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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
QUÍMICA FARMACÉUTICA
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DEL EXTRACTO
ACETÓNICO DE Hibiscus sabdariffa EN HORTALIZAS
Proyecto de investigación presentado como requisito previo para la obtención del
título de: Químico Farmacéutico
AUTOR: Jessica Lizbeth Latacunga Chiluiza
TUTOR: Dr. Fernando Augusto Novillo L. PhD.
DMQ, Julio 2018
i
DEDICATORIA
A Dios
Por haberme dado fuerzas y sabiduría para poder llegar hasta este punto.
A mi madre Pilar
Por brindarme su apoyo en todo momento de mi carrera estudiantil, por sus consejos, su
paciencia, por sus valores que me ha sabido infundir, por la motivación constante y sobre
todo por su amor.
A mi padre Fausto
Por su ejemplo de perseverancia y constancia que me ha inculcado día a día, por sus
consejos y por su apoyo incondicional.
A mi hermano Andrés
Por las motivaciones que me ha sabido brindar en los momentos difíciles de mi carrera
estudiantil, y por su constante apoyo.
A mi abuelito Gonzalo
Por guiarme desde el cielo y por permitirme mantener la Fé en cualquier situación que me
encuentre.
JESSICA
ii
AGRADECIMIENTOS
Finalmente mi más sincero agradecimiento a la Universidad Central del Ecuador,
Facultad de Ciencias Químicas que a través de los conocimientos impartidos por sus
docentes han permitido mi formación profesional.
A los miembros de mi Tribunal Dra. Dayana Borja y Dra. Ana María Hidalgo por su
colaboración y por las prestaciones de los laboratorios y materiales para el desarrollo de
mi proyecto de investigación.
A mi Tutor Fernando Novillo por brindarme sus consejos académicos, y sobre todo por
apoyarme en el desarrollo de mi proyecto de investigación.
A mis padres Fausto y Pilar que con su paciencia y consejos, me han sabido dar las fuerzas
necesarias para no dejar de luchar por mis metas y sobre todo por darme todo lo necesario
para poder culminar mi carrera profesional.
A mi hermano Andrés por ser como un segundo padre y darme ánimos necesarios para
saber sobrellevar los días malos y sobre todo por apoyarme en mi carrera estudiantil sin
necesidad de yo pedírselo.
A mi sobrino Sebitas que con su inocencia, sus risas y su ternura me ha enseñado a tomar
de mejor manera los problemas y dificultades que se me han presentado.
A mi cuñada Kathy por brindarme su ayuda incondicional, por estar siempre presta
ayudarme y brindarme su cariño de hermana.
A mi Tía Paty por brindarme palabras de apoyo y fortaleza y brindarme su amor de madre.
A ti Estiby por comprenderme y sacarme las mejores sonrisas frente a los momentos
difíciles.
A mi amigo Andrés por apoyarme y darme ánimos necesarios para culminar este proyecto
de investigación.
A mi amiga Paulina que aparte de ser compañera de aula se convirtió en mi hermanita, la
cual me supo ayudar en la etapa más complicada de mi trayecto estudiantil, gracias por
sus enseñanzas y por su valiosa amistad.
JESSICA
iii
iv
v
vi
ÍNDICE DE CONTENIDO
RESUMEN ......................................................................................................................... xiv
ABSTRACT ........................................................................................................................ xv
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 1
CAPÍTULO I ........................................................................................................................ 2
EL PROBLEMA ................................................................................................................... 2
1.1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ................................................................ 2
1.2. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA ..................................................................... 3
1.3. OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN ............................................................... 4
1.3.1. Objetivo general. ................................................................................................... 4
1.3.2. Objetivos Específicos ............................................................................................ 4
1.4. IMPORTANCIA Y JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN ....................... 5
CAPÍTULO II ....................................................................................................................... 7
MARCO TEÓRICO ............................................................................................................. 7
2.1 ANTECEDENTES .................................................................................................. 7
2.2 FUNDAMENTO TEÓRICO ................................................................................... 9
2.2.1. Descripción de la flor de Jamaica (Hibiscus sabdariffa). ..................................... 9
2.2.2. Taxonomía de Hibiscus sabdariffa. .................................................................... 10
2.2.3. Cultivo de Hibiscus sabdariffa. ........................................................................... 10
2.2.4. Habitad de Hibiscus sabdariffa. .......................................................................... 10
2.2.5. Usos de Hibiscus sabdariffa. ............................................................................... 11
2.2.6. Composición nutricional de la Jamaica. .............................................................. 11
2.2.7. Fitocompuestos de Hibiscus sabdariffa. ............................................................. 11
2.2.8. Extractos Vegetales. ............................................................................................ 13
2.2.9. Maceración. ......................................................................................................... 13
2.2.10. Cromatografía en columna. ............................................................................... 14
2.2.11. Cromatografía en capa fina. .............................................................................. 14
2.2.12. Hortalizas. ......................................................................................................... 14
2.2.13. Contaminación microbiana en hortalizas. ......................................................... 15
2.2.13.1. Planes de muestreo. .................................................................................. 15
vii
2.2.14. Lavado de hortalizas.......................................................................................... 18
2.2.15. Enfermedades transmitidas por alimentos (ETA). ............................................ 18
2.2.15.1. Microorganismos en alimentos. ................................................................ 18
2.2.15.2. Microorganismos patógenos. .................................................................... 19
2.2.16. Microorganismos de prueba. ............................................................................. 20
2.2.16.1. Salmonella enterica. ................................................................................. 20
2.2.16.2. Escherichia coli. ....................................................................................... 21
2.2.17. Métodos de evaluación antibacteriana. ............................................................. 22
2.2.17.1. Métodos de difusión en disco. .................................................................. 22
2.2.17.2. Determinación de la (CMI) por el métodos de dilución. .......................... 23
2.2.18. Recuento de Escherichia coli y Coliformes por la técnica petrifilm AOAC
Método oficial 991.14. .................................................................................................. 23
2.2.19. Aislamiento e identificación de Salmonella spp ISO 6579. .............................. 24
2.3. FUNDAMENTO LEGAL ......................................................................................... 24
2.4. HIPÓTESIS ............................................................................................................... 25
2.4.1. Hipótesis del trabajo. ........................................................................................... 25
2.4.2. Hipótesis nula. ..................................................................................................... 25
2.5. CONCEPTUALIZACIÓN DE VARIABLES ........................................................... 25
CAPÍTULO III ................................................................................................................... 26
MARCO METODOLÓGICO ........................................................................................... 26
3.1. DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN ........................................................................ 26
3.2. POBLACIÓN Y MUESTRA ..................................................................................... 26
3.3. MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................. 27
3.3.1 Materiales. ............................................................................................................ 27
3.3.2. Metodología. ....................................................................................................... 29
3.3.2.1. Obtención del material vegetal. ..................................................................... 30
3.3.2.2. Tratamiento del material vegetal. .................................................................. 30
3.3.2.3. Control de calidad del material vegetal. ........................................................ 30
3.3.2.4. Descripción macroscópica. MGA-FH 0040. ................................................. 30
3.3.2.5. Cromatografía en capa fina: Ensayo de identidad MGA-FH 0050. .............. 31
3.3.2.6. Pérdida por secado MGA-FH 0080. .............................................................. 31
viii
3.3.2.7. Cenizas Totales MGA-FH 0060. ................................................................... 31
3.3.2.8. Intensidad de la coloración. ........................................................................... 31
3.3.2.9. Valoración de ácido cítrico MGA 0091. ....................................................... 32
3.3.2.10. Proceso de extracción. ................................................................................. 32
3.3.2.11. Fraccionamiento primario del extracto acetónico por cromatografía en
columcolumna. ..................................................................................................................... 32
3.3.2.12. Evaluación de la actividad antibacteriana de las colecciones del
fraccifraccionamiento. .......................................................................................................... 34
3.3.2.13. Activación de cepas bacterianas. ................................................................. 34
3.3.2.14. Preparación de discos para antibiograma. ................................................... 34
3.3.2.15. Preparación del estándar (0,5 Mc. Farland) para el inóculo. ....................... 35
3.3.2.16. Método de difusión en discos. ..................................................................... 36
3.3.2.17. Concentración Mínima Inhibitoria. ............................................................. 36
3.3.2.18. Determinación de fenoles y flavonoides. .................................................... 37
3.3.2.19. Identificación de fenoles totales. ................................................................. 37
3.3.2.20. Identificación de flavonoides....................................................................... 37
3.3.2.21. Evaluación de la actividad antibacteriana. .................................................. 38
3.3.2.22. Recuento de Escherichia coli/ Coliformes en placas Petrifilm 3M. ........... 39
3.3.2.23. Aislamiento e Identificación de Salmonella spp. ........................................ 39
3.4 DISEÑO EXPERIMENTAL ...................................................................................... 39
3.5. MATRIZ DE OPERACIONALIZACIÓN DE VARIABLES .................................. 40
3.6. TÉCNICA DE PROCESAMIENTO DE DATOS ..................................................... 41
CAPÍTULO IV .................................................................................................................... 43
ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS ............................................................. 43
4.1 Control de calidad de Hibiscus sabdariffa flor de Jamaica ........................................ 43
4.1.1. Descripción macroscópica................................................................................... 43
4.1.2. Cromatografía en capa fina: Ensayo de Identidad. ............................................. 43
4.1.3. Materia extraña. ................................................................................................... 45
4.1.4. Pérdida por secado. ............................................................................................. 45
4.1.5. Cenizas totales. .................................................................................................... 46
4.1.6. Intensidad de coloración...................................................................................... 47
ix
4.1.7. Valoración. .......................................................................................................... 47
4.1.8. Proceso de extracción de Hibiscus sabdariffa..................................................... 49
4.1.9. Fraccionamiento Primario del extracto acetónico de la flor de Hibiscus
sabdariffa. ..................................................................................................................... 50
4.1.10. Evaluación de la actividad antibacteriana por el método de disco difusión de las
colecciones del extracto acetónico de Hibiscus sabdariffa. .......................................... 52
4.1.11. Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI). ........................ 54
4.1.12. Cuantificación de fenoles y flavonoides. .......................................................... 54
4.1.12.1. Determinación de fenoles totales de la flor de Hibiscus sabdariffa. ........... 54
4.1.12.2. Determinación de flavonoides totales de Hibiscus sabdariffa. ................... 55
4.1.13. Recuento de Coliformes/Escherichia coli en hortalizas en placas petrifilm 3M.
....................................................................................................................................... 57
4.1.13.1. Recuento de Coliformes. ............................................................................. 57
4.1.13.2. Recuento de Escherichia coli. ..................................................................... 57
4.1.14. Presencia/ausencia Salmonella spp en hortalizas. ............................................. 58
4.2. DISEÑO EXPERIMENTAL ..................................................................................... 59
4.2.1. Análisis descriptivo de las variables. .................................................................. 59
4.2.3. Análisis estadístico. ............................................................................................. 60
CAPÍTULO V ..................................................................................................................... 63
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ............................................................... 63
5.1. CONCLUSIONES ..................................................................................................... 63
5.2. RECOMENDACIONES ............................................................................................ 64
BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................ 65
ANEXOS ............................................................................................................................. 71
x
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo 1 Certificado de identificación botánica ................................................................... 71
Anexo 2 Fotos del proceso de experimentación ................................................................... 78
Anexo 3 Recuento de Coliformes en hortalizas en placas petrifilm 3M .............................. 79
Anexo 4 Recuento de Escherichia coli en hortalizas en placas petrifilm 3M ...................... 80
Anexo 5 Crecimiento de colonias características de Salmonella spp. en medios de cultivos
frente a la lechuga ................................................................................................................. 81
Anexo 6 Crecimiento de colonias características de Salmonella spp. en medios de cultivos
frente al tomate riñón ............................................................................................................ 81
Anexo 7 Crecimiento de colonias características de Salmonella spp. en medios de cultivos
frente al culantro ................................................................................................................... 82
Anexo 8 Presencia/Ausencia de Salmonella spp. en el medio de enriquecimiento
Rappaport-Vassiliadis para cada una de las muestras de las diferentes Hortalizas .............. 83
Anexo 9 Presencia/Ausencia de Salmonella spp. en el medio de enriquecimiento Selenito
Cistina para cada una de las muestras de las diferentes Hortalizas ...................................... 83
Anexo 10 Especificaciones de Salmonella enteritidis ATCC 13076 ................................... 84
Anexo 11Especificaciones de Escherichia coli ATCC 25922 ............................................. 85
Anexo 12 Guía de interpretación placas petrifilm para el recuento de Escherichia coli/
Coliformes ............................................................................................................................ 89
xi
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura N° 1 Flor de Jamaica ................................................................................................... 9
Figura N° 2 Polifenoles presentes en Hibiscus sabdariffa ................................................... 12
Figura N° 3 Antocianinas principales ................................................................................... 13
Figura N° 4 Cromatografía en capa fina de Hibiscus sabdariffa ......................................... 44
Figura N° 5 Revelación UV a 365 nm de Hibiscus sabdarifa ............................................. 44
Figura N° 6 Revelación UV a 254 nm de Hibiscus sabdarifa ............................................. 44
Figura N° 7 Primera derivada de la valoración de Hibiscus sabdariffa ............................... 48
Figura N° 8 Segunda derivada de la valoración de Hibiscus sabdariffa .............................. 48
Figura N° 9 Curva del estándar de ácido gálico ................................................................... 55
Figura N° 10 Curva del estándar de quercetina .................................................................... 56
Figura N° 11 Interpretación de los valores de la media de cada de las mediciones de los
halos de inhibición ................................................................................................................ 60
Figura N° 12 Interpretación de los valores de la media de cada uno de los conjuntos de
mediciones ............................................................................................................................ 62
xii
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla N° 1 Clasificación Taxonomía de Hibiscus sabdariffa .............................................. 10
Tabla N° 2 Contenido Nutricional de la flor de Jamaica ...................................................... 11
Tabla N° 3 Planes de muestreo para combinaciones de diferente grado de riesgo para la
salud y diversas condiciones de manipulación ..................................................................... 16
Tabla N° 4 Criterios microbiológicos en Alimentos ............................................................ 17
Tabla N° 5 Patógenos aislados sobre frutas y hortalizas causantes de enfermedades de
origen alimentario. ................................................................................................................ 20
Tabla N° 6 Disolventes y mezclas para el fraccionamiento primario .................................. 33
Tabla N° 7 Disolventes y mezclas para el fraccionamiento primario .................................. 33
Tabla N° 8 Concentración de las soluciones impregnadas en los discos para antibiograma 35
Tabla N° 9 Concentración de las soluciones de controles para el antibiograma .................. 35
Tabla N° 10 Tamaño mínimo de la muestra para ensayo ..................................................... 38
Tabla N° 11 Factores y niveles del diseño experimental ..................................................... 40
Tabla N° 12 Operacionalización de la variable independiente ............................................ 40
Tabla N° 13 Operacionalización de la variable dependiente ................................................ 41
Tabla N° 14 ANOVA de dos Factores ................................................................................. 41
Tabla N° 15 Resultados de la descripción macroscópica de Hibiscus sabdariffa ................ 43
Tabla N° 16 Resultado del ensayo de Identidad de Hibiscus sabdariffa ............................. 44
Tabla N° 17 Resultados de materia extraña de Hibiscus sabdariffa .................................... 45
Tabla N° 18 Datos de pérdida por secado de Hibiscus sabdariffa ....................................... 46
Tabla N° 19 Resultado de la pérdida por secado de Hibiscus sabdariffa ............................ 46
Tabla N° 20 Datos de cenizas totales de Hibiscus sabdariffa .............................................. 46
Tabla N° 21 Resultado de cenizas totales de Hibiscus sabdariffa ....................................... 47
Tabla N° 22 Resultado de la intensidad de coloración de Hibiscus sabdariffa .................... 47
Tabla N° 23 Resultado de la intensidad de coloración de Hibiscus sabdariffa .................... 47
Tabla N° 24 Datos de valoración de Hibiscus sabdariffa .................................................... 49
Tabla N° 25 Resultado de la valoración de Hibiscus sabdariffa .......................................... 49
Tabla N° 26 Resultado de rendimiento de Hibiscus sabdariffa ........................................... 50
Tabla N° 27 Fracciones obtenidas del extracto acetónico Hibiscus sabdariffa, según la fase
móvil utilizada en cromatografía en columna ...................................................................... 50
Tabla N° 28 Primer agrupamiento de las fracciones obtenidas del extracto acetónico
Hibiscus sabdariffa según bandas de similitud en TLC ....................................................... 51
Tabla N° 29 Segundo agrupamiento de las fracciones obtenidas a partir del extracto
acetónico Hibiscus sabdariffa según bandas de similitud en TLC ....................................... 52
Tabla N° 30 Medida de los halos de inhibición formados por los extractos frente a
Escherichia coli ATCC 25922 ............................................................................................. 53
Tabla N° 31 Medida de los halos de inhibición formados por los extractos frente a
Salmonella enteritidis ATCC13076 ..................................................................................... 53
xiii
Tabla N° 32 Resultado de la CMI del tratamiento del Grupo III en Escherichia coli ATCC
25922 y Salmonella enteritidis ATCC 13076 ...................................................................... 54
Tabla N° 33 Datos de concentración y absorbancia del estándar ácido gálico .................... 54
Tabla N° 34 Concentración de ácido gálico presente en las fracciones acetónicas ............. 55
Tabla N° 35 Datos de concentración y absorbancia del estándar quercetina ....................... 56
Tabla N° 36 Concentración de quercetina presente en las fracciones acetónicas ................ 56
Tabla N° 37 Resultados del Recuento de Coliformes antes y después de aplicar el
tratamiento de la fracción III en hortalizas de estudio (Lechuga, Tomate riñón y Culantro)
.............................................................................................................................................. 57
Tabla N° 38 Resultados del Recuento de Escherichia coli antes y después de aplicar el
tratamiento de la fracción III en hortalizas de estudio (Lechuga, Tomate riñón y Culantro)
.............................................................................................................................................. 58
Tabla N° 39 Presencia/Ausencia de Salmonella spp. en medio de enriquecimiento: Caldo
Rappaport Vassiliadis ........................................................................................................... 58
Tabla N° 40 Presencia/Ausencia de Salmonella spp. en medio de enriquecimiento: Caldo
Selenito Cistina ..................................................................................................................... 59
Tabla N° 41 Análisis descriptivo de las variables ................................................................ 59
Tabla N° 42 Análisis estadístico ........................................................................................... 61
Tabla N° 43 Subconjuntos homogeneos según la media de halo de inhibición ................... 61
xiv
TÍTULO: EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DEL
EXTRACTO ACETÓNICO DE Hibiscus sabdariffa EN HORTALIZAS
AUTOR: Jessica Lizbeth Latacunga Chiluiza
TUTOR: Dr. Fernando Augusto Novillo L.
RESUMEN
En el presente proyecto de investigación se evalúa la actividad antibacteriana
del extracto acetónico de la flor de Hibiscus sabdariffa en hortalizas como lechuga, tomate
riñón y culantro. Para conseguir este propósito, al extracto acetónico preparado por
maceración de las flores se realizó un fraccionamiento primario mediante cromatografía en
columna. La fase estacionaria utilizada fue sílica gel y como fase móvil se utilizaron una
mezcla de disolventes de polaridad creciente. Mediante la simulación de un antibiograma
empleando el método de difusión en disco se evaluó la mayor actividad antibacteriana de
las fracciones obtenidas del extracto acetónico y del extracto total, frente a las cepas de
prueba: Escherichia coli ATCC 25922 y Salmonella enteritidis ATCC 13076. Se utilizó la
acetona como blanco, ácido acético al 0,05% como control positivo y una mezcla de
polisorbato 80-agua como control negativo.
Finalmente, se evaluó la fracción III sobre las hortalizas en estudio, realizando
dos técnicas microbiológicas, en la primera se realizó el recuento de Escherichia coli/
Coliformes en placas Petrifilm 3M según el Método oficial AOAC 991.14., evidenciando la
reducción de unidades formadoras de colonias en las tres hortalizas de estudio, y en la
segunda técnica se realizó el Aislamiento e Identificación de Salmonella spp según la ISO
6579, evidenciando la ausencia de Salmonella spp. en lechuga y tomate riñón, mientras que
para el culantro se evidenció presencia de Salmonella spp.
PALABRAS CLAVES: HORTALIZAS, EXTRACTO ACETÓNICO, ACTIVIDAD
ANTIBACTERIANA, CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA, ANTIBIOGRAMA,
DESINFECTANTE.
xv
TITLE: EVALUATION OF ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF Hibiscus sabdariffa
ACETONIC EXTRACT IN VEGETABLES.
AUTHOR: Jessica Lizbeth Latacunga Chiluiza.
TUTOR: Dr. Fernando Augusto Novillo L.
ABSTRACT
In the present research project, the antibacterial activity of the acetonic extract
of Hibiscus sabdariffa flowers in vegetables such as lettuce, kidney tomato and culantro is
evaluated. To achieve this purpose, a primary fractionation by column chromatography of
acetonic extract wich was prepared by maceration of the flowers was performed. The
stationary phase was silica gel and the mobile phase was mixture of solvents of increasing
polarity. Then, by simulating an antibiogram using the disc diffusion method, the highest
antibacterial activity of the fractions obtained from the acetonic extract and the total extract
was evaluated against: Escherichia coli ATCC 25922 and Salmonella enteritidis ATCC
13076. It used acetone as blank, acetic acid 0.05% as positive control and a polysorbate80-
water mixture was negative control.
Finally, fraction III was evaluated on the vegetables under study, performing
two microbiological techniques, in the first the count of Escherichia coli / Coliforms in 3M
Petrifilm plates was performed according to the official AOAC 991.14. method, evidencing
the reduction of colony forming units In the vegetables study and in the second technique,
Isolation and Identification of Salmonella spp was carried out according to ISO 6579,
evidencing the absence of Salmonella spp. in lettuce and kidney tomato, while for the
coriander was evidencing the presence of Salmonella spp.
KEY WORDS: VEGETABLES, ACETONIC EXTRACT, ANTIBACTERIAL
ACTIVITY, CHROMATOGRAPHY IN COLUMN, ANTIBIOGRAM, DISINFECTANT.
1
INTRODUCCIÓN
El uso de antimicrobianos sintetizados químicamente ha causado daño en la
salud de las personas, surgiendo la necesidad de buscar agentes antimicrobianos de origen
natural, es por ello que el presente trabajo de investigación tuvo como objetivo evaluar la
actividad antibacteriana del extracto acetónico de Hibiscus sabdariffa en hortalizas
(lechuga, tomate riñón y culantro).
“En el capítulo uno de este trabajo de investigación se analiza y se describe el
planteamiento y formulación del problema basado principalmente en la evaluación del
efecto antibacteriano del extracto acetónico de Hibiscus sabdariffa en hortalizas, también se
describe los objetivos de la investigación de forma general como específica. Finalmente, se
detalla la importancia y justificación de realizar este trabajo, con el fin de servir como un
aporte para futuras investigaciones.
En el capítulo dos se describe los antecedentes del estudio, el fundamento
teórico donde se detalla la descripción morfológica, taxonomía, propiedades, composición
química, aplicaciones de la especie vegetal Hibiscus sabdariffa, así como los procesos de
extracción y los métodos de evaluación antimicrobiana. Finalmente, se detalla la
formulación de la hipótesis describiendo la hipótesis nula y alternativa y la
conceptualización de las variables.
En el capítulo tres se describe: la metodología que se realizó durante la
investigación, los métodos y materiales requeridos, el diseño experimental, la matriz de
operacionalización de las variables y procesamiento de datos.
En el capítulo cuatro se realiza el análisis y discusión de los resultados, bajo los
cuales se determinó el cumplimiento de control de calidad de la especie vegetal Hibiscus
sabdariffa, determinación del porcentaje de extracción de las flores secas de Jamaica,
Agrupamiento de las fracciones del extracto acetónico, determinación de la concentración
de fenoles totales y flavoniodes, determinación de la actividad antimicrobiana mediante el
método de difusión en discos, evaluación de la Concentración Mínima Inhibitoria por el
método de microdilución en placa del extracto con mayor actividad antibacteriana frente a
las cepas de estudio Escherichia coli ATCC 25922 y Salmonella enteritidis ATCC 13076 .
Finalmente, se realiza la evaluación de la fracción con mayor actividad antibacteriana sobre
las hortalizas en estudio (lechuga, tomate riñón y culantro) realizando el: Aislamiento e
Identificación de Salmonella spp según la ISO 6579 y el recuento de Escherichia coli/
Coliformes en placas Petrifilm 3M según el Método oficial AOAC 991.14.
En el capítulo cinco se resumen los resultados obtenidos y aportes del trabajo
en concordancia con los objetivos propuestos.
2
CAPÍTULO I
EL PROBLEMA
1.1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
En Ecuador el consumo de vegetales frescos entre la población, ya sea por
razones dietéticas o económicas a aumentado en nuestro país como en otros países del
mundo y paralelamente se han incrementado los problemas de salud de los consumidores
por la proliferación de microorganismos, debido a la posibilidad de contaminación de los
vegetales que están expuestos al contacto con el agua y con el medio ambiente en general
(León Jessica, 2007). En todo el mundo alrededor del 70% de los casos de diarrea son
causados por contaminación biológica, así como los brotes de ETA en América es del 2,5%
en hortalizas y el 0,8% en frutas. En EEUU el porcentaje de brotes en productos frescos es
del 20,8% en frutas, 16,7% en lechugas, 9,4% en coles, 5,2% en repollos, 3,1% en
zanahorias, 2,1% en tomates, 35,4% en ensaladas y un 7.3% es desconocido (Piñeiro &
Días Ríos, 2004). Así mismo una de las principales causas del deterioro de los alimentos es
el ataque por diferentes tipos de microorganismos (bacterias, levaduras y mohos) como es
el caso de Salmonella y Escherichia coli, implicando pérdicas económicas evidentes, tanto
para los fabricantes, distribuidores y consumidores. (Ximhai Ra & Rodríguez Sauceda
Elvia Nereyda, 2011)
La contaminación en hortalizas es debido a que en zonas productivas ubicadas
alrededor de las ciudades generalmente no cuentan con riego, lo que ha obligado que se
canalicen aguas residuales hacia sus fincas sin tener una claridad ni conciencia de los
riesgos, siendo muchos de los productos cosechados vendidos en mercados a gran escala
sin contar con controles apropiados (Garcés , Cabrera, & Paredes, 2006). Se ha calculado
que cada año mueren 1,8 millones de personas como consecuencia de enfermedades
diarreicas, cuya causa puede atribuirse en la mayoría de los casos a la ingesta de agua o
alimentos contaminados. (Organización Mundial de la Salud, 2007)
En Ecuador el número de brotes de enfermedades trasmitidas por alimentos es
de 48 con 1 788 afectados con un total de 23 fallecidos. En EEUU el brote de bacterias en
frutas y vegetales es del 47% por Salmonella; 44% por Escherichia coli O157:H7; 3% por
Shigella; 2% por Escherichia coli y Campybacter y el 1% por Escherichia coli 011:H43 y
Bacillus cereus (Piñeiro & Días Ríos, 2004). Por lo cual, la investigación sobre la
conservación y adecuada desinfección de las hortalizas es importante, ya que varios
microrganismos suelen encontrarse en estas, afectando tanto al producto como al ser
humano generando enfermedades infecciosas debido al contagio con estos
microorganismos.
3
En la actualidad ha surgido la necesidad de buscar alternativas de conservación
y desinfección de los alimentos, esto es debido a que se ha asociado el consumo de
conservadores químicos con intoxicaciones. La demanda de productos frescos
mínimamente tratados está aumentando, así como el interés por los agentes antimicrobianos
de origen natural (derivados de vegetales), por esto en la actualidad se busca la
combinación de dos o más factores que interaccionen aditiva o sinérgicamente controlando
a la población microbiana, cabe señalar que la velocidad de deterioro microbiológico no
solo depende de los microorganismos presentes, sino también de la combinación química
del producto y del tipo de carga microbial inicial. (Ximhai Ra & Rodríguez Sauceda Elvia
Nereyda, 2011)
En esta búsqueda se han encontrado nuevos agentes antimicrobianos de origen
natural, por ejemplo los que incluyen compuestos fenólicos, que han sido usados desde
1867 como sanitizante, el cual es proveniente de cortezas, tallos, hojas, flores, ácidos
orgánicos presentes en frutos y fitoalexinas producidas en plantas, por lo que ya no solo
tendremos mayor seguridad, sino mejor calidad de los alimentos ya que este tipo de
antimicrobianos se consideran como fuentes potencialmente seguras, sin que afecte los
componentes nutricionales, ni las propiedades organolépticas de los alimentos. (Reyes
Jurado, Palou, & López, 2014)
Sin embargo, existe una gran cantidad de compuestos naturales de los que aún
no se han investigado sus usos potenciales y su posible efecto sobre las propiedades
sensoriales de los alimentos a los que se adicionen, por consiguiente se ha planteado
evaluar la actividad antibacteriana de la especie vegetal Hibiscus sabdariffa, cultivada en
Ecuador, aplicando el beneficio de los extractos obtenidos en hortalizas, con el fin de
garantizar a las personas un consumo seguro y mantenimiento la calidad del alimento.
1.2. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA
Después de haberse planteado la problemática de investigación se ha diseñado
la siguiente enunciación:
¿Se logrará inhibir las bacterias patógenas que se encuentran en las hortalizas a
través de una formulación que contenga un extracto acetónico de un producto natural
Hibiscus sabdariffa (cáliz de la flor de Jamaica)?
4
1.3. OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN
1.3.1. Objetivo general.
Evaluar la actividad antibacteriana del extracto acetónico de Hibiscus sabdariffa en
hortalizas (lechuga, tomate riñón y culantro).
1.3.2. Objetivos Específicos
Realizar la identificación botánica de la especie vegetal.
Realizar el control de calidad de la especie vegetal de Hibiscus sabdariffa.
Obtener el extracto acetónico de las flores de Hibiscus sabdariffa mediante
maceración.
Realizar el fraccionamiento primario del extracto acetónico de Hibiscus sabdariffa
mediante cromatografía en columna.
Agrupar las fracciones obtenidas en el fraccionamiento primario de acuerdo al
perfil cromatográfico de la cromatografía en capa fina.
Evaluar la actividad antibacteriana de las fracciones obtenidas mediante la
simulación de un antibiograma utilizando cepas de Escherichia coli ATCC 27853 y
Salmonella enteritidis ATCC 13076.
Determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) mediante el método de
microdilución en placa frente a las cepas bacterianas de Escherichia coli ATCC
27853 y Salmonella enteritidis ATCC 13076.
Determinar cuantitativamente el porcentaje de fenoles totales y flavonoides presente
en la fracción y extracto acetónico.
Evaluar la fracción con mayor actividad antibacteriana, en lechuga, tomate riñón y
culantro realizando el recuento de Escherichia coli y coliformes mediante la técnica
de Petrifilm.
Evaluar la fracción con mayor actividad antibacteriana en lechuga, tomate riñón y
culantro, determinando la presencia o ausencia de Salmonella spp mediante la
norma ISO 6579
5
1.4. IMPORTANCIA Y JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN
Las enfermedades causadas por patógenos alimentarios constituyen a lo ancho
del mundo problemas de salud pública y prevenirlos es la mayor meta de la sociedad. Las
enfermedades microbianas de origen alimentario son típicamente causadas por bacterias o
sus metabolitos, parásitos, virus o toxinas (ICMSF, International Commission on
Microbiological Specifications for Foods, 2006). Según La Organización Mundial de la
Salud (OMS) advirtió que por la inocuidad de los alimentos que contienen bacterias, virus,
parásitos o sustancias químicas nocivas se desencadenan más de 200 enfermedades, que
van desde la diarrea hasta el cáncer.
En países desarrollados más del 30% de las personas sufren cada año de
enfermedades causadas por alimentos, mientras que los países en desarrollo la diarrea
infantil es uno de los mayores problemas de salud pública. La incidencia de enfermedades
causadas por alimentos puede ser de 300 a 350 veces más altas que las que reportan las
cifras en el mundo. El comercio internacional de alimentos excede los 400.000 millones de
dólares al año, siendo el 50% del comercio mundial de exportación de alimentos
proveniente de países en desarrollo (Piñeiro & Días Ríos, 2004). A nivel mundial, las
enfermedades transmitidas por alimentos crudos han sido un factor preponderante para la
humanidad, ya que la mayoría de las hortalizas poseen una carga microbiana intrínseca. Sin
embargo, no se ha reducido el consumo de vegetales, generando en lo posterior infecciones
e intoxicaciones por su contenido de microorganismos. (Carrillo Quezada, 2016)
La horticultura en el Ecuador ha crecido paulatinamente a partir de la década de
los años 90, debido a que los hábitos alimenticios de la población han cambiado
positivamente hacia un mayor consumo de hortalizas en su dieta diaria (Monteros Guerrero,
Sumba Lusero, & Salvador Sarauz, 2015). Durante los últimos años en Ecuador la
producción de hortalizas ha experimentado un significativo progreso en cuanto a
rendimiento y calidad, siendo a la vez productos agrícolas ampliamente consumidos por lo
cual la presente investigación hace referencia a la evaluación de formulaciones que
incluyan mezclas de compuestos derivados de plantas como es el caso de Hibiscus
sabdariffa, la cual presenta actividad antimicrobiana sinérgica , siendo utilizada como
desinfectante y conservador para alimentos y así poder eliminar bacterias patógenas que se
encuentran en las hortalizas.
El proyecto de investigación tiene como fin evaluar la reducción de la carga
microbiana de hortalizas, para esto se empleará formulaciones desinfectantes obtenidas del
extracto acetónico de Hibiscus sabdariffa (flor de Jamaica), ya que en estudios realizados
en esta planta se ha determinado que en su composición contiene una gama de compuestos
fitoquímicos los cuales actúan de manera sinérgica potencializando el efecto desinfectante
6
que posee esta, siendo utilizado como desinfectantes y conservante de alimentos de origen
vegetal. (Hernández Gómez & Gómez Aldapa, 2016)
Con esta investigación se proyecta crear una alternativa diferente a los
desinfectantes tradicionales, elaborando un tratamiento más natural para la desinfección de
hortalizas, ofreciendo de esta manera a los consumidores una desinfección más segura y
menos tóxica, ayudando a la vez a prevenir enfermedades en la población debido a la
presencia de microorganismos como Salmonella y Escherichia coli en las hortalizas.
7
CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO
2.1 ANTECEDENTES
En Ecuador no se encontró estudios relacionados con la evaluación de la
actividad antibacteriana que posee la flor de Jamaica de especie vegetal Hibiscus sabdariffa
sobre hortalizas, no obstante en la Universidad Técnica de Ambato en la Facultad de
Ciencia e Ingeniería en Alimentos se desarrolló un Proyecto de Investigación relacionado a
la evaluación antibacteriana de dos especies vegetales en diferentes hortalizas. A
continuación se detalla lo propuesto.
TÍTULO: “APLICACIÓN DE ACEITES ESENCIALES DE ORÉGANO
(Origanum vulgare) Y TOMILLO (Thymus vulgaris) EN CUATRO TIPOS DE
HORTALIZAS: COL DE REPOLLO (Brassica oleracea var. capitata cv. bronco),
COL MORADA (Brassica oleracea var. capitata f. rubra), LECHUGA ICEBERG
TIPO SALINAS (Lactuca sativa var. capitata) Y ESPINACA (Spinacia oleracea)
PARA DISMINUIR LA CARGA MICROBIOLÓGICA PATÓGENA”.
Autor: Mélida Marianela Chuquitarco Guano
Año: 2014
El estudio realizado por Mélida Chuquitarco, hace referencia a la desinfección
de hortalizas como: col de repollo, col morada, lechuga Iceberg tipo Salinas y espinaca en
soluciones al 0,025% de aceites esenciales de orégano, tomillo y su mezcla,
antimicrobianos naturales, teniendo como propósito disminuir la carga microbiológica
patógena presente en hortalizas cultivadas con aguas de regadío contaminadas, con el fin de
evitar las posibles enfermedades que pueden transmitir estos alimentos. Las respuestas
experimentales fueron la determinación de mesófilos totales, mohos y levaduras,
Coliformes totales, Salmonella, y Staphylococcus. aureus. La eficiencia germicida con
relación a los mesófilos totales en col de repollo y col morada fueron de 96,7%, 94,3% en
espinaca 95,2% en lechuga; con respecto a mohos y levaduras, se consiguió un 96,9% de
desinfección en col de repollo, 92,9% en col morada, 95,2% en espinaca; en Coliformes
totales, col de repollo presento 98,9% de desinfección, 98,0% en col morada, 99,1% en
espinaca y 96,6% en lechuga y en Salmonella y Staphylococcus. aureus se consiguió un
100% de desinfección en las cuatro hortalizas. (Chuquitarco Guano, 2014)
8
TÍTULO: SOLUCIONES A BASE DE FITOCOMPUESTOS PARA
DESINFECTAR HORTALIZAS
Autor: Carlos Alberto Gómez Aldapa & Jesus Alberto Hernández Gómez
Año: 2016
La patente sobre soluciones a base de fitocompuestos para desinfectar hortalizas
describe composiciones para desinfectar y conservar de manera efectiva las hortalizas
contaminadas con microorganismos patógenos. Las formulaciones que se lleva a cabo
presentan compuestos con efecto antimicrobiano la cual actuará de manera sinérgica,
actuando por si solo o en combinación con otros agentes desinfectantes. (Hernández Gómez
& Gómez Aldapa, 2016)
TÍTULO: MÉTODOS DE EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD
ANTIMICROBIANA Y DE DETERMINACIÓN DE LOS COMPONENTES
QUÍMICOS DE LOS ACEITES ESENCIALES
Autor: Reyes jurado, E. Palou y A. López Malo
Año: 2014
Los aceites esenciales derivados de plantas tienen efectos antimicrobianos. Se
ha identificado que existen efectos relacionados a los componentes químicos, por lo cual, su
investigación busca estandarizar métodos que determinen el efecto antimicrobiano y los
componentes químicos por cromatografía para así poder determinar la concentración
mínima inhibitoria para reportar la efectividad de los aceites esenciales como agentes
antimicrobianos utilizando como método el arrastre de vapor por contacto directo. (Reyes
Jurado, Palou, & López, 2014)
TÍTULO: USO DE AGENTES ANTIMICROBIANOS NATURALES EN
LA CONSERVACIÓN DE FRUTAS Y HORTALIZAS
Autor: Elvia Nereyda Rodríguez Sauceda
Año: 2011
La demanda de productos frescos mínimamente tratados está aumentando, así
como el interés por los agentes antimicrobianos de origen natural (derivados de vegetales),
por esto en la actualidad se busca la combinación de dos o más factores que interaccionen
aditiva o sinérgicamente controlando a la población microbiana, permitiendo con estos
productos semejantes al producto fresco pero con menos aditivos, cabe señalar que la
velocidad de deterioro microbiológico no solo depende de los microorganismos presentes,
9
sino también de la combinación química del producto y del tipo de carga microbial inicial.
En general, cada vez se descubren más plantas o partes de estas que contienen
antimicrobianos naturales, por ejemplo los que incluyen compuestos fenólicos provenientes
de cortezas, tallos, hojas, flores, ácidos orgánicos presentes en frutos y fitoalexinas
producidas en plantas, por lo que ya no solo tendremos mayor seguridad, sino mejor calidad
de los alimentos ya que este tipo de antimicrobianos se consideran como fuentes
potencialmente seguras. (Ximhai Ra & Rodríguez Sauceda Elvia Nereyda, 2011)
TÍTULO: UNIVERSIDAD DE HIDALGO HALLA PROPIEDADES
DESINFECTANTES EN LA FLOR DE JAMAICA
Autor: Bertha Alfaro
Año: 2017
Un grupo de investigadores de la Universidad Autónoma de
Hidalgo descubrieron propiedades antibacterianas en la flor de Jamaica. Las pruebas de
la flor de Jamaica como desinfectante, las realizaron en frutas y verduras cultivadas en
el Valle del Mezquital, que son regadas con aguas negras. En la investigación se determinó
que la flor de Jamaica tiene vitaminas y minerales como el hierro, fósforo y calcio que
combaten las bacterias en los alimentos. (Alfaro, 2017)
2.2 FUNDAMENTO TEÓRICO
2.2.1. Descripción de la flor de Jamaica (Hibiscus sabdariffa).
Figura N° 1 Flor de Jamaica
Fuente: Latacunga J
10
La flor de Jamaica (Hibiscus sabdarifa) es una planta anual nativa de África e
intensamente cultivada en las regiones tropicales y subtropicales de la India, Tailandia,
Senegal, Estados Unidos, Panamá y México.
Esta planta, que pertenece a la familia de las Malváceas, es un arbusto que
puede llegar a medir hasta 3 m de altura. Los nombres comunes, populares o sinónimos son
rosa de Jamaica, flor de dardo, rosa de Jericó, té rojo, rosella, flor de Jamaica, flor roja.
(Díaz Pérez & Ramos Delgado, 2011)
2.2.2. Taxonomía de Hibiscus sabdariffa.
Tabla N° 1 Clasificación Taxonomía de Hibiscus sabdariffa
Flor de Jamaica Hibiscus sabdariffa
Reino Plantae
División Anthophyta
Clase Magnoliopsida
Subclase Dilleniidae
Orden Malvales
Familia Malvaceae
Género Hibiscus
Especie Hibiscus sabdariffa L.
(Díaz Pérez & Ramos Delgado, 2011)
2.2.3. Cultivo de Hibiscus sabdariffa.
El cultivo de la flor de Jamaica no se ha difundido en nuestro medio y
solamente se lo siembra en ciertas áreas de la Amazonía donde existen pequeñas áreas de
producción en las provincias de Napo, Morona Santiago y Pastaza. Este es un cultivo
temporal y su producto se encuentra disponible todo el año. En el país se cultiva para
aprovechar los frutos y cálices carnosos, de color rojo intenso (morado), ricos en ácido
málico. (Cárdenas León I. , 2015)
2.2.4. Habitad de Hibiscus sabdariffa.
La flor de Jamaica pertenece a temperaturas calientes y secas. Se adapta a una
gran variedad de suelos, porque es una planta que no requiere de muchos cuidados. Sin
embargo, es más productiva en suelos rojizos y pocos profundos. (Cárdenas León I. , 2015)
11
2.2.5. Usos de Hibiscus sabdariffa.
Es un producto con baja industrialización que se comercializa principalmente
como cálices deshidratados con los cuales se preparan infusiones acuosas que se consumen
como bebida refrescante. (Ing Medina Carrillo, y otros, 2013)
La Jamaica se la utiliza de diferentes maneras, siendo la más común como
planta medicinal para bajar el colesterol, los triglicéridos y para disminuir el peso corporal,
estimula la acción del hígado y los riñones, ayuda a la absorción de ciertos minerales. Del
cáliz se puede obtener varios subproductos como vinos, jaleas, conservas, mermeladas y
refrescos y se puede obtener las semillas que sirven para la siembra o la reproducción. De
los tallos, se obtiene una fibra de calidad que puede sustituir al yute en la fabricación de
cordeles y sacos para envasar productos agrícolas. (Cárdenas León I. , 2015)
2.2.6. Composición nutricional de la Jamaica.
Tabla N° 2 Contenido Nutricional de la flor de Jamaica
Cálices Semillas Follaje
Proteína (g) 2,00 28,9 3,50
Carbohidratos (g) 10,2 25,5 8,70
Grasa (g) 0,100 21,4 0,300
Tiamina (mg) 0,0500 0,100 0,200
Riboflavina (mg) 0,0700 0,150 0,500
Niacina (mg) 0,0600 1,50 1,40
Vitamina C (mg) 17,0 - 2,30
Calcio (mg) 150 350 240
Hierro (mg) 3,00 - 5,00
(Cárdenas León I. M., 2015)
2.2.7. Fitocompuestos de Hibiscus sabdariffa.
El análisis fitoquímico de la Jamaica ha revelado la presencia de ciertas
sustancias naturales que se encuentran en las plantas y en la mayoría de aceites vegetales
llamadas fitosteroles, flavonoides, saponinas y otros glucósidos, carbohidratos, ácido
ascórbico y una mezcla de ácido cítrico y málico. La Jamaica contiene dos pigmentos
coloridos: la hibiscina y la gosipitina, que se usan como base natural de jarabes y licores
12
cloridos. Se han identificado los pigmentos extraidos de las flores, como la gosipetina,
quercetina, luteolina, hibiscina y sus respectivos glucósidos (Figura 2). Los principales
pigmentos de esta planta son las antocianinas: la cianidina-3-glucósido y la delfinidina 3-
glucósido (Figura 3), que tienen propiedades antioxidantes y que no presentan actividad
tóxica ni mutagénica. Se ha demostrado que los compuestos fenólicos como el ácido
procatecuíco, aislado de las flores de esta planta tienen fuertes propiedades antioxidantes,
mientras que el ácido hibiscus manifiesta una elevada actividad inhibitoria sobre ciertas
enzimas pancreáticas. (Cobo Pimentel & Coronel Carrión, 2016)
Figura N° 2 Polifenoles presentes en Hibiscus sabdariffa
13
Figura N° 3 Antocianinas principales
2.2.8. Extractos Vegetales.
Mezcla compleja, con multitud de compuestos químicos, obtenible por procesos
físicos, químicos y/o microbiológicos a partir de una fuente natural y utilizable en cualquier
campo de la tecnología (Pardo Zapata, 2002). Los métodos de extracción dependen de la
naturaleza química de las sustancias presentes en la planta y del propósito de la
investigación. Si el trabajo va dirigido al aislamiento de sustancias para la comprobación de
actividad biológica, la extracción del material vegetal debe hacerse utilizando solventes de
acuerdo a la solubilidad y estabilidad que posean las sustancias beneficiosas (Marcano &
Hasegawa, 2002). Según la OMS el 25% de los fármacos comercializados actualmente son
de origen vegetal y un 25% contiene principios vegetales modificados químicamente.
(Pardo Zapata, 2002).
2.2.9. Maceración.
La maceración es un proceso de extracción sólido-líquido, dónde la materia
prima posee una serie de compuestos solubles en el líquido de extracción que son los que se
pretende extraer. El proceso de maceración genera dos productos que pueden ser empleados
dependiendo de las necesidades de uso, el sólido ausente de esencias o el propio extracto.
La naturaleza de los compuestos extraídos depende de la materia prima empleada, así como
del líquido de extracción. (Catania & Avagnina, 2007)
14
2.2.10. Cromatografía en columna.
Todas las cromatografías denominadas en columna se caracterizan por
tener una fase estacionaria que se encuentra dentro de una columna de vidrio de 5 a 30 mm
de diámetro por la que se hace pasar una fase móvil líquida o gaseosa que estará en
permanente movimiento. Según la afinidad de las moléculas por la fase móvil o la
estacionaria, éstas se separaran. Después de cada cromatografía se puede obtener
información del cromatograma tanto cualitativa (para identificar los distintos compuestos
de la mezcla) como cuantitativa (para poder obtener la cantidad y composición de las
sustancias separadas). Las fases estacionarias pueden ser de materiales muy distintos,
existen derivados de dextranos, derivados de agarosa, poliacrilamida, esferas de vidrio,
sílice, etc. (Harris, 2003)
2.2.11. Cromatografía en capa fina.
La cromatografía en capa fina de alta resolución (HPTLC, por sus siglas en
inglés) es un procedimiento que se utiliza para separar moléculas relativamente pequeñas.
Al igual que otras cromatografías, consiste de una fase estacionaria y una fase móvil y el
principio de separación es el mismo: la sustancia de interés se adherirá a la fase estacionaria
o se moverá con la fase móvil, viajando una distancia que es inversamente proporcional a la
afinidad por la fase estacionaria. El parámetro utilizado con fines cualitativos es el factor de
retención (Rf) que, aunque puede ser considerado como constante bajo condiciones
estrictamente definidas, no siempre estas se cumplen en un laboratorio normal, por lo que
solo puede considerarse como guía para obtener una información aproximada de la
movilidad de los solutos. Las determinaciones semi-cuantitativas se realizan comparando el
color o el área de las manchas del soluto con los obtenidos para distintas concentraciones de
una sustancia patrón. (Pino Bovey & Noriega Rodríguez, 2011)
2.2.12. Hortalizas.
Se define como hortalizas a aquellas plantas que son utilizadas en la
alimentación, de manera parcial o total, contienen un alto valor vitamínico y mineral, y son
bajas en calorías. Estas son plantas herbáceas que no necesariamente precisan de un
proceso de transformación para ser consumidas. (Gordón Núñez, 2010)
Según (ICMSF, Microorganisms in Foods. Microbial Ecology of Food
Commodities, 2000) , las hortalizas crudas pueden ser cosechadas y enviadas directamente
al mercado de venta al por menor, o retenidas en almacenaje durante tiempos variables
antes de la venta. Se pueden definir varios tipos de productos generales a base de hortalizas
crudas o relativamente no tratadas:
15
Hortalizas crudas: pueden no recibir tratamiento alguno o ser lavadas, seleccionadas
y clasificadas antes de ser colocadas en bolsas, en cajas o en canastos.
Hortalizas recién cortadas: se pueden preparar troceándolas antes de ser presentadas
a la venta.
Hortalizas almacenadas: la rapidez del envejecimiento de las hortalizas se puede
reducir, y por tanto se puede aumentar la vida de almacén, reduciendo el contenido
de oxígeno de la atmósfera de almacenaje y aumentando el contenido de CO2.
Hortalizas en atmósfera controlada: Estos productos no reciben un tratamiento
térmico suficiente para conseguir esterilidad comercial, y generalmente se
distribuyen en envases con atmósferas modificadas. Las hortalizas tratadas
mínimamente incluyen la lechuga, la col, las patatas peladas etc.
2.2.13. Contaminación microbiana en hortalizas.
2.2.13.1. Planes de muestreo.
El plan de muestreo sólo se aplica a lote o lotes de alimentos y bebidas. Se sustenta en el
riesgo para la salud y las condiciones normales de manipulación y consumo del alimento, y
establece:
Categoría de riesgo: Escala relativa al riesgo que representa un alimento y a la
manipulación posterior prevista.
Componentes del plan de muestreo:
"n" (minúscula): Número de unidades de muestra requeridas para realizar el
análisis
"c": Unidades de muestra provisionalmente aceptables en un plan de
muestreo de 3 clases.
"m" (minúscula): Límite microbiológico que separa la calidad aceptable de
la rechazable.
"M" (mayúscula): Los valores de recuentos microbianos superiores a "M"
son inaceptables, el alimento representa un riesgo para la salud.
Tipos de plan de muestreo para lote o lotes:
Condición de "aceptable": Cuando todas las unidades de muestra presentan
recuentos igual o inferiores a "m". Cuando hasta "c" unidades de muestra
pueden tener recuentos entre "m" y "M" (incluido "M").
Condición de "rechazo": Cuando más de "c" unidades de muestra presentan
recuentos entre "m" y "M" (incluido "M"). Cuando al menos 1 de las
unidades de muestra presentan recuentos superiores a "M".
16
Tabla N° 3 Planes de muestreo para combinaciones de diferente grado de riesgo
para la salud y diversas condiciones de manipulación
Grado de importancia en
relación con la utilidad y riesgo
sanitario
Condiciones esperadas de manipulación y consumo
del alimento o bebida luego del muestreo
Grado de
peligrosidad
reducido
Sin cambio de
peligrosidad
Aumento de
Peligrosidad.
Vida útil y alteración Categoría 1
3 clases
n = 5, c = 3.
Categoría 2
3 clases
n = 5, c = 2.
Categoría 2
3 clases
n = 5, c = 3.
Indicadores de riesgo bajo
indirecto para la salud
Categoría 4
3 clases
n = 5, c = 3.
Categoría 5
3 clases
n = 5, c = 2.
Categoría 6
3 clases
n = 5, c = 1.
Patógenos de riesgo moderado
directo, de diseminación limitada
Categoría 7
3 clases
n = 5, c = 2.
Categoría 8
3 clases
n = 5, c = 1.
Categoría 9
3 clases
n = 10 c = 1.
Patógenos de riesgo moderado
directo, de diseminación
potencialmente extensa.
Categoría 10
2 clases
n = 5, c = 0.
Categoría 11
2 clases
n = 10 c = 0.
Categoría 12
2 clases
n = 20 c = 0.
Patógenos de riesgo grave
directo para la salud.
Categoría 13
2 clases
n = 15, c = 0.
Categoría 14
2 clases
n = 30 c = 0.
Categoría 15
2 clases
n = 60 c = 0.
(ICMSF, 2006)
17
Tabla N° 4 Criterios microbiológicos en Alimentos
FRUTAS, HORTALIZAS, FRUTOS SECOS Y SIMILARES
Frutas y hortalizas frescas. ( sin ningún tratamiento)
Agente microbiano Categoría Clase n c Límite por g.
m M
Escherichia coli 5 3 5 2 102 103
Salmonella sp. 10 2 5 0 Ausencia/25 g -----
Frutas y hortalizas frescas semiprocesadas (lavadas, desinfectadas, peladas, cortadas
y/o precocidas), refrigeradas y/o congeladas.
Agente microbiano Categoría Clase n c Límite por g.
m M
Aerobios mesófilos 1 3 5 3 104 106
Escherichia coli 5 3 5 2 10 102
Salmonella sp. 10 2 5 0 Ausencia/25 g -----
Listeria monocytogene
(*)
10 2 5 0 Ausencia/25 g -----
(*)Solo para frutas y hortalizas de tierra (a excepción de las precocidas).
Frutas y hortalizas desecadas, deshidratadas o liofilizadas
Agente microbiano Categoría Clase n c Límite por g.
m M
Mohos 3 3 5 1 10 102
Levaduras 3 3 5 1 10 102
Escherichia coli 5 3 5 2 10 5x102
Salmonella sp. 10 2 5 0 Ausencia/25 g -----
Frutas y hortalizas en vinagre, aceite o salmuera o fermentadas
Agente microbiano Categoría Clase n c Límite por g.
m M
Levaduras 3 3 5 1 103 104
Frutos secos (dátiles, tamarindo, otros) y Semillas (castañas, maní, pecanas, nuez,
almendras, otros).
Agente microbiano Categoría Clase n c Límite por g.
m M
Mohos 3 3 5 1 10 102
Levaduras 3 3 5 1 10 102
Escherichia coli 5 3 5 2 10 102
(ICMSF, 2006)
18
2.2.14. Lavado de hortalizas.
La materia prima deberá lavarse según sea necesario para separar la tierra o
eliminar cualquier otra contaminación. El agua que se haya utilizado para estas operaciones
no deberá recircularse, a menos que se haya tratado adecuadamente para mantenerla en
unas condiciones que no constituyan un peligro para la salud pública. El agua empleada
para las operaciones de lavado, enjuagado o transporte de los productos alimenticios
terminados, deberá ser de calidad potable. (CODEX, 2003)
2.2.15. Enfermedades transmitidas por alimentos (ETA).
Las ETA se producen por la ingestión de alimentos infectados con agentes
patógenos contaminantes en porcentajes elevados, los cuales afectan a la salud del
consumidor. Las hortalizas pueden originar malestares provocados por patógenos, tales
como bacterias, virus, hongos, parásitos o metales pesados, que se encuentran en su
interior. Los síntomas más comunes son diarrea y vómito, dolor de cabeza, fiebre etc. (Dra.
Donato, 2007)
La inocuidad de los alimentos se asegura principalmente mediante el control en
el punto de origen, el control de la planificación y formulación del producto y la aplicación
de buenas prácticas de higiene durante la producción, elaboración (incluido el etiquetado),
manipulación, distribución, almacenamiento, venta, preparación y uso, junto con la
aplicación del Sistema de HACCP (Sistema de Análisis de Peligros y de los Puntos Críticos
de Control y Directrices para su Aplicación). (CPE INEN-CODEX CAC/GL 21, 2013)
2.2.15.1. Microorganismos en alimentos.
Prácticamente, todas las hortalizas en su estado natural son sensibles a la
alteración por microorganismos, con una rapidez que depende de varios factores
intrínsecos, tecnológicos, extrínsecos e implícitos. En general, en comparación con
productos animales, las hortalizas crudas en buen estado son menos mantenedoras del
crecimiento de los microorganismos de la intoxicación alimentaria. Pueden mantener el
crecimiento de patógenos una vez que la integridad de las células ha desaparecido por la
marchitez, por envejecimiento o por una lesión tal como el cortado, el desmenuzado, el
machacamiento o la extracción del jugo. (ICMSF, Microorganisms in Foods. Microbial
Ecology of Food Commodities, 2000)
Al evaluar el riesgo microbiológico que un alimento puede contener, deben
considerarse todos los microorganismos que pueden ser transmisibles a partir de él, entre
los que se pueden incluir bacterias, virus, hongos, levaduras, algas y parásitos. Si no se
19
tiene control sobre la calidad de los alimentos, su consumo puede representar, en algún
momento, un riesgo para la salud del consumidor, pues éste contendrá microorganismos
patógenos, toxinas, metabolitos tóxicos o microorganismos capaces de deteriorar la calidad
del alimento hasta un estado inaceptable. Por lo tanto, deben tenerse muy en cuenta los
tipos y número de microorganismos presentes en los alimentos. La presencia de
microorganismos puede ocasionar alteraciones en el producto, enfermedades, así como
indicar la posibilidad de que los alimentos estén contaminados por patógenos. (Paniagua
González, 2016)
Para la evaluación de la inocuidad microbiológica de los alimentos, se utilizan
organismos indicadores que se aplican a través de técnicas que permiten evaluar la calidad
de la materia prima, problemas de almacenamiento, abuso de temperatura, vida útil
(recuento de microorganismos aerobios mesófilos), potencial contaminación fecal o posible
presencia de patógenos (Enterobacteriaceae, Escherichia coli, Coliformes fecales). Los
microorganismos mencionados anteriormente son indicadores que revelan las condiciones a
las que ha sido expuesto el producto y el peligro que pudieran representar en algún
momento. (Paniagua González, 2016)
2.2.15.2. Microorganismos patógenos.
Son aquellos microorganismos que pueden encontrarse en los alimentos,
convirtiéndolos en potencial vehículo de enfermedad para quien los consuma (Health and
Consumer Protection Directirate General, 1999). En los países donde se utilizan residuos
animales como abono, sería de esperar la contaminación de las hortalizas por patógenos. En
el oriente, el uso de contenido de las letrinas en las hortalizas y en frutas puede causar del
orden del 20% de las infecciones recidivantes de shigelosis, fiebre tifoidea, cólera y
amebiasis. Los cultivos de raíces y los cultivos de hojas y tallos de crecimiento lento están
contaminados masivamente por usar efluente de aguas residuales o agua de riego
contaminada. La eficiencia del lavado subsiguiente con agua clorada para eliminar
patógenos, es dudosa. En la mayoría de las hortalizas crudas, los tiempos de supervivencia
correspondientes a Coliformes, a patógenos bacterianos y a virus entéricos dependen de la
humedad y de la temperatura y se prolongan significativamente más allá de la vida de
almacén de los productos. (ICMSF, Microorganisms in Foods. Microbial Ecology of Food
Commodities, 2000)
Una gran variedad de hortalizas han sido relacionadas con varios patógenos;
entre ellas, tomate, lechuga, espinaca, perejil, cilantro, brócoli, espárragos y repollo. Los
brotes con los que han sido relacionadas las hortalizas incluyen bacterias patógenas como
Salmonella spp, Escherichia coli O157:H7, Shigella spp, Listeria monocytogenes, Bacillus
cereus, Campylobacter jejuni, Yersinia enterocolítica y Aeromonas spp. Se ha demostrado
20
que estos patógenos pueden crecer en hortalizas refrigeradas, incluyendo lechuga, brócoli,
coliflor, y el espárrago. (Peluffo Rivera, 2009). La Escherichia coli se ha encontrado en
hortalizas crudas especialmente en la lechuga, siendo identificada como causa frecuente de
diarrea de los viajeros. (ICMSF, Microorganisms in Foods. Microbial Ecology of Food
Commodities, 2000). Según la revista SCientífica explica que estudios realizados en
Bolivia ha demostrado que alrededor del 60% de Escherichia coli y el 20 % de Salmonella
spp se encuentra en lechugas. (Calvo Flores, Canaviri Flores, Cruz Callisaya, & Campero
Paredes, 2006)
Tabla N° 5 Patógenos aislados sobre frutas y hortalizas causantes de enfermedades
de origen alimentario.
Patógenos Frutas y Hortalizas
Aeromonas spp. Brotes de alfalfa, espárrago, brócoli, coliflor, lechuga,
pimiento.
Bacillus cereus Brotes de distintas especies
Escherichia coli 0157:H7 Repollo, apio, cilantro, lechuga(*), ananá, sidra de
manzanas(*), brotes de alfalfa(*)
Listeria monocytogenes Brotes de poroto, repollo, pepino, repollo cortado(*),
papa, rabanito, hongos comestibles (*), ensaladas(*),
tomates y otras hortalizas
Salmonella spp. Alcaucil, brotes de poroto(*), tomate(*), brotes de
alfalfa("), sidra de manzanas(*), coliflor, apio, berenjena,
endivias, pimiento, melón cantalupo(*), sandía(*),
lechuga, rabanito y diversas hortalizas
Clostridium botulinum Repollo cortado(*)
Shigella spp. Perejil, hortalizas de hoja, lechuga cortada(*)
Cryptosporidium spp. Sidra de manzana(*)
Cyclospora spp. Frambuesa(*), albahaca(*), lechuga(*)
Hepatitis A Lechuga(*), frutilla(*), frutilla congelada(*)
(*) Enfermedades reportadas. (López Camelo, 2003).
2.2.16. Microorganismos de prueba.
2.2.16.1. Salmonella enterica.
Salmonella enterica es un bacilo Gram negativo, perteneciente a una subespecie
de serotipo Enteritidis (SE), es un enteropatógeno frecuentemente involucrado en brotes de
21
infecciones transmitidas al ingerir comida o líquidos contaminados con material fecal de
humanos o animales infectados. La contaminación de alimentos puede darse durante la
limpieza, empaquetamiento y procesamiento, o cuando los mismos son manipulados por
personas infectadas, así como por la presencia de roedores en las instalaciones. La ingestión
de verduras, carne de pollo y carnes rojas poco cocidas, al igual que la leche no
pasteurizada y huevos contaminados, también son otras formas de transmisión de
salmonelosis. Las infecciones por Salmonella enterica se adquiere frecuentemente por vía
oral, produciendo principalmente diarrea, y dependiendo del estado inmunitario del
hospedador, de la cepa y de 18 la dosis infectante, Salmonella spp. puede producir
septicemia. Al ingresar al hospedador la bacteria tiene la capacidad de modular la expresión
de sus genes para poder sobrevivir a los severos cambios ambientales como el pH ácido,
aumento de temperatura, baja tensión de oxígeno y alta osmolaridad. Una vez que se
ingieren alimentos contaminados con Salmonella spp., la bacteria pasa por el sistema
digestivo y debe sobrevivir al ambiente ácido del estómago, para ello la bacteria genera una
respuesta de tolerancia al ácido, que requiere de la síntesis de más de 50 proteínas. Los
alimentos ricos en grasa también pueden proteger a la bacteria, por lo que dosis bajas del
microorganismo serían suficientes para desencadenar una infección (Logacho Pilataxi ,
2015). Para este proyecto de investigación se utilizó la cepa de Salmonella enteritidis
ATCC 13076 cuyas especificaciones se puede revisar en ANEXO 10.
2.2.16.2. Escherichia coli.
La Escherichia coli es casi exclusivamente de origen fecal y se transmite a
través de la contaminación fecal de los alimentos y del agua, así como también a través de
la contaminación cruzada o por contacto humano directo durante la preparación de los
alimentos. Una amplia gama de alimentos pueden ser un vehículo para la Escherichia coli
patógena en conjunto con sus respectivas ecologías. Los alimentos pueden contaminarse de
manera directa o por contaminación cruzada durante el crecimiento y cultivo (hortalizas),
recolección (leche) o faenado (carne). Se puede producir una contaminación adicional
durante la manipulación poscosecha, transporte, elaboración y manipulación no higiénica
de alimentos durante su preparación. Los factores que contribuyen a la persistencia de la
Escherichia coli en los sistemas alimentarios incluyen el control inadecuado de los
parámetros de procesamiento (p. ej., temperatura de cocción, valor del pH, actividad del
agua y almacenamiento a altas temperaturas que permiten el crecimiento de estas bacterias).
(FAO, 2018)
Para este proyecto de investigación se utilizó la cepa de Escherichia coli ATCC
25922, la cual es una bacteria Gram-negativa aparentemente ubicua, conocida por su
capacidad de causar brotes transmitidos por los alimentos. La cepa ATCC 25922 es una
cepa de control de calidad utilizada comúnmente, particularmente en ensayos de
22
sensibilidad a anticuerpos y se aisló originalmente a partir de una muestra clínica humana
recogida en Seattle y WA (1946). Es del serotipo O6 y biotipo 1. (American Society For
Microbiology, 2014). Las especificaciones de Escherichia coli ATCC 25922 se puede
revisar en ANEXO 11
2.2.17. Métodos de evaluación antibacteriana.
Diferentes métodos de laboratorio pueden ser usados para determinar in-vitro la
susceptibilidad de bacterias ante agentes microbianos, pero estos no son igualmente
sensibles o no se basan en los mismos principios, permitiendo que los resultados sean
influenciados por el método seleccionado, los microorganismos usados y el grado de
solubilidad de cada compuesto evaluado. Los métodos para evaluar la actividad
antibacteriana están clasificados, en tres grupos principales: Métodos de difusión, métodos
de dilución y bioautografía, un cuarto método es el análisis conductimetrico, el cual detecta
el crecimiento microbiano como un cambio en la conductividad eléctrica o impedancia del
medio de cultivo. Las técnicas de difusión han sido ampliamente usadas para evaluar
extractos de plantas con actividad antimicrobiana. En general se propone usar los métodos
de difusión (en papel o en pozo) para estudiar compuestos polares, y los métodos de
dilución para sustancias polares y no polares. ( Ramirez & Castaño, 2009)
Las metodologías aplicadas siempre consideran la estandarización de la
concentración bacteriana a utilizar, con el ánimo de evitar un crecimiento exhaustivo, que
impida el análisis de los resultados o proporcione resultados errados lo cual puede variar
significativamente la respuesta del extracto vegetal o aceite, indicando la necesidad de
utilizar concentraciones mayores de éste para inhibir el crecimiento del microorganismo. La
concentración de bacterias usada para el estudio de susceptibilidad en el laboratorio ha sido
estandarizado en 5 x 105 unidades formadoras de colonias (ufc)/ml, lo cual equivale a un
patrón de 0.5 en la escala de Mac Farland. Es recomendable tomar el inoculo de cultivos en
la fase exponencial de crecimiento y siempre tomar 4 o 5 colonias de un cultivo puro para
evitar seleccionar variantes atípicas. Los medios de cultivo más utilizados en dichas
técnicas son el agar Mueller-Hinton y Agar Tripticasa de Soya, ya que sus componentes
facilitan el crecimiento de diferentes cepas bacterianas y mayor difusión de las muestras.
( Ramirez & Castaño, 2009)
2.2.17.1. Métodos de difusión en disco.
El antibiograma disco-placa basado en el trabajo de Bauer, Kirby y
colaboradores), se recomienda para la determinación de la sensibilidad bacteriana a los
antimicrobianos. El antibiograma disco-placa consiste en depositar, en la superficie de agar
de una placa de petri previamente inoculada con el microorganismo, discos de papel
23
secante impregnados con los diferentes antibióticos. Tan pronto el disco impregnado de
antibiótico se pone en contacto con la superficie húmeda del agar, el filtro absorbe agua y el
antibiótico difunde al agar. El antibiótico difunde radialmente a través del espesor del agar
a partir del disco formándose un gradiente de concentración. Transcurridas 18-24 horas de
incubación los discos aparecen rodeados por una zona de inhibición. La concentración de
antibiótico en la interfase entre bacterias en crecimiento y bacterias inhibidas se conoce
como concentración crítica y se aproxima a la concentración mínima inhibitoria (CMI)
obtenida por métodos de dilución. (Picazo, 2000)
2.2.17.2. Determinación de la (CMI) por el métodos de dilución.
El método de dilución en agar o en caldo como test de susceptibilidad
microbiana es utilizado para determinar la concentración mínima bactericida (MBC) y la
concentración mínima inhibitoria (MIC), la cual es definida como la concentración más
baja de sustancia que puede inhibir el crecimiento visible de un microorganismo después de
incubar por 24 horas, y la (MBCs) como la concentración más baja que puede prevenir el
crecimiento de un organismo después de subcultivar en un medio libre del compuesto
evaluado, estas variables son una herramienta para investigar nuevos antimicrobianos. En la
técnica de dilución en caldo, son utilizados tubos o microplacas (microdilución) que
contienen concentraciones crecientes del extracto vegetal. El organismo en estudio es
inoculado en los diferentes tubos o pozos de las microplacas y la MIC es determinada
después de la incubación. ( Ramirez & Castaño, 2009)
2.2.18. Recuento de Escherichia coli y Coliformes por la técnica petrifilm
AOAC Método oficial 991.14.
Las Placas Petrifilm™ para el Recuento de Escherichia coli/Coliformes (Placa
Petrifilm EC) contienen nutrientes de Bilis Rojo Violeta (VRB), un agente gelificante
soluble en agua fría, un indicador de actividad de la glucuronidasa y un indicador que
facilita la enumeración de las colonias. La mayoría de las Escherichia coli (cerca del 97%)
produce beta-glucuronidasa, la que a su vez produce una precipitación azul asociada con la
colonia. La película superior atrapa el gas producido por Escherichia coli y Coliformes
fermentadores de lactosa. Cerca del 95% de las Escherichia coli producen gas, representado
por colonias entre azules y rojo-azules asociadas con el gas atrapado en la Placa Petrifilm
EC (dentro del diámetro aproximado de una colonia).
La AOAC Internacional y el Manual de Análisis Bacteriológico de la FDA de
los Estados Unidos definen los Coliformes como colonias de bastoncillos gram-negativos
que producen ácido y gas de la lactosa durante la fermentación metabólica de la lactosa.
Las colonias Coliformes que crecen en la Placa Petrifilm, producen un ácido que causa el
24
oscurecimiento del gel por el indicador de pH. El gas atrapado alrededor de las colonias
rojas de Coliformes confirma su presencia. (Guía de Intepretación 3M. Placas Petrifilm
para el Recuento de Escherichia coli/Coliformes, 2006)
2.2.19. Aislamiento e identificación de Salmonella spp ISO 6579.
Este procedimiento es aprobado por la Norma (ISO 6579-1, 2017) , el cual no
es un método cuantitativo y es aplicable para determinar la presencia o ausencia de
Salmonella en alimentos con alta carga microbiana. (MSc Hidalgo). Este método se basa en
la investigación de Salmonella en cuatro etapas sucesivas: Preenrequecimiento en medio no
selectivo, Enriquecimiento en medios selectivos líquidos (Caldo Rappaport y Caldo
Selenito Cistina), Aislamiento e identificación que se lo realiza en medios sólidos (agar
XLD y agar Hektoen) y la confirmación que se realiza una siembra de las presuntas
colonias de Salmonella y se confirma en medios de ensayos bioquímicos y serológicos
apropiados (Prueba TSI, úrea, LIA).
2.3. FUNDAMENTO LEGAL
Constitución Nacional de la República del Ecuador, Registro oficial N⁰
449, 2008
Sistema nacional de ciencia, tecnología, innovación y saberes ancestrales
Art. 385.- El sistema nacional de ciencia, tecnología, innovación y saberes
ancestrales, en el marco del respeto al ambiente, la naturaleza, la vida, las culturas y la
soberanía, tendrá como finalidad:
Generar, adaptar y difundir conocimientos científicos y tecnológicos.
2) Recuperar, fortalecer y potenciar los saberes ancestrales.
3) Desarrollar tecnologías e innovaciones que impulsen la producción nacional,
eleven la eficiencia y productividad, mejoren la calidad de vida y contribuyan a la
realización del buen vivir.
Ley Orgánica de Salud (Ley No. 2006-67)
Capítulo II. De la autoridad sanitaria nacional, sus competencias y
responsabilidades
Art. 6.- Es responsabilidad del Ministerio de Salud Pública:
Regular y realizar el control sanitario de la producción, importación, distribución,
almacenamiento, transporte, comercialización, dispensación y expendio de alimentos
procesados, medicamentos y otros productos para uso y consumo humano; así como los
25
sistemas y procedimientos que garanticen su inocuidad, seguridad y calidad, a través del
Instituto Nacional de Higiene y Medicina Tropical Dr. Leopoldo Izquieta Pérez y otras
dependencias del Ministerio de Salud Pública.
Objetivos Del Plan Nacional Del Buen Vivir. (2017-2021)
Promover la interacción recíproca entre la educación, el sector productivo y la
investigación científica y tecnológica, para la transformación de la matriz productiva y la
satisfacción de necesidades.
2.4. HIPÓTESIS
2.4.1. Hipótesis del trabajo.
Hi: Las soluciones obtenidas a partir del fraccionamiento cromatográfico del
extracto acetónico de Hibiscus sabdariffa presentan actividad antibacteriana en hortalizas.
2.4.2. Hipótesis nula.
Ho: Las soluciones obtenidas a partir del fraccionamiento cromatográfico del
extracto acetónico de Hibiscus sabdariffa no presentan actividad antibacteriana en
hortalizas.
2.5. CONCEPTUALIZACIÓN DE VARIABLES
Etapa 5: Evaluación de la actividad antibacteriana a partir de las fracciones del
fraccionamiento primario obtenidos del extracto acetónico de la especie vegetal Hibiscus
sabdariffa
Variable independiente.
A: Tipo de extracto o fracción
B: Tipo de cepa bacteriana
Variables Dependientes
A: Efecto antibacteriano frente a las diferentes cepas bacterianas
B: Diámetro de halo de inhibición
26
CAPÍTULO III
MARCO METODOLÓGICO
3.1. DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN
El enfoque de este trabajo de investigación corresponde a un enfoque
cuantitativo ya que se basa en la recolección de datos para probar la hipótesis con base a
una medición numérica y estadística, para establecer patrones de comportamiento y probar
teorías (Hernándes Sampieri, 2014, pág. 4). Los datos a recolectar están basados en
determinar el porcentaje de extracción, el número de fracciones extraído a partir del
extracto acetónico de Hibiscus sabdariffa mediante el método de cromatografía en
columna, evaluar la mejor actividad antibacteriana mediante la medición de los halos de
inhibición formados a partir de los extractos obtenidos, evaluar la Concentración Mínima
Inhibitoria mediantes lecturas de diluciones seriadas y evaluar el extracto con mejor
actividad antibacteriana en hortalizas.
El nivel de investigación de este proyecto se basa en un nivel explicativo,
debido a que este permite conocer la relación existente entre la causa y efecto de los
fenómenos estudiados. En este nivel de investigación se evaluó la capacidad antibacteriana
de la Flor de Jamaica de la especie vegetal Hibbiscus sabdariffa frente a microorganismos
patógenos mediante una fracción del extracto acetónico de Hibbiscus sabdariffa.
El tipo de investigación planteado es una investigación experimental ya que se
desarrolló en laboratorios donde las variables son controladas, manipuladas y medidas,
además, es una investigación bibliográfica porque se sustentó en estudios previos
realizados.
3.2. POBLACIÓN Y MUESTRA
Para el presente estudio se describió como población a la especie certificada
como Hibbiscus sabdariffa proveniente de la finca “El Tesoro”, ubicada en el Cantón
Sucúa, Provincia de Morona Santiago, y como muestra a las hortalizas (lechuga, tomate
riñón y culantro) obtenidas del Mercado Santa Clara ubicado entre las calles Versalles y
Ramírez Dávalos, a las cuales se le realizó un análisis microbiológico.
27
3.3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.3.1 Materiales.
Material Botánico
Flores de la especie vegetal Hibiscus sabdariffa
Material Biológico
Cepa ATCC25922 Escherichia coli
Cepa ATCC 13076 Salmonella enteritidis
Materiales
Espátula
Vaso de precipitación de 25, 50 y 100 ml
Matraces de 500 ml
Viales de vidrio
Picnómetro
Mortero
Columna cromatográfica (h = 51 cm; d = 6 cm)
Pinzas para columna
Quitasato
Probetas de 500 y 1000 ml
Varillas de vidrio
Pipetas Pasteur
Pera de succión
Capilares
Algodón desengrasado
Papel filtro
Papel aluminio
Cámara para CCF
Regla metálica
Estilete
Placa de vidrio
Mechero
Asa de inoculación
28
Gradilla
Tubos de ensayo con tapa rosca
Pipetas automáticas graduables
Puntas para pipetas estériles
Pinzas metálicas
Papel empaque
Regla
Discos estériles para antibiograma Whatman No. 42
Guantes
Mascarilla
Toca
Hisopos
Microtubos
Reactivos
Sílica Gel, 60 Ǻ, 63-200 µm (65-250 mesh)
Sílica TLC 200 X 200 mm
Sílica Gel 60 F254 TLC 10 x 20 cm
Cloroformo 99.8 % P.A
Hexano 99,9% P.A
Diclorometano al 99%
Metanol al 100%
Sulfato de Sodio
Sulfato cérico amoniacal
Acetato de Etilo al 99.9%
Agua destilada
Polisorbato 80
Petrifilm 3M
Agua peptonada
Tripteína Soya Caldo
Agar Tripteína de Soya
Agar Müller-Hinton
Caldo Müller-Hinton
Agar Lisina-Hierro
Caldo Urea
Agar Hierro y Triple Azúcar
Agar Entérico-Hektoen
Agar Xilosa-Lisina-Desoxicolato
29
Caldo Selenito-Cistina
Caldo Rappaport-Vassiliadis
Quercetina P.A
Ácido gálico P.A
Etanol al 96%
Reactivo de Folin-Ciocalteu
Na2CO3 al 20%
NaNO2 al 5%
AlCl3 al 10%
Soluciones de NaOH 1M y 0,1N
Equipos
Balanza analítica DENVER
Rotary Evaporator RE 500
Incubadora BSU 100
Cámara de flujo laminar BSC-130011A2-X Clase II
Espectrofotómetro HITACHI U-1900
Lampara UV Cole-Parmer de 254 y 365 nm
Secadora
Cocineta
Molino
Autoclave
Estufa
Desecador
Refrigeradora
Vórtex
3.3.2. Metodología.
La experimentación constó de siete etapas: En la primera etapa se compró la
planta de Jamaica (Hibiscus sabdariffa) a la cual se la extrajo su flor y se procedió a su
identificación botánica, así como también la limpieza de esta parte vegetal. En la segunda
etapa se realizó un control de calidad de la especie vegetal. En la tercera etapa, se obtuvo el
extracto acetónico de Hibiscus sabdariffa por medio de maceración estática. En la cuarta
etapa, se realizó el fraccionamiento primario del extracto acetónico mediante cromatografía
en columna abierta, en la cual se obtuvo 147 eluatos, los cuales se agruparon, de acuerdo a
su similitud cromatográfica de CCF, en 7 fracciones (I-VII). En la quinta etapa, se
realizaron ensayos microbiológicos para determinar que fracción posee mayor actividad
30
antibacteriana. En la sexta etapa, se cuantificó la cantidad de fenoles y flavonoides
existente en el extracto acetónico puro y en el extracto del grupo de fraccionamiento que
evidenció tener mayor actividad antibacteriana. Finalmente, en la séptima etapa, se preparó
una solución acuosa de la fracción con mayor actividad, la cual fue probada sobre los
microorganismos existentes en las hortalizas (lechuga, tomate riñón y culantro).
Etapa 1
3.3.2.1. Obtención del material vegetal.
Se utilizaron flores de la especie vegetal Hibiscus sabdariffa, las cuales se
obtuvieron de los sembríos ubicados en la finca “El Tesoro”, ubicada en el Cantón Sucúa,
Provincia de Morona Santiago. Posteriormente se realizó la identificación botánica de la
especie en el Herbario Alfredo Paredes de la Universidad Central del Ecuador.
3.3.2.2. Tratamiento del material vegetal.
Al material vegetal, se eliminó la materia extraña, partes deterioradas y otras
impurezas, dejando únicamente como material de experimentación las flores de la planta, a
estas se les dejó secar a temperatura ambiente y luego fueron triturados en un molino hasta
lograr un tamaño de partícula de entre 1 a 5 mm.
Etapa 2
3.3.2.3. Control de calidad del material vegetal.
El control de calidad de la especie vegetal se realizó siguiendo las indicaciones
y metodología de la monografía de Jamaica, Flor: Hibiscus sabdariffa L, existente en la
Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos. (Comisión Permanente de la
farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, 2013, págs. 228-229)
3.3.2.4. Descripción macroscópica. MGA-FH 0040.
Para la descripción macroscópica de Hibiscus sabdariffa se analizó el tamaño
de la flor, utilizando una regla graduada en milímetros. Para determinar el color se colocó la
muestra bajo la luz difusa del día. Para determinar el olor se colocó una pequeña porción de
la muestra en la palma de la mano y se realizó una inhalación lenta y repetida del aire. Para
contar el número de sépalos de forma manual, y la forma del calículo se determinó de
forma visual.
31
3.3.2.5. Cromatografía en capa fina: Ensayo de identidad MGA-FH 0050.
Para el ensayo de identidad se realizó por cromatografía en capa fina, utilizando
como fase estacionaria placas de sílica gel y como fase móvil una mezcla de ácido fórmico:
agua: butanol (10:12:40). La muestra fue preparada utilizando 1,0 gramo de polvo de
material vegetal, al cual se le agregó 10 ml de etanol al 60%, se mezcló durante 15 minutos
y se filtró. Se sembró en banda 5 µl de la muestra y se dejó eluir hasta el 90 por ciento de la
longitud de la placa, se secó al aire y se examinó a la luz del día.
3.3.2.6. Pérdida por secado MGA-FH 0080.
Se pesó aproximadamente 1,0 g de polvo de material vegetal en un crisol seco y
de peso constante, luego se colocó las muestras en una estufa a 105 ºC durante dos horas.
Se controló hasta tener dos pesadas consecutivas que no difieran por más de 5.0 mg. El
ensayo se realizó por duplicado
3.3.2.7. Cenizas Totales MGA-FH 0060.
Para este ensayo se colocó aproximadamente 2.0 g de material vegetal molido
en un crisol calcinado y a peso constante, luego, se dispersó el material formando una capa
homogénea y se colocó en la mufla a una temperatura de 600 ºC durante 5 horas hasta que
se encuentre completamente blanco. Se enfrió los crisoles en un desecador y finalmente
fueron pesados. El ensayo se realizó por duplicado
3.3.2.8. Intensidad de la coloración.
Se pesó 10 g de material vegetal molido y se colocó en un tamiz de malla 355
µm. Posteriormente se tomó 1,0 g del material tamizado y se colocó en un matraz de 100
ml, se añadió 25 ml de agua en ebullición y se calentó durante 15 minutos en un baño maría
agitando constantemente. Luego se filtró y se realizó un lavando del papel filtro con 3
porciones de 5 ml de agua caliente. Del filtrado se tomó 5 ml y se llevó a un volumen de 50
ml con agua destilada. Finalmente, se midió la absorbancia a 520 nm utilizando agua como
blanco. El ensayo se realizó por duplicado.
32
3.3.2.9. Valoración de ácido cítrico MGA 0091.
A 1,0 gramo de la muestra en polvo se adicionó 100 ml de agua exenta de
dióxido de carbono y se mantuvo en baño maría durante 15 minutos. Se filtró y se tomó 50
ml del filtrado, al cual se añadió 100 ml de agua exenta de dióxido de carbono. Finalmente,
se valoró con una solución de NaOH 0,1 N hasta un pH 7.0, que corresponde al punto final
de la titulación potenciométrica. El ensayo se realizó por duplicado.
1,0 ml de la solución de NaOH 0,1 N, corresponde a 6.4 mg de ácido cítrico.
Etapa 3
3.3.2.10. Proceso de extracción.
La metodología empleada para la obtención del extracto acetónico de Hibiscus
sabdariffa está basado en la Patente “Soluciones a base de Fitocompuestos para desinfectar
hortalizas realizado por (Hernández Gómez & Gómez Aldapa, 2016).
Para este proceso se utilizó la técnica de extracción por maceración estática, en
donde se pesó aproximadamente 100 g de la flor de Jamaica, posteriormente, se colocó en
un envase de vidrio ámbar, y se le añadió 900 ml de acetona grado HPLC, esta mezcla se
dejó reposar estáticamente durante 7 días a temperatura ambiente. Transcurrido este tiempo
la mezcla fue filtrada al vacío, y se concentró en un rotavapor (RE 500), sin llevar a total
sequedad. El concentrado se lo colocó en un platillero limpio, seco y previamente pesado,
se dejó secar a temperatura ambiente hasta que no exista variación en su peso.
Dos gramos del extracto seco se almacenó en un vial limpio y seco, a
temperatura ambiente hasta su posterior uso.
Etapa 4
3.3.2.11. Fraccionamiento primario del extracto acetónico por
cromatografía en columna.
En el extracto acetónico que se obtuvo se colocó 10 gotas de hexano y 30
gramos de sílica gel, siendo homogeneizado con un mortero y pistilo hasta obtener una
textura similar a la de la sílica.
33
Se colocó en un lugar fijo y seguro la columna cromatográfica de 51 cm de
altura y 6 cm de diámetro. En esta columna se colocó una pequeña porción de algodón
desengrasado, se adicionó 300 g de sílica gel (65-250 mesh), y posteriormente el extracto
acetónico adsorbida en sílica gel. Posteriormente, se adicionó una pequeña cantidad de
sulfato de sodio y finalmente se colocó una capa de algodón desengrasado. Una vez
empaquetada la columna se eluyó con diferentes disolventes a diferentes gradientes de
polaridad, de acuerdo como se resume en las tablas N° 6 y 7.
Tabla N° 6 Disolventes y mezclas para el fraccionamiento primario
Cloroformo (%) Acetona (%)
100 x
90 10
80 20
70 30
60 40
50 50
40 60
30 70
20 80
x 100
Elaborado por: Latacunga J.
Tabla N° 7 Disolventes y mezclas para el fraccionamiento primario
Acetona (%) Metanol (%)
100 x
95 5
80 20
50 50
x 100
Elaborado por: Latacunga J.
Una vez obtenidas las fracciones, se concentró en rotavapor (RE 500), y cada
una de estas se colocó en un vial aproximadamente entre 1 a 2 ml. Luego se realizó una
cromatografía en capa fina para unir las fracciones que tenían similitud, mediante un
revelado físico (luz UV de 254 y 365 nm) y químico (sulfato cérico amoniacal).
Finalmente, se realizó un replaqueo de las fracciones para obtener las fracciones (I-III), las
cuales fueron evaluadas su actividad antibacteriana.
34
Etapa 5
3.3.2.12. Evaluación de la actividad antibacteriana de las colecciones del
fraccionamiento.
La prueba de susceptibilidad antimicrobiana se realizó en base al Manual de
procedimientos para la prueba de sensibilidad antimicrobiana por el método de disco
difusión. (Organismo Público Descentralizado de Sector Salud, Ministerio de Salud Pública
del Perú, & Instituto Nacional de Salud, 2002)
Se evaluó la actividad antibacteriana de las fracciones obtenidas, mediante la
técnica de difusión en disco frente a cepas de Escherichia coli ATCC 25922 y Salmonella
enteritidis ATCC 13076.
3.3.2.13. Activación de cepas bacterianas.
Para la activación de la cepa de Salmonella enteritidis ATCC 13076, se
procedió a desinfectar las tijeras que se ocupó para abrir el kit y la superficie dónde se
trabajó con alcohol al 70%. Luego, junto al mechero se abrió el kit CULTI-LOOPS® y se
colocó el capuchón en un tubo que contenía 3 ml de Caldo Tripteína de Soya (TSB), esto se
incubo durante 24 h a 37 °C. Transcurrido este tiempo y observando turbidez en el tubo
inoculado se realizó el pase por estriación a cajas de Agar Tripteína de Soya (TSA), las
cuales fueron incubadas por 24 h a 37 °C.
La activación de Escherichia coli ATCC 25922 se realizó tomando con el asa
de inoculación dos colonias aisladas del medio de cultivo donde se encontraban, y
posteriormente se llevó a cabo el estriamiento del microorganismo sobre una caja que
contenía Agar TSA, siendo finalmente incubada durante 24 h a 37 °C.
3.32.2.14. Preparación de discos para antibiograma.
Se prepararon soluciones acuosas con cada una de las fracciones obtenidas del
extracto acetónico de la siguiente manera (Ver tabla N° 8):
1. Se preparó una solución de Polisorbato 80-agua (15:85)
2. La solución anteriormente preparada se adicionó al extracto seco en
proporción 10:1
3. Se homogeneizó y la solución se guardó en frascos estériles.
4. En la cabina de flujo laminar clase II, utilizando una micropipeta estéril, se
35
colocaron alícuotas de 20 μl de las soluciones preparadas sobre los discos
de papel filtro (Whatman No. 42; d = 6 mm), y se dejaron secar durante 2 h
en la misma cabina, impregnado un total de 46 discos.
Tabla N° 8 Concentración de las soluciones impregnadas en los discos para
antibiograma
Fracciones Peso de
extracto, g
Volumen
de mezcla (Polisorbato
80-Agua), ml
Concentración,
g/ml
I 0,0251 0,25 0,100
II 0,0253 0,25 0,101
III 0,0256 0,25 0,102
IV 0,0254 0,25 0,102
V 0,0258 0,25 0,103
VI 0,0253 0,25 0,101
VII 0,0249 0,25 0,100
E.A 0,0247 0,25 0,099
E.A: Extracto acetónico
Elaborado por: Latacunga J.
Tabla N° 9 Concentración de las soluciones de controles para el antibiograma
CONTROLES CONCENTRACIÓN,
%
Blanco Acetona 99,9
Positivo Ácido acético (0,05%) 0,05
Negativo Mezcla (Polisorbato 80-agua) 15:85
Elaborado por: Latacunga J.
3.3.2.15. Preparación del estándar (0,5 Mc. Farland) para el inóculo.
En tubos de ensayo que contenían solución salina estéril al 0,85 %, con una asa
microbiológica se inoculó directamente de dos a tres colonias de cada cepa y se
homogeneizó en un vórtex, se ajustó la turbidez a la escala 0,5 McFarland (1,5 x108
UFC/ml), esta concentración se aseguró midiendo la absorbancia del inóculo en un
espectrofotómetro a 594 nm obteniendo valores de absorbancia entre 0,08 y 0,09.
36
3.3.2.16. Método de difusión en discos.
El agar Mueller-Hinton se preparó de acuerdo con las especificaciones
establecidas por el fabricante, se pesó 22,8 g de agar y se disolvió en 600 ml de agua
destilada, se calentó hasta total disolución manteniendo el sistema en ebullición.
Finalmente, se mantuvo en una autoclave a 121 ° C durante 15 minutos.
Dentro de los 15 minutos siguientes se ajustó la turbidez del inóculo, se
sumergió un hisopo estéril en la suspensión, rotando el hisopo varias veces y presionando
sobre la pared interior del tubo por encima del nivel del líquido para remover el exceso de
inóculo. Luego, se sembró sobre la superficie seca de la placa de Mueller-Hinton realizando
un estriado con el hisopo en tres direcciones para asegurar una distribución uniforme del
inóculo. Antes de colocar los discos se dejó secar la placa a temperatura ambiente durante 3
a 5 minutos para que cualquier exceso de humedad superficial sea absorbido. Una vez que
se colocó los discos con los diferentes fracciones y controles, a las placas se les dejó en la
incubadora a 35°C durante 24 h y de forma invertida. Trascurrido este tiempo se midió los
halos de inhibición correspondientes a cada tratamiento. Este ensayo se lo realizó por
triplicado.
3.3.2.17. Concentración Mínima Inhibitoria.
Este proceso se realizó en microtubos, en los cuales se colocó el caldo de
Mueller-Hinton como medio de cultivo y una suspensión bacteriana en solución salina
0,85% de concentración 5x105 ufc/ml (la suspensión puede prepararse a partir de una 0,5
McFarland).
En el microtubo 1 se colocó 100 μl de extracto más 100 μl de medio, este
microtubo sirvió como blanco. Desde el microtubo 2 al microtubo 8 se colocó 100 μl del
medio, en el microtubo 2 se adicionó 100 μl del extracto, a partir del cual se realizó
diluciones seriadas a la mitad hasta el microtubo 8. Posteriormente se procedió a inocular
100 μl de suspensión bacteriana de concentración 5x105 ufc/ml desde el microtubo 2 al
microtubo 8 obteniendo un volumen final de 200 μl. En el microtubo 9 se colocó el control
negativo que corresponde a 200 μl del medio sin inocular. Finalmente, en el microtubo 10
se colocó el control positivo que corresponde a 100 μl de medio más 100 μl se suspensión
bacteriana. Finalmente se dejó en la incubadora los microtubos a 35 °C durante 24 h.
Este proceso se realizó por duplicado para la fracción que obtuvo mayor
actividad antibacteriana en el ensayo del antibiograma frente a cada bacteria en estudio.
37
Etapa 6
3.3.2.18. Determinación de Fenoles y Flavonoides.
La prueba de determinación de Fenoles y Flavonoides se realizó en base a la
Guía de Productos Naturales II. (Caramunt, Farrán, & López, 2013)
3.3.2.19. Identificación de Fenoles totales.
Curva de Calibración
Se preparó 10 ml de soluciones de ácido gálico (0,1 mg, 0,2 mg, 0,5 mg, 1 mg y
2 mg por ml de etanol al 96%). Se tomó seis tubos de ensayo de 5 ml y se añadió 0,05 ml
de las soluciones en cada uno así: para el blanco se colocó en el tubo de ensayo 4 ml de
agua y 0,25 ml del Reactivo de Folin-Ciocalteu y para el extracto se colocó 0,5 ml de la
muestra en las diferentes concentraciones más 3,5 ml de agua y 0,25 ml del Reactivo de
Folin-Ciocalteu.
Se esperó dos minutos y se adicionó 0,75 ml de Na2CO3 al 20% y se dejó
reposar en la oscuridad y a temperatura ambiente durante dos horas. Se leyó en el
espectrofotómetro a 765 nm y finalmente, se repitió este procedimiento con la muestra, la
cual se disolvió en etanol al 96% en relación 1:10.
3.3.2.20. Identificación de Flavonoides.
Curva de Calibración
Se preparó 5 ml de las soluciones acuosas de quercetina (1; 0,5; 0,25; 0,125;
0,0625 mg/ml) y se realizó el mismo tratamiento que el de las muestras y se leyó a una
longitud de onda de 510 nm.
La muestra se disolvió en agua en relación 1:10 y se dejó en reposo. A cada uno
de los estándares y a la muestra se agregaron 1,35 ml de agua destilada y 0,075 ml de
NaNO2 al 5% y se dejó en reposo por 6 minutos, luego se agregó 0,15 ml de AlCl3 al 10% y
se dejó reposar por 5 minutos más. Posteriormente, se adicionó 0,5 ml de NaOH 1M
completando el volumen con agua destilada hasta 2,5 ml y se leyó la absorbancia en el
espectrofotómetro a una longitud de onda de 510 nm.
38
Etapa 7
3.3.2.21. Evaluación de la actividad antibacteriana.
La evaluación de la actividad antibacteriana con respecto al Recuento de
Escherichia coli/ Coliformes en placas Petrifilm 3M se lo realizó en base al método AOAC
método oficial 991.14, y para aislamiento e identificación de Salmonella spp. en Alimentos
se realizó de acuerdo a lo especificado en (NTE INEN-ISO 6579, 2014).
El agar agua peptonada se preparó de acuerdo con las especificaciones
establecidas por el fabricante, se pesó 156 g de agar y se disolvió en 8 l de agua destilada.
Finalmente, se calentó hasta total disolución manteniendo el sistema en ebullición a 121 °C
durante 15 minutos.
En el presente proyecto de investigación se consideró como muestras las
hortalizas, siendo estas: lechuga, tomate riñón y culantro, las cuales fueron obtenidas al
azar y de diferentes niveles del lote en un puesto de mercado Santa Clara, ubicado entre las
calles Versalles y Ramírez Dávalos. El muestreo se realizó según lo especificado en (NTE
INEN 1750:1994, 2012), el cual hace referencia al muestreo de hortalizas frescas y al
tamaño mínimo de muestra a ensayarse.
Tabla N° 10 Tamaño mínimo de la muestra para ensayo
Tamaños y formas Nombre Tamaño mínimo
de cada muestra
para ensayo
Vulgar
Científico
Hortalizas pequeñas Cilantro o
culantro
Familia: Umbellíferae (Apiaceae)
Género: Coriandrum Especie: C.
sativum L.
1kg
Hortalizas Medianas Tomate
Riñon
Familia: Solanacea Género:
Lycopersicum Especie: L.
esculentum M.
2kg
Hortalizas varias Lechuga Familia: Compositae
(Asteraceae);
Género: Lactuca, Especie: L.
sativa L.
10 unidades
(NTE INEN 1750:1994, 2012)
39
Para el tratamiento de las muestras se pesó 25 g de cada una y se colocó en 225
ml de agua peptonada y se dejó en la incubadora a 37 °C durante 20 h. Para analizar el
tratamiento con mayor actividad antibacteriana, se pesó 25 g de cada muestra y se les
colocó 20 ml del extracto a probar durante 5 minutos y luego se colocó estas muestras en
225 ml de agua peptonada. Este procedimiento sirvió tanto para el recuento de Escherichia
coli/ Coliformes y para el aislamiento e identificación de Salmonella spp.
3.3.2.22. Recuento de Escherichia coli/ Coliformes en placas Petrifilm 3M.
Se preparó asépticamente las muestras y las diluciones. Se colocó la placa
Petrifilm 3M en una superficie plana y estéril junto al mechero. Se levantó el film superior
y con la ayuda de una pipeta se colocó de forma perpendicular a la placa Petrifilm, 1 ml de
la muestra en el centro del film inferior. Se bajó el film superior con cuidado, evitando
introducir burbujas de aire. Con la cara lisa hacia abajo, se colocó el aplicador en el film
superior sobre el inóculo y con cuidado se ejerció una presión sobre el aplicador para de
esta manera repartir el inóculo sobre todo el área circular. Luego se esperó un minuto a que
solidifique el gel y se Incubaron las placas invertidas en pilas de hasta 20 placas.
Finalmente, las lecturas se realizaron en base al Método oficial AOAC 991.14. Para
Coliformes se incubó durante 24 ± 2 h a 35 ± 1 °C y para Escherichia coli se incubó
durante 48 ± 2 h a 35 ± 1 °C. El mismo procedimiento se realizó para las muestras que
contenían la aplicación del tratamiento. Estos ensayos se hicieron por duplicado.
3.3.2.23. Aislamiento e Identificación de Salmonella spp.
De las muestras que fueron preparadas de forma aséptica, se cogió una alícuota
de 1 ml y se colocó en un tubo de ensayo que contenía 9 ml del medio de enriquecimiento,
tanto para el Caldo Selenito Cistina y para Caldo Rappaport-Vassiliadis, se dejó incubar a
37 °C por 24 h y a 42 °C por 24 h, respectivamente. Trascurrido este tiempo, a partir de los
cultivos anteriores se sembró en medios sólidos (agar XLD, agar Hektoen) y se les dejó en
la incubadora a 37 °C por 24 h. Finalmente, para confirmar las presuntas colonias de
Salmonella spp., se realizó una siembra en medios tales como: TSI, caldo úrea y LIA. (ISO
6579-1, 2017)
3.4 DISEÑO EXPERIMENTAL
En la quinta etapa se realizó ensayos microbiológicos para la evaluación de la
actividad antibacteriana por el método de difusión en discos, midiendo el halo de inhibición
formado por cada tipo de extracto/fracción frente a cada cepa bacteriana.
40
Tabla N° 11 Factores y niveles del diseño experimental
Factores Niveles
Tipo de bacteria Escherichia coli ATCC 25922
Salmonella enteritidis ATCC 13076
Tipo de
extracto/
fracción
Grupo I
Grupo II
Grupo III
Grupo IV
Grupo V
Grupo VI
Grupo VII
Extracto puro
Ácido acético (0,05%)
Acetona
Polisorbato 80-Agua
Elaborado por: Latacunga J.
3.5. MATRIZ DE OPERACIONALIZACIÓN DE VARIABLES
Variable independiente: extracto acetónico de las flores de Hibiscus sabdariffa
Tabla N° 12 Operacionalización de la variable independiente
Conceptualización Dimensión Indicador
Extracto acetónico de
Hibiscus sabdariffa: mezcla
compleja de compuestos,
obtenida por procesos
fisicoquímicos a partir de la
flor de Jamaica la cual puede
presentar o no actividad.
Extracto acetónico
puro.
% de rendimiento.
Cuantificación de fenoles (mg ácido
gálico/g extracto).
Cuantificación de flavonoides (mg
quercetina/g extracto).
Fraccionamiento
cromatográfico.
Número de fracciones obtenidas.
% de rendimiento de cada fracción.
Fracción activa. Cuantificación de fenoles (mg ácido
gálico/g fracción activa).
Cuantificación de flavonoides (mg
quercetina/g fracción activa).
Elaborado por: Latacunga J.
41
Variable Dependiente: actividad antibacteriana
Tabla N° 13 Operacionalización de la variable dependiente
Conceptualización Dimensión Indicador
Actividad antibacteriana:
capacidad del extracto
acetónico para inhibir el
crecimiento de
microorganismos,
disminuyendo o eliminando la
carga bacteriana en hortalizas.
Inhibición de
crecimiento.
Diámetro halos de inhibición (mm).
Determinación de fracción activa.
Concentración mínima inhibitoria
(mg/ml).
Disminución del
número de
microrganismos
presentes en las
hortalizas.
Recuento de Escherichia coli antes y
después del tratamiento (UFC/g).
Recuento de Coliformes totales antes y
después del tratamiento (UFC/g).
Presencia o ausencia de Salmonella spp
antes y después del tratamiento.
(Ausencia/presencia).
Elaborado por: Latacunga J.
3.6. TÉCNICA DE PROCESAMIENTO DE DATOS
Para la técnica de procesamiento de datos se utilizó un análisis de varianza
ANOVA para comparar las medias de la variable respuesta en los diferentes niveles de los
factores.
Tabla N° 14 ANOVA de dos Factores
FUENTE DE
VARIACIÓN
SUMA DE
CUADRADOS
GL CUADRADO
MEDIO
RAZÓN
F
VALOR
P
Efecto A SCA a-1 CMA 𝐶𝑀𝐴
𝐶𝑀𝐸
𝑃(𝐹
> 𝐹0𝐴)
Efecto B SCB b-1 CMB 𝐶𝑀𝐵
𝐶𝑀𝐸
𝑃(𝐹
> 𝐹0𝐵)
Efecto AB SCAB (a-1) (b-1) CMAB 𝐶𝑀𝐴𝐵
𝐶𝑀𝐸
𝑃(𝐹
> 𝐹0𝐴𝐵)
Error SCE ab(n-1) CME
Total SCT abn-1
(Gutiérrez Pulido & De la Vara Salazar, 2008)
42
Luego de realizar el análisis de varianza y determinar que existe diferencia
significativa entre los tratamientos, se rechazó la hipótesis nula propuesta para el diseño
experimental, y se procedió a comparar las medias de los tratamientos utilizando la prueba
de comparaciones múltiples de Tukey para identificar cuáles medias son diferentes entre sí,
con un nivel de significancia del 0,05.
Por medio de la Ecuación 1 la cual es planteada por (Gutiérrez Pulido & De la
Vara Salazar, 2008), se pudo comparar las diferencias entre medias muestrales con el valor
crítico dado por:
𝑻𝜶 = 𝒒𝜶(𝒌, 𝑵 − 𝑲)√𝑪𝑴𝑬/𝒏𝒊 Ec.1
Donde:
CME = cuadrado medio del error
n = número de observaciones por tratamiento
k = número de tratamientos,
N – k = grados de libertad
α = nivel de significancia prefijado y el estadístico
qα(k, N – k) = puntos porcentuales de la distribución del rango estudentizado
Para realizar el análisis estadístico de la base de datos, se emplearon los
programas SPSS, ver. 22 y MINITAB, ver 16.
43
CAPÍTULO IV
ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
4.1 Control de calidad de Hibiscus sabdariffa flor de Jamaica
4.1.1. Descripción macroscópica.
Para la descripción macroscópica de la flor de Jamaica se realizó de forma
visual y manual, siendo comparado el resultado con las especificaciones de la Farmacopea
Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos (FEUM, MGA-FH 0040 Examen visual e
inspección microscópica., 2013, pág. 23), de acuerdo como se presenta en la tabla N° 15.
Tabla N° 15 Resultados de la descripción macroscópica de Hibiscus sabdariffa
Especificación de la planta
de Hibiscus sabdariffa
Flor Hibiscus sabdariffa Resultado
Cáliz color roja-rosa Cáliz color roja-rosa Cumple
Cáliz con 5 sépalos en forma
de lengüeta
Cáliz con 5 sépalos en forma
de lengüeta
Cumple
Sépalos carnosos Sépalos carnosos Cumple
Sépalos miden hasta 5 cm Sépalos miden 4,5 cm Cumple
Sépalos libres o asociados en
grupo de 2 a 3
Sépalos asociados en grupo
de 3
Cumple
Calículo pequeño en forma
de láminas color oscuro
Calículo pequeño en forma
de láminas color oscuro
Cumple
Inodoro Inodoro Cumple
Sabor ácido Sabor ácido Cumple
Elaborado por: Latacunga J.
4.1.2. Cromatografía en capa fina: Ensayo de Identidad.
Para el ensayo de identidad se realizó por cromatografía en capa fina, utilizando
como fase estacionaria placas de sílica gel y como fase móvil una mezcla de ácido fórmico:
agua: butanol (10:12:40), los resultados obtenidos se compararon con las especificaciones
de la Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos (FEUM, MGA-FH 0050
Cromatografía en capa delgada, 2013, págs. 28,29), de acuerdo como se presenta en la tabla
N° 16.
44
Tabla N° 16 Resultado del ensayo de Identidad de Hibiscus sabdariffa
Especificación de la planta de
Hibiscus sabdariffa
Flor Hibiscus sabdariffa Resultado
Obtención de dos manchas.
Se debe observar una mancha azul
violeta por debajo del azul sulfán de
referencia, y una mancha violeta intensa
por debajo de rojo de quinaldina.
Se observa dos manchas, una
mancha azul violeta por debajo del
azul sulfán de referencia, y una
mancha violeta intensa por debajo
de rojo de quinaldina.
Cumple
Azul violeta
Rf = 0,47
Violeta
Rf = 0,53
Elaborado por: Latacunga J.
Figura N° 4 Cromatografía en capa fina de Hibiscus sabdariffa
Figura N° 5 Revelación UV a 365 nm de Hibiscus sabdarifa
Figura N° 6 Revelación UV a 254 nm de Hibiscus sabdarifa
45
4.1.3. Materia extraña.
Para la determinación de materia extraña se lo realizó de forma visual, los
obtenidos se compararon con las especificaciones de la Farmacopea Herbolaria de los
Estados Unidos Mexicanos (FEUM, MGA-FH 0030 Materia extraña, 2013, pág. 22), de
acuerdo como se presenta en la tabla N° 17.
Tabla N° 17 Resultados de materia extraña de Hibiscus sabdariffa
Especificación de la planta de
Hibiscus sabdariffa
Flor Hibiscus sabdariffa Resultado
Libre de contaminación por
hongos, insectos y otros
animales
Libre de contaminación por
hongos, insectos y otros
animales
Cumple
No presenta olores anormales No presenta olores anormales Cumple
No se detecta decoloración o
señales de deterioro
No se detecta decoloración o
señales de deterioro
Cumple
Elaborado por: Latacunga J.
4.1.4. Pérdida por secado.
Para la determinación de pérdida por secado de la especie vegetal Hibiscus
sabdariffa se utilizó la Ecuación 2 y 3, obteniendo un valor de 9,64% el cual se comparó
con las especificaciones de la Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos
(FEUM, MGA-FH 0080 Pérdida por secado, 2013, pág. 33), cumpliendo el porcentaje de
aceptación establecido el cual dice que no sea más del 11%.
𝑷𝑺 = 𝑷𝒊 − 𝑷𝒇 Ec.2
Dónde:
𝑃𝑆 = 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑝𝑒𝑟𝑑𝑖𝑑𝑜 𝑑𝑢𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒 𝑒𝑙 𝑠𝑒𝑐𝑎𝑑𝑜
𝑃𝑖 = 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑒𝑛 𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠
𝑃𝑓 = 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑒𝑛 𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠
%𝑷𝑺 = (𝑷𝑺
𝑷𝒊) × 𝟏𝟎𝟎 Ec.3
46
Tabla N° 18 Datos de pérdida por secado de Hibiscus sabdariffa
Muestra 𝑷𝒊 (g) 𝑷𝒇(g) 𝑷𝑺 (g) %𝑷𝑺 %Promedio
M1 0,9999 0,9035 0,0964 9,6410 9,69
0,9999 0,9026 0,0973 9,7310
M2 1,0056 0,9102 0,0954 9,4869 9,58
1,0063 0,9089 0,0974 9,6790
Elaborado por: Latacunga J.
Tabla N° 19 Resultado de la pérdida por secado de Hibiscus sabdariffa
Especificación de la planta de
Hibiscus sabdariffa
Flor Hibiscus sabdariffa Resultado
No más del 11 % 9,64 % Cumple
Elaborado por: Latacunga J.
4.1.5. Cenizas totales.
Para la determinación de cenizas totales se utilizó la Ecuación 4 , obteniendo
un valor de 3,99% el cual se comparó con las especificaciones de la Farmacopea Herbolaria
de los Estados Unidos Mexicanos (FHEUM, 2013, pág. 31), cumpliendo el porcentaje de
aceptación establecido el cual dice que no sea más del 10%.
% 𝒄𝒆𝒏𝒊𝒛𝒂𝒔 𝒕𝒐𝒕𝒂𝒍𝒆𝒔 = (𝒎𝟐−𝒎𝟎
𝒎𝟏−𝒎𝟎) × 𝟏𝟎𝟎 Ec.4
Dónde:
𝑚0 = 𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑒𝑛 𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑟𝑖𝑠𝑜𝑙 𝑣𝑎𝑐í𝑜
𝑚1 = 𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑒𝑛 𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑟𝑖𝑠𝑜𝑙 𝑐𝑜𝑛 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
𝑚2 = 𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑒𝑛 𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑟𝑖𝑠𝑜𝑙 𝑐𝑜𝑛 𝑙𝑎𝑠 𝑐𝑒𝑛𝑖𝑧𝑎𝑠
Tabla N° 20 Datos de cenizas totales de Hibiscus sabdariffa
Muestra 𝒎𝟎 (g) 𝒎𝟏 (g) 𝒎𝟐(g) % Cenizas
Totales
%Promedio
M1 18,2258 20,2501 18,3049 3,9075 3,99
15,1903 17,1933 15,2720 4,0789
Elaborado por: Latacunga J.
47
Tabla N° 21 Resultado de cenizas totales de Hibiscus sabdariffa
Especificación de la planta de
Hibiscus sabdariffa
Flor Hibiscus sabdariffa Resultado
No más del 10 % 3,99 % Cumple
Elaborado por: Latacunga J.
4.1.6. Intensidad de coloración.
Para la determinación de la intensidad de coloración se leyó la absorbancia de la
muestra a una longitud de onda de 520 nm, obteniendo un valor de 1,298 el cual se
comparó con las especificaciones de la Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos
Mexicanos (FEUM, Intensidad de coloración, 2013), cumpliendo la especificación
establecida, el cual dice que no sea menos a 0,350.
Tabla N° 22 Resultado de la intensidad de coloración de Hibiscus sabdariffa
Muestra Absorbancia
(nm)
Promedio
(nm)
M1 1,300 1,298
M2 1,296
Elaborado por: Latacunga J.
Tabla N° 23 Resultado de la intensidad de coloración de Hibiscus sabdariffa
Especificación de la planta de
Hibiscus sabdariffa
Flor Hibiscus sabdariffa Resultado
No menos a 0,350 abs 1,298 abs Cumple
Elaborado por: Latacunga J.
4.1.7. Valoración.
Para la valoración de ácido cítrico se valoró con NaOH 0,1 N hasta un pH 7.0,
que corresponde al punto final de la titulación potenciométrica, teniendo en consideración
la siguiente equivalencia: 1,0 ml de NaOH 0,1 N, corresponde a 6,4 mg de ácido cítrico,
obteniendo un valor de 14,62% el cual se comparó con las especificaciones de la
Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos (FEUM, Valoración, Jamaica
48
Flor, 2013), cumpliendo la especificación establecida, el cual dice que no sea menos del
13,5%.
Figura N° 7 Primera derivada de la valoración de Hibiscus sabdariffa
Elaborado por: Latacunga J.
Figura N° 8 Segunda derivada de la valoración de Hibiscus sabdariffa
Elaborado por: Latacunga J.
0
0,5
1
1,5
2
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
dp
H/d
v
Volumen Naoh (ml)
Primera derivada M1
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
dp
H/d
v
Volumen NaOH (ml)
Primera derivada M2
49
Tabla N° 24 Datos de valoración de Hibiscus sabdariffa
Muestra Peso droga
(mg)
Material
extraíble (mg)
Volumen de
equivalencia (ml)
M1 1005 728 16
M2 1000 717 17
Elaborado por: Latacunga J.
1 ml de NaOH --------------- 6,4 mg de ácido cítrico
16 ml-------------------------------X
X1=102,4 mg de ácido crítico
X2=108,8 mg de ácido crítico
728 mg ----------------------------------100 %
102,4 mg---------------------------------x
X1=14,07 %
X2=15,17 %
�̅� =14,07 + 15,17
2
�̅� = 𝟏𝟒, 𝟔𝟐 %
Tabla N° 25 Resultado de la valoración de Hibiscus sabdariffa
Especificación de la planta de
Hibiscus sabdariffa
Flor Hibiscus sabdariffa Resultado
No menos del 13,5% 14,62 % Cumple
Elaborado por: Latacunga J.
4.1.8. Proceso de extracción de Hibiscus sabdariffa.
Para la determinación del porcentaje de rendimiento se utilizó la Ecuación 5,
obteniendo un valor del 32,59%.
%𝑹 =𝑷𝒆𝒔𝒐 𝒇𝒊𝒏𝒂𝒍 𝒅𝒆𝒍 𝒆𝒙𝒕𝒓𝒂𝒄𝒕𝒐 𝒐𝒃𝒕𝒆𝒏𝒊𝒅𝒐
𝑷𝒆𝒔𝒐 𝒊𝒏𝒊𝒄𝒊𝒂𝒍 𝒅𝒆 𝒍𝒂 𝒎𝒖𝒆𝒔𝒕𝒓𝒂 × 𝟏𝟎𝟎 Ec.5
50
Tabla N° 26 Resultado de rendimiento de Hibiscus sabdariffa
Extracto Peso planta (g) Peso extracto (g) Rendimiento (%)
Acetónico 100 32,59 32,59
Elaborado por: Latacunga J.
4.1.9. Fraccionamiento Primario del extracto acetónico de la flor de Hibiscus
sabdariffa.
Tabla N° 27 Fracciones obtenidas del extracto acetónico Hibiscus sabdariffa, según
la fase móvil utilizada en cromatografía en columna
Fase móvil Proporción Fracciones
Cloroformo 100 1-6
Cloroformo: Acetona 90:10 7-12
Cloroformo: Acetona 80:20 13-19
Cloroformo: Acetona 70:30 20-36
Cloroformo: Acetona 60:40 37-42
Cloroformo: Acetona 50:50 43-49
Cloroformo: Acetona 40:60 50-55
Cloroformo: Acetona 30:70 56-66
Cloroformo: Acetona 20:80 67-77
Acetona 100 78-108
Acetona: Metanol 95:5 109-115
Acetona: Metanol 80:20 116-126
Acetona: Metanol 50:50 127-133
Metanol 100 134-147
Elaborado por: Latacunga J.
51
Tabla N° 28 Primer agrupamiento de las fracciones obtenidas del extracto acetónico
Hibiscus sabdariffa según bandas de similitud en TLC
Fracción Número Promedio de Rf
A 1-6 Rf 1=0,64
B 7-11 Rf 1=0,19
Rf 2=0,33
Rf 3=0,43
Rf 4=0,71
C 11-17 Rf 1=0,15
Rf 2=0,24
Rf 3=0,34
D 18-24 Rf 1=0,22
Rf 2=0,32
E 25-29 Rf 1=0,68
Rf 2=0,78
F 30-38 Rf 1=0,12
Rf 2=0,32
Rf 3=0,66
Rf 4=0,83
G 39-53 Rf 1=0,25
Rf 2=0,38
Rf 3=0,66
Rf 4=0,53
H 54-60 Rf 1=0,30
Rf 2=0,40
I 61-69 Rf 1=0,30
Rf 2=0,66
J 70-72 Rf 1=0,41
K 73-79 Rf 1=0,35
Rf 2=0,56
L 80-117 Rf 1=0,37
Rf 2=0,56
Rf 3=0,80
M 118-120 Rf 1=0,63
Rf 2=0,72
N 121-128 Rf 1=0,76
Rf 2=0,83
O 129-147 Rf 1=0,49
Rf 2=0,66
Elaborado por: Latacunga J.
En el segundo agrupamiento de las fracciones obtenidas se pudo observar que el
porcentaje de rendimiento de extracción realizado por el método de maceración de las
52
flores de Jamiaca especie vegetal Hibiscus sabdariffa, tuvo mayor porcentaje de
rendimiento para la fracción III con el 5,7 %.
Tabla N° 29 Segundo agrupamiento de las fracciones obtenidas a partir del extracto
acetónico Hibiscus sabdariffa según bandas de similitud en TLC
Fracciones Número de
fracción
Peso, mg Rendimiento,
%
Rf
I 1-6 97,8 0,0978 Rf 1=0,48
II 7-38 1042,0 1,0420 Rf 1=0,34
Rf 2=0,54
III 39-53 5746,4 5,7464 Rf 1=0,18
Rf 2=0,28
IV 54-69 1660,1 1,6601 Rf 1=0,40
Rf 2=0,75
V 70-79 248,3 0,2483 Rf 1=0,33
VI 80-117 1261,9 1,2619 Rf 1=0,25
Rf 1=0,75
VII 118-147 4950,0 4,95 Rf 1=0,48
Se obtuvieron 147 fracciones en total agrupadas en siete colecciones
Elaborado por: Latacunga J.
4.1.10. Evaluación de la actividad antibacteriana por el método de disco
difusión de las colecciones del extracto acetónico de Hibiscus sabdariffa.
Relacionando la tabla 30 y 31 que se presenta a continuación, se puede
observar, que la fracción III tiene mayor halo de inhibición frente a Escherichia coli ATCC
25922 y para Salmonella enteritidis ATCC 13076 con 11,7 y 14,7 mm de diámetro,
respectivamente. De igual manera, se pudo evidenciar que la acetona y la mezcla de
polisorbato 80-agua, utilizados como blanco y control negativo, respectivamente, no
aportan en la evaluación antibacteriana. Finalmente, se evidenció que el ácido acético al
0,05% utilizado como control positivo inhibe el crecimiento (14 mm) de los dos
microorganismos de prueba.
53
Tabla N° 30 Medida de los halos de inhibición formados por los extractos frente a
Escherichia coli ATCC 25922
Fracciones Medida de halo de inhibición +
disco (mm)
Promedio de
sensibilidad (mm)
Primera Segunda Tercera
I 6 6 6 6,0
II 6 6 6 6,0
III 13 11 11 11,7
IV 6 6 6 6,0
V 6 6 6 6,0
VI 6 6 6 6,0
VII 6 6 6 6,0
Extracto puro 8 7 7 7,3
Acetona (99,9%) 6 6 6 6,0
Ácido acético (0,05%) 12 13 13 12,7
Polisorbato 80-Agua 6 6 6 6,0
Nota: el diámetro de los discos para antibiograma es de 6 mm
Elaborado por: Latacunga J.
Tabla N° 31 Medida de los halos de inhibición formados por los extractos frente a
Salmonella enteritidis ATCC13076
Fracciones Medida de halo de inhibición +
disco (mm)
Promedio de
sensibilidad (mm)
Primera Segunda Tercera
I 7 8 6 7,0
II 6 6 6 6,0
III 15 14 15 14,7
IV 12 10 10 10,7
V 6 6 6 6,0
VI 6 6 6 6,0
VII 6 6 6 6,0
Acetona (99,9%) 10 10 9 9,7
Ácido acético (0,05%) 6 6 6 6,0
Ácido acético 14 15 13 14,0
Polisorbato 80: Agua 6 6 6 6,0
Nota: el diámetro de los discos para antibiograma es de 6 mm
Elaborado por: Latacunga J.
54
4.1.11. Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI).
En la tabla N° 32 que se detalla a continuación, se observa que para
Escherichia coli ATCC 25922 la CMI para la fracción III fue de 5 mg/ml, mientras que
para Salmonella enteritidis ATCC 13076 fue de 2,5 mg/ml.
Tabla N° 32 Resultado de la CMI del tratamiento del Grupo III en Escherichia coli
ATCC 25922 y Salmonella enteritidis ATCC 13076
Microorganismo
Concentraciones de la fracción III mg/ml
20 10 5 2,5 1,25 0,625 0,313
Escherichia coli
ATCC 25922
S S S R R R R
Salmonella enteritidis
ATCC 13076
S S S S R R R
S: Sensible; R: Resistente
Elaborado por: Latacunga J.
4.1.12. Cuantificación de fenoles y flavonoides.
4.1.12.1. Determinación de Fenoles totales de la flor de Hibiscus
sabdariffa.
Para la determinación de fenoles totales se realizó una curva de calibración a
partir del estándar ácido gálico, obteniendo la siguiente ecuación: y = 1,2929x + 0,0362.
Tabla N° 33 Datos de concentración y absorbancia del estándar ácido gálico
Absorbancia
765 nm
Ácido gálico
concentración (mg/ml)
Standard 1 0,186 0,1
Standard 2 0,296 0,2
Standard 3 0,716 0,5
Standard 4 1,238 1,00
Standard 5 2,658 2,00
Elaborado por: Latacunga J.
55
Figura N° 9 Curva del estándar de ácido gálico
Elaborado por: Latacunga J.
En la tabla N° 34 que se detalla a continuación, se muestra que mayor
porcentaje de concentración de fenoles expresado en mg ác. gálico /g extracto, tiene el
extracto acetónico total respecto al extracto obtenido de la fracción del grupo III.
Tabla N° 34 Concentración de ácido gálico presente en las fracciones acetónicas
Masa Absorbancia
765 nm
Concentración
(mg ác. Gálico/ml)
Concentración
(mg ác. Gálico /g
extracto)
EA
0,501 1,57 1,18 118,00
F III
1,012 0,69 0,51 50,27
EA: Extracto acetónico total; F III: fracción III obtenido a partir del fraccionamiento
primario
Elaborado por: Latacunga J.
4.1.12.2. Determinación de Flavonoides totales de Hibiscus sabdariffa.
Para la determinación de flavonoides se realizó una curva de calibración a partir
del estándar quercetina, obteniendo la siguiente ecuación: y = 0,6194x + 0,0178.
y = 1,2929x + 0,0362R² = 0,9972
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Ab
sorb
anci
a
Concentración (mg/ml)
Curva estándar de ácido gálico
56
Tabla N° 35 Datos de concentración y absorbancia del estándar quercetina
Absorbancia
510 nm
Quercetina
concentración (mg/ml)
Standard 1 0,021 0,0625
Standard 2 0,062 0,125
Standard 3 0,150 0,25
Standard 4 0,274 0,5
Standard 5 0,601 1
Stándard 6 1,224 2
Elaborado por: Latacunga J.
Figura N° 10 Curva del estándar de quercetina
Elaborado por: Latacunga J.
En la tabla N° 36 que se detalla a continuación, se muestra el mayor porcentaje
de concentración de flavonoides expresado en mg quercetina /g extracto, con respecto al
extracto acetónico total y el extracto obtenido del grupo tres de las fracciones.
Tabla N° 36 Concentración de quercetina presente en las fracciones acetónicas
Masa Absorbancia
765 nm
Concentración
(mg quercetina/ml)
Concentración
(mg quercetina /g extracto)
EA 0,5091 0,228 0,3394 33,33
F III 1,009 0,129 0,1795 17,79
EA: Extracto acetónico total; F III: Fracción III obtenido a partir del fraccionamiento
primario
Elaborado por: Latacunga J.
y = 0,6194x - 0,0178R² = 0,9995
0
0,5
1
1,5
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Ab
sorb
anci
a
Concentración (mg/ml)
Curva estándar Quercetina
57
4.1.13. Recuento de Coliformes/Escherichia coli en hortalizas en placas
petrifilm 3M.
4.1.13.1. Recuento de Coliformes.
En la tabla N° 37 que se detalla a continuación expresa el recuento de
Coliformes en ufc/g antes y después de aplicar el tratamiento de la fracción III en las
hortalizas de estudio (lechuga, tomate riñón y culantro). El detalle de todos los valores
obtenidos del Recuento de coliformes de cada una de las hortalizas se puede visualizar en el
Anexo 3.
Tabla N° 37 Resultados del Recuento de Coliformes antes y después de aplicar el
tratamiento de la fracción III en hortalizas de estudio (Lechuga, Tomate riñón y Culantro)
Determinación de ufc/g : Método petrifilm
Muestra: Lechuga
Antes Después
P ufc/g P ufc/g
166 17x101
Muestra: Tomate riñón
Antes Después
P ufc/g P ufc/g
18 2x101
Muestra: Culantro
Antes Después
P ufc/g P ufc/g
564 56x101 88 9x101
P: Promedio de las colonias contadas; ufc: Unidades Formadoras de Colonias.
Elaborado por: Latacunga J
4.1.13.2. Recuento de Escherichia coli.
En la tabla N° 38 que se detalla a continuación expresa el Recuento de
Escherichia coli en ufc/g antes y después de aplicar el tratamiento de la fracción III en las
hortalizas de estudio (lechuga, tomate riñón y culantro). El detalle de todos los valores
obtenidos en el Recuento de Escherichia coli se puede visualizar en el Anexo 4.
58
Tabla N° 38 Resultados del Recuento de Escherichia coli antes y después de aplicar
el tratamiento de la fracción III en hortalizas de estudio (Lechuga, Tomate riñón y
Culantro)
Determinación de ufc/g : Método petrifilm
Muestra: Lechuga
Antes Después
P ufc/g P ufc/g
Muestra: Tomate riñón
Antes Después
P ufc/g P ufc/g
Muestra: Culantro
Antes Después
P ufc/g P ufc/g
28 3x101 12 1x101
P: Promedio de las colonias contadas; ufc: Unidades Formadoras de Colonias.
Elaborado por: Latacunga J
4.1.14. Presencia/ausencia Salmonella spp en hortalizas.
En la tabla N° 39 que se detalla a continuación, se evidencia la presencia/
ausencia de Salmonella spp. en el Caldo Rappaport Vassiliadis antes y después de aplicar el
tratamiento de la fracción III en las hortalizas tanto en el agar Entérico Hektoen y agar
XLD. El detalle de todos los datos obtenidos de la determinación de presencia/ausencia de
Salmonella spp. de cada una de las hortalizas se puede visualizar en el Anexo 8.
Tabla N° 39 Presencia/Ausencia de Salmonella spp. en medio de enriquecimiento:
Caldo Rappaport Vassiliadis
MEDIO DE ENREQUECIMIENTO: CALDO RAPPAPORT VASSILIADIS
Agar Entérico de Hektoen Agar XLD
Hortaliza Antes Después Antes Después
Lechuga Presencia Ausencia Presencia Ausencia
Tomate riñón Presencia Ausencia Presencia Ausencia
Culantro Presencia Ausencia Presencia Presencia
Elaborado por: Latacunga J
59
En la tabla N° 40 que se detalla a continuación, se evidencia la presencia/
ausencia de Salmonella spp. en el Caldo Selenito Cistina antes y después de aplicar el
tratamiento de la fracción III en las hortalizas tanto en el agar Entérico Hektoen y agar
XLD. El detalle de todos los datos obtenidos se puede visualizar en el Anexo 9.
Tabla N° 40 Presencia/Ausencia de Salmonella spp. en medio de enriquecimiento:
Caldo Selenito Cistina
MEDIO DE ENREQUECIMIENTO: CALDO SELENITO CISTINA
Agar Entérico de Hektoen Agar XLD
Hortaliza Antes Después Antes Después
Lechuga Presencia Ausencia Ausencia Ausencia
Tomate riñón Presencia Ausencia Ausencia Ausencia
Culantro Ausencia Ausencia Presencia Ausencia
Elaborado por: Latacunga J
4.2. DISEÑO EXPERIMENTAL
4.2.1. Análisis descriptivo de las variables.
Se detalla un resumen estadístico de los valores obtenidos de los halos de
inhibición adquiridos de cada fracción/extracto frente a Salmonella enteritidis ATCC 13076
y Escherichia coli ATCC 25922.
Tabla N° 41 Análisis descriptivo de las variables
MEDIDA DEL HALO DE INHIBICIÓN PRODUCIDO (mm)
Fracciones
Tipo de bacteria
Salmonella enteritidis
ATCC13076
Escherichia coli
ATCC25922
Media Desviación
estándar
N Media Desviación
estándar
N
I 7,00 1,000 3 6,00 0,000 3
II 6,00 0,000 3 6,00 0,000 3
III 14,67 0,577 3 11,67 1,155 3
IV 10,7 1,155 3 6,00 0,000 3
V 6,00 0,000 3 6,00 0,000 3
VI 6,00 0,000 3 6,00 0,000 3
VII 6,00 0,000 3 6,00 0,000 3
Extracto puro 9,67 0,577 3 7,33 0,577 3
Ácido acético 14,00 1,000 3 12,67 0,577 3
Acetona 6,00 0,000 3 6,00 0,000 3
Polisorbato 80- Agua 6,00 0,000 3 6,00 0,000 3
Elaborado por: Latacunga J
60
Figura N° 11 Interpretación de los valores de la media para los halos de inhibición
Elaborado por: Latacunga J
4.2.3. Análisis estadístico.
Se comparó las medias de las medidas de los halos de los 11 grupos de datos,
para determinar si existen diferencias entre ellas. Lo cual se realizó mediante una prueba
ANOVA.
1. Hipótesis nula: Todos los grupos (tratamientos) y tipos de bacterias
generan halos de igual tamaño.
2. Hipótesis alternativa: Al menos uno de los grupos (tratamientos) o
tipos de bacterias da una medida del halo diferente al resto.
Mediante el programa SPSS, se encontró:
VIIV
IVIVIIIIII
4 P
olisorb
ato
3 A
ceto
na
2 Á
cido
acé
tico
1 E
xtr
acto
puro
15,0
12,5
10,0
7,5
5,0
Grupo
Me
dia
Esch. coli
Salm. enteritidis
Bacteria
Gráfica de interacción para HaloMedias de datos
Med
ia
Extracto/Fracciones
61
Tabla N° 42 Análisis estadístico
PRUEBAS DE EFECTOS INTER-SUJETOS
Origen Suma de cuadrados Gl Cuadrático promedio F Sig.
Bacteria 20,74 1 20,74 76,06 0.00
Grupo 487,94 10 48,79 178,91 0.00
Bacteria * Grupo 37,76 10 3,78 13,84 0.00
Error 12,00 44 0,27
Total corregido 558,44 65
Elaborado por: Latacunga J
Decisión e interpretación:
Para la bacteria: Puesto que Sig. = 0, 00 < 0,05, se acepta la hipótesis alternativa. Es
decir que los halos generados en los agares de Müller-Hinton frente a Salmonella
enteritidis ATCC 13076 son diferentes a los halos generados por Escherichia coli
ATCC 25922.
Para los Grupos: Puesto que Sig. = 0, 00 < 0,05, aceptamos la hipótesis alternativa.
Es decir que hay tratamientos cuya medida es estadísticamente diferente del resto de
tratamientos.
Para Bacteria*Grupo: Puesto que Sig. = 0, 00 < 0,05, aceptamos la hipótesis
alternativa. Es decir que al realizar el análisis del diámetro de los halos de
inhibición, existe interacción entre el tipo de bacteria y el tratamiento aplicado.
Para determinar cómo se producen las diferencias en las medidas de los halos
de inhibición, se empleó una prueba de Tukey, encontrando tres grupos de tratamientos.
Tabla N° 43 Subconjuntos homogeneos según la media de halo de inhibición
SUBCONJUNTOS HOMOGÉNEOS
Fracción/Extracto N Subconjunto 1 Subconjunto 2 Subconjunto 3
Media (mm) Media (mm) Media (mm)
II 6 6,00
V 6 6,00
VI 6 6,00
VII 6 6,00
Acetona 6 6,00
Polisorbato 80-Agua 6 6,00
I 6 6,50
IV 6 8,33
Extracto puro 6 8,50
III 6 13,17
Ácido acético 6 13,33
Nota: el diámetro de los discos para antibiograma es de 6 mm
Elaborado por: Latacunga J
62
Para visualizar cómo se distribuyen las medias de los diferentes tratamientos,
emplearemos una prueba de análisis de la media.
Figura N° 12 Interpretación de los valores de la media de cada uno de los conjuntos
de mediciones
Elaborado por: Latacunga J
Interpretación general.
De las pruebas estadísticas, podemos deducir que:
Los dos tipos de bacterias producen halos de inhibición cuya medida son
estadísticamente diferente.
Los halos de inhibición que produjeron los 11 tratamientos se pueden agrupar
en tres grupos:
Aquellos cuyo halo de inhibición fueron indetectables, que corresponde a los
tratamientos II, V, VI, VII, Acetona y Polisorbato.
Aquellos cuyo halo de inhibición es de alrededor de 8,2 mm, que corresponde a los
tratamiento IV y Extracto puro.
Aquellos cuyo halo de inhibición es de más de 13mm, que corresponde a los
tratamientos III y Ácido acético.
De entre todos los tratamientos que el que mejor tiene actividad antibacteriana
es el extracto del grupo III.
VIIV
IVIVIIIIII
Pol
isor
bato
Ace
tona
Áci
do a
cético
Extr
act
o puro
15,0
12,5
10,0
7,5
5,0
Grupo
Med
ia
7,80
6,51
9,10
Alfa = 0,05
Análisis de la Media de Halo
Med
ia
Extracto/Fraccione
s
63
CAPÍTULO V
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1. CONCLUSIONES
La evaluación antibacteriana de las fracciones del extracto acetónico de Hibiscus
sabdariffa se realizó frente a Escherichia coli ATCC 25922 y Salmonella enteritidis
ATCC 13076, obteniendo mayor actividad antibacteriana en la fracción III, la cual
fue evaluada en hortalizas (lechuga, tomate riñón y culantro) realizando el
aislamiento e identificación de Salmonella spp y el recuento de Escherichia coli y
coliformes mediante la técnica de Petrifilm.
La identificación del espécimen vegetal fue realizada en el Herbario Alfredo
Paredes y correspondió a la especie Hibiscus sabdariffa L., de la familia Malvaceae.
El control de calidad que se realizó en la especie vegetal Hibiscus sabdariffa
cumplió con todas las especificaciones establecidas por la Farmacopea Herbolaria
de los Estados Unidos Mexicanos.
Se preparó el extracto acetónico de las flores de Jamaica, mediante la técnica de
maceración, obteniéndose un rendimiento del 32,6 %.
El fraccionamiento primario del extracto acetónico, mediante cromatografía en
columna, permitió obtener 147 eluatos, las cuales fueron agrupadas en siete
fracciones (I–VII) luego del análisis de cada una de las fracciones en cromatografía
en capa fina.
Al evaluar la actividad antibacteriana del extracto acetónico y de las fracciones (I-
VII), mediante el método de difusión en discos, se obtuvo mayor halo de inhibición
para la fracción III con un valor de 11,7 mm frente a Escherichia coli ATCC 25922
y de 14,7 mm frente Salmonella enteritidis ATCC 13076. Es importante mencionar
que el halo de inhibición para el control positivo (ácido acético al 0,05%) fueron de
12,7 mm y 14,0 mm, respectivamente para ambos microorganismos.
La Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de la fracción III mediante el método
de microdilución en placa frente a cepas bacterianas Escherichia coli ATCC 25922
y Salmonella enteritidis ATCC 13076, fueron 5 y 2,5 mg/ml, respectivamente.
La concentración de fenoles del extracto acetónico y de la fracción III, utilizando
como marcador al ácido gálico, fue 118,001 y 50,27 mg ác. gálico/g extracto,
64
respectivamente. Por otro lado, la concentración de flavonoides, utilizando como
marcador la quercetina, fue de 33,33 y 17,79 mg ác. gálico/g extracto,
respectivamente.
Al realizar el recuento de Coliformes y Escherichia coli después de aplicar el
tratamiento de la fracción III en las hortalizas de estudio, se evidenció una
reducción de unidades formadoras de colonias tanto en la lechuga, tomate riñón y
culantro.
Al determinar la presencia o ausencia de Salmonella spp después de aplicar el
tratamiento de la fracción III en las hortalizas de estudio, se evidenció la ausencia
de Salmonella spp. en lechuga y tomate riñón, mientras que para el culantro se
evidenció presencia de Salmonella spp.
5.2. RECOMENDACIONES
Realizar un estudio químico del extracto total de esta especie vegetal, la misma que
es cultivada en Ecuador, con el propósito de aislar los metabolitos secundarios y así
evaluar sus actividades biológicas.
Se recomienda realizar estudios de estabilidad a las soluciones acuosas formadas a
partir de la fracción III, para una posible comercialización.
Se recomienda evaluar el efecto antibacteriano en otros tipos de microorganismos
presentes en otras hortalizas, frutas, carnes blancas y rojas.
65
BIBLIOGRAFÍA
Alfaro, B. (19 de marzo de 2017). Noticieros Televisa. Universidad de Hidalgo halla
propiedades desinfectantes en la flor de jamaica. Recuperado el 05 de Enero de
2018, de http://noticieros.televisa.com/ultimas-noticias/estados/2017-03-
19/universidad-hidalgo-halla-propiedades-desinfectantes-flor-jamaica/
American Society For Microbiology. (25 de Septiembre de 2014). Centro Nacional de
Información Biotecnológica. doi:10.1128 / genomeA.00969-14
Calvo Flores, M. R., Canaviri Flores, D., Cruz Callisaya, O., & Campero Paredes, P.
(Agosto de 2006). Revista SCientifica. Recuperado el 28 de Febrero de 2018, de
Enterobacterias en lechga expendidas en Hipermaxi, Ketal y Mercado Popular
Rodríguez de la Ciudad de La Paz:
http://www.revistasbolivianas.org.bo/scielo.php?pid=S1813-
00542008000100004&script=sci_arttext
Caramunt, R., Farrán, M., & López, C. (2013). Química Biorgánica de Productos
Naturales. Madrid, España. Recuperado el 22 de Febrero de 2018
Cárdenas León, I. (2015). Respuesta del cultivo de Jamaica (Hibiscus sabdariffa L.) a la
fertilización foliar complementaria con tres bioestimulantes a tres dosis en la
Parroquia Teniente Hugo Ortíz. Recuperado el 15 de Julio de 2015, de
http://www.dspace.uce.edu.ec/bitstream/25000/4542/1/T-UCE-0004-8.pdf
Cárdenas León, I. M. (2015). RESPUESTA DEL CULTIVO DE JAMAICA (Hibiscus
sabdariffa L.) A LA FERTILIZACIÓN FOLIAR COMPLEMENTARIA CON TRES
BIOESTIMULANTES A TRES DOSIS EN LA PARROQUIA TENIENTE HUGO
ORTIZ. Quito, Ecuador. Recuperado el 08 de Marzo de 2018
Carrillo Quezada, G. (Junio de 2016). Determinación microbiológica y de metales pesados
en lechuga de repollo (Lactuca sativa), expendidos en los diferentes Mercados del
Distrito Metropolitano de Quito. Quito, Pichincha, Ecuador. Recuperado el 05 de
Enero de 2018, de https://dspace.ups.edu.ec/handle/123456789/13230
Catania, C., & Avagnina, S. (2007). Maceración. Recuperado el 05 de Enero de 2018, de
http://catarina.udlap.mx/u_dl_a/tales/documentos/lpro/lopez_a_e/capitulo1.pdf
Chuquitarco Guano, M. M. (2014). Aplicación de aceites esenciales de orégano (Origanum
vulgare) y tomillo (Thymus vulgaris) en cuatro tipos de hortalizas: col de repollo,
col morada, lechuga Iceberg tipo Salinas y espinaca para disminuir la carga
microbiológica patógena. Amabato.
66
Cobo Pimentel, J. C., & Coronel Carrión, A. L. (2016). Estudio y difusión de la (Hibiscus
Sadariffa) Flor de Jamaica y su aplicación en nuevas propuestas culinarias.
Guayaquil.
CODEX. (2003). Código de Prácticas de Higuiene para las frutas y hortalizas frescas.
Comisión Permanente de la farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos. (2013).
Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos. Mexico: Secretaria de
Salud.
CPE INEN-CODEX CAC/GL 21. (2013). Principios para el Establecimiento y Aplicación
de Criterios Microbiológicos a los Alimentos. Recuperado el 28 de Febrero de 2018,
de http://apps.normalizacion.gob.ec/fileserver/2018/cpe_inen_codex_cac_gl_21.pdf
Díaz Pérez, B., & Ramos Delgado, J. (2011). El cultivo de la rosa de Jamica. Recuperado
el 10 de Marzo de 2018, de
http://oa.upm.es/12612/1/INVE_MEM_2011_106653.pdf
Dra. Donato, A. (12 de Mayo de 2007). Enfermedades Alimentarias. Salud y Sociedad.
Recuperado el 28 de Febrero de 2018, de
http://salud.bioetica.org/enfalimentarias.htm
FAO. (2018). Prevención de la Escherichia coli en los alimentos. Recuperado el 17 de
Mayo de 2018, de
http://www.fao.org/fileadmin/user_upload/agns/pdf/Preventing_Ecoli_es.pdf
FEUM. (2013). Intensidad de coloración. En Farmacopea Herbolaria de los Estados
unidos Mexicanos. México. Recuperado el 03 de Febrero de 2018
FEUM. (2013). MGA-FH 0030 Materia extraña. En Farmacopea Herbolaria de los
Estados Unidos Mexicanos (pág. 22). México. Recuperado el 03 de Febrero de 2018
FEUM. (2013). MGA-FH 0040 Examen visual e inspección microscópica. En Farmacopea
Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos (pág. 23). México. Recuperado el 03
de Febrero de 2018
FEUM. (2013). MGA-FH 0050 Cromatografía en capa delgada. En Farmacopea
Herbolaria de los Estados Unidos (págs. 28,29). México. Recuperado el 03 de
Febrero de 2018
FEUM. (2013). MGA-FH 0080 Pérdida por secado. En Farmacopea Herbolaria de los
Estados Unidos Mexicanos (pág. 33). México. Recuperado el 03 de Febrero de 2018
FEUM. (2013). Valoración, Jamaica Flor. En Farmacopea Herbolaria de los Estados
Unidos Mexicanos. México. Recuperado el 03 de febrero de 2018
67
FHEUM. (2013). MGA-FH 0060 Determinación de cenizas. En Farmacopea Herbolaria de
los Estados Unidos Mexicanos (pág. 31). México. Recuperado el 03 de Febrero de
2018
Garcés , M., Cabrera, H., & Paredes, P. (2006). Uso de aguas servidas en agricultura en
Ecuador.
Gordón Núñez, J. A. (2010). Propuesta de mejoramiento de manejo postcosecha en
hortalizas producidas en un sistema campesino asociado. 18.
(2006). Guía de Intepretación 3M. Placas Petrifilm para el Recuento de Escherichia
coli/Coliformes. México.
Harris, D. (2003). Análisis Químico Cuantitatico. California: Editorial Reverté.
Health and Consumer Protection Directirate General. (1999). Health and Consumer
Protection Directorate General- European Commission. Opinion of the scientific
committee on veterinary measures relating to public health on the evaluation of
microbiological criteria for food products of animal origin for humanconsump.
Recuperado el 15 de Diciembre de 2018, de
http://europa.eu.int/comm/food/fs/sc/scv/out26_en.html
Hernándes Sampieri, R. (2014). En J. M. Chacón (Ed.), Metodología de la Investigación
(pág. 4). México.
Hernández Gómez, J. A., & Gómez Aldapa, C. A. (2016). Patente sobre Soluciones a basa
de fitocompuestos para desinfectar hortalizas. Instituto Mexicano en la Propiedad
Industrial, 3.
ICMSF. (2000). Microorganisms in Foods. Microbial Ecology of Food Commodities.
Zaragoza, España: ACRIBIA, S.A.
ICMSF. (2006). Guia simplificada para el entendimiento y uso de Objetivos de Inocuidad
de los Alimentos y Objetivos de Rendimiento.
ICMSF. (2006). International Commission on Microbiological Specifications for Foods.
Guía Simplificada para el Entendimiento y uso de Objetivos de inocuidad de los
alimentos y Objetivos de rendimiento. Recuperado el 20 de Enero de 2018, de
http://www.icmsf.org/pdf/FSO%20Ojectives/GuiaSimplificadosp.pdf
Ing Medina Carrillo, R., Dra. Sumaya Martínez, M. T., M.C. Machuca Sánchez, M. L., Dra.
Sánchez Herrera, L. M., Dr. Balois Morales, R., & Dr. Jiménez Ruiz, E. I. (2013).
Actividad antioxidante de extractos de cálices deshidratados de 64 variedades de
jamaica (hibiscus sabdariffal.) en función de fenólicos y antocianinas totales.
Recuperado el 15 de Julio de 2017, de
http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S2071-00542013000500006
68
ISO 6579-1. (2017). Microbiology of the food chain. Horizontal method for the detection,
enumeration and serotyping of Salmonella. Recuperado el 15 de Mayo de 2018
León Jessica. (2007). "El consumo de Hortalizas crudas (Lechuga “Lactucasativa” y
Tomate “Lycopersicum esculentum”) y su incidencia en la generación de estas en el
Mercado Central de la Ciudad de Ambato”. 3. Ambato, Ecuador. Recuperado el 05
de Enero de 2018, de
http://repositorio.uta.edu.ec/bitstream/123456789/3420/3/PAL133.pdf
Logacho Pilataxi , M. C. (2015). Detección de Salmonella Enteritidis, Typhimurium e
Infantis en materia prima y alimento balanceado en un sistema productivo de pollos
de engorde en la Provincia de Pichincha. Quito, Ecuador. Recuperado el 15 de
Mayo de 2018
López Camelo, A. (2003). Boletín de Servicios Agrícolas de la FAO 151. Recuperado el 17
de Marzo de 2018|, de Manual para la preparación y venta de frutas y hortalizas del
campo al meracdo:
https://books.google.es/books?hl=es&lr=&id=xf1zTXxRGMgC&oi=fnd&pg=PA49
&dq=FAO+El+riesgo+microbiol%C3%B3gico+en+la+producci%C3%B3n+y+distr
ibuci%C3%B3n+de+frutas+y+hortalizas&ots=DtE69yQ-
km&sig=0XbwrqXSsdj_DNkjxEayBTNBIzY#v=onepage&q=FAO%20El%20riesg
o%20mic
Marcano, D., & Hasegawa, M. (2002). Share Facebook Twitter Pinterest. Carácas,
Venezuela. Recuperado el 05 de Marzo de 2018, de
https://books.google.com.ec/books?id=hPkjgPwXD-
QC&pg=PA8&lpg=PA8&dq=Marcano+y+Hasegawa+fitoqu%C3%ADmica+organi
ca+2002&source=bl&ots=N9Mbne3fiC&sig=bBI0gmE7u3a-
IG9LdE64B87weX8&hl=es&sa=X&ved=0ahUKEwiZ1ofZpo3bAhXS0FMKHWu
qAbIQ6AEINjAC#v=onepage&q=Marcano%20y
Monteros Guerrero, A., Sumba Lusero, E., & Salvador Sarauz, S. (2015). Productividad
Agrícola en el Ecuador. 3. Recuperado el 15 de Julio de 2017, de
http://sinagap.agricultura.gob.ec/pdf/estudios_agroeconomicos/indice_productivida
d.pdf
MSc Hidalgo, A. M. (s.f.). Guía de Prácticas de Microbiología de Alimentos. Universidad
Central del Ecuador, Facultad de Ciencias Químicas, Carrera de Alimentos, Quito.
Recuperado el 28 de Febrero de 2018
NTE INEN 1750:1994. (28 de Septiembre de 2012). Muestreo de Hortalizas y Frutas
frescas. Recuperado el 28 de Febrero de 2018, de
http://181.112.149.203/buzon/normas/1750-C.pdf
69
NTE INEN-ISO 6579. (Enero de 2014). Microbiología de los alimentos para consumo
humano y alimentación animal. Método horizontal para la detección de Salmonell
spp. Quito, Ecuador. Recuperado el 22 de Enero de 2018
Organismo Público Descentralizado de Sector Salud, Ministerio de Salud Pública del Perú,
& Instituto Nacional de Salud. (2002). Manal de procedimiento para la prueba de
sensibilidad antimicrobiana por el método de disco difusión. Recuperado el 01 de
Marzo de 2018, de
http://www.ins.gob.pe/insvirtual/images/otrpubs/pdf/manual%20sensibilidad%202.
Organización Mundial de la Salud. (2007). Manual sobre las cinco claves para la
inocuidad de los alimentos.
Paniagua González, M. (Agosto de 2016). Verificación del método Simplate® Total Plate
Count Color Indicator (TPC CI), comparado con el método estándar de recuento en
placa por vertido, para el recuento total de microorganismos aeróbicos mesófilos en
productos terminados y materias primas. Guatemála. Recuperado el 20 de Enero de
2018, de http://www.biblioteca.usac.edu.gt/tesis/06/06_4001.pdf
Pardo Zapata, J. (2002). Patentabilidad de los extractos vegetales. Recuperado el 08 de
mayo de 2018, de
http://www.ub.edu/centredepatents/pdf/doc_dilluns_CP/pardo_patentesextractospla
ntas.pdf
Peluffo Rivera, A. M. (2009). Evaluación de peligros microbiológicos en cilantro
(Coriandrum sativum) y lechuga (Lactuca sativa), producidos en Puerto Rico.
Recuperado el 28 de Febrero de 2018, de
https://www.researchgate.net/profile/Angelica_Peluffo_Rivera/publication/2372647
75_EVALUACION_DE_PELIGROS_MICROBIOLOGICOS_EN_CILANTRO_C
oriandrum_sativum_Y_LECHUGA_Lactuca_sativa_PRODUCIDOS_EN_PUERT
O_RICO/links/5657772f08ae4988a7b56d33/EVALUACION-DE-PELIGR
Picazo, J. (2000). Métodos básicos para el estudio de sensibilidad a los antimicrobianos.
Pino Bovey, F. J., & Noriega Rodríguez, J. A. (2011). Análisis de Clases de Lípidos por
Cromatografía de Capa Fina de alta resolución. Recuperado el 15 de Julio de 2017,
de http://www.invurnus.uson.mx/revistas/articulos/10-
Pino%20Bovey%20y%20Noriega%20R%20(2011)%20Invurnus%206%20(2)%203
8-43.pdf
Piñeiro, M., & Días Ríos, L. B. (2004). FAO: Mejoramiento de la calidad e inocuidad de
las frutas y hortalizas frescas: un enfoque práctico manual para multiplicadores.
70
Ramirez, L. S., & Castaño, D. M. (2009). Metodologías para evaluar in vitro la actividad
antibacteriana de compuestos de origen vegetal.
Reyes Jurado, Palou, E., & López, A. (2014). Métodos de evaluación de la actividad
antimicrobiana y de determinación de los componentes químicos de los aceites
esenciales. 69. Recuperado el 15 de Julio de 2017, de
http://web.udlap.mx/tsia/files/2015/05/TSIA-81-Reyes-Jurado-et-al-2014.pdf
The Essentials of life Science Reseach. (2016). Recuperado el 21 de Mayo de 2018, de
https://www.atcc.org/products/all/25922.aspx
The Essentials of Life Science Research. (2016). Recuperado el 21 de mayo de 2018, de
https://www.atcc.org/products/all/13076.aspx
Ximhai Ra, & Rodríguez Sauceda Elvia Nereyda. (2011). Agentes antimicrobianos
naturales en la conservación de frutas y hortalizas. Revista de Sociedad, Cultura y
Desarrollo Sustentable, 2, 3. Recuperado el 15 de Julio de 2017, de
file:///C:/Users/USUARIO/Downloads/26675-51540-1-PB%20(1).pdf
71
ANEXOS
Anexo 1 Certificado de identificación botánica
72
PLANTA DE LA FLOR DE JAMAICA
Hibiscus sabdariffa
FLOR DE JAMAICA Hibiscus
sabdariffa
ENSAYO DE IDENTIDAD DE Hibiscus
sabdariffa
MEDICIÓN DE LA FLOR SECA DE
JAMAICA Hibiscus sabdariffa
VALORACIÓN DE Hibiscus sabdariffa
CENIZAS TOTALES DE Hibiscus
sabdariffa
INTENSIDAD DE COLORACIÓN DE
Hibiscus sabdariffa
CÁLIZ MOLIDO DE LA FLOR
Hibiscus sabdariffa
73
FILTRACIÓN DEL MACERADO DE
Hibiscus sbdariffa
CONCENTRACIÓN DEL
EXTRACTO ACETÓNICO DE
Hibiscus sabdariffa
PESO DEL CONCENTRADO DEL
EXTRACTO ACETÓNICO DE Hibiscus
sabdariffa
PESO DEL CONCENTRADO DEL
EXTRACTO ACETÓNICO DE
Hibiscus sabdariffa
MEZCLA DE SÍLICA GEL Y
EXTRACTO ACETÓNICO DE Hibiscus
sabdariffa
COLUMNA CROMATOGRÁFICA
ARMADA
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DEL FRACCIONAMIENTO PRIMARIO
DEL EXTRACTO ACETÓNICO DE Hibiscus sabdariffa
74
REVELACIÓN LUZ UV DE LAS PLACAS CROMATOGRÁFICAS DEL
FRACCIONAMIENTO PRIMARIO DEL EXTRACTO ACETÓNICO DE Hibiscus
sabdariffa
REVELACIÓN DE LAS PLACAS CROMATOGRÁFICAS DEL
FRACCIONAMIENTO PRIMARIO DEL EXTRACTO ACETÓNICO DE Hibiscus
sabdariffa
PRUEBA DE SENSIBILIDAD
ANTIMICROBIANA POR EL MÉTODO
DE DISCO DIFUSIÓN EN LAS
AGRUPACIONES
PRUEBA DE SENSIBILIDAD
ANTIMICROBIANA POR EL
MÉTODO DE DISCO DIFUSIÓN EN
LAS AGRUPACIONES
75
PRUEBA DE SENSIBILIDAD
ANTIMICROBIANA PARA Escherichia
coli ATCC25922
PRUEBA DE SENSIBILIDAD
ANTIMICROBIANA PARA
Salmonella enterit idis ATCC13076
CONCENTRACIÓN MÍNIMA
INHIBITORIA PARA Escherichia coli
ATCC25922
CONCENTRACIÓN MÍNIMA
INHIBITORIA PARA Salmonella
enteritidis ATCC13076
FENOLES TOTALES DE Hibiscus
sabdariffa
FLAVONOIDES TOTALES DE
Hibiscus sabdariffa
76
RECUENTO DE Escherichia coli y Coliformes EN PLACAS PETRIFILM PARA
EL TOMATE
RECUENTO DE Escherichia coli y Coliformes EN PLACAS PETRIFILM PARA
EL CULANTRO
77
RECUENTO DE Escherichia coli y Coliformes EN PLACAS PETRIFILM PARA
LA LECHUGA
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Salmonella spp EN AGAR XLD Y
AGAR ENTÉRICO HEKTOEN PARA LA LECHUGA
78
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Salmonella sppEN AGAR XLD Y
AGAR ENTÉRICO HEKTOEN PARA EL TOMATE
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Salmonella sppEN AGAR XLD Y
AGAR ENTÉRICO HEKTOEN PARA EL CULANTRO
IDENTIFICACIÓN DE Salmonella spp
Anexo 2 Fotos del proceso de experimentación
79
DETERMINACIÓN DE UFC/g MÉTODO PETRIFILM
Lechuga Tomate riñón Culantro
Antes Antes Antes
Muestra Diluciones P ufc/g P ufc/g P ufc/g
M1 10-1 66 660 7 70 MNPC MNPC
10-2 17 1700 MNPC MNPC
10-3 455 455000
M2 10-1 140 1400 22 220 MNPC MNPC
10-2 25 2500 MNPC MNPC
10-3 585 585000
M3 10-1 73 730 16 155 MNPC MNPC
10-2 18 1800 MNPC MNPC
10-3 600 600000
M4 10-1 385 3850 27 270 MNPC MNPC
10-2 58 5800 MNPC MNPC
10-3 12,5 12500 615 615000
Lechuga Tomate riñón Culantro
Después Después Después
P ufc/g P ufc/g P ufc/g
M1 10-1 MNPC -
10-2 475 47500
10-3 100 100000
M2 10-1 MNPC -
10-2 475 47500
10-3 86 86000
M3 10-1 MNPC -
10-2 485 48500
10-3 90 90000
M4 10-1 MNPC -
10-2 420 42000
10-3 76 76000
P: Promedio; UFC: Unidades Formadoras de Colonias; MNPC: Muy Numerosas Para Contar Elaborado por: Latacunga J
Anexo 3 Recuento de Coliformes en hortalizas en placas petrifilm 3M
80
DETERMINACIÓN DE UFC/g MÉTODO PETRIFILM
Lechuga Tomate riñón Culantro
Antes Antes Antes
Muestra Diluciones P ufc/g P ufc/g P ufc/g
M1 10-1 MNPC MNPC
10-2 30 3000
10-3
M2 10-1 MNPC MNPC
10-2 33 3300
10-3
M3 10-1 MNPC MNPC
10-2 33 3300
10-3
M4 10-1 MNPC MNPC
10-2 17 1700
10-3
Lechuga Tomate riñón Culantro
Diluciones Después Después Después
M1 10-1 22 220
10-2
10-3
M2 10-1 30 300
10-2
10-3
M3 10-1 20 200
10-2
10-3
M4 10-1 30 300
10-2
10-3
P: Promedio; UFC: Unidades Formadoras de Colonias; MNPC: Muy Numerosas Para Contar Elaborado por: Latacunga J
Anexo 4 Recuento de Escherichia coli en hortalizas en placas petrifilm 3M
81
MEDIO DE ENREQUECIMIENTO: CALDO RAPPAPORT VASSILIADIS
Agar Entérico Hektoen XLD Agar
ANTES DESPUÉS ANTES DESPUÉS
M1 +++ - ++ -
M2 +++ - + -
M3 +++ - + -
M4 ++ - ++ -
MEDIO DE ENREQUECIMIENTO: CALDO SELENITO CISTINA
Agar Entérico Hektoen XLD Agar
ANTES DESPUÉS ANTES DESPUÉS
M1 + - - -
M2 + - - -
M3 - - - -
M4 + - - -
(-): No hay crecimiento; (+): Poco crecimiento; (++): Mucho crecimiento; (+++): Demasiado
crecimiento
Elaborado por Latacunga J
Anexo 5 Crecimiento de colonias características de Salmonella spp. en medios de cultivos
frente a la lechuga
MEDIO DE ENREQUECIMIENTO: CALDO RAPPAPORT VASSILIADIS
Agar Entérico Hektoen XLD Agar
ANTES DESPUÉS ANTES DESPUÉS
M1 ++ - + -
M2 ++ - + -
M3 ++ - + -
M4 ++ - + -
MEDIO DE ENREQUECIMIENTO: CALDO SELENITO CISTINA
Agar Entérico Hektoen XLD Agar
ANTES DESPUÉS ANTES DESPUÉS
M1 ++ - - -
M2 ++ - - -
M3 + - - -
M4 + - - -
(-): No hay crecimiento; (+): Poco crecimiento; (++): Mucho crecimiento; (+++): Demasiado
crecimiento
Elaborado por Latacunga J
Anexo 6 Crecimiento de colonias características de Salmonella spp. en medios de cultivos
frente al tomate riñón
82
MEDIO DE ENREQUECIMIENTO: CALDO RAPPAPORT VASSILIADIS
Agar Entérico Hektoen XLD Agar
ANTES DESPUÉS ANTES DESPUÉS
M1 ++++ ++ ++ +
M2 ++ + ++ +
M3 ++ + ++ +
M4 ++ + ++ +
MEDIO DE ENREQUECIMIENTO: CALDO SELENITO CISTINA
Agar Entérico Hektoen XLD Agar
ANTES DESPUÉS ANTES DESPUÉS
M1 - - + -
M2 - - + -
M3 + + + -
M4 - - - -
(-): No hay crecimiento; (+): Escaso crecimiento: (++): Poco crecimiento; (+++): Mucho
crecimiento; (+++): Demasiado crecimiento
Elaborado por Latacunga
Anexo 7 Crecimiento de colonias características de Salmonella spp. en medios de cultivos
frente al culantro
83
Medio de enriquecimiento: Caldo Rappaport -Vassiliadis
Agar Entérico de Hektoen Agar XLD
Hortaliza
Antes Después Antes Después
Lechuga
M1 Presencia Ausencia Presencia Ausencia
M2 Presencia Ausencia Presencia Ausencia
M3 Presencia Ausencia Presencia Ausencia
M4 Presencia Ausencia Presencia Ausencia
Tomate
riñón
M1 Presencia Ausencia Presencia Ausencia
M2 Presencia Ausencia Presencia Ausencia
M3 Presencia Ausencia Presencia Ausencia
M4 Presencia Ausencia Presencia Ausencia
Culantro
M1 Presencia Presencia Presencia Presencia
M2 Presencia Presencia Presencia Presencia
M3 Presencia Presencia Presencia Presencia
M4 Presencia Presencia Presencia Presencia
Anexo 8 Presencia/Ausencia de Salmonella spp. en el medio de enriquecimiento
Rappaport-Vassiliadis para cada una de las muestras de las diferentes Hortalizas
MEDIO DE ENRIQUECIMIENTO: SELENITO CISTINA
Agar Entérico de Hektoen Agar XLD
Hortaliza
Antes Después Antes Después
Lechuga
M1 Presencia Ausencia Ausencia Ausencia
M2 Presencia Ausencia Ausencia Ausencia
M3 Ausencia Ausencia Ausencia Ausencia
M4 Presencia Ausencia Ausencia Ausencia
Tomate
riñón
M1 Presencia Ausencia Ausencia Ausencia
M2 Presencia Ausencia Ausencia Ausencia
M3 Presencia Ausencia Ausencia Ausencia
M4 Presencia Ausencia Ausencia Ausencia
Culantro
M1 Ausencia Ausencia Presencia Ausencia
M2 Ausencia Ausencia Presencia Ausencia
M3 Presencia Presencia Presencia Ausencia
M4 Ausencia Ausencia Ausencia Ausencia
Anexo 9 Presencia/Ausencia de Salmonella spp. en el medio de enriquecimiento Selenito
Cistina para cada una de las muestras de las diferentes Hortalizas
84
Anexo 10 Especificaciones de Salmonella enteritidis ATCC 13076
(The Essentials of Life Science Research, 2016)
85
Anexo 11Especificaciones de Escherichia coli ATCC 25922
(The Essentials of life Science Reseach, 2016)
86
87
88
89
Anexo 12 Guía de interpretación placas petrifilm para el recuento de Escherichia
coli/ Coliformes
