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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS

CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA

DESPLIEGUE DIFERENCIAL DE GENES CANDIDATOS DEL PROCESO DE

EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA EN TOMATE DE ÁRBOL (Solanum betaceum

L.)

TRABAJO DE GRADO PREVIA A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE

INGENIERA AGRÓNOMA

VANESSA ESTEFANÍA TELLO SUÁREZ

TUTOR: ING.AGR. ANÍBAL POZO, ESP.

QUITO, SEPTIEMBRE 2016

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DEDICATORIA

A mi padre celestial, el creador de todas las cosas, que me ha dado

el don de vida y la fortaleza para superar con éxito cada reto

propuesto hasta hoy, dedico primeramente mi trabajo a Dios.

A mis amados padres, hermanas y abuela, por haberme formado

como un ser humano de buenos sentimientos y valores, que con su

amor incondicional me han apoyado durante mi carrera profesional

y en todas las circunstancias de mi vida, a ustedes les debo mi

felicidad.

A ti, Pablo Aguirre, con todo el amor de mi corazón.

Vanessa.

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AGRADECIMIENTO

A mis profesores y distinguido Tutor, por trasmitirme su

sabiduría y el honor de haber tenido su dirección a lo largo

de este camino.

A mis hermanas, por ser mi alegría y motivarme a ser un

mejor modelo de hermana mayor.

A mis amigos, por compartir a mi lado buenos y malos

momentos durante esta bella experiencia universitaria,

seremos amigos por siempre Luz María, Cynthia, Gabriel y

Carlos.

A mis familiares y amigos que me han brindado el soporte

económico y moral para la culminación exitosa de este

trabajo.

Vanessa.

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CONTENIDO CAPÍTULO PÁGINAS

1.INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………………………………………….1

1.1.OBJETIVOS……………………………………………………………………………………………………………….2

2.REVISION DE LITERATURA………………………………………………………………………………………….3

2.1.Tomate de árbol - Solanum betaceum L……………………………………………………………….….3

2.2.Importancia económica de Solanum betaceum L. en Ecuador…………………………..…….3

2.3.Cultivo in-vitro de tejidos vegetales…………………………………………………………………………4

2.4.Embriogénesis somática………………………………………………………………………………………….4

2.5.Factores que afectan la embriogénesis somática…………………………………………………….5

2.6.Fases de la embriogénesis somática………………………………………………………………………..6

2.7.Embriogénesis somática en Solanaceae…………………………………………………………….…...7

2.8.Expresión genética durante la embriogénesis somática…………………………………………..8

2.9.Importancia de la transcriptómica en procesos fisiológico-genético-molecular…..….9

2.10.Métodos para estudiar el transcriptoma……………………………………………………………….9

3.MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………………………………………………………...11

3.1.UBICACIÓN………………………………………………………………………………………………………...….11

3.2.MATERIALES…………………………………………………………………………………………………………..11

3.3.MÉTODOS………………………………………………………………………………………………………….…..13

4.RESULTADOS Y DISCUSIÓN………………………………………………………………………………………16

4.1.Cultivo in vitro……………………………………………………………………………………………………....16

4.2.Despliegue de bandas diferenciales…………………………………………………………………….…17

5.CONCLUSIONES………………………………………………………………………………………………………..20

6.RECOMENDACIONES………………………………………………………………………………………….…….21

7.RESUMEN………………………………………………………………………………………………………………...22

SUMMARY…………………………………………………………………………………………………….…………23

8.REFERENCIAS………………………………………………………………………………………………………...…24

9.FIGURAS……………………………………………………………………………………………………………….….29

10.ANEXOS……………………………………………………………………………………………………………….…32

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ÍNDICE DE ANEXOS

ANEXO PÁG.

1. Protocolo PurelinkTM RNA mini kit Ambion by Life Technologies. .................................. 32

2. Mezclas de reacción y condiciones para retrotranscripción del ARN protocolo

SuperScript III Transcriptasa Reversa InvitrogenTM 200U. .................................................. 33

3. Mezcla de reacción y condiciones de amplificación de cDNA mediante PCR según el

protocolo de amplificación Taq DNA Polimerasa Recombinante InvitrogenTM. ................. 34

4. Concentraciones de las soluciones para teñir el gel de poliacrilamida........................... 35

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ÍNDICE DE GRÁFICOS

GRÁFICO PÁG.

1. Número de bandas diferenciales encontradas por combinación de primers del kit de

despliegue diferencial de GenHunter, en varias estructuras inducidas in vitro en tomate de

árbol. ............................................................................................................................... 18

2. Número de bandas diferenciales exclusivas, subexpresadas y sobreexpresadas

resultantes de las 5 combinaciones de primers exitosas (HT11A-HAP6, HT11A-HAP7,

HT11A-HAP8, HT11C-HAP8, HT11C-HAP7) para embrión somático, embrión cigótico, callo

embriogénico, callo no embriogénico e hipocótilo de Solanum betaceum L. ............... 18

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ÍNDICE DE FIGURAS

FIGURA PÁG.

1. Gel resultante de la electroforesis en poliacrilamida al 6% de los productos amplificados

correspondiente a las muestras testigo (2: embrión cigótico y 5: hipocótilos) y muestras

inducidas (1: embrión somático, 3: callo embriogénico y 4: callo no embriogénico) con las

5 distintas combinaciones de primers (HT11A-HAP6, HT11A-HAP7, HT11A-HAP8, HT11C-

HAP8, HT11C-HAP7). El marcador de peso molecular utilizado fue 100pb de Invitrogen. De

izquierda a derecha MW: ladder 100pb; Banda A6: Primer HT11A-HAP6; Banda A7: Primer

HT11A-HAP7; Banda A8: Primer HT11A-HAP8; Banda C8: Primer HT11C-HAP8; Banda G7:

Primer HT11G-HAP7. ...................................................................................................... 17

2. Esquema de las fases que desarrolla el embrión somático a través del proceso de

inducción a embriogénesis somática. ............................................................................ 29

3. Esquema gráfico de la metodología utilizada para el despliegue diferencial de bandas en

geles de poliacrilamida durante la embriogénesis somática en tomate de árbol Solanum

betaceum L. .................................................................................................................... 29

4. Explantes sobre medio de inducción a embriogénesis somática. A. Hipocótilos sembrados

en medio MS (suplementado 9% sacarosa, Bacto Agar DifcoTM 7.5 gL-1, 4.5 ppm ANA, 0.1

ppm 2,4-D, pH 6.068). B. tejido desdiferenciado incubado a 28°C a los 30 días de cultivo.

........................................................................................................................................ 30

5. Fase de inducción embriogénica, masas de células proembriogénicas inducidas en medio

MS (suplementado 9% sacarosa, Bacto Agar DifcoTM 7.5 gL-1, 4.5 ppm ANA, 0.1 ppm 2,4-

D, pH 6.068). ................................................................................................................... 30

6. Callo embriogénico en medio de multiplicación con embriones globulares en desarrollo

a los 10 días de subcultivado el callo.............................................................................. 31

7. Bandas expresadas en gel de agarosa 4% de los primers HAP6-HT11A, HAP7-HT11A,

HAP8-HT11A, HAP8-HT11C, HAP7-HT11G...................................................................... 31

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DESPLIEGUE DIFERENCIAL DE GENES CANDIDATOS DEL PROCESO DE EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA EN TOMATE DE ÁRBOL Solanum betaceum L.

Autor: Vanessa Estefanía Tello Suárez

Tutor: Ing. Agr. Aníbal Pozo, Esp.

RESUMEN

En esta investigación se evidenció, mediante despliegue diferencial, la activación o represión de genes involucrados en las frases de cultivo in vitro que conducen a la formación de embriones somáticos a partir de hipocótilos de Tomate de árbol (Solanum betaceum L.). Se utilizó el medio MS suplementado con sacarosa 90 gL-1, Bacto Agar DifcoTM 7.5 gL-1, ANA SigmaTM 4.5 gL-1, 2-4D SigmaTM 0.1 gL-1 pH 6.068. Se obtuvo un total de 11 bandas diferenciales, de las cuales dos pertenecen a embrión somático, una a embrión cigótico, 3 a callo embriogénico, 4 a callo no embriogénico y una a hipocótilo. De éstas, algunas fueron exclusivas para embrión somático, callo embriogénico, callo no embriogénico e hipocótilo, otras fueron subexpresadas o sobreexpresadas en los tejidos evaluados. Nuestros resultados contribuirán a identificar los genes implicados en los procesos de formación de embriones somáticos.

PALABRAS CLAVE: EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA, EXPRESIÓN DIFERENCIAL, FITOHORMONAS

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DIFFERENTIAL DISPLAY OF CANDIDATE GENES OF SOMATIC EMBRYOGENESIS PROCESS IN TAMARILLO Solanum betaceum L.

Author: Vanessa Estefanía Tello Suárez

Tutor: Ing. Agr. Anibal Pozo B., Esp.

ABSTRACT

In this study we evidenced, by differential display, the activation and repression of genes involved in the phases of in vitro culture that lead to the formation of somatic embryos from tamarillo hypocotyls (Solanum betaceum L.). We used the MS medium supplemented with sucrose 90gL-1, Bacto Agar DifcoTM 7.5gL-1, ANA SigmaTM 4.5 gL-1, 2-4D SigmaTM 0.1 gL-1 pH 6,068. A total of 11 differential bands were obtained, of which two belong to somatic embryo, one to zygotic embryo, three to embryogenic callus, four to non-embryogenic callus and one to hypocotyls. From these, some were unique to somatic embryo, zygotic embryo, embryogenic callus, non-embryogenic callus or hypocotyl, others were down regulated or up regulated in the tissues tested. Our findings will contribute to the identification of genes implicated in the processes of somatic embryo formation.

KEY WORDS: SOMATIC EMBRYOGENESIS, DIFFERENTIAL EXPRESSION, PHYTOHORMONES.

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1. INTRODUCCIÓN

El tomate de árbol (Solanum betaceum L.) es un arbusto semileñoso, originario de la zona andina. Su fruto es comestible, tiene forma ovoidal con delicioso sabor y aroma. Su pulpa es aprovechada para la elaboración de zumos, mermeladas y jaleas (Correia & Canhoto, 2012). La demanda de este frutal se ha extendido a nivel mundial por lo que se lo cultiva en Ecuador, Colombia, Kenia, India, Estados Unidos y Nueva Zelanda, siendo este último el mayor exportador mundial de tomate de árbol (Lucas et al., 2011).

En el Ecuador se cultiva aproximadamente 6043 has de tomate de árbol, siendo la provincia de Tungurahua con 32.9% la de mayor porcentaje del total de producción a nivel nacional. Actualmente la producción ecuatoriana es apta para exportación hacia Colombia, Estados Unidos y Europa, sin embargo, el nivel competitivo en cuanto a productividad y calidad de la fruta es muy bajo en relación a los demás países productores, esto se debe principalmente a la carencia de un sistema de producción que sea capaz de manejar los problemas fitosanitarios, uso intensivo de pesticidas, homogenización de la calidad de la fruta y control de la presencia de mosca de la fruta (Soria, 2009).

El establecimiento de programas de mejoramiento genético se ha visto dificultado por la reducida diversidad genética encontrada en las variedades cultivadas de esta especie (Ordoñez, 2007), por lo que convendría recurrir a los parientes silvestres en búsqueda de genes de resistencia y tolerancia a factores bióticos y abióticos. Los métodos propagación in vitro podrían contribuir mediante la multiplicación masiva de genotipos seleccionados por sus características deseables, y mediante la introducción de genes foráneos mediante Ingeniería Genética. Adicionalmente, se ha demostrado que la embriogénesis somática en Solanum betaceum L. y otras especies vegetales brinda la posibilidad de homogenizar las plantaciones mediante la multiplicación de clones con las características de interés para el productor y el mercado demandante (Casimiro, 2014). Esta herramienta abre además la posibilidad de realizar trabajos en transgénia y el manejo de silvicultura clonal de alta productividad (Celestino et al., 2005), siendo también posible su aplicación en áreas de investigación como variación clonal, estudios celulares y crioconservación de líneas embriogénicas (Arahana et al., 2010).

La importancia de esta investigación consiste en identificar genes que se activan o reprimen durante el proceso de embriogénesis somática mediante la técnica de despliegue diferencial. Esto permitirá entender las rutas metabólicas responsables de este proceso complejo y eventualmente será posible su manipulación, ya sea para incrementar la eficiencia, así como para superar las barreras que impiden su ejecución en especies recalcitrantes (Celestino et al., 2005).

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1.1. OBJETIVOS

1.1.1. Objetivo General

Evidenciar la expresión diferencial de genes candidatos que se activan en el proceso de embriogénesis somática en tomate de árbol (Solanum betaceum L.) mediante la técnica despliegue diferencial.

1.1.2. Objetivos específicos

- Inducir in vitro embriogénesis somática en tomate de árbol mediante combinaciones hormonales en el medio de cultivo.

- Determinar en geles de poliacrilamida la expresión diferencial de genes en el proceso de embriogénesis somática.

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2. REVISION DE LITERATURA

2.1. Tomate de árbol - Solanum betaceum L.

El tomate de árbol es un arbusto semileñoso, nativo de la región andina; crece de forma natural en Bolivia, Argentina, Venezuela, Ecuador, Perú y Colombia; se lo cultiva comercialmente en Colombia, Ecuador y Nueva Zelanda; este último se ha consolidado como el mayor exportador a nivel mundial de este frutal (INIAP, 2004).

El fruto es ovoidal, la coloración del pericarpio va desde tonos del amarillo, anaranjado, morado, hasta el rojo oscuro, posee una pulpa jugosa ligeramente ácida, empleada en la industria para la preparación de jugos, jaleas, mermeladas y postres de cocina gourmet (Leiva, 2008).

En Ecuador se reconocen 6 variedades basado en la forma y color del fruto: común anaranjado, amarillo gigante, amarillo bola, morado puntón, morado gigante y morado bola (Jaramillo, 2013).

El tomate de árbol se reproduce principalmente de manera sexual por semilla, pero en ocasiones se lo propaga de forma vegetativa por estacas (Albornoz, 1992).

2.2. Importancia económica de Solanum betaceum L. en Ecuador

En el Ecuador, el área sembrada con tomate de árbol ha crecido paulatinamente a través de los años, para el 2001 se reportaron 4 064 ha de cultivo (INIAP, 2004) y según la actualización del último censo nacional agropecuario (MAGAP, 2010) se están dedicando 6 043 hectáreas para la producción de tomate de árbol entre monocultivo y asociaciones con otros frutales. Las provincias que cultivan la mayor parte de tomate de árbol son: Tungurahua (39.2%), Chimborazo (22.2%), Azuay (14.1%), Pichincha (10%), Imbabura (4.8%) (Lucas et al., 2011).

Por otro lado, se considera que la producción de tomate de árbol con fines de exportación en nuestro país es incipiente, debido a la carencia de un sistema de producción que afronte los problemas fitosanitarios y la homogenización de la calidad de la fruta, con lo cual podría ingresar a los mercados internacionales (Soria, 2009).

2.2.1. Limitantes para la producción de tomate de árbol

Según León & Viteri (2003) el área de cultivo de tomate de árbol ha ido en aumento con los años, pero no es el caso del rendimiento, el cual mantiene una tendencia a la baja con 5,5 tm/ha/año en año 2001 y 3.29 tm/ha/año en el año 2010, lo cual se debe principalmente a la alta incidencia de plagas y enfermedades, al requerimiento de fertilización y escasa asistencia técnica.

Dentro de los principales problemas fitosanitarios que enfrenta la producción de tomate de árbol en nuestro país se menciona: plagas insectiles como pulgones (Aphis sp.), gusano tozador (Agrotis sp.), cutzo (Phyllophaga sp.) y plagas fúngicas que se presentan en las diferentes etapas del cultivo como: pudrición radicular (Fusarium oxysporum), mancha negra (Fusarium solani), Tizón temprano (Alternaria sp.), Tizon tardío (Phytoptora infestans), oidio o cenicilla (Oidium sp.), nematodos (Meloidogyne incognita) y antracnosis (Collectotrichum gloesporoides) principal problema debido a que afecta directamente a la calidad del fruto (Revelo et al., 2008).

Una alternativa que se ha venido utilizando para el manejo de Meloidogyne incognita es injertar la planta de tomate de árbol sobre patrones de Solanum arboreum, Nicotiana glauca, Solanum ispidum y Solanum auriculatum, sin embargo, esta alternativa no sería muy practica en grandes extensiones de cultivo por los altos costos de mano de obra que demandaría (INIAP, 2004).

Mediante la investigación de alternativas de propagación que presenten la posibilidad de un mejoramiento posterior de la fruta, el tomate de árbol, se posicionaría en mercados extranjeros potencialmente bastos como: Estados Unidos, Holanda, Canadá, Bélgica, Alemania, Suecia, Suiza,

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Dinamarca, Reino Unido, España y Finlandia, siendo una ventaja del Ecuador la posibilidad de producir durante todo el año (Ordoñez, 2007).

2.3. Cultivo in-vitro de tejidos vegetales

El cultivo in vitro es un procedimiento que se lleva a cabo a través de una metodología estandarizada dependiendo del vegetal a estudiar; las características generales del medio de cultivo en donde permanecen los explantes son benéficas para el crecimiento y desarrollo de tejidos debido al contenido de sales esenciales, vitaminas, agente gelificante, sacarosa y en algunos casos hormonas reguladoras de crecimiento. Sus condiciones deben permanecer estériles y libres de contaminantes, con lo cual se apuesta por la sanidad vegetal en menores tiempos de multiplicación y mayor cantidad de plantas en espacios reducidos (Miranda, 2014).

Las sales inorgánicas que se emplean en el medio de cultivo se clasifican en macronutrientes como nitrógeno (N), potasio (K), calcio (Ca), fosforo (P), magnesio (Mg), azufre (S) y pequeñas cantidades de micronutrientes como hierro (Fe), níquel (Ni), cloro (Cl), manganeso (Mn), zinc (Zn), boro (B), cobre (Cu) y molibdeno (Mo). Estos elementos junto con carbono (C), oxigeno (O) e hidrogeno (H) constituyen los 17 elementos esenciales para el desarrollo vegetal; aunque cada planta tiene sus requerimientos elementales se ha encontrado que la mayoría puede adaptarse a un medio que promueva su desarrollo. El medio más utilizado es la formulación Murashinge and Skoog (1962) (George, 2008).

Según Jordán & Casaretto (2006) bajo condiciones in vitro las células que presentan división y elongación celular se encuentran influenciadas por la existencia de varias hormonas. Las auxinas, son hormonas naturales o sintéticas reguladoras del crecimiento y formación de raíces; regulan los tropismos, dominancia apical, desarrollo de flores y frutos, diferenciación vascular, entre otras. Las citoquininas en cambio promueven la división celular, provocan organogénesis, androgénesis, iniciación de brotes, activación de yemas en dormancia. La presencia de hormonas en el medio de cultivo permite que los explantes tomen diferentes caminos morfogénicos; si se combinan diferentes niveles de auxinas y citoquininas pueden presentarse respuestas alternativas, por ejemplo, al colocar altos niveles de auxina se induce la multiplicación celular pero sin conseguir mayor diferenciación en el tejido, si la cantidad de axina es más alta que la de citoquinina se da lugar a la formación de raíces adventicias, si por otro lado los niveles de citoquinina son más elevados que los de auxina el tejido es inducido a la formación de brotes adventicios; las giberelinas muestran su efecto más importante sobre la altura de los tallos, se ha demostrado que las plantas altas poseen GA1 mientras que las enanas GA20, promueven el desarrollo de inflorescencias, inducen la germinación de semillas en dormancia y son aplicadas para la producción de uvas sin semilla (Kato et al., 2000).

Las técnicas de cultivo in vitro han permitido entender mejor los eventos de diferenciación celular y adicionalmente se ha conseguido aprovechar eficientemente el potencial vegetativo del reino vegetal a través del mejoramiento genético, obtención de plantas libre de patógenos, conservación de germoplasma y micropropagación; esta última consiste en reproducir masivamente un tejido u órgano cultivado in vitro, procedimiento que para múltiples especies presenta ventajas muy superiores en calidad, sanidad y ahorro de tiempo con respecto a técnicas de propagación tradicionales (Villalobos & Thorpe, 1991).

2.4. Embriogénesis somática

La embriogénesis somática es una forma de micro propagación a partir de una célula o grupo de células que mantienen activa división celular dando como resultado la formación de embriones somáticos sin necesidad de fusionar gametos (Gomora, 2014). Diferentes tejidos vegetales tales como embriones cigóticos, hipocótilos, cotiledones, raíces y hojas son idóneos para iniciar este proceso (Correia & Canhoto, 2012). Estos explantes sembrados en un medio inductor aséptico en condiciones de luz y temperatura apropiadas originan embriones somáticos que desarrollan las

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mismas fases de un embrión cigótico gracias a la totipotencia celular de los miembros del reino vegetal (Casimiro, 2014).

Un embrión somático se considera como un individuo de estructura bipolar capaz de originar una planta completa pasando por las mismas fases de desarrollo que un embrión cigótico. El proceso embriogénico puede ocurrir de dos maneras, directa o indirectamente, en la primera, el embrión somático se forma sobre el tejido inicial y en la segunda, el embrión se forma a partir de células desdiferenciadas y reprogramadas gracias al regulador hormonal (Pérez et al., 1998).

La embriogénesis somática presenta ventajas y desventajas. Entre las primeras se menciona la eficiencia y el ahorro económico; se han reportado experimentos exitosos en varias especies forestales maderables y de interés alimenticio por la rapidez de inducción y desarrollo de embriones somáticos con el mismo genotipo de la planta seleccionada como idónea de una plantación, puede llevarse a cabo en medio liquido lo cual ahorra espacio y recursos, es posible también la multiplicación de genotipos difíciles de propagar por vía sexual, además representa la mejor vía de conservación de especies con semillas recalcitrantes que por sus características son difíciles de mantener en los bancos de germoplasma pudiendo crear a través de este método una “semilla sintética” (Celestino et al., 2005).

Entre las desventajas que han surgido durante la inducción, multiplicación y evaluación del material vegetal proveniente de la embriogénesis somática están: la aún baja multiplicación en campo de plantas provenientes de cultivo embriogénico pues de las 81 especies reproducidas mediante embriogénesis somática, solo 34 fueron capaces de crecer en el suelo, otra limitación es la baja posibilidad de obtener embriones somáticos a partir de material adulto pues las semillas y el material juvenil son altamente utilizados para la técnica (Ablanque, 1999).

2.5. Factores que afectan la embriogénesis somática

Existen varios factores que influyen en los procesos embriogénicos obstaculizando alcanzar los más altos niveles de eficiencia en el mismo, entre los de mayor importancia están factores como el genotipo, tipo de explante, medio de cultivo y concentración de hormonas exógenas, lo que ha dificultado la rápida estandarización de un protocolo ideal para este proceso (Criollo, 2013).

Como primer factor de importancia dentro del proceso embriogénico está el genotipo, ya que la frecuencia de la embriogénesis somática se puede alterar significativamente por variantes genotípicas siendo aún plantas del mismo género y especie, un ejemplo de ello es la respuesta diferente que mostraron los clones BC5, BC6 y BC36 de cacao (Theobroma cacao) ante el mismo tratamiento con 2,4-D, agua de coco, prolina y ácido giberelico (Kononowickz et al., 1984).

Tomando en cuenta el tipo de explante, existen tejidos que responden mejor que otros a ciertos tratamientos de inducción a los que son sometidos, por lo que cultivar el tejido adecuado asegura la eficiencia embriogénica esperada. Escalant & Sandoval (1989) destacaron la utilidad de las inflorescencias estaminadas como tejido exitoso para la obtención de callos embriogénicos en el clon de banano Pineo Enano, así como en otros tipos de bananos (Albarrán et al., 2009). En café ha sido posible inducir embriogénesis somática a partir de diversos explantes como segmentos de tallo, hojas, óvulos e hipocótilos; se comprobó además que según el grado de desarrollo de hipocótilos y hojas, es posible inducir embriogénesis directa en lugar de callo embriogénico con alto potencial de multiplicación (López et al., 2010). En Solanum betaceum, Guñimares et al. (1988) obtuvieron plantas de tomate de árbol a partir de embriogénesis somática utilizando explantes como hipocótilos, cotiledones, raíces, peciolo de hojas jóvenes y embriones cigóticos maduros (Casimiro, 2014).

En cuanto al medio de cultivo, factores como la concentración de sacarosa pueden ser de vital importancia para inducir embriogénesis somática en distintas especies; los resultados de un estudio en cacao demuestran que la formación de callo y la diferenciación de embriones somáticos estuvo directamente influenciada por la concentración entre 4% y 6% de sacarosa en el medio para el

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hibrido UF-613xIMC-67 (Valverde & Villalobos, 2000); dosis altas de sacarosa estimulan la formación de callos embriogénicos (Litz & Jarret, 1986). Existe según Alva-Guzman et al. (2014) una relación entre la concentración de sacarosa y la concentración de 2,4-D para lograr la mejor eficiencia embriogénica en Carica papaya, de manera que al combinar 30 gL-1 de sacarosa y 20mM de 2,4-D se consiguió una de las tasas más altas de inducción de callos potenciales para la formación de embriones somáticos. Tras realizar estudios comparativos entre agentes gelificantes del medio resultó que el agar fue superior en frecuencia embriogénica en comparación con el gelrite en Ipomoea batatas; por su lado los medios líquidos presentan ventajas como evitar la pérdida de nutrientes alrededor del explante, estos medios se utilizan en la fase de maduración de embriones somáticos (Criollo, 2013).

La respuesta de las células al regulador de crecimiento exógeno depende de las necesidades de la célula y la cantidad y el tipo de hormona ya presente; para la inducción de embriogénesis somática el medio debe contar con cierta concentración de auxinas, las cuales tienen un efecto inductor a la formación de masas proembriogénicas mediante división celular; con una baja concentración de auxina el tejido es inducido a formar raíces adventicias, mientras que con altas concentraciones se da lugar a la formación de callo y embriones; el 2,4-D es la auxina con mayor eficiencia y utilización según el reporte de varios trabajos sobre embriogénesis; por otro lado las citoquininas como BAP se emplean en la inducción de callos y embriogénesis en muchas dicotiledóneas (Alvez & Oropeza, 2015); para lograr la desdiferenciación y totipotencia celular las hormonas más utilizadas son: Acido Indol Acético (AIA) auxina natural, ácido nalftalenacético (ANA), ácido diclorofenoxiacético (2,4-D), picloram, ácido picolínico y kinetina entre las hormonas sintéticas (Gomora, 2014).

2.6. Fases de la embriogénesis somática

En muchas de las especies en las que se han realizado trabajos de embriogénesis somática se ha propuesto la ocurrencia de 4 etapas consecutivas y cuyas condiciones de cultivo varían (Arnold et al., 2002) 1: Inducción de células embriogénicas; el medio de cultivo contiene reguladores de crecimiento y alta concentración de sacarosa para estimular a la célula para formar masas proembriegénicas (Viñas & Jiménez , 2011); 2. Desarrollo de células embriogénicas; que se da lugar en el mismo medio de inducción; 3. Inhibición de la fase proliferativa de células embriogénicas; mediante el traspaso del tejido a un medio libre de regulador de crecimiento; 4. Desarrollo y Maduración de embriones somáticos; los embriones pasan por las etapas globular, corazón y torpedo en medio sin auxinas o en ocasiones con la incorporación al medio de ABA.

Según Komamine et al. (1992) mediante la observación de los cambios morfológicos durante el proceso de embriogénesis somática es posible reconocer cuatro fases muy distintivas que se llevan a cabo. En la fase 0, material vegetal competente a inducir, durante esta fase es posible observar dos estados (Estado 0) formación de racimos de células des-diferenciadas en presencia de auxina, (Estado1) células des-diferenciadas adquieren la capacidad de convertirse en embriones al ser colocadas en un medio libre de auxina. Ya para la fase 1, las células incrementan en número y sin mayor diferenciación, en la fase 2, la división celular ocurre en ciertas zonas de callo, dando lugar a la formación de embriones globulares y finalmente en la fase 3 en donde crecen y se desarrollan los embriones globulares dando paso a las etapas corazón y torpedo Figura 1.

Arnold et al. (2002), indican que las fases ocurren de la siguiente manera:

2.6.1. Inducción de células embriogénicas

Es un proceso que consiste en el cambio de patrón de expresión genética del tejido inicial mediante reprogramación celular, es posible generar embriones somáticos a través de reguladores de crecimiento como auxinas y citoquininas en el medio de cultivo (Fernández-Guijarro, 1997). La metilación es un posible elemento para la baja expresión génica de algunos tejidos puesto que puede inducir callo desorganizado o el crecimiento de callo polarizado que conlleva a embriogénesis somática. En la mayoría de especies la embriogénesis somática solo es posible a partir de tejido inmaduro lo cual representa la limitación de no poder seleccionar individuos adultos

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de mayor fiabilidad (Celestino et al., 2005), sin embargo, se encuentran especies como Daucus carota y Medicago sativa que son capaces de expresar su potencial embriogénico independientemente del estado de desarrollo y tipo de explante que se cultive.

2.6.2. Desarrollo de células embriogénicas fase de Proliferación

Es un proceso que aún requiere de auxina para que continúe la proliferación de las masas celulares proembriogénicas; esta fase no da lugar a la formación de embriones somáticos por la presencia del regulador hormonal en el medio; en muchos casos la auxina se agota a los pocos días de iniciado el cultivo y si el tejido no es transferido a un medio de igual concentración de auxina iniciará la formación de embriones somáticos; las masas celulares desarrolladas pueden conservar su potencial embriogénico por tiempo prolongado mediante subcultivos en medio con regulador de crecimiento pero, es recomendable la crioconservación en caso de que los periodos sobrepasen los 6 meses; si lo que se desea es acelerar el desarrollo y proliferación, los cultivos en suspensión son los mejores.

2.6.3. Inhibición de la fase proliferativa premaduración de embriones somáticos

Se caracteriza por la disminución drástica o retirada total del regulador de crecimiento del medio, permite que los embriones globulares alcancen su desarrollo para posteriormente activar los genes que los llevarán por sus distintas fases a la madurez.

2.6.4. Maduración de embriones somáticos

Se llevan a cabo las fases corazón, torpedo y cotiledonar con características similares al embrión cigótico, diferenciándolos el contenido de reservas así como el momento de acumulación, adquieren además tolerancia a la desecación (Thomas, 1993); Para el caso de la conífera Picea abies, estudios revelan que se ha incorporado 7.6uM ABA durante 30 días como tiempo óptimo para incrementar el número de embriones de superficie lisa formados y la acumulación de lípidos (Arnold & Hakman, 1987); En un estudio utilizando BAP (5uM) con 2ip (5uM) durante etapa de maduración lograron un 85% de conversión de embriones de Cocus nucifera, posteriormente se incluyó Acido giberélico (0.45uM) el cual fomentó la maduración de embriones de esta misma especie (Perea et al., 2006).

2.7. Embriogénesis somática en Solanaceae

Se ha reportado un limitado número de especies de la familia Solanaceae que han sido propagadas mediante embriogénesis somática, las condiciones generales del medio de cultivo para inducción embriogénica se mantienen, pero varían en cuanto al tipo de explante y la concentración de sacarosa y auxina. Un estudio en Solanum melongena reportó alta frecuencia de embriogénesis somática a partir de hojas, en presencia de 10mg/L de ANA y 0,06M de sacarosa (Gleddie et al., 1983). En Solanum tuberosum también se utilizó segmentos de hojas como explantes; el medio de inducción contenía 2,4-D + BA (benziladenina), una vez formados los callos primarios estos fueron transferidos a medio MS con zeatina (22,8uM) + BA (10mM) en donde se observaron mayor número de embriones somáticos directamente del tejido meristemático nodular, la regeneración de plántulas ocurrió en MS sin reguladores (JayaSree et al., 2001). En otro estudio, embriones somáticos se obtuvieron a partir de segmentos nodales de Solanum tuberosum cultivados in vitro en medio MS 0.5 mg/L piridoxina, 2 mg/L de glicina, 0,5 mg/L de extracto de levadura, 1,4 mg/L 2,4-D y 25 g/L sacarosa, a 23°C durante 60 días; se observó que el desarrollo de los embriones no era sincronizado, pues las etapas globular, corazón y torpedo se encontraron sobre un mismo callo (De García & Martínez, 1995).

Según Newman et al. (1996), es posible producir embriones somáticos en Lycopersicon esculentum Mill. a partir de hipocótilos en medio de inducción MS suplementado 40uM de 6-benciladenina y medio de multiplicación libre de regulador hormonal. A través del cultivo de protoplastos del mesófilo de la hoja en medio MS suplementado con 3% sacarosa, 9% manitol, 1 mg/L cinetina (K) y 1 mg/L de ANA se indujo estructuras embriogénicas en Lycopersicon peruvianum con etapas

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similares al embrión cigótico, mientras que sustituyendo (K y ANA) con 0,5mg/L 2,4-D las estructuras embriogénicas no se formaron (Zapata & Sink, 1981). En otro estudio se logró obtener embriogénesis somática directa utilizando 50 y 80umol.L-1 6-bencilaminopurina; las semillas de tomate fueron germinadas en este medio y las plántulas resultantes se mantuvieron en un medio idéntico durante 6 semanas (Gill et al., 1995), a pesar de los estudios la embriogénesis somática en tomate aún no se ha desarrollado eficientemente para la producción a gran escala (Bhatia et al., 2004).

Plantas de Capsicum annuum L. fueron regeneradas a partir de embriones cigóticos inmaduros a través de embriogénesis somática directa, el medio de inducción fue MS suplementado con 2,4-D (9uM), agua de coco (10%) y alta concentración de sacarosa (8%); el proceso se completó en el mismo medio de cultivo y se observó embriogénesis secundaria, además se corroboró la producción asincrónica del proceso embriogénico; finalmente los embriones se trasladaron a medio MS con AG3 y/o TDZ en donde se desarrollaron como plantas normales (Binzel et al., 1996) (Harini & Lakshmi, 1993). Otro estudio a partir de hojas de pimiento investigó el efecto de las vitaminas y micronutrientes sobre la embriogénesis somática; el medio de cultivo empleado fue MS con sacarosa (8%), 6-benciladenina (12,9uM), 2,4-D (9uM), tiamina (0,5 mg.L-1) y la adición de once diferentes vitaminas; como resultado se observó que la adición de ácido nicotínico y el aumento de la concentración de cobre en el medio de cultivo hacen posible la obtención de embriones somáticos; además superó al testigo en 9,2% embriones somáticos en la superficie del explante (Kintzios et al., 2001).

Guimarães et al., 1996, Consiguieron por primera vez embriones somáticos de Solanum betaceum L. tras cultivar hipocótilos y embriones cigóticos maduros; en trabajos posteriores los tejidos aptos para realizar embriogénesis fueron los mismos embriones cigóticos maduros e hipocótilos y además raíces, cotiledones y hojas jóvenes cultivados en medio MS suplementado con auxinas (5mgL-1) y alta concentración de sacarosa (9%) que aumentó en un 85% la eficiencia de embriogénesis somática. Según Casimiro (2014), las condiciones en las que se obtuvieron embriones somáticos a partir de foliolos de tomate de árbol fueron medio MS suplementado con sacarosa (0.25M), picloram (20 uM), Phytagel (2.5gL-1), los cultivos fueron incubados a 24°C en completa oscuridad durante 12 semanas, posteriormente las zonas embriogénicas fueron separadas y multiplicadas sobre el mismo medio de inducción. Otra investigación utilizó el medio MS suplementado con sucrosa (0.25M), picloram (20uM), phytagel (0.25%) pH 5.7, de igual forma los cultivos se incubaron a 24°C en completa oscuridad durante 12 semanas, posteriormente las zonas embriogénicas fueron separadas y multiplicadas sobre el mismo medio de inducción durante 4 semanas (Correia et al., 2012). En el Ecuador Arahana et al., (2010), obtuvieron plantulas de tomate árbol mediante embriogénesis somática, los embriones somáticos se consiguieron a traves de la siembra de embriones cigóticos en medio de inducción MS suplementado con 5mgL-1 de ANA y 90gL-1 de sacarosa a la cuanta semana de cultivo bajo condiciones de completa oscuridad y 28°C.

2.8. Expresión genética durante la embriogénesis somática

La importancia de conocer los genes esenciales que hacen posible embriogénesis somática es que permiten entender los procesos metabólicos involucrados, lo que eventualmente haría posible la manipulación dirigida de la regeneración de plantas vía embriogénesis somática (Lynn Zimmerman, 1993). Las auxinas al ser potentes iniciadores del proceso embriogénico conducen a la activación de varios genes tales como pJCW1(1784pb) y pJCW2(1945pb) en soya Glycine max, los niveles de transcripción declinaron en cultivos embriogénicos más maduros (Ainley et al., 1988), otro gen, Dchsp-1 (851pb) que presenta homología con proteínas de choque térmico de bajo peso molecular (Kitamiya et al., 2000), Dcarg-1 (1042pb) gen detectable solo durante el periodo de inducción embriogénica temprana, CEM6 (727pb) gen activado específicamente en las etapas preglobulares y globulares del embrión somático en zanahoria, Proteínas inducibles por ABA de embriogénesis tardía DcECP31 (1128pb), DcECP40 y DcECP60 en zanahoria y CP31 (1035pb) en Arabidopsis presentan mayor expresión en etapa torpedo de embriones somáticos, otro gen CAISE4 (523pb)

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se presenta en la transición de globular a torpedo de embriones somáticos (Chugh & Khurana, 2002).

Un gen que al parecer juega un papel directo en la transición vegetativa a embriogénica del tejido es SERK, un receptor de quinasa en zanahoria (Zuo, et al., 2002), y en otras especies como Limonium sinense (851pb) (Bose, et al., 2016), Coffea canephora (859pb) (Santos e al., 2009), Dendrobium catenatum (2518pb) (Juan, 2014), Hevea brasiliensis (612pb) (Kumari et al., 2014), Theobroma cacao (1402pb) (Aragao et al., 2005), CitSERK1 (1866pb) en Citrus sinensis (Shimada et al., 2005). En una solanácea de importancia mundial como Solanum tuberosum se ha demostrado que StSERK1 mejora la competencia embriogénica de las células somáticas y que la estructura intron/exón es conservada como ya es característica de esta familia de genes, StSERK1 indicó incremento de expresión durante la fase de inducción, posiblemente SERK es un marcador de pluripontencia y no embriogénico solamente (Kumar et al., 2008), durante la embriogénesis somática la expresión de SERK cesó después de la fase globular (Schmidt et al., 1997)

Según Ma, et al., (1994) el gen SbH1 (1515pb) está presente en el proceso embriogénico de Glycine max L., la transcripción se presenta en las primeras etapas del embrión somático aumentando antes de la formación de los cotiledones y disminuyendo a partir de entonces, esta proteína además se expresó débilmente en hipocótilos y tallos, pero no en tejido no embriogénico.

2.9. Importancia de la transcriptómica para el desciframiento de procesos fisiológico-genético-molecular

La transcriptómica es el método por el cual es posible medir todos los ARNm transcritos en una célula o una población de células; la secuencia de datos generados por la transcriptómica proporciona estrategias eficientes para el descubrimiento de genes (Zhuang et al., 2014). La importancia de analizar el transcriptoma radica en la posibilidad de conocer la función de los genes que se expresan en una condición o célula determinada dependiendo de los estímulos iniciales intra o extracelulares que haya activado la cascada de señalización para que dicho gen pueda expresarse o reprimirse; con esta herramienta es viable no solo conocer el porqué del agrupamiento de varios genes, su función bajo determinado estimulo sino también identificar los elementos promotores comunes a varios genes (Soto & López, 2012).

2.10. Métodos para estudiar el transcriptoma

2.11. Despliegue diferencial

Técnica que amplifica transcritos expresados en la célula en un momento especifico mediante la reacción en cadena polimerasa (PCR) utilizando un cebador anclado y otro cebador corto de secuencia arbitraria. Uno de los objetivos principales es comparar niveles de expresión de los genes entre las muestras. Intervienen previamente procesos de extracción de ARN, síntesis de su primera hebra de cDNA mediante retrotranscripción del ARN a ADNc de cadena corta, amplificación del cDNA, electroforesis en geles de poliacrilamida de los amplificados y finalmente la secuenciación de dichas bandas para su comparación en el Genbank, todo ello con el objetivo de identificar los genes que se activan en las diferentes muestras dependiendo del estímulo que se haya dado a ese material (Liang et al., 1993). Mediante despliegue diferencial en Solanum betaceum L. el gen TSI-1 fue identificado en respuesta a la tolerancia de estrés salino (Jaramillo, 2013).

2.12. Técnica cDNA-AFLP

Análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos de cDNA amplificados, es una técnica de análisis molecular que utiliza el protocolo estándar AFLP en una plantilla de cDNA, para realizar PCR. Generalmente se utilizan 2 enzimas de restricción, para la técnica AFLP la elección de las enzimas

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depende de la complejidad del genoma en estudio y factores como el estado de metilación del ADN; para cDNA-AFLP la elección de las enzimas de restricción se determina por la frecuencia de escisión, idealmente las enzimas de restricción deberían cortar el cDNA una vez y subsecuentemente cortar el cDNA en uno o ambos lados adyacentes para producir fragmentos de tamaño entre 100 y 1000 pb (Bachem et al., 1996). A través de esta técnica ha sido posible analizar la expresión génica en Solanum tuberosum encontrando el gen patatina B2 StPATB2 X13178 expresión que comienza concomitantemente con la formación de tubérculos (Stiekema et al., 1988). Un segundo gen STGLL X61187 se localizó durante la inducción a tuberización, este gen codifica glucosa pirofosforilasa ADP que se induce como parte de la síntesis de almidón (Nakata et al., 1991).

2.13. Microarrays

Método basado en bilogía molecular que se utiliza para detectar y cuantificar proteínas, permiten estudiar simultáneamente todos los ARNm expresados en un momento particular de la célula. Esta tecnología utiliza un robot que coloca en lugares específicos del array cDNA de la especie en estudio y mediante hibridación selectiva y revelado por fluorescencia es posible identificar los genes que se expresaron bajo un estímulo en particular (Jaramillo, 2013). Se encontró en Helianthus annuus genes fosfatasa MAPK implicado en el mecanismo de defensa del girasol contra el patógeno Phoma macdonaldii, al mismo tiempo el gen de la proteína fosfatasa 2ª (PP2A) que está implicado en la inhibición de la muerte celular podría limitar el desarrollo de este patógeno (Alignan et al., 2006).

2.14. RNA-Seq

El RNA-seq es una herramienta transcriptómica actual que está fundamentada en la secuenciación de cDNA basada en el desarrollo de las técnicas de secuenciación de nueva generación (NGS). RNA-Seq se refiere a la secuenciación absoluta de todo el transcriptoma donde el RNAm o cDNA es mecánicamente fragmentado, lo que resulta en la superposición de fragmentos cortos que cubren todo el transcriptoma. Estudios han demostrado que RNA-Seq es más sensible y preciso que Microarrays para el estudio de transcripción de proteínas de baja expresión, esta técnica se muestra como conveniente y asequible para realizar estudios comparativos de expresión génica, se ha utilizado esta técnica en perfiles de transcriptoma en especies como maíz, arroz y soya. En un estudio realizado en Oryza sativa se identificó el gen de respuesta a auxina OsIAA18 activado durante el desarrollo embrionario de arroz e involucrado en procesos de desarrollo en etapas media y tardía (Kikuchi et al., 2003).

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3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. UBICACIÓN

País: Ecuador

Provincia: Pichincha

Cantón: Quito

Sector: Ciudadela Universitaria.

3.2. MATERIALES

3.2.1. Material vegetal

Se utilizaron hipocótilos, embriones cigóticos y cotiledones extraídos de semillas de tomate de árbol de la variedad común anaranjado

3.2.2. Cultivo in vitro

3.2.2.1. Desinfección de semillas de tomate de árbol

- Solución de alcohol al 75% - Solución de hipoclorito de sodio al 2.5% - Tween 20 - Agua destilada estéril

3.2.2.2. Medio de inducción de embriogénesis somática en tomate de árbol

MS (Murashige & Skoog, 1962), sacarosa90gL-1, Bacto Agar DifcoTM 7.5gL-1, Acido Naftaleno Acético ANA SigmaTM 4.5 gL-1, Ácido 2,4-Dicloro fenoxiacético 2-4D SigmaTM 0.1 gL-1 pH 6.068

3.2.2.3. Cultivo in vitro de tomate de árbol

- Cámara de flujo laminar (ESCO) - Autoclave (All American modelo) - Potenciómetro (Jenway) - Balanza analítica (Radwag)

3.2.3. Extracción de RNA

- Hipocótilos y embriones cigóticos extraídos de semillas, callo embriogénico, callo no embriogénico y embriones

- PurelinkTM RNA mini kit Ambion (Life Technologies) - Solución de etanol al 75% (Scharlau) - Tubos de microcentrífuga - Morteros - Pinza y bisturí - Microcentrifuga Eppendorf

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3.2.4. Cuantificación de ácidos nucleicos

Nanodrop 2000 (Thermo ScientificTM)

3.2.5. Retrotrancripción de ARN

- Agua tratada con DEPC (InvitrogenTM)

- dNTP Mix (InvitrogenTM)

- Primer H-T11A, H-T11C, H-T11G RNAimage ARNm Differential Display system (GenHunterTM

CorporationTM) Secuencia H-T11G 5’-AAGCTTTTTTTTTTTG- 3’ Secuencia H-T11A 5’-AAGCTTTTTTTTTTTA- 3’ Secuencia H-T11C 5’-AAGCTTTTTTTTTTTC- 3’

- SuperScript III Transcriptasa Reversa (InvitrogenTM) - Buffer 5X First Strand (InvitrogenTM) - Dithiothreitol (InvirogenTM) - Microcentrífuga Eppendorf - Termociclador (Techne Flexigene) - Muestras de ARN total de tomate de árbol

3.2.6. Amplificación de cDNA

- Agua tratada con DEPC (InvitrogenTM) - dNTP Mix (InvitrogenTM) - Cebadores H-AP6, H-AP7, H-AP8 RNAimage ARNm Differential Display system (GenHunterTM

CorporationTM)

Secuencia H-AP1 5’- AAGCTTGATTGCC- 3’

Secuencia H-AP2 5’- AAGCTTCGACTGT- 3’

Secuencia H-AP3 5’- AAGCTTTGGTCAG- 3’

Secuencia H-AP4 5’- AAGCTTCTCAACG- 3’

Secuencia H-AP6 5’- AAGCTTGCACCAT- 3’

Secuencia H-AP7 5’- AAGCTTAACGAGG- 3’

- Platinum Taq Polimerasa (InvitrogenTM) - Buffer 10X para PCR (InvitrogenTM) - Cloruro de Magnesio 50mM (InvitrogenTM) - Termociclador (Techne Flexigene)

3.2.7. Electroforesis en Gel de poliacrilamida

- Solución poliacrilamida 6% (Acrilamida Sigma-AldrichTM 57gL-1, Bisacrilamida InvitrogenTM 3gL-1, TBE 1x, Urea InvitrogenTM 300gL-1)

- TBE 5x (Tris base InvitrogenTM 108gL-1, Ácido bórico MerckTM 55gL-1, EDTA SigmaTM 7.44gL-1)

- Persulfato de amonio (SigmaTM)

- Temed (Sigma-AldrichTM)

- Alconox (Sigma-AldrichTM)

- Blue juice (Invitrogen)

- Ladder 100bp (Ladder 100bp InvitrogenTM 20%, Blue juice InvitrogenTM 10%)

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- Ácido acético glacial (J.T. BakerTM)

- Bind Silane (3- Methacryloxypropyltrimethoxysilane) GE (Life Science)

- Cámara vertical de electroforesis (C.B.S Scientific Co.)

- Fuente de poder (Consort)

- Solución fijadora/parada (Alcohol Absoluto Scharlau 10%, Ácido acético glacial J.T. BakerTM 1%)

- Solución de tinción (Nitrato de plata J.T. Baker 4gL-1, formaldehido ICN Biomedicals 37%)

- Solución de revelado (Hidróxido de sodio MerckTM15gL-1, formaldehido ICN Biomedicals 37%)

- Cámara fotográfica (Canon Ecos REBEL T5i)

3.2.8. Tinción del gel de poliacrilamida (Anexo 4)

- Solución fijadora

- Solución de revelado

- Solución de parada

3.2.9. Extracción de bandas del gel poliacrilamida

- TE (Tris HCl InvitrogenTM 10mM, EDTA SigmaTM 0.1 mM)

- Agitador orbital (Thermo Scientific)

3.3. MÉTODOS

3.3.1. Desinfección de semillas

Las semillas fueron colocadas en alcohol potable al 70% durante diez minutos con agitación constante para posteriormente ser enjuagadas en agua destilada estéril; luego se las sumergió en hipoclorito de sodio al 5.5% con una gota de tween 20 durante 10 minutos con agitación constante y finalmente se realizaron tres aclareos con agua destilada estéril para eliminar los restos de detergente y cloro que pudieron quedar en la semilla.

3.3.2. Inducción de embriogénesis somática

Para hallar el medio inductor de embriogénesis somática más eficiente, se realizaron ensayos con 9 diferentes concentraciones de reguladores de crecimiento y 3 tipos de explante como embrión cigótico, cotiledones e hipocótilos, respectivamente para cada combinación como se ilustra en el Cuadro 1.

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Cuadro 1. Medios de cultivo MS basal suplementado con diferentes concentraciones hormonales para la inducción de embriogénesis somática de Solanum betaceum L.

Medio MS

basal

Explante Concentración sacarosa gL-1

Concentración ANA ppm

Concentración 2,4-D ppm

Concentración Kinetina ppm

1

Embrión cigótico/

cotiledones/

hipocótilos

90 4.5 0.1 0.0

2 90 5.0 0.0 0.0

3 90 0.0 2.4 0.0

4 90 5.2 0.0 0.0

5 85.5 5.0 0.0 4.95

6 85.5 5.0 0.0 0.05

7 85.5 4.5 0.1 4.95

8 85.5 4.5 0.1 0.05

9 85.5 4.84 0.0 4.95

Una vez desinfectadas las semillas se utilizó un estéreo microscopio para la extracción de los hipocótilos. Las semillas fueron cortadas de forma paralela a los cotiledones y la radícula, descartando ese segmento y conservando el otro que contiene el hipocótilo en forma de ¨C¨ y desechando la testa por completo. Se sembró 16 hipocótilos por caja Petri agrupados en cuatro grupos de cuatro hipocótilos y tras la siembra las cajas se incubaron a 28 °C en completa oscuridad por aproximadamente 20 días hasta la aparición de embriones somáticos.

3.3.3. Despliegue diferencial

3.3.3.1. Aislamiento de ARN total

Se extrajo el ARN de las muestras inducidas (embrión somático, callo embriogénico y callo no embriogénico) y testigo (embrión cigótico e hipocótilos) utilizando para ello el kit PurelinkTM RNA mini kit Ambion by Life Technologies, siguiendo el protocolo descrito por el fabricante (Anexo 1).

3.3.3.2. Cuantificación de ARN

Se cuantificó el ARN mediante espectrofotometría ultravioleta utilizando el NANODROP 2000. Una vez cuantificado el ARN las muestras fueron llevadas a una concentración final de 100 ng/µL de cada muestra.

3.3.3.3. Retrotranscripción de ARN mensajero

Se utilizó la enzima Superscript III Reverse Transcriptase de InvitrogenTM siguiendo el protocolo del fabricante con una modificación en la cantidad de enzima como se muestra en el Anexo 2. El volumen final por reacción fue de 15.5µL. Los cebadores utilizados fueron HT11G, HT11C, HT11A de GenHunter para cada una de las muestras.

3.3.3.4. Amplificación de ADNc de tomate de árbol

Se utilizó Platinum Taq Polimerasa de InvitrogenTM con 11 diferentes combinaciones de cebadores: H-APx GenHunterTM como forward y H-T11M GenHunterTM como reverse. Las mezclas de reacción, así como las condiciones de la PCR fueron las sugeridas por el fabricante de la Platinum Taq Polimerasa InvitrogenTM (Anexo 3).

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3.3.3.5. Electroforesis en gel de Poliacrilamida

Para la separación de los productos del PCR, se utilizó una cámara de electroforesis vertical (C.B.S Scientific Co). Inicialmente se limpiaron los vidrios con detergente AlconoxTM. Se dio a cada vidrio un tratamiento especial, se utilizó alcohol al 70% seguido de Bind Silane (1 mL ácido acético glacial + 3 uL Bind SilaneTM) al vidrio que se pega el gel y 800 uL de SigmacoteTM al vidrio de la cámara. Una vez tratados los vidrios se armó la cámara siguiendo las instrucciones del proveedor. Se introdujo 40 mL de solución de poliacrilamida al 6% previamente preparada junto con 140 mL de persulfato de amonio y 14,5 uL de TemedTM. se dejó polimerizar la acrilamida en los vidrios durante una hora en posición horizontal y con el peine en sentido contrario a los dientes para formar el frente de corrida. Transcurrido el tiempo se introdujo el peine en dirección normal para formar los pocillos y se ensambló la cámara en posición vertical. Se agregaron 2 litros de TBE 1X y se retiró la urea de cada pocillo con una pipeta Pasteur. Finalmente se cargaron las muestras (3 uL de DNA y 3 uL de Blue juice 10x) y se las corrió durante 5 horas a 600 V.

Para la tinción con nitrato de plata, los vidrios fueron separados, se colocó el vidrio que contenia el gel en la solución fijadora durante 10 minutos, luego se pasó a una solución de tinción por 16 minutos con agitación constante, acto seguido se lavó el vidrio con agua destilada por 10 segundos y posteriormente se introdujo el gel en la solución reveladora con agitación constante hasta que aparecieron las bandas (20-30 minutos aproximadamente). Se colocó el gel durante 5 minutos en la solución de parada y se finalizó con un último lavado por 10 segundos con agua destilada.

3.3.3.6. Aislamiento de bandas diferenciales a partir del gel del poliacrilamida

Se colocó al vidrio del gel en el transiluminador y se realizó la comparación de bandas entre los tratamientos embrión somatico, embrión cigótico, callo embriogénico, callo no embriogénico e hipocótilos para identificar las bandas que se expresan diferencialmente. Con un bisturí las bandas localizadas fueron cortadas y depositadas en 25 µL de TE en tubos Eppendorf dejándolas por 12 horas en el shaker a 37 °C. Finalmente se recogió el sobrenadante en un nuevo tubo Eppendorf.

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4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1. Cultivo in vitro

4.1.1. Inducción de embriogénesis somática

El medio de cultivo que proporcionó los mejores resultados fue el medio 1: MS suplementado con sacarosa 90 gL-1, Bacto Agar DifcoTM 7.5 gL-1, 4.5 mgL-1 Acido Naftaleno Acético SigmaTM, 0.1 mg.L-1, Ácido 2,4-Dicloro fenoxiacético SigmaTM, pH 6.068. El medio empleado en esta investigación posee características semejantes a las propuestas en otros trabajos, como el uso de altas concentraciones de auxinas (Zuo et al., 2002), acompañado de altas dosis de sacarosa, las cuales favorecen la formación de masas proembriogénicas (Litz & Jarret, 1986). El medio utilizado en esta investigación presenta cierta semejanza con el medio de cultivo utilizado para embriogénesis somática en Eucaliptus globulus Labill en donde se empleó 3 mgL-1 de ANA concentración cercana a la empleada en tomate de árbol (Pinto et al., 2004).

Inicialmente se probó la respuesta del embrión cigótico al medio 1, mostrando una respuesta poco exitosa, debido a que el porcentaje de eficiencia para la formación de embriones somáticos a través de este tejido fue del 10%, en lugar de embriones somáticos se formaron raíces adventicias que de acuerdo a lo que mencionan Alvez & Oropeza (2015) se debe probablemente al bajo contenido de auxina en el medio de cultivo con respecto al tejido utilizado. El explante seleccionado para la inducción de embriones somáticos fue el hipocótilo tras haber realizado pruebas con embriones cigóticos y cotiledones que no dieron buenos resultados, es por ello que a diferencia de Casimiro (2014) quien asegura el éxito utilizando el embrión cigótico como explante. En esta investigación los hipocótilos aislados a partir del eje embrionario de la semilla sometidos al medio de cultivo medio MS (suplementado con sacarosa 90gL-1, Bacto Agar DifcoTM 7.5gL-1, Acido Naftaleno Acético ANA SigmaTM 4.5 gL-1, Ácido 2,4-Dicloro fenoxiacético 2-4D SigmaTM 0.1 gL-1 pH 6.068) fueron exitosos al promover la formación de embriones somáticos como se muestra en la Figura 3. A los 15 días después de realizada la siembra de los hipocótilos bajo condiciones de completa oscuridad y 28°C de temperatura, se observó que el 100% del hipocótilo se había convertido en tejido desdiferenciado o callo, el cual era de tamaño mediano, color blanco cremoso y de textura friable. Sin embargo, el 40% de ellos no mostraron la capacidad embriogenética debido a la proliferación de células alargadas y aumento de tamaño. Solo el 60% de los callos mantuvieron su coloración, tamaño y textura hasta los 30 días de iniciado el cultivo y formaron embriones somáticos tal como se presenta en la Figura 4.

Las condiciones de temperatura 28 °C y completa oscuridad mencionados por Arahana et al. (2010) alcanzaron resultados positivos, puesto que al incubar las cajas Petri bajo estas condiciones presentaron desdiferenciación a las 2 semanas de sembrados los hipocótilos y embriones somáticos en fase globular a las 4 semanas.

A diferencia de los resultados obtenidos en Picea abies por Arnold & Hakman (1987) en cuanto al retiro parcial o definitivo de la auxina y a la disminución de la concentración de sacarosa, para dar inicio a la fase multiplicativa por la que atraviesa la embriogénesis somática, en esta investigación los callos embriogénicos observados en el medio de inducción fueron subcultivados en el mismo medio con lo cual se logró la multiplicación de células embriogénicas con el 100% de eficiencia y por lo tanto numerosos embriones somáticos.

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4.2. Despliegue de bandas diferenciales

La combinación de cebadores HT11A-HAP6 generó 1 banda diferencial, la combinación HT11A-HAP7: 1 banda, HT11A-HAP8: 3 bandas; HT11C-HAP8: 3 bandas; HT11G-HAP7: 3 bandas, completando un total de 11 bandas diferenciales.

Figura 1. Gel resultante de la electroforesis en poliacrilamida al 6% de los productos amplificados correspondiente a las muestras testigo (2: embrión cigótico y 5: hipocótilos) y muestras inducidas (1: embrión somático, 3: callo embriogénico y 4: callo no embriogénico) con las 5 distintas combinaciones de cebadores (HT11A-HAP6, HT11A-HAP7, HT11A-HAP8, HT11C-HAP8, HT11C-HAP7). El marcador de peso molecular utilizado fue 100pb de Invitrogen. De izquierda a derecha MW: ladder 100pb; Banda A6: Cebador HT11A-HAP6; Banda A7: Cebador HT11A-HAP7; Banda A8: Cebador HT11A-HAP8; Banda C8: Cebador HT11C-HAP8; Banda G7: Cebador HT11G-HAP7.

Las 5 combinaciones de cebadores seleccionados para realizar despliegue diferencial de cDNA, generó un total de 180 bandas (36 bandas promedio por combinación), de este total solo 11 fueron diferenciales entre los tejidos evaluados, el mayor número de bandas diferenciales se obtuvo con las combinaciones (HT11G-HAP7, HT11A-HAP8 y HT11C-HAP8) con 3 bandas diferenciales cada una; las otras dos combinaciones de cebadores (HT11A-HAP6 y HT11A-HAP7) dieron una sola banda diferencial cada una como se muestra en el (Gráfico 1).

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Gráfico 1. Número de bandas diferenciales encontradas por combinación de cebadores del kit de despliegue diferencial de GenHunter, en varias estructuras inducidas in vitro en tomate de árbol.

De las 11 bandas diferenciales identificadas, una fue exclusiva para embrión somático, tres para callo embriogénico, una para callo no embriogénico y una para hipocótilo. Una banda se mostró sobreexpresada en embrión somático, una en embrión cigótico y dos en callo no embriogénico. Finalmente, una banda estuvo subexpresada en callo no embriogénico

La mayor cantidad de bandas diferenciales las presentó el tejido callo embriogénico, seguido por el embrión somático, callo no embriogénico e hipocótilo con la misma cantidad de bandas exclusivas, se puede observar que el embrión cigótico no mostró ninguna banda diferencial exclusiva (Gráfico 2).

Gráfico 2. Número de bandas diferenciales exclusivas, subexpresadas y sobreexpresadas resultantes de las 5 combinaciones de cebadores exitosas (HT11A-HAP6, HT11A-HAP7, HT11A-HAP8, HT11C-HAP8, HT11C-HAP7) para embrión somático, embrión cigótico, callo embriogénico, callo no embriogénico e hipocótilo de Solanum betaceum L.

0

1

2

3

HT11-G - H-AP7 HT11-A - H-AP6 HT11-A - H-AP7 HT11-A - H-AP8 HT11-C - H-AP8

Nú

mer

o d

e b

and

as

Combinaciones de cebadores

0

1

2

3

Embrión somático Embrión cigótico Callo embriogénico Callo noembriogénico

Hipocótilo

Nú

me

ro d

e b

and

as

Bandas exclusivas Bandas sobreexpresadas Bandas subexpresadas

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Durante el proceso embriogénico muchos genes implicados en los procesos de desarrollo del embrión somático son inducidos, según estudios realizados en especies como Daucus carota y Glicine max las auxinas actúan como potentes iniciadoras del proceso embriogénico conduciendo a la activación de varios genes. Mediante el despliegue diferencial se obtuvo bandas diferenciales exclusivas para embrión somático A71, callo embriogénico C83, C831 y G73, bandas como A81 que se expresaron en embrión somático y callo embriogénico simultáneamente sin expresarse en las otras muestras. Debido a esto existen genes que se expresan específicamente en estos tejidos posiblemente gracias a la acción de la auxina en el medio, las bandas únicas localizadas en callo embriogénico posiblemente podrían corresponder a genes auxina-reguladores similares a los encontrados en soya y zanahoria como pJCW1 y pJCW2, Dchsp-1 y Dcarg-1 detectados solamente durante el periodo de inducción embriogénica temprana (Lynn Zimmerman, 1993). Otro grupo de genes que juegan un papel directo en la transición vegetativa a embriogénica son los receptores de quinasa SERK que mejoraron la competencia embriogénica de las células somáticas en Solanum tuberosum (StSERK1) y su expresión cesó después de la fase globular (Kumar et al., 2008). La banda A71 de embrión somático podría relacionarse con el gen CAISE4 que se mostró activo durante las etapas de transición globular a torpedo y A81 relacionado con CEM6 gen activado específicamente en las etapas preglobulares y globulares del embrión somático en zanahoria (Chugh & Khurana, 2002).

En callo no embriogénico ocurre que la banda sobreexpresada A64 mostró su presencia en todas las muestras a excepción de embrión somático y embrión cigótico, las bandas A84 y A841 fueron exclusivas para callo no embriogénico y la banda C84 mostró estar claramente subexpresada con respecto al resto de muestras, lo cual hace posible pensar que la baja expresión o desaparición de uno o varios genes específicos en el tejido calloso no embriogénico permitan la formación de embriones somáticos. Estas bandas mencionadas podrían relacionarse con la proteína NEP-TC encontrada en callo no embriogénico derivado de explantes como embrión cigótico e hipocótilos en tomate de árbol, este gen muestra potencial inhibitorio para la inducción a embriogénesis somática y su regulación a la baja o subexpresión aumenta el potencial embriogénico del tejido (Casimiro, 2014). Si la banda exclusiva encontrada en embrión somático no corresponde a genes inducidos por el proceso embriogénico podría tratarse posiblemente de un gen que se activa durante el proceso embriogénico tanto cigótico como somático, así como el gen OsIAA18 activo durante el desarrollo temprano del embrión cigótico en Oryza sativa (Xu et al., 2012)

En lo referente a los testigos, la banda G72 de embrión cigótico no se expresó en embrión somático, pero si se expresó en el resto de muestras (callo embriogénico, callo no embriogénico e hipocótilos). La banda G75 se muestra exclusivamente en hipocótilo, lo cual hace posible que uno o varios genes de origen cigótico se inactiven específicamente en el momento de dar paso a la formación de embriones somáticos globulares.

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5. CONCLUSIONES

Se logró inducir la embriogénesis somática in vitro mediante el uso del hipocótilo extraído de la semilla y el medio de cultivo MS suplementado con sacarosa90gL-1, Bacto Agar DifcoTM 7.5gL-1, Acido Naftaleno Acético ANA SigmaTM 4.5 gL-1, Ácido 2,4-Dicloro fenoxiacético 2-4D SigmaTM 0.1 gL-1 pH 6.068.

Fue posible obtener bandas diferenciales entre las muestras inducidas y las muestras testigo de tomate de árbol Solanum betaceum var. Común anaranjado, por lo cual se concluye que la generación de un impulso hormonal en el medio de cultivo que le permita al tejido transcribir ARNm hace posible la identificación de nuevos genes que reprograman la información del tejido inicial.

Las combinaciones de cebadores que mostraron un mayor despliegue de bandas fueron HAP8-HT11C y HAP7-HT11G.

3 bandas diferenciales exclusivas fueron extraídas de callo embriogénico (C83, C831 y G73) activando la mayor cantidad de genes específicos relacionados con el proceso de inducción a embriogénesis somática.

Las bandas sobreexpresadas A84, A841, A64 extraídas de callo no embriogénico y no presentes en tejidos embriogénicos demostraron que la alta expresión de uno o varios genes específicos presentes en el tejido calloso no embriogénico inhiben la formación de embriones somáticos.

La banda subexpresada C84 de callo no embriogénico mostró que la baja expresión de este gen no permite dar paso al proceso embriogénico, ya que en el resto de muestras la expresión de esta banda fue alta.

Para la etapa de multiplicación embriogénica no fue necesario retirar la hormona ni mucho menos bajar la concentración de sacarosa.

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6. RECOMENDACIONES

Reamplificar y secuenciar las bandas diferenciales encontradas en este estudio para identificar los genes implicados en los procesos de callogénesis y embriogénesis, así como en los explantes iniciales.

Usar un mayor número de combinaciones de cebadores del kit de GenHunter a fin de incrementar la cobertura del genoma en busca de genes relacionados con los procesos en estudio.

Comparar la expresión diferencial de genes en la embriogénesis somática con otros procesos como caulogénesis y rizogénesis para eventualmente tener la posibilidad de dirigir los destinos de las célular según el interés de los investigadores.

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7. RESUMEN

El tomate de árbol Solanum betaceum L. es un pequeño arbusto semileñoso que produce frutos comestibles altamente demandados a nivel mundial por sus cualidades exóticas de sabor y aroma. El Ecuador pese a tener las condiciones óptimas de desarrollo del cultivo presenta un bajo nivel competitivo con respecto a otros países productores como Colombia, Kenia y Nueva Zelanda, debido principalmente a la carencia de un sistema de producción capaz de manejar problemas fitosanitarios, uso intensivo de pesticidas, presencia de mosca de la fruta y homogenización de la calidad de la fruta. Durante muchos años se han utilizado varios programas de mejoramiento genético y resistencia fitosanitaria a través de patrones, sin embargo, la productividad e inocuidad del fruto no ha mejorado de manera significativa. Los métodos de propagación in vitro se presentan como una alternativa eficiente hacia la multiplicación de genotipos libres de patógenos en tiempo reducido.

La embriogénesis somática es un método de propagación in vitro, que consiste en promover la formación de embriones somáticos totalmente capaces de multiplicar masivamente plántulas sin anormalidades en menor tiempo que las técnicas tradicionales. La inducción del proceso de embriogénesis somática es posible a través del cultivo de tejidos vegetales como: embriones cigóticos, hipocótilos, cotiledónes, raíces y hojas en un medio de cultivo con altos niveles de sacarosa y rico en auxinas

En esta investigación, se probaron 9 diferentes concentraciones de reguladores de crecimiento y 3 tipos de explante. El medio de cultivo que mostró mayor eficiencia para la inducción de embriones somáticos fue MS (suplementado con sacarosa 90 gL-1, Bacto Agar DifcoTM 7.5 gL-1, Acido Naftaleno Acético ANA SigmaTM 4.5 gL-1, Ácido 2,4-Dicloro fenoxiacético 2-4D SigmaTM 0.1 gL-1 pH 6.068) y el explante de mayor éxito fue el hipocótilo. La siembra se realizó bajo condiciones de completa oscuridad y 28°C de temperatura, los embriones somáticos fueron observados a la cuarta semana de cultivo y posteriormente fueron cosechados. Para el despliegue diferencial de bandas se tomaron 5 muestras: embrión somático, embrión cigótico, callo embriogénico, callo no embriogénico e hipocótilos para la comparación entre las mismas. Mediante procesos de extracción de RNA, cuantificación de RNA, retrotranscripción, amplificación de cDNA y electroforesis en geles de poliacrilamida de los productos amplificados se obtuvieron bandas que fueron analizadas en el foto-documentador.

Los resultados revelaron que existen bandas diferenciales entre las muestras inducidas (embrión somático, callo embriogénico y callo no embriogénico) y las muestras testigo (embrión cogótico e hipocótilo) de tomate de árbol. Se obtuvo un total de 11 bandas diferenciales, de las cuales dos pertenecen a embrión somático, una a embrión cigótico, 3 a callo embriogénico, 4 a callo no embriogénico y una a hipocótilo. De éstas, algunas fueron exclusivas para embrión somático, callo embriogénico, callo no embriogénico e hipocótilo, otras fueron subexpresadas o sobreexpresadas en los tejidos evaluados. Nuestros resultados contribuirán a identificar los genes implicados en los procesos de formación de embriones somáticos.

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SUMMARY

Tamarillo Solanum betaceum L. is a small arbutus that produces edible fruit high demand globally for its exotic flavor and aroma qualities. Ecuador despite having the optimal conditions for crop development has a low competitive level compared to other producing countries such as Colombia, Kenya and New Zealand, mainly due to the lack of a production system capable of handling phytosanitary problems, intensive pesticides, the presence of fruit fly and homogenization of the fruit quality. For many years we have used various breeding programs and plant resistance through patterns, however, productivity and safety of the fruit has not improved significantly. Methods of in vitro propagation are presented as efficient towards the free genotypes multiplication of pathogens in reduced time alternative.

Somatic embryogenesis is a method of propagation in vitro which is to promote the formation of somatic embryos fully capable of massively multiply seedlings without abnormalities in less time than traditional techniques. Induction of somatic embryogenesis process is possible through plant tissue culture as zygotic embryos, hypocotyls, cotyledons, roots and leaves in a culture medium with high levels of sucrose and rich in auxins.

In this study, 9 different concentrations of growth regulators and 3 types of explants were tested. The culture medium showed more efficient for induction of somatic embryos was MS (supplemented with sucrose 90 gL-1, Bacto Agar DifcoTM 7.5 gL-1 Naphthalene Acetic Acid 4.5 gL SigmaTM ANA-1, 2,4-Dichloro phenoxyacetic 2-4D SigmaTM pH 0.1 gL-1 6,068) and the most successful explant was the hypocotyl. Planting was carried out under conditions of complete darkness and 28 ° C temperature, somatic embryos were observed at the fourth week of culture and were subsequently harvested. Somatic embryo, zygotic embryo, embryogenic callus, embryogenic callus and hypocotyls not for comparison therebetween: For differential display bands 5 samples were taken. Through extraction processes RNA, RNA quantification, reverse transcription, cDNA amplification and polyacrylamide gel electrophoresis of the amplified products were analyzed bands in fotodocumentador obtained.

The results revealed that there are differential induced bands between samples (somatic embryos, embryogenic callus and non-embryogenic callus) and the control samples (cogótico and hypocotyl embryo) tree tomato. A total of 11 differential bands, two of which belong to somatic embryo, zygotic embryo join, 3 to embryogenic callus, embryogenic callus 4 and not to hypocotyl was obtained. Of these, some were unique to somatic embryos, embryogenic callus, embryogenic callus and hypocotyl not, others were subexpresadas or overexpressed in the tissues tested. Our results will help identify genes involved in the processes of formation of somatic embryos.

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8. REFERENCIAS

Ablanque, M. (1999). Inducción de embriogénesis somática en encina y estudios sobre los procesos de desarrollo y maduración. Madrid, España: s.n.

Ainley , W., Walker, J., Nagao, R., & Key, J. (1988). Sequence and characterization of two auxin-regulated genes from soybean. Journal Biology, 263(22), pp.7185-7189

Albarrán , J., Gonzáles, A., Gonzáles, O., Salazar, E., Trujillo, I.(2009). Embriogénesis somática a partir de flores masculinas de Pineo gigante y Cambur Manzano. Venezuela: Agronomía Tropical, 59(4), pp. 363-371

Albornoz, G. (1992). El tomate de árbol (Cyphomandra betacea Sendt.) en el Ecuador. Quito, Ecuador: s.n.

Alignan, M., Hewezi, T., Petitprez, M., Dechamp-Guillaume, G., & Gentzbittel, L. (2006). A cDNA microarray approach to decipher sunflower (Helianthus annuus) responses to the necrotrophic fungus Phoma macdonaldii. The Plant Cell, 523-536

Alva-Guzman, B., Cerna-Rebaza, L., & Chico-Ruiz, J. (2014). Inducción de embriones somáticos a partir de hojas de Capsicum chinensis, utilizando diferentes concentraciones de 2,4-Diclorofenoxiacético y 6-Bencil Amino Purina. Trujillo, Perú: Unversidad Nacional de Trujillo.

Alvez, B., & Oropeza, M. (2015). Efecto de Dicamba y de ácido 2,4 diclorofenoxiacético sobe la embriogénesis somática en caña de azúcar. Colombia: Scielo Revista Colombiana de Biotecnología, 17(2), pp. 85-94

Aragao, F., Santos, M., & Romano, E. (2005). Characterization of the cacao somatic embryogenesis receptor-like Kinase (SERK) gene expressed dirung somatic embryogenesis. Plant Science, 168(3), pp.723-729

Arahana, V., Cabrera, A. R., & Torres, M. L. (2010). Propagación de tomate de árbol (Solanum betaceum) vía embriogénesis somática. AVANCES EN CIENCIAS E INGENIERÍAS, B16-B21.

Arnold, S., & Hakman, I. (1987). Regulation of somatic embryo development in Picea abies by Abscisic Acid (ABA). SciencieDirect, pp. 164-169

Arnold, S., Bozhkov, P., Dyachok, J., Filonova, L., & Sabala, I. (2002). Developmental pathways of somatic embryogenesis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 69, pp. 233-249

Bachem, C., Van der Hoeven, R., Brujin, S., Vreugdenhil, D., Zabeau, M., & Visser, R. (1996). Visualization of differential gene expression using a novel method of RNA fingerprinting based on AFLP: Analysis of gene expression during potato tuber development . The Plant Journal, 9(5), pp. 745-753

Bhatia, P., Ashwath, N., Senaratna, T., & Midmore, D. (2004). Tissue Culture Studies of Tomato (Lycopersicon esculentum). Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 78(1), pp.1-21

Binzel, M., Sankhla, N., Joshi, S., & Sankhla, D. (1996). Induction of direct somatic embryogenesis and plant regeneration in pepper (Capsicum annuum L.). Plant Cell Reports, 15, pp. 536-540

Bose, S., Basu, U., Ghosh, U., & Bandyophadhyay, T. (2016). Partial coding sequence of Somatic Embryogenesis Receptor Kinase (SERK) of limonium sinense. Kalyani.

Carvajal, R. (2012). Estudio de factibilidad para la creacion de una empresa dedicada a la industrializacion y comercializacion del tomate de árbol en conserva, destinado al consumo de la ciudad de Quito, ubicada en la provincia de Pichincha. Trabajo de Grado presentado como

25

requisito parcial para optar al Título de Ingeniero Comaercial. Quito: Universidad Politécnica Salesiana.

Casimiro, B. (2014). Análise do envolvimento da proteína. Brasil: Universidad de Coimbra.

Celestino, C., Hernandéz, I., Carneros, E., López-Vela, D., & Toribio, M. (2005). La embriogénesis somática como elemento central de la biotecnologia forestal. Invest agrar, 14(3), pp. 345-357

Chugh, A., & Khurana, P. (2002). Gene expression during somatic embryogenesis - recent advances. Current Science, 83(6) disponible en URL: http://www.iisc.ernet.in/currsci/sep252002/715.pdf[consulta 16 de septiembre de 2016]

Correia, S., & Canhoto, J. (2012). Biotechnology of tamarillo (Cyphomandra betacea): From in vitro cloning to. Scientia Horticulturae, 161-168

Correia, S., Cunha, A., Salgueiro, L., & Canhoto, J. (2012). Somatic embryogenesis in tamarillo (Cyphomandra betacea): approaches to increase efficiency of embryo formation and plant development. Plant Cell, 109, PP. 143-152

Criollo, H. (2013). Estudios orientados a la regeneracion de plantas de lulo (Solanum quitoense Lam.) a través de la embriogénesis somática. Bogotá,Colombia: s.n.

De García, E., & Martínez, S. (1995). Somatic Embryogenesis in Solanum tuberosum L. cv. Désirée from Stem Nodal Sections. Plant Physiology, 145(4), pp. 526-530

Fernández-Guijarro, B. (1997). Embriogénesis somática en alcornoque (Quercus suber L.). Madrid, España: E.T.S Ingenieros de Montes.

George, E. (2008). The components of plant tissue cultures media: macro and micro-nutrients. Plant Propagation by Tissue Culture , 1, pp. 65-113

Gill, R., Malik, K., Sanago, M., & Saxena, P. (1995). Somatic Embruogenesis and Plant Regeneration from seedling cultures of tomato (Lycopersicon esculentum Mill.). Plant Physiology, 147, pp. 273-276

Gleddie, S., Keller, W., & Setterfield, G. (1983). Somatic embryogenesis and plant regenerations from leaf explants and cell suspensions of solanum melongena (eggplant). Canadian Journal of Botany, 61(3), pp. 656-666 disponiable en URL: http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.1139/b83-074#.V9woNPnhC1s[consulta 16 de septiembre de 2016]

Gomora, J. (2014). Embriogénesis somática de cuatro variedades de crisantemo (Dendranthema grandiflora Tzvelev). Tenancingo, México: s.n.

Guimarães, M., Tomé, M., & Cruz, G. (1996). Cyphomandra betacea (Cav.) Sendt. (Tamarillo). Biotecnology in Agriculture and Forestry, 35, pp. 120-137

Harini, I., & Lakshmi, G. (1993). Direct somatic embryogenesis and plant regeneration from immature embryos of chili (Capsicum annuum L.). Plant Science, 891, pp.107-112

INIAP (2004). Manual Del Cultivo De Tomate De Árbol (Solanum betaceum Cav.). Quito, Ecuador: Autor.

INIAP (2004). Manual Guía De Capacitación Del Cultivo De Tomate De Árbol En Ecuador. Quito, Ecuador: Autor.

Jaramillo, P. (2013). Identificación de genes candidatos de tolerancia a estrés por salinidad en tomate de árbol (Solanum betaceum) mediante la técnica de despliegue diferencial de

26

genes.Trabajo de Grado presentado como requisito parcial para optar al Título de Ingeniero en Procesos Biotecnológicos. Quito: Universidad San Francisco de Quito.

JayaSree, T., Pavan, U., Ramesh, M., Rao, A., Jagan, K., Reddy, M., & Sadanandam, A. (2001). Somatic embryogenesis from leaf cultures of potato. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 13-17

Jordán, M., & Casaretto, J. (2006). Hormonas y reguladores del crecimiento Auxinas, Giberelinas y Citocininas. La Serena, Chile: F.A. Squeo & L. Cardemil.

Juan, W. X. (2014). Cloning and expression of somatic embryogenesis receptor Kinase (SERK) gene from Dendrobium afficinale Kimura et Migo. Guandong, China: s.n.

Kato, K., Ohara, H., Takahashi, E., Matsui , H., & Nakayama, M. (2000). Endogenous gibberellin-induced parthenocarpy in grape berries. Horticulturae, 514, pp.69-74

Kikuchi, S., Satoh, K., Nagata, T., Kawagashira, N., Doi, K., Kishimoto, N., . . . Ishikawa, M. (2003). Collection, mapping, and annotation of over 28,000 cDNA clones from japonica rice. Science, 301(5631), pp.376-379

Kintzios, S., Drossopoulos, J. B., & Lymperopoulos, C. (2001). Effect of vitamins and inorganic micronutrients on callus growth and somatic embryogenesis from leaves of chilli pepper. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 67, pp.55-62

Kitamiya, E., Suzuki, S., Sano, T., & Nagata, T. (2000). Isolation of two genes that were induced upon the initiation of somatic embryogenesis on carrot hypocotyls by high concentration of 2,4-D. Plant Cell Reports, 19, 551-557

Komamine, A., Kawahara, R., Matsumoto, M., Sunabori, S., Troya, T., Fujiwara, A., . . . Fujimura, T. (1992). Mechanism of somatic embryogenesis in cell cultures: Physiology, Biochemestry, and molecular biology. Tissue Culture Association, 11-14

Kononowickz, H., Kononowickz , A., & Janick, J. (1984). Response of Embryogenic Callus of Theobroma cacao L. To Gibberelic Acid and Inhibitors of Gibberelic Acid Synthesis. Pflanzanphysiologie, 113(4), pp. 359-366

Kumar, S., Millam, S., Hein, I., & Bryan, G. (2008). Cloning and molecular characterisation os a potato SERK gene transcriptionally induced during initiation of somatic embryogenesis. Planta, 228-319

Kumari , J., Soya, M., Supriya, R., Suni, A., & Thulaseedharan, A. (2014). Cloning and characterization of somatic embryogenesis receptor Kinase (SERK) gene from Hevea brasiliensis clone RRII 105. Kottayam.

Leiva, L. (2008). Caracterización de dos poblaciones segregantes de Tomate de Árbol. Quito, Ecuador: s.n.

Liang, P., Averboukh, L., & Pardee, A. (1993). Distribution and cloning of eukaryotic mRNAs by means of differential display: refinements and optimization. Plant Cell, 21(14), pp. 3269-3275

Litz , R., & Jarret, R. (1986). Regeneración de plantas en el cultivo de tejidos: embriogénesis somática y organogénesis. Florida, US: s.n.

López, P., Iracheta, L., Castellanos, M., Méndez, I., Sandoval, A., Aguirre, J., . . . Gutiérrez, A. (2010). Influencia del explante y medio de cultivo en la embriogenesis somática en hojas de café. Revista Fitotecnica Mexico, 33, pp. 205-213

27

Lucas, K., Maggi, J., & Yagual, M. (2011). Creación de una empresa de producción, comercialización y exportación de tomate de árbol en el área de Sangolquí, provincia de Pichincha. Trabajo de Grado presentado como requisito parcial para opar al Título de Ingeniería Comercial y Empresarial. Guayaquil, Ecuador: Escuela Superior Politecnica del Litoral. disponible en URL: https://www.dspace.espol.edu.ec/bitstream/123456789/10688/2/TOMATE%20DE%20ARBOL.pdf[consulta 16 de septiembre de 2016]

Lynn Zimmerman, J. (1993). Somatic Embryogenesis: A model for early development in Higher Plants. The Plant Cell, 5, pp.1411-1423

Ma, H., McMullen, M., & Finer, J. (1994). Identification of a homeobox-containing gene with enhanced expression during soybean (Glycine max L.) somatic embryo development. Plant Molecular Biology, 24(3), pp 465-473

MAGAP. (2010). Imágenes satelitales que dispone el MAGAP. Quito, Ecuador: Autor. disponible en URL:http://sinagap.agricultura.gob.ec/component/content/article/21-personalizada/297-estadisticas-spr[consulta 16 de septiembre de 2016]

Miranda, O. (2014). Evaluación y selección in vitro de materiales promisorios de tomate de árbol (Solanum betaceum Cav.) resistentes a la anracnosis (Colletotrichum spp.). Quito, Ecuador: s.n.

Morgan, W. (2005). Cultivo de tejido vegetal. International Plant Lab, 245-253

Nakata, P., Greene, T., Anderson, J., Smith-White, B., Okita, T., & Preiss, J. (1991). Comparison of the primary sequences of two potato tuber ADP-glucose pyrophosphorylase subunits. Plant Molecular biology, 1089-1093

Newman, P., Krishnajaraj, S., & Saxena, P. (1996). Regeneration of tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) Somatic Embryogenesis and shoot organogenesis from hypocotyl explants induced with 6-Bencyladenine. Plant Science, pp. 554-560

Ordoñez, S. (2007). Diferenciación de variedades en cultivos de Tomate de Árbol, Solanum betaceum mediante la tecnica molecular de AFLP. Quito,Ecuador: s.n.

Perea, I., Vidhanaarachchi, R., Gunathilake, R., Yakandawala, D., Hocher, V., Verdeil, L., & Weerakoon, K. (2006). Effect of plant growth regulators on ovary culture of coconut (Cocus nucifera L.) plumule explants. In vitrro Cellular and developmental Biology, pp. 37-43

Pérez, P., Alvarado, C., Goméz, K., Jiménez, G., & Orellana, P. (1998). Propagacion y mejora genética de plantas por biotecnología. Instituto de biotecnología de las plantas, pp. 390

Pinto, G., Loureiro, J., Lopes, T., & Santos, C. (2004). Analysis of the genetic stability of Eucalyptus globulus Labill. somatic embryos by flow cytometry. Theoretical ans Applied Genetics, pp. 580-587

Revelo, J., Pérez, E., & Maila , M. (2008). Manual ecologico del tomate de árbol en Ecuador. Quito, Ecuador:

Santos, M., Romano, E., Vieira, L., Baldoni, A., & Aragao, F. (2009). Suppression of SERK gene expression affects fungus tolerance and somatic embryogenesis in transgenic lettuce. Plant Biol, pp. 83-89

Schmidt, E. D., Guzzo, F., Toonen, M. A., & de Vries, S. C. (1997). A leucine-rich repet containing receptor-like kinase marks somatic plant cells competent to form embryos. Development, 124(10), pp. 2049-2062

28

Shimada, T., Hirabayashi, T., Endo, T., Jujii, H., Kita, M., & Mitsuo, O. (2005). Isolation and characterization of the somatic embryogenesis receptor-like kinase gene homologue (CitSERK1) from Citrus unshiu Marc. Scientia Horticulturae, pp. 233-238

Soria, N. (25 de Febrero de 2009). Tomate de árbol proyecto. disponible en URL: http://tomatederbolproyecto.blogspot.com/[consulta 16 de septiembre de 2016]

Soto, J., & López, C. (2012). RNA-seq: herramienta transcriptómica útil para el estudio de interacciones planta-patógeno . Fitosanidad, pp.101-113

Stiekema, W., Heidekamp, F., Dirkse, W., van Beckum, J., de Haan, P., Bosch, C., & Louwerse, J. (1988). Molecular cloning and analysis of four potato tuber mRNAs. Plant Molecular, pp. 255-269

Thomas, T. (1993). Gene expression during plant embryogenesis and germination. Plant Cell, pp. 1401-1410

Valverde, L., & Villalobos, V. (2000). Efecto del pH, la luz y la concentraion de sacarosa en la embriogenesis somática de cacao (Theobroma cacao L.). Uniciencia, 39-45.

Villalobos, V., & Thorpe, T. (1991). Micropropagación: conceptos, metodología. Bogota, Colombia: s.n.

Viñas, M., & Jiménez , V. (2011). Factores que influyen en la embriogenesis somática in tro de palmas (Arecaceae). Rev. Colombiana de Biotecnologia, 13(2), pp.229-242

Xu, H., Gao, Y., & Wang, J. (2012). Transcriptomic Analysis of Rice ( Oryza sativa ) Developing Embryos Using the RNA-Seq Technique. Plos ONE, 306-346

Zapata, F., & Sink, K. (1981). Somatic embryogenesis from Lycopersicon peruvianum leaf mesophyll protoplast. Theoretical and Applied Genetics, 59, pp.265-268

Zhuang, J., Zhang, J., Hou, X.-L., Wang, F., & Xiong, A.-S. (2014). Transcriptomic, Proteomic, Metabolomic and Functional Genomic Approaches for the Study of Abiotic Stress in Vegetable Crops. Plant Science, 225-237

Zuo, J., Niu, Q.-W., Frugis, G., & Chua, N.-H. (2002). The WUSCHEL gene promotes vegetative-to- embryonic transition in Arabidopsis. The plant journal, 30(3), pp.349-359

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9. FIGURAS

Figura 2. Esquema de las fases que desarrolla el embrión somático a través del proceso de inducción a embriogénesis somática.

Fuente: (Lynn Zimmerman, 1993)

Figura 3. Esquema gráfico de la metodología utilizada para el despliegue diferencial de bandas en geles de poliacrilamida durante la embriogénesis somática en tomate de árbol Solanum betaceum L.

Desinfección Siembra Cosecha Extracción ARN

Cuantificación Retrotranscripción y PCR Electroforesis

Identificación de bandas Aislamiento de bandas

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Figura 4. Explantes sobre medio de inducción a embriogénesis somática. A. Hipocótilos sembrados en medio MS (suplementado 9 % sacarosa, Bacto Agar DifcoTM 7.5 gL-1, 4.5 ppm ANA, 0.1 ppm 2,4-D, pH 6.068). B. tejido desdiferenciado incubado a 28°C a los 30 días de cultivo. C. Embriones somáticos en fase torpedo cosechados a los 31 días de cultivo.

Figura 5. Fase de inducción embriogénica, masas de células proembriogénicas inducidas en medio MS (suplementado 9% sacarosa, Bacto Agar DifcoTM 7.5 gL-1, 4.5 ppm ANA, 0.1 ppm 2,4-D, pH 6.068).

A B C

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Figura 6. Callo embriogénico en medio de multiplicación con embriones globulares en desarrollo a los 10 días de subcultivado el callo.

Figura 7. Bandas expresadas en gel de agarosa 4% de los cebadores HAP6-HT11A, HAP7-HT11A, HAP8-HT11A, HAP8-HT11C, HAP7-HT11G.

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10. ANEXOS

Anexo 1. Protocolo PurelinkTM RNA mini kit Ambion by Life Technologies.

- Pesar 0.1g de muestra - Limpiar el exceso de agua en los morteros previamente congelados usando una servilleta estéril - Colocar la muestra en el mortero y agregar 600 μL de Lysis buffer - Macerar hasta obtener una solución homogénea - Tomar 600 μL de la solución obtenida y colocarla en un recovery tube que forma parte del kit - Homogenizar manualmente y centrifugar a 12000 revoluciones durante 2 minutos - Tomar el sobre nadante y estimar la cantidad extraída con la micropipeta luego vierta ese

contenido en un nuevo recovery tube - A este último recovery tube con el sobrenadante agregar igual cantidad de etanol al 70% - Homogenizar manualmente - Tomar 700 μL de esa solución y colocar en un spin cartridge que forma parte del kit - Centrifugar a 12000 revoluciones por 15 segundos, descartando la solución que queda al fondo

y conservando el tubo - Añadir al Spin cartridge 700 μL de wash buffer I - Centrifugar a 12000 revoluciones por 15 segundos, descartando tanto la solución del fondo y

el tubo de colecta, conservar el spin cartridge y colocarlo en un nuevo collection tube - Añadir al spin cartridge 500 μL de wash buffer II y centrifugar a 12000 revoluciones por 15

segundos, descartando la solución del fondo y conservando el tubo - Nuevamente, añadir al spin cartridge 500 μL de wash buffer II y centrifugar a 12000

revoluciones por 15 segundos, descartando la solución del fondo y conservando el tubo - Centrifugar el Spin cartridge a 12000 revoluciones por 2 minutos, descartando el collection tube

y colocar el spin cartridge en un nuevo recovery tube que forma parte del kit - Añadir 50 μL de RNase-free water al centro de la Spin cartridge - Dejar reposar el tubo durante 1 minuto - Centrifugar la Spin cartridge a 12000 revoluciones por 2 minutos - Tomar el recovery tube con ARN

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Anexo 2. Mezclas de reacción y condiciones para retrotranscripción del ARN protocolo SuperScript III Transcriptasa Reversa InvitrogenTM 200U.

Reactivo Concentración de partida

para la reacción Vol. Por reacción (µL)

Agua tratada con DEPC 7 Oligo T 2µM 1

dNTP mix 10µM 1 RNA 100ng/µL 1

Esta mezcla se sometió a un proceso de desnaturalización que consistió en el calentamiento a 65°C por 5 minutos en el termociclador e incubación en hielo por 1 minuto. Simultáneamente se preparó una segunda mezcla de reacción que se incorporó a la primera, transcurrido los 6 minutos antes mencionados:

Reactivo Concentración de partida

para la reacción Vol. Por reacción (µL)

Buffer 5x 4 DTT 0.1M 1

SuperScript III Transcriptasa Reversa

200U/µL 0.5

Las mezclas de reacción se llevaron al termociclador a 50°C por 5 minutos para la síntesis de la primera hebra y luego a 85°C por 5 minutos para detener la reacción, Hold 4°C.

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Anexo 3. Mezcla de reacción y condiciones de amplificación de cDNA mediante PCR según el protocolo de amplificación Taq DNA Polimerasa Recombinante InvitrogenTM.

Reactivo Concentración de partida

para la reacción Vol. Por reacción (µL)

Agua tratada con DEPC 10 dNTPs mix 10µM 1.0 Cloruro de Magnesio MgCl2 50mM 0.6 PCR Buffer minus Mg 10x 2.0 H-APx primer 2µM 2.0 H-T11M primer 2µM 2.0 Taq polimerasa Recombinante

5U/µL 0.4

cDNA 2.0

Programa en termociclador:

Paso Temperatura Tiempo Número de

ciclos

Denaturalización inicial 94°C 3 minutos 1 Denaturalización 94°C 30 segundos 35 Annealing 40°C 2 minutos 35 Extensión 72°C 30 segundos 35 Extensión final 72°C 4 minutos 1

-

35

Anexo 4. Concentraciones de las soluciones para teñir el gel de poliacrilamida

Solución de Fijación o Parada (1000 ml)

Alcohol absoluto (10%)

100 ml

Ácido acético Glacial (1%)

5 ml

Agua destilada 895 ml Volumen final 1000 ml

Solución de Tinción (1000 ml)

Nitrato de plata

2 g

Formaldehído (Ci: 37% - Cf: 0,024%)

0,650 ml

Solución de Tinción (1000 ml)

Hidróxido de sodio

15 g

Formaldehído (Ci: 37% - Cf: 0,024%)

0,650 ml