras de aceite esencial
Aceite esencial extraído por Hidrodestilación
Tamaño de partícula 0,5mm Tamaño de partícula 2,0mm
(% de rendimiento) (% de rendimiento)
H1 0,03 F1 0,02
H2 0,03 F2 0,02
H3 0,04 F3 0,01
H4 0,03 F4 0,02
H5 0,05 F5 0,02
�̅� 0,036 �̅� 0,018
Aceite esencial extraído por Fluidos supercríticos
Tamaño de partícula 0,5mm Tamaño de partícula 2,0mm
(% de rendimiento) (% de rendimiento)
H1 0,08 F1 0,07
H2 0,08 F2 0,06
H3 0,09 F3 0,05
H4 0,08 F4 0,09
H5 0,10 F5 0,06
�̅� 0,086 �̅� 0,066
Las medias de los porcentajes de rendimiento de los aceites esenciales obtenidos
por los métodos de hidrodestilación y fluidos supercríticos se encuentran en el rango de
aceites extraídos de 0,01-6 %, como Stashenko (2009) lo menciona en su trabajo de
investigación, sin embargo en la tabla 4-4 se observa que por el método de fluidos
supercríticos y al disminuir el tamaño de partícula el porcentaje de rendimiento aumenta
65
debido a que mejora la superficie de contacto en el sistema de extracción como lo indican
Navarro F y Costa J (1993).
4.2.2. Características organolépticas
Se realizó al finalizar la extracción tanto por Hidrodestilación como por fluidos
supercríticos, y los datos obtenidos se observan en las tablas 4-5 y 4-6.
Tabla 4-5: Características organolépticas del aceite esencial extraído por hidrodestilación.
Aceite extraído por Hidrodestilación
Tamaño de partícula 0,5mm Tamaño de partícula 2,0mm
Color Olor Textura Color Olor Textura
H1 Incoloro madera aceitosa F1 Incoloro madera aceitosa
H2 Incoloro madera aceitosa F2 Incoloro madera aceitosa
H3 Incoloro madera aceitosa F3 Incoloro madera aceitosa
H4 Incoloro madera aceitosa F4 Incoloro madera aceitosa
H5 incoloro madera aceitosa F5 incoloro madera aceitosa
Tabla 4-6: Características organolépticas del aceite esencial extraído por fluidos supercríticos
Aceite extraído con Fluidos supercríticos
Tamaño de partícula 0,5mm Tamaño de partícula 2,0mm
Color Olor Textura Color Olor Textura
D1 anaranjado madera viscosa C1 anaranjado madera viscosa
D2 anaranjado madera viscosa C2 anaranjado madera viscosa
D3 anaranjado madera viscosa C3 anaranjado madera viscosa
D4 anaranjado madera viscosa C4 anaranjado madera viscosa
D5 anaranjado madera viscosa C5 anaranjado madera viscosa
Como se observa en la tabla 4-5 los aceites obtenidos por hidrodestilación, en los
diferentes tamaños de partícula, son incoloros y tienen las mismas características en olor
y textura, mientras que estos difieren de los aceites obtenidos con fluidos supercríticos
(tabla 4-6), ya que en ellos aumentan la viscosidad y adquieren un color anaranjado. En
66
la extracción con fluidos supercríticos el aceite extraído viene acompañado de cera y otros
compuestos de alto peso molecular según lo explican Peredo y Col. (2009), sin embargo,
a pesar de esas diferencias tienen una característica en común como es el olor fuerte a
madera húmeda que es característico en aceites extraídos de troncos y cortezas.
4.2.3. Características físico-químicas
Se realizó tomando una muestra al azar de cada tamaño de partícula en cada
método de extracción.
Índice de refracción
Con las muestras escogidas se procedió a determinar el índice de refracción en un
refractómetro de ABBÉ obteniendo los resultados de la tabla 4-7.
Tabla 4-7: Determinación del índice de refracción
Hidrodestilación
(N)
Fluidos
supercríticos
(N)
Tamaño
partícula
0,5 mm 1,431 0,5 mm 1,470
2,0 mm 1,424 2,0 mm 1,464
Los índices de refracción obtenidos tienen una similitud entre los métodos de
extracción, sin embargo, no todos se encuentran en el rango de índice de refracción para
aceites y grasas que es de 1,440-1,480 indicado por Medina G, (2016).
4.3.2.2. Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas
Se realizó el perfil cromatográfico en 2 muestras diferentes de aceite esencial
obtenidos por cada método de extracción (véase anexo H), en las cuales se logró separar
los compuestos constituyentes del aceite esencial.
67
Tabla 4-8: Compuestos determinados por CG-EM en el aceite esencial extraído por
hidrodestilación
Comp
.
N°
Aceite esencial obtenido por hidrodestilación
Tamaño de partícula 0,5 mm
Tiempo
retención
, min
Proba-
bilidad
, %
Nombre Estructura
1 18,78 10,8 1-Bromo-3-(2-
Bromoetil) nonano,
C11H22Br2
2 19,73 75,2 2,6-Di-terc-butil-4-
metilfenol, C15H24O
3 21,22 81,1 Ftalato de dietilo
C12H14O4
4 23,53 10,9 Decano,5,6-bis
(2,2dimetilpropilideno
)-,(5E, 6Z)-, C20H38
5 29,71 85,2 Palmitato de etilo,
C18H36O2
68
6 32,79 31,1 Oleato de etilo,
C20H38O2
7 36,55 97,2 2,2'-Metilenobis (6-
tert-butil-4 metilfenol),
C23H32O2
Comp
.
N°
Tamaño de partícula 2,0 mm
Tiempo
retención
, min
Proba-
bilidad
, %
Nombre estructura
1 21,23 79,8 Ftalato de dietilo
C12H14O4
2 23,53 11,5 Decano,5,6-bis
(2,2dimetilpropilideno
)-,(5E, 6Z)-, C20H38
3 32,78 32,5 Oleato de etilo,
C20H38O2
69
4 36,56 98,0 2,2'-Metilenobis (6-
tert-butil-4 metilfenol),
C23H32O2
En la tabla 4-8 se observan los resultados obtenidos por CG-EM, que muestran la
relación de los compuestos separados e identificados. En la muestra de aceite del tamaño
de partícula de 0,5 mm, se observa una mayor cantidad de compuestos separados en
comparación con la del tamaño de partícula 2 mm. Sin embargo, existe concordancia en
el tiempo de retención y en la probabilidad entre 4 compuestos que se obtienen en ambas
muestras.
Entre los compuestos identificados se encuentra un terpeno (decano,5,6-bis
(2,2dimetilpropilideno)-,(5E, 6Z)-); se sabe que los terpenos han mostrado actividad
biológica, sin embargo no se ha evidenciado actividad en este terpeno específico.
(Masahisa D, 2002)
Además, es importante resaltar que la manipulación y el almacenamiento de los
aceites esenciales juegan un papel importante en su análisis puesto que por la estabilidad
térmica de los constituyentes químicos volátiles pueden disminuir su detección.
(Navarrete C, 2010)
70
Tabla 4-9: Compuestos determinados por CG-EM en el aceite esencial extraído por fluidos
supercríticos
Comp
.
N°
Aceite esencial obtenido por fluidos supercríticos
Tamaño de partícula 0,5 mm
Tiempo
retención
, min
Proba-
bilidad
, %
Nombre Estructura
1 21,23 79,8 Ftalato de dietilo
C12H14O4
2 23,48 17,5 Decano,5,6-bis
(2,2dimetilpropilideno
)-,(5E, 6Z)-, C20H38
3 29,73 91,4 Palmitato de etilo,
C18H36O2
4 32,65 55,3 Éster etílico del ácido
linoleico, C20H36O2
5 32,85 28,9 Oleato de etilo,
C20H38O2
71
6 33,32 81,3 Estearato de etilo,
C20H40O2
7 47,80 64,5 Stigmasterol, C29H48O
8 48,59 77,9 gamma-sitosterol,
C23H32O2
9 50,0 78,4 gamma-sitostenona,
C29H48O
Comp
.
N°
Tamaño de partícula 2,0 mm
Tiempo
retención
, min
Proba-
bilidad
, %
Nombre estructura
1 21,29 24,6 Methyl12,14-
dihomojuvenate,
C18H30O3
2 23,53 14,2 Decano,5,6-bis
(2,2dimetilpropilideno
)-,(5E, 6Z)-, C20H38
3 29,76 91,3 Palmitato de etilo,
C18H36O2
72
4 32,84 29,1 Oleato de etilo,
C20H38O2
5 32,84 28,0 Éster etílico del ácido
elaidico, C20H38O2
6 36,6 71,5 Adipato de bis (2-
etilhexilo), C22H42O4
7 42,86 63,0 Stigmasterol, C29H48O
8 48,63 73,6 gamma-sitosterol,
C23H32O2
9 49,99 71,9 gamma-sitostenona,
C29H48O
Los resultados obtenidos por fluidos supercríticos (tabla 4-9), muestran una mayor
cantidad de compuestos en comparación con los obtenidos por hidrodestilación. Sin
embargo, hay coincidencia con los compuestos en el tiempo de retención bajo (por debajo
de los 40 min). Los compuestos obtenidos a tiempo de retención mayores constituyen
esteroles; entre los compuestos identificados se encuentra el stigmasterol, el cual en
estudios reportados por Rdnattural, (2013) indica que puede usarse para reducir el
colesterol y actúa como antioxidante.
73
Se conoce que ciertos compuestos de tipo esteroles son fotosensibles (Martínez
A, 2002). Esto podría justificar porque no se obtuvieron en los aceites obtenidos por
hidrodestilación ya que éste método además de utilizar altas temperaturas el equipo
utilizado no fue protegido de la luz, en comparación con el equipo de fluidos supercríticos
que es cerrado y hermético.
4.3. Etapa III: Evaluación de la actividad antibacteriana del aceite
Concentración Mínima inhibitoria (CMI)
Una vez que se realizó la solubilidad de los aceites en etanol, Propilenglicol y
glicerina se determinó que el etanol fue el mejor disolvente.
Los aceites esenciales obtenidos por los diferentes métodos de extracción fueron
evaluados en un rango de concentraciones de 100mg/ml – 0,19mg/ml, la evaluación se
realizó visualmente, estos resultados se utilizaron para la selección de las concentraciones
en el método de difusión por perforación, los resultados se presentan en la tabla 4-10.
Tabla 4-10: Concentración mínima inhibitoria de los aceites esenciales
Aceite esencial CMI
Staphylococssus aureus Pseudomonas aeruginosa
Hidrodestilación 25 mg/ml ---
Fluidos supercríticos 12,5 mg/ml 50mg/ml
Con los resultados establecidos se determinaron las 3 concentraciones que se
evaluaron en el método de difusión en agar por perforación las cuales son 1 mg/ml, 20
mg/ml y 50 mg/ml, la menor concentración se estableció mediante el control positivo que
se utilizó que fue la ceftriaxona a 1mg/ml.
Como se observa en la tabla 4-10 con la cepa Pseudomonas aeruginosa no se pudo
evidenciar visualmente la concentración mínima inhibitoria con lo cual ya se predice la
inexistencia de actividad antimicrobiana con el aceite obtenido por hidrodestilación.
74
4.3.1. Evaluación de la actividad antibacteriana en el aceite obtenido por
Hidrodestilación
En la tabla 4-11 se evidencian los halos de inhibición obtenidos por el método de
difusión en agar por perforación frente a dos cepas bacterianas entre ellas Staphylococcus
aureus y Pseudomonas aeruginosa.
Tabla 4-11: Halos de inhibición del aceite esencial obtenido por Hidrodestilación
FACTOR B
F
A
C
T
O
R
A
H
1mg/ml
I
20mg/ml
J
50mg/ml
S. aureus (S)
0 0 12
0 0 11
0 0 12
P. aeruginosa
(Q)
0 0 0
0 0 0
0 0 0
Los resultados encontrados con el aceite esencial obtenido por hidrodestilación no
arrojan actividad antibacteriana frente a la cepa Pseudomonas aeruginosa, mientras que
la cepa Staphylococcus aureus presenta halos de inhibición a 50mg/ml de concentración,
sin embargo, según el rango del criterio de interpretación de susceptibilidad
antimicrobiana de la tabla 2-5 la actividad es intermedia.
Puesto que solo se evidencia actividad antibacteriana intermedia frente a
Staphylococcus aureus no es necesario aplicar un análisis estadístico.
75
4.3.2. Evaluación de la actividad antibacteriana en el aceite obtenido por
fluidos supercríticos
En la tabla 4-12 se evidencian los halos de inhibición obtenidos por el método de
difusión en agar por perforación frente a las cepas bacterianas entre ellas Staphylococcus
aureus y Pseudomonas aeruginosa.
Tabla 4-12: Halos de inhibición del aceite esencial obtenido con Fluidos supercríticos
FACTOR B
F
A
C
T
O
R
A
H
1mg/ml
I
20mg/ml
J
50mg/ml
S. aureus (S)
0 12 19
0 13 23
0 15 20
P. aeruginosa
(Q)
0 0 13
0 0 15
0 0 14
En los resultados se evidencia los correspondientes halos de inhibición frente a
cada cepa siendo la de Staphylococcus aureus la que mayor cantidad de halos se obtuvo,
mientras que con Pseudomonas aeruginosa solo se observa a alta concentración y según
los criterios de interpretación de la tabla 2-5 se obtiene lo siguiente:
Staphylococcus aureus: a 1 mg/ml es resistente, 20mg/ml con una media
de 13 es intermedia y a 50mg/ml con una media de 21 es sensible.
Pseudomonas aeruginosa: a 1 y 20 mg/ml es resistente y a 50mg/ml con
una media de 14 es intermedia.
76
Análisis estadístico de actividad antibacteriana.
El análisis en esta etapa tuvo como finalidad la evaluación de la actividad
antibacteriana con sus diferentes factores y niveles.
Tabla 4-13: Esquema de diseño experimental para comparación de factores
FACTOR A
FACTOR B (Concentración de aceite)
H
1mg/ml
I
20mg/ml
J
50mg/ml
S. aureus (S)
0,00 12,00 19,00
0,00 13,00 23,00
0,00 15,00 20,00
Promedio 0,00 13,33 20,67
Desviación
estándar
0,00 1,53 2,08
P. aeruginosa
(Q)
0,00 0,00 13,00
0,00 0,00 15,00
0,00 0,00 14,00
Promedio 0,00 0,00 14,00
Desviación
estándar
0,00 0,00 1,00
Para evaluar los efectos de los factores establecidos experimentalmente se usó el
Software IBM SPSS Statistics, versión 20. El análisis entre las concentraciones y las
cepas de prueba se realizó mediante un diseño A x B análisis de varianzas (ANOVA) de
la siguiente forma:
El factor A con 2 niveles (cepas bacterianas)
El factor B con 3 niveles (concentración del aceite)
77
Tabla 4-14: Análisis de varianza de dos factores
Origen de las
variaciones
Suma de
cuadrados
g.l Promedio de
los
cuadrados
F Sig.
Cepa bacteriana 200,000 1 200,000 156,522 0,000
Concentración
de aceite
917,333 2 458,667 358,957 0,000
Interacción 133,333 2 66,667 52,174 0,000
Dentro del grupo 15,333 12 1,278
Total
2418,000
18
El análisis de varianza indica que existe un efecto estadísticamente influyente
entre el factor A (cepas bacterianas) (F = 156,522; p < 0,05), también existe un efecto
significativo entre el factor B (concentración de aceite) (F = 358,957; p < 0,05) y el efecto
de la interacción de los factores es significativo (F = 52,174; p < 0,05).
Con el análisis estadístico de los efectos en cada factor es que se acepta la Hi de
la hipótesis general que indica que existe una diferencia significativa en los grupos o
factores (cepas bacterianas, concentración de aceite e interacciones) de estudio.
El análisis gráfico también permite observar lo siguiente:
En el gráfico de perfil 4.3 se evidencia la notable inhibición del aceite extraído
por fluidos supercríticos frente a la cepa de Staphylococcus aureus mientras que para la
cepa Pseudomonas aeruginosa no presenta inhibición.
78
Gráfico 4.3: Gráfico de perfil entre las medias marginales de los halos de inhibición y las cepas
bacterianas
En el grafico 4.4 se observa que a medida que la concentración de aceite aumenta
la inhibición también lo que indica una relación proporcional
Gráfico 4.4: Gráfico de perfil entre las medias marginales de los halos de inhibición y las
concentraciones
79
Finalmente, en el grafico 4.5 se evidencia que hay mayor inhibición con la cepa
de Staphylococcus aureus puesto que a las dos concentraciones (20 y 50 mg/ml) presenta
un halo, mientras que en la cepa de Pseudomonas aeruginosa solo se observa inhibición
en su mayor concentración (50mg/ml) por lo que es evidente la sensibilidad frente a la
primera cepa.
Gráfico 4.5: Gráfico de perfil entre el halo de inhibición frente a la cepa y la concentración
Como se observa tanto en el análisis estadístico como en los criterios de
interpretación de la CLSI de la tabla 2-5 la cepa con mayor sensibilidad es la de
Staphylococcus aureus a las concentraciones de 20 y 50 mg/ml, mientras que
Pseudomonas aeruginosa en su alta concentración tiene inhibición intermedia.
De acuerdo a los resultados obtenidos en la identificación de los compuestos en
los aceites se observa que el aceite obtenido por fluidos supercríticos es el que exhibe
actividad antibacteriana, ésta actividad se podría atribuir a los esteroles identificados.
80
4.4. Etapa IV: Evaluación de la actividad antioxidante del aceite.
Para la evaluación de la actividad antioxidante se procedió a utilizar el método
DPPH presente en el trabajo de investigación de Coronel (2017) con algunas
modificaciones.
4.4.1. Evaluación del porcentaje de inhibición en el estándar de referencia
Trolox.
Condiciones espectrofotométricas
El estándar para la calibración del método es el TROLOX (6-hydroxy-
2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid).
Solvente que se utilizó metanol.
Barrido espectrofotométrico
Se realizó la curva de calibración utilizando el trolox en una concentración de 0,09
mg/ml a un rango de longitud de onda de barrido de 400-600 nm, obteniendo la longitud
de onda máxima de 517 nm (gráfico 4.6), que se encuentra en el rango de luz visible del
espectro electromagnético.
Gráfico 4.6: Longitud de onda máxima para el estándar trolox
81
Con la longitud de onda máxima se procedió a realizar la curva de calibración
obteniendo los datos de la tabla 4-15, misma que fue base para la aplicación de las
muestras de aceite obtenidas por hidrodestilación y fluidos supercríticos.
Tabla 4-15: Datos de la curva de calibración con Trolox.
Volumen
Trolox (uL)
Absorbancias de muestras de
trolox
1 2 3 Promedio
1 BLANCO 0,291 0,29 0,291 0,291
2 25 0,283 0,282 0,283 0,283
3 75 0,271 0,273 0,271 0,272
4 100 0,265 0,269 0,265 0,266
5 150 0,254 0,252 0,254 0,253
Se realizó el promedio de tres curvas de calibración con un alto coeficiente de
correlación obteniendo un R2 de 0,9974 (gráfico 4.7).
Gráfico 4.7: Curva de calibración del estándar trolox
y = -0,0002x + 0,289R² = 0,9974
0.250
0.255
0.260
0.265
0.270
0.275
0.280
0.285
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Ab
sorb
an
cia
Volumen uL
82
Relación lineal obtenida:
𝑨 = −𝟎, 𝟎𝟎𝟎𝟐 𝑽 + 𝟎, 𝟐𝟖𝟗
Donde:
A: corresponde a la absorbancia medida a 517nm.
V: corresponde al volumen en uL de trolox.
Con los resultados de la tabla 4-15 se realizó el cálculo del porcentaje de inhibición
mediante la ecuación 2.1.
Tabla 4-16: Resultados del % de inhibición con el trolox
Volumen trolox
(uL) Absorbancia % Inhibición
0 Blanco 0,291 0
1 25 0,283 2,749
2 75 0,272 6,529
3 100 0,266 8,591
4 150 0,253 13,058
En la tabla 4-16 se observan que los porcentajes de inhibición son bajos debido a que la
concentración de trolox es baja, con estos datos se realizó el gráfico 4.8
Gráfico 4.8: Porcentaje de inhibición vs Volumen del trolox uL
y = 0,0825x + 0,5155R² = 0,9979
0.000
2.000
4.000
6.000
8.000
10.000
12.000
14.000
0 20 40 60 80 100 120 140 160
% I
nh
ibic
ión
Volumen trolox uL
83
Relación lineal obtenida:
% 𝑰𝒏𝒉𝒊𝒃𝒊𝒄𝒊ó𝒏 = 𝟎, 𝟎𝟖𝟐𝟓 𝑽 + 𝟎, 𝟓𝟏𝟓𝟓
Mediante la relación lineal se obtiene el volumen necesario para una inhibición
del 50% utilizando la concentración de 0,09 mg/ml.
V = 50% − 0,5155
0,0825
𝐕 = 𝟓𝟗𝟗, 𝟖𝟏 𝐮𝐋
4.4.2. Evaluación del porcentaje de inhibición en el Aceite obtenido por
Hidrodestilación
Con la muestra de aceite extraída por hidrodestilación se obtuvo los datos de la
tabla 4-17.
Tabla 4-17: Resultados de absorbancias del aceite obtenido por hidrodestilación
Volumen
muestra
(uL)
Absorbancias de obtenidas por
hidrodestilación
1 2 3 Promedio
1 BLANCO 0,271 0,271 0,284 0,275
2 25 0,263 0,27 0,266 0,266
3 75 0,252 0,265 0,251 0,256
4 100 0,238 0,264 0,248 0,250
5 150 0,234 0,252 0,235 0,240
Se realizó el promedio en las tres repeticiones y se utilizó para el cálculo del
porcentaje de inhibición mediante el uso de la ecuación 2.1, así como también el factor
de equivalencia a la concentración que se utilizó en el estándar de referencia.
84
Tabla 4-18: Resultados del porcentaje de inhibición del aceite obtenido por Hidrodestilación
Volumen aceite
hidrodestilación
(uL)
Absorbancia Factor % Inhibición
1 0 0,275 133,33 0
2 25 0,266 133,33 0,025
3 75 0,256 133,33 0,052
4 100 0,250 133,33 0,068
5 150 0,240 133,33 0,095
Con los datos obtenidos en la tabla 4-18 se realizó el gráfico 4.9
Gráfico 4.9: Porcentaje de inhibición vs volumen de aceite uL.
Relación lineal obtenida:
% 𝑰𝒏𝒉𝒊𝒃𝒊𝒄𝒊ó𝒏 = 𝟎, 𝟎𝟎𝟎𝟔 𝑽 + 𝟎, 𝟎𝟏𝟎𝟏
Mediante la relación lineal se obtiene el volumen del aceite esencial obtenido
por hidrodestilación necesario para una inhibición del 50% utilizando la concentración
de 0,09 mg/ml.
V = 50% − 0,0101
0,0006
𝐕 = 𝟖𝟑𝟑𝟏𝟔, 𝟓 𝐮𝐋
y = 0,0006x + 0,0101R² = 0,9991
0.000
0.020
0.040
0.060
0.080
0.100
0.120
0 20 40 60 80 100 120 140 160
% I
nh
ibic
ión
Volumen aceite uL
85
Como se evidencia el volumen necesario de aceite esencial obtenido por
hidrodestilación para llegar al 50% de inhibición, es alto en comparación con el volumen
del estándar utilizado.
4.4.3. Evaluación del porcentaje de inhibición en el Aceite obtenido con
Fluidos supercríticos
Con la muestra de aceite extraído por Fluidos supercríticos se obtuvo los datos de
la tabla 4-19.
Tabla 4-19: Resultados de absorbancias del aceite obtenido con fluidos supercríticos
Volumen
muestra
(uL)
Absorbancias de muestras de
muestra por fluidos
1 2 3 Promedio
1 BLANCO 0,294 0,293 0,287 0,291
2 25 0,282 0,282 0,271 0,278
3 75 0,267 0,27 0,257 0,265
4 100 0,262 0,262 0,251 0,258
5 150 0,246 0,246 0,236 0,243
Se realizó el promedio en las tres repeticiones y se utilizó para el cálculo del
porcentaje de inhibición mediante el use de la ecuación 2.1, así como también el factor
de equivalencia a la concentración que se utilizó en el estándar de referencia.
86
Tabla 4-20: Resultados del porcentaje de inhibición del aceite obtenido con fluidos supercríticos
Volumen
aceite
fluidos (uL)
Absorbancia Factor % Inhibición
1 0 0,291 55,6 0
2 25 0,278 55,6 0,080
3 75 0,265 55,6 0,161
4 100 0,258 55,6 0,204
5 150 0,243 55,6 0,297
Con los datos obtenidos en la tabla 4-20 se realizó el gráfico 4,10
Gráfico 4.10: Porcentaje de inhibición vs volumen de aceite uL
Relación lineal obtenida:
% 𝑰𝒏𝒉𝒊𝒃𝒊𝒄𝒊ó𝒏 = 𝟎, 𝟎𝟎𝟏𝟕 𝑽 + 𝟎, 𝟎𝟑𝟒
y = 0,0017x + 0,034R² = 0,9984
0.000
0.050
0.100
0.150
0.200
0.250
0.300
0.350
0 20 40 60 80 100 120 140 160
% I
nh
ibic
ión
Volumen uL
87
Mediante la relación lineal se obtiene el volumen de aceite esencial obtenido por
fluidos supercríticos necesario para una inhibición del 50% utilizando la concentración
de 0,09 mg/ml.
V = 50% − 0,034
0,0017
𝐕 = 𝟐𝟗𝟑𝟗𝟏, 𝟕𝟔 𝐮𝐋
Como se evidencia el volumen necesario de aceite esencial obtenido por fluidos
supercríticos para llegar al 50% de inhibición es alto en comparación con el volumen del
estándar utilizado, sin embargo, es menor que el necesario con el aceite obtenido por
hidrodestilación.
4.4.4. Comparación del estándar de referencia Trolox y los aceites.
En la tabla 4-21 mediante las relaciones lineales obtenidas de los gráficos 4.8; 4.9
y 4.10 se comparan los volúmenes necesarios para alcanzar el 50% de inhibición a una
misma concentración.
Tabla 4-21: Comparación de concentraciones
%Inhibición
antioxidante b a
Volumen
(uL)
Volumen
ml
Concen-
tración
(mg/ml)
Trolox 50 0,5155 0,0825 559,81 0,6 0,09
Aceite por
hidrodestilación 50 0,0101 0,0006 83316,50 83,3 0,09
Aceite con
fluidos
supercríticos
50 0,034 0,0017 29391,76 29,4 0,09
Existe una diferencia notable entre los volúmenes necesarios para llegar al 50%
de inhibición, los cuales se evidencian en la tabla 4-21.
88
Con los datos tabulados en la tabla 4-22 se realizó el grafico 4.11 donde se
observa el comportamiento de los aceites en comparación con el estándar trolox.
Tabla 4-22: Comparación de porcentajes de inhibición de los aceites y el estándar
N° Volumen
(uL)
Estándar Trolox Aceite
Hidrodestilación
Aceite
Fluidos
supercríticos
1 25 2,749 0,025 0,080
2 75 6,529 0,052 0,161
3 100 8,591 0,068 0,204
4 150 13,058 0,095 0,297
En donde la serie 1 representa el estándar de referencia trolox, la serie 2 el aceite
obtenido con fluidos supercríticos y la serie 3 el aceite obtenido por hidrodestilación,
como se observa hay una diferencia altamente evidente entre el comportamiento
antioxidante del trolox y los aceites, así como una mínima diferencia de inhibición entre
los dos aceites, lo que indican que no funcionan como antioxidante.
0.000
2.000
4.000
6.000
8.000
10.000
12.000
14.000
0 20 40 60 80 100 120 140 160
% I
nh
ibic
ión
Volumen uL
Series1 Series2 Series3
Gráfico 4.11: Comparación entre el estándar trolox y los aceites obtenidos
89
4.4.5. Análisis estadístico de la actividad antioxidante
El análisis de la actividad antioxidante tuvo como finalidad evaluar el comportamiento
de los aceites obtenidos por diferente método de extracción y el estándar de referencia
trolox.
Tabla 4-23: Datos del porcentaje de inhibición de las fuentes de actividad antioxidante
N° Estándar de
referencia trolox
Aceite obtenido por
Hidrodestilación
Aceite obtenido por
fluidos supercríticos
1 0,000 0,000 0,000
2 2,749 0,025 0,080
3 6,529 0,052 0,161
4 8,591 0,068 0,204
5 13,058 0,095 0,297
Promedio 6,185 0,048 0,148
Desviación
estándar
5,080 0,037 0,114
Para la comparación de los niveles del factor establecido experimentalmente se
usó el Software IBM SPSS Statistics, versión 20. El análisis univariante se presenta de la
siguiente forma:
El factor A con 3 niveles (fuentes de actividad antioxidante)
Tabla 4-24: Análisis univariante
Origen de las
variaciones
Suma de
cuadrados
g.l Promedio de
los
cuadrados
F Sig.
Fuente de act.
antioxidante
123,545 2 61,773 7,178 0,009
Error 103,268 12 8,606
Total 294,696
15
90
El análisis estadístico realizado con un nivel de confianza del 95%, indica que la
variable dependiente (porcentaje de inhibición) presenta una diferencia significativa entre
sus niveles (aceites de prueba y estándar trolox) (F = 7,178; p < 0,05), por lo que se acepta
la Hi.
Mediante el gráfico de perfil de medias se observa claramente la diferencia
evidente entre los aceites y el estándar de referencia trolox. (Gráfico 4.12)
Gráfico 4.12: Gráfico de perfil de medias marginales de los porcentajes de inhibición frente a los
aceites y el estándar
Finalmente, en el diagrama de barras se evidencia el intervalo de porcentaje de
inhibición de los aceites obtenidos en cada método de extracción y el estándar de
referencia utilizado trolox.
91
Gráfico 4.13: Diagrama de barras de error del porcentaje de inhibición frente a los aceites y el
estándar de referencia.
Al igual que en el gráfico de perfil se evidencia la diferencia del porcentaje de
inhibición del estándar de referencia con los aceites obtenidos, así mismo se observa la
baja diferencia de porcentaje de inhibición entre los aceites de prueba, siendo el aceite
obtenido por fluidos supercríticos con mayor porcentaje lo cual podría deberse a que en
su composición mediante la cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas
se detectó el stigmasterol, compuesto que según Panda S y otros (2008) en investigaciones
relacionadas sirve como antioxidante, sin embargo ninguno de los aceites presenta
actividad antioxidante representativa relacionándolo con el estándar de referencia trolox.
92
Capítulo V
5. Conclusiones y Recomendaciones
5.1. Conclusiones
El aceite esencial extraído por fluidos supercríticos presenta actividad
antibacteriana frente a Staphylococcus aureus (ATCC 25923) a una concentración
de 50mg/ml, por otra parte, los aceites esenciales extraídos por hidrodestilación y
fluidos supercríticos no presentaron actividad antioxidante representativa.
Al realizar el control de calidad de la materia prima (tronco y corteza de la especie
Handroanthus chrysanthus) se encontró que cumple con los parámetros
establecidos de la muestra tomada como referencia (corteza de canela) según la
farmacopea herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos (tabla 4-1), además
presenta 35,24% de humedad.
Se extrajo el aceite esencial del tronco y corteza de la especie Handroanthus
chrysanthus mediante dos métodos de extracción, obteniéndose los resultados por
cada 100 gramos de muestra, en hidrodestilación 34,6±7,4 mg con 0,5 mm de
tamaño de partícula y 21,8± 3,9 mg con 2,0 mm de tamaño de partícula y por
fluidos supercríticos 88,1± 7,8 mg con 0,5 mm de tamaño de partícula y 66,7±
14,7 mg con 2,0 mm de tamaño de partícula.
Se realizó la caracterización de los aceites esenciales obtenidos por ambos
métodos, tanto las características organolépticas (tablas 4-5 y 4-6) como las físico-
químicas y mediante cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas
donde se evidenció la presencia de esteroles (stigmasterol y sitosterol) solo en el
aceite esencial extraído por fluidos supercríticos.
La concentración mínima inhibitoria del aceite esencial extraído por
hidrodestilación fue de 25mg/ml frente a Staphylococcus aureus, mientras que
frente a Pseudomonas aeruginosa no presentó concentración mínima inhibitoria,
93
y para el aceite esencial extraído por fluidos supercríticos fue de 12,5 mg/ml frente
a Staphylococcus aureus y 50 mg/ml frente a Pseudomonas aeruginosa.
En el aceite esencial extraído por hidrodestilación, según los criterios de
interpretación de la CLSI (tabla 2-7) se evidencia que frente a Staphylococcus
aureus (a 50 mg/ml) presenta actividad intermedia, mientras que frente a
Pseudomonas aeruginosa presenta resistencia, por otro lado el aceite esencial
extraído por fluidos supercríticos frente a Staphylococcus aureus (a 50 mg/ml)
presenta sensibilidad y (a 20mg/ml) actividad intermedia y frente a Pseudomonas
aeruginosa (a 50 mg/ml) presenta actividad intermedia.
Se determinó mediante el método 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH) que, a una
concentración de 0,09mg/ml del estándar de referencia trolox (antioxidante) se
necesita 0,6 ml para inhibir el 50%, mientras que para el aceite extraído por
hidrodestilación a la misma concentración necesita 83,3 ml y para el aceite
extraído por fluidos supercríticos 29,4 ml.
5.2. Recomendaciones
Utilizar como método de extracción de aceites esenciales el método de fluidos
supercríticos.
Ampliar la aplicación del aceite esencial extraído por fluidos supercríticos como
tensoactivo o para la formulación de productos de uso tópico.
Realizar un estudio del aceite esencial extrayendo de otra parte de la especie
Handroanthus chrysanthus como las hojas o flores o especie del mismo género.
Ampliar la investigación sobre los esteroles como el stigmasterol para futuros
fines en tratamientos del colesterol.
Evaluar otro tipo de propiedad fitoterapéutica como la actividad antiinflamatoria
en el aceite esencial obtenido por fluidos supercríticos.
94
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101
7. Anexos
Anexo A: Árbol de problemas
102
Anexo B: Diagrama de flujo para la metodología realizada
103
104
Anexo C: Categorización de variables
Aceite esencial de tronco y corteza de
Handroanthus chrysanthus
Productos naturales
Farmacognosia
Definición: aceite
esencial Rendimiento Propiedades físicas y
química
Propiedades Fitoterapéuticas
Presencia y distribución
en la naturaleza
Actividad antioxidante Actividad antibacteriana
Técnicas de evaluación
Métodos de extracción
Parámetros de caracterización de
aceites esenciales
Metabolitos primarios y
secundarios
105
Anexo D: Matriz de Operacionalización de Variables
OBJETIVO GENERAL
EVALUAR LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA Y ANTIOXIDANTE DEL ACEITE ESENCIAL EXTRAÍDO DEL TRONCO Y
CORTEZA DE HANDROANTHUS CHRYSANTHUS.
ETAPAS DE ANÁLISIS
OBJETIVO ESPECÍFICO 1: Realizar un estudio de parámetros de calidad de la materia prima.
OBJETIVO ESPECÍFICO 2: Extraer el aceite esencial del tronco y corteza de Handroanthus chrysanthus mediante hidrodestilación y fluidos
supercríticos.
FACTOR O VARIABLE DIMENSIÓN NIVEL INDICADOR
MÉTODO DE EXTRACCIÓN Sistemas de extracción
(solido-líquido)
Hidrodestilación
Fluidos supercríticos
Rendimiento de extracción (mg de aceite por
cada 100 g de muestra) TAMAÑO DE PARTÍCULA
Diferenciación de tamaños
por superficie activa para
extracción (tamizaje).
Unidades de medida mm
0,5
2,0
OBJETIVO ESPECÍFICO 4: Evaluar si el aceite esencial extraído del tronco y corteza de Handroanthus chrysanthus presenta actividad
antibacteriana.
TIPO DE CEPA
Diferenciación de
actividades y aplicación
Staphylococcus
aureus
Pseudomonas
aeruginosa
Poder de inhibición bacteriano comparado con
patrón de actividad estándar (Halo de inhibición
en mm) CONCENTRACIÓN DE
ACEITE
Grado de eficacia
comparativa
Unidades de medida:
1 mg/ml
20 mg/ml
106
50 mg/ml
OBJETIVO ESPECÍFICO 5: Determinar si el aceite esencial extraído del tronco y corteza de Handroanthus chrysanthus presenta actividad
antioxidante.
FUENTE DE ACTIVIDAD
ANTIOXIDANTE
Grado de eficacia
comparativa
Aceite esencial
obtenido por
Hidrodestilación
Aceite esencial
obtenido por fluidos
supercriticos
Estándar de
referencia Trolox
Porcentaje de inhibición frente al radical DPPH.
OBJETIVO ESPECÍFICO 3: Caracterizar calidad y rendimiento de los aceites esenciales extraídos por hidrodestilación y fluidos
supercríticos.
PARÁMETROS DE ANÁLISIS DE CARACTERIZACIÓN DE ACEITE ESENCIAL
CARACTERÍSTICAS Parámetros
CARACTERÍSTICAS ORGANOLÉPTICAS
Color
Olor
Textura
ENSAYOS FÍSICOS-QUÍMICOS Índice de refracción
CG-EM
107
Anexo E: Instrumento de recolección de datos
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
GUÍA DE OBSERVACIÓN
PROYECTO: Actividad antibacteriana y antioxidante del aceite esencial extraído del
tronco y corteza de la especie Handroanthus chrysanthus (Guayacán).
Objetivo: Obtener datos para la posterior evaluación de efectos y estadísticas
relacionadas con las variables propuestas.
FECHA DE
ESTUDIO
Nombre de
investigador
MUESTRA
Parte de la muestra
TRATAMIENTO
CONDICIONES DE EXTRACCIÓN
Tamaño de partícula 0,5 mm 2 mm
Hidrodestilación Extracción FSC Hidrodestilación Extracción FSC
Peso de la muestra
Fracciones de muestra
Masa de aceite (mg)
Concentración
(mg/ml)
Porcentaje de
rendimiento (%)
CONTROL DE CALIDAD
Color
Olor
Textura
Índice de refracción
CG-EM
EVALUACIÓN DE ACTIVIDADES EN ACEITE (Tamaño ___)
Prueba de solubilidad (Et, Prop o Glic) y determinar CMI:
Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa
Actividad antibacteriana (Halo de inhibición en mm)
1 mg/ml 20 mg/ml 50 mg/ml 1 mg/ml 20 mg/ml 50 mg/ml
Et, Prop o Glic.
108
Actividad antioxidante (% de inhibición frente al radical DPPH)
MUESTRA DE ACEITE ESENCIAL
( Hidrodestilación) (Absorbancias)
FÁRMACO DE REFERENCIA Trolox
(Absorbancias)
V
(uL)
Repeticiones Media V
(uL)
Repeticiones Media
Curva de
calibración
V1 V1
V2 V2
V3 V3
V4 V4
V5 V5
MUESTRA DE ACEITE ESENCIAL
(Fluidos supercríticos) (Absorbancias)
FÁRMACO DE REFERENCIA Trolox
(Absorbancias)
V(uL) Repeticiones Media V(uL) Repeticiones Media
Curva de
calibración
V1 V1
V2 V2
V3 V3
V4 V4
V5 V5
Parámetros de calidad de materia prima
Definición
Descrip.
microscopica
Descrip.
macroscopica
Humedad
Cenizas totales
Otras observaciones:__________________________________________________
EVALUACIÓN DE ACTIVIDADES DE EXTRACTO TAMAÑO (___)
Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa
Actividad antibacteriana (Halo de inhibición en mm)
1 mg/ml 20 mg/ml 50 mg/ml 1 mg/ml 20 mg/ml 50 mg/ml
Et, Prop o Glic.
Actividad antioxidante (% de inhibición frente al radical DPPH)
109
Anexo F: Autorización de propiedad de la muestra
110
Anexo G: Certificación de la muestra
111
Anexo H: Perfiles cromatograficos de las muestras de aceite
Gráfico 7.1: Perfil cromatográfico del aceite esencial con tamaño 0,5 mm por hidrodestilación
Gráfico 7.2: Perfil cromatográfico del aceite esencial con tamaño 2,0 mm por hidrodestilación
112
Gráfico 7.3: Perfil cromatográfico del aceite esencial con tamaño 0,5 mm por fluidos supercríticos
Gráfico 7.4: Perfil cromatográfico del aceite esencial con tamaño 2,0 mm por fluidos supercríticos
113
Anexo I: Certificados de los reactivos utilizados.
Gráfico 7.5: Certificado del reactivo estándar Trolox.
Gráfico 7.6: Certificado del reactivo DPPH
114
Anexo J: Figuras de la experimentación por etapas
Etapa I: extracción de los aceites.
Figura 7.1: Aceites extraídos por los dos métodos
Etapa II: Caracterización de los aceites
Cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas (CG-EM)
Figura 7.2: Equipo de CG-EM
Etapa III: Evaluación de la actividad antibacteriana
Figura 7.3: Solubilidad del aceite obtenido por fluído y Microdilución en placa
115
Figura 7.4: Halos de inhibición medidos frente a S. aureus y P. aeruginosa
Etapa IV: Evaluación de la actividad antioxidante
Figura 7.5: Preparación de diluciones del estándar y aceites
Figura 7.6: Agitación de los tubos y lectura de las absorbancias
