UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE ......Extracción con fluido supercrítico (EFS) ..... 9 1.4.3. Extracción con CO 2 como fluido supercrítico ..... 10 1.4.4. Variables

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA

CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA

Estudio de las condiciones óptimas de extracción mediante

fluido supercrítico del extracto de las hojas de chiriyuyo

(Kalanchoe pinnata)

Trabajo de titulación, modalidad proyecto de investigación

para la obtención del título de Ingeniero Químico

Autor: Yadira Isabel Vilca Tobar

Tutor: Dra. Elvia Victoria Cabrera Maldonado

QUITO

2019

ii

©DERECHOS DE AUTOR

Yo, Yadira Isabel Vilca Tobar en calidad de autor y titular de los derechos morales y

patrimoniales del trabajo de titulación Estudio de las condiciones óptimas de extracción

mediante fluido supercrítico del extracto de las hojas de chiriyuyo (Kalanchoe pinnata),

modalidad Proyecto de Investigación, de conformidad con el Art. 114 del CÓDIGO

ORGÁNICO DE LA ECONOMIA SOCIAL DE LOS CONOCIMIENTOS,

CREATIVIDAD E INNOVACIÓN, concedo a favor de la Universidad Central del

Ecuador una licencia gratuita, intransferible y no exclusiva para el uso comercial de la

obra, con fines estrictamente académicos. Conservo a mi favor todos los derechos de autor

sobre la obra, establecidos en la norma citada.

Así mismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la

digitalización y publicación de este trabajo de titulación en el repositorio virtual, de

conformidad a lo dispuesto en el Art. 114 de la Ley Orgánica de Educación Superior.

El autor declara que la obra objeto de la presente autorización es original en su forma de

expresión y no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo la responsabilidad por

cualquier reclamación que pudiera presentarse por esta causa y liberando a la Universidad

de toda responsabilidad.

En la ciudad de Quito, a los 12 días del mes de Marzo del 2019.

Firma:

________________________

Yadira Isabel Vilca Tobar

C.C. 1725494098

[email protected]

iii

APROBACION DEL TUTOR

Yo, Elvia Victoria Cabrera Maldonado en calidad de tutor del trabajo de titulación,

modalidad proyecto de investigación Estudio de las condiciones óptimas de extracción

mediante fluido supercrítico del extracto de las hojas de chiriyuyo (Kalanchoe pinnata),

elaborado por la estudiante Yadira Isabel Vilca Tobar, de la carrera de Ingeniería Química

de la Facultad de Ingeniería Química de la Universidad Central del Ecuador, considero

que el mismo reúne los requisitos y méritos necesarios en el campo metodológico y en el

campo epistemológico, para ser sometido a la evaluación por parte del jurado examinador

que se designe, por lo que lo APRUEBO, a fin de que el trabajo investigativo sea

habilitado para continuar con el proceso de titulación determinado por la Universidad

Central del Ecuador.

En la ciudad de Quito, a los 12 días del mes de Marzo del 2019.

------------------------------------------

Dra. Elvia Cabrera

C.C. 1757151921

iv

DEDICATORIA

A Dios por guiar cada uno de mis pasos y ofrecerme la vida que hoy tengo y

A mi familia por ser mi fuerza motora y el pilar fundamental de mi vida.

v

AGRADECIMIENTOS

A cada uno de los profesores de la Facultad de Ingeniería Química de la Universidad

Central del Ecuador quienes me dieron las pautas durante toda la carrera para formarme

profesionalmente y así el día de hoy poder culminarla.

A la Doctora Elvia Cabrera, quien me apoyó con su conocimiento, tiempo y experiencia

para que pueda culminar mi trabajo de investigación y así poder realizarme como

profesional.

Doy gracias al Ingeniero Pablo Londoño y la Ingeniera Estefanía Villamarín por su

tiempo y colaboración durante la elaboración de mi trabajo de investigación.

A mi mejor amiga Lissette quien con sus palabras me dio ánimo en los momentos difíciles

y con la que compartí muchas alegrías también, gracias por tu apoyo incondicional

durante estos 15 años de amistad.

A todos y cada uno de mis amigos quienes me extendieron su mano en los tiempos

difíciles, a aquellos que estuvieron a mi lado durante toda la carrera y aquellas personas

que me brindaron la oportunidad de conocer el significado de la amistad.

A mi novio Cristian por estar a mi lado, llenarme de cariño y amor durante este proceso

y poder culminar uno de mis objetivos.

vi

CONTENIDO

Pág.

LISTA DE TABLAS……………………………………... ............................................ x

LISTA DE FIGURAS…………………………………… ........................................... xii

LISTA DE ANEXOS……………………………………. .......................................... xiv

RESUMEN………………………………………………. ........................................... xv

ABSTRACT………………………………………………. ........................................ xvi

INTRODUCCIÓN…………………………………………. .......................................... 1

1. MARCO TEÓRICO………………………………………. ................................. 3

1.1. Generalidades de la planta Kalanchoe Pinnata .................................................... 3

1.2. Principios Activos ............................................................................................... 4

1.2.1. Polifenoles .......................................................................................................... 4

1.2.2. Flavonoides ......................................................................................................... 5

1.3. Obtención de extractos por métodos convencionales ........................................... 6

1.3.1. Extracción Soxhlet .............................................................................................. 6

1.3.2. Extracción por maceración .................................................................................. 7

1.4. Obtención de extractos por fluidos supercríticos (EFS) ........................................ 8

1.4.1. Fluido supercrítico............................................................................................... 8

1.4.2. Extracción con fluido supercrítico (EFS) ............................................................. 9

1.4.3. Extracción con CO2 como fluido supercrítico .................................................... 10

1.4.4. Variables operacionales de la EFS ..................................................................... 11

1.5. Métodos de identificación y cuantificación de metabolitos secundarios ............. 13

vii

2. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL……………………………………….....14

2.1. Diseño Experimental para la extracción por CO2 supercrítico ........................... 14

2.1.1. Variables Dependientes ..................................................................................... 14

2.1.2. Variables Independientes: .................................................................................. 14

2.1.3. Variables Fijas................................................................................................... 14

2.1.4. Diseño Experimental ......................................................................................... 15

2.2. Diagrama de flujo del proceso de extracción mediante CO2 supercrítico ............ 16

2.3. Diagrama de fases del proceso ........................................................................... 17

2.4. Metodología para las fases de la Investigación................................................... 17

2.4.1. Tratamiento de las hojas de Kalanachoe Pinnata ............................................... 17

2.4.2. Extracción mediante CO2 supercrítico del polvo de las hojas de K. Pinnata y

determinación del rendimiento .................................................................................... 21

2.4.3. Estimación del contenido total de flavonoides en el extracto de las hojas de

Kalanachoe Pinnata. ................................................................................................... 26

2.4.4. Caracterización por marchas fitoquímicas y cromatografía de gases con

espectrometría de masa ............................................................................................... 30

2.4.5. Análisis de Datos............................................................................................... 32

3. CÁLCULOS Y RESULTADOS……………………………………………..…33

3.1. Cálculos del tratamiento a las hojas de Kalanachoe Pinnata ............................. 33

3.1.1. Cálculo de la humedad promedio de las hojas frescas de Kalanachoe Pinnata ... 33

3.2. Cálculos de la extracción mediante CO2 supercrítico del polvo de las hojas de K.

Pinnata y determinación del rendimiento .................................................................... 35

3.2.1. Cálculo del flujo volumétrico del co-solvente empleado en la extracción ........... 35

3.2.2. Cálculo del rendimiento del extracto.................................................................. 40

3.3. Cálculos de la estimación del contenido total de flavonoides en el extracto de las

hojas de Kalanachoe Pinnata. ..................................................................................... 42

3.3.1. Cálculos para la curva de calibración ................................................................. 42

viii

3.3.2. Cuantificación de flavonoides totales en los extractos obtenidos por EFS .......... 43

3.4. Caracterización por marchas fitoquímicas y cromatografía de gases con

espectrometría de masa ............................................................................................... 48

3.4.1. Resultados de la caracterización por marchas fitoquímicas ................................ 48

3.4.2. Resultados de la caracterización por cromatografía de gases con espectrometría de

masa ........................................................................................................................... 48

3.5. Resultados para el análisis de Datos .................................................................. 50

3.5.1. Análisis estadístico para el Rendimiento del extracto obtenido por EFS ............. 51

3.5.2. Análisis estadístico para el TFC de extracto obtenido por EFS........................... 52

4. DISCUSIÓN……………………………………………………………………..53

4.1. Características y consideraciones en el tratamiento de las hojas de Kalanchoe

pinnata. ....................................................................................................................... 53

4.2. Extracción mediante CO2 supercrítico del polvo de las hojas de K. pinnata y

determinación del rendimiento .................................................................................... 55

4.2.1. Resultados del rendimiento de extracción .......................................................... 55

4.2.2. Optimización del rendimiento del extracto obtenido mediante fluido supercrítico

CO2 ............................................................................................................................. 56

4.2.3. Comparación entre la extracción por maceración y mediante fluido supercrítico

CO2 ............................................................................................................................. 58

4.3. Estimación del contenido total de flavonoides (TFC) en el extracto de las hojas de

Kalanachoe pinnata .................................................................................................... 60

4.3.1. Resultados de la estimación (TFC) .................................................................... 60

4.3.2. Optimización del contenido total de flavonoides en las hojas de Kalanchoe

pinnata........................................................................................................................ 61

4.4. Resultados para la caracterización por marchas fitoquímicas y cromatografía de

gases con espectrometría de masa del extracto de K. pinnata ....................................... 62

4.4.1. Caracterización mediante marcha fitoquímica.................................................... 62

4.4.2. Caracterización por cromatografía de gases con espectrometría de masa (CG-EM)

................................................................................................................................... 63

ix

5. CONCLUSIONES…………………………………………. .................................... 64

6. RECOMENDACIONES………………………………………… ............................ 65

CITAS BIBLIOGRAFICAS………………………………….. ................................... 66

ANEXOS…………………………………………………………. .............................. 72

x

LISTA DE TABLAS

Pág.

Tabla 1. Tipos de flavonoides y sus estructuras moleculares ......................................... 5

Tabla 2.Propiedades supercríticas de ciertas sustancias ................................................ 9

Tabla 3.Propiedades de algunas sustancias usadas como fluidos supercríticos ............. 10

Tabla 4. Investigaciones de extracción con fluidos supercríticos de productos naturales

................................................................................................................................... 12

Tabla 5. Diseño experimental de la investigación sin réplica ....................................... 15

Tabla 6. Niveles de los parámetros en investigación .................................................... 15

Tabla 7. Humedad promedio de las hojas frescas de Kalanchoe pinnata ...................... 34

Tabla 8. Porcentaje de humedad de las hojas secas ...................................................... 35

Tabla 9. Flujos volumétricos empleados en cada experimento de la extracción por EFS

................................................................................................................................... 40

Tabla 10. Resultados de los rendimientos de los extractos obtenidos por EFS ............. 41

Tabla 11. Resultados de los volúmenes necesarios para aforar a 10 mL las soluciones

estándar ...................................................................................................................... 43

Tabla 12. Concentraciones de las soluciones diluidas de quercetina con sus respectivas

absorbancias ............................................................................................................... 43

Tabla 13. Concentraciones de quercetina equivalente en los extractos ......................... 45

Tabla 14. Contenido total de flavonoides (TFC) .......................................................... 47

Tabla 15. Identificación de flavonoides en el extracto ................................................. 48

Tabla 16. Compuestos identificados en el extracto de hojas de Kalanchoe pinnata

disuelto en etanol ........................................................................................................ 49


disuelto en cloroformo ................................................................................................ 50

Tabla 18. Representación de los factores empleados en las hipótesis nulas y alternativas

................................................................................................................................... 51

Tabla 19. ANOVA para el rendimiento del extracto .................................................... 51

Tabla 20:ANOVA para el contenido total de flavonoides (TFC) del extracto .............. 52

xi

Tabla 21. Características de las hojas de Kalanchoe pinnata ....................................... 53

Tabla 22. Características y rendimientos de los extractos de las hojas de K. pinnata

obtenidos por diferentes tipos de extracción ................................................................ 59

xii

LISTA DE FIGURAS

Pág.

Figura 1. Kalanchoe pinnata ........................................................................................ 3

Figura 2. Diagrama de fases para el CO2 ....................................................................... 8

Figura 3. Diagrama de flujo del proceso de investigación ............................................ 16

Figura 4. Fases de la Investigación .............................................................................. 17

Figura 5. Hojas de Kalanchoe pinnata dentro de la estufa a las condiciones

especificadas ............................................................................................................... 19

Figura 6. Proceso de secado de las hojas de chiriyuyo ................................................. 19

Figura 7. Molino centrífugo ........................................................................................ 20

Figura 8. Sistema de análisis granulométrico ............................................................... 20

Figura 9. Esquema del equipo de fluido supercrítico ................................................... 22

Figura 10. Crisol con 40 g de polvo de hojas de K. pinnata ......................................... 23

Figura 11. Tanque extractor del equipo EFS ................................................................ 23

Figura 12. Tanque extractor dentro del horno del equipo EFS ..................................... 24

Figura 13. Imagen del equipo de Extracción con fluido supercrítico ............................ 26

Figura 14. Preparación de las soluciones estándar de quercetina para la curva de

calibración .................................................................................................................. 28

Figura 15. Reactivos preparados.................................................................................. 28

Figura 16. Extractos obtenidos por EFS ...................................................................... 29

Figura 17. Preparación de viale ................................................................................... 32

Figura 18. Curva de calibración de quercetina ............................................................. 44

Figura 19. Cromatograma CG-EM del extracto de hojas de Kalanchoe pinnata disuelto

en etanol ..................................................................................................................... 48

Figura 20. Cromatograma CG-EM del extracto de hojas de Kalanchoe pinnata disuelto

en cloroformo ............................................................................................................. 49

Figura 21. Efecto del Flujo de CO2 sobre el rendimiento de extracción ....................... 55

Figura 22. Diagrama de pareto estandarizado para el rendimiento del extracto ............ 57

xiii

Figura 23. Gráfica de efectos principales para el rendimiento del extracto obtenido por

extracción con fluido supercrítico CO2 ........................................................................ 57

Figura 24. Gráfico de superficie de respuesta estimada a temperatura constante .......... 58

Figura 25. Comparación de los rendimientos de extracción por maceración y EFS ...... 59

Figura 26. Diagrama de Pareto estandarizado para el TFC ........................................... 61

Figura 27. Efectos principales para el TFC .................................................................. 61

Figura 28. Gráfico de superficie de respuesta estimada a tiempo dinámico constante... 62

xiv

LISTA DE ANEXOS

Pág.

ANEXO A. Análisis granulométrico del polvo de las hojas de K. pinnata ................... 73

ANEXO B. Mediciones de absorbancias de los diferentes extractos obtenidos por EFS

................................................................................................................................... 74

ANEXO C. Marcha Fitoquímica: Reacción de Shinoda ............................................... 75

ANEXO D. Marcha Fitoquímica: Reacción de Cloruro Férrico ................................... 76

ANEXO E. Marcha Fitoquímica: Reacción de Cianidina ............................................ 77

xv

TITULO: Estudio de las condiciones óptimas de extracción mediante fluido

supercrítico del extracto de las hojas de chiriyuyo (Kalanchoe pinnata).

Autora: Yadira Isabel Vilca Tobar


RESUMEN

Se optimizaron las condiciones de presión, temperatura y tiempo dinámico, en el

rendimiento y contenido total de flavonoides (TFC) del extracto de las hojas de

Kalanchoe pinnata, obtenido mediante fluido supercrítico, CO2.

Para la extracción se trabajó con polvo de hoja con un tamaño de partícula (≤1 mm),

acondicionado a una humedad del 8–10%. Se llevó a presiones de 150 y 200 bar,

temperaturas de 35 y 40 ºC y tiempos dinámicos de 60 y 120 min, fijando el tiempo

estático en 80 min, el solvente a 5 L / min y una relación del 5% en masa de etanol

48%(v/v) / CO2. Para la estimación del TFC se aplicó el método colorimétrico de cloruro

de aluminio.

La identificación de las mejores condiciones se realizó aplicando la metodología de

superficie de respuesta con un diseño experimental 23. Se obtuvo como resultado un

rendimiento del 1,59% y un TFC de 0,4575 mg Quercetina Equivalente (QE) / g muestra

seca, a las condiciones óptimas: presión de 200 bar, temperatura de 35 ºC y tiempo

dinámico de 120 min, concluyendo que la variable con mayor influencia significativa es

la presión.

PALABRAS CLAVE: OPTIMIZACIÓN/ EXTRACCIÓN/ FLUIDOS

SUPERCRÍTICOS / DIOXIDO DE CARBONO / KALANCHOE PINNATA /

CHIRIYUYO / FLAVONOIDES.

xvi

TITLE: Study of the optimal conditions of extraction through supercritical fluid of

the extract of the leaves of chiriyuyo (Kalanchoe pinnata).

Author: Yadira Isabel Vilca Tobar


ABSTRACT

The conditions of pressure, temperature and dynamic time, in the yield and total content

of flavonoids (TFC) of the extract of the leaves of Kalanchoe pinnata, obtained by means

of supercritical fluid, CO2, were optimized.

For the extraction we worked with leaf powder with a particle size (≤1 mm), conditioned

at a humidity of 8-10%. It was brought to pressures of 150 and 200 bar, temperatures of

35 and 40 ºC and dynamic times of 60 and 120 min, fixing the static time in 80 min, the

solvent at 5 L / min and a ratio of 5% in mass of ethanol 48% (v / v) / CO2. For the

estimation of the TFC, the colorimetric method of aluminum chloride was applied.

The identification of the best conditions was carried out applying the response surface

methodology with an experimental design 2 ^ 3. The result was a yield of 1.59% and a

TFC of 0.4575 mg Equivalent Quercetin (QE) / g dry sample, at the optimum conditions:

pressure of 200 bar, temperature of 35 ºC and dynamic time of 120 min, concluding that

the variable with the most significant influence is the pressure.

KEY WORDS: OPTIMIZATION / EXTRACTION / SUPERCRITICAL FLUIDS

/ CARBON DIOXIDE / KALANCHOE PINNATA / CHIRIYUYO / FLAVONOIDS.

1

INTRODUCCIÓN

El Ecuador posee una gran diversidad en cuanto a flora, que ha sido reconocida y

estudiada por varios años, aproximadamente existen 18766 especies de plantas

vasculares, de estas, se han detectado 5172 como especies útiles en lo que se refiere a

usos medicinales, alimenticios y materiales de construcción (Balslev, Navarrete, Torre,

& Macía, 2008). En el campo medicinal, 3118 plantas son usadas de forma tradicional

(Vacas Cruz et al., 2015). En cuanto a su distribución geográfica un 42 % se encuentra en

la región Oriente del Ecuador, de este porcentaje se identificó en la Provincia de Napo

(Tena) una planta llamada comúnmente Chiriyuyo, cuyo nombre científico es Kalanchoe

Pinnata, el extracto obtenido a partir de sus hojas, tallos y raíces presentan propiedades

particulares que lo convierten en un recurso biológico antioxidante, inmunomodulador,

antialérgico, anticancerígeno, antiviral, anticonvulsivo, antihipertensivo, antifúngico,

entre otros (Bopda et al., 2014).

Para la obtención de extractos a partir de materias primas vegetales se emplean métodos

tradicionales como la maceración y extracción soxhlet que si bien, proporcionan buenos

rendimientos (Alara, Abdurahman, & Ukaegbu, 2018a), involucran grandes cantidades

de tiempo y solvente así como también la descomposición de compuestos orgánicos.

En los últimos años se ha planteado ciertas tecnologías medioambientales como la

extracción asistida por microondas, extracción ultrasónica y extracción con fluido

supercrítico (EFS), siendo la última metodología empleada actualmente en varias

investigaciones y de las cuales se han obtenido mejores resultados de extracción de

compuestos activos de manera eficiente, superando las técnicas convencionales

(Ferrentino, Morozova, Mosibo, Ramezani, & Scampicchio, 2018).

En Ecuador están reportados algunos trabajos relacionados con la extracción de

compuestos mediante fluido supercrítico, la mayoría se enfatizan en la obtención de

aceites de semillas y determinación de compuestos activos de plantas pero, en la

actualidad no hay información respecto a la extracción con fluido supercrítico del extracto

2

activo de las hojas de Kalanchoe pinnata que, dada sus comprobadas propiedades

anteriormente señaladas, hace un interesante objetivo de estudio la optimización de la

extracción a partir de la fuente natural vegetal.

Basado en estas evidencias y gracias a la disponibilidad de un equipo de EFS en la

Facultad de Ingeniería Química de la Universidad Central del Ecuador, se realizó un

estudio del proceso de extracción aplicando fluido supercrítico CO2 a las hojas de

Chiriyuyo para determinar si se obtiene un mejor resultado en cuanto a rendimiento y

calidad, optimizando las variables del proceso de extracción.

Este trabajo aporta con el desarrollo de investigaciones previas y además de la obtención

de un extracto natural de alta calidad en cuanto a compuestos activos que podrían ser

aplicados en el campo farmacéutico, alimenticio, cosmético, etc.

3

1. MARCO TEÓRICO

1.1. Generalidades de la planta Kalanchoe Pinnata

Kalanchoe pinnata también conocida como Bryophyllum pinnatum, es una planta

medicinal perteneciente a la familia Crussulaceae, el estudio del extracto acuoso de sus

hojas presenta gracias a los análisis fitoquímicos, alcaloides, saponinas, taninos, esteroles,

flavonoides, vitaminas, y minerales (Bopda et al., 2014), físicamente esta hierba exhibe

hojas de color verde oscuro festoneadas y bordadas por un color rojizo, tallos altos

(huecos) y flores colgantes en forma de campana.

Endémicamente proviene de Madagascar (Mora-Pérez & Hernández-Medel, 2016) pero

esta especie ha sido localizada también en las regiones templadas como Asia, Australia,

Nueva Zelanda, Polinesia, Ecuador, México, (Sharker et al., 2012a) debido a que ha sido

introducida y naturalizada.

Figura 1. Kalanchoe pinnata (autor)

Su actividad biológica le ha permitido destacarse en el campo farmacológico

combatiendo ciertas patologías como infecciones, reumatismo e inflamación; por otra

parte, también se utilizan para el tratamiento del dolor de oído, quemaduras, úlceras,

diarrea y picaduras de insectos (Bogucka-Kocka, Zidorn, Kasprzycka, Szymczak, &

Szewczyk, 2018)

4

1.2. Principios Activos

Esta hierba medicinal está constituida por un grupo de compuestos químicos endógenos

llamados antioxidantes, que son moléculas orgánicas capaces de inhibir o retrasar el

proceso de oxidación a través de varios mecanismos, uno de ellos es la interacción de

electrones liberados por estas sustancias con los radicales libres presentes en un cuerpo o

individuo. Esta neutralización se da gracias a una afinidad superior existente entre los

antioxidantes y los radicales libres en comparación con cualquier otro tipo de sustrato

oxidable; entendiendo como tal a la mayoría de moléculas orgánicas como inorgánicas

que forman parte de células vivas como por ejemplo los lípidos, proteínas, hidratos de

carbono, incluso el mismo ADN (García, 2001)(Uwalsky, 1840)(Justo & Gutiérrez, 2002)

(Iglesias, 2009).

1.2.1 Polifenoles

Una parte del potencial antioxidante en las plantas se debe a compuestos polifenólicos

presentes; estos son un grupo de metabolitos secundarios derivados naturalmente del

vegetal. Los polifenoles ejercen el papel de agentes reductores, eliminadores de iones

metálicos quelatos y de radicales libres, también están en la capacidad de estabilizarlos,

pueden ser cofactores de enzimas que catalizan reacciones oxidativas, inhiben oxidasas y

dan fin a reacciones de la cadena radical.

Existen varias clases de polifenoles, como por ejemplo ácidos benzoicos, ácidos

cinámicos, ácidos fenólicos, cumarinas y flavonoides (Martínez & Expósito, 2018), K.

pinnata contiene precisamente esta clase de polifenoles cuya actividad ayuda a la

prevención de algunos tipos de cáncer. Químicamente están presentes p-hidroxicinámico,

cafeico, p-cumárico, ferúlico, p-hidroxibenzoico, ácidos protocatéquicos, quercetina,

kaempferol, luteolina, astragalina, rutina y patuletina (Bogucka-Kocka et al., 2018).

5

1.2.2 Flavonoides

Los flavonoides son moléculas polifenólicas presentes esencialmente en las hojas de

plantas vasculares, se caracterizan por exhibir una estructura de tipo (C6-C3-C6) que

consiste de dos anillos bencénicos en los extremos de la molécula (anillo A y B), unidos

por tres átomos de carbono que pueden o no formar un tercer anillo denominado (anillo

C) (Soto, 2015); se dividen en flavonoides, isoflavonoides y neoflavonoides, además se

incluyen otras moléculas como las chalconas, hidrochalconas, auronas y auronoles

(Cabrera & Mach, 2012). Las modificaciones estructurales a la base se dan por sustitución

de grupos metoxilo, metilendioxi, acetilo y residuos de azúcares(Osmany Cuesta R,

Ingrid Márquez H, 2015).

Los flavonoides poseen diversas propiedades debido a la variación en el número y

disposición de los grupos hidroxilo, así como también de la naturaleza, grado de

alquilación y glicosilación de los mismos (Zamora, 2016), de esta forma tienen un poder

antioxidantes, antiinflamatorio, antialérgico, antitumoral, antifúngico e inhibidor de

enzimas.

Tabla 1. Tipos de flavonoides y sus estructuras moleculares (Marriott, 2013)

Tipo de Flavonoide Estructura Nombre

Isoflavonas

R1=H

R2=OCH3

R3=OH

Gliciteina

Chalconas R1=OH

R2=OH

R3= OCH3

2,6-dihidroxi-4´-

metoxichalcona

6

Tabla 1. (Continuación)

Tipo de Flavonoide Estructura Nombre

Flavanonas

R1=H

R2=H

R3=H

Pinocembrina

Flavonoles R1=OH

R2=OH

R3=H

Quercetina

Antocianinas

R1=OH

R2=OH

R3=H

Cianidina

1.3. Obtención de extractos por métodos convencionales

Para la obtención de extractos a partir de una planta, tradicionalmente se empleaban la

decocción o la infusión, que si bien, permiten extraer cierta parte activa de la planta, son

métodos poco reproducibles al contrario de la extracción soxhlet y maceración, que

además de ser simples, admiten una cuantificación de compuestos con cierta actividad

que se encuentran presentes en la muestra a examinar. (Verde, Aranday, & Rivas, 2016)

1.3.1. Extracción Soxhlet

La extracción soxhlet es una técnica de lixiviación comúnmente utilizada para la

extracción de compuestos fenólicos, trabaja con menos tiempo y solvente que otros

métodos convencionales como la maceración, generando así un elevado rendimiento en

7

cuanto a transferencia de masa a partir de una muestra (Alara, Abdurahman, & Ukaegbu,

2018b).

Operacionalmente es una técnica continua-discreta, donde se procede a colocar la muestra

vegetal en un soporte de dedal, este se llena de disolvente fresco condensado desde un

matraz de destilación hasta que llega al punto de desbordamiento donde es aspirado por

un sifón llevando los compuestos requeridos en el solvente nuevamente hacia el equipo

de destilación. Para concluir con la extracción se debe llevar a cabo un proceso de

evaporación y concentración. (Luque de Castro, Ruiz Jiménez, & García Ayuso, 2013)

En un estudio comparativo de extracción de aceite de nuez moscada entre EFS y

extracción soxhlet se observó un mayor rendimiento en la extracción con fluido

supercrítico con un valor de 38,8 g de aceite, mientras que con extracción soxhlet se

obtuvo 34 g de aceite ambos sobre 100 g de muestra. Además en lo que se refiere a

calidad, los extractos por EFS exhibieron un grupo éter aromático significativamente más

alto que en los extractos conseguidos por extracción soxhlet (Al-Rawi, Ibrahim, Majid,

Abdul Majid, & Kadir, 2013).

1.3.2. Extracción por maceración

Por mucho tiempo se ha empleado la maceración como un método de extracción sólido-

líquido, se lleva a cabo gracias al contacto del material vegetal en ciertas condiciones con

un solvente seleccionado por polaridad en un lapso de tiempo determinado; esta técnica

puede ser aplicada en frío o en caliente dependiendo de la materia prima o el

requerimiento, adicional, se puede complementar con agitación para mejorar la

solubilidad de compuestos y por ende la eficiencia del proceso. Por último, el extracto

obtenido se somete a evaporación para la concentración de los compuestos y eliminación

del solvente. (Enrique et al., 2013)(Bishr, El-Degwy, Abdel Hady, Amin, & Salama,

2017)

En una investigación sobre la extracción de piretrinas de flores de piretro

(Chrysanthemum cinerariifolium) con los métodos de maceración y fluido supercrítico se

observó que el rendimiento obtenido por la EFS tuvo un valor de aproximadamente 4,1

% del material extraído con respecto al peso de las flores secas con la ventaja de que no

8

requirió el uso de co-disolvente y en un tiempo de 40 minutos. Por otra parte, las

extracciones con maceración tradicional tuvieron contenidos máximos de sustancias

extraíbles en n-hexano (3,03%) y alcohol etílico (5,77%) en un tiempo de 4 días (Gallo

et al., 2017).

1.4. Obtención de extractos por fluidos supercríticos (EFS)

1.4.1. Fluido supercrítico

Se denomina fluido supercrítico a cierta sustancia pura que se encuentra operando en

condiciones de presión y temperatura por encima de su punto crítico; en un diagrama de

fases esta zona se designa como “estado supercrítico” y exhibe propiedades peculiares en

los compuestos, de modo que presentan características tanto de líquidos como de gases,

esta particularidad les permite tener alta densidad, baja viscosidad y elevada difusividad

que son propiedades susceptibles a cambios ya sea por efecto del aumento o disminución

de presión o temperatura (Valverde, 2002) (Cardona & Orrego, 2009).

Figura 2. Diagrama de fases para el CO2 (Romero et al., 2010)

9

El punto crítico es propio de cada sustancia de tal forma que escoger un solvente

apropiado es determinante a la hora de llegar a este estado.

Tabla 2.Propiedades supercríticas de ciertas sustancias (Liley et al., 1999)

Fluido Temperatura crítica

(°C)

Presión crítica

(atm)

Densidad crítica

(g/cm3)

CO2 31,06 73,9 0,463

N2O 36,42 72,8 0,321

NH3 132,50 113,0 0,236

C2H5OH 240,77 61,2 0,449

H2O 373,98 219,4 0,274

1.4.2. Extracción con fluido supercrítico (EFS)

La extracción con fluido supercrítico es una operación unitaria que se utiliza comúnmente

en la obtención de compuestos activos de una matriz vegetal por transferencia de masa a

partir del uso de un agente extractor en estado supercrítico.

Esta tecnología reemplaza los métodos de separación tradicionales gracias a ciertas

ventajas que presenta, una de ellas es que su procedimiento es amigable con el medio

ambiente debido a que no usa sustancias tóxicas o en caso de hacerlo, en pequeñas

cantidades, además no necesita ningún proceso de separación previo o adicional y debido

a que trabaja con fluidos supercríticos es posible ajustar el poder de solvatación del mismo

manipulando ciertas variables permitiendo realizar extracciones selectivas, rápidas y

efectivas en las que se proporciona un extracto estable y uniforme. (Favareto et al.,

2017)(Bishr et al., 2017)

La extracción se lleva a cabo bajo cuatro etapas generales, la primera es un ajuste de

temperatura mediante resistencias que aportan energía térmica, el solvente previamente

escogido se calienta hasta elevarlo por encima de su temperatura crítica. La segunda etapa

es un proceso de presurización en la que el disolvente ya calentado llega a un valor

superior a su presión crítica. La tercera etapa es la fase de extracción y el fluido ya en las

10

condiciones deseadas permanece en contacto con la muestra que lleva consigo el soluto.

Por último, queda la etapa de separación, aquí el gas se descomprime por debajo de su

presión crítica dejando al soluto libre en el recipiente del equipo (Ramírez, 2017)(Pantoja,

2016)

1.4.3. Extracción con CO2 como fluido supercrítico

El disolvente más empleado en extracciones con fluido supercrítico es el CO2, esto gracias

a las excelentes características que presenta frente a otros solventes, entre estas cabe

mencionar que es una sustancia no tóxica, no inflamable, no corrosiva, con alta pureza,

químicamente inerte y su adquisición es fácil y relativamente barata. (EntrainerHazuki et

al., 2016)

Por otra parte, su uso tiene un gran interés debido a que sus propiedades fisicoquímicas

como baja temperatura crítica evita o minimiza la degradación de compuestos

termolábiles y la generación de compuestos indeseables (Villanueva-Bermejo, Zahran,

García-Risco, Reglero, & Fornari, 2017); otras propiedades como la densidad, viscosidad

y difusividad le confieren una alta selectividad en cuanto a compuestos no polares, lo que

puede mencionarse como una ligera desventaja. La obtención de compuestos polares se

supera con la adición de pequeñas cantidades de agentes de arrastre como co-disolventes,

entre los más empleados el agua y etanol (Gallo et al., 2017).

Tabla 3.Propiedades de algunas sustancias usadas como fluidos supercríticos

(Antonio, Camacho, & Lobato, 2004)

Propiedades CO2 NH3 H2O(l) N2O CFC HC CH3OH

Toxicidad + - + + + -

Inflamabilidad + - + + - -

Bajo Costo + - + + - -

Reactividad + - - - + + -

Facilidad en alcanzar condiciones

supercríticas

+ - - + + + -

Impacto ambiental + + - -

11


Propiedades CO2 NH3 H2O(l) N2O CFC HC CH3OH

Gas en condiciones ambientales + + + + +

Polaridad - + + + + - +

Donde: (+) Favorable para la extracción (-) Desfavorable para la extracción

(CFC) Clorofluorocarbonados (HC) hidrocarburos

1.4.4. Variables operacionales de la Extracción con fluido supercrítico (EFS)

Para una extracción concreta con fluido supercrítico se debe tomar en cuenta las

características que tienen la matriz vegetal, la materia que se desea extraer y el disolvente

que se empleará, puesto que de estas dependen las condiciones operativas con las que se

diseñará la metodología experimental (Raventos, 2005).

Por otra parte, es necesario tener un conocimiento previo de las variables que van a tener

influencia durante el proceso de extracción ya que es el primer paso hacia una

optimización. A continuación se describen algunos de los factores que intervienen en este

tipo de extracción (Valverde, 2002):

Presión y Temperatura: el poder de solvatación del agente extractor está

estrictamente relacionado con su variabilidad.

Tipo de extracción: la extracción con fluido supercrítico se puede llevar a cabo de

forma estática o de forma dinámica donde su diferencia radica en la renovación del

disolvente.

Tiempo de extracción: el tiempo de contacto entre el disolvente y la matriz vegetal

es fundamental para lograr una buena extracción, se otorga un tiempo a cada tipo de

extracción.

Características de la muestra: el tamaño de partícula y la humedad de la muestra

son variables que se ven afectadas debido al área superficial de contacto y la

interacción de la cantidad de agua con el solvente en acción respectivamente.

Modificador: el tipo de co-solvente (polar o apolar) que se emplee, tendrá un mayor

o menor efecto de acuerdo al tipo de compuestos que se desee obtener.

12

Caudal del fluido supercrítico: dado el agente extractor está en la capacidad de

arrastrar consigo la mayor cantidad de soluto es importante la continua renovación de

volumen de fluido supercrítico en un tiempo determinado para evitar la saturación y

con ello mejorar la efectividad del proceso.

Relación co-solvente/solvente: según bibliografía la relación puede ser en volumen,

pero la más empleada es en masa entre los valores de (5-10) %.

Este tipo de extracción maneja una gran cantidad de variables que afectan el proceso, por

tal razón una sola condición no genera suficiente información al respecto, esta dificultad

se soluciona identificando e investigando un considerable número de factores bajo un

control adecuado modificando así la capacidad de extracción. Además en la EFS se puede

ajustar un gran número de variables que hacen que el proceso sea sensible, único y

específico (Sharif et al., 2014).

Tabla 4. Investigaciones de extracción con fluidos supercríticos de productos

naturales

Materia

Prima

Principio

activo

Condiciones

óptimas de

extracción

Resultados Fuente

Frutos de

Ammi visnaga

ɤ-Pyrones P (bar): 200

T (°C): 45

t.p. (mm): 1,4

R= 1,74%

(Bishr et al.,

2017)

Ají panca capsaicinoides P (bar): 400

T (°C): 40

R=13,337% (Gavilan &

Narda, 2016)

Mesocarpio

del fruto de

palma africana

Aceite esencial P (bar): 300

F (L/min): 4,2

T (°C): 50

R=8,0% (Morillo,

Fernández,

Hernández,

Castillo, &

Marquina, 2010)

Semillas de

mora

Aceite esencial P (bar): 350

T (°C): 60

R=14,5% (Pantoja-

Chamorro,

Hurtado-

Benavides, &

Martínez-

Correa, 2017)

13


Materia

Prima

Principio

activo

Condiciones

óptimas de

extracción

Resultados Fuente

Azafrán α-crocin P (bar): 350

T (°C): 60

Co: metanol

R =62,7%

(EntrainerHaz

uki et al.,

2016)

Donde: P= Presión, T= Temperatura, t.d.= Tiempo dinámico, t.p.= Tamaño de

partícula, F= Flujo de CO2, R= Rendimiento, Co= Co-solvente

1.5. Métodos de identificación y cuantificación de metabolitos secundarios

La identificación de metabolitos secundarios se logra con la aplicación de ciertas técnicas

de análisis cualitativo como las marchas fitoquímicas entre las cuales se tiene a la reacción

de shinoda, cianidina y cloruro férrico (Ortíz et al., 2016). Actualmente la cuantificación

de ciertos compuestos ha alcanzado un gran interés puesto que proporciona una idea de

calidad de extracto. Uno de los métodos más empleado para la cuantificación de

polifenoles, en específico flavonoides, es la espectrofotometría UV-Vis, que se basa en

la ley de Lambert Beer que no es otra cosa que una relación entre la absorbancia y la

concentración del soluto (Harvey, 2002).

Experimentalmente para la cuantificación se construye una curva de calibración estándar

a partir de un compuesto patrón, con los reactivos y longitudes de onda pertinentes; una

vez hecho esto, se encuentra una ecuación por regresión lineal que represente el modelo

y por con siguiente la determinación cuantitativa de flavonoides. Los valores son

representados en unidades de mg del flavonoide estándar equivalente por gramo de

muestra seca (Al-Owaisi, Al-Hadiwi, & Khan, 2014).

14

2. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL

Este trabajo de investigación partió de una extensa revisión bibliográfica actualizada, se

llevó a cabo en la ciudad de Quito en el Laboratorio de Investigación 212 de la Facultad

de Ingeniería Química de la Universidad Central del Ecuador.

2.1. Diseño Experimental para la extracción por CO2 supercrítico

2.1.1. Variables Dependientes

Rendimiento del extracto (%)

Calidad del extracto: Contenido total de flavonoides (mg de quercetina equivalente

(QE) / g de muestra seca)

2.1.2. Variables Independientes:

Presión de extracción (bar)

Temperatura de extracción (°C)

Tiempo dinámico de extracción (min)

2.1.3. Variables Fijas

Porcentaje de humedad las hojas de K. Pinnata : (8 − 10 % )

Flujo de CO2 : (5𝐿

𝑚𝑖𝑛)

Relación en masa (etanol/ masa de CO2) : (5% masa)

Tiempo estático : (80 min)

Tamaño de partícula :(≤ 1)mm de diámetro

Co-solvente : Etanol 48 % (v/v) (mL/min

15

2.1.4. Diseño Experimental

Para la optimización de las variables en cuanto a rendimiento del extracto y contenido

total de flavonoides se optó por un diseño factorial 23 con una réplica., dando como

resultado 8 tratamientos y un total de 16 experimentos.

Tabla 5. Diseño experimental de la investigación sin réplica

Tratamientos

Variables

P (bar) T (°C) t (min) R (%) TFC

1 +1 +1 +1 R1 TFC1

2 +1 +1 -1 R2 TFC2

3 +1 -1 +1 R3 TFC3

4 +1 -1 -1 R4 TFC4

5 -1 +1 +1 R5 TFC5

6 -1 +1 -1 R6 TFC6

7 -1 -1 +1 R7 TFC7

8 -1 -1 -1 R8 TFC8

Donde: P = presión de extracción (bar)

T = temperatura de extracción (grados centígrados)

t = tiempo dinámico de extracción (minutos)

R= rendimiento del extracto (%)

TFC= contenido total de flavonoides (𝑚𝑔 𝑄𝑢𝑒𝑟𝑐𝑒𝑡𝑖𝑛𝑎 𝐸𝑞𝑢𝑖𝑣𝑎𝑙𝑒𝑛𝑡𝑒

𝑔 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑠𝑒𝑐𝑎)

La tabla 4 muestra el diseño experimental con las variables para evaluar el efecto de la

presión de extracción, temperatura de extracción y tiempo dinámico de extracción

respecto al rendimiento del extracto y el contenido total de flavonoides.

Tabla 6. Niveles de los parámetros en investigación

Parámetros Niveles

Alto (+1) Bajo (-1)

Presión de extracción (bar) 200 150

Temperatura de extracción (°C) 40 35

Tiempo dinámico de extracción (min) 120 60

16

2.2. Diagrama de flujo del proceso de extracción mediante CO2 supercrítico

Figura 3. Diagrama de flujo del proceso de investigación (autor)

17

2.3. Diagrama de fases del proceso

Figura 4. Fases de la Investigación (autor)

2.4. Metodología para las fases de la Investigación

2.4.1. Tratamiento de las hojas de Kalanachoe Pinnata

a. Sustancias y Reactivos

Agua H2O(l)

Etanol C2H5OH(l)

b. Materiales y Equipos

Hojas de Kalanachoe Pinnata

Papel periódico

Papel aluminio

Tina

Rociador V=(1L)

Balanza analítica Marca: BOECO.

Modelo: BAS 31 plus

A= (±0,0001g) R= (220g)

Tratamiento de las hojas

de Kalanchoe

pinnata

Extracción mediante CO2

supercrítico de las hojas de

Kalanachoe pinnata y

determinación del rendimiento

Estimación del contenido total de flavonoides en el extracto de las hojas de

Kalanachoe pinnata

Caracterización por marchas

fitoquímicas y cromatografía de

gases con espectrometría de

masa

18

Vaso de precipitación A=(±50mL) V= (600mL)

Tijeras

Cucharilla metálica

Molino Centrífugo Marca: Retsch

Modelo: ZM200

Estufa Marca: Memmert

Modelo: 100-800

A= (±5°C) R= (30-330°C)

Sistema de análisis granulométrico Marca: Retsch Technology

Modelo: CAMSIZER

c. Procedimiento

En la parroquia de Misahualli, ubicada en la Provincia de Napo (Tena), bajo un clima

húmedo-tropical con temperaturas desde los 25°C; se recolectó 12 Kg de hojas frescas de

Kalanachoe pinnata y se envolvieron en papel periódico para que no se maltraten

mientras se trasladaban al laboratorio de Investigación 212 en la Facultad de Ingeniería

química de la Universidad Central del Ecuador (Quito).

Limpieza y desinfección de las hojas

Seleccionar y lavar las hojas con el fin de eliminar cualquier tipo de residuo o

impureza que interfiera con la extracción. Una vez realizado esto escurrir sobre papel

periódico por un lapso de 24 horas.

Desinfectar las hojas con ayuda de un rociador lleno de etanol al 96% y dejar actuar

por un tiempo de 4 horas.

19

Secado de las hojas

Una vez desinfectadas las hojas, se determinó la humedad promedio por un método

gravimétrico.

Colocar 50 gramos de hojas frescas cortadas sobre papel aluminio previamente

pesado, luego introducir dentro de una estufa a 60°C por 12 horas y pesar en lapsos

de cada 4 horas hasta que el valor de la masa sea constate, la diferencia entre la masa

inicial y la final fue la cantidad de humedad que perdió la muestra en el proceso de

secado. Realizar este procedimiento por triplicado.

Figura 5. Hojas de Kalanchoe pinnata dentro de la estufa a las condiciones

especificadas (autor)

Tomar una tijera y cortar el resto de las hojas en trozos pequeños, luego estos pedazos

colocar sobre papel periódico encima de las mesas del laboratorio y dejar secar bajo

sombra a temperatura ambiente durante 8 días. Calcular el porcentaje de humedad aun

presente en 5 muestras de aproximadamente 5 g de hojas secas con el procedimiento

anteriormente mencionado.

Figura 6. Proceso de secado de las hojas de chiriyuyo (autor)

20

Molienda y tamizado

Con ayuda de un vaso de precipitación de 600 mL ingresar las hojas cortadas y secas

con un porcentaje de humedad (8 − 10)% en un molino centrífugo y triturar a una

velocidad de 6000 (rpm); además tamizar con una malla de tamaño de partícula de 1

mm.

Figura 7. Molino centrífugo (autor)

Para el análisis granulométrico del polvo obtenido:

Colocar 10 g de la muestra sobre la tolva del equipo teniendo cuidado de no trasponer

las partículas unas sobre otras, luego encender el software de análisis CAMSIZER y

especificar la altura de la tolva, amplitud de vibración del alimentador y el rango de

medida, por último, trasportar a la zona de medida y determinar el tamaño promedio

de las partículas. Repetir el proceso 3 veces. Ver Anexo A

Figura 8. Sistema de análisis granulométrico (autor)

21

Almacenar el polvo de hojas de chiriyuyo en un recipiente hermético bajo sombra

hasta su uso posterior. Forrar con papel aluminio para evitar el contacto con la luz.

2.4.2. Extracción mediante CO2 supercrítico del polvo de las hojas de K. pinnata y



Agua H2O(l)

Etanol C2H5OH(l)

Dióxido de Carbono CO2


Equipo de extracción con fluido supercrítico (EFS)

Marca: Applied Separations

Modelo: 7070

P máxima= (690 bar)

T máxima= (240 °C)

Balanza Análitica Marca: BOECO.

Modelo: BAS 31 plus

A= (±0,0001g) R= (220g)

Refrigerador: Marca: HACEB

Modelo: NEV HACEB SE ESS

446LT

Vaso de precipitación A= (±50mL) V=(250mL)

Balón aforado V=(100mL)

Probeta A= (±2mL) V=(100mL)

Crisol


Papel Aluminio

22

La Figura 9 muestra los equipos e instrumentos que forman parte del equipo de extracción

con fluido supercríticos donde: (1) Tanque de almacenamiento de CO2, (2) Bomba, (3)

Enfriador, (4) Tanque de extracción, (5) Horno, (6) Bomba del co-solvente, (7) Vial

recolector del extracto, (8) Rotámetro, (9) Válvula de venteo, (10) Compresor de aire,

(11) Recipiente Co-solvente, (TC) Controlador de temperatura, (PC) Controlador de

presión, (TI) Indicador de temperatura, (V) Válvulas.

Figura 9. Esquema del equipo de fluido supercrítico (Londoño-Larrea, Zapata, Lara-

López, & Villamarín-Barriga, 2018)

23

c. Procedimiento

En una balanza analítica con ayuda de una cucharilla metálica pesar aproximadamente

40 g de polvo de hojas de Kalanchoe pinnata en un crisol y tomar la medida del peso

con cuatro decimales. (muestra 1)

Con lana de propileno cubrir los orificios de las tapas del tanque extractor para evitar

acumulación de la muestra y ensamblar una tapa, luego añadir la muestra

conjuntamente con núcleos de ebullición hasta el tope (500 mL) y cerrar el tanque.

Figura 10. Crisol con 40 g de polvo de hojas de K. pinnata (autor)

Figura 11. Tanque extractor del equipo EFS (autor)

24

Colocar el tanque extractor dentro del horno de tal forma que la muestra quede en la

parte superior y el termopar del horno toque uno de los orificios del mismo, además

conectar con las líneas de gas respectivas verificando que las válvulas de entrada de

CO2, salida de extracto y venteo estén cerradas.

Figura 12. Tanque extractor dentro del horno del equipo EFS (autor)

Encender el equipo de EFS. Abrir la válvula del tanque de almacenamiento de CO2 y

permitir el paso hacia la bomba observando que el nivel de presión no sea menor a 45

bar para abastecer al sistema la presión suficiente y el buen funcionamiento; realizar

una prueba de fugas una vez abierta la válvula de entrada de CO2 al tanque extractor.

Una vez realizado esto, encender los interruptores de las resistencias y alcanzar las

condiciones de temperatura (35 y 40 °C), luego presionar el botón de seguridad de la

bomba y dejar comprimir hasta llegar a las condiciones de presión (150 y 200 bar),

dejar estabilizar y dar paso a la extracción estática por un tiempo de 80 minutos. Las

condiciones operacionales fueron ingresadas y seteadas en el software del equipo.

Horno

Tanque

extractor

Líneas de

gas

Termopar

25

Dar paso a la extracción dinámica durante (60 y 120) min con renovación de solvente

(CO2 al 99.9 % de pureza) a una razón de flujo de 5 L/min e ingreso de co-solvente

(etanol al 48%) previamente preparado por dilución en un balón aforado de 100 mL.

Además, en este paso también recolectar el extracto activo de la planta en un vial

propio del equipo (pesado y cubierto con papel aluminio previamente), para ello

conectar el mismo en la aguja de la válvula de salida de extracto y rotámetro.

Para la cantidad necesaria de co-solvente calcular el flujo volumétrico con una

relación en masa al 5% de (etanol/ masa de CO2) en (mL/min). Para la adición de este:

encender la bomba, conectar con mangueras hacia un contenedor de etanol (vaso de

precipitación de 250 mL) y realizar la respectiva purga para evitar la cavitación, por

último, dejar bombear el fluido hacia el tanque durante la extracción. Se usó cinta

adhesiva para mantener bien sujetas las mangueras en el contenedor de etanol.

Ya trascurrido el tiempo de extracción dinámica, cerrar la válvula de salida del

extracto, retirar el vial y proceder a tomar el peso en una balanza analítica. Por último,

almacenar en un refrigerador a 4°C hasta su análisis posterior.

Para la despresurización del tanque volver a abrir la válvula de salida del extracto y

dejar salir libremente el CO2 hasta una presión igual a 30 bar, previo cerrar las válvulas

de entrada y de almacenamiento del solvente. Llegado a ese valor cerrar la válvula de

salida del extracto y abrir la válvula de venteo hasta que la presión final sea cero.

Conjuntamente con este pasó apagar los interruptores de temperatura para que se

enfríe el tanque y proceder a su limpieza.

Repetir todo el proceso para cada una de las muestras que requiere el diseño

experimental (16 muestras).

Para determinar el rendimiento realizar una relación entre la cantidad de extracto

obtenido sobre la cantidad de muestra que ingresó al tanque extractor.

26

Figura 13. Imagen del equipo de Extracción con fluido supercrítico (autor)

2.4.3. Estimación del contenido total de flavonoides en el extracto de las hojas de

Kalanachoe pinnata.


Agua destilada H2O(l)

Etanol C2H5OH(l)

Cloruro de aluminio AlCl3(S)

Acetato de sodio CH3COONa (S)

Quercetina C12H10O7 (S)

Rotámetro

Válvula salida

de extracto

Vial

recolector

Enfriador

Válvula de

venteo

Recipiente

co-solvente

Bomba co-

solvente

Bomba

Pantalla

y

Software

Válvula

entrada

CO2

Horno

Tanque de

CO2

27



Vaso de precipitación A= (±5mL) V=(100mL)




Micropipeta A= (±5uL) R=(100-1000uL)

Tubos de ensayo

Gradilla metálica



Balanza analítica Marca: BOECO.

Modelo: BAS 31 plus

A= (±0,0001g) R= (220g)

Espectrofotómetro UV-vis Marca: Agilent Technologies

Modelo: Cary 60

Baño ultrasónico Marca: OVAN

Modelo: ATM40-15LCD

c. Procedimiento

Para la estimación del contenido total de flavonoides (TFC) en los extractos de las hojas

de Kalanchoe pinnata se siguió el procedimiento informado en (Al-Owaisi et al., 2014)

que es un método colorimétrico en el que se forma complejos estables entre el cloruro de

aluminio con los grupos hidroxilos fenólicos y cetona de los flavonoides (flavonas y

flavonoles). (Rafael, Agudelo, & Wagner, 2015). Se empleó quercetina como flavonoide

estándar.

28

Curva de Calibración

Para la solución madre, pesar en una balanza analítica 10 mg de quercetina y diluir

con etanol al 80% en un balón aforado de 50 mL, además realizar diluciones desde 5

a 30 (ug / mL) en balones aforados de 10 mL con ayuda de una probeta del mismo

volumen.

Figura 14. Preparación de las soluciones estándar de quercetina para la curva de

calibración (autor)

Mezclar cada una de las diluciones con los reactivos en tubos de ensayo empleando

una micropipeta en las siguientes proporciones: 500 µL de solución estándar con 1500

µL de etanol al 96%, 100 µL de cloruro de aluminio al 10%, 100 µL de acetato de

sodio 1 M y 2800 µL de agua destilada. Preparas las soluciones de los reactivos

previamente en el laboratorio.

Figura 15. Reactivos preparados (autor)

29

Colocar en una gradilla metálica los tubos de ensayo y dejar durante 30 minutos a

temperatura ambiente, transcurrido el tiempo ingresar las soluciones en la celda del

espectrofotómetro UV-vis y medir las absorbancias correspondientes a 415 nm.

Realizar 4 mediciones. Previo usar un blanco que contiene todos los reactivos ya antes

mencionados en las proporciones especificadas.

Realizar una gráfica concentración de quercetina en función de las absorbancias

medidas y obtener la respectiva ecuación a través de una regresión.

Tratamiento al extracto crudo de hojas de Kalanchoe pinnata

Diluir cada uno de los extractos obtenidos por EFS con 10 mL de etanol al 96% bajo

un baño ultrasónico a temperatura ambiente (solución EFS), luego tomar una alícuota

de 1 mL de estas soluciones con una micropipeta y colocar en un balón aforado de

100 mL. Completar el mismo con etanol al 96% con ayuda de una probeta de 100 mL

(solución diluida).

Figura 16. Extractos obtenidos por EFS (autor)

Poner en contacto cada una de las soluciones diluidas de los extractos con los

reactivos y en las proporciones anteriormente mencionadas, luego del tiempo

especificado para la reacción ingresar al espectrofotómetro UV-vis y tomar los

valores de las absorbancias (10 mediciones); antes de las mediciones usar un blanco

con los reactivos mencionados. Ver Anexo B

30

Para la estimación del contenido total de flavonoides en los extractos calcular a partir

de la ecuación de regresión lineal de la curva de calibración en unidades de (mg de

quercetina equivalente / g de muestra seca).

2.4.4. Caracterización por marchas fitoquímicas y cromatografía de gases con

espectrometría de masa

a. Sustancias y reactivos

Extracto de las hojas de Kalanchoe pinnata

Etanol C2H5OH (l)

Cloroformo CHCl3 (l)

Ácido Clorhídrico HCl (C)

Cloruro férrico FeCl3

Limaduras de magnesio Mg(S)


Jeringuillas A= (±1mL) V=(5mL)

Vasos de precipitación A= (±5mL) V=(100mL)


Filtros para jeringuillas

Viales

Estufa Marca: Memmert

Modelo: 100-800

A= (±5°C) R= (30-330°C)

Cromatógrafo de gases acoplado a un espectrómetro de masa

Marca: Agilent Technologies

Modelo: 7820

Número de serie: CN16032008

31

c. Procedimiento

Procedimiento para marchas Fitoquímicas

Las marchas fitoquímicas son pruebas químicas cualitativas y para la identificación de

flavonoides se sigue los ensayos mencionados en los que se produce cambios de

coloración por reacciones con ciertos reactivos (Osmany Cuesta R, Ingrid Márquez H,

2015).

Shinoda

Tomar aproximadamente 2 mL de extracto obtenido por EFS disuelto en etanol al 96

% y poner en contacto con 1 mL de ácido clorhídrico concentrado más 3 limaduras

de magnesio. Un cambio de coloración de amarillo a rojizo y abundante espuma

indica presencia de Flavonoides. Ver Anexo C

Cloruro férrico


% y puner en contacto con 1mL de cloruro férrico al 1% en un vaso de precipitación

de 100 mL. Un cambio de coloración de amarillo a verde, azul o negra revela la

existencia de flavonoides. Ver Anexo D

Reacción de cianidina


% y poner en contacto con 1 mL de alcohol clorhídrico (alcohol etílico al 50% + ácido

clorhídrico concentrado en una proporción 2:1 v/v) en un vaso de precipitación de

100 mL. Un cambio de coloración de amarillo a rojo o rosa indica presencia de

flavonoides. Ver Anexo E

32

Procedimiento para cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masa

Se tomó los 2 extractos que presentaron las mejores condiciones en cuanto a rendimiento

y TFC, que estaban diluidos en etanol al 96% y se prepararon de la siguiente forma:

Tomar en una jeringuilla 4 mL de uno de los extractos diluidos y con ayuda de un

filtro introducir en un vial propio del equipo.

El otro extracto diluido dejar evaporar en una estufa a una temperatura de 35 °C por

un tiempo de 4 días, luego volver a diluir en 5 mL de cloroformo y de la misma forma

que el primer extracto preparar el segundo vial.

Figura 17. Preparación de viales (autor)

Introducir los dos viales en el cromatógrafo de gases acoplado a un espectrómetro de

masa donde previamente se debe ingresar las condiciones de operación y analizar.

2.4.5. Análisis de Datos

Para el análisis de datos de esta investigación, se empleó el software estadístico

STATGRAPHICS Centurion XVI.I, donde los datos se sometieron a un análisis de

varianza ANOVA con el objetivo de optimizar y conocer el efecto de las variables

establecidas sobre el rendimiento de extracción y contenido total de flavonoides de los

extractos obtenidos por EFS.

33

3. CÁLCULOS Y RESULTADOS

3.1. Cálculos del tratamiento a las hojas de Kalanachoe Pinnata

3.1.1. Cálculo de la humedad promedio de las hojas frescas de Kalanachoe Pinnata

a. Cálculo de la humedad de las hojas

𝒘 =𝒎. 𝒉. −𝒎. 𝒔.

𝒎. 𝒉.=

𝒎. 𝒂.

𝒎. 𝒉.× 𝟏𝟎𝟎% (𝟏)

𝑤 =45,1611𝑔

50,0125𝑔× 100%

𝑤 = 90,2996 %

Donde:

w= Humedad (%)

m.h.= masa muestra húmeda (𝑔)

m.s.= masa muestra seca (𝑔)

m.a.= masa de agua en la muestra (𝑔)

b. Cálculo de la humedad promedio de las hojas

�̅� =𝐰𝟏 + 𝐰𝟐 + ⋯ + 𝒘𝒏

𝐧 (𝟐)

�̅� =90,2996 + 89,9843 + 88,5250

3

�̅� = 89,6030 %

Donde:

�̅� = Humedad promedio (%)

n = Número de muestras

34

c. Resultados de la humedad promedio de las hojas frescas de Kalanchoe pinnata

Tabla 7. Humedad promedio de las hojas frescas de Kalanchoe pinnata

Pruebas m.h (g) m.s. (g) m.a. (g) w (%) �̅� (%)

1 50,0125 4,8514 45,1611 90,2996

89,6030 2 50,0047 5,0083 44,9964 89,9843

3 50,0478 5,7430 44,3048 88,5250

3.1.2. Cálculo del porcentaje de humedad de las hojas secas de Kalanchoe pinnata

a. Cálculo del porcentaje de humedad

𝒘𝒑 =𝒎. 𝒔. 𝒉 − 𝒎. 𝒔. 𝒔

𝒎. 𝒔. 𝒉.=

𝒎. 𝒉.

𝒎. 𝒔. 𝒉.× 𝟏𝟎𝟎% (𝟑)

𝒘𝒑 =0,4357

5,1240× 𝟏𝟎𝟎%

𝒘𝒑 = 8,5031

Donde:

𝒘𝒑 = Porcentaje de humedad (%)

𝒎. 𝒔. 𝒉 = Muestra seca con porcentaje de humedad (𝑔)

𝒎. 𝒔. 𝒔 = Muestra seca sin humedad (𝑔)

𝒎. 𝒉. = Humedad en la muestra (𝑔)

b. Cálculo del porcentaje de humedad promedio de las hojas

𝒘𝒑̅̅ ̅̅ =𝐰𝟏 + 𝐰𝟐 + ⋯ + 𝒘𝒏

𝐧 (𝟒)

𝒘𝒑̅̅ ̅̅ =8,5031 + 8,1329 + 9,5752 + 8,5394 + 9,7139

5

𝒘𝒑̅̅ ̅̅ = 8,8933 %

Donde:

𝒘𝒑̅̅ ̅̅ = Porcentaje de humedad promedio (%)

n = Número de muestras

35

c. Resultados del porcentaje de humedad

Tabla 8. Porcentaje de humedad de las hojas secas

Muestras m.s.h (g) m.s.s (g) m.h. (g) 𝒘𝒑 (%) 𝒘𝒑̅̅ ̅̅ (%)

1 5,1240 4,6883 0,4357 8,5031

8,8933

2 5,2011 4,7781 0,4230 8,1329

3 5,0140 4,5338 0,4802 9,5772

4 5,2369 4,7897 0,4472 8,5394

5 5,0474 4,5571 0,4903 9,7139

3.2. Cálculos de la extracción mediante CO2 supercrítico del polvo de las hojas de

K. Pinnata y determinación del rendimiento

3.2.1. Cálculo del flujo volumétrico del co-solvente empleado en la extracción

a. Cálculo de la masa total de CO2 durante la extracción

Para el cálculo de la masa total de CO2 en la extracción se utilizó las ecuaciones de Van

der Waals y del Gas Ideal, donde se determinó la cantidad de moles y, por consiguiente,

la masa necesaria para la extracción estática y dinámica.

Moles de CO2 en la extracción estática

Se usó la ecuación de Van der Waals durante la extracción dinámica puesto que es la que

más se ajusta a las condiciones de trabajo en este caso altas presiones.

𝑷 =𝑹𝑻

𝑽𝒎 − 𝒃−

𝒂

𝑽𝒎𝟐 (𝟓)

𝑃 =𝑅𝑇𝑛

𝑉 − 𝑏𝑛−

𝑎𝑛2

𝑉2

Para:

P = 200 (bar) = 197,4 (atm)

T = 40 (°C) = 313,15 (K

36

197,4 𝑎𝑡𝑚 =(0,082

𝑎𝑡𝑚 𝐿𝑚𝑜𝑙 𝐾)(313,15 𝐾)(𝑛)

(0,5 𝐿) − (𝑏)(𝑛)−

(𝑎)(𝑛2)

(0,5𝐿)2

𝒂 =𝟐𝟕 𝑹𝟐𝑻𝒄𝟐

𝟔𝟒 𝑷𝒄 (𝟔)

𝒃 =𝑹 𝑻𝒄

𝟖 𝑷𝒄 (𝟕)

Para:

Tc = 30,97 (°C) = 304,12 (K)

Pc = 73,9 (atm)

𝑎 =27 (0,082

𝑎𝑡𝑚 𝐿𝑚𝑜𝑙 𝐾)2(304,12 𝐾)2

64 (73,9 𝑎𝑡𝑚)

𝑎 = 3,594 𝑎𝑡𝑚 𝐿2

𝑚𝑜𝑙2

𝑏 = (0,082

𝑎𝑡𝑚 𝐿𝑚𝑜𝑙 𝐾)

2

(304,12 𝐾)

8 (73,9 𝑎𝑡𝑚)

𝑏 = 0,0427 𝐿

𝑚𝑜𝑙

Reemplazando a y b

197,4 𝑎𝑡𝑚 =(0,082

𝑎𝑡𝑚 𝐿𝑚𝑜𝑙 𝐾)(313,15 𝐾)(𝑛)

(0,5 𝐿) − (0,0427 𝐿

𝑚𝑜𝑙)(𝑛)−

(3,594 𝑎𝑡𝑚 𝐿2

𝑚𝑜𝑙2 )(𝑛2)

(0,5𝐿)2

𝑛 = 7,0871 𝑚𝑜𝑙

Donde:

P = Presión (𝑎𝑡𝑚)

T = Temperatura (℃)

R = Constante universal de los gases ideales (𝑎𝑡𝑚 𝐿

𝑚𝑜𝑙 𝐾)

Vm = Volumen molar (𝐿

𝑚𝑜𝑙)

V = Volumen (𝐿)

37

n = Número de moles (mol)

a = Constante (Fuerza de atracción intermoleculares) (𝑎𝑡𝑚 𝐿2

𝑚𝑜𝑙2 )

b = Constante (Volumen que ocupan las moléculas) (𝐿

𝑚𝑜𝑙)

Masa de CO2 en la extracción estática

𝒎𝒆.𝒆. = 𝑴 × 𝒏 (𝟖)

𝑚𝑒.𝑒. = (44,01 𝑔

𝑚𝑜𝑙) × (7,0871 𝑚𝑜𝑙)

𝑚𝑒.𝑒. = 313,9453 𝑔

Donde:

𝒎𝒆.𝒆. = Masa de CO2 en la extracción estática (g)

M = Peso molecular (𝑔

𝑚𝑜𝑙)

Masa de CO2 en la extracción dinámica

La ecuación del gas ideal se emplea en la extracción dinámica puesto que se trabaja con

a condiciones atmosféricas es decir bajas presiones.

𝑷𝑽 = 𝒏𝑹𝑻 (𝟗)

𝑚𝑒.𝑑. =𝑃 𝑉 𝑀

𝑅𝑇

Para:

P = 0,72 (atm)

T = 20 (℃) = 293,15 (K)

𝑚𝑒.𝑑. =(0,72 𝑎𝑡𝑚) (44,01

𝑔𝑚𝑜𝑙)𝑉

(0,082 𝑎𝑡𝑚 𝐿𝑚𝑜𝑙 𝐾)(293,15 𝐾)

38

𝑽 = 𝑸 × 𝒕 (𝟏𝟎)

Para:

Q = 5 (𝐿

𝑚𝑖𝑛); Valor fijado en el rotámetro del equipo de extracción

t = 60 (min)

𝑉 = (5𝐿

𝑚𝑖𝑛) × (60 𝑚𝑖𝑛)

𝑉 = 300 𝐿

Remplazando V

𝑚𝑒.𝑑. =(0,72 𝑎𝑡𝑚) (44,01

𝑔𝑚𝑜𝑙)(300𝐿)

(0,082 𝑎𝑡𝑚 𝐿𝑚𝑜𝑙 𝐾)(293,15 𝐾)

𝑚𝑒.𝑑. = 395,4589 𝑔

Donde:

P = Presión (𝑎𝑡𝑚)

T = Temperatura (℃)

R = Constante universal de los gases ideales (𝑎𝑡𝑚 𝐿

𝑚𝑜𝑙 𝐾)

V = Volumen (𝐿)

n = Número de moles

M = Peso molecular ( 𝑔

𝑚𝑜𝑙)

t = Tiempo dinámico (𝑚𝑖𝑛)

Q = Caudal (𝐿

𝑚𝑖𝑛)

𝒎𝒆.𝒅.= Masa de CO2 en la extracción dinámica (𝑔)

Masa total de CO2 en la extracción

𝒎𝑪𝑶𝟐= 𝒎𝒆.𝒆. + 𝒎𝒆.𝒅. (𝟏𝟏)

𝑚𝐶𝑂2= 313,9453 𝑔 + 395,4589 𝑔

𝑚𝐶𝑂2= 709,404 𝑔

Donde:

𝒎𝑪𝑶𝟐 = Masa total de CO2 (𝑔)

39

b. Cálculo del flujo volumétrico del co-solvente (etanol 48 %)

Para el cálculo del flujo volumétrico del co-solvente en este caso etanol 48 % (v/v) se usó

una relación al 5% de masa de co-solvente/masa de CO2.

𝒎𝒆𝒕 = 𝒎𝑪𝑶𝟐× (

𝟓 𝒎𝒄𝒐𝒔𝒐𝒍

𝟏𝟎𝟎 𝒎𝑪𝑶𝟐

) (𝟏𝟐)

𝑚𝑒𝑡 = 709,404 𝑔 × (5 𝑔

100 𝑔 )

𝑚𝑒𝑡 = 35,4702

𝑽𝒆𝒕 =𝒎𝒆𝒕

𝒕 × 𝝆𝒆𝒕 (𝟏𝟑)

𝑉𝑒𝑡 =(35,4702 𝑔)

(60 𝑚𝑖𝑛) × (0,90207 𝑔

𝑐𝑚3)

𝑉𝑒𝑡 = 0,6534 𝑐𝑚3

𝑚𝑖𝑛≈ 0,6534

𝑚𝑙

𝑚𝑖𝑛

Donde:

𝒎𝒆𝒕 = Masa etanol al 48 % (𝑔)

𝒎𝑪𝑶𝟐 = Masa total de CO2 (𝑔)

𝒎𝒄𝒐𝒔𝒐𝒍 = Masa de co-solvente (𝑔)

𝑽𝒆𝒕 = Flujo volumétrico de etanol al 48% (𝑚𝑙

𝑚𝑖𝑛)

𝝆𝒆𝒕 = Densidad del etanol (𝑔

𝑐𝑚3)

t = Tiempo dinámico (𝑚𝑖𝑛)

40

c. Resultados del cálculo del flujo volumétrico

Tabla 9. Flujos volumétricos empleados en cada experimento de la extracción por

EFS

Experimento P (bar) T (°C) t (min) Co-solvente

(ml)

𝑽𝒆𝒕

(ml/min)

1 150 35 60 38,458 0,641

2 150 35 120 60,378 0,503

3 150 40 60 38,071 0,635

4 150 40 120 59,991 0,500

5 200 35 60 39,600 0,660

6 200 35 120 61,520 0,513

7 200 40 60 39,309 0,655

8 200 40 120 61,228 0,510

3.2.2. Cálculo del rendimiento del extracto

𝑹 =𝑭. 𝒆 − 𝑭. 𝒗

𝒎𝒎𝒊× 𝟏𝟎𝟎% =

𝑬𝒐𝒃

𝒎𝒎𝒊× 𝟏𝟎𝟎% (𝟏𝟒)

𝑅 =16,2843 − 16,1462

40,0170× 100%

𝑅 =0,1381

40,0170× 100%

𝑅 = 0,3451 %

Donde:

R = Rendimiento del extracto (%)

F.e. = Masa del frasco vial + extracto (𝑔)

F.v. = Masa del frasco vial vacío (𝑔)

𝑬𝒐𝒃 = Masa del extracto Obtenido (𝑔)

𝒎𝒎𝒊 = Masa de la muestra inicial (𝑔)

41

Tabla 10. Resultados de los rendimientos de los extractos obtenidos por EFS

EXP P

(bar)

T

(°C)

t

(min)

Frasco

vial

vacío

(g)

Frasco

vial +

extracto

(g)

Masa

extracto

obtenido

(g)

Masa

muestra

inicial

(g)

Rendimiento

(%)

1 150 35 60 16,1462 16,2843 0,1381 40,0170 0,3451

2 150 35 60 16,2229 16,3431 0,1202 40,0159 0,3004

3 200 35 60 16,1553 16,4115 0,2562 40,0270 0,6401

4 200 35 60 16,1337 16,3883 0,2546 40,0860 0,6351

5 200 40 60 16,1487 16,3596 0,2109 40,3930 0,5221

6 200 40 60 16,1101 16,3242 0,2141 40,1199 0,5337

7 200 35 120 16,2466 16,8889 0,6423 40,2602 1,5954

8 200 35 120 16,1098 16,6479 0,5381 40,1743 1,3394

9 200 40 120 16,2085 16,5519 0,3434 40,1028 0,8563

10 200 40 120 16,1975 16,5725 0,375 40,0125 0,9372

11 150 40 60 16,2174 16,328 0,1106 40,1882 0,2752

12 150 40 60 16,1657 16,255 0,0893 40,0547 0,2229

13 150 35 120 16,1948 16,3755 0,1807 40,1007 0,4506

14 150 35 120 16,1207 16,2326 0,1119 40,0639 0,2793

15 150 40 120 16,2105 16,3383 0,1278 40,0784 0,3189

16 150 40 120 16,1607 16,2835 0,1228 40,0774 0,3064

Donde:

Tratamiento

Réplica

EXP = Experimento

42

3.3. Cálculos de la estimación del contenido total de flavonoides en el extracto de

las hojas de Kalanachoe Pinnata.

3.3.1. Cálculos para la curva de calibración

a. Concentración de la solución madre

𝑪𝑸 =𝟏𝟎 𝒎𝒈 𝑸

𝟓𝟎 𝒎𝑳 𝒔𝒐𝒍𝒖𝒄𝒊ó𝒏×

𝟏 𝒈 𝑸

𝟏𝟎𝟎𝟎 𝒎𝒈 𝑸× 𝟏𝟎𝟎% (𝟏𝟓)

𝐶𝑄 = 0,02 % = 𝐶1

Donde:

𝑪𝑸 = Concentración quercetina %(p/v)

Q = Quercetina

b. Concentración de la solución estándar

𝑪𝑬 =𝟓 𝒖𝒈 𝑸

𝒎𝑳 𝒔𝒐𝒍𝒖𝒄𝒊ó𝒏×

𝟏 𝒈 𝑸

𝟏𝟎𝟔 𝒖𝒈 𝑸× 𝟏𝟎𝟎% (𝟏𝟔)

𝐶𝐸 = 0,0005 % = 𝐶2

Donde:

𝑪𝑬 = Concentración solución estándar %(p/v)

Q = Quercetina

c. Volumen necesario para alcanzar la concentración de las soluciones diluidas

estándar

𝑪𝟏𝑽𝟏 = 𝑪𝟐𝑽𝟐 (𝟏𝟕)

𝑉1 =𝐶2𝑉2

𝐶1

𝑉1 =(0,0005 %)(10 𝑚𝐿)

(0,02 %)

𝑉1 = 0,25 𝑚𝐿 = 250 𝑢𝐿

43

Donde:

𝑪𝟏 = Concentración solución madre (%)

𝑽𝟏 = Volumen solución madre (𝑚𝐿)

𝑪𝟐 = Concentración solución estándar (%)

𝑽𝟐 = Volumen solución estándar (𝑚𝐿)

Tabla 11. Resultados de los volúmenes necesarios para aforar a 10 mL las

soluciones estándar

𝑪𝟏 % 𝑪𝟐 % 𝑽𝟐 (mL) 𝑽𝟏 (𝒎𝑳)

0,02 0,0005 10 0,25

0,02 0,0010 10 0,50

0,02 0,0015 10 0,75

0,02 0,0020 10 1,00

0,02 0,0025 10 1,25

0,02 0,0030 10 1,50

3.3.2. Cuantificación de flavonoides totales en los extractos obtenidos por EFS

a. Cálculo de la concentración de quercetina equivalente a través de la ecuación

de la curva de calibración

Tabla 12. Concentraciones de las soluciones diluidas de quercetina con sus

respectivas absorbancias

Concentración de

Quercetina

(ug/mL)

absorbancias Absorbancia

promedio Señal 1 Señal 2 Señal 3 Señal 4

5 0,0887 0,0887 0,0888 0,0886 0,0887

10 0,1198 0,1195 0,1198 0,1199 0,1198

15 0,1948 0,1941 0,1943 0,1941 0,1943

25 0,2971 0,2990 0,2980 0,2981 0,2981

30 0,3597 0,3602 0,3602 0,3599 0,3600

44

Figura 18. Curva de calibración de quercetina

𝒚 = 𝟖𝟗, 𝟒𝟗𝟓𝒙 − 𝟏, 𝟗𝟖𝟕𝟕 (𝟏𝟖)

Si x = 0.0583

𝑦 = 89,495(0,0583) − 1,9877

𝑦 = 3,2263 𝑢𝑔 𝑄𝐸

𝑚𝐿 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛

Donde:

y = Concentración de quercetina equivalente (𝒖𝒈 𝑸𝑬

𝒎𝑳 𝒔𝒐𝒍𝒖𝒄𝒊ó𝒏 )

x = Absorbancia

QE = Quercetina equivalente

y = 89,495x - 1,9877R² = 0,9934

0

5

10

15

20

25

30

35

0,0000 0,0500 0,1000 0,1500 0,2000 0,2500 0,3000 0,3500 0,4000

Co

nce

ntr

ació

n Q

uer

ceti

na

(u

g/m

L)

Absorbancia

45

b. Resultados del cálculo de las concentraciones de quercetina equivalente

Tabla 13. Concentraciones de quercetina equivalente en los extractos

EXP

P

(bar)

T

(ºC)

t (min)

(x)

Absorbancia

Promedio

(y)

(𝒖𝒈 𝒒𝒖𝒆𝒓𝒄𝒆𝒕𝒊𝒏𝒂 𝒆𝒒𝒖𝒊𝒗𝒂𝒍𝒆𝒏𝒕𝒆


1 150 35 60 0,05826 3,2263

2 150 35 60 0,05832 3,2316

3 200 35 60 0,08700 5,7984

4 200 35 60 0,13070 9,7093

5 200 40 60 0,12800 9,4677

6 200 40 60 0,12094 8,8358

7 200 35 120 0,22803 18,4198

8 200 35 120 0,19317 15,3000

9 200 40 120 0,17509 13,6820

10 200 40 120 0,19131 15,1336

11 150 40 60 0,05770 3,1762

12 150 40 60 0,03578 1,2144

13 150 35 120 0,07796 4,9893

14 150 35 120 0,05046 2,5282

15 150 40 120 0,05671 3,0876

16 150 40 120 0,05741 3,1502

Donde

Experimento

Réplica

c. Estimación del contenido total de flavonoides (TFC)

Cálculo quercetina equivalente

𝐶(100 𝑚𝐿) = 3,2263 𝑢𝑔 𝑄𝐸

𝑚𝐿 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑖𝑑𝑎 × 100 𝑚𝐿 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑖𝑑𝑎

𝐶(100 𝑚𝐿) = 322,63 𝑢𝑔 𝑄𝐸

𝐶(10 𝑚𝐿) =322,63 𝑢𝑔 𝑄𝐸

𝑚𝐿 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝐸𝐹𝑆× 10 𝑚𝐿 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝐸𝐹𝑆

𝐶(10 𝑚𝐿) = 3226,27 𝑢𝑔 𝑑𝑒 𝑄𝐸

46

Donde:

𝑪(𝟏𝟎𝟎 𝒎𝑳) = Quercetina equivalente en los 100 mL de solución (Solución diluida)

𝑪(𝟏𝟎 𝒎𝑳) = Quercetina equivalente en los 10 mL de solución (Solución EFS)

De las conversiones anteriores se deriva la siguiente ecuación

𝑸𝑬 = 𝒚 × 𝑽𝒕𝒐𝒕𝒂𝒍 = 𝒚 × 𝟏𝟎𝟎𝟎 𝒎𝑳 (𝟏𝟗)

𝑄𝐸 = 3,2263 𝑢𝑔 𝑄𝐸

𝑚𝐿 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 × 1000 𝑚𝐿

𝑄𝐸 = 3226,27 𝑢𝑔

Donde:

y = Concentración de quercetina equivalente (𝒖𝒈 𝑸𝑬


𝑽𝒕𝒐𝒕𝒂𝒍 = Volumen total de solución (𝑚𝐿)

𝑸𝑬 = Quercetina equivalente (𝑢𝑔)

Cálculo del contenido total de flavonoides (TFC)

𝑻𝑭𝑪 =𝒎𝒈 𝒅𝒆 𝒒𝒖𝒆𝒓𝒄𝒆𝒕𝒊𝒏𝒂 𝒆𝒒𝒖𝒊𝒗𝒂𝒍𝒆𝒏𝒕𝒆

𝒈 𝒎𝒖𝒆𝒔𝒕𝒓𝒂 𝒊𝒏𝒊𝒄𝒊𝒂𝒍 𝒔𝒆𝒄𝒂 (𝟐𝟎)

𝑇𝐹𝐶 =3226,27 𝑢𝑔 𝑄𝐸

40, 0170 𝑔 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑠𝑒𝑐𝑎×

1 𝑚𝑔 𝑄𝐸

1000 𝑢𝑔 𝑄𝐸

𝑇𝐹𝐶 = 0,0806 𝑚𝑔 𝑄𝐸

𝑔 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑠𝑒𝑐𝑎

Donde:

𝑻𝑭𝑪 = Contenido total de flavonoides

𝑸𝑬 = Quercetina equivalente

47

d. Resultados de la TFC en el extracto de las hojas de kalanachoe pinnata.

Tabla 14. Contenido total de flavonoides (TFC)

EXP

P (bar)

T

(ºC)

t (min)

Quercetina

Equivalente

(QE)

(ug)

TFC

(mg QE/ g muestra

seca)

1 150 35 60 3226,28 0,0806

2 150 35 60 3231,65 0,0808

3 200 35 60 5798,37 0,1449

4 200 35 60 9709,30 0,2422

5 200 40 60 9467,66 0,2344

6 200 40 60 8835,83 0,2202

7 200 35 120 18419,84 0,4575

8 200 35 120 15300,05 0,3808

9 200 40 120 13681,98 0,3412

10 200 40 120 15133,59 0,3782

11 150 40 60 3176,16 0,0790

12 150 40 60 1214,43 0,0303

13 150 35 120 4989,33 0,1244

14 150 35 120 2528,22 0,0631

15 150 40 120 3087,56 0,0770

16 150 40 120 3150,21 0,0786

Donde:

Tratamiento

Réplica

QE= Quercetina Equivalente

48

3.4. Caracterización por marchas fitoquímicas y cromatografía de gases con


3.4.1. Resultados de la caracterización por marchas fitoquímicas

Tabla 15. Identificación de flavonoides en el extracto

Metabolito

Secundario

Ensayo Observaciones Resultado

Flavonoides

Shinoda Coloración rojiza anaranjada

tenue y abundante espuma

+

Cloruro

férrico

Coloración verdosa tenue +

Reacción de

Cianidina

Sin cambio de coloración -

Donde: (+) Presencia de flavonoides

(-) Ausencia de flavonoides

3.4.2. Resultados de la caracterización por cromatografía de gases con


Figura 19. Cromatograma CG-EM del extracto de hojas de Kalanchoe pinnata

disuelto en etanol

49


disuelto en etanol

Compuestos Identificados Tiempo de

retención

Porcentaje de área

relativo (%)

Estructura

molecular

9H-Fluoreno, 9-diazo- 23,710 1,164 C13H8 N2

Ácido n-hexadecanoico 29,372 11,912 C16 H32O2

Phytol 31,468 1,776 C20H40O

Ácido 9,12,15-

Octadecatrienoico

32,395 12,915 C18H30O 2

Ácido phthalico bis(2-etil

hexil)éster

38,358 12,803 C24H38O 4

Esqualeno 42,400 17,228 C30H50

δ-Tocopherol

43,935

45,238

46,234

3,128

1,100

2,658

C27H46O2

γ-Sitosterol 48,228 1,226 C29H50O

Simiarenol 48,895 24,013 C30H50O

Phytyl tetradecanoato 49,114 2,944 C34H66O2

β-Amyrin acetato 49,669 7,132 C32H52O2

Figura 20. Cromatograma CG-EM del extracto de hojas de Kalanchoe pinnata

disuelto en cloroformo

50


disuelto en cloroformo

Compuestos

Identificados

Tiempo de

retención

Porcentaje de área

relativo (%)

Estructura

molecular

Ácido hexadecanoico 30,747 27,596 C16H32O 2

Phytol 31,690 1,601 C20H40O

Ácido 9,12,15-

Octadecatrienoico

32,840 44,960 C18H30O2

Ácido eicosanoico 36,395 1,497 C20H40O2

Diisooctyl phthalate 38,439 0,424 C24H38O4

Tetracosanal 39,938 0,293 C24H48O

Heptacosano 40,495 0,439 C27H56

Esqualeno 42,590 7,830 C30H50

Hexacosanal 42,845 0,536 C26H52O

δ-Tocopherol 44,102 1,691 C27H46O 2

Vitamina E

45,337

46,443

1,456

2,935

C29H50O 2

(E)-24-

Propilidenocolesterol

49,014 6,940 C30H50O

β-Amyrin acetato 49,786 1,800 C32H52O2

3.5. Resultados para el análisis de Datos

Para analizar la significancia estadística de los factores y sus interacciones con respecto

al rendimiento y TFC del extracto de las hojas de Kalanchoe pinnata obtenidos por

extracción mediante fluido supercrítico CO2, se utilizó un análisis de varianzas con una

significancia de 0,05, para lo cual se planteó las hipótesis del efecto individual y en

conjunto de los factores para cada una de las variables respuesta, por ejemplo:

Ho: No existe diferencia significativa en el rendimiento promedio del extracto de las

hojas de kalanchoe pinnata por efecto del factor A.

Hi: Existe diferencia significativa en el rendimiento promedio del extracto de las hojas

de kalanchoe pinnata por efecto del factor A.

51

Tabla 18. Representación de los factores empleados en las hipótesis nulas y

alternativas

Factor Representación

Presión de extracción A

Temperatura de extracción B

Tiempo dinámico de extracción C

Presión y Temperatura de extracción AB

Presión y Tiempo de extracción AC

Temperatura y Tiempo dinámico de extracción BC

3.5.1. Análisis estadístico para el Rendimiento del extracto obtenido por EFS

Tabla 19. ANOVA para el rendimiento del extracto

Fuente Suma de

Cuadrados

Gl Cuadrado

Medio

Razón-F Valor-P

A:PRESIÓN 1,29989 1 1,29989 105,27 0,0000

B:TEMPERATURA 0,16255 1 0,16255 13,16 0,0067

C:TIEMPO 0,425397 1 0,425397 34,45 0,0004

AB 0,076826 1 0,076826 6,22 0,0373

AC 0,29858 1 0,29858 24,18 0,0012

BC 0,0483011 1 0,0483011 3,91 0,0833

Bloques 0,0126169 1 0,0126169 1,02 0,3417

Error total 0,0987853 8 0,0123482

Total (corr.) 2,42294 15

R-cuadrada = 95,9229 porciento

La ecuación de regresión para el rendimiento (R) que mejor se ajusta a los datos es:

𝑹 = −𝟕, 𝟐𝟓𝟒𝟔 + 𝟎, 𝟎𝟑𝟔𝟓 𝐀 + 𝟎, 𝟐𝟏𝟗𝟔 𝐁 + 𝟎, 𝟎𝟎𝟏𝟎 𝐂 − 𝟎, 𝟎𝟎𝟏𝟐 𝐀𝐁 + 𝟎, 𝟎𝟎𝟎𝟐 𝐀𝐂

− 𝟎, 𝟎𝟎𝟎𝟕𝐁𝐂 (𝟐𝟏)

52

El rendimiento máximo calculado a partir de las condiciones óptimas es 1,407%.

3.5.2. Análisis estadístico para el contenido total de flavonoides (TFC) de extracto

obtenido por EFS

Tabla 20:ANOVA para el contenido total de flavonoides (TFC) del extracto

Fuente Suma de

Cuadrados

Gl Cuadrado

Medio

Razón-F Valor-P

A:PRESIÓN 0,199273 1 0,199273 114,43 0,0000

B:TEMPERATURA 0,00114582 1 0,00114582 0,66 0,4407

C:TIEMPO 0,0388484 1 0,0388484 22,31 0,0015

AB 0,00006642 1 0,00006642 0,04 0,8500

AC 0,0258888 1 0,0258888 14,87 0,0048

BC 0,0017264 1 0,0017264 0,99 0,3486

bloques 0,00026244 1 0,00026244 0,15 0,7080

Error total 0,0139317 8 0,00174146

Total (corr.) 0,281143 15

R-cuadrada = 94,9749 porciento

la ecuación de regresión que mejor se ajusta a los datos y relaciona las variables

estudiadas con el TFC es:

𝑻𝑭𝑪 = −𝟎, 𝟎𝟐𝟐𝟓 − 𝟎, 𝟎𝟎𝟏𝟔 𝑨 + 𝟎, 𝟎𝟎𝟑𝟒 𝑩 − 𝟎, 𝟎𝟎𝟐𝟓 𝑪 + 𝟎, 𝟎𝟎𝟎𝟎𝟑 𝑨𝑩 + 𝟎, 𝟎𝟎𝟎𝟎𝟓 𝑨𝑪 −

𝟎. 𝟎𝟎𝟎𝟏𝟑 𝑩𝑪 (𝟐𝟐)

Reemplazando las condiciones operativas óptimas se obtiene el máximo TFC con un

valor de 0,406238.

53

4. DISCUSIÓN

4.1. Características y consideraciones en el tratamiento de las hojas de Kalanchoe

pinnata.

Las hojas de Kalanchoe pinnata fueron lavadas, secadas y trituradas durante la fase de

tratamiento, además en esta fase de la investigación se determinó los promedios del

porcentaje de humedad de las hojas frescas y secas como se muestra en la Tabla 21. El

valor de la humedad de trabajo fue el mismo para todos los análisis y se encuentra entre

los valores de humedad reportados en estudios relacionados con extracciones mediante

fluido supercrítico con valores de 3%, 6,93% y 10,5% del material vegetal que

garantizaron buenos resultados de extracción de compuestos activos y la conservación de

los mismos.

Tabla 21. Características de las hojas de Kalanchoe pinnata

Características Kalanchoe pinnata

Humedad promedio hojas frescas 89,6030 (%)

Porcentaje de humedad promedio hojas secas 8,8933 (%)

Tamaño promedio del polvo de hojas 0,3046±0,1655 (mm)

Usualmente la humedad mejora la solubilidad y actúa como agente de arrastre del soluto

en el sistema de extracción; pero también puede dificultar el proceso afectando el

rendimiento mecánico debido a la obstrucción de ciertos elementos del equipo (Al-Rawi

et al., 2013), por esta razón el proceso de secado cumple un papel importante en este tipo

de extracciones que además de reducir la humedad, rompe las paredes celulares de la

matriz vegetal y permite el acceso del solvente al interior de la estructura mejorando el

flujo de transferencia de masa (Gavilan & Narda, 2016). No obstante, si el secado no se

lleva bajo control puede influir de manera negativa reduciendo el rendimiento de los

54

componentes requeridos. Arjona, Días, & Iriarte (2006) indican que uno de los procesos

de secado poco satisfactorio en cuestión de rendimientos es la exposición directa al sol al

contrario del uso de un secador solar tipo macrotunel y la liofilización que aumentaron el

porcentaje de rendimiento.

Por otra parte, dado que ciertos autores consideran al tamaño de partícula como uno de

los factores más influyentes en EFS y que la humedad de las hojas de Kalanchoe pinnata

es elevada se decidió trabajar con un tamaño de partícula menor o igual a 1 mm con el

objetivo de optimizar la materia prima y mejorar el rendimiento de extracción ya que si

el tamaño es demasiado grande la partícula tiene menor área de superficie, por ende la

difusión del solvente en el interior de las células vegetales presenta más resistencia

mientras que, si es demasiado pequeño se produce la canalización del fluido supercrítico

llegando solo a ciertas partes del lecho y no uniformemente por lo cual el valor

recomendado en algunas investigaciones es 0,45 mm (Priyanka & Khanam, 2018) (Al-

Rawi et al., 2013).

El Anexo A muestra la distribución de los tamaños de partícula que presentan las muestras

del polvo de las hojas de Kalanchoe pinnata, gracias al análisis granulométrico además

se puede observar que el valor medio se aproxima al valor recomendado y sobre todo se

encuentra dentro del rango especificado en el diseño experimental.

El flujo de CO2 que se aplicó en el diseño experimental fue obtenido gracias a

experimentaciones previas en las que se determinó que a mayor cantidad de solvente

mayor es el rendimiento del extracto , tomando en cuenta que el incremento fue

moderado; este comportamiento también se observó en la extracción de aceite esencial

de la raíz de cúrcuma donde hubo un incremento del rendimiento de 5 a 10 (g/min) de

flujo de solvente mientras que disminuyó cuando incrementó a 15 (g/min) dado a un

menor tiempo de contacto soluto-solvente (Priyanka & Khanam, 2018), además durante

las experiencias se observó que a 10 (L/min) la aguja de la válvula de salida del extracto

se congelaba formando cristales e interrumpiendo la salida continua del extracto; por este

motivo se optó por trabajar con un valor de 5 (L/min) que no ocasionó inconvenientes

durante el proceso de extracción.

55

A continuación, se muestra la Figura 21 donde se observa el aumento de rendimiento del

extracto de hojas de Kalanchoe pinnata a medida que se altera el flujo de CO2 de forma

creciente manteniendo los valores de presión, temperatura, diámetro de partícula, tiempo

estático y tiempo dinámico constantes.

Figura 21. Efecto del Flujo de CO2 sobre el rendimiento de extracción

El co-solvente empleado y su relación en masa con respecto al fluido supercrítico CO2

fueron tomados de información bibliográfica, donde los resultados obtenidos indicaron

un aumento del rendimiento de extracción por efecto del incremento de la relación en

masa de 0 al 15%, además el co-solvente empleado fue una mezcla agua-etanol que fue

reportado como una mezcla de gran potencial para la extracción de compuestos polares

con capacidad antioxidante (Pérez-Coello, Marchante, Díaz-Maroto, Alarcón, & Alañón,

2017). La relación (v/v) con la que se trabajó fue al 48%.

4.2. Extracción mediante CO2 supercrítico del polvo de las hojas de K. Pinnata y


4.2.1. Resultados del rendimiento de extracción

En la Tabla 10 se muestra los rendimientos del extracto del polvo de las hojas de

kalanchoe pinnata obtenidos por extracción con fluido supercrítico CO2, para cada uno

de los tratamientos del diseño experimental y su réplica, obteniendo valores entre 0,22 y

1,59%.

0,2850,323

0,354

0,0000,0500,1000,1500,2000,2500,3000,3500,400

3 5 10

Ren

dim

ien

to (

%)

Flujo de CO2(L/min)

56

El experimento 7 y la réplica 10 presentaron las cantidades más altas de rendimiento con

valores de 1,59% y 0,93%, para ambos datos la presión de extracción y el tiempo

dinámico fueron 200 bar y 120 min, mientras que la temperatura aumentó de 35 a 40°C

respectivamente, un incremento de temperatura de extracción disminuye

considerablemente el valor del rendimiento del extracto; este efecto también fue

reportado para ciertos intervalos de temperatura en las extracciones con fluido

supercrítico de aceite de nuez moscada y aceite volátil de Achillea millefolium L. de

Macedonia (Villanueva-Bermejo et al., 2017) debido al aumento de la presión de vapor

de ciertos compuestos a extraer lo que conduce a la creciente volatilidad y evaporación

de los mismos.

Además, se puede observar que un incremento de presión de 150 a 200 bar manteniendo

fijas la temperatura y el tiempo dinámico de extracción aumenta la cantidad de extracto

obtenido debido al aumento de la solubilidad de los compuestos en el disolvente en estado

supercrítico por aumento de la densidad (Bishr et al., 2017).

4.2.2. Optimización del rendimiento del extracto obtenido mediante fluido

supercrítico CO2

La Tabla 19 muestra el cálculo ANOVA del rendimiento del extracto del polvo de las

hojas de Kalanchoe pinnata obtenido mediante extracción por fluido supercrítico con

CO2, donde se analizó la diferencia entre las medias de los factores y sus interacciones a

un nivel de significancia de 0,05, probando que el efecto individual de los 3 factores

estudiados influye significativamente, así como también la interacción de presión-

temperatura y presión-tiempo en la variable respuesta.

Además, se observa que existe un 95,92 % de varianza en el rendimiento de extracción

afectado por las variables presión, temperatura y tiempo dinámico.

57

Figura 22. Diagrama de pareto estandarizado para el rendimiento del extracto

En el diagrama de pareto se puede apreciar que el factor presión es la variable operativa

con mayor influencia en el proceso de extracción seguido del efecto del tiempo y la

interacción presión-tiempo. Se incluye además el gráfico de efectos principales que

muestra como influyen estos factores en el rendimiento del extracto al pasar de su nivel

bajo, a su nivel alto, como se muestra en la figura 23.

En la Figura 23 se puede observar que la relación que existe entre el rendimiento del

extracto y los factores presión y tiempo es directamente proporcional, es decir que el

incremento de la presión de 150 a 200 bar y del tiempo de 60 a 120 min aumenta la

cantidad de extracto obtenido; por el contrario la temperatura tiene una relación inversa

con la variable respuesta disminuyendo el rendimiento durante el incremento de 35 a

40ªC, por lo tanto al variar el nivel de la temperatura de bajo a alto, el rendimiento del

extracto decrece.

Figura 23. Gráfica de efectos principales para el rendimiento del extracto obtenido

por extracción con fluido supercrítico CO2

Diagrama de Pareto Estandarizada para Rendimiento

0 2 4 6 8 10 12

Efecto estandarizado

BC

AB

B:Temperatura

AC

C:Tiempo

A:Presión +

-

Presión

150 200

Temperatura

35 40

Tiempo

60 120

Gráfica de Efectos Principales para Rendimiento

0,31

0,41

0,51

0,61

0,71

0,81

0,91

Ren

dim

ien

to

58

Con el objetivo de optimizar el proceso de extracción se empleó la metodología de

superficie de respuesta, que reportó los valores óptimos para la obtención experimental

del máximo rendimiento del extracto mediante CO2 supercrítico, de esta forma se observó

que una presión de 200 bar, un tiempo de 120 min y una temperatura de 35 ºC, fueron las

condiciones operacionales que generan el mayor rendimiento del extracto.

En el gráfico que se presenta a continuación se mantuvo la temperatura constante en su

valor óptimo de 35 ºC ya que como muestra el diagrama de Pareto este factor, aunque es

significativo es el que menos influencia tiene de las tres variables.

Figura 24. Gráfico de superficie de respuesta estimada a temperatura constante

4.2.3. Comparación entre la extracción por maceración y mediante fluido

supercrítico CO2

Un estudio preliminar a la investigación actual obtuvo el extracto metanólico de las hojas

de kalanchoe pinnata por maceración, método empleado usualmente para la extracción

de esta planta. La extracción se llevó acabo con 2 L de metanol al 60% por un tiempo de

(7 a 15) días con agitación. El macerado se rotaevaporó a 40°C obteniendo un líquido

oscuro con un rendimiento del 2,97% (Chávez, 2017)

Superficie de Respuesta Estimada

Temperatura=35,0

150 160 170 180 190 200

Presión

6070

8090

100110

120

Tiempo

0

0,4

0,8

1,2

1,6

Ren

dim

iento

59

Tabla 22. Características y rendimientos de los extractos de las hojas de k. pinnata

obtenidos por diferentes tipos de extracción

Tipo de extracción Maceración EFS

Rendimiento (%) 2,97 1,59

Tiempo de extracción 15 días + 7 días

de evaporación

200 min

Color Oscuro Amarillo claro

Aroma Sin aroma Aroma dulce

Textura Viscoso Sólido

Solvente Metanol

60% (2L)

Solución etanol-agua

48% (60,52 mL)

Figura 25. Comparación de los rendimientos de extracción por maceración y EFS

En la Tabla 22 se observa las características y rendimientos de los extractos de las hojas

de k. pinnata obtenidos por maceración y extracción mediante fluido supercríticos CO2

con el objetivo de establecer una comparación y constatar las ventajas y desventajas de la

EFS frente a extracciones convencionales.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

Maceración EFS

2,97

1,59

Ren

dim

ien

to (

%)

Método de extracción

60

La Figura 25 muestra el rendimiento expresados como un porcentaje del material extraído

con respecto al peso de las hojas de chiriryuyo empleado, hay una visible diferencia

indicando que la extracción por maceración obtiene mejores rendimientos de extracción,

pero no necesariamente de selectividad como lo indica Gavilan & Narda (2016) en la

extracción de capsaicinoides de las venas de ají panca.

Por otro lado, los tiempos de extracción demuestran que la extracción por maceración es

más lenta que la EFS y que puede generarse la degradación de compuestos durante la

rotaevaporación. Por último, el color oscuro del extracto puede indicar presencia de

pigmentos o impurezas, asimismo la cantidad de metanol usado es elevado y dado que es

un solvente tóxico hace que la técnica por maceración no sea muy conveniente.

4.3. Estimación del contenido total de flavonoides (TFC) en el extracto de las hojas

de Kalanachoe Pinnata

4.3.1. Resultados de la estimación del TFC

La Tabla 14 muestra que los valores de presión 200 bar, temperatura 35°C y tiempo 120

min son los niveles de los parámetros que maximizaron el contenido total de flavonoides,

obteniendo 0,4575 (mg QE/g muestras seca); de esta forma el efecto del aumento de la

presión es buena debido a una mayor capacidad de solvatación del CO2 en estado

supercrítico.

Además, se observó que un aumento de temperatura disminuye ligeramente el TFC

posiblemente debido a pérdidas de compuestos a temperaturas más altas. Por último,

mientras mayor sea el tiempo dinámico de extracción aumenta el contenido total de

flavonoides en el polvo de hojas de kalanchoe pinnata debido a que durante el tiempo

dinámico la renovación del solvente es continua evitando la saturación del fluido

supercrítico y mejorando la eficiencia de extracción.

61

4.3.2. Optimización del contenido total de flavonoides en las hojas de Kalanchoe

pinnata

La tabla de ANOVA para el contenido total de flavonoides exhibe que el valor P del factor

presión (p=0,0000), tiempo (p=0,0016) y la interacción presión-tiempo (p=0,0050) son

estadísticamente significativos en el TFC. Mientras que la variable temperatura no tiene

influencia significativa en el contenido total de flavonoides

Figura 26. Diagrama de Pareto estandarizado para el TFC

El diagrama de Pareto indica que 3 de los 6 efectos estudiados son significativos, siendo

el factor presión el de mayor influencia en el TFC, seguido por el efecto del tiempo

dinámico, también muestra que el factor temperatura es uno de los factores que menos

influencia tiene en la variable respuesta

Figura 27. Efectos principales para el TFC

Diagrama de Pareto Estandarizada para TFC

0 2 4 6 8 10 12

Efecto estandarizado

AB

B:Temperatura

BC

AC

C:Tiempo

A:Presión +

-

Gráfica de Efectos Principales para TFC

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

TF

C

Presión

150 200

Temperatura

35 40

Tiempo

60 120

62

En la Figura 27 se puede observar que la presión y el tiempo tienen relación directa con

la variable dependiente, es decir al pasar el nivel del factor de bajo a alto el TFC

incrementa, mientras que la temperatura tiene relación inversa con el contenido total de

flavonoides por lo cual, un incremento de temperatura modifica la variable respuesta de

forma decreciente.

Por último, el gráfico de superficie de respuesta identifica el nivel óptimo de cada factor

para obtener el mayor TFC posible. En el gráfico 29 se mantuvo constante el tiempo

dinámico en su valor óptimo de 120 min.

Figura 28. Gráfico de superficie de respuesta estimada a tiempo dinámico

constante

4.4. Resultados para la caracterización por marchas fitoquímicas y cromatografía

de gases con espectrometría de masa del extracto de K. pinnata

4.4.1. Caracterización mediante marcha fitoquímica

La caracterización por marchas fitoquímicas es un método simple y rápido para la

identificación de metabolitos secundarios. En la Tabla 15 se observó la identificación de

flavonoides para los extractos obtenidos mediante CO2 supercrítico a partir de las hojas

de k. pinnata. Dado a que hubo cambios de coloración y formación de espuma durante la

experiencia los resultados fueron positivos para las reacciones de shinoda y cloruro

férrico, mientras que la prueba de cianidina dio resultados negativos. (Anexos D, E y F)

Superficie de Respuesta Estimada

Tiempo=120,0

150160

170 180190

200

Presión

35

36

37

38

39

40

Temperatura

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

TF

C

63

4.4.2. Caracterización por cromatografía de gases con espectrometría de masa

(CG-EM)

Para la caracterización por cromatografía de gases con espectrometría de masa se utilizó

los extractos que se generaron a las condiciones óptimas en cuanto a rendimiento y TFC,

se empleó como fase móvil dos solventes: etanol y cloroformo que dieron como resultado

cromatogramas similares. Aunque los cromatogramas eran muy similares se observó

mejor resolución usando como solvente etanol

Un estudio químico y biológico de Kalanchoe pinnata (Lam.) que crecen en Bangladesh

reportó ciertos compuestos también obtenidos por CG-EM mencionados en esta

investigación (Sharker et al., 2012b).

.

64

5. CONCLUSIONES

Mediante extracción con fluido supercrítico CO2 se obtuvo un extracto puro con

compuestos activos a partir de las hojas de Kalanachoe pinnata.

Se comprobó que las variables independientes estudiadas presión, tiempo dinámico y

temperatura tuvieron influencia significativa sobre el rendimiento del extracto,

mientras que para el contenido total de flavonoides solo la presión y el tiempo

dinámico fueron estadísticamente significativas.

Se determinó que las condiciones óptimas de extracción con respecto al rendimiento

de extracción y contenido total de flavonoides fueron presión 200 bar, temperatura

35°C y tiempo dinámico 120 min, con valores de 1,59 % de rendimiento y 0,4575(mg

QE/g muestra seca) respectivamente.

Al comparar los rendimientos de extracción por el método de maceración y fluido

supercrítico se evidenció que el método convencional tiene mayor rendimiento de

extracto, pero fue más largo el tiempo de maceración y la extracción del solvente más

complejo.

65

6. RECOMENDACIONES

Tomando en cuenta que en varias investigaciones de extracciones con fluido

supercrítico donde se trabaja con más de dos niveles de las variables

independientes, se observan rangos de la variable respuesta se ve afectada de

manera positiva por estas; mientras que en otros influyen negativamente. Se

recomienda para futuras investigaciones trabajar con más de dos niveles de las

variables estudiadas para de esta manera analizar mejor el efecto y

comportamiento de estos factores.

Dado que el efecto de la variable tiempo dinámico favorece el rendimiento de

extracción y el contenido total de flavonoides a medida que pasa de su nivel bajo

al alto, se recomienda hacer una cinética de extracción que permita encontrar el

tiempo de extracción donde ya no se obtiene extracto de las hojas de Kalanchoe

pinnata.

66

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72

ANEXOS

73

ANEXO A. Análisis granulométrico del polvo de las hojas de K. pinnata

74

ANEXO B. Mediciones de absorbancias de los diferentes extractos obtenidos por EFS

Tabla B. Mediciones de las absorbancias de cada muestra a 415 (nm)

EXP Señales de absorbancias Absorbancia promedio

1 0,058 0,0581 0,0581 0,0581 0,058 0,0582 0,0582 0,0595 0,0582 0,0582 0,0583

2 0,0582 0,0582 0,0583 0,0583 0,0582 0,0587 0,0584 0,0582 0,0583 0,0584 0,0583

3 0,0869 0,0869 0,087 0,087 0,0871 0,0871 0,087 0,087 0,087 0,087 0,0870

4 0,1323 0,1303 0,1305 0,1305 0,1306 0,1305 0,1305 0,1307 0,1305 0,1306 0,1307

5 0,128 0,128 0,1278 0,1279 0,1279 0,1281 0,1281 0,128 0,1281 0,1281 0,1280

6 0,1223 0,1211 0,1242 0,1201 0,1197 0,1222 0,12 0,1199 0,1199 0,12 0,1209

7 0,2278 0,228 0,2286 0,2281 0,2278 0,2279 0,2279 0,228 0,2282 0,228 0,2280

8 0,1931 0,1932 0,1929 0,1932 0,1931 0,1932 0,1931 0,1932 0,1932 0,1935 0,1932

9 0,1749 0,1749 0,1752 0,1751 0,1751 0,1751 0,175 0,175 0,1752 0,1754 0,1751

10 0,1893 0,1909 0,1968 0,2007 0,1893 0,1892 0,1891 0,1894 0,1893 0,1891 0,1913

11 0,0587 0,0589 0,0572 0,0574 0,0574 0,0578 0,0571 0,0572 0,0578 0,0575 0,0577

12 0,0426 0,0359 0,0349 0,0348 0,0347 0,0347 0,0347 0,0348 0,0351 0,0356 0,0358

13 0,0773 0,0785 0,0774 0,0757 0,0731 0,0791 0,0797 0,0797 0,0795 0,0796 0,0780

14 0,0505 0,0505 0,0504 0,0504 0,0506 0,0505 0,0504 0,0505 0,0503 0,0505 0,0505

15 0,0566 0,0566 0,0568 0,0565 0,0567 0,0567 0,0568 0,0568 0,0568 0,0568 0,0567

16 0,0573 0,0577 0,0574 0,0573 0,0575 0,0573 0,0573 0,0574 0,0575 0,0574 0,0574

75

ANEXO C. Marcha Fitoquímica: Reacción de Shinoda

Figura C.1. Muestra del extracto sin reactivos

Figura C.2. Muestra del extracto con reactivos

76

ANEXO D. Marcha Fitoquímica: Reacción de Cloruro Férrico

Figura D.1. Muestra del extracto sin reactivos

Figura D.2. Muestra del extracto con reactivos

77

ANEXO E. Marcha Fitoquímica: Reacción de Cianidina

Figura E.1. Muestra del extracto sin reactivos

Figura E.2. Muestra del extracto con reactivos

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