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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
CARRERA DE QUIMICA FARMACEUTICA
Caracterización de emulsiones a escala nanométrica mediante la técnica de
Microscopia de Fuerza Atómica
Autor: Ana Lucia Marcillo Chiguano
Informe Final de Investigación para optar por el Título de:
QUÍMICA FARMACÉUTICA
Tutor: Dr. Pablo Mauricio Bonilla Valladares
Quito - Marzo, 2016
ii
Marcillo
Chiguano Ana Lucia (2016). Caracterización de
emulsiones a escala nanométrica mediante la
técnica de Microscopia de Fuerza Atómica.
Informe Final de Investigación para optar por el
título de Química Farmacéutica. Carrera de
Química Farmacéutica. Quito: UCE. 127p
iii
DEDICATORIA
Dedico a mis padres Esther y Carlos quienes han sido mi mayor motivación para culminar
este proyecto, en especial a mi madre por ser un ejemplo de lucha, esfuerzo y
perseverancia para conseguir una meta más en mi vida.
iv
AGRADECIMIENTOS
A la Universidad Central del Ecuador, por permitirme realizar la tesis en el Laboratorio
de Nano-estructuras, con la ayuda del Dr. Pablo Bonilla quien como tutor supo guiarme e
impartir sus conocimientos para la exitosa culminación de mi trabajo.
De igual manera a César por su apoyo incondicional, a mis amigas y amigos que me han
brindado su amistad durante todo este tiempo.
v
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
CARRERA DE QUIMICA FARMACEUTICA
Yo, Ana Lucia Marcillo Chiguano en calidad de autor del trabajo de investigación
realizado sobre “CARACTERIZACIÓN DE EMULSIONES A ESCALA
NANOMÉTRICA MEDIANTE LA TÉCNICA DE MICROSCOPÍA DE FUERZA
ATÓMICA”, por la presente autorizo a la UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR,
hacer uso de todos los contenidos que me pertenecen o de parte de los que contienen esta
obra, con fines estrictamente académicos o de investigación.
Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la presente autorización,
seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los artículos 5, 6, 8, 19
y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su Reglamento.
También autorizo a la Universidad Central del Ecuador a realizar la digitalización y
publicación de este trabajo de investigación en el repositorio virtual, de conformidad a lo
dispuesto en el Art. 144 de Ley Orgánica de Educación Superior.
__________________________
Ana Lucia Marcillo Chiguano
C.C. 1721738787
vi
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
CARRERA DE QUIMICA FARMACEUTICA
Por la presente, dejo constancia que he leído la tesis presentada por la señorita Ana Lucia
Marcillo Chiguano, para optar por el título profesional de Química Farmacéutica cuyo
tema es: CARACTERIZACIÓN DE EMULSIONES A ESCALA NANOMÉTRICA
MEDIANTE LA TÉCNICA DE MICROSCOPÍA DE FUERZA ATÓMICA, la misma que
reúne los requerimientos y los méritos suficientes para ser sometido a evaluación por el
Tribunal Calificador.
En la ciudad de Quito, a los 11 días del mes de febrero del 2016.
vii
viii
LUGAR DONDE SE REALIZO LA INVESTIGACIÓN
La presente investigación se llevó a cabo en la Universidad Central del Ecuador, Instituto
de Posgrado de Facultad de Ciencias Químicas en el Laboratorio de Nano-estructuras.
ix
CONTENIDO
pág.
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................. 1
CAPITULO I ......................................................................................................................... 2
1. EL PROBLEMA ............................................................................................................. 2
1.1. Planteamiento del problema ......................................................................................... 2
1.2. Formulación del problema ............................................................................................ 3
1.3. Preguntas directrices ..................................................................................................... 3
1.4. Objetivos de la investigacion ....................................................................................... 3
1.4.1. Objetivo general ...................................................................................................... 3
1.4.2. Objetivos especificos ............................................................................................... 3
1.5. Importancia y justificación de la investigacion ............................................................ 4
CAPITULO II ........................................................................................................................ 5
2. MARCO TEÓRICO ....................................................................................................... 5
2.1. Antecedentes de la investigacion ................................................................................. 5
2.2. Fundamentación teórica ............................................................................................... 6
2.2.1. Nano-emulsiones ..................................................................................................... 6
2.2.1.1. Características de las nano-emulsiones ................................................................. 7
2.2.1.2. Clasificación .......................................................................................................... 8
2.2.1.3. Componentes de una nano-emulsión ..................................................................... 8
2.2.1.4. Caracterización de nano-emulsiones ..................................................................... 8
a) Método para determinar tamaño de gota ........................................................................ 9
Dispersión de Luz Dinámica (DLS) .................................................................................... 9
b) Distribución de tamaño de gota .................................................................................... 10
c) Método para determinar morfología de la nano-emulsión ........................................... 11
Microscopia óptica y electrónica ....................................................................................... 11
Criofijación ........................................................................................................................ 12
Replicación por criofractura y grabado por congelamiento .............................................. 13
d) Método para determinar potencial z de la nano-emulsión ............................................ 15
2.2.2. Microscopio de Fuerza Atómica ............................................................................ 16
2.2.2.1. Componentes del Microscopio de Fuerza Atómica ............................................ 16
Cantilever y punta.............................................................................................................. 17
Escáner.. ............................................................................................................................ 19
Actuador piezoeléctrico ..................................................................................................... 19
x
2.2.2.2. Esquema de funcionamiento del instrumento AFM. ........................................... 20
2.2.2.3. Modos de operación del microscopio de fuerza atómica AFM .......................... 22
a) Modo contacto .............................................................................................................. 23
b) Modo No-contacto ........................................................................................................ 24
c) Modo de contacto intermitente o Tapping .................................................................... 25
2.2.2.4. Ventajas y desventajas de los modos Contacto, No-contacto y Tapping ............ 26
2.2.2.5. Resolución del AFM ........................................................................................... 27
2.2.2.6. Aplicaciones del Microscopio de Fuerza Atómica ............................................. 28
2.2.2.7. Comparación entre AFM y otras técnicas de imagen ......................................... 31
2.3. FUNDAMENTACIÓN LEGAL ................................................................................ 32
2.3.1. NIOSH (Estados Unidos) ...................................................................................... 32
2.3.2. Comisión Europea ................................................................................................. 32
2.3.3. Norma INEN (ISO/TR 12885:2008, IDT) ............................................................ 32
2.3.3.1. Recogida de muestras para caracterización de materiales .................................. 32
2.3.3.2. Caracterización de la muestra ............................................................................. 33
2.4. Hipótesis del trabajo ................................................................................................... 33
2.5. Sistema de variables ................................................................................................... 33
CAPITULO III ..................................................................................................................... 34
3.1. METODOLOGÍA ...................................................................................................... 34
3.1.1. Diseño de la investigación ..................................................................................... 34
3.1.2. Población y Muestra .............................................................................................. 34
3.1.3. Diseño Experimental ............................................................................................. 34
3.1.4. Matriz de Operacionalización de las Variables ..................................................... 35
3.1.5. Técnicas e Instrumentos de Recolección de Datos ................................................ 35
3.1.5.1. Técnicas de Recolección de Datos ...................................................................... 35
Limpieza de las placas de vidrio ....................................................................................... 35
Recubrimiento de placas.................................................................................................... 36
Elaboración de la muestra ................................................................................................. 37
3.1.5.2. Instrumento de Recolección de Datos ................................................................. 38
Medición del diámetro de gota por AFM .......................................................................... 38
3.1.6. Técnicas de Procesamiento y Análisis de Datos ................................................... 39
3.1.6.1. Técnica de Procesamiento de Datos .................................................................... 39
Diseño Factorial................................................................................................................. 39
3.1.6.2. Análisis de datos .................................................................................................. 40
Diferencia mínima significativa ........................................................................................ 41
CAPITULO IV .................................................................................................................... 43
xi
4. Análisis y Discusión de Resultados .............................................................................. 43
4.1. Limpieza de las placas de vidrio ................................................................................ 43
4.2. Recubrimiento de placas de vidrio ............................................................................. 43
4.3. Elaboración de muestras ............................................................................................. 44
4.4. Medición de diámetro de gota en AFM ...................................................................... 44
4.5. Análisis estadístico ..................................................................................................... 44
4.5.1. Análisis estadístico de la emulsión w/o, del sistema aceite de palma y agua. ...... 44
4.5.2. Análisis estadístico del sistema de emulsión o/w, aceite de soya y agua. ............. 49
CAPITULO V ...................................................................................................................... 54
5. Conclusiones y Recomendaciones ................................................................................ 54
5.1. Conclusiones .............................................................................................................. 54
5.2. Recomendaciones ....................................................................................................... 56
6. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ......................................................................... 57
7. ANEXOS ...................................................................................................................... 60
xii
LISTA DE TABLAS
pág.
Tabla 2.1 Importancia del área interfacial ........................................................................... 11
Tabla 2.2 Comparación entre AFM y STM ......................................................................... 31
Tabla 2.3 Comparación entre AFM y SEM ......................................................................... 31
Tabla 2.4 Comparación entre AFM y TEM ......................................................................... 31
Tabla 2.5 Variables independientes que influyen en el tamaño de gota .............................. 33
Tabla 3.1 Matriz de Operacionalización de las Variables ................................................... 35
Tabla 3.2 Materiales para limpieza de placas de vidrio ....................................................... 36
Tabla 3.3 Materiales para recubrimiento de placas ............................................................. 36
Tabla 3.4 Materiales para el tratamiento de superficies ..................................................... 39
Tabla 3.5 Factores y niveles ............................................................................................... 39
Tabla 3.6 Diseño factorial 2 ×2 para emulsión o/w ............................................................. 40
Tabla 3.7 Diseño factorial 2×2 para emulsión w/o .............................................................. 40
Tabla 3.8 Datos de diámetros de partícula para ANOVA ................................................... 41
Tabla 3.9 Reporte de datos de ANOVA .............................................................................. 41
Tabla 3.10 Reporte de datos de la prueba Diferencia Mínima Significativa ....................... 42
Tabla 4.1 Datos de diámetros de gota para ANOVA ......................................................... 44
Tabla 4.2 Análisis de varianza de los Diámetros de gota sistema aceite de palma-agua ... 45
Tabla 4.3 Rangos establecidos por la prueba de Diferencia Mínima Significativa para
Diámetros y Temperatura. ................................................................................................... 45
Tabla 4.4 Rangos establecidos por la prueba de Diferencia Mínima Significativa para
Diámetros y Superficie ........................................................................................................ 46
Tabla 4.5 Diámetros de gota de la emulsión o/w ................................................................. 49
Tabla 4.6 Análisis de varianza de los Diámetros de gota sistema aceite de soya-agua ...... 49
Tabla 4.7 Rangos establecidos por la prueba de Diferencia Mínima Significativa para
Diámetros y Temperatura .................................................................................................... 49
Tabla 4.8 Rangos establecidos por la prueba de Diferencia Mínima Significativa para
Diámetros y Superficie ........................................................................................................ 50
xiii
LISTA DE GRAFICOS
pág.
Figura 2.1 Fluctuaciones de intensidad para partículas grandes y pequeñas. ..................... 10
Figura 2.2 Esquema de un equipo para medición de DLS ................................................... 10
Figura 2.3 Emulsión aceite en agua ..................................................................................... 12
Figura 2.4 Procedimiento para la formación de réplicas por criofractura ........................... 14
Figura 2.5 Región de inestabilidad en cuanto al pH, en este caso entre pH 4 hasta pH 7.5.15
Figura 2.6 Microscopio de Fuerza Atómica ........................................................................ 16
Figura 2.7 Punta del microscopio de fuerza atómica ........................................................... 17
Figura 2.8 Puntas empleadas en AFM ................................................................................. 18
Figura 2.9 Cantilever ........................................................................................................... 18
Figura 2.10 Escáner separado de x-y scanner ...................................................................... 19
Figura 2.11. Actuador piezoeléctrico ................................................................................... 19
Figura 2.12 Magnitud de deflexión del cantiléver como función de la distancia entre la
punta y la muestra. ............................................................................................................... 21
Figura 2.13 Esquema de funcionamiento del AFM ............................................................. 22
Figura 2.14 Esquema del principio básico de operación de un AFM y en modo contacto . 23
Figura 2.15 Modo no contacto ............................................................................................. 24
Figura 2.16 Representación de AFM en modo tapping ....................................................... 25
Figura 2.17 Efecto de la geometría de la punta en la resolución de un AFM ...................... 27
Figura 2.18 Quantum Dots-Dispositivos Fotónicos ............................................................ 28
Figura 2.19 Nano-estructuras magnéticas estructuras Co Antidot ..................................... 28
Figura 2.20 Superficies Óxido de Zinc ................................................................................ 29
Figura 2.21 Células solares- Fotoconductividad .................................................................. 29
Figura 2.22 Liposomas ........................................................................................................ 30
Figura 2.23 Vesículas lipídicas y bicapa en líquido fotografiado ........................................ 30
Figura 3.1 Diagrama de preparación de las muestras .......................................................... 37
Figura 3.2 Lectura de muestras en el Microscopio de Fuerza Atómica .............................. 38
Figura 4.1 Imágenes de placas después de la limpieza ........................................................ 43
Figura 4.2 Imágenes de placas con recubrimiento de barniz ............................................... 43
Figura 4.3 Intervalos de medias de los diámetros de la emulsión w/o con la temperatura de
la Diferencia Mínima Significativa al 95% ......................................................................... 45
xiv
Figura 4.4 Interacción de medias de los diámetros de la emulsión tipo w/o con la
temperatura y la superficie de la Diferencia Mínima Significativa al 95% ......................... 46
Figura 4.5 Intervalos de medias de los diámetros de la emulsión w/o con la superficie de la
Diferencia Mínima Significativa al 95% ............................................................................. 46
Figura 4.6 Interacción de medias de los diámetros de la emulsión tipo w/o con la superficie
y la temperatura de la Diferencia Mínima Significativa al 95%. ......................................... 47
Figura 4.7 Distribución normal e Histograma de los diámetros de gota del sistema w/o a
una temperatura de 25ºC y superficie vidrio sin recubrimiento. ......................................... 47
Figura 4.8 Distribución normal e Histograma de los diámetros de gota del sistema w/o a
una temperatura de 40ºC y superficie vidrio sin recubrimiento. ......................................... 47
Figura 4.9 Distribución normal e Histograma de los diámetros de gota del sistema w/o a
una temperatura de 25ºC y superficie vidrio barniz. ............................................................ 48
Figura 4.10 Distribución normal e Histograma de los diámetros de gota del sistema w/o a
una temperatura de 40ºC y superficie vidrio barniz. ............................................................ 48
Figura 4.11 Intervalos de medias de los diámetros de la emulsión o/w con la temperatura
de la Diferencia Mínima Significativa al 95%. .................................................................... 50
Figura 4.12 Interacción de medias de los diámetros de la emulsión tipo o/w con la
temperatura y la superficie de la Diferencia Mínima Significativa al 95% ......................... 50
Figura 4.13 Intervalos de medias de los diámetros de la emulsión o/w con la Superficie de
la Diferencia Mínima Significativa al 95%. ........................................................................ 51
Figura 4.14 Interacción de medias de los diámetros de la emulsión tipo o/w con la
superficie y la temperatura de la Diferencia Mínima Significativa al 95% ......................... 51
Figura 4.15. Distribución normal e Histograma de los diámetros de gota del sistema o/w a
una temperatura de 25ºC y superficie vidrio sin recubrimiento. ......................................... 51
Figura 4.16. Distribución normal e Histograma de los diámetros de gota del sistema o/w a
una temperatura de 40ºC y superficie vidrio sin recubrimiento. ......................................... 52
Figura 4.17. Distribución normal e Histograma de los diámetros de gota del sistema o/w a
una temperatura de 25ºC y superficie vidrio barniz ............................................................. 52
Figura 4.18. Distribución normal e Histograma de los diámetros de gota del sistema o/w a
una temperatura de 25ºC y superficie vidrio barniz ............................................................. 52
xv
LISTA DE ANEXOS
pág.
Anexo 1. Instrumento de recolección de datos .................................................................... 60
Anexo 2: Tabla de mediciones de las muestras w/o ............................................................ 61
Anexo 2.1 Muestra 1 sistema w/o aceite de palma-agua a temperatura de 25°C y superficie
vidrio sin recubrimiento. ...................................................................................................... 61
Anexo 2.2 Muestra 2 sistema w/o aceite de palma-agua a temperatura de 25°C y superficie
vidrio sin recubrimiento. ...................................................................................................... 63
Anexo 2.3 Muestra 3 sistema w/o aceite de palma-agua a temperatura de 25°C y superficie
vidrio sin recubrimiento. ...................................................................................................... 65
Anexo 2.4 Muestra 1 sistema w/o aceite de palma-agua a temperatura de 40°C y superficie
vidrio sin recubrimiento. ...................................................................................................... 67
Anexo 2.5 Muestra 2 sistema w/o aceite de palma-agua a temperatura de 40°C y superficie
vidrio sin recubrimiento. ...................................................................................................... 69
Anexo 2.6 Muestra 3 sistema w/o aceite de palma-agua a temperatura de 40°C y superficie
vidrio sin recubrimiento. ...................................................................................................... 71
Anexo 2.7 Muestra 1 sistema w/o aceite de palma-agua a temperatura de 25°C y superficie
vidrio barniz. ........................................................................................................................ 73
Anexo 2.8 Muestra 2 sistema w/o aceite de palma-agua a temperatura de 25°C y superficie
vidrio barniz. ........................................................................................................................ 75
Anexo 2.9 Muestra 3 sistema w/o aceite de palma-agua a temperatura de 25°C y superficie
vidrio barniz. ........................................................................................................................ 77
Anexo 2.10 Muestra 1 sistema w/o aceite de palma-agua a temperatura de 40°C y
superficie vidrio barniz. ....................................................................................................... 79
Anexo 2.11 Muestra 2 sistema w/o aceite de palma-agua a temperatura de 40°C y
superficie vidrio barniz. ....................................................................................................... 81
Anexo 2.12 Muestra 3 sistema w/o aceite de palma-agua a temperatura de 40°C y
superficie vidrio barniz. ....................................................................................................... 83
Anexo 3: Tabla de mediciones de las muestras o/w ............................................................ 85
Anexo 3.1 Muestra 1 sistema o/w aceite de soya-agua a temperatura de 25°C y superficie
vidrio sin recubrimiento. ...................................................................................................... 85
xvi
Anexo 3.2 Muestra 2 sistema o/w aceite de soya-agua a temperatura de 25°C y superficie
vidrio sin recubrimiento. ...................................................................................................... 87
Anexo 3.3 Muestra 3 sistema o/w aceite de soya-agua a temperatura de 25°C y superficie
vidrio sin recubrimiento. ...................................................................................................... 89
Anexo 3.4 Muestra 1 sistema o/w aceite de soya-agua a temperatura de 40°C y superficie
vidrio sin recubrimiento. ...................................................................................................... 91
Anexo 3.5 Muestra 2 sistema o/w aceite de soya-agua a temperatura de 40°C y superficie
vidrio sin recubrimiento. ...................................................................................................... 93
Anexo 3.6 Muestra 3 sistema o/w aceite de soya-agua a temperatura de 40°C y superficie
vidrio sin recubrimiento. ...................................................................................................... 95
Anexo 3.7 Muestra 1 sistema o/w aceite de soya-agua a temperatura de 25°C y superficie
vidrio barniz. ........................................................................................................................ 97
Anexo 3.9 Muestra 3 sistema o/w aceite de soya-agua a temperatura de 25°C y superficie
vidrio barniz. ...................................................................................................................... 101
Anexo 3.10 Muestra 1 sistema o/w aceite de soya-agua a temperatura de 40°C y superficie
vidrio barniz. ...................................................................................................................... 103
Anexo 3.11 Muestra 2 sistema o/w aceite de soya-agua a temperatura de 40°C y superficie
vidrio barniz ....................................................................................................................... 105
Anexo 3.12 Muestra 3 sistema o/w aceite de soya-agua a temperatura de 40°C y superficie
vidrio barniz ....................................................................................................................... 107
xvii
LISTA DE ABREVIATURAS
AFM: Atomic Force Microscope
DLS: Dispersión de Luz Dinámica
crio-ET: tomografía crioelectrónica
nm: nanómetro (s) (1 nm = 10−9
metros)
mL: mililitro
uL: microlitro
Hz: Hertz
µm: micrómetros
xviii
RESUMEN
El avance constante de la nanotecnología y las nano-ciencias requiere conocer las
diferentes técnicas de análisis de nano-estructuras, y la microscopia de fuerza atómica, es
uno de ellos. Para llevar a cabo un análisis se conoció el funcionamiento del equipo,
diferentes aplicaciones y dificultades.
En el presente trabajo de investigación se caracterizó, emulsiones o/w y w/o por
microscopia de fuerza atómica y se determinó morfología y diámetro de gota en distintas
superficies y temperaturas.
Los cubreobjetos como superficie, fue pre-lavada con disolventes orgánicos e inorgánicos
para eliminar las impurezas existentes, para posteriormente ser utilizado como placas con o
sin revestimiento adicional y luego se colocó la muestra de cada emulsión. Las placas con
barniz, se secó durante 24 horas en una placa de vidrio. La medición de cada muestra se
realizó en el microscopio de fuerza atómica, en modo contacto. De cada sistema se obtuvo
los diámetros y las imágenes en altura y 3D, se aplicó un tratamiento estadístico y se
determinó si la temperatura y la superficie, influyen o no en la lectura de una placa. Las
condiciones óptimas para leer una emulsión tipo w/o, fue a una temperatura de secado de
25°C y superficie de vidrio con barniz. Mientras que para la emulsión o/w se encontró que
se debe realizar a una temperatura de 25°C en una superficie de vidrio.
Términos Descriptivos: Nanoemulsiones/Diámetros/Imágenes/Temperatura/Superficie
xix
ABSTRACT
The steady advance of nanotechnology and nanoscience requires knowing the different
techniques of analysis of nano-structures, and the atomic force microscopy is one of them.
For carrying out an analysis was learned operation of the equipment, the different
applications and difficulties.
In the present work of investigation emulsions o/w and w/o were characterized by atomic
force microscopy and was determined morphology and droplet diameter in different
surfaces and temperatures.
The samples analyzed were emulsions o/w soybean oil-water and emulsions w/o palm oil-
water system. Coverslips as surface was pre-washed with organic and inorganic solvents to
remove existing impurities, later to be used as plates with or without additional coating and
then the sample of each emulsion was placed. The plates with varnish, which was dried for
24 hours in a glass plate.
The measurement of each sample was performed in the atomic force microscope, in
contact mode. Of each system were obtained diameters and height and 3D images, a
statistical analysis was applied to determine the temperature and the surface, whether or
not affects the reading of a plate. Optimal conditions for reading an emulsion type w/o
were dry temperature of 25 ° C and glass surface with varnish. While for o/w emulsion at a
temperature of 25 ° C in a glass surface.
KEYWORDS: nanoemulsions/ diameters/images/ temperature/ surface
1
INTRODUCCIÓN
La presente investigación tuvo como objetivo desarrollar una técnica que permita
determinar las condiciones adecuadas para lograr caracterizar una emulsión a escala
nanométrica aplicando la técnica de microscopia de fuerza atómica.
Se estudió el funcionamiento del microscopio de fuerza atómica y la factibilidad del
mismo para realizar lecturas de este tipo de muestras.
Las muestras que se utilizaron fueron emulsiones w/o y o/w las cuales se sometieron a
cambios de temperatura y superficie, logrando obtener diámetros de emulsiones y a los
cuales se aplicó un análisis estadístico para determinar si existe una diferencia mínima
significativa entre los factores mencionados.
En el Capítulo I se presenta el problema, el planteamiento del problema, la
formulación del problema, las preguntas directrices, los objetivos, la importancia y
justificación para esta investigación.
En el Capítulo II se abordan los aspectos teóricos relacionados con las nano-
emulsiones, sus características y caracterización de las mismas, así como el esquema
de funcionamiento, composición, modos de lectura, ventajas y desventajas entre modos
y aplicaciones del microscopio de fuerza atómica.
En el Capítulo III se describe la metodología que se aplicó a esta investigación, el
diseño experimental propuesto, la matriz de operacionalización de las variables
implicadas, las técnicas e instrumentos con los que se realizó la recolección de los
diámetros de gota, así como la técnica con los que se procesó y analizo los datos
obtenidos.
En el Capítulo IV se analizó los resultados obtenidos desde la recolección de datos
hasta el procesamiento y análisis de los mismos para las respectivas discusiones.
En el Capítulo V se presenta las conclusiones y recomendaciones que se obtuvieron en
la investigación.
2
CAPITULO I
1. EL PROBLEMA
1.1. Planteamiento del problema
Las nano-emulsiones, obedecen las leyes de la física cuántica por lo que sus
propiedades mecánicas, ópticas y eléctricas son totalmente diferentes a emulsiones de
tamaño micrométrico. Por lo que resulta difícil manejarlas y en cuanto a su análisis no
existe una técnica directa y sencilla para la determinación de tamaño de gota a escala
nanométrica. Debido a estas características las nano-emulsiones se ven afectadas por
el aumento del movimiento browniano que no permite distinguirlas mediante
instrumentos ópticos simples.
Las técnicas actuales para determinar la topografía de una emulsión requieren procesos
complicados y condiciones extremas de tratamiento, como por ejemplo, la técnica de
crioscopía en donde la muestra se enfría a máxima velocidad mediante nitrógeno
líquido pasando por un sistema de criofijación, este procedimiento es usado en las
técnicas de Microscopia Electrónica de Barrido (por sus siglas en ingles SEM) y
Microscopia Electrónica de Transmisión (por sus siglas en ingles TEM) las cuales son
costosas y se necesita de personal capacitado y equipo adecuado. (Microscopia, 2012)
Por ello nace la necesidad de una técnica versátil y sensible, para lograr resultados
confiables, replicables y publicables. Creándose así, el Microscopio de Fuerza
Atómica (Atomic Force Microscope por sus siglas en inglés (AFM)) el cual es una
herramienta indispensable para la investigación en nanotecnología, permitiendo
realizar análisis más a fondo de las propiedades de los materiales y fenómenos
interfaciales en términos de nano-escala, logrando caracterizar las propiedades
mecánicas, magnéticas, ferroeléctricos, y piezoeléctricos con alta resolución espacial.
Por lo expuesto anteriormente el propósito de esta investigación fue conocer si las
condiciones de superficie y temperatura tienen un efecto sobre la impresión de gotas de
una emulsión.
De esta manera, determinar el tamaño y morfología de una emulsión mediante la
técnica de Microscopia de Fuerza de Atómica.
3
1.2. Formulación del problema
La técnica convencional para caracterizar nano-emulsiones es la crioscopia, la misma
que requiere de equipo de alta tecnología y de personal capacitado.
Al contar con el microscopio de fuerza atómica se plantea la posibilidad de desarrollar
una técnica para caracterizar emulsiones a escala nanométrica utilizando materiales y
equipos que se dispone en el laboratorio y lograr así garantizar el alcance de los
objetivos.
1.3. Preguntas directrices
¿Es factible determinar las condiciones adecuadas para caracterizar emulsiones a
escala nanométrica mediante la técnica de Microscopía de Fuerza Atómica?
¿Al variar parámetros como la temperatura y el tipo de superficie se logrará realizar
mediciones en el equipo de fuerza atómica?
1.4. Objetivos de la investigación
1.4.1. Objetivo general
Caracterizar emulsiones w/o y o/w a escala nanométrica mediante la técnica
microscopía de fuerza atómica.
1.4.2. Objetivos específicos
- Conocer el funcionamiento y aplicaciones del equipo de Microscopio de Fuerza
Atómica.
- Realizar lecturas de impresiones de gotas de nano-emulsiones a base de aceite de
soya en sistema o/w y aceite de palma en sistema w/o, en los diferentes tipos de
superficies de vidrio (hidrofílica) y vidrio con recubrimiento de barniz.
- Estudiar el efecto de la temperatura a 25°C y 40°C para lograr impresiones sobre
placa de gotas de emulsiones en los diferentes sistemas.
- Identificar los parámetros que intervienen en la determinación del diámetro de
gota de emulsiones a escala nanométrica en el Microscopio de Fuerza Atómica.
4
1.5. Importancia y justificación de la investigación
En los últimos años en nuestro país se está dando paso a la investigación en nano-
ciencia y nanotecnología, lo que implica profundizar en estas áreas del conocimiento y
dominar las diferentes técnicas empleadas para identificar un material fabricado a
escala nanométrica.
El conocer el funcionamiento y manejo de los equipos usados en este proceso,
permitirá realizar investigaciones innovadoras sobre nano-materiales.
El área de interés para esta investigación se enfocó en nano-emulsiones obtenidas a
partir de aceites vegetales, que serán usadas como sistema transportador de fármacos.
Su caracterización topográfica es de mucha importancia ya que permitirá conocer la
morfología y tamaño de las gotas formadas. La correcta preparación de la misma para
ser analizada mediante la técnica de Microscopía de Fuerza Atómica (AFM) es un paso
imprescindible.
Comparada con las técnicas actuales el AFM proporciona imágenes tridimensionales
de superficies con alta resolución espacial en tiempo real. Sin necesidad de una
preparación excesivamente cara (en recubrimientos de oro, titanio) de muestras no
conductoras, es posible observar y brindar una información completa de las que se
obtienen en dos dimensiones a partir de secciones transversales de muestras en
microscopia electrónica.
En la tecnología actual, el AFM es el sistema más económico para lograr resolución
atómica sobre cualquier tipo de material y con un mínimo de preparación de la
muestra; sin embargo existen ciertas limitaciones impuestas sobre todo por las
características de las muestras, que dificultan la obtención de imágenes de calidad con
resolución espacial atómica, siendo además importante la adecuada elección de los
parámetros de medida para cada muestra en particular. (Arroyave M. , 2002)
Con el objeto de obtener imágenes de alta resolución de las nano-emulsiones se
realizaron ensayos experimentales con dos tipos de sistemas o/w y w/o que se
sometieron a superficies hidrofílicas, recubiertas con barniz y a diferentes temperaturas
con el fin de caracterizarlas topográficamente.
5
CAPITULO II
2. MARCO TEÓRICO
2.1. Antecedentes de la investigación
Se han encontrado diferentes investigaciones en donde se determinar la forma y el
tamaño de una nano-emulsión los cuales se mencionan en los siguientes artículos.
Segun la investigación Síntesis, morfología y reología de núcleo-corteza de una
emulsión acrílica de silicona estabilizadas con tensioactivo polimerizable, indica que
las películas del polímero fueron preparadas mediante el recubrimiento por
centrifugación en una placa de vidrio recién escindido. La película del polímero se
secó durante unos minutos al aire y a temperatura ambiente antes de su observación
por microscopía de fuerza atómica (AFM). Todas las mediciones se hicieron en el
modo de contacto. (Wang & R, 2010)
En el año 2012 la investigacion, Formulación y caracterización de Nano-emulsión
recubiertas con aceite de neem (Azadirachta indica) determinaron la forma y el
tamaño de la nano-emulsión con aceite de neem utilizando AFM. En este estudio las
nano-emulsiones se diluyeron con agua. La gota de la nano-emulsión diluida, se colocó
sobre un portaobjetos de vidrio y se secaron en el horno para luego llevarse a cabo los
estudios en AFM. (Karthikeyan & Jeeva, 2012)
La investigación Los Efectos de las Pequeñas y grandes moléculas emulsionadoras en
las características de nano-emulsiones de b-caroteno preparado a alta presión de
homogenización, estudiaron la estructura de las nano-emulsiones de b-caroteno
mediante AFM. Las muestras fueron diluidas y luego se depositaron sobre sustratos de
mica recién escindidas, y secadas al aire. Las diferentes regiones de mica fueron
escaneados por AFM con la sonda Si3N4, aplicando corriente alterna en el modo de
tapping. Presentándose la imagen en plano y la imagen tridimensional de la morfología
de la superficie. (Like & Duoxia, 2010)
En comparación con la microscopía electrónica de barrido (SEM) la observación de
muestras criofijadas puede dotarse de un sistema que es capaz de tratar a la muestra a
muy baja temperatura de forma que su preservación estructural es máxima y la
6
capacidad de trabajo del microscopio no afecta en absoluto, pues ya no tratamos con
una muestra hidratada sino congelada.
El proceso se inicia enfriando la muestra a la máxima velocidad posible mediante
nitrógeno líquido. Luego se lleva a un sistema de criofijación, donde se puede
fracturar, sublimar el hielo superficial y recubrir con oro o carbono para su
observación y/o análisis.
2.2. Fundamentación teórica
La nanotecnología y la nano-ciencia son ramas nuevas en el país, que va generando
conocimiento. Se aplica en medicina, comunicaciones, el transporte, los recursos
energéticos, y otros elementos fundamentales en la vida de hombres y mujeres. Las
aplicaciones que tiene a nivel industrial (fármacos, metalmecánica) son un salto al
futuro”. Por lo que conocer las técnicas de análisis para este tipo de nano-materiales
hace indispensable saber el manejo del equipo para realizar mediciones a escala
nanométrica.
Dentro de los equipos y técnicas de análisis de nano-materiales se encuentra el
microscopio de fuerza atómica el cual es una herramienta indispensable para la
caracterización de superficies de materiales. Además AFM posee una altísima
resolución de manera tal que permiten visualizar la materia a nivel atómico.
2.2.1. Nano-emulsiones
Definición.- son dispersiones de aceite y agua hechas con tensioactivos, moléculas co-
surfactante. En muchos aspectos, son versiones a pequeña escala de emulsiones. Sin
embargo, los tamaños de las gotitas son muy pequeñas, aproximadamente 100 veces
más pequeño que los tamaños típicos de emulsión de gotas.
Una emulsión consta de pequeñas gotas de un líquido suspendidas en otro líquido
continuo. (Mc Bain, 1996).
Una emulsión es sistema heterogéneo líquido-líquido formados por glóbulos líquidos
insolubles, dispersados en una fase liquida. (Helman, 1982)
Una emulsión es un sistema constituido por dos fases líquidas inmiscibles, una de las
cuales se dispersa a través de la otra en forma de gotas muy pequeñas. (Ashford, 2004)
7
Una emulsión es un sistema disperso en el que las fases son líquidas no miscibles o
parcialmente miscibles. Los glóbulos del líquido dispersado son generalmente entre
0,1µ de diámetro. (Shaw, 1990).
Se denomina fase dispersa a la fase en forma de gotitas pequeñas y fase continua a
aquella en la que se encuentran suspendidas las gotitas.
2.2.1.1. Características de las nano-emulsiones
Están formadas por gotitas de 20 a 500 nm de diámetro y constituyen sistemas
inherentemente inestables; los glóbulos de menor tamaño demuestran un
comportamiento coloidal y la estabilidad de una dispersión coloidal hidrófoba.
Las nano-emulsiones son realmente sistemas monofásicos en el que la estructura
contiene fusionado bolas de aceite y bolas de agua fusionadas, sin fase realidad
dispersa.
Las nano-emulsiones son flexibles cerca de estructuras de curvatura cero cuya
estabilidad termodinámica implica una tensión ultra baja interfacial de manera que la
deformación interfacial es fácil.
La fase dispersa tiene tamaños de 10-200 nm.
Tienen una energía libre de formación NEGATIVA, son termodinámicamente
inestables y estables cinéticamente. Como se indica en la ecuación (1).
∆𝑮 = 𝜸𝑰𝑬∆𝑨 − 𝑻∆𝑺 (1)
∆𝑮 = Energía libre de Gibss
𝜸𝑰𝑬∆𝑨 = Energía Interfacial
∆𝑺 = Entropía
𝑻 = temperatura
Las nano-emulsiones exhiben las propiedades típicas de todas las emulsiones pero
con algunas características específicas su tamaño de gota sub-micrométrico las hace
transparentes o por lo menos translúcidas dependiendo de la distribución de tamaño
de gota y del contenido de fase interna. Ya que la interacción con la luz es muy
sensible al tamaño de gota es muy probable que se produzcan cambios en su aspecto
según evolucione el tamaño de gota, es decir, se produzca alguna desestabilización.
8
Las nano-emulsiones no son sistemas particularmente viscosos cuando poseen poca
proporción de fase interna. Sin embargo, es bien conocido que la viscosidad de las
emulsiones aumenta a medida que el tamaño de gota disminuye, así, y
contrariamente a las macro-emulsiones, las nano-emulsiones podrían ser viscosas a
un porcentaje de fase interna entre 40-50% especialmente si son poco poli-
dispersas, en cuyo caso frecuentemente son denominadas emulsiones-gel.
Debido a su pequeño tamaño de gota, las nano-emulsiones tienen mayor área
interfacial llevan mejor la función de transporte de calor y de sustancias pero se
requiere una mayor cantidad de surfactante para estabilizarlas, particularmente si
se toma en cuenta el recubrimiento interfacial.
Se comporta como fluidos newtonianos. (Tauer, 2015)
2.2.1.2. Clasificación
Si el aceite es la fase dispersa, la emulsión se denomina emulsión de aceite en agua
(o/w), si el medio acuoso es la fase dispersa, la emulsión será de agua en aceite (w/o).
Pueden existir sistemas de emulsiones más complicados como ejemplo suspender en
agua una gotita de agua incluida en una gotita de aceite y formar una emulsión de agua
en aceite en agua (w/o/w). Estos sistemas o su contrapartida o/w/o, se denominan
emulsiones múltiples y tiene interés como sistemas de administración de fármacos de
acción retarda.
(Romo, 2000)
2.2.1.3. Componentes de una nano-emulsión
Una nano-emulsión está compuesta por:
Fase orgánica: disolventes orgánicos, aceites, ceras.
Fase acuosa
Tensioactivos: No iónicos, iónicos, Catiónicos
Cotensoactivos: alcoholes de cadena corta, isopropanol, butanol.
2.2.1.4. Caracterización de nano-emulsiones
Para caracterizar las nano-emulsiones se puede determinar:
9
a) tamaño de gota
b) distribución de tamaño de gota
c) morfología
d) potencial z.
a) Método para determinar tamaño de gota
Dispersión de Luz Dinámica (DLS)
DLS es la técnica más utilizada para estimar diámetros medios de sistemas coloidales
liofóbicos. DLS (DDL o DLS, por sus siglas en inglés de "Dynamic light Scattering"),
es conocida también como QELS (Quasi Elastic Light Scattering) o como PCS con
siglas en inglés (Photon Correlation Spectroscopy) espectroscopia de correlación de
fotones.
La dispersión de luz dinámica no tiene en cuenta la dependencia del ángulo, sino la
variación de la intensidad de dispersión en el tiempo.
El término "dinámica" no se refiere al movimiento de la muestra como un conjunto,
sino a la "vibración" de las partículas que la componen.
El fundamento de la técnica viene dada por una la luz láser que al alcanzar las
numerosas partículas que hay en una suspensión, se dispersa en todas las direcciones
posibles. Si una dirección se separa, los haces de luz dispersados por distintas
partículas interfieren entre sí y se logra obtener una determinada intensidad de
dispersión.
El movimiento browniano propio de una partícula nanométrica hace que las
posiciones relativas de las partículas varíen constantemente entre sí, lo que provoca
cambios en las condiciones de interferencia y en la intensidad de dispersión.
Entonces si las partículas se mueven rápidamente (partículas pequeñas), se acelera la
variación de la intensidad de dispersión. Por el contrario, las partículas lentas (grandes)
llevan a variaciones más lentas. Como se demuestra en la figura 2.1.
El equipo puede determinar el tamaño de las partículas, pesos moleculares y
potenciales Z de partículas dispersadas en solución.
Actualmente, DLS permite caracterizar muchos sistemas coloidales en un rango
aproximado de 1 nm a 5 micrones, incluyendo a los látex. Obsérvese en la figura
2.2. (Salager, 1991)
10
Fuente: (Salager, 1991)
Fuente: (Salager, 1991)
b) Distribución de tamaño de gota
El tamaño promedio de gota ( �̅�), puede calcularse de diferentes formas según que el
fenómeno de interés se relacione con el número de gota, su superficie o su volumen.
En cada caso, se usa un algoritmo adecuado.
Se divide la escala de diámetro en diferentes clases 𝒊 (𝒊 =1,2,3..n) y se cuenta el
número de gotas (𝒏𝒊 )correspondientes a la clase 𝒊, cuyo diámetro representativo es 𝒅𝒊
( en general el centro del intervalo).
La frecuencia relativa se define como el número de gotas pertenecientes a la clase i
divido por el número total de gotas. Si se hace la analogía con los conceptos clásicos
de estadística 𝒇𝒊 corresponde a la probabilidad de ocurrencia de 𝒅𝒊.
El tamaño y la distribución del tamaño de las gotas tiene influencia en las propiedades
de las emulsiones, como la velocidad de degradación, la estabilidad a grandes tiempos,
la resistencia al cremado, la textura y la apariencia óptica, la viscosidad, la eficiencia
fisiológica y la reactividad química, como en el caso de la cinética de las reacciones de
polimerización o en las reacciones catalizadas por lipasas en las que el área interfacial
entre la fase oleosa y la fase acuosa tiene una gran influencia.
Figura 2.1 Fluctuaciones de
intensidad para partículas grandes y
pequeñas.
Figura 2.2 Esquema de un equipo
para medición de DLS
11
En la tabla 2.1 se demuestra la importancia del área interfacial en función del tamaño
o distribución de tamaños para un mismo volumen de comparación. (Fernandez,
2006)
Tabla 2.1 Importancia del área interfacial
Radio
(m)
Numero de
partículas
Superficie
(m2)
Superficie/
volumen
(m-1)
Fracción de
moléculas en la
superficie
1 1 1.3×101 3 6×10
-9
10-3
109 1.3×10
4 3×10
3 6×10
-6
10-6
1018
1.3×107 3×10
6 6×10
-3
6×10-10
4.63×1024
1.3×109 5×10
8 1
Calculado para un área por molécula de 0.5nm2, un volumen molecular de 1×10
-27m
3 y
un volumen total de 4.2 m3. (Fernandez, 2006).
c) Método para determinar morfología de la nano-emulsión
Microscopia óptica y electrónica
La observación directa o la fotografía en microscopia óptica son los métodos más
simples, y los únicos que pueden considerarse como absolutos permiten al operador
pronunciar un juicio subjetivo acerca del tamaño o de la forma de las gotas, como se
demuestra en la figura 2.3. Sin embargo, se vuelven extremadamente tediosos y a
menudo es difícil hacer medidas objetivas, como la determinación del tamaño de gota.
El límite inferior de la microscopia óptica es del orden de 1 μm, en buenas condiciones
de iluminación y de contraste. Sin embargo para tales dimensiones, el movimiento
browniano se vuelve un problema y se requiere utilizar mucha sensibilidad y
alumbrados flash para "inmovilizar" la imagen.
Las gotas grandes (d > 100 μm) pueden, por otro lado, aplastarse entre las láminas y
por lo tanto aparecer con un diámetro aumentado o enmascarado, sin embargo se
puede corregir este problema usando láminas especiales.
La microscopia electrónica, tanto de transmisión como de barrido, permite un análisis
de estructuras más pequeñas, tales como cristales líquidos o microemulsiones. Sin
12
embargo, su uso está limitado por los requerimientos de alto vacío, y las dificultades
preparativas tales como la criofractura o la necesidad de réplica. (Fernandez, 2006)
Fuente: (Salager, 1991)
Criofijación
Es una técnica alternativa, que consiste en congelar con rapidez las células y los
tejidos.
Actúa como un fijador químico deteniendo procesos metabólicos y conservando la
estructura biológica.
La principal dificultad que tiene la criofijación, es que forma cristales de hielo, que
crecen hacia fuera desde sitios donde se forman sus núcleos. Conforme crecen los
cristales de hielo, destruye el frágil contenido de la célula en la que se forma. Por lo
que al congelar la muestra con tanta rapidez se evitar la formación de cristales de hielo.
Para alcanzar dichas velocidades de congelación ultrarrápidas se usan varias técnicas.
Cuando se trata de muestras más pequeñas casi siempre se sumergen en un líquido a
muy baja temperatura (como propano líquido, con punto de ebullición a -42°C). Y
cuando son especímenes más grandes se los trata con congelación a alta presión.
Para esta técnica, la muestra se somete a presión hidrostática alta y se rocía con
chorros de nitrógeno líquido. La presión alta reduce el punto de congelación del agua,
lo que disminuye la velocidad de crecimiento de los cristales de hielo.
La muestra congelada puede cortarse con un micrótomo especial en forma similar a un
bloque de tejido en parafina o en plástico. Estos cortes congelados (crio-secciones)
están listos para visualizarlos al microscopio óptico o al electrónico.
Figura 2.3 Emulsión aceite en agua
13
Para lograr imágenes tridimensionales es necesario realizar una reconstrucción
computarizada tridimensional llamada tomograma, y al tratarse de muestras
congeladas esta técnica se denomina tomografía crioelectrónica (crio-ET). Esta técnica
fue desarrollada por Wolfgang Baumeister la cual puede alcanzar una resolución de
unos cuantos nanómetros. (Karp, 2011)
Replicación por criofractura y grabado por congelamiento
La técnica de replicación por criofractura, se realiza colocando pequeños fragmentos
de tejido en un disco metálico pequeño y se congelan con rapidez. Luego el disco se
monta sobre una placa fría dentro de una cámara de vacío y el bloque de tejido
congelado se golpea con el borde de una navaja. El plano de fractura resultante se
extiende desde el punto de contacto y divide el tejido en dos piezas, algo similar a la
manera en que una hoja de hacha separa en dos un trozo de madera.
Considérese que una célula contiene diversos organelos con distintas composiciones.
Estas estructuras tienden a causar desviaciones en el plano de fractura, ya sea hacia
arriba o abajo, lo que produce elevaciones, depresiones y crestas en la cara de fractura
que reflejan los contornos del protoplasma atravesado. Por consiguiente las superficies
expuestas por la fractura contienen información respecto al contenido de la célula. Por
lo que el objetivo es hacer visible esta información.
El proceso de replicación, usa la superficie de fractura como un molde en el que se
deposita una capa de metal pesado en la misma cámara en la que se fracturó el tejido.
El metal se deposita en un ángulo para producir sombras que acentúen la topografía
local. Después se deposita una capa de carbono sobre la capa de metal para cimentar
los parches de metal en una superficie sólida. Una vez que se hizo el molde de la
superficie, el tejido que constituyó el molde puede descongelarse, retirarse y
desecharse; la réplica de metal-carbono es la que se coloca en la rejilla para muestra y
se visualiza en el microscopio electrónico.
Las variaciones en el grosor del metal en las distintas partes de la réplica producen
variaciones en la cantidad de electrones penetrantes que llegan a la pantalla de
visualización, lo que produce el contraste necesario en la imagen.
La replicación por criofractura por sí misma es una técnica en extremo valiosa, pero
puede aportar aún más información si se incluye un paso llamado grabado por
14
congelamiento. En este paso, la muestra congelada y fracturada, que aún permanece
dentro de la cámara fría, se expone al vacío a una temperatura alta por uno a unos
cuantos minutos, durante los cuales puede evaporarse (sublimarse) una capa de hielo
de la superficie expuesta. Luego de retirar parte del hielo, la superficie de la estructura
puede cubrirse con metal pesado y carbono para crear una réplica metálica que revela
las superficies externa e interna de las membranas celulares.
La técnica brinda una resolución muy alta y puede usarse para revelar la estructura y la
distribución de los complejos macromoleculares, como los del citoesqueleto, como se
supone que existen dentro de la célula viva. Refiérase a la figura 2.4 (Karp, 2011)
Fuente: (Karp, 2011)
Figura 2.4 Procedimiento para la formación de réplicas
por criofractura
15
d) Método para determinar potencial z de la nano-emulsión
Fuente: (Kosegarten, 2012)
Existe un potencial entre la superficie de la partícula y el líquido de dispersión, que
varía de acuerdo con la distancia desde la superficie de la partícula, este potencial en el
plano de deslizamiento se llama el potencial Zeta.
Sus unidades son los milivoltios (mV). El valor del potencial Z se ve marcadamente
afectado por el pH de la emulsión, por el efecto de este en la carga de las partículas.
Así las variaciones en el pH resultaran en variaciones en el potencial Z y por tanto, en
la estabilidad de la emulsión, como se demuestra en la figura 2.5.
La tasa de disminución en el potencial zeta, controla estabilidad de la emulsión
mientras que el aumento de la tasa de decaimiento de potencial zeta reducirá la
estabilidad de la emulsión. Indicando que la estabilidad de la emulsión se rige por la
velocidad con la que la desorción de emulgente de la película interfacial tiene lugar
durante el envejecimiento.
Por tanto, puede tenerse en cuenta que la tasa de disminución en el potencial zeta
refleja la fuerza de la película de emulsionante.
El potencial zeta de la muestra determinará si las partículas dentro de un líquido
tenderán a flocular (pegarse) o no.
El potencial zeta es determinado por la naturaleza de la superficie de la partícula y el
medio de dispersión.
Figura 2.5 Región de inestabilidad en cuanto al pH,
en este caso entre pH 4 hasta pH 7.5.
16
De hecho puede existir cierta atracción cerca de este valor también, y como regla si
queremos asegurarnos que exista repulsión entre las partículas, debemos asegurarnos
de que el valor de potencial zeta en mayor a +30mV o menor a –30mV. (Kosegarten,
2012).
2.2.2. Microscopio de Fuerza Atómica
La técnica se basa en la interacción local entre la punta y la superficie de una muestra,
proporcionando imágenes tridimensionales de superficies con alta resolución espacial
en tiempo real. Se lo utiliza para la caracterización y determinación de propiedades
físicas de superficies de materiales no conductores. (Birdi, 2003)
2.2.2.1. Componentes del Microscopio de Fuerza Atómica
Fuente: (Park S. , 2015)
La figura 2.6 representa los componentes del microscopio de fuerza atómica tiene los
dentro de los que se describe:
a. Cantilever y punta
b. Escáner
c. Actuador piezoeléctrico
d. Espejo
e. Fotodetector
Figura 2.6 Microscopio de Fuerza Atómica
17
f. Amplificador
g. Registro.
Cantilever y punta
Fuente: (Hernandez, 2009)
La elección de la punta más apropiada para cada tipo de experimento es uno de los
pasos previos más importantes.
Las puntas se obtienen con radios de curvatura de entre 1 y 10nm. Las dimensiones de
la micropalanca (cantiléver) varían entre 50micras determinando esta longitud su
dureza final, es decir la constante de fuerza del cantiléver (K o constante de la sonda) y
por tanto, dependiendo de la aplicación o la superficie a analizar se elegirá una sonda u
otra existiendo múltiples combinaciones entre la geometría y dimensiones de la punta y
la longitud del cantiléver. Refiérase a la figura 2.7. (Olmos & González, 2014)
En la figura 2.8 se aprecia las micropalancas que pueden ser de diferentes formas, por
ejemplo:
- Las de forma triangular se pueden utilizar para las medidas de fricción y en
medio en medio liquido debido a su mayor estabilidad.
Figura 2.7 Punta del microscopio de fuerza atómica
18
Figura 2.9 Cantilever
- Las de forma rectangular se suelen utilizar para realizar experimentos al aire.
Fuente: (Olmos & González, 2014)
La circunstancia que limita en gran medida la elección son las condiciones de alta
temperatura (hasta 145ºC).
A veces las puntas se fabrican con recubrimientos finos de un material reflectante, lo
que permite un aumento de la reflectividad.
Las puntas de Si3N4 no pueden ser utilizadas en ensayos a alta temperatura debido a los
diferentes coeficientes de expansión térmica entre el material de la punta y el del
cantilever ya que se generarían tensiones en la punta, provocando un momento de
torsión sobre ella que puede llegar a partirla.
Por este motivo las puntas utilizadas en este tipo de experimentos serán de un único
material, generalmente silicio. (Ramirez, 2010)
En la figura 2.9 se muestra al soporte de la punta el cantilever.
Fuente: (Parker, 2013)
Figura 2.8 Puntas empleadas en AFM
19
Figura 2.11. Actuador piezoeléctrico
Escáner
El diseño del escáner tiene forma de tubo y es de un material cerámico piezoeléctrico
que cambia de dimensiones como respuesta a un voltaje aplicado.
El escáner se caracteriza por tener tres grados de libertad, expandiéndose en una
dirección y contrayéndose en otra como resultado del voltaje aplicado a sus electrodos.
El mayor intervalo de operación de un escáner es de ≈ 100micras en movimiento
lateral y ≈ 10 micras en movimiento vertical. Como se demuestra en la figura 2.10.
Fuente: (Parker, 2013)
Actuador piezoeléctrico
Fuente: (Parker, 2013)
Figura 2.10 Escáner separado de x-y scanner
Escáner XY
Escáner Z
Piezoeléctrico
20
En la figura 2.11, se muestra el sensor presenta dimorfismo, esta característica permite
que el sensor desplace la muestra en el eje x, y para realizar el barrido y en eje Z para
ajustar la distancia de la punta (cantiléver) a la muestra.
2.2.2.2. Esquema de funcionamiento del instrumento AFM.
El fundamento del funcionamiento del equipo se expresa mediante una curva de la
fuerza en donde las perturbaciones registradas en el movimiento de la punta, con
respecto al movimiento dan cuenta de las fuerzas de interacción entre la punta y la
muestra.
La punta está montada en el extremo libre de una viga en voladizo, la cual actúa como
un sensor de fuerza, y opera con base en la ley de Hooke.
𝑭𝒊 = 𝑲𝒗𝒅𝒗 (2)
En donde:
𝑭𝒊 : Fuerza de interacción punta-superficie
𝑲𝒗: Constante de resorte de la viga en voladizo
𝒅𝒗: Desplazamiento vertical
La denominación de fuerza atómica está dada por la baja magnitud obtenida con
materiales como Silicio (Si) y Nitruro de Silicio (SiN3), las cuales son de 𝑲𝒗 (0,1 a
10N/m), que permiten detectar fuerzas del orden de fuerzas interatómicas, razón por la
cual se le conoce a este microscopio, y en inglés Atomic Force Microscopy (AFM).
De acuerdo al régimen y el tipo de fuerzas involucradas en las mediciones, se pueden
obtener hasta tres modos distintos de funcionamiento: AFM de contacto (AFM-C) o
modo estático, AFM de no contacto (AFM-NC) o modo dinámico y AFM de no
contacto intermitente (AFM-IC) también conocido como Tapping Mode. (Arroyave
M. , 2008)
Los regímenes de interacción están dominados, en lo fundamental, por fuerzas
interatómicas de corto y largo alcance, fuerzas adhesivas relacionadas con efectos de
capilaridad y la fuerza misma que ejerce la viga en voladizo sobre la superficie de
acuerdo a 𝑲𝒗 el régimen de contacto o repulsivo está gobernado, principalmente, por
fuerzas de corto alcance sobre distancias menores a un nanómetro, involucradas con el
21
solapamiento de las funciones de onda de las nubes electrónicas de punta y muestra
respectivamente.
Siendo así que para realizar una lectura el microscopio de fuerza atómica, monitorea
la superficie de la muestra con una punta de radio de curvatura de 20 a 60nm que se
localiza al final de un cantiléver. (Arroyave M. , 2002)
Las fuerzas entre la punta y la muestra provocan la deflexión del cantiléver,
simultáneamente un detector mide esta deflexión a medida que la punta se desplaza
sobre la superficie de la muestra generando una micrografía de la superficie. La fuerza
interatómica que contribuye a la deflexión del cantiléver es la fuerza de Van der
Waals. La Magnitud de deflexión del cantiléver actúa como una función de la distancia
entre la punta y la muestra. (Arroyave M. , 2002) Refiérase a la figura 2.12.
Fuente: (Olmos & González, 2014)
Una vez que el AFM detecta que la punta esta próxima a la superficie de la muestra, se
registra la flexión del cantiléver mediante un haz laser reflejado en su parte posterior y
este a su vez incide en un fotodetector dividido en cuatro cuadrantes midiendo la
posición del haz reflejado en cada cuadrante, mientras que el control del AFM le indica
el área de desplazamiento al actuador piezoeléctrico. De esta forma se puede
determinar los desplazamientos de la punta en la dirección z, permitiendo generar un
mapa del relieve de la muestra, Como se demuestra en la figura 2.13. (Ramirez, 2010)
Figura 2.12 Magnitud de deflexión del cantiléver como
función de la distancia entre la punta y la muestra.
22
Fuente: (Ramirez, 2010)
2.2.2.3. Modos de operación del microscopio de fuerza atómica AFM
El microscopio de fuerza atómica utiliza múltiples modos de operación de acuerdo a
las características físicas de la muestra y de las propiedades a medir.
Contacto: Mide la topografía de la muestra deslizando la punta sobre su superficie.
Tapping: También llamado contacto intermitente, mide la topografía de la muestra
tocando intermitentemente su superficie.
Imagen de fase: proporciona una imagen contrastada generada por las diferencias
de adhesión en la superficie de la muestra.
No contacto: Mide la topografía de acuerdo a las fuerzas de Van der Waals que
existen entre la superficie de la muestra y la punta.
Fuerza Magnética: Mide el gradiente de fuerza magnética sobre la superficie de la
muestra.
Fuerza eléctrica: Mide el gradiente de fuerza eléctrica sobre la superficie de la
muestra.
Potencial de Superficie: Mide el gradiente de campo eléctrico sobre la superficie de
la muestra.
Figura 2.13 Esquema de funcionamiento del AFM
23
Modo Lift: técnica que utiliza dos modos de operación usando la información
topográfica para mantener la punta a una altura constante sobre la superficie.
Modulación de Fuerza: mide la elasticidad/suavidad relativa de la superficie de las
muestras.
Fuerza Lateral: Mide la fuerza de fricción entre la punta y la superficie de las
muestras.
Microscopia Electroquímica: Mide la estructura de la superficie y las propiedades
de los materiales conductores inmersos en soluciones electrolíticas.
Litografía: se emplea una punta especial para grabar información sobre la superficie
de muestra. (Cruz, 2005)
a) Modo contacto
Fuente: (Cruz, 2005)
La técnica se basa en las medidas de deflexión de la viga en voladizo, como resultado
de la fuerza neta (valor promedio de 10-9
N) que actúa sobre esta, a medida que el
sistema de posicionamiento en 3D de la muestra (escáner piezoeléctrico) se mueve
bajo la punta. Como esta fuerza depende de la distancia punta-muestra, se utiliza para
detectar las variaciones topográficas de la superficie bajo análisis, manteniendo la
fuerza de interacción constante a través del control realimentado de posición vertical
de la viga, la cual se calcula con un láser y un fotosensor, obteniéndose así una imagen
topográfica o de altura de la superficie de la muestra, refiérase a la figura 2.14. (Cruz,
2005).
Figura 2.14 Esquema del principio básico de operación de un
AFM y en modo contacto
24
b) Modo No-contacto
El régimen de no contacto o atractivo está sometido por fuerzas de largo alcance tipo
Van der Waals, las cuales actúan en rangos de varias decenas de nanómetros y pueden
ser modeladas como la aproximación de una esfera (punta) a un cuerpo semi-infinito
(muestra), lo que lleva a obtener la expresión (Meyer, Josef Hug & Benitez).
𝑭𝑽𝒅𝑾 =𝑯𝑹
𝟔𝑫𝟐 (3)
Donde:
𝑯 : Constante de Hamaker
𝑹 : Radio de la punta
𝑫 : Distancia entre la punta y la superficie.
En la figura 2.15 se demuestra el funcionamiento del modo no contacto.
Fuente: (Olmos & González, 2014)
La técnica AFM-NC involucra aspectos instrumentales y físicos más sofisticados, ya
que la viga en voladizo debe ser excitada por una señal oscilante a la frecuencia
principal de resonancia. En este modo, la fuerza de interacción (50-150 angstrom)
entre la punta y la muestra está influenciada por un factor periódico.
En general la capa fluida de contaminante es sustancialmente más gruesa que el rango
de fuerzas de Van der Waals y por tanto, los intentos de obtener verdaderas imágenes
Figura 2.15 Modo no contacto
25
con el método de no-contacto fallan en el momento que la punta oscilante se ve
atrapada en la capa fluida o se encuentra situada más allá del rango efectivo de fuerzas
que intenta medir. (Cruz, 2005)
Se utiliza cuando el modo contacto interactúa con la punta y puede alterar la muestra.
c) Modo de contacto intermitente o Tapping
Este modo es la herramienta más avanzada en AFM. Es tan potente que permite
obtener una alta resolución en imágenes topográficas de superficies de muestras que
pueden dañarse con facilidad. Tapping está libre de problemas asociados a fricción,
adhesión, fuerzas electrostáticas y otras dificultades. Trabaja en atmosfera ambiente
mediante oscilación del cantiléver a su frecuencia de resonancia o cercana a ella
utilizando un cristal piezoeléctrico.
Fuente: (Olmos & González, 2014)
El movimiento del piezo provoca que el cantiléver oscile con una elevada amplitud
cuando la punta no está en contacto con la superficie. La punta oscilante entonces se
mueve hacia la superficie hasta que comience a tocar ligeramente o golpear la
superficie. Durante el barrido, la punta con oscilación vertical contacta y se eleva de
manera alternativa generalmente a una frecuencia de 50000 a 500000 ciclos por
segundo. Como se demuestra en la figura 2.16.
Figura 2.16 Representación de AFM en
modo tapping
26
Durante el contacto intermitente de la punta con la superficie, la oscilación del
cantiléver se ve reducida debido a la perdida de energía causada por el propio contacto.
La reducción en la amplitud de oscilación se utiliza para identificar y medir las
características superficiales. (Cruz, 2005)
2.2.2.4. Ventajas y desventajas de los modos Contacto, No-contacto y Tapping
MODO CONTACTO
Ventajas
Alta velocidad de barrido.
Eliminación de fuerzas capilares.
Reducción de fuerzas de Van der Waals y capacidad para estudiar procesos
(tecnológicos y biológicos importantes en interfaces solido-liquido.
Desventajas
Las fuerzas laterales pueden distorsionar las características de la superficie en la
imagen.
Las fuerzas normales de interacción punta-muestra pueden ser altas en aire por las
fuerzas de capilaridad la capa fluido-muestra.
Fuerzas laterales y normales pueden reducir la resolución espacial y dañar muestras
blandas.
MODO NO CONTACTO
Ventajas
No se ejercen fuerzas sobre la superficie de la muestra.
Desventajas
Menor resolución lateral, limitada por la separación punta-muestra.
Menor velocidad de barrido se evita el contacto para que la punta no se quede
pegada.
Se utiliza para estudiar muestras muy hidrofóbicas donde la capa de fluido adsorbida
es mínima.
27
MODO TAPPING
Ventajas
Mayor resolución lateral en la mayoría de las muestras (1-5nm).
Menores fuerzas y daño en muestras blandas al trabajar al aire.
Las fuerzas laterales son virtualmente eliminadas, de manera que no deberían
producirse arañazos.
Desventajas
Ligeramente menores velocidades de barrido que en el modo contacto.
2.2.2.5.Resolución del AFM
Fuente: (Cruz, 2005)
En el caso de AFM se la denomina resolución lateral ya que las imágenes que
proporciona son tridimensionales y se considera además una resolución vertical.
Existe una distinción importante entre imágenes obtenidas mediante ondas y las
obtenidas mediante técnicas de barrido de una sonda.
La última está limitada por la geometría de la sonda y de la muestra. Normalmente la
anchura de una molécula de ADN se utiliza como medida de la resolución porque se
conoce un diámetro de 2.0nm en la forma B. Algunos de los mejores valores para
AFM son de 3nm para una forma de DNA en propanol. Refiérase a la figura 2.17.
Muchos autores han visto que es el radio de curvatura de la punta el que influye de
manera significativa en la capacidad de resolución del AFM. (Cruz, 2005)
Figura 2.17 Efecto de la geometría de la punta en la
resolución de un AFM
28
2.2.2.6. Aplicaciones del Microscopio de Fuerza Atómica
La Microscopia de Fuerza Atómica es aplicada en el estudio de materiales. En las
industrias de electrónica, telecomunicaciones, biológicas, químicas, aeroespaciales y
energéticas. Los materiales que se investigan suele ser recubrimientos finos y gruesos,
cerámicas, materiales compuestos, vidrios, membranas sintéticas y biológicas, metales,
polímeros y semiconductores.
Por ejemplo en la figura 2.18 se muestra las imágenes de elaboración de los
Dispositivos Fotónicos vistas con AFM.
Fuente: (Sangwook, 2003)
En la figura 2.19 se observa imágenes de nano-estructuras magnéticas provista en
AFM
Fuente: (JinBae, 2009)
Figura 2.18 Quantum Dots-Dispositivos
Fotónicos
Figura 2.19 Nano-estructuras magnéticas
estructuras Co Antidot
29
Mediante la utilización de AFM no solo se pueden obtener imágenes a escala atómica
sino que también se pueden medir las fuerzas aplicadas sobre un material a una escala
del nano-newton.
Obteniendo de una muestra la imagenología, medidas y análisis de escaneo completo.
Como se demuestra en la figura 2.20 las imágenes vista desde AFM de superficies de
óxido de zinc.
Fuente: (Doutt, 2009)
La determinación de la fotoconductividad y la estructura de células solares que
proporciona la figura 2.21.
Fuente: (Lee, 2008)
Figura 2.21 Células solares- Fotoconductividad
Figura 2.20 Superficies Óxido de Zinc
30
La altura y profundidad de una muestra biológica en este caso de liposomas vistas
desde AFM en 3 dimensiones como se observa en la figura 2.22.
Fuente: (Park S. , 2015)
La determinación de diámetros y la imagen de superficies blandas como son las
vesículas lipídicas, son posibles hacerlas en AFM como se demuestra en la figura 2.23
en donde se visualiza imagen de altura y 3D.
Fuente: (System, 2015)
Figura 2.22 Liposomas
Figura 2.23 Vesículas lipídicas y bicapa en líquido fotografiado
31
2.2.2.7. Comparación entre AFM y otras técnicas de imagen
A continuación en la tabla 2.2 se resume el análisis de las técnicas más utilizadas para
determinar nano-estructuras versus la microscopia de fuerza atómica.
Tabla 2.2 Comparación entre AFM y STM
AFM STM(microscopio de efecto túnel)
La dependencia fuerza-distancia es
mucho más compleja teniendo en
cuenta la influencia que tienen la
forma de la punta y la fuerza de
contacto.
Se usa para aislantes como para
conductores. Siendo más versátil.
Tiene la ventaja de que el voltaje de
entrada y el espaciado entre la punta
y la muestra se pueden controlar
independientemente.
La resolución del STM es mejor que
la del AFM en algunos casos debido a
la dependencia exponencial de la
corriente túnel con la distancia.
Solo es aplicable a muestras
conductoras.
El voltaje de entrada y el espaciado
entre la punta los dos parámetros están
integralmente unidos.
Tabla 2.3 Comparación entre AFM y SEM
AFM SEM (microscopía electrónica de barrido)
Provee un extraordinario contraste
topográfico a partir de la medida
directa de alturas sin obscurecer vistas
de algunas características de la
superficie.
No es necesario realizar
recubrimientos conductores en
muestras que no son conductoras.
Necesita superficies conductoras por
las que las muestras se revisten con oro,
plata y oxido de titanio.
Tabla 2.4 Comparación entre AFM y TEM
AFM TEM (microscopia electrónica de
transmisión)
No necesita una preparación
excesivamente cara de la muestra a
observar y da lugar a una información
más completa.
No obstante con AFM no se pueden
realizar análisis de difracción.
Imágenes que se obtienen de dos
dimensiones a partir de secciones
transversales de muestras.
Se puede realizar análisis de
difracción.
Las muestras se dispersan en etanol,
luego se depositan en una rejilla de cobre
soportada y se secan a presión reducida.
Necesita criofijación y criofractura
32
2.3. FUNDAMENTACIÓN LEGAL
2.3.1. NIOSH (Estados Unidos)
NIOSH es la agencia federal de Estados Unidos encargada de controlar la
investigación y proveer guía en temas de salud ocupacional, implicaciones sanitarias y
aplicaciones de la nanotecnología.
NIOSH ofrece directrices provisionales para el trabajo con nano-materiales,
consistentes con el mejor conocimiento científico.
2.3.2. Comisión Europea
La comisión de comunidades europeas (Diciembre 2004) publica un comunicado
donde se describe estrategias para el desarrollo responsable de la nanotecnología,
incluyendo los potenciales usos para nano-materiales, investigación a nivel mundial,
inversión y la necesidad de integrar evaluación de riesgo ambiental en la investigación
y desarrollo de estas actividades.
2.3.3. Norma INEN (ISO/TR 12885:2008, IDT)
2.3.3.1.Recogida de muestras para caracterización de materiales
A menudo se requiere la determinación de las propiedades físicas y químicas de los
nano-materiales en suspensión relevantes respecto a su efecto potencial sobre la salud
humana. Parámetros como tamaño de partícula, forma, área superficial, composición,
estado de aglomeración, cristalinidad, solubilidad y biopersistencia proporcionan la
información básica para la evaluación de la exposición y toxicidad de los nuevo
materiales.
Las principales técnicas disponibles para determinar el tamaño, la forma y la
composición de partículas son las microscopias electrónicas de alta resolución como
las de barrido (scanning electron microscopy, SEM), emisión de campo (fiel emission
gun, SEM), transmisión (transmission electron microscopy, TEM) y transmisión y
barrido (Scanning transmission electron microscopy-STEM), combinadas con el
microanálisis por rayos X, la espectroscopia de perdida de energía electrónica
(Electron Energy Loss Spectroscopy, EELS) y la difracción electrónica.
33
2.3.3.2. Caracterización de la muestra
Para caracterizar la distribución por tamaños, la concentración en número y la forma
de las nano-partículas recogidas en muestreadores, pueden utilizarse la microscopia
electrónica. En los métodos de limpieza, la utilización de filtros mixtos de esteres de
celulosa a modo de toallitas podría facilitar dicho análisis.
La dispersión de la luz, la difracción laser, la cromatografía de exclusión por tamaño,
las técnicas acústicas y el fraccionamiento de flujo de campo (field flow fractionation)
podrían utilizarse para caracterizar la distribución de tamaños y la concentración en
número, mientras que las técnicas espectroscópicas pueden ser útiles para obtener
información sobre la composición química y la estructura de las nano-partículas. Estas
técnicas también pueden funcionar con los métodos de muestreo mediante aclarado.
2.4. Hipótesis del trabajo
Hi: Al variar parámetros de temperatura o tratamientos de superficies cambiará la
morfología y tamaño de las gotas de las emulsiones.
Ho: Al variar parámetros de temperatura o tratamientos de superficies no cambiará la
morfología y tamaño de las gotas de las emulsiones.
2.5. Sistema de variables
Se establecieron variables independientes las que influirán en la variable dependiente
como se muestra en la tabla 2.5 cada una de las cuales se analizará individualmente.
Tabla 2.5 Variables independientes que influyen en el tamaño de gota
Variables independientes Variable dependiente
Temperatura:
ambiente 25ºC
Diámetro de la gota de emulsión
estufa a 40ºC
Superficie:
vidrio
vidrio-barniz
Los valores del diámetro del tamaño de gota se calcularon en nanómetros.
34
CAPITULO III
3.1.METODOLOGÍA
3.1.1. Diseño de la investigación
Al ser un tema innovador se aplicó una investigación experimental cuantitativa y
estadística. En el cual se modificaron las variables seleccionadas que intervienen en la
determinación del diámetro de gota de la emulsión. Dentro del método experimental
se establecieron las variables independientes y dependientes como son temperatura –
superficie y diámetro de gota, respectivamente. Las temperaturas establecidas son
controladas, y se determinó si influyen o no en el diámetro de la gota de las
emulsiones. Así como la superficie en la que se las tratara.
Mediante la hipótesis formulada se podrá definir las relaciones causales, y este mismo
a su vez se diferencia con los otros tipos de investigación, ya que su objetivo de
estudio y su tratamiento dependen completamente del investigador.
La búsqueda documental es necesaria para complementar la investigación acerca de
métodos e investigaciones previamente realizadas lo que se considera el estado de arte.
3.1.2. Población y Muestra
La población constituye todas aquellas emulsiones con sistema de w/o y o/w que se
están desarrollando en el Laboratorio de Nano-estructuras de la Facultad de Ciencias
Químicas de la Universidad Central del Ecuador. Por lo tanto se puede determinar que
durante la investigación se va a trabajar con toda la población.
Las muestras comprenden emulsiones con sistema w/o de aceite de palma y agua y las
de sistema o/w son de aceite soya y agua, elegidas por su estabilidad para ser
visualizadas en AFM.
3.1.3. Diseño Experimental
La determinación del diámetro de gota de emulsión se realizó con el equipo de
Microscopia de Fuerza Atómica NX10, Park System.
35
Al tratarse de emulsiones diferentes fue necesario dividir el trabajo en dos partes
experimentales estableciendo un diseño experimental para cada una de las partes.
Emulsiones w/o
Emulsiones o/w
3.1.4. Matriz de Operacionalización de las Variables
A continuación se describe la matriz Operacionalización de las Variables
Tabla 3.1 Matriz de Operacionalización de las Variables
Variables Dimensiones Indicador
Dependiente: Diámetro de la
gota
Diámetro de la gota Longitud del
diámetro del gota en
nanómetros
Independiente: Condiciones
Físicas y Ambientales
Temperatura (A) Temperatura ajustada
en estufa en °C. 25°C
y 40°C.
Superficie de la placa
(B)
Tipo de superficie de
la placa con y sin
tratamiento.
B1 y B2
3.1.5. Técnicas e Instrumentos de Recolección de Datos
3.1.5.1. Técnicas de Recolección de Datos
Limpieza de las placas de vidrio
Proceso para remover impurezas del cubreobjetos.
Coloque 25 cubreobjetos (22 × 22 mm) en un vaso de 250 mL limpio.
A continuación lave los cubreobjetos en acetona por 3 min luego con una
pinza tómelos uno a uno y transfiéralos a un nuevo vaso de precipitación.
Añada al vaso, 50 ml de una solución 50% de metanol - 50% de agua,
después llévelo al baño de ultrasonido y proceda a sonicar durante 20
minutos.
Transfiera los cubreobjetos a un nuevo vaso de precipitación y vuelva a
sonicar durante 20 min en 50 ml de cloroformo.
Coloque los cubreobjetos secos en una placa de vidrio la cual fue previamente
limpiada con cloroformo.
36
Llevar la placa de vidrio con los cubreobjetos y dejarlos secar en la estufa a
25°C durante 15 minutos.
Luego con ayuda de una pinza, colóquelos uno por uno en la caja plástica
adecuada para cubreobjetos. (Cientifica, 2008)
Tabla 3.2 Materiales para limpieza de placas de vidrio
Materiales Equipos Reactivos
Cubreobjetos 22 x 22mm Ultrasonido marca Kendal CHCl3
Vasos de precipitación 100mL Estufa marca Memmert CH3-CO-CH3
Pinza plástica CH3OH
Caja plástica Agua tipo I
Placa de vidrio
Recubrimiento de placas
Para el recubrimiento de placas se procedió de la siguiente manera:
En un placa de vidrio coloque pedazos de cinta doble haz de 1cm y vaya
ubicando de tal modo que haya un espacio de 1cm de separación para cada
cubreobjetos.
Después, en un vaso de precipitación añada 50 mL de barniz acrílico, luego
con ayuda de una pinza tome un cubreobjetos y sumerja el mismo en el barniz
hasta cubrirlo completamente.
Luego proceda a escurrirlos completamente y colóquelos en la cinta doble haz
q esta sobre la placa de vidrio y déjelos secar 24 horas.
Una vez secados, vaya retirándoles con un estilete y vuélvalos a colocar en la
caja para cubreobjetos.
Tabla 3.3 Materiales para recubrimiento de placas
Materiales Reactivos
Cubreobjetos 22 x 22mm Barniz acrílico
Vasos de precipitación 50mL
Pinza plástica
Caja plástica
Placa de vidrio
Cinta doble haz
Estilete
37
Elaboración de la muestra
Se describe el procedimiento en la figura 3.1:
Figura 3.1 Diagrama de preparación de las muestras
Inicio
Diluir a
100mL
En cada balón
Agua Tipo I 5uL de
nanoemulsión
o/w
w/o
Colocar
0,5mL de
cada solución Jeringa
Superficie
vidrio Superficie vidrio
con barniz
T: 25°C T: 40°C T: 40°C T: 25°C
3 repeticiones 3 repeticiones 3 repeticiones 3 repeticiones
Filtrar 50mL Filtro jeringa
0,2 µm
Lectura en
AFM
Fin
t: 15 min t: 15 min t: 15 min t: 10 min
Inicio
38
Se utilizaron nano-emulsiones previamente preparadas.
Las tipo o/w fueron preparadas con aceite de soya como fase dispersa y para la fase
dispersante se utilizó agua tipo 1 adicionalmente distintos surfactantes no iónicos tales
como Tween 20, Tween 80, Cremophor A25, Kolliphor.
Mientras que las tipo w/o la fase dispersa fue aceite de palma y agua tipo I como fase
dispersante. (Calderon, 2015).
3.1.5.2. Instrumento de Recolección de Datos
Medición del diámetro de gota por AFM
Se describe el procedimiento a continuación en la figura 3.2.
Figura 3.2 Lectura de muestras en el Microscopio de Fuerza Atómica
Inicio
Colocar en el
disco magnético
Placa muestra o/w
Cinta adhesiva
doble faz Placa muestra w/o
Trasladar al
portamuestras
magnético
Programas los
parámetros de
lectura
Modo: Contacto
Velocidad de
barrido: 0,50 Hz
Escáner área: 10µm
Pixeles: 512
Observar la
imagen en el
programa
Procesar la
imagen y darle
aplanamiento
Medir diámetros
Fin
39
Se determinó el diámetro de cada una de las gotitas en el equipo de Microscopia de
Fuerza Atómica la cual se basa en la interacción de la punta de silicio y la muestra.
Este arroja la topografía de la gota en una imagen permitiendo medir su tamaño.
Los pasos a seguir para realizar la lectura en el equipo se describe en el siguiente
diagrama:
Tabla 3.4 Materiales para el tratamiento de superficies
Materiales Equipos Reactivos
Caja plástica Microscopio de Fuerza Atómica Muestra con o/w
Pinza NX10 marca Park System Muestra con w/o
Disco de plata
Cinta doble faz
Estilete
3.1.6. Técnicas de Procesamiento y Análisis de Datos
3.1.6.1.Técnica de Procesamiento de Datos
Diseño Factorial
El objetivo de un diseño factorial es estudiar el efecto de varios factores sobre una o
varias respuestas o características en un proceso de calidad y determinar una
combinación de niveles de los factores en la cual el desempeño del proceso sea mejor
que en las condiciones de operación actuales; es decir, encontrar nuevas condiciones
de operación del proceso que eliminen o disminuyan ciertos problema en la variable
respuesta.
Para la obtención y análisis de los resultados se aplicó el Diseño Factorial con dos
factores en A y B con a y b (a, b ≥ 2) niveles de prueba respectivamente. Siendo un
diseño factorial a × b que consiste en a × b tratamientos donde:
Tabla 3.5 Factores y niveles
Factor A Temperatura
Factor B Superficie
El factorial a trabajar es de 2 × 2 porque fueron 2 niveles de temperatura y 2 niveles de
superficies. Cada una con tres repeticiones.
40
Tabla 3.6 Diseño factorial 2 ×2 para emulsión o/w
A: Temperatura
B: Superficie Temperatura
ambiente 25ºC
Temperatura
estufa 40ºC
Vidrio sin
recubrimiento
Vidrio con barniz
Tabla 3.7 Diseño factorial 2×2 para emulsión w/o
A: Temperatura
B: Superficie Temperatura
ambiente 25ºC
Temperatura
estufa 40ºC
Vidrio sin
recubrimiento
Vidrio con barniz
Se elige este diseño factorial a× b ya que se pueden estudiar los dos efectos
individuales y el efecto de interacción de ambos factores.
3.1.6.2. Análisis de datos
Este análisis estadístico midió la variación total de las observaciones, la que se divide
para sus componentes, quedando el residuo como error experimental.
A su vez se estudió la relación entre una variable dependiente y uno o más factores
independientes, estableciendo un balance entre la variabilidad inducida y la no
explicada que viene a ser el error experimental.
Este análisis estadístico se aplicó por separado para los dos distintos sistemas
estudiados es decir, para cada tipo de emulsión sea o/w y w/o.
Además se determinó la existencia de diferencias significativas con un nivel de 95,0%
de confianza entre las medias de los distintos tratamientos utilizando como variable de
comparación el diámetro del tamaño de gota.
Tomando como base lo anteriormente expuesto en la tabla 3.8 se describe ANOVA:
41
Tabla 3.8 Datos de diámetros de partícula para ANOVA
Superficie Temperatura Diámetros
(nm) �̅� Diámetros
(nm)
Desviación
estándar
1 2 3 Vidrio sin
recubrimiento
25°C
40°C
Vidrio-barniz 25°C
40°C
De acuerdo a la hipótesis y análisis de varianza que implica los dos efectos A, B y AB.
Así se plantea la hipótesis:
Ho: Efecto de temperatura (A) = 0
HA: Efecto de temperatura (A) ≠ 0
Ho: Efecto de superficie (B) = 0
HA: Efecto de superficie (B) ≠ 0
Ho: Efecto de temperatura × superficie (AB) = 0
HA: Efecto de temperatura × superficie (AB) ≠ 0
Tabla 3.9 Reporte de datos de ANOVA
Variabilidad SC GL CM Fo Valor-p
Efecto A SCA a-1 𝑪𝑴𝑨 =
𝑺𝑪𝑨
𝑮𝑳𝑨
𝑪𝑴 𝑨
𝑪𝑴 𝑬
𝑷(𝑭 > 𝑭𝟎𝑨)
Efecto B SCB b-1 𝑪𝑴𝑩 =
𝑺𝑪𝑩
𝑮𝑳𝑩
𝑪𝑴 𝑩
𝑪𝑴 𝑬
𝑷(𝑭 > 𝑭𝟎𝑩)
Efecto AB SCAB (a-1)(b-1) 𝑪𝑴𝑨𝑩
=𝑺𝑪𝑨𝑩
𝑮𝑳𝑨𝑩
𝑪𝑴 𝑨𝑩
𝑪𝑴 𝑬
𝑷(𝑭
> 𝑭𝟎𝑨𝑩)
Error SCE ab(n-1) CME
Total SCT abn-1
Diferencia mínima significativa
La prueba se realizó al rechazar la hipótesis nula obtenida en el análisis de ANOVA.
La diferencia mínima es aquella que debe haber entre dos medias muéstrales para
poder considerar que los tratamientos son significativamente diferentes.
Esta prueba permite comparar múltiples medias de los tratamientos y su uso en
comparaciones simultaneas por distintos rangos.
42
Tabla 3.10 Reporte de datos de la prueba Diferencia Mínima Significativa
Tratamientos Repeticiones Media Media Sigma Grupos Homogéneos
Temperatura 6 X
Superficie 6 X
43
CAPITULO IV
4. Análisis y Discusión de Resultados
4.1. Limpieza de las placas de vidrio
Se comprobó que los cubreobjetos estén limpios observando los mismos en el
microscopio. Como se demuestra en la figura 4.1
Figura 4.1 Imágenes de placas después de la limpieza
Se pudo observar que no existen residuos o polvo que interfiera en el análisis.
4.2. Recubrimiento de placas de vidrio
A las 24 horas de haberse secado las placas que contenía una película fina de barniz se
observó en el microscopio para comprobar presencia de partículas que puedan
interferir en el análisis. Como se demuestra en la figura 4.2.
Figura 4.2 Imágenes de placas con recubrimiento de barniz
44
4.3. Elaboración de muestras
Las muestras luego de ser secadas en la estufa se las dejó reposar por 24 horas en la
caja para cubreobjetos.
Las muestras de sistema aceite palma y agua en w/o, tomaron más de 48 horas en
secarse mientras que las muestras de sistema aceite de soya en agua o/w, a las 48 horas
estaban listas para ser observadas.
4.4. Medición de diámetro de gota en AFM
Las fluctuaciones ambientales tales como vibraciones o cambios de temperatura tienen
un gran efecto en las mediciones con equipo de Microscopio de Fuerza Atómica.
Se trató de disminuir al mínimo el ruido trabajando a puertas cerradas y evitando
cualquier tipo de sonido o vibración por parte del analista y de los demás equipos que
se encontraban alrededor.
Otra forma de estabilizar al equipo fue mantenerlo encendido por 5 minutos antes de
realizar una lectura. Luego de haber encontrado la señal óptima de trabajo se procedió
a realizar varias mediciones a una misma muestra y se eligió la imagen que sea visible
con pequeñas gotitas que después fueron medidas en términos de nanómetros
obteniendo 50 datos que luego se procedió a realizar el respectivo análisis estadístico.
Refiérase los datos de cada medición en la tabla de anexos así como las imágenes en
altura y 3D.
4.5. Análisis estadístico
4.5.1. Análisis estadístico de la emulsión w/o, del sistema aceite de palma y agua.
Tabla 4.1 Datos de diámetros de gota para ANOVA
Superficie Temperatura Diámetros
(nm)
Promedio
(nm)
Desviación
estándar
1 2 3
Vidrio sin
recubrimiento
25°C 128 133 121 127 6
40°C 131 136 123 130 6
Vidrio-barniz 25°C 135 116 122 124 9
40°C 114 111 125 117 8
45
Tabla 4.2 Análisis de varianza de los diámetros de gota sistema aceite de palma-agua
Origen de las
variaciones
Suma de
cuadrados
Grados
de
libertad
Promedio
de los
cuadrados
F Valor
crítico
para F
Efectos
principales
A:Temperatura 18,2 1 18,2 0,3 0,5
B:Superficie 203,3 1 203,3 3,6 0,09
INTERACCIÓN
AB 79,0 1 79,0 1,4 0,27
ERROR 451,5 8 56,4
TOTAL 752,1 11
Tabla 4.3 Rangos establecidos por la prueba de Diferencia Mínima Significativa para
diámetros y temperatura.
Método: 95,0 porcentaje DMS
Temperatura Casos Media Media Sigma Grupos Homogéneos
Estufa 6 123 3 X
Ambiente 6 126 3 X
Contraste Sig. Diferencia +/- Limites
ambiente - estufa ns 3 10
Figura 4.3 Intervalos de medias de los diámetros de la emulsión w/o con la
temperatura de la Diferencia Mínima Significativa al 95%
ambiente estufa
Means and 95,0 Percent LSD Intervals
Temperatura
110
114
118
122
126
130
134
Dia
metr
os
46
Figura 4.4 Interacción de medias de los diámetros de la emulsión tipo w/o con la
temperatura y la superficie de la Diferencia Mínima Significativa al 95%
Tabla 4.4 Rangos establecidos por la prueba de Diferencia Mínima Significativa para
diámetros y superficie
Método: 95,0 porcentaje DMS
Superficie Casos Media Media Sigma Grupos Homogéneos
vidrio-barniz 6 120 3 X
Vidrio sin
recubrimiento
6 129 3 X
Contraste Sig. Diferencia +/- Limites
vidrio sin recubrimiento- vidrio-
barniz
ns 8 10
Figura 4.5 Intervalos de medias de los diámetros de la emulsión w/o con la superficie
de la Diferencia Mínima Significativa al 95%
Interaction Plot
Temperatura
110
114
118
122
126
130
134D
iam
etr
os
ambiente estufa
Superficie
vidrio
vidrio-barniz
vidrio vidrio-barniz
Means and 95,0 Percent LSD Intervals
Superficie
110
114
118
122
126
130
134
Dia
metr
os
sin recubrimiento
sin recubrimiento
47
Histogram for Diametros nm
70 100 130 160 190 220
Diametros nm
0
20
40
60
80
freq
uency
Distribution
Normal
Histogram for Diametros nm
70 90 110 130 150 170 190
Diametros nm
0
10
20
30
40
50
60
frequency
Distribution
Normal
Figura 4.6 Interacción de medias de los diámetros de la emulsión tipo w/o con la
superficie y la temperatura de la Diferencia Mínima Significativa al 95%.
Figura 4.7 Distribución normal e Histograma de los diámetros de gota del sistema w/o
a una temperatura de 25ºC y superficie vidrio sin recubrimiento.
Figura 4.8 Distribución normal e Histograma de los diámetros de gota del sistema w/o
a una temperatura de 40ºC y superficie vidrio sin recubrimiento.
Normal
media = 127 nm
desviación
estándar = 23
Normal
media = 130 nm
desviación estándar = 24
Interaction Plot
Superficie
110
114
118
122
126
130
134
Dia
me
tros
vidrio vidrio-barniz
Temperatura
ambiente
estufa
sin recubrimiento
48
Histogram for Diametros nm
70 100 130 160 190 220
Diametros nm
0
10
20
30
40
50
frequency
Distribution
Normal
Histogram for Diámetros nm
70 90 110 130 150 170
Diámetros nm
0
20
40
60
80
frequency
Distribution
Normal
Figura 4.9 Distribución normal e Histograma de los diámetros de gota del sistema w/o
a una temperatura de 25ºC y superficie vidrio barniz.
Figura 4.10 Distribución normal e Histograma de los diámetros de gota del sistema
w/o a una temperatura de 40ºC y superficie vidrio barniz.
Se estableció diferencia significativa entre los tratamientos de sistema w/o a
temperatura de 25°C y 40°C con superficies de vidrio y vidrio con recubrimiento,
después de realizar el análisis de varianza; los rangos de comparaciones múltiples se
identificaron cuatro grupos homogéneos. Los histogramas y la distribución normal de
cada uno de tratamientos presentaron polidispersión en los valores de los diámetros, y
se obtuvo una alta desviación estándar lo que sugiere inestabilidad en el sistema.
Normal media = 125nm
desviación
estándar = 25
Normal media = 117nm
desviación
estándar = 18
49
4.5.2. Análisis estadístico del sistema de emulsión o/w, aceite de soya y agua.
Tabla 4.5 Diámetros de gota de la emulsión o/w
Tabla 4.6 Análisis de varianza de los diámetros de gota sistema aceite de soya-agua
Origen de las
variaciones
Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Promedio de
los
cuadrados
F Valor
crítico
para F
Efectos principales
A:Temperatura 23585,3 1 23585,3 37,7 0,0003
B:Superficie 432,0
1 432,0
0,6
0,43
INTERACCIONES
AB 21000,3 1 21000,3 33,6 0,0004
RESIDUALES 4996,0 8 629,7
TOTAL 50013,7 11
Tabla 4.7 Rangos establecidos por la prueba de Diferencia Mínima Significativa para
diámetros y temperatura
Método: 95,0 porcentaje DMS
Temperatura Casos Media Media Sigma Grupos Homogéneos
ambiente 6 139 10 X
estufa 6 227 10 X
Comparaciones Sig. Diferencia +/- Limites
ambiente - estufa * 88 33
Un asterisco se ha colocado junto al tratamiento ambiente-estufa, lo que indica que
este par muestra una diferencia estadísticamente significativa al nivel de confianza
95,0%.
Superficie Temperatura Diámetros
(nm)
Promedio
(nm)
Desviación
estándar
1 2 3
vidrio 25°C 142 204 193 180 33
40°C 216 147 161 175 36
vidrio-
barniz
25°C 279 281 266 275 8
40°C 106 102 101 103 2
50
Figura 4.11 Intervalos de medias de los diámetros de la emulsión o/w con la
temperatura de la Diferencia Mínima Significativa al 95%.
Figura 4.12 Interacción de medias de los diámetros de la emulsión tipo o/w con la
temperatura y la superficie de la Diferencia Mínima Significativa al 95%
Tabla 4.8 Rangos establecidos por la prueba de Diferencia Mínima Significativa para
diámetros y superficie
Método: 95,0 porcentaje DMS
Superficie Casos Media Media Sigma Grupos Homogéneos
vidrio sin
recubrimiento
6 177 10 X
vidrio-barniz 6 189 10 X
Contraste Sig. Diferencia +/- Limites
Vidrio sin recubrimiento -
vidrio-barniz
ns 12 33
ambiente estufa
Means and 95,0 Percent LSD Intervals
Temperatura
120
150
180
210
240
270
Dia
metr
os
Interaction Plot
Temperatura
100
130
160
190
220
250
280
Dia
me
tros
ambiente estufa
Superficie
vidrio
vidrio-barniz
sin recubrimiento
51
Histogram for Diámetros nm
90 130 170 210 250 290 330
Diámetros nm
0
10
20
30
40
50
60
freq
ue
ncy
Distribution
Normal
Figura 4.13 Intervalos de medias de los diámetros de la emulsión o/w con la
Superficie de la Diferencia Mínima Significativa al 95%.
Figura 4.14 Interacción de medias de los diámetros de la emulsión tipo o/w con la
superficie y la temperatura de la Diferencia Mínima Significativa al 95%
Figura 4.15. Distribución normal e Histograma de los diámetros de gota del sistema
o/w a una temperatura de 25ºC y superficie vidrio sin recubrimiento.
Normal
media = 178 nm
desviación estándar = 45
vidrio vidrio-barniz
Means and 95,0 Percent LSD Intervals
Superficie
160
170
180
190
200
210
Dia
metr
os
Interaction Plot
Superficie
100
130
160
190
220
250
280
Dia
me
tros
vidrio vidrio-barniz
Temperatura
ambiente
estufa
sin recubrimiento
sin recubrimiento
52
Histogram for Diámetros nm
90 130 170 210 250 290 330
Diámetros nm
0
10
20
30
40
50
frequency
Distribution
Normal
Histogram for Diámetros nm
190 210 230 250 270 290 310
Diámetros nm
0
20
40
60
80
100
frequency
Distribution
Normal
Histogram for Diámetros nm
60 80 100 120 140 160 180
Diámetros nm
0
20
40
60
80
freq
ue
ncy
Distribution
Normal
Figura 4.16. Distribución normal e Histograma de los diámetros de gota del sistema
o/w a una temperatura de 40ºC y superficie vidrio sin recubrimiento.
Figura 4.17. Distribución normal e Histograma de los diámetros de gota del sistema
o/w a una temperatura de 25ºC y superficie vidrio barniz
Figura 4.18. Distribución normal e Histograma de los diámetros de gota del sistema
o/w a una temperatura de 25ºC y superficie vidrio barniz
La diferencia significativa se estableció entre los tratamientos del sistema o/w a
temperatura de 25°C y 40°C con superficies de vidrio y vidrio con recubrimiento,
después de realizar el análisis de varianza; los rangos de comparaciones múltiples se
identificaron 2 grupos homogéneos. Los histogramas y la distribución normal de cada
Normal
media = 175 nm
desviación
estándar = 47
Normal
media = 275 nm
desviación estándar = 34
Normal
media = 103 nm
desviación
estándar = 16
53
uno de tratamientos presentaron polidispersión en los valores de los diámetros, y se
obtuvo una alta desviación estándar lo que sugiere inestabilidad en el sistema.
54
CAPITULO V
5. Conclusiones y Recomendaciones
5.1. Conclusiones
Se concluye que el microscopio de fuerza atómica, detecta las fuerzas
interatómicas que se produce al interaccionar una punta con una nano-
superficie.
Además se conoció las diversas aplicaciones que tiene el microscopio como por
ejemplo: realiza mediciones químicas, mediciones de fuerza, propiedades
eléctricas, magnéticas, ópticas, piezoeléctricas, mecánicas, termales.
En esta investigación se aplicó el microscopio de fuerza atómica para analizar
nano-superficies de gota nano-emulsiones tipo w/o y o/w, que al tratarse de
superficies blandas se necesitó de un tratamiento específico para poder realizar
las respectivas lecturas.
Las lecturas del diámetro de gota de las placas se realizó en el microscopio de
fuerza atómica, las mismas que contenían la emulsión w/o a base del sistema
aceite de palma-agua en diferentes superficies que fueron vidrio sin
recubrimiento(cubreobjetos) y vidrio con barniz (cubreobjetos con
recubrimiento de barniz). Los diámetros obtenidos fueron sometidos a un
análisis estadístico y a una prueba de significancia, los resultados indican que
no existe significancia entre ambos tratamientos por lo tanto el factor superficie
no es determinante para realizar las lecturas.
Mientras que las emulsiones o/w con sistema a base de aceite de soja-agua, los
diámetros que se obtuvieron después de ser sometidos al tratamiento estadístico
y a la prueba de significancia indicaron que no existe una significancia entre los
dos tipos de superficie, y en cuanto a la interacción entre tratamientos se
observa una significancia con la temperatura de secado. Por lo tanto se logró
determinar diámetros más pequeños en una superficie de vidrio con barniz a
temperatura de secado de 40°C que en una superficie de vidrio sin
recubrimiento y temperatura de secado de 25°C.
55
Se estudió el efecto de la temperatura de secado en la emulsión w/o a base del
sistema aceite de palma-agua y se determinó que el diámetro promedio de gota
no se ve afectado si se lo realiza a temperatura de secado de 25°C o 40°C.
Para las emulsiones o/w con sistema a base de aceite de soja-agua, se pudo
observar que existe una significancia entre la interacción del factor temperatura
y superficie (temperatura 40°C y vidrio con barniz) la cual provocó la
reducción del diámetro de gota, por lo tanto se concluye que este tratamiento
deforma a la emulsión.
Se determinó la factibilidad para usar la técnica Microscopía de Fuerza
Atómica para lograr impresiones sobre placa de una emulsión a escala
nanométrica, sin embargo se requiere ampliar la investigación en cuanto a la
medición del diámetro de las muestras ya que al comparar los valores de
desviación estándar obtenidos por AFM con los valores de DLS se encuentran
muy altos.
Por lo tanto, para leer impresiones de gotas de una emulsión w/o (a base del
sistema aceite de palma-agua), las condiciones ideales fueron temperatura de
secado 25°C y superficie de vidrio con barniz, ya que el diámetro medio por
AFM fue 124 ± 9 el cual es similar al obtenido por DLS con un valor de
124,8nm ±14,7.
Y para emulsiones o/w (sistema a base de aceite de soja-agua) las condiciones
fueron temperatura de secado a 25°C y en una superficie de vidrio sin
recubrimiento, ya que el diámetro medio obtenido en AFM fue de 180 ± 33
mientras que con DLS fue de 181,0± 8,8.
Se realizó una comparación del valor promedio del diámetro de gota de la
emulsión w/o (sistema aceite de palma-agua) obtenido con el tratamiento vidrio
y temperatura de 25°C medidos por AFM y el mismo fue de 127nm ±6
mientras que el diámetro promedio obtenido por DLS fue de 124,8nm ±14,7.
Al comparar estos valores se los encuentra que son parcialmente cercanos,
debido a que esta emulsión presentó un cambio en su estabilidad incluso en
versión de fase.
56
Y para la emulsión o/w (sistema aceite de soja-agua) a las mismas condiciones
anteriormente mencionadas, en AFM con un valor de 180 ± 33 mientras que el
diámetro promedio obtenido por DLS fue de 181,4± 8,8. Al comparar estos
valores se observa que están similares, pero con una desviación estándar alta en
AFM.
Las figuras de polidispersión de los diferentes tratamientos para cada muestra
(w/o) y (o/w) indica la alta variación entre los diámetros y se obtuvo valores
altos de desviación estándar debido a las características propias de la muestra
cómo se demuestran en las figuras de los anexos.
5.2. Recomendaciones
Se recomienda realizar la caracterización de emulsiones que contenga principio
activo ya que es indispensable conocer su morfología y tamaño para el
desarrollo de nuevas formas farmacéuticas con liberación controlada.
Al tratarse de una investigación innovadora se propone hacer una validación
del método comparando la técnica de AFM contra el DLS como métodos de
caracterización de nano-partículas.
El modo contacto fue utilizado para la lectura de todos los análisis por lo tanto,
se recomienda ampliar esta investigación en los modos de no contacto y
tapping.
Se recomienda estudiar el cambio de versión de fase en las nano-emulsiones
tipo w/o a o/w, utilizando la técnica de microscopía de fuerza atómica.
Para emulsiones tipo o/w, se concluye que las desviaciones estándar obtenidas
por el método AFM están elevadas con respecto al obtenido por DLS por lo
tanto, se recomienda realizar posteriores investigaciones para determinar la
factibilidad de medir el diámetro de gota mediante AFM para este tipo de
muestras.
57
6. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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60
7. ANEXOS
Anexo 1. Instrumento de recolección de datos
Figura 7.1 Recubrimiento de placas
Figura 7.2 Elaboración de muestra
Figura 7.3 Lectura de placas en AFM
61
Anexo 2: Tabla de mediciones de las muestras w/o
Anexo 2.1 Muestra 1 sistema w/o aceite de palma-agua a temperatura de 25°C y
superficie vidrio sin recubrimiento.
Temperatura: 25°C
Superficie: Vidrio
N° Mediciones Diámetros
(nm)
N°
Mediciones
Diámetros
(nm)
1 80 26 125
2 100 27 125
3 100 28 125
4 100 29 125
5 100 30 125
6 100 31 125
7 100 32 125
8 100 33 125
9 120 34 125
10 120 35 125
11 120 36 125
12 120 37 130
13 120 38 130
14 120 39 160
15 120 40 160
16 120 41 160
17 120 42 160
18 120 43 160
19 120 44 160
20 120 45 160
21 120 46 160
22 120 47 160
23 120 48 160
24 120 49 160
25 120 50 200
�̅� 128 ± 23
62
Figura 7.4 Imagen de altura del anexo 2.1
Figura 7.5 Imagen en 3D de anexo 2.1
63
Anexo 2.2 Muestra 2 sistema w/o aceite de palma-agua a temperatura de 25°C y
superficie vidrio sin recubrimiento.
Temperatura: 25°C
Superficie: Vidrio
N° Mediciones Diámetros
(nm)
N° Mediciones Diámetros
(nm)
1 80 26 120
2 100 27 120
3 100 28 120
4 100 29 120
5 100 30 125
6 120 31 125
7 120 32 125
8 120 33 150
9 120 34 160
10 120 35 160
11 120 36 160
12 120 37 160
13 120 38 160
14 120 39 160
15 120 40 160
16 120 41 160
17 120 42 160
18 120 43 160
19 120 44 160
20 120 45 160
21 120 46 160
22 120 47 160
23 120 48 160
24 120 49 160
25 120 50 200
�̅� 133 ± 24
64
Figura 7.6 Imagen de altura del anexo 2.2
Figura 7.7 Imagen en 3D del anexo 2.2
65
Anexo 2.3 Muestra 3 sistema w/o aceite de palma-agua a temperatura de 25°C y
superficie vidrio sin recubrimiento.
Temperatura: 25°C
Superficie: Vidrio
N° Mediciones Diámetros
(nm)
N° Mediciones Diámetros
(nm)
1 80 26 120
2 100 27 120
3 100 28 120
4 100 29 120
5 100 30 120
6 100 31 120
7 100 32 120
8 100 33 120
9 100 34 120
10 100 35 120
11 100 36 120
12 100 37 120
13 100 38 125
14 100 39 125
15 120 40 130
16 120 41 130
17 120 42 140
18 120 43 140
19 120 44 160
20 120 45 160
21 120 46 160
22 120 47 160
23 120 48 160
24 120 49 160
25 120 50 160
�̅� 121 ± 20
66
Figura 7.8 Imagen de altura del anexo 2.3
Figura 7.9 Imagen en 3D del anexo 2.3
67
Anexo 2.4 Muestra 1 sistema w/o aceite de palma-agua a temperatura de 40°C y
superficie vidrio sin recubrimiento.
Temperatura: 40°C
Superficie: Vidrio
N° Mediciones Diámetros
(nm)
N° Mediciones Diámetros
(nm)
1 100 26 120
2 100 27 125
3 100 28 125
4 100 29 125
5 100 30 125
6 100 31 130
7 100 32 140
8 100 33 160
9 100 34 160
10 100 35 160
11 120 36 160
12 120 37 160
13 120 38 160
14 120 39 160
15 120 40 160
16 120 41 160
17 120 42 160
18 120 43 160
19 120 44 160
20 120 45 160
21 120 46 160
22 120 47 160
23 120 48 160
24 120 49 160
25 120 50 160
�̅� 131 ± 23
68
Figura 7.10 Imagen de altura del anexo 2.4
Figura 7.11 Imagen en 3D del anexo 2.4
69
Anexo 2.5 Muestra 2 sistema w/o aceite de palma-agua a temperatura de 40°C y
superficie vidrio sin recubrimiento.
Temperatura: 40°C
Superficie: Vidrio
N° Mediciones Diámetros
(nm)
N° Mediciones Diámetros
(nm)
1 80 26 125
2 100 27 125
3 100 28 140
4 100 29 160
5 100 30 160
6 100 31 160
7 120 32 160
8 120 33 160
9 120 34 160
10 120 35 160
11 120 36 160
12 120 37 160
13 120 38 160
14 120 39 160
15 120 40 160
16 120 41 160
17 120 42 160
18 120 43 160
19 120 44 160
20 120 45 160
21 120 46 160
22 120 47 160
23 120 48 160
24 125 49 160
25 125 50 160
�̅� 136±23
70
Figura 7.12 Imagen de altura del anexo 2.5
Figura 7.13 Imagen en 3D del anexo 2.5
71
Anexo 2.6 Muestra 3 sistema w/o aceite de palma-agua a temperatura de 40°C y
superficie vidrio sin recubrimiento.
Temperatura: 40°C
Superficie: Vidrio
N° Mediciones Diámetros
(nm)
N° Mediciones Diámetros
(nm)
1 80 26 120
2 80 27 120
3 80 28 120
4 100 29 120
5 100 30 120
6 100 31 120
7 100 32 120
8 100 33 120
9 100 34 120
10 100 35 120
11 100 36 125
12 100 37 125
13 120 38 125
14 120 39 125
15 120 40 160
16 120 41 160
17 120 42 160
18 120 43 160
19 120 44 160
20 120 45 160
21 120 46 160
22 120 47 160
23 120 48 160
24 120 49 160
25 120 50 160
�̅� 123±23
72
Figura 7.14 Imagen de altura del anexo 2.6
Figura 7.15 Imagen en 3D del anexo 2.6
73
Anexo 2.7 Muestra 1 sistema w/o aceite de palma-agua a temperatura de 25°C y
superficie vidrio barniz.
Temperatura: 25°C
Superficie: Vidrio recubierto de barniz
N° Mediciones Diámetros
(nm)
N° Mediciones Diámetros
(nm)
1 80 26 130
2 100 27 130
3 100 28 140
4 100 29 140
5 100 30 140
6 100 31 140
7 100 32 150
8 100 33 160
9 110 34 160
10 120 35 160
11 120 36 160
12 120 37 160
13 120 38 160
14 120 39 160
15 120 40 160
16 120 41 160
17 120 42 160
18 120 43 160
19 120 44 160
20 120 45 160
21 120 46 160
22 120 47 160
23 120 48 160
24 130 49 180
25 130 50 200
�̅� 135 ± 26
74
Figura 7.16 Imagen de altura del anexo 2.7
Figura 7.17 Imagen en 3D de altura del anexo 2.7
75
Anexo 2.8 Muestra 2 sistema w/o aceite de palma-agua a temperatura de 25°C y
superficie vidrio barniz.
Temperatura: 25°C
Superficie: Vidrio recubierto de barniz
N° Mediciones Diámetros
(nm)
N° Mediciones Diámetros
(nm)
1 100 26 110
2 100 27 110
3 100 28 110
4 100 29 110
5 100 30 110
6 100 31 110
7 100 32 120
8 100 33 120
9 100 34 120
10 100 35 120
11 100 36 120
12 100 37 120
13 100 38 120
14 100 39 120
15 100 40 120
16 100 41 125
17 100 42 130
18 100 43 130
19 100 44 160
20 100 45 160
21 100 46 160
22 100 47 160
23 100 48 160
24 110 49 160
25 110 50 200
�̅� 116 ± 23
76
Figura 7.18 Imagen de altura del anexo 2.8
Figura 7.19 Imagen en 3D del anexo 2.8
77
Anexo 2.9 Muestra 3 sistema w/o aceite de palma-agua a temperatura de 25°C y
superficie vidrio barniz.
Temperatura: 25°C
Superficie: Vidrio recubierto de barniz
N° Mediciones Diámetros
(nm)
N° Mediciones Diámetros
(nm)
1 90 26 120
2 100 27 120
3 100 28 120
4 100 29 120
5 100 30 120
6 100 31 120
7 100 32 120
8 100 33 120
9 100 34 130
10 100 35 130
11 100 36 130
12 100 37 130
13 100 38 140
14 100 39 140
15 100 40 140
16 100 41 140
17 100 42 150
18 110 43 160
19 110 44 160
20 110 45 160
21 110 46 160
22 110 47 160
23 110 48 160
24 120 49 160
25 120 50 200
�̅� 122 ± 24
78
Figura 7.20 Imagen de altura del anexo 2.9
Figura 7.21 Imagen en 3D del anexo 2.9
79
Anexo 2.10 Muestra 1 sistema w/o aceite de palma-agua a temperatura de 40°C y
superficie vidrio barniz.
Temperatura: 40°C
Superficie: Vidrio recubierto de barniz
N° Mediciones Diámetros
(nm)
N° Mediciones Diámetros
(nm)
1 100 26 120
2 100 27 120
3 100 28 120
4 100 29 120
5 100 30 120
6 100 31 120
7 100 32 120
8 100 33 120
9 100 34 120
10 100 35 120
11 100 36 120
12 100 37 120
13 100 38 120
14 100 39 120
15 100 40 120
16 100 41 120
17 100 42 125
18 100 43 125
19 100 44 125
20 120 45 125
21 120 46 125
22 120 47 125
23 120 48 125
24 120 49 130
25 120 50 140
�̅� 114 ± 11
80
Figura 7.22 Imagen de altura del anexo 2.10
Figura 7.23 Imagen en 3D del anexo 2.10
81
Anexo 2.11 Muestra 2 sistema w/o aceite de palma-agua a temperatura de 40°C y
superficie vidrio barniz.
Temperatura: 40°C
Superficie: Vidrio recubierto de barniz
N° Mediciones Diámetros
(nm)
N° Mediciones Diámetros
(nm)
1 75 26 120
2 75 27 120
3 75 28 120
4 75 29 120
5 80 30 120
6 100 31 120
7 100 32 120
8 100 33 120
9 100 34 120
10 100 35 120
11 100 36 120
12 100 37 120
13 100 38 120
14 100 39 120
15 100 40 120
16 100 41 120
17 100 42 125
18 100 43 125
19 100 44 125
20 100 45 125
21 100 46 125
22 100 47 125
23 100 48 160
24 100 49 160
25 120 50 160
�̅� 111 ± 19
82
Figura 7.24 Imagen de altura de anexo 2.11
Figura 7.25 Imagen en 3D del anexo 2.11
83
Anexo 2.12 Muestra 3 sistema w/o aceite de palma-agua a temperatura de 40°C y
superficie vidrio barniz.
Temperatura: 40°C
Superficie: Vidrio recubierto de barniz
N° Mediciones Diámetros
(nm)
N° Mediciones Diámetros
(nm)
1 100 26 120
2 100 27 120
3 100 28 120
4 100 29 120
5 100 30 120
6 100 31 120
7 100 32 120
8 100 33 120
9 100 34 120
10 100 35 120
11 120 36 125
12 120 37 125
13 120 38 130
14 120 39 130
15 120 40 160
16 120 41 160
17 120 42 160
18 120 43 160
19 120 44 160
20 120 45 160
21 120 46 160
22 120 47 160
23 120 48 160
24 120 49 160
25 120 50 160
�̅� 125 ± 20
84
Figura 7.26 Imagen de altura del anexo 2.12
Figura 7.27 Imagen en 3D del anexo 2.12
85
Anexo 3: Tabla de mediciones de las muestras o/w
Anexo 3.1 Muestra 1 sistema o/w aceite de soya-agua a temperatura de 25°C y
superficie vidrio sin recubrimiento.
Temperatura: 25°C
Superficie: Vidrio
N° Mediciones Diámetros
(nm)
N° Mediciones Diámetros
(nm)
1 100 26 160
2 100 27 160
3 100 28 160
4 120 29 160
5 120 30 160
6 120 31 160
7 120 32 160
8 120 33 160
9 120 34 160
10 120 35 160
11 120 36 160
12 120 37 160
13 120 38 160
14 120 39 160
15 120 40 160
16 120 41 160
17 120 42 160
18 120 43 160
19 125 44 160
20 125 45 160
21 125 46 160
22 125 47 160
23 160 48 160
24 160 49 160
25 160 50 160
�̅� 142±22
86
Figura 7.28 Imagen de altura del anexo 3.1
Figura 7.29 Imagen en 3D del anexo 3.1
87
Anexo 3.2 Muestra 2 sistema o/w aceite de soya-agua a temperatura de 25°C y
superficie vidrio sin recubrimiento.
Temperatura: 25°C
Superficie: Vidrio
N° Mediciones Diámetros (nm) N° Mediciones Diámetros (nm)
1 100 26 200
2 100 27 200
3 100 28 200
4 100 29 200
5 150 30 200
6 150 31 200
7 150 32 250
8 150 33 250
9 150 34 250
10 150 35 250
11 150 36 250
12 160 37 250
13 200 38 250
14 200 39 250
15 200 40 250
16 200 41 250
17 200 42 250
18 200 43 250
19 200 44 250
20 200 45 250
21 200 46 250
22 200 47 250
23 200 48 250
24 200 49 250
25 200 50 300
�̅� 204 ± 48
88
Figura 7.30 Imagen de altura del anexo 3.2
Figura 7.31 Imagen en 3D del anexo 3.2
89
Anexo 3.3 Muestra 3 sistema o/w aceite de soya-agua a temperatura de 25°C y
superficie vidrio sin recubrimiento.
Temperatura: 25°C
Superficie: Vidrio
N° Mediciones Diámetros
(nm)
N° Mediciones Diámetros
(nm)
1 160 26 200
2 160 27 200
3 160 28 200
4 160 29 200
5 160 30 200
6 160 31 200
7 160 32 200
8 160 33 200
9 160 34 200
10 160 35 200
11 160 36 200
12 160 37 200
13 160 38 200
14 160 39 200
15 160 40 200
16 160 41 240
17 160 42 240
18 160 43 240
19 160 44 240
20 160 45 250
21 200 46 250
22 200 47 250
23 200 48 250
24 200 49 250
25 200 50 250
�̅� 193 ± 32
90
Figura 7.32 Imagen de altura del anexo 3.3
Figura 7.33 Imagen en 3D del anexo 3.3
91
Anexo 3.4 Muestra 1 sistema o/w aceite de soya-agua a temperatura de 40°C y
superficie vidrio sin recubrimiento.
Temperatura: 40°C
Superficie: Vidrio
N° Mediciones Diámetros
(nm)
N° Mediciones Diámetros
(nm)
1 160 26 200
2 160 27 200
3 160 28 200
4 160 29 200
5 160 30 200
6 160 31 200
7 160 32 200
8 160 33 250
9 180 34 250
10 200 35 250
11 200 36 250
12 200 37 250
13 200 38 250
14 200 39 250
15 200 40 250
16 200 41 250
17 200 42 250
18 200 43 250
19 200 44 250
20 200 45 250
21 200 46 300
22 200 47 300
23 200 48 300
24 200 49 300
25 200 50 300
�̅� 216 ± 41
92
Figura 7.34 Imagen de altura del anexo 3.4
Figura 7.35 Imagen en 3D del anexo 3.4
93
Anexo 3.5 Muestra 2 sistema o/w aceite de soya-agua a temperatura de 40°C y
superficie vidrio sin recubrimiento.
Temperatura: 40°C
Superficie: Vidrio
N° Mediciones Diámetros
(nm)
N° Mediciones Diámetros
(nm)
1 100 26 160
2 100 27 160
3 100 28 160
4 100 29 160
5 100 30 160
6 100 31 160
7 120 32 160
8 120 33 160
9 120 34 160
10 120 35 160
11 120 36 160
12 120 37 160
13 120 38 160
14 120 39 160
15 120 40 160
16 120 41 160
17 125 42 200
18 125 43 200
19 125 44 200
20 125 45 200
21 125 46 200
22 125 47 200
23 130 48 200
24 130 49 200
25 140 50 250
�̅� 147±35
94
Figura 7.36 Imagen de altura del anexo 3.5
Figura 7.37 Imagen en 3D del anexo 3.5
95
Anexo 3.6 Muestra 3 sistema o/w aceite de soya-agua a temperatura de 40°C y
superficie vidrio sin recubrimiento.
Temperatura: 40°C
Superficie: Vidrio
N° Mediciones Diámetros
(nm)
N° Mediciones Diámetros
(nm)
1 100 26 160
2 100 27 160
3 100 28 160
4 120 29 160
5 120 30 160
6 120 31 160
7 125 32 160
8 125 33 160
9 125 34 160
10 125 35 160
11 125 36 160
12 125 37 160
13 125 38 200
14 140 39 200
15 140 40 200
16 160 41 200
17 160 42 200
18 160 43 200
19 160 44 200
20 160 45 200
21 160 46 200
22 160 47 200
23 160 48 200
24 160 49 250
25 160 50 250
�̅� 161 ± 35
96
Figura 7.38 Imagen de altura del anexo 3.6
Figura 7.39 Imagen en 3D del anexo 3.6
97
Anexo 3.7 Muestra 1 sistema o/w aceite de soya-agua a temperatura de 25°C y
superficie vidrio barniz.
Temperatura: 25°C
Superficie: Vidrio con recubrimiento de barniz
N° Mediciones Diámetros
(nm)
N° Mediciones Diámetros
(nm)
1 200 26 300
2 200 27 300
3 200 28 300
4 200 29 300
5 200 30 300
6 250 31 300
7 250 32 300
8 250 33 300
9 250 34 300
10 250 35 300
11 250 36 300
12 250 37 300
13 250 38 300
14 250 39 300
15 250 40 300
16 250 41 300
17 300 42 300
18 300 43 300
19 300 44 300
20 300 45 300
21 300 46 300
22 300 47 300
23 300 48 300
24 300 49 300
25 300 50 300
�̅� 279 ± 34
98
Figura 7.40 Imagen de altura del anexo 3.7
Figura 7.41 Imagen en 3D del anexo 3.7
99
Anexo 3.8 Muestra 2 sistema o/w aceite de soya-agua a temperatura de 25°C y
superficie vidrio barniz.
Temperatura: 25°C
Superficie: Vidrio con recubrimiento de barniz
N° Mediciones Diámetros
(nm)
N° Mediciones Diámetros
(nm)
1 200 26 300
2 200 27 300
3 250 28 300
4 250 29 300
5 250 30 300
6 250 31 300
7 250 32 300
8 250 33 300
9 250 34 300
10 250 35 300
11 250 36 300
12 250 37 300
13 250 38 300
14 250 39 300
15 250 40 300
16 250 41 300
17 250 42 300
18 300 43 300
19 300 44 300
20 300 45 300
21 300 46 300
22 300 47 300
23 300 48 300
24 300 49 300
25 300 50 300
�̅� 281 ± 28
100
Figura 7.42 Imagen de altura del anexo 3.8
Figura 7.43 Imagen en 3D del anexo 3.8
101
Anexo 3.9 Muestra 3 sistema o/w aceite de soya-agua a temperatura de 25°C y
superficie vidrio barniz.
Temperatura: 25°C
Superficie: Vidrio con recubrimiento de barniz
N° Mediciones Diámetros
(nm)
N° Mediciones Diámetros
(nm)
1 200 26 300
2 200 27 300
3 200 28 300
4 200 29 300
5 200 30 300
6 200 31 300
7 200 32 300
8 200 33 300
9 200 34 300
10 250 35 300
11 250 36 300
12 250 37 300
13 250 38 300
14 250 39 300
15 250 40 300
16 250 41 300
17 250 42 300
18 250 43 300
19 250 44 300
20 250 45 300
21 250 46 300
22 250 47 300
23 250 48 300
24 250 49 300
25 250 50 300
�̅� 266 ± 38
102
Figura 7.44 Imagen de altura del anexo 3.9
Figura 7.45 Imagen en 3D del anexo 3.9
103
Anexo 3.10 Muestra 1 sistema o/w aceite de soya-agua a temperatura de 40°C y
superficie vidrio barniz.
Temperatura: 40°C
Superficie: Vidrio con recubrimiento de barniz
N° Mediciones Diámetros
(nm)
N° Mediciones Diámetros
(nm)
1 75 26 100
2 80 27 100
3 80 28 100
4 80 29 100
5 80 30 100
6 80 31 100
7 100 32 100
8 100 33 100
9 100 34 120
10 100 35 120
11 100 36 120
12 100 37 125
13 100 38 125
14 100 39 125
15 100 40 125
16 100 41 125
17 100 42 125
18 100 43 125
19 100 44 125
20 100 45 125
21 100 46 125
22 100 47 125
23 100 48 125
24 100 49 125
25 100 50 125
�̅� 105±15
104
Figura 7.46 Imagen de altura del anexo 3.10
Figura 7.47 Imagen en 3D del anexo 3.10
105
Anexo 3.11 Muestra 2 sistema o/w aceite de soya-agua a temperatura de 40°C y
superficie vidrio barniz
Temperatura: 40°C
Superficie: Vidrio con recubrimiento de barniz
N° Mediciones Diámetros
(nm)
N° Mediciones Diámetros
(nm)
1 70 26 100
2 70 27 100
3 75 28 100
4 80 29 100
5 80 30 100
6 80 31 100
7 80 32 100
8 80 33 100
9 80 34 100
10 80 35 100
11 80 36 100
12 80 37 120
13 80 38 120
14 100 39 125
15 100 40 125
16 100 41 125
17 100 42 125
18 100 43 125
19 100 44 125
20 100 45 125
21 100 46 125
22 100 47 125
23 100 48 125
24 100 49 125
25 100 50 150
�̅� 102 ± 18
106
Figura 7.48 Imagen de altura del anexo 3.11
Figura 7.49 Imagen en 3D del anexo 3.11
107
Anexo 3.12 Muestra 3 sistema o/w aceite de soya-agua a temperatura de 40°C y
superficie vidrio barniz
Temperatura: 40°C
Superficie: Vidrio con recubrimiento de barniz
N° Mediciones Diámetros
(nm)
N° Mediciones Diámetros
(nm)
1 80 26 100
2 80 27 100
3 80 28 100
4 80 29 100
5 80 30 100
6 80 31 100
7 80 32 100
8 80 33 100
9 80 34 100
10 80 35 100
11 80 36 100
12 90 37 100
13 100 38 100
14 100 39 100
15 100 40 125
16 100 41 125
17 100 42 125
18 100 43 125
19 100 44 125
20 100 45 125
21 100 46 125
22 100 47 125
23 100 48 125
24 100 49 125
25 100 50 125
�̅� 101 ± 15
108
Figura 7.50 Imagen de altura del anexo 3.12
Figura 7.51 Imagen en 3D del anexo 3.12