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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS
CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA
Caracterización molecular de un grupo de segregantes y de cuatro
variedades comerciales de tomate de árbol Solanum betaceum
Trabajo de titulación presentado como requisito previo a la obtención de Título de
Ingeniera Agrónoma
Autora: Chamba Vaca Jessica Pamela
Tutora: Dra. Gioconda García Santamaría, Ph.D.
Quito, Septiembre de 2018
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DEDICATORIA
Este título va dirigido especialmente a mis maravillosos padres Amable Chamba y Carmita Vaca, por ser mi motor y mayor inspiración para superarme, a ellos, mi amor, respeto y gratitud por siempre.
A mis queridos padrinos Felicidad y Jorge, por su infinito amor y preocupación.
A mis hermanos Carlos y Cristina, por brindarme cariño y compañía.
A Edwin, por su amor, compañía y apoyo incondicional durante y después de este largo trayecto.
Con mucho cariño.
Pamela.
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AGRADECIMIENTOS
A Dios por ser mi fortaleza, soporte y guía espiritual, a él le debo la bendición de hacer posible esta meta.
A mis padres, quienes son mi vida entera, gracias porque sin su incesante apoyo y sacrificio no lo hubiese logrado, por enseñarme cada día a ser una mejor persona. En especial a mi madre Carmita por su entrega incondicional y amor infinito, por ser mi mejor amiga y cómplice.
A la Universidad Central del Ecuador y a la Facultad de Ciencias Agrícolas por haberme dado la oportunidad de realizarme como profesional.
A mi tutora de tesis, Dra. Gioconda García, por su paciencia y por poner a mi disposición sus conocimientos.
Agradezco muy cordialmente a los Ingenieros que integran el Laboratorio de Biotecnología, por su disposición a ayudarme, por su amabilidad de dejarme utilizar los reactivos y equipos, especialmente al Dr. Venancio Arahana por la colaboración e invaluable ayuda en la realización de mi tesis y por compartir sus sabios conocimientos.
A Martita Ilaquiche, por su amistad y paciencia a lo largo de mi vida universitaria.
Pamela.
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ÍNDICE DE CONTENIDOS
CAPÍTULO PÁGINAS
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................. 1
2. REVISIÓN DE LITERATURA ........................................................................... 3
2.1 El cultivo de tomate de árbol ................................................................................... 3
2.1.1 Origen, domesticación y distribución ...................................................................... 3
2.1.2 Importancia económica ........................................................................................... 3
2.1.3 Genotipos................................................................................................................. 4
2.1.4 Taxonomía ............................................................................................................... 4
2.1.5 Valor nutritivo del tomate de árbol ......................................................................... 5
2.1.6 Mejoramiento en Tomate de árbol .......................................................................... 5
3.1 Mejoramiento Genético ........................................................................................... 6
3.1.1 Variabilidad genética ............................................................................................... 6
3.1.2 Segregación ............................................................................................................. 7
3.1.3 Recombinación genética.......................................................................................... 7
4.1 Evolución molecular................................................................................................ 7
4.1.1 ADN ........................................................................................................................ 7
4.1.2 Polimorfismos de ADN ........................................................................................... 8
4.1.3 Alelos....................................................................................................................... 8
5.1 Marcadores moleculares en el mejoramiento de las plantas ................................... 8
5.1.1 Microsatélites (SSRs) .............................................................................................. 9
5.1.2 Secuencias de Ortólogos Conservados (COSSII) ................................................. 10
6.1 Técnicas para el análisis molecular ....................................................................... 10
6.1.1 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ......................................................... 10
6.1.2 Electroforesis en gel de agarosa ............................................................................ 11
3. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................... 13
3.1 Ubicación del sitio experimental ........................................................................... 13
3.1.1 Campo Docente Experimental La Tola (CADET) UCE- FCA, ubicado en el barrio
La Morita, de la Parroquia Tumbaco, Cantón Quito. ............................................ 13
3.1.2 Laboratorio de Biotecnología Vegetal. ................................................................. 14
3.2 MATERIALES ................................................................................................... 14
3.2.1 Equipos de laboratorio........................................................................................... 14
3.2.2 Reactivos ............................................................................................................... 14
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CAPÍTULO PÁGINAS
3.3 MÉTODOS........................................................................................................... 15
3.3.1 Recolección de tejido foliar ................................................................................... 15
3.3.2 Desinfección de las hojas y Extracción de ADN .................................................. 15
3.3.3 Cuantificación del ADN ........................................................................................ 15
3.3.4 Dilución de los cebadores...................................................................................... 16
3.3.5 Pruebas preliminares de amplificación PCR - transferibilidad de cebadores ....... 16
3.3.6 Amplificación PCR de los marcadores en los segregantes y variedades
comerciales ............................................................................................................ 17
3.3.7 Electroforesis en gel de agarosa ............................................................................ 17
3.3.8 Visualización de los fragmentos de ADN en el gel............................................... 18
3.3.9 Toma de datos ....................................................................................................... 18
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ......................................................................... 19
4.1 Transferibilidad del grupo de cebadores de papa (Solanum tuberosum) al tomate
de árbol (Solanum betaceum) ................................................................................ 19
4.2 Análisis de ADN del material vegetal experimental ............................................. 21
4.2.1 Identificación de loci polimórficos ........................................................................ 21
4.2.2 Número de alelos ................................................................................................... 23
4.2.3 Segregación de alelos ............................................................................................ 24
4.2.4 Identificación molecular de los segregantes y especies cultivadas - barcodes ...... 24
5. CONCLUSIONES ............................................................................................... 26
6. RECOMENDACIONES ..................................................................................... 27
7. RESUMEN ........................................................................................................... 28
SUMMARY .......................................................................................................... 30
8. REFERENCIAS .................................................................................................. 32
9. ANEXOS .............................................................................................................. 36
ix
LISTA DE CUADROS
CUADROS PÁG.
1. Orden de las muestras de PCR en el gel de agarosa para la electroforesis. ................. 17
2. Cebadores de papa utilizados para la prueba de transferibilidad para el genoma de
tomate de árbol. ........................................................................................................... 20
3. Cebadores polimórficos y monomórficos para el material en estudio y tamaño bandas
que amplificaron. ......................................................................................................... 22
4. Número de alelos (bandas) que amplificaron para los segregantes, comerciales y
silvestre ........................................................................................................................ 23
5. Bandaje específico para algunos materiales en estudio (segregantes, variedades
comerciales y silvestre). .............................................................................................. 25
x
LISTA DE FIGURAS
FIGURAS PÁG.
1. Distribución geográfica del grupo de segregantes de tomate de árbol en el CADET. 13
2. Imagen del espectro uv y valores de la concentración de ADN .................................. 16
3. Amplificación de los cebadores 4 (STG0007), 5 (STI0014), 11 (STM1021), 15
(STMCL13) y 16 (T0869) en el genoma de tomate de árbol. El cebador 5 (STI0014) y
15 (STMCL13) presentaron bandas de 100 pb y 120 pb respectivamente. Los
productos de amplificación se revelaron en geles de agarosa al 1 % teñidos con Sybr-
Safe DNA. ................................................................................................................... 20
4. Cebador 4 (STG0007) presenta polimorfismo para las líneas 2 (segregante 1); 3
(segregante 2) y 14 (comercial mora), los productos de amplificación se revelaron en
geles de agarosa al 1 % teñidos con Sybr-Safe DNA. ................................................. 21
xi
LISTA DE ANEXOS
ANEXOS PÁG.
1. Identificación de los segregantes y variedades comerciales de tomate de árbol. ........ 36
2. Concentración de ADN de las muestras de tomate de árbol. ...................................... 36
3. Cebadores con sus respectivas temperaturas de alineamiento..................................... 37
4. Programa de PCR usado para la amplificación de los loci. La temperatura de
alineamiento varía para cada par de cebadores. .......................................................... 37
5. Cebador 1 (At3g24160) presenta bandas monomórficas ( alelo 400 pb) excepto el
tomate silvestre. ........................................................................................................... 38
6. Cebador 2 (DMC42144A) presenta bandas monomórficas ( alelo 600 pb) en las
muestras en estudio. ..................................................................................................... 38
7. Cebador 5 (STI0014) presenta doble banda de 500 pb y 110 pb. ............................... 38
8. Cebador 12 (STM1051) presenta bandas monomórficas para el grupo de segregantes
excepto el 10 (alelo 400 pb), los tomates comerciales son polimorficos (alelos de 400,
380 y 350 pb), el tomate silvestre heterocigoto (alelos 350 y 300 pb). ....................... 39
9. Cebador 14 (STM3012) presenta bandas monomórficas (alelo 200 pb) para todas las
muestras en estudio. ..................................................................................................... 39
10. Cebador 15 (STMCL13) presenta bandas monomórficas ( alelo 130 pb) en las
muestras en estudio. ..................................................................................................... 40
11. Cebador 16 (T0869) presenta bandas monomórficas ( alelo 400 pb) en las muestras en
estudio. ......................................................................................................................... 40
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TÍTULO: Caracterización molecular de un grupo de segregantes y de cuatro
variedades comerciales de tomate de árbol Solanum betaceum.
Autora: Jessica Pamela Chamba Vaca
Tutora: Gioconda Magdalena García Santamaría
RESUMEN
El objetivo de la investigación fue caracterizar molecularmente un grupo de segregantes y
cuatro variedades comerciales de tomate de árbol (Solanum betaceum), utilizando 16
marcadores moleculares específicos para papa. De los 16 cebadores utilizados, tres fueron
polimórficos 5 (STI0014), 4 (STG0007) y 12 (STM1051), lo que corresponde al 37.5%,
asimismo amplificaron 2, 3 y 4 alelos respectivamente. Los segregantes S3, S4, S9 y la
variedad comercial amarillo puntón no presentaron diferencias para los marcadores
probados. Mientras que los segregantes S1, S2, S7, S10 y todas las variedades comerciales,
así como la especie silvestre presentaron polimorfismos para estos tres marcadores.
PALABRAS CLAVE: MARCADORES MOLECULARES / POLIMÓRFICOS /
ALELOS / SEGREGANTES.
xiii
TITLE: Molecular characterization of a group of segregants and four commercial
varieties of tree tomato Solanum betaceum
Author: Jessica Pamela Chamba Vaca
Mentor: Gioconda García Santamaría
ABSTRACT
The objective of the research was to molecularly characterize a group of segregants and
four commercial varieties of tree tomato (Solanum betaceum), using 16 specific molecular
markers for potatoes. Out of the 16 primers used, three were polymorphic 5 (STI0014),
4 (STG0007) and 12 (STM1051), which corresponds to 37.5%, also amplified 2, 3 and 4
alleles respectively. The segregants S3, S4, S9 and the yellow commercial variety puntón
did not present differences for the markers tested. Whereas segregates S1, S2, S7, S10 and
all commercial varieties, as well as the wild species, presented polymorphisms for these
three markers.
KEYWORDS: MOLECULAR MARKERS / POLYMORPHIC / ALLELES /
SEGREGATES.
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INTRODUCCIÓN
El tomate de árbol Solanum betaceum Cavanilles, 1799 (Solanales: Solanaceae) es un frutal semiperenne originario de la región Andina, evidencias muestran que la mayoría de variedades cultivadas están relacionadas directamente con materiales silvestres nativos de Bolivia. Según Bohs y Nelson (1999) citado por (Alminate, 2017), estudios relacionados con las características morfológicas y moleculares han identificado a Bolivia como su lugar de origen.
La producción del tomate de árbol en Ecuador, se localiza principalmente en la sierra, en zonas con clima templado y suelos con alto contenido de materia orgánica (Lucas et al., 2011). Dicho cultivo se ha convertido en una alternativa rentable para el pequeño agricultor, en el caso de la provincia de Tungurahua se caracteriza por ser el principal cultivo permanente en unidades productivas familiares que promedian 0,26 ha sembradas (INEC, 2015). Datos oficiales del SINAGAP (2016) indican que las zonas de producción y superficie de cultivo han variado a través del tiempo. Sin embargo, datos históricos indican que las provincias de Tungurahua, Imbabura y Azuay consistentemente muestran las mayores superficies de área cultivada.
La comercialización del tomate de árbol se realiza a nivel local principalmente, sin embargo, estudios de mercadeo indican que existen posibilidades en el mercado mundial, debido a sus características físicas, organolépticas, alto contenido de ácido ascórbico, pro vitamina a, carotenoides, vitamina B6, C, E; su alta actividad antioxidante y a que contiene minerales (calcio, hierro y fósforo) presenta potencial de industrialización (Tamba, 2014).
De acuerdo a Lobo et al. (2000), citado por (Tamba, 2014), los parientes silvestres de S. betaceum poseen una serie de características genotípicas y fenotípicas que pueden ser aprovechadas para el mejoramiento genético; a través de hibridación con los ecotipos cultivados se ha logrado desarrollar híbridos entre S. unilobum y S. betaceum con resistencia mejorada a la antracnosis.
En la actualidad el fitomejoramiento tradicional se apoya en técnicas de ADN o marcadores moleculares, los cuales permiten identificar directamente los genotipos y evidenciar polimorfismos en la secuencia del ADN entre dos individuos, modifiquen estas o no su fenotipo (ArgenBio, 2007). Así mismo permiten mejorar el proceso de selección facilitando el control y manejo de la base genética de poblaciones de mejoramiento, ahorrando recursos para el mantenimiento de cultivos de prueba, y garantizando la pureza genética de nuevas variedades desarrolladas (Cárdenas, 2009).
Otro uso de los marcadores moleculares es la determinación filogenética de los individuos y el establecimiento de relaciones de parentesco o "pedigree" entre líneas o variedades para realizar estudios genéticos (Moreno, 2001). Así mismo, Peñafiel et al. (2009) mencionan que mientras más amplia sea la variabilidad genética de una población, la probabilidad de detectar diferencias en su ADN es mayor y estas diferencias pueden ser relacionadas a adaptaciones a factores bióticos o abióticos.
Acosta et al. (2012), menciona que en Ecuador la producción de tomate de árbol se ve limitada por diversos factores como la falta de diferenciación clara entre variedades y disponibilidad insuficiente de información sobre su caracterización genética. Por tal razón
2
el autor ha realizado estudios sobre la diversidad molecular con marcadores AFLPs utilizando 11 combinaciones de cebadores de una colección de 25 accesiones pertenecientes a cuatro grupos de cultivares, encontrando 78 (39,59%) marcadores polimórficos de 197, así mismo, obtuvieron huellas genéticas específicas y únicas para cada accesión.
En la Facultad de Agronomía de la Universidad Central, se mantiene una serie de segregantes provenientes de la cruza entre el tomate común (S. betaceum) x S. unilobum. Mediante una serie de retrocruzas del cual no se cuenta con un registro actual, se ha recuperado las características del tomate común1, algunos de los individuos presentan características deseables (altos rendimientos, buenas propiedades organolépticas y nutricionales) que requieren ser genotipificados.
Para el análisis de genotipificación, se utilizaron ocho cebadores estudiados anteriormente para detectar resistencia a Phythophtora infestans en papa (S. tuberosum) (Li, et al., 2012), dado que estudios preliminares han demostrado que la transferibilidad de cebadores de especies cercanas es efectiva para determinar la variabilidad genética intraespecífica (Peñafiel, 2007). Esto permitirá la identificación clara de estos individuos y el uso en mejoramiento genético.
Por lo expuesto, esta investigación se planteó caracterizar molecularmente a un grupo de segregantes y cuatro variedades comerciales de tomate de árbol Solanum betaceum. Como objetivos específicos se propuso: 1) Identificar marcadores moleculares polimórficos en material segregante y comercial de tomate de árbol; 2) Determinar la segregación de bandas para cada marcador molecular; 3) Establecer el número de alelos segregando.
1 De León, J. 2017. Información sobre el origen del material segregante de tomate de árbol. Ing. Agr.
Docente de la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad Central del Ecuador. Quito, Ec.
(Comunicación personal).
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2. REVISIÓN DE LITERATURA
2.1 El cultivo de tomate de árbol
2.1.1 Origen, domesticación y distribución
Estudios desarrollados por Bohs (1991) y Bohs & Nelson (1997) citado por Acosta, (2011) determinaron a Bolivia como el lugar de origen de S. betaceum. De acuerdo a (Bohs, 1989; Bohs, 1994) existen alrededor de 30 especies del género Cyphomandra, que está relacionado estrechamente al género Solanum. Análisis filogenéticos determinaron la estrecha relación entre las especies silvestres del grupo Cyphomandra y (S. maternum, S. unilobum y S. roseum), que al igual que S. betaceum conforman un complejo taxonómico muy cercano. Análisis de este grupo de las especies identificaron que, S. maternum es morfológicamente muy similar a S. betaceum y por lo tanto es muy difícil diferenciarlas; el epíteto “maternum” se debe a la posibilidad de que esta especie represente al ancestro silvestre del tomate de árbol.
La fecha de divergencia entre las especies, S. betaceum y S. unilobum parece reciente y data de 430 mil a 480 mil años), lo cual, es un tiempo corto de divergencia por lo tanto; el número de mutaciones acumuladas son reducidas y no existe una barrera genética para su cruzamiento, razón por la cual es posible conseguir híbridos viables y vigorosos entre ellos (Lobo, 2000).
Especies silvestres como S. unilobum son una fuente de genes de resistencia a enfermedades, especialmente cuando estas no están disponibles dentro de la especie cultivada. Cruzas interespecíficas para obtención de híbridos entre las especies cultivadas y sus especies silvestres ha sido una estrategia utilizada para introducir resistencia a patógenos (Bedoya y Barrero, 2009).
2.1.2 Importancia económica
La expansión del cultivo de tomate de árbol en el Ecuador se ve limitada por varios factores tales como la falta de diferenciación clara de variedades, baja calidad de fruta (heterogeneidad y problemas sanitarios), uso de variedades no adecuadas o sustitución de las variedades locales por materiales de otros orígenes; asimismo, se lo ha catalogado como un cultivo de subsistencia y una especie marginal, no considerada en programas de conservación y mejora de recursos fitogenéticos (Ramírez, et al., 2015).
Según datos del MAGAP (2013) citado por (INEC, 2015), en el Ecuador hubo un total de 4 233 ha cultivadas con tomate de árbol y una producción de 12 260 Tm, siendo uno de los productos andinos de importancia dentro de los rubros alimentarios a nivel nacional.
Este frutal en su mayoría se lo cultiva en las provincias de la serranía ecuatoriana. Debido al crecimiento de la demanda nacional, la producción del cultivo se ha esparcido por diversas regiones del país, siendo Tungurahua la provincia de mayor superficie cosechada de 585 ha, con una producción de 12 013 Tm, seguido de la provincia de Imbabura con una superficie cosechada 417 ha, con una producción de 1 117.08 Tm (ESPAC, 2014).
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2.1.3 Genotipos
En Ecuador los genotipos de tomate de árbol no se conservan puros, debido al cruzamiento natural entre los materiales que se cultivan en los huertos de los agricultores y posterior selección comercial.
Los genotipos cultivados en el Ecuador según Ávila (2009) son:
a) Rojo puntón: el color de la piel es rojo, la pulpa y mucílago que envuelven a las semillas son de color anaranjado medio, presenta alrededor de 196 semillas. Estos frutos a la madurez completa tienen 14,8 grados Brix y 260 ml.L-1 de vitamina C.
b) Anaranjado gigante: tanto su piel, pulpa y mucílago son anaranjados. Tiene alrededor de 308 semillas. Presenta un contenido de azúcares de 13,2 grados Brix y además 320 ml.L-1 de vitamina C.
c) Amarillo puntón: su piel, pulpa y mucílago son de color anaranjado. A la madurez presenta 14,42 grados Brix y además 270 ml.L-1 de vitamina C. Este genotipo es poco cultivado y comercializado, tal vez por tener menos calibre, pero tiene alta capacidad productiva, precocidad y menor tamaño de la planta.
d) Mora: la piel presenta una coloración rojiza oscura, la pulpa y el mucílago van de un color rojo oscuro a morado. Tiene un contenido de azúcares de 15 grados Brix y 10 ml.L-1 de vitamina C. Es preferido por los consumidores en los Estados Unidos y Europa debido a que el color es más atractivo aunque el sabor es más ácido que el anaranjado.
El genotipo más cultivado es el anaranjado gigante y el híbrido mora que es apreciado en la Costa. Se desconoce el origen del tomate anaranjado gigante que es muy cultivado en Tungurahua e Imbabura, donde se encuentran UPAs de hasta 10 hectáreas, especialmente en Imbabura (Revelo, et al., 2006).
2.1.4 Taxonomía
La ubicación de esta especie en el sistema jerárquico vegetal, la sitúa en el género Solanum, en la sección Pachyphyla, de acuerdo a la base de datos de plantas del servicio de conservación de Recursos Naturales, del Departamento de Agricultura de Estados Unidos (USDA) (Cárdenas, 2009).
Reino Vegetal Superdivisión Espermatofita División Magnoliophyta Clase Magnolipsida Subclase Asteridae Orden Solanales Familia Solanacea Género Solanum Subgénero Bassovia Sección Pachyphylla Especie Solanum betaceum Cav.
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2.1.5 Valor nutritivo del tomate de árbol
Las características nutritivas del tomate de árbol lo hacen atractivo para el consumo y exportación a mercados exteriores. Teniendo un alto contenido de provitamina A, vitaminas B6, C y E, así como de hierro, además contiene compuestos fenólicos. Según un estudio realizado por Vasco (2005) citado por (Beltrán, 2013), el tomate de árbol morado contiene mayor cantidad de polifenoles que el tomate amarillo. De las tres fracciones en la que fue dividida la fruta (cáscara, mesocarpio y placenta), la concentración de polifenoles fue mayor en la cáscara; mientras que, el mesocarpio presentó el menos contenido.
En ciertas poblaciones de Ecuador y Colombia los frutos de tomate de árbol, e incluso sus hojas, son utilizados en la medicina tradicional, teniendo excelentes propiedades contra las dolencias de la garganta y para la reducción del colesterol. En países como Jamaica y Bolivia se utilizan para combatir problemas hepáticos. Los campesinos de la región andina atribuyen a los frutos de esta especie propiedades medicinales para aliviar enfermedades respiratorias y combatir la anemia (Acosta, 2011).
2.1.6 Mejoramiento en Tomate de árbol
Caracterización morfológica y molecular
En Ecuador la producción de tomate de árbol se ve limitada por diversos factores como falta de diferenciación clara entre variedades, utilización de variedades no adecuadas o sustitución de las variedades locales por materiales de otros orígenes; además, es un cultivo de subsistencia, que no está considerada en programas de conservación y mejora de recursos fitogenéticos. Por tal razón Acosta en 2011, realizó estudios de caracterización morfológica y molecular de tomate de árbol, evaluando 27 accesiones pertenecientes a cuatro grupos de cultivares, encontrando diferencias significativas (P<0,05) entre accesiones en la mayoría de caracteres, especialmente en los relacionados con el fruto, lo que refleja una considerable variabilidad e indica que es posible seleccionar materiales con características de fruto más adecuadas para los mercados. En cuanto a la caracterización molecular evaluó once combinaciones de cebadores, encontrando 197 marcadores AFLPs, de los cuales 78 (39,59%) fueron polimórficos. Se obtuvieron huellas genéticas específicas y únicas para cada accesión. Sin embargo no detectó marcadores específicos y universales para los grupos agronómicos, lo cual sugiere que existe una escasa diferenciación genética entre grupos. Los grupos agronómicos mostraron una considerable diversidad interna, indicando que cada uno contiene una parte importante de la diversidad de la especie, lo cual tiene implicaciones relevantes tanto para su conservación como para su mejora genética.
Poblaciones segregantes
El Programa Nacional de Fruticultura del INIAP en Ecuador, ha realizado estudios, en los cuales evaluó segregantes de cruzamientos interespecíficos entre la especie cultivada S. betaceum por la especie silvestre S. unilobum, obteniéndose distintos niveles de resistencia a Colletotrichum sp., pero deficiente calidad del fruto en cuanto a tamaño, color y sabor de pulpa, por lo que se han visto en la necesidad de realizar retrocruzamientos hacia S. betaceum para recuperar dichas características.
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Posteriormente, se han seleccionado segregantes en función de la resistencia a la enfermedad, desempeño agronómico y calidad del fruto (Viera, et al., 2015).
3.1 Mejoramiento Genético
El desarrollo de nuevas variedades mediante mejoramiento genético permite crear un tipo de planta que responda a las diferentes condiciones ambientales, pero también a los diferentes usuarios como el productor, la industria y consumidor interno y externo (UNALM, 2014).
El mejoramiento vegetal inicia con la domesticación de las especies respondiendo a las necesidades del hombre, por esto es una de las realizaciones más antiguas de la humanidad. Con el proceso de domesticación se inicia una selección dirigida a satisfacer la planta ideotipo con la finalidad de proveer una fuente segura de alimentación. Este mejoramiento inicial más bien era intuitivo y sin base científica generado por el empirismo y considerada por esto un arte más que ciencia. Fue necesario, el redescubrimiento de las Leyes de Mendel para que se inicie el mejoramiento genético como una ciencia y fueron aplicadas al mejoramiento vegetal al inicio del siglo pasado (UNALM, 2014).
El mejoramiento genético de vegetales es más exitoso cuando se cuenta con una base genética, por esta razón la biodiversidad es un patrimonio muy valioso que debe ser utilizado para el beneficio de la humanidad. Una base genética está constituida por variedades, poblaciones silvestres y especies relacionadas de una planta, esto permite identificar y seleccionar características deseables e introducir en las especies cultivadas. Muchas veces cuando la base genética es estrecha es necesario ampliarla mediante la hibridación ó cruces inter e intra específicos para la introducción de genes de interés en cultivares de varias plantaciones (Peñafiel, 2007).
La introgresión (transferencia de un gen o carácter de un individuo a otro por retrocruces repetidos con el mismo parental) de genes en variedades domesticadas, provenientes de especies silvestres relacionadas, ha sido aprovechada sobre todo para conferir algún tipo de resistencia (Peñafiel, 2007).
El primer paso en un programa de mejoramiento genético es la creación de un banco de germoplasma activo que haya sido caracterizado para las diferentes características de interés económico. Esto permite identificar individuos que servirán como parentales y los segregantes necesarios para la selección (Alezones, et al., 2014).
3.1.1 Variabilidad genética
Es la variación en el material genético de una población o especie, e incluye los genomas. Es una medida de la tendencia de los genotipos de una población a diferenciarse. Los individuos de una misma especie no son idénticos. Si bien, son reconocibles como pertenecientes a la misma especie, existen muchas diferencias en su forma, función y comportamiento. En cada una de las características que podamos nombrar de un organismo existirán variaciones dentro de la especie (CONABIO, 2005).
La variación es también esencial en la técnica del análisis genético. Sin variación genética no es posible obtener marcadores ni hacer disección genética.
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La magnitud de la variación genética que existe en una especie viene determinada por su historia evolutiva, en donde la selección natural y la deriva genética son las fuerzas moduladoras de dicha variación (Barbadilla, s.f)
3.1.2 Segregación
Es la separación independiente de los alelos hereditarios después de un cruzamiento de progenitores con caracteres contrastables (ej. alto o enano, etc.), para uno o más pares de genes de manifestación cualitativa. Si los progenitores son líneas puras (homocigóticas) para sus alelos dominantes o recesivos y contrastantes, la generación F1, será 100% heterocigota y ésta al autofecundarla o cruzarla con ella misma, producirá la generación F2 en donde se manifestará la máxima segregación genética. Si los progenitores no son homocigotos contrastantes, la segregación se manifestará en la F1 (Martínez y Sáenz, 2003).
3.1.3 Recombinación genética
Es un proceso que lleva a la obtención de un nuevo genotipo a través del intercambio de material genético entre secuencias homólogas de DNA de dos orígenes diferentes. La información genética de dos genotipos puede ser agrupada en un nuevo genotipo mediante recombinación genética. Por lo tanto la recombinación genética es otra forma efectiva de aumentar la variabilidad genética de una población.
La recombinación implica que una hebra de ADN o de ARN se divide y se vincula a una molécula de un material genético que resulta diferente. Esto hace que los descendientes dispongan de una combinación genética que resulta distinta a la de sus padres (Martínez, 2016).
4.1 Evolución molecular
El estudio del origen y el mantenimiento de la variabilidad genética en las poblaciones naturales han sido de gran importancia en los últimos 70 años. Es debido al papel fundamental de la presencia de la variación genética tiene en el proceso evolutivo.
De acuerdo a Arboleda (2008) indica que en el año 1968, Motoo Kimura propuso la teoría neutralista de la evolución molecular que sostiene que la mayor parte de los cambios evolutivos que se observan a nivel molecular se han producido por la fijación aleatoria de mutaciones selectivamente neutras. De hecho, de acuerdo al neutralismo la mayor parte de la variación molecular que se observa en las especies es selectivamente neutra y el resultado de un equilibrio entre la aparición de nuevas variantes por mutación y la eliminación o fijación de éstas por deriva genética. Así, desde el punto de vista de la teoría neutralista el polimorfismo es una fase transitoria de la evolución molecular.
4.1.1 ADN
El ácido desoxirribonucleico (ADN) es un ácido nucleico que contiene toda la información genética hereditaria que sirve de “manual de instrucción” para desarrollarnos, vivir y reproducirnos. La mayoría de las moléculas de ADN consisten en dos cadenas de biopolímero en espiral alrededor de la otra para formar una doble hélice. La información
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en el ADN se almacena como un código compuesto por cuatro bases químicas que son: adenina (A), guanina (G), citosina (C) y timina (T) (VIU, 2017).
El ADN se encuentra en el núcleo de las células, aunque una pequeña parte también se localiza en las mitocondrias, de ahí los términos ADN mitocondrial y ADN nuclear. La información genética está contenida en secuencia a lo largo de la molécula; la cual puede hacer copias exactas de sí misma por un proceso denominado replicación, pasando de este modo la información genética a las células hijas, cuando las células se dividen (Morán, 2013).
4.1.2 Polimorfismos de ADN
El polimorfismo genético representa diferentes formas en las secuencias de ADN. Científicamente se define como la existencia simultánea en una población de genomas con distintos alelos para un locus determinado. Es el responsable de la gran variabilidad existente entre los individuos de una misma especie. La diversidad del genoma entre especies es obvia, mientras que la diversidad del genoma dentro de una misma especie hace que cada individuo sea único e irrepetible. Esta diversidad es la responsable de fenómenos a gran escala como la evolución de las especies y las características diferenciales entre individuos de una misma especie (Torrades, 2002).
Aproximadamente el 99.9% de la secuencia del ADN de dos individuos diferentes es la misma. Una proporción significativa de las diferencias encontradas en los individuos, es decir, sus diferencias fenotípicas y/o susceptibilidades a ciertas enfermedades, radica en el 0.1% de variación (Checa, 2007).
Existen numerosos mecanismos moleculares bien conocidos que pueden originar los polimorfismos, como la recombinación homóloga, la segregación de cromosomas, las mutaciones, las duplicaciones y las transposiciones. Cuando los polimorfismos sólo afectan a un único nucleótido (unidades monoméricas de la secuencia del ADN), se denominan SNP (Polimorfismo de nucleótido simple) (Torrades, 2002).
4.1.3 Alelos
Los alelos son variaciones de la secuencia del ADN presentes en una posición definida (locus) en un cromosoma. Consecuentemente, en una célula diploide cada locus está ocupado por dos alelos, uno de origen materno y otro de origen paterno, situados en los respectivos cromosomas homólogos (Torrades, 2002).
5.1 Marcadores moleculares en el mejoramiento de las plantas
Los marcadores moleculares son fragmentos específicos de ADN que pueden ser identificados en todo el genoma. Se utilizan para identificar o marcar alelos de difícil expresión fenotípica. En otras palabras, son herramientas que facilitan la selección del alelo de interés a través del marcador (Vallejo y Estrada, 2002). Estos marcadores se utilizan a nivel poblacional para el estudio de la diversidad genética en colecciones de germoplasma (Ramos y Andrade, 2005).
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En un cruzamiento dirigido el uso de marcadores moleculares que están asociados a las características de interés, son fundamentales para seleccionar individuos que hayan heredado estos genes de interés, ya que el marcador indica la presencia de la característica deseada. La ventaja con los marcadores moleculares es que los individuos con características superiores pueden ser identificados y seleccionados en las generaciones tempranas y solo estos ser avanzados a la siguiente generación (Ramos y Andrade, 2005).
Los marcadores deben ser altamente heredables (heredabilidad próxima a 1:0), de fácil evaluación y estar íntimamente ligados al alelo que se desea seleccionar. De esta manera, el marcador y el gen de interés tienden a permanecer juntos y por lo tanto, una planta que exprese el fenotipo del marcador debe ser portadora, al mismo tiempo, del alelo de interés. Estas propiedades hacen de los marcadores unos instrumentos muy eficientes para efectuar selección indirecta de alelos de interés para los programas de mejoramiento. Además, por poseer un número ilimitado de polimorfismos con base en el ADN y ser independientes del efecto ambiental y del estado fisiológico de la planta, permiten identificar en forma precoz y precisa las plantas con una mejor combinación de alelos favorables (Vallejo y Estrada, 2002).
Los marcadores moleculares también son utilizados en estudios de variabilidad genética, identificación de cultivares, protección de los derechos del fitomejorador u obtentor, evaluación de la pureza genética de las semillas, mapeamiento genético e incremento de conocimientos sobre la organización de los genomas (Vallejo y Estrada, 2002).
A través de los marcadores moleculares es posible analizar en profundidad la estructura del genoma de las plantas y de esta manera hacer más eficiente la utilización de los recursos genéticos en el mejoramiento vegetal. En los últimos años se ha avanzado mucho en el desarrollo de mapas genéticos y en el marcado de genes de interés agronómico (Masuelli, 1999).
Existen diferentes marcadores moleculares como los Polimorfismo de longitud de fragmento de Restricción (RFLP) basados en el uso de enzimas de restricción que son codominantes y pueden detectar individuos heterozigotes. La segunda generación de marcadores se basa en la amplificación de segmentos de ADN utilizando la reacción de la cadena polimerasa. Polimorfismos en la longitud de los fragmentos amplificados (AFLP) basada en la amplificación selectiva de un subconjunto de fragmentos de ADN que previamente han sido cortados con enzimas de restricción. Los microsatélites como los basados en la amplificación de Secuencias Simples Repetidas (SSR) (Powell, et al., 1996).
5.1.1 Microsatélites (SSRs)
Los microsatélites o repeticiones de simple secuencia (SSRs), consisten en segmentos de ADN que contienen numerosas repeticiones en tándem de una secuencia de "tema" corto, normalmente de una a seis bases (p.ej. CACACACAŠ). Los microsatélites se amplifican a través de PCR, utilizando cebadores específicos que se hibridan en regiones conservadas que flanquean la región del ADN que contiene las secuencias repetidas. El proceso PCR da lugar a un gran número de copias del segmento elegido de ADN que contiene la secuencia microsatélite (Butcher, et al., 1999).
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En plantas, encontraron que los microsatélites son altamente polimórficos, y que las repeticiones de (AT)n son las más numerosas. No obstante dichos marcadores son multi-alélicos, codominantes, abundantes dentro del genoma y reproducibles entre laboratorios. Además, el análisis requiere solamente una cantidad escasa de ADN, extraído generalmente de un material disponible a lo largo del año (Fendri, 2008).
El carácter hipervariable de los SSRs permite discriminar eficazmente entre individuos estrechamente relacionados, lo cual es de utilidad para la identificación de cultivares (Peñafiel, et al., 2009). Asimismo, estos marcadores son ideales para el estudio de ligamiento genético en plantas, el mapeo físico y los estudios poblacionales (Azofeifa, 2006). Otra de las ventajas de este tipo de marcador, es que los sitios donde se ubican los microsatélites son conservados entre especies y géneros relacionados, haciendo posible su transferencia (Ordoñez, 2007).
5.1.2 Secuencias de Ortólogos Conservados (COSSII)
Estos marcadores COS provienen de secuencias de genes expresados (ESTs), son secuencias marcadoras obtenidas del procesamiento de la información de las bases de datos de secuencias biológicas. Estas secuencias corresponden a genes de plantas que se han mantenido conservados y en un bajo número de copias en sus genomas, desde los últimos ancestros comunes que comparten las plantas con flores (Solís, 2008).
Los COSII pueden utilizarse para evaluaciones a gran escala, los análisis filogenéticos permiten con alta probabilidad clasificarlos como ortólogos y el diseño de cebadores universales pueden amplificar contrapartes ortólogas (exónes y/o intrones) de otras especies de solanáceas relacionadas (Cárdenas, 2009).
Estos marcadores presentan características que los hacen valiosos en el estudio de especies de la familia Solanácea: pueden ser convertidos a marcadores codominantes y de bajo costo y están distribuidos en los 12 cromosomas del tomate. Su uso en especies con poco desarrollo genómico como el tomate de árbol facilitará la ubicación de cromosomas al ser comparados con sus posiciones en el cromosoma del tomate. Los estudios de diversidad, la selección asistida por marcadores o por genómica acoplada con la identificación de QTLs de importancia económica, como apoyo a programas de mejoramiento genético (Cárdenas, 2009).
6.1 Técnicas para el análisis molecular
6.1.1 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La reacción en cadena de la polimerasa es una técnica de biología molecular descrita en 1986 por Kary Mullis, cuyo objetivo es sintetizar muchas veces un pedazo o fragmento de ADN utilizando una polimerasa que puede trabajar a temperaturas muy elevadas (González, 2004).
Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a
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continuación, dejar que vuelvan a unirse a polimerasas para que vuelvan a duplicarlas (González, 2004).
Cuando hacemos una reacción de PCR simulamos lo que sucede en una célula cuando se sintetiza el ADN y en el tubo se mezclan todos los reactivos necesarios para hacerlo: taq polimerasa, dinucleótidos, ADN, agua, buffer con magnesio y otras sales, y oligonucleótidos (cebadores). Posteriormente se coloca los tubos en una máquina conocida como termociclador, que básicamente sirve para calentarlos o enfriarlos a temperaturas muy precisas. En este proceso las muestras de reacción se someten a ciclos sucesivos, cada uno correspondiente a una fase de desnaturalización, una de hibridación o alineamiento y una de extensión (Espinosa, 2002).
a) Durante la desnaturalización, las dobles cadenas del ADN se abren o desnaturalizan, quedando en forma de cadenas sencillas.
b) Durante el alineamiento, el termociclador ajusta la temperatura en un intervalo entre 40oC y 68oC, a esta temperatura se forman y se rompen constantemente los puentes de hidrógeno entre los oligonucleótidos y el ADN, y aquellas uniones más estables durarán mayor tiempo, quedando los oligonucleótidos “alineados” formando una pequeña región de doble cadena. La polimerasa se une a este pequeño pedazo de ADN de doble cadena y comienza a copiar en sentido 5’ a 3’; al agregar unas bases más, los puentes de hidrógeno que se forman entre las bases estabilizan más la unión y el oligonucleótido permanece en este sitio para el siguiente paso.
c) Durante la fase de extensión, la temperatura sube a 72ºC, a esta temperatura la
polimerasa alcanza su máxima actividad, y continúa la síntesis de los fragmentos de ADN a partir de los oligonucleótidos que ya se habían alineado. Al finalizar cada ciclo, la cantidad de ADN molde disponible para el ciclo siguiente aumenta al doble.
Cabe mencionar que antes y después de estos ciclos se programan dos pasos, uno de 95 oC durante varios minutos para iniciar con desnaturalización, y al final de los ciclos, un paso último de extensión a 72 oC para permitir que la taq termine de sintetizar todos los fragmentos que pueden haber quedado incompletos.
6.1.2 Electroforesis en gel de agarosa
La electroforesis en gel de agarosa se utiliza comúnmente para separar moléculas en función de su carga, tamaño y forma. Se trata de un medio de separación especialmente eficaz para las biomoléculas cargadas como el ADN, el ARN y las proteínas (Padilla, et al., 2008).
El gel se hace disolviendo polvo de agarosa en una solución tampón hirviente. A continuación, se deja enfriar la solución a 55°C y se vierte en un soporte, donde se solidifica. Se sumerge después el soporte en un equipo de electroforesis de electrodos que contiene solución tampón. Las muestras pueden entonces colocarse por medio de una micropipeta de transferencia en las rendijas visibles en el gel con la ayuda de una plantilla. Por su densidad, las muestras se sumergen en la solución tampón y permanecen en los pocillos (EDVOTEK, 2016).
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El equipo de electroforesis se conecta a una fuente de corriente continua directa y se somete a tensión. Las moléculas cargadas contenidas en las muestras penetran en los capilares del gel. Las moléculas de carga negativa (ADN) migran hacia el electrodo positivo del aparato de electroforesis (ánodo), mientras que las moléculas de carga neta positiva migran hacia el electrodo negativo (cátodo). Dentro de ciertos márgenes, cuanto más fuerte sea el campo eléctrico, más rápido migran las moléculas. El tampón sirve a la vez para conducir la electricidad y para controlar el pH. Efectivamente, el pH tiene una influencia sobre la carga y la estabilidad de las moléculas biológicas (EDVOTEK, 2016).
Al utilizar geles de agarosa, se debe añadir bromuro de etidio, sustancia que se intercala entre las bases del ADN y es fluorescente cuando se ilumina con luz ultravioleta. Tras la electroforesis, se visualiza el gel en el fotodocumetador, donde se observará las bandas correspondientes a las muestras de ADN aplicado y los marcadores de peso molecular (Padilla, et al., 2008).
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3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Ubicación del sitio experimental
3.1.1 Campo Docente Experimental La Tola (CADET) UCE- FCA, ubicado en el barrio La Morita, de la Parroquia Tumbaco, Cantón Quito.
La asignatura de Fruticultura ha mantenido un grupo de segregantes provenientes de la cruza entre el tomate cultivado (S. betaceum) x el tomate silvestre (S. unilobum), los cuales se encuentran sembrados en el CADET (Figura 1).
Figura 1. Distribución geográfica del grupo de segregantes de tomate de árbol en el CADET.
Las características geográficas y climáticas según la Estación Agrometeorológica “la Tola” son: Altitud: 2465 m. Latitud: 0° 12´ 88´´ SUR. Longitud: 78° 22' 28´´OESTE Temperatura máxima: 25.5° C Temperatura mínima: 7.7° C Temperatura promedio: 16.2° C Precipitación media/mensual: 75.5 mm Humedad relativa: 78.3% Velocidad del viento: 3.0 m/s N y SE. Luminosidad: 147.2 horas sol/ mes y 4.9 horas sol/día
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3.1.2 Laboratorio de Biotecnología Vegetal.
Provincia: Pichincha. Cantón: Quito. Sector: Ciudadela Universitaria.
Características geográficas y climáticas según INAMHI:
Altitud: 2789 msnm Latitud: 00°11’54.8’’ S Longitud: 78°30’25.1’’ O Humedad Relativa: 90% Fotoperiodo: 12 horas luz Temperatura: 17 °C
3.2 MATERIALES
Material biológico
Tejido de hojas jóvenes de tomate de árbol, de las variedades comerciales: anaranjado gigante, amarillo puntón, rojo puntón y mora; y de diez segregantes, colectados en el Campo Docente Experimental La Tola (CADET) y un tomate silvestre colectado en el invernadero del laboratorio de Biotecnología en Quito (ANEXO 1).
Material de campo
Tijera de podar, hielo, marcador, tubos de 200 uL, Cámara fotográfica.
Material de laboratorio
Micropipetas (CORNING) (0.5-10 l y 20-200 l), tubos eppendorf (1.5 ml y 0.2 ml), puntas para micropipetas, gradillas.
3.2.1 Equipos de laboratorio
Espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific), cámara de flujo laminar (Streamline), cabina PCR (Biobase), termociclador (Techne Flexigene), balanza analítica (RADWAY®), congelador (Indurama), vórtex (Thermo Scientific), cámara horizontal de electroforesis (Thermo Scientific), fuente de poder (Thermo Scientific), microondas (General Electric®), fotodocumentador (BIORAD), autoclave (All American), computadora.
3.2.2 Reactivos
Reactivos para extracción de ADN
Dilución Buffer (Thermo Scientific), agua destilada estéril, hipoclorito de sodio.
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Reactivos para Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR)
Agua Ultrapura estéril, agua libre de nucleasas (Thermo Scientific), Phire Plant Direct PCR Master Mix (Thermo Scientific), Control Primer Mix (Thermo Scientific), Cebadores de papa (Li, et al, 2012), muestras de ADN de tomate de árbol.
Reactivos para electroforesis en gel de agarosa
Agarosa ultrapura (Invitrogen), Buffer de corrida (TBE)1X (Invitrogen), buffer de carga Blue juice 10X (Invitrogen), colorante Sybr-Safe DNA (invitrogen), escalera O’Generuler Express DNA (Thermo Scientific).
3.3 MÉTODOS
3.3.1 Recolección de tejido foliar
La recolección de las muestras de hojas de tomate de árbol de los diez segregantes y las cuatro variedades comerciales (anaranjado gigante, rojo puntón, amarillo puntón y mora) se realizó en el CADET y la muestra del tomate silvestre en el invernadero del Laboratorio de Biotecnología en Quito. Se tomó varios brotes de hojas jóvenes, se los colocó en tubos eppendorf y fueron etiquetados con el número de la muestra. Seguidamente se los almacenó en un contenedor con hielo, para posteriormente ser llevados al laboratorio para su desinfección y extracción de ADN.
3.3.2 Desinfección de las hojas y Extracción de ADN
Para limpiar y desinfectar, las muestras fueron sumergidas en hipoclorito de sodio (NaClO) al 2% durante 1 minuto con agitación constante, inmediatamente se realizaron dos aclareos con agua destilada estéril para eliminar el cloro que pudo quedar en la hoja.
Para la extracción de ADN se utilizó un kit de Fisher Scientific y se siguió el protocolo descrito para Thermo scientific Phire Plant Direct PCR Master Mix. Con la ayuda de un bisturí y una micro balanza, se tomó 0.5 mg de tejido, se colocó en un tubo de 200 uL (0,2 mL), se añadió 20 uL del reactivo Dilution Buffer, y se maceró el tejido con una punta de 20 uL hasta obtener una solución de color verdoso. Se usó 0,5 uL del sobrenadante como plantilla para una reacción de 20 uL de PCR.
3.3.3 Cuantificación del ADN
Debido a que los primeros intentos de amplificación del ADN mediante PCR no produjeron los resultados esperados, se consideró apropiado cuantificar y diluir el ADN previo a su uso en las reacciones de PCR. Se siguió el protocolo de Thermo scientific Phire Plant Direct PCR Master Mix, con ligeras modificaciones. Se cuantificó el ADN mediante espectrofotometría ultravioleta, utilizando el NANODROP 2000. Para esto se procedió a colocar 2uL de Dilution Buffer (solución blanco) en el pedestal inferior, posteriormente se levantó el brazo y se limpió ambos pedestales con una toalla limpia. Finalmente se colocó 3 uL de la muestra de ADN en el pedestal inferior para la determinación del espectro de absorción uv, los valores fueron proporcionados en ng/uL (Figura 2).
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Figura 2. Imagen del espectro de absorción uv y valores de la concentración de ADN
Una vez cuantificado el ADN de cada muestra, se preparó diluciones a una concentración de 100 ng/µL (Anexo 2). Las diluciones se realizaron con agua ultra pura estéril y fueron mantenidas a -20°C en un congelador Indurama. Las extracciones originales fueron también guardadas a -20º C en caso de que sea necesario realizar diluciones adicionales.
3.3.4 Dilución de los cebadores
La concentración inicial de los cebadores fue de 100uM, para bajar su concentración a 5uM se utilizó la siguiente fórmula:
C1 x V1= C2 x V2
En donde:
C1= 100 uM (concentración inicial del cebador)
V1=? uL (volumen de la solución inicial del cebador a utilizar)
C2= 5uM (concentración final)
V2= 100 uL (volumen final de la solución diluida del cebador)
100uM x V1= 5uM x 100 uL
V1= 5 uL del cebador + 95 ul de H2O
3.3.5 Pruebas preliminares de amplificación PCR - transferibilidad de cebadores
Debido a que se carecía de cebadores específicos para tomate de árbol, se probaron 16 cebadores específicos para papa (Li, et al, 2012) (Anexo 3), que fueron proporcionados por el Laboratorio de Biotecnología de la Facultad de Ciencias Agrícolas. Estos cebadores han sido probados y asociados con resistencia a Phythoptora infestans en papa (Li, et al, 2012; Cevallos, 2015).
Para determinar la transferibilidad de los cebadores de papa en tomate de árbol, se utilizó una muestra de ADN obtenido de tejido del tomate comercial mora. Se realizaron pruebas con cada par de cebadores para verificar si amplificaba en el ADN de tomate de árbol.
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3.3.6 Amplificación PCR de los marcadores en los segregantes y variedades comerciales
Ocho cebadores fueron analizados en el grupo de diez segregantes, cuatro tomates comerciales (anaranjado gigante, amarillo puntón, rojo puntón y mora) y un tomate silvestre. Siguiendo el protocolo de Thermo scientific Phire Plant Direct PCR Master Mix, las reacciones de amplificación se hicieron en tubos de PCR (200uL), en un volumen final de 20 uL, conteniendo 5,5 uL de H2O nuclease-free; 10 uL de 2x phire plant direct PCR master mix; 2uL (5 uM) del cebador Forward; 2uL (5uM) del cebador Reverse; y 0,5 uL de la suspensión de ADN.
Las reacciones de PCR se dieron en un termociclador (Techne), programado para una desnaturalización inicial a 98 °C por 5 min, seguido de 40 ciclos, cada uno de ellos consistió de una desnaturalización a 98 °C por 5 seg, alineación del oligonucleótido (temperatura varía según el par de cebador) por 5 segundos, extensión a 72 °C por 30 seg y una extensión final a 72 °C por 4 min (ANEXO 4).
3.3.7 Electroforesis en gel de agarosa
Para la separación de los fragmentos de ADN amplificados, se preparó un gel de agarosa al 1%, para esto se pesó 0,4 g de agarosa, se colocó en un matraz de125ml, seguidamente se añadió 40ml de TBE (Tris-borato-EDTA) 1x, la solución se disolvió en el microondas por 30 segundos aproximadamente, se retiró con cuidado el matraz del microondas y se mezcló. A continuación se dejó enfriar la solución y se colocó 4 uL de colorante Sybr-Safe DNA y se mezcló la solución agitando hasta obtener una coloración rosada opaca. La solución se vertió en la cámara horizontal, previamente se colocó el peine en la ranura superior y se dejó solidificar por 15 min. Posteriormente se colocó TBE 1x hasta cubrir el gel. En el primer pocillo se depositó 3uL de Ladder O’Generuler Express DNA (Thermo Scientific), seguido de 5uL de producto PCR de cada muestra en los siguientes pocillos (Cuadro 1). Finalmente se corrió la electroforesis a 100 voltios por 50min.
Cuadro 1. Orden de las muestras de PCR en el gel de agarosa para la electroforesis.
# línea Identificación
1 Escalera
2 segregante 1
3 segregante 2
4 segregante 3
5 segregante 4
6 segregante 5
7 segregante 6
8 segregante 7
9 segregante 8
10 segregante 9
11 segregante 10
12 comercial gigante
13 comercial amarillo
14 comercial mora
15 comercial rojo
16 Silvestre
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3.3.8 Visualización de los fragmentos de ADN en el gel
La separación de los segmentos de ADN fue visualizada y fotografiada bajo luz ultravioleta en el fotodocumentador (Biorad).
3.3.9 Toma de datos
A partir de las fotos de los geles, se preparó una matriz con datos de tamaño de la banda y presencia o ausencia de bandas (alelos) para cada una de las plantas en estudio y por cada uno de los pares de cebadores.
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4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1 Transferibilidad del grupo de cebadores de papa (Solanum tuberosum) al
tomate de árbol (Solanum betaceum)
Por la limitación de recursos, en este estudio se utilizó un grupo de cebadores específicos para papa (Li et al., 2012), ya que en casos en los que no se puede disponer de cebadores desarrollados específicamente para la especie en estudio, es frecuente recurrir al uso de cebadores diseñados a partir de especies cercanas (Peñafiel, 2007).
Los 16 cebadores analizados, han sido previamente estudiados y asociados a genes de resistencia a Phytoptora infestans en S. tuberosum (Li, et al, 2012; Cevallos, 2015). Consecuentemente, se especula que las secuencias amplificadas en los segregantes y variedades comerciales utilizadas en este estudio, estarían marcando regiones del genoma de tomate de árbol asociadas a esta resistencia, lo cual constituiría un insumo importante para el desarrollo de variedades de tomate de árbol resistentes al patógeno. Sin embargo, en Ecuador, a pesar que se ha encontrado a S. betaceum como hospedero del linaje de Phytoptora infestans denominado EC-3, se considera que no es una plaga de importancia en este frutal (Oyarzum, et al, s.f). Al contrario, un estudio realizado por Castaño et al, (2015) señala que Phytophthora infestans sensu lato, es una plaga de tomate de árbol que se ha incrementado notablemente en las dos últimas décadas y ha ocasionado grandes pérdidas económicas en varias zonas productoras de Colombia.
En la prueba de transferibilidad, se probó 16 pares de cebadores de la papa, en una sola muestra de tomate de árbol, el tomate comercial mora. Diez cebadores (aproximadamente 62.5%) mostraron algún producto de amplificación. Sin embargo, de los 10 cebadores, el 25% presentó patrones de amplificación inespecífica, con productos de elevado peso molecular (Figura 3). Solamente ocho cebadores produjeron tamaños de bandas esperados (SSR, COS, EST) en el ADN de tomate de árbol, considerando por tanto una transferibilidad efectiva del 50%. Los cebadores que amplificaron efectivamente y fueron usados en el análisis de las muestras de tomate de árbol fueron: 1 (At3g24160), 2 (DMC42144A), 4 (STG0007), 5 (STI0014), 12 (STM1051), 14 (STM3012), 15 (STMCL13), 16 (T0869)
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Cuadro 2. Cebadores de papa utilizados para la prueba de transferibilidad al genoma de tomate de árbol.
Código de
cebador
Nombre cebador
a
Tipo de
marcador
Amplificación en T. de árbol
Peso molecular (pb)
Cromosomab
En muestras finales de tomate de árbol
En papa*
1 At3g24160 COS X 400 - IX
2 DMC42144A Gen candidato
X 600 - IX
3 DMC42152B Gen candidato
- - - -
4 STG0007 SSR X 300-600 - XII
5 STI0014 SSR X 110-500 112-139 IX
6 STI0038 SSR - 110-113 -
7 STI0057 SSR - - - -
8 STINHWI SSR - - - -
9 STLS1G SSR X - - VII
10 STM0038 SSR - - 110-115 -
11 STM1021 SSR X - - -
12 STM1051 SSR X 300-400 - IX
13 STM3009 SSR - - - -
14 STM3012 SSR X 200 153-213 IX
15 STMCL13 EST598644 X 130 - XII
16 T0869 COS X 400 - II
a Nombre con el que se conoce el cebador a nivel internacional, mientras que el código es el número asignado para esta
investigación. b
El número corresponde al cromosoma de papa (Li, et al., 2012). *Tamaño de bandas que amplifica en papa (INIAP, 2007). Cos (Secuencias Ortólogas Conservadas); SSR (Secuencias Simples Repetidas).
Peñafiel (2007) menciona que de manera general, en plantas la amplificación exitosa y útil entre especies parece limitarse a congéneres, con porcentajes de entre el 50% y el 100% de transferibilidad de cebadores a especies del mismo género, presentando posibilidades de polimorfismo en un rango entre el 20 % y 100%. Aun cuando un mismo grupo de cebadores se evalúa en especies cercanas del mismo género, tanto el número de cebadores que amplifican, como el porcentaje de éstos que muestra polimorfismo, varía considerablemente entre dichas especies.
Figura 3. Amplificación de los cebadores 4 (STG0007), 5 (STI0014), 11 (STM1021), 15 (STMCL13) y 16 (T0869) en el genoma de tomate de árbol. El cebador 5 (STI0014) y 15 (STMCL13) presentaron bandas de 100pb y 120 pb respectivamente. Los productos de amplificación se revelaron en geles de agarosa al 1% teñidos con Sybr-Safe DNA.
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En el estudio realizado por el INIAP en 2006, basada en la técnica microsatélite, se determinó que el cebador 14 (STM3012) amplificó exitosamente en el genoma de tomate de árbol, al igual que en la presente investigación.
4.2 Análisis de ADN del material vegetal experimental
4.2.1 Identificación de loci polimórficos
Los ocho pares de cebadores que presentaron amplificación fueron probados en 10 segregantes, cuatro cultivares comerciales (anaranjado gigante, rojo puntón, amarillo puntón y mora) y un silvestre. De los ocho cebadores, tres (4, 5 y 12) resultaron ser polimórficos, lo que corresponde al 37.5% (Cuadro 3; Figura 4; Anexos 7 y 8). Estos resultados de polimorfismo equivalen a alrededor de la mitad de lo obtenido en un estudio realizado por INIAP en 2006, donde utilizaron 16 cebadores provenientes de la papa (S. tuberosum), 9 de los cuales resultaron ser polimórficos (56.25%) para el tomate de árbol en 87 variedades cultivadas y en 27 especies silvestres. Esta diferencia en el polimorfismo entre los dos estudios puede estar asociada con el origen del material evaluado (variedades vs segregantes) y las diferencias en el tamaño de las muestras (114 vs 15).
En el estudio realizado por Peñafiel en 2007, los resultados de polimorfismo son totalmente diferentes, pues encontraron 4 cebadores polimórficos de 53, lo que representa el 7,5%. Hay que señalar que los cebadores usados por Peñafiel (2007), fueron distintos a los usados en el presente estudio aunque también provenían de la papa, y fue realizado con 50 variedades cultivadas.
Los cebadores 1 (At3g24160), 2 (DMC42144A), 14 (STMCL13), 15 (STMCL13) y 16 (T0869) mostraron un patrón monomórfico. El cebador 14 (STM3012), de igual manera fue analizado en un estudio realizado por INIAP en 2006, en el cual, éste cebador amplificó el mismo tamaño de banda (200 pb) para los cultivares de tomate de árbol, pero para las especies silvestres amplificó bandas polimórficas de 100 y 300 pb.
Así mismo, en el estudio realizado por Peñafiel en 2007, este cebador amplificó bandas monomórficas de 186 pb para las accesiones de tomate de árbol.
Figura 4. Cebador 4 (STG0007) presenta polimorfismo para las líneas 2 (segregante 1); 3 (segregante 2) y 14 (comercial mora). Los productos de amplificación se revelaron en geles de agarosa al 1% teñidos con Sybr-Safe DNA.
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Cuadro 3. Cebadores polimórficos y monomórficos para el material en estudio y tamaño bandas que amplificaron.
Cebador 1
(At3g24160) 2
(DMC42144A) 4
(STG0007) 5
(STI0014) 12
(STM1051) 14
(STM3012) 15
(STMCL13) 16
(T0869)
Material en estudio
400 Pb
600 pb
600 pb
400 pb
300 pb
500 pb
110 pb
400 Pb
380 pb
350 pb
300 pb
200 Pb
130 pb
400 Pb
Segregante 1 + + + + + + + + +
Segregante 2 + + + + + + + + + +
Segregante 3 + + + + + + + +
Segregante 4 + + + + + + + +
Segregante 5 + + + + + + + + +
Segregante 6 + + + + + + + + +
Segregante 7 + + + + + + + +
Segregante 8 + + + + + + + + +
Segregante 9 + + + + + + + +
Segregante 10 + + + + + + + + +
Comercial gigante + + + + + + + +
Comercial amarillo + + + + + + + +
Comercial mora + + + + + + + + +
Comercial rojo + + + + + + + +
Silvestre + + + + + + +
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4.2.2 Número de alelos
El número total de alelos, considerando los 8 cebadores y las 15 muestras de tomate de árbol (segregantes, variedades comerciales y el silvestre), fue de 14. En tanto que, de manera separada, 11 alelos estuvieron presentes en los segregantes, 12 alelos en las variedades comerciales y 7 alelos en la especie silvestre. Obviamente hay que recordar que muchos de estos alelos son comunes para las tres clases de individuos.
El mayor número de alelos se obtuvo con el cebador 12 (STM1051) con cuatro alelos en total (2 alelos en los segregantes, 3 alelos en las variedades cultivadas y 2 alelos en la especie silvestre), en tanto que el cebador 5 (STI0014) mostró solamente 2 alelos en total (2 alelos en los segregantes, un alelo en las variedades cultivadas y 0 alelos en la especie silvestre). El cebador 4 (STG0007), produjo 3 alelos en los segregantes y tres alelos en las variedades comerciales y ningún alelo en la especie silvestre (Cuadro 4). En este último caso, la presencia de 3 alelos en los segregantes, no correspondería a un cruce de dos parentales y estaría sugiriendo cruzamientos multiparentales. Otra posibilidad es que la banda de 600 pb (muy grande para marcadores SSR) sea más bien un caso de falta de especificidad del cebador y no propiamente un alelo, lo cual se podría dilucidar mediante secuenciación de la mencionada banda.
En un estudio realizado por INIAP en 2006, se obtuvo 12 alelos para las 87 accesiones cultivadas y 27 alelos para las 11 especies silvestres. Podemos deducir que los marcadores utilizados en el presente estudio son más informativos que los analizados por INIAP a pesar de que en las dos investigaciones los marcadores no eran específicos para S. betaceum. No obstante, el mismo autor hace énfasis en que los marcadores utilizados lograron amplificar en especies silvestres emparentadas obteniendo resultados con un alto polimorfismo en estos materiales. Por lo que afirma que los SSR analizados son informativos y que es la homogeneidad del cultivo lo que explica el bajo polimorfismo del tomate de árbol cultivado.
Cuadro 4. Número de alelos (bandas) que amplificaron para los segregantes, comerciales y silvestre.
Código del cebador
Nombre del cebador
Número de alelos
Total Segre y comer
Segregantes (N=10)
Comerciales (N=4)
Silvestre (N=1)
Heterocigotos en los
segregantes
1 (At3g24160) 1 1 1 0 0 (0%)
2 (DMC42144A) 1 1 1 1 0(0%)
4 (STG0007) 3 3 3 0 2(20%)
5 (STI0014) 2 2 1 1 4(40%)
12 (STM1051) 4 1 3 2 1(10%)
14 (STM3012) 1 1 1 1 0(0%)
15 (STMCL13) 1 1 1 1 0(0%)
16 (T0869) 1 1 1 1 0(0%)
Total 14 11 12 7 Prom: 7(8.75%)
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4.2.3 Segregación de alelos
El promedio de heterocigosidad para los 10 segregantes incluidos en este estudio es de 8.75%, considerando los 8 loci analizados en cada uno de los 10 individuos segregantes. Los loci 4, 5 y 12, presentan niveles de polimorfismo de 20%, 40% y 10% de heterocigocidad, en tanto que el resto de loci analizados han fijado un alelo, que posiblemente corresponde al parental comercial, dado que la población en estudio es resultado de retrocruzas direccionadas hacia la recuperación del genotipo de dicho parental. Este valor de heterocigocidad hallado, permite especular que la población en estudio correspondería a un cuarto ciclo de retrocruza (valor esperado 6.25%).
Por otro lado, el nivel de recuperación del genotipo del parental comercial ha alcanzado el 95.63%, pues en los 10 individuos y los 8 loci analizados, solo 7 alelos encontrados (de 160 posibles) corresponderían al parental silvestre (S. unilobum), lo cual también coincidiría con un cuarto ciclo de retrocruza (valor esperado 96.875%). Obviamente estos datos deben ser tomados con precaución dado el tamaño de la muestra analizada.
En un estudio similar realizado en arroz (Oryza sativa) por Arnao et al. (2006), evaluaron 21 marcadores microsatélites polimórficos en las progenies (Retrocruza2Filial2 y RC3F1), de los cuales 11 resultaron ser homocigotos para el padre recurrente (PR) en todos los individuos analizados, indicando que la mayoría de los alelos del PR ya habían sido fijados en la RC2F2. Por otro lado, los 10 marcadores que segregaron presentaron un comportamiento un poco diferente al esperado en cada generación de retrocruza. En las generaciones RC2F2 y RC3F1 las proporciones esperadas de los loci de individuos homocigotos para el PR deberían ser 0,81 y 0,875, respectivamente. Quizás la desviación en la segregación observada, con respecto al esperado, se debió al bajo número de individuos escogidos para realizar los cruces, el cual fue de 30 para la RC2F2 y 20 para la RC3F1.
4.2.4 Identificación molecular de los segregantes y especies cultivadas - barcodes
El cebador 4 (STG0007) es polimórfico y detectó diferencias entre segregantes y los tomates comerciales. Los segregantes 1 y 2 son totalmente distintos al grupo de segregantes restantes, puesto que son los únicos que amplificaron doble banda (400-300) pb y (600-400) pb respectivamente. La banda de 400 pb está presente tanto en el grupo de segregantes como en los tomates comerciales. El tomate comercial mora presenta doble banda (600-400) pb, para este mismo cebador, siendo diferente a los tres cultivares comerciales restantes. El tomate silvestre no presenta ninguna banda (Cuadro 5).
Con el cebador 5 (STI0014) se puede diferenciar a los segregantes 2, 5, 6 y 8 del resto de segregantes porque amplificaron doble banda (500-110) pb (Cuadro 5).
Con el cebador 12 (STMCL13) se observa que solamente el segregante 10 es heterocigótico (400-380) pb, siendo diferente al grupo de segregantes restantes. En cuanto a los tomates comerciales este cebador también permite separar los tomates comerciales anaranjado gigante y amarillo puntón, siendo los únicos que presentan bandas de 380 pb y 400 respectivamente (Cuadro 5).
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Cuadro 5. Bandaje específico para algunos materiales en estudio (segregantes, variedades comerciales y silvestre)
CEBADOR
Segregantes Variedades comerciales Silvestre
S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 AG AP M RP Sil
bandas (pb)
4 (STG0007)
600
600
400 400 400 400 400 400 400 400 400 400 400 400 400
300
300
5
(STI0014)
500 500 500 500
110 110 110 110 110 110 110 110 110 110 110 110 110 110 110
12 (STM1051)
400 400 400 400 400 400 400 400 400 400
400
380 380
350 350 350
300
*AG=anaranjado gigante; AP= amarillo puntón; M=mora; RP=rojo puntón; Sil=silvestre.
Tomando en conjunto los tres marcadores polimórficos (4, 5, 12) se puede hacer un intento de construir un código de barras para la identificación de los individuos segregantes, comerciales y la especie silvestre, similar a lo que se muestra en el Cuadro 5. Cada color indica el mismo genotipo en los tres loci considerados. Según esto, por ejemplo, el color verde incluye a los segregantes S3, S4, S9 y la variedad comercial amarillo puntón, los cuales tienen el mismo genotipo y pueden diferenciarse del resto de segregantes y del resto de las variedades comerciales así como de la especie silvestre.
Los segregantes S1, S2, S7, S10 y todas las variedades comerciales, así como la especie silvestre tienen genotipos únicos, considerando los 3 loci polimórficos y se distinguen del resto de los individuos estudiados.
El Cuadro 5 también hace notar la dificultad para identificar el posible parental comercial de los segregantes en estudio, pues si bien la variedad amarillo puntón parecería el candidato con mayores posibilidades de hacerse acreedor a esta nominación, pues comparte con los segregantes el mayor número de alelos, sin embargo parecería que algunos de los segregantes también heredaron alelos de las otras variedades comerciales (ej. S2 alelo 600 del tomate Mora, S1 alelo 300 del Anaranjado Gigante, etc).
Finalmente, es importante mencionar que los resultados presentados en esta investigación podrían variar de alguna manera si se usara geles de poliacrilamida para la electroforesis, para la separación de los fragmentos amplificados por PCR, pues hay la posibilidad de que algunas de las bandas que aparecen como un solo alelo, en poliacrilamida podrían separarse en dos alelos. Consecuentemente, López y Sandoval (2010) mencionan que es mejor utilizar gel de poliacrilamida porque tiene un mayor poder de separación de los ácidos nucleicos de pequeño tamaño y una mejor resolución de tamaño de banda.
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5. CONCLUSIONES
De los ocho cebadores analizados en el material segregante y comercial de tomate de árbol se identificó tres cebadores polimórficos: 4 (STG0007), 5 (STI0014) y 12 (STM1051).
Se determinó en promedio 8.75 % de heterocigosidad para los 10 segregantes en estudio, considerando los 8 loci analizados en cada uno de los individuos. Los loci 4 (STG0007) y 5 (STI0014) y 12 (STM1051), presentan niveles de polimorfismo de 20 %, 40 % y 10 % de heterocigocidad respectivamente.
Se identificó un total de 14 alelos. El grupo de segregantes amplificaron 11 alelos, las variedades comerciales amplificaron 12 alelos y la especie silvestre amplificó 7 alelos. Los cebadores 12 (STM1051), 4 (STG0007) y 5 (STI0014), amplificaron 4, 3 y 2 alelos respectivamente.
Fue posible identificar diferencias en las muestras analizadas, es así que los segregantes S3, S4, S9 y la variedad comercial amarillo puntón, tienen el mismo genotipo, al igual que los segregantes S5, S6 y S8, mientras que los segregantes S1, S2, S7, S10 y todas las variedades comerciales, así como la especie silvestre tienen genotipos únicos y se distinguen del resto de los individuos estudiados.
La transferibilidad de cebadores específicos de papa S. tuberosum hacia la especie S. betaceum dio como resultado un 50.0% éxito (ocho cebadores). Estos cebadores podrían estar asociados a genes de resistencia a Phytoptora infestans
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6. RECOMENDACIONES
Es necesario incrementar la cantidad de cebadores con la finalidad de cubrir más áreas del genoma de tomate de árbol e identificar más polimorfismos.
Aunque los microsatélites son los más utilizados debido a las restricciones logísticas y de recursos, lo recomendable es iniciar con nuevos tipos de marcadores que en la actualidad han demostrado ser más eficientes, específicos y de mayor cobertura del genoma. Es esencial probar los marcadores específicos como son los marcadores ortólogos COSSI que fueron desarrollado para esta cruza específica (S. betaceum x S. unilobum) y que ya han sido probados en una población hermana (Colombia).
Se debe probar el cebador 4 (STG0007) y 12 (STM1051) con más segregantes ya que fueron los cebadores que más bandas amplificaron tanto en los segregantes como en las variedades comerciales.
Además se debe verificar en campo si existe la asociación de resistencia a Phythoptora infestans en los segregantes de tomate de árbol.
Aumentar las condiciones de astringencia del gel y las condiciones de amplificación del ADN en el termociclador. Para una mejor observación de bandas se debe amplificar los cebadores en geles de poliacrilamida.
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7. RESUMEN
El tomate de árbol Solanum betaceum es un frutal semiperenne originario de la región Andina, evidencias muestran que la mayoría de variedades cultivadas están relacionadas directamente con materiales silvestres nativos de Bolivia (Alminate, 2017). El cultivo de tomate de árbol se ha convertido en una alternativa rentable para el pequeño agricultor, en el caso de la provincia de Tungurahua se caracteriza por ser el principal cultivo permanente en unidades productivas familiares que promedian 0,26 ha sembradas (INEC, 2015). La comercialización del tomate de árbol se realiza a nivel local principalmente, sin embargo, estudios de mercadeo indican que posee posibilidades de posicionamiento en el mercado mundial, debido a dos aspectos importantes, el largo período de tiempo de almacenaje que presenta y la creciente demanda para su consumo en fresco (Tamba, 2014). A pesar de constituir una excelente alternativa de producción, no se han desarrollado estrategias tecnológicas para el mejoramiento genético del cultivo de tomate de árbol, que tomen ventaja de la diversidad genética existente. Estudios de diversidad realizados por Acosta (2012) utilizando marcadores moleculares determinaron que las variedades no están claramente diferenciadas y frecuentemente no se cultiva la más apropiada para cada localidad. En la Facultad de Ciencias Agrícolas-CADET existe un grupo de segregantes de tomate de árbol que aún no han sido caracterizados para aprovechar su potencial genético en el fitomejoramiento, por tal razón este estudio mediante la utilización de técnicas moleculares identificó las diferencias genotípicas existentes entre individuos que forman parte de un germoplasma. Para lo cual se recolectó muestras de tejido foliar del grupo de segregantes, de cuatro cultivares comerciales y de un silvestre. Para el análisis molecular se realizaron pruebas preliminares de transferibilidad en una muestra de tomate comercial con 16 cebadores específicos de papa (S. tuberosum), determinando que únicamente ocho fueron transferibles para tomate de árbol. La extracción de ADN se basó en el protocolo de Thermo Scientific Phire Plant Direct PCR Master Mix. Con ligeras modificaciones en el protocolo, la cuantificación del ADN se realizó mediante espectrofotometría UV con ayuda del nanodrop. Los cebadores fueron amplificados con las 15 muestras siguiendo el protocolo de Phire Plant Direct PCR Master Mix; los productos de la amplificación fueron resueltos en geles de agarosa al 1 %, a 100 voltios por 50 minutos y fotografiados bajo luz ultravioleta en el fotodocumentador (BIORAD). Mediante fotointerpretación de los geles de agarosa, se preparó una matriz con datos de tamaño de la banda y presencia o ausencia de bandas (alelos) para cada una de las plantas en estudio y por cada uno de los cebadores. Como resultados se obtuvo que los ocho cebadores analizados amplificaron un total de 14 bandas diferentes, de las cuales 9 correspondieron a los tres cebadores polimórficos y las 5 bandas restantes a los cebadores monomórficos. El cebador 12 (STM1051) amplificó 4 bandas en total (2 alelos en los segregantes, 3 alelos en las variedades cultivadas y 2 alelos en la especie silvestre), en tanto que el cebador 5 (STI0014) mostró solamente 2 alelos en total (2 alelos en los segregantes, un alelo en las variedades cultivadas y 0 alelos en la especie silvestre), mientras que el cebador 4 (STG0007) produjo 3 alelos en los segregantes y tres alelos en las variedades comerciales y ningún alelo en la especie silvestre. En cuanto a este cebador, la presencia de 3 alelos en los segregantes, no correspondería a un cruce de dos parentales y estaría sugiriendo cruzamientos multiparentales. Otra posibilidad es que la banda de 600 pb (muy grande para marcadores SSR) sea más bien un caso de falta de especificidad del cebador y no
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propiamente un alelo. En conjunto con los tres loci polimórficos, se construyó un código de barras, en donde se identificó diferencias en las muestras analizadas, es así que los segregantes S3, S4, S9 y la variedad comercial amarillo puntón, tienen el mismo genotipo, al igual que los segregantes S5, S6 y S8, mientras que los segregantes S1, S2, S7, S10 y todas las variedades comerciales, así como la especie silvestre tienen genotipos únicos y se distinguen del resto de los individuos estudiados.
Con base en los resultados obtenidos se recomienda incrementar la cantidad de cebadores con la finalidad de cubrir más áreas del genoma de tomate de árbol e identificar más polimorfismos, iniciar con nuevos tipos de marcadores que en la actualidad han demostrado ser más eficientes, específicos y de mayor cobertura del genoma, como son los marcadores ortólogos COSSI, probar el cebador 4 (STG0007) y 12 (STM1051) con más segregantes ya que fueron los cebadores que más bandas amplificaron tanto en los segregantes como en las variedades comerciales y para una mejor observación de bandas se debe amplificar los cebadores en geles de poliacrilamida.
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SUMMARY
The tree tomato Solanum betaceum is a semi-perennial fruit native to the Andean region, evidences show that the majority of cultivated varieties are directly related to wild materials native to Bolivia (Alminate, 2017). Tree tomato cultivation has become a profitable alternative for the small farmer, in the case of the province of Tungurahua is characterized as the main permanent crop in family productive units that average 0.26 ha sown (INEC, 2015). The commercialization of the tomato of tree takes place to local level mainly, nevertheless, studies of marketing indicate that it possess possibilities of positioning in the world-wide market, due to two important appearances, the long period of time of storage that presents and the increasing demand for its consumption in fresh (Tamba, 2014). Despite being an excellent production alternative, technological strategies have not been developed for the genetic improvement of the tomato tree crop, taking advantage of the existing genetic diversity. Diversity studies conducted by Acosta (2012) using molecular markers determined that the varieties are not clearly differentiated and the most appropriate one for each locality is often not cultivated. In the Faculty of Agricultural Sciences-CADET there is a group of tree tomato segregants that have not yet been characterized to take advantage of their genetic potential in plant breeding, for this reason this study using molecular techniques identified the genotypic differences between individuals that are part of a germplasm. For which samples of leaf tissue were collected from the group of segregants, four commercial cultivars and one wild. For the molecular analysis, preliminary transferability tests were carried out on a commercial tomato sample with 16 specific potato (S. tuberosum) primers, determining that only nine were transferable for tree tomato. The extraction of DNA was based on the protocol of Thermo Scientific Phire Plant Direct PCR Master Mix. DNA was quantified by UV spectrophotometry with the help of nanodrop. The primers were then amplified with the 15 samples following the Phire Plant Direct PCR Master Mix protocol, the products of the amplification were solved in 1% agarose gels, at 100 volts for 50 minutes and photographed under ultraviolet light in the photodocument (BIORAD). By means of photointerpretation of agarose gels, a matrix was prepared with data on band size and presence or absence of bands (alleles) for each of the plants under study and for each of the primers. As results, it was obtained that the eight primers analyzed amplified a total of 14 different bands, of which 9 corresponded to the three polymorphic primers and the remaining 5 bands to the monomorphic primers. Primer 12 (STM1051) amplified 4 bands in total (2 alleles in the segregants, 3 alleles in the cultivated varieties and 2 alleles in the wild species), while the primer 5 (STI0014) showed only 2 alleles in total (2 alleles in the segregants, one allele in the cultivated varieties and 0 alleles in the wild species), while the primer 4 (STG0007) yielded 3 alleles in the segregants and three alleles in the commercial varieties and no alleles in the wild species. Regarding this primer, the presence of 3 alleles in the segregates, would not correspond to a cross between two parents and would suggest multiparental crosses. Another possibility is that the 600 bp band (very large for SSR markers) is rather a case of lack of primer specificity and not properly an allele. In conjunction with the three polymorphic loci, a bar code was constructed, where differences were identified in the analyzed samples, so the segregants S3, S4, S9 and the yellow commercial variety puntón, have the same genotype, as well as the segregates S5, S6 and S8, while the segregates S1, S2, S7, S10 and all
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commercial varieties, as well as the wild species have unique genotypes and are distinguished from the rest of the individuals studied.
Based on the results obtained, it is recommended to increase the number of primers in order to cover more areas of the tomato tree genome and identify more polymorphisms, start with new types of markers that currently have proven to be more efficient, specific and with greater genome coverage, such as orthologous markers COSSI, try the primer 4 (STG0007) and 12 (STM1051) with more segregates since they were the primers that more bands amplified both in the segregants and commercial varieties and for better band observation the primers should be amplified in polyacrylamide gels.
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36
9. ANEXOS
Anexo 1. Identificación de los segregantes y variedades comerciales de tomate de árbol.
Anexo 2. Concentración de ADN de las muestras de tomate de árbol.
Identificación Concentración inicial ng/uL
Concentración final ng/uL
Segregante 1 1397.6 100.0
Segregante 2 595.8 100.0
Segregante 3 785.0 100.0
Segregante 4 654.1 100.0
Segregante 5 380.3 100.0
Segregante 6 424.4 100.0
Segregante 7 458.8 100.0
Segregante 8 226.3 100.0
Segregante 9 577.2 100.0
Segregante 10 590.6 100.0
Gigante anaranjado 290.8 100.0
Amarillo puntón 104.4 100.0
Mora 176.4 100.0
Rojo puntón 399.2 100.0
Silvestre 201.6 100.0
Numeración Código Identificación
1 S1 Segregante 1
2 S2 Segregante 2
3 S3 Segregante 3
4 S4 Segregante 4
5 S5 Segregante 5
6 S6 Segregante 6
7 S7 Segregante 7
8 S8 Segregante 8
9 S9 Segregante 9
10 S10 Segregante 10
11 AG Comercial anaranjado gigante
12 AP Comercial amarillo puntón
13 M Comercial mora
14 RP Comercial rojo puntón
15 Sil Silvestre
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Anexo 3. Cebadores con sus respectivas temperaturas de alineamiento.
Código del cebador
Nombre del cebador
Secuencia del cebador
Temp. Alineamiento
para papa
Temp. Alineamiento para tomate
de árbol
1F At3g24160F AGAGCAATATGGAGCAGAAGGTGTTG 60°C 61°C
1R At3g24160R TCGAATAATGGCTCAGCTACTGAAGG 62.2°C
2F DMC42144Af ACACCGCCGAGAAAGTCCAGCA 63.4°C 62°C
2R DMC42144Ar ATTTGATCTAGAACGTGCCCTGAGC 59.9°C
4F STG0007F ATTTGATCTAGAACGTGCCCTGAGC 56.6°C 55°C
4R STG0007R AGCTCTTTCGCCAAAATTGA 52.9°C
5F STI0014F AGAAACTGAGTTGTGTTTGGGA 54.5°C 55°C
5R STI0014R TCAACAGTCTCAGAAAACCCTCT 55.7°C
9F STLS1GF GGGTCAAGGGCTAATATAAGA 51.3°C 52°C
9R STLS1GR ACAAGGATTAAAAGCACCTCT 51.9°C
12F STM1051F TCCCCTTGGCATTTTCTTCTCC 57.4°C 57°C
12R STM1051R TTTAGGGTGGGGTGAGGTTGG 57.1°C
14F STM3012F CAACTCAAACCAGAAGGCAAA 53.8°C 53°C
14R STM3012R GAGAAATGGGCACAAAAAACA 52.2°C
15F STMCL13F CGGCATCTCAATCTCAGTCA 54.5°C 55°C
15R STMCL13F ATTACGCAACCGATCCAGTC 55.0°C
16F T0869F ATCAACTCAATGGCCGTCTC 55.0°C 55°C
16R T0869R TACAATCCGCATTTTCCACA 52.4°C
Anexo 4. Programa de PCR usado para la amplificación de los loci. La temperatura de alineamiento varía para cada par de cebadores.
Ciclo Tiempo Temperatura Ciclos
Desnaturalización inicial 98°C 5 min 1
Desnaturalización 98°C 5 seg 40
Alineamiento - 5 seg
Extensión 72°C 30 seg
Extensión final 72°C 4°C
1 min 1
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Anexo 5. Cebador 1 (At3g24160) presenta bandas monomórficas (alelo 400 pb) excepto el tomate silvestre.
Anexo 6. Cebador 2 (DMC42144A) presenta bandas monomórficas (alelo 600 pb) en las muestras en estudio.
Anexo 7. Cebador 5 (STI0014) presenta doble banda 500 pb y 110 pb.
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Anexo 8. Cebador 12 (STM1051) presenta bandas monomórficas para el grupo de segregantes excepto el 10 (alelo 400 pb), los tomates comerciales son polimórficos (alelos de 400, 380 y 350 pb), el tomate silvestre heterocigoto (alelos 350 y 300 pb).
Anexo 9. Cebador 14 (STM3012) presenta bandas monomórficas (alelo 200 pb) para todas las muestras en estudio.
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Anexo 10. Cebador 15 (STMCL13) presenta bandas monomórficas ( alelo 130 pb) en la muestras en estudio.
Anexo 11. Cebador 16 (T0869) presenta bandas monomórficas ( alelo 400 pb) en las muestras en estudio.
