UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE CIRUGA

MODULACIN DE LA RESPUESTA INFLAMATORIA ESPLCNICA EN LA COLESTASIS MICROQUIRRGICA EXPERIMENTAL CON

KETOTIFN

TESIS DOCTORAL DE: ARTURO CRUZ CIDONCHA

BAJO LA DIRECCIN DE: JAIME ARIAS PREZ

M NGELES ALLER REYERO CRUZ GARCA MARTN

Madrid, 2013

Arturo Cruz Cidoncha, 2013

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE CIRUGIA

MODULACIN DE LA RESPUESTA

INFLAMATORIA ESPLCNICA EN LA

COLESTASIS MICROQUIRRGICA

EXPERIMENTAL CON KETOTIFN

Memoria para optar al Grado de Doctor presentada por

ARTURO CRUZ CIDONCHA

Directores:

Prof. Jaime Arias Prez

Prof. M ngeles Aller Reyero

Prof. Cruz Garca Martn

TESIS DOCTORAL

MADRID, 2013

IMPRESO DE INSCRIPCION DE LA UCM

INFORME DE LOS DIRECTORES

EVALUADORES

APROBACION DEL CONSEJO

A mi padre Santiago Cruz

AGRADECIMIENTOS:

Quiero dar mi ms sincero agradecimiento a todas aquellas personas que han hecho

posible este trabajo:

- En primer lugar al Prof. Jaime Arias Prez, Catedrtico de Ciruga de la Facultad

de Medicina de la U.C.M., por haber aceptado ser codirector de mi Tesis, por su

paciencia instruyndome en Microciruga, por darme la oportunidad de trabajar

junto a l, por su sencillez, y por haberme contagiado su ilusin por la docencia y la

investigacin.

- A la Prof. Mara ngeles Aller Reyero, Profesora Titular de Ciruga de la

Facultad de Medicina de la U.C.M., por haber aceptado ser codirectora de mi Tesis,

por su infinita paciencia y comprensin conmigo, por sus excelentes indicaciones y

consejos, y por su enorme capacidad de ensear.

- A la Prof. M Cruz Garca Martn, del Dpto. de Bioqumica y Biologa Molecular

III, de la Facultad de Medicina de la U.C.M., por haber aceptado ser codirectora de

mi Tesis, por haberme permitido trabajar en el laboratorio de bioqumica, por

ensearme a realizar las determinaciones bioqumicas, y por haber tenido tanta

paciencia conmigo.

- A Mara Paz Nava, Profesora Titular de Fisiologa de la Facultad de Biolgicas de

la U.C.M., por haberme enseado el adecuado manejo de los animales y el mtodo

correcto de medicin de la presin portal, por haberme abierto las puertas del

animalario de la facultad de Ciencias Biolgicas, por su paciencia, su cercana y sus

consejos, y por estar siempre pendiente y dispuesta para ayudar.

- A la Dra. Beatriz Diguez Fernndez, por su apoyo y empuje continuo en el inicio y

desarrollo de este trabajo y por su amistad.

- Al Dr. Manuel Losada Ruz con quien pas tantas horas en el animalario, en el

departamento de ciruga y con quien he compartido tantos quebraderos de cabeza en

este de trabajo.

- A Fernando Snchez Patn que con infinita paciencia me ense la tcnica de la

colestasis microquirrgica experimental en la rata.

- A la Dra. Elena Vara Ameigeiras, del Dpto. de Bioqumica y Biologa Molecular

III, de la Facultad de Medicina de la U.C.M., por haberme abierto las puertas de su

laboratorio para realizar las determinaciones de mi Tesis.

- A la Dra. Patrocinio Vergara Esteras, del Dpto. de Biologa Celular, Fisiologa e

Inmunologa de la Facultad de Veterinaria de la Universidad Autnoma de

Barcelona, por ser tan abierta, y por haberme prestado su tiempo y atencin en

innumerables ocasiones.

- Al personal del animalario de la Facultad de Medicina de la Universidad

Complutense de Madrid y en especial a su directora Da. Pilar Bringas de Lastra

quienes nos permitieron el uso de sus instalaciones y siempre estuvieron dispuestos a

resolver todas mis dudas para el manejo de los animales.

- Al personal del laboratorio de bioqumica de la Facultad de veterinaria de la

Universidad Autnoma de Barcelona quienes realizaron las determinaciones

bioqumicas para la obtencin de nuestros resultados.

- Este trabajo no podra haber sido realidad sin el estudio histopatolgico de las

muestras que realizaron los Dres. del Dpto. de Anatoma Patolgica del Hospital

Carlos III de Madrid. Agradecer a la Dra. Mara Teresa Corcuera Pindado su

inapreciable colaboracin para el estudio de las muestras de tejidos.

- A Pedro Cuesta lvaro y a Santiago Cano del Centro de Clculo de la U.C.M., por

realizar la estadstica y estar siempre dispuestos a nuestras preguntas y dudas.

- A los Laboratorios Novartis, que nos donaron amablemente el Ketotifn.

- Al laboratorio BIO-Nova que realizaron las determinaciones bioqumicas en

tejidos.

- A Eva Tavares del Hospital Universitario Virgen de Valme de Sevilla que realiz

las determinaciones bioqumicas en Ascitis.

- A Diana Currs que me ayud en el inicio de este trabajo y fue ejemplo de

motivacin por la investigacin y el conocimiento.

- A Gema de quien he recibido el apoyo necesario sin el cual habra abandonado en

multiples ocasiones.

- A los laboratorios Braum surgical y Covidien que amablemente han colaborado en

la financiacin de este proyecto.

- Es digna de elogio la calidad humana de este grupo de personas. A todos ellos, les

estar siempre agradecido por haberme tratado con tanto cario, y por poner su

tiempo y sus conocimientos a mi disposicin. En este tiempo con ellos, no slo han

sido para m un referente como cientficos, sino tambin como amigos y personas.

- Este trabajo ha sido parcialmente realizado gracias a la concesin de ayudas a la

Investigacion:

Ayuda de investigacin FISCAM (Fundacin para la Investigacin de Castilla la

Mancha),Ref.n: PI-2007/64.

ndice de abreviaturas y acrnimos

Abreviaturas y acrnimos

A

A: Glndula suprarrenal

AB: Acidos biliares

ACBB11: Canalicular bile salt

export pump

(Bomba exportadora

canalicular de sales biliares)

ALP: Fosfatasa alcalina

ALT: Alanina amino

transferasa

AST: Aspartato amino

transferasa

-SMA: -smooth muscle

actin (alfa actina de msculo

liso)

B

B: Bazo

C

CBD: Common bile duct

(Conducto biliar comn)

CBP: (Lipid binding protein)

Proteina de union a

lipopolisacaridos

CCL2: Chemoquine ligand 2

(Ligando de quimioquina 2)

CCl4: Tetracloruro de carbono

CCR2: Chemokine receptor 2

(Receptor de citoquina 2)

CGRP: Pptido relacionado

con el gen de la Calcitonina

(Calcitonin gen related

peptide)

CMQ: Ratas con colestasis

microquirrgica

CMQ+K: Ratas con colestasis

microquirrgica tratadas con

ketotifn

CO: Monxido de carbono

Cr: Creatinina

CTFG: Connective tissue

growth factor (Factor de

crecimeinto de tejido

conectivo)

CTMC: Connective mast cells

(Clulas cebadas conectivas)

D

D: Duodenum (Duodeno)

DE: Desviacin estndar

DMSO: Dimetil-sulfoxido

DNA: Acido

desoxirribonucleico

PC: Incremento de peso

corporal

E

E: Estmago

EGF: Epithelial growth factor

(Factor de crecimiento

epithelial)

Abreviaturas y acrnimos

ELISA: enzyme-linked

immunosorbent assay

ER: Espleno-renal

Eri: Colaterales

portosistmicas

esplenorenales inferiores o

caudales

Ers: Colaterales

portosistmicas

esplenorenales superiores o

craneales

ES: Estadsticamente

significativo

F

F: Ligamento falciforme

G

GAGs: Glicosaminglicanos

GGT: Gammaglutamil

transferasa

GM-CSF: Factor estimulante

de colonias macrfago-

granulocito

H

HDL: High Density Lipoprotein

(Lipoproteinas de alta

densidad)

HGF: Hepatocitary growth

factor (Factor de crecimiento

hepatocitario)

HMGB1: High-mobility group

protein 1 (Grupo de proteinas

de alta mobilidad)

H2S: Sulfuro de hidrgeno

I

ICAM-1: Molecula de

adhesin leucocitaria 1

IFCC: International Federation

for Clinical Chemistry

IFN-: Interfern Gamma

IGF: Insuline-like growth

factor

IL: Interleuquinas

iNOS: Oxido ntrico sintasa

inducible

IP-10/CXCL10: Interferon

inducible-protein 10 (Proteina

10 inducible por interfern)

L

LBP: Lypopolisacaride-

blinding-protein

LC: Lobulo caudado

LDH: Lactato Deshidrogenasa

LDL: Light Density Lipoprotein

(Lipoproteinas de baja

densidad)

LK: Left kidney (Rin

izquierdo)

LLD: Lobulo lateral derecho

Abreviaturas y acrnimos

LLI: Lobulo lateral izquierdo

LLL: Left lateral lobe (Lobulo

lateral izquierdo)

LM: Lobulo medio

LPS: Lipopolisacrido

LRV: Left renal vein (Vena

renal izquierda)

LSR: Left adrenal gland

(Glndula suprarrenal

izquierda)

M

MAPK: ERK-mitogen-activated

protein kinase

MCP-1: Monocyte

chemoatractant protein 1

(Proteina quimioatrayente de

macrofagos 1)

MDC: macrophage-derived

chemokine (Quimioquina

derivada de los macrfagos)

MDR3: multidrug-resistant 3

protein

MIF: Factor inductor de

macrfagos

MIG/CXCL9: Monokine

induced by IFN- (Monoquina

inducida por interfern )

ML: Middle lobe (Lbulo

medio)

MMC: Mucosal mast cells

(Clulas cebadas mucosas)

MMP: Metaloproteasas de la

matriz tisular

mRNA: Acido ribonucleico

mensajero

MRP2: Canalicular conjugate

export pump

N

Na: Sodio

NAD+ y NADH: Nicotinamida

adenina dinucletido

NEFAs: Acidos grasos no

esterificados

NFB/IkB: Complejo

regulador transcripcional

NF-: Factor de transcripcin

NF-

NO: Oxido ntrico

O

OATP2, OATPB1: NA-

taurocholate cotransporter and

organic anion transporting

proteins

P

P: Pancreas

PAF: Factor de activacin

plaquetario

PC: Proceso caudado

PCF: Peso corporal final

Abreviaturas y acrnimos

PCI: Peso corporal inicial

PE: Peso esplnico

PH: Peso heptico

PDGF: Factor de crecimiento

derivado de las plaquetas

PE: Venas periesofgicas

PGI2: Prostaciclina

PP: Presin portal

PP: Colaterales paraportales

PR: Colaterales pararrectales

PSO: Ratas pseudoperadas

PSO+K: Ratas pseudoperadas

tratadas con ketotifn

PT: Peso testicular

R

R: Recto

RI: Rin izquierdo

RANTES: Regulated on

activation of normal T cells-

expressed and secreted

protein

RLL: Right lateral lobe (Lbulo

lateral derecho)

RMCP-II: Rat mast cell

proteinase II

ROS: Especies reactivas de

oxgeno

RT: Ligamento triangular

derecho.

S

S: Spleen (Bazo)

SR: Glndula suprarenal

T

TGC: Triglicridos

TGF-1: Transforming growth

factor (Factor de crecimiento

transformador 1)

TIMP-1: Inhibidores tisulares

de las MMPs

TLR-4,2: Receptores Toll-like

TNF,TNF: Factor de necrosis

tumoral y

U

UCM: Universidad

Complutense de Madrid

V

VCAM: Molecula de adhesin

leucocitaria

VE: Vena esplnica

VEGF: Vascular endotelial

Grow factor (Factor de

crecimiento del endotelio

vascular)

VEGF-A: Vascular endotelial

grow factor-recombinant

(Factor de crecimiento del

Abreviaturas y acrnimos

endotelio vascular-

recombinante)

VGI: Vena gstrica izquierda

VHA: Vena heptica accesoria

VLDL: Very Light Density

Lipoprotein (Lipoproteinas de

muy baja densidad)

VMS: Vena mesentrica

superior

VRI: Vena renal izquierda

VVM: Vasculopata venosa

mesentrica

RESUMEN

Introduccin. El desarrollo de fibrosis heptica e hipertensin portal en mltiples

hepatopatas crnicas de etiologa diversa es un proceso multifuncional, mediado por

clulas inflamatorias que, al liberar mediadores fibrognicos, activan a las clulas

estrelladas y a los miofibroblastos. La administracin de ketotifn, un frmaco

estabilizador de clulas cebadas, que inhibe la sntesis y liberacin de sus mediadores

inflamatorios, en un modelo experimental microquirrgico de colestasis

extraheptica, al inhibir la degranulacin de las clulas cebadas, disminuira la

liberacin hepato-intestinal de mediadores inflamatorios y profibrognicos,

consiguindo as reducir tanto la respuesta inflamatoria esplcnica como la fibrosis

biliar secundaria a colestasis

Material y Mtodos. Para verificar sta hiptesis se han estudiado en ratas Wistar

pseudo-operadas (PSO; n=15) y con colestasis extraheptica microquirrgica (CMQ;

n=20) la presencia de ascitis, de vasculopata venosa mesentrica, de hipertensin

portal y el desarrollo de circulacin colateral portosistmica. Se cuantificaron las

concentraciones sricas de parmetros de funcin hepato-biliar por fotocolorimetra,

as como los niveles de mediadores pro- y anti-inflamatorios en el ileon terminal, los

ganglios linfticos mesentricos y el hgado mediante tcnicas de inmunoensayo

enzimtico de tipo enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Por ltimo, se

realiz un estudio histopatolgico heptico y tincin de Rojo Sirio para cuantificar el

area de fibrosis heptica. Los mismos parmetros se evaluaron en ratas PSO (n=20) y

en ratas con CMQ (n=20) a las que se administr ketotifen (10 mg/kg/da; v.o.) desde

las 24 horas previas a la intervencin y durante todo el perodo postoperatorio de 8-9

semanas

Resultados: Las ratas con colestasis mostraron ascitis, aumento de la presin portal

(p

respuesta inflamatoria esplcnica, en las ratas con colestasis se observ aumento de

catalasa en el leon (p

ABSTRACT

Introduction: The development of hepatic fibrosis and portal hypertension in most

cases of cronic hepatic illness from diverse etiologies is a multifunctional process,

mediated by inflamatory cells that, when liberate they fibrogenic mediators, they

activate star cells and miofibroblasts. Ketotifen, a drug that stabilizes mast cells and

inhibits synthesis and liberation of inflamatory mediators, was administered in a

cholestasis hepatic microsurgery experimental model, where it inhibits mast cell

degranulation which reduces hepatic-intestinal inflammatory and profibrogenics

mediators. This achieved a decrease in the splacnic inflamatory response as biliar

fibrosis secondary to cholestasis.

Material and Methods: In order to verify the hypothesis about the presence of

ascitis, venous mesenteric vasculopaty, portal hypertension and the development of

portosistemic colateral circulation has been studied in sham-operated Wistar rats

(SO; n=15) and in rats with microsurgery extrahepatic cholestasis (MC; n=20).

Hepatobiliar function establishes the parameters for seric concentrations by

fotocolorimetric tecnics, as well as the distal ileum, pro-inflamatory and anti-

inflamatory mediators levels, the mesenteric lymphatic nodes and liver by enzymatic

inmunotest (enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA). Finally we perform an

hepatic histopathology test and Red Syrius stain to quantify the hepatic fibrosis area.

Same parameters were evaluated in sham-operated rats SO (n=20) and in

microsurgycal cholestatic rats MC (n=20) which were treated with ketotifen (10

mg/kg/day; oral) from 24 hours previous to surgery to the whole postoperatory

period (8-9 weeks).

Results: Cholestatic rats showed ascitis, rising portal pressure (p

with cholestasis, we showed an increase of catalase in ileon (p

NDICE GENERAL

NDICE GENERAL

Resumen Pgina

I. INTRODUCCION33

1. COLESTASIS 35

2. ANATOMIA DE LA VIA BILIAR EN LA RATA..38

3. COLESTASIS EXTRAHEPATICA EXPERIMENTAL..40

4. FISIOPATOLOGIA DE LA COLESTASIS.44

5. LAS CELULAS CEBADAS COMO MEDIADORAS DE INFLAMACIN Y

FIBROSIS.53

6. KETOTIFN, UN FRMACO ESTABILIZADOR DE LAS CLULAS

CEBADAS.65

II. HIPTESIS Y OBJETIVOS .71

III. MATERIAL Y METODOS 77

1. MATERIAL79

1.A. ANIMALES..79

1.B. INSTALACIONES80

1.B.1. Animalario...80

1.B.2. Unidad de microciruga81

1.B.3. Sala de sacrificio y procesado de muestras..81

1.B.4. Area de conservacin de muestras..82

1.B.5. Eliminacin de residuos biolgicos.82

1.C. FARMACOS..82

1.C.1. Anestsicos..82

1.C.2. Ketotifn..82

1.C.3. Otros frmacos.82

1.D. MATERIAL..83

NDICE GENERAL

1.D.1. Instrumental quirrgico..83

1.D.1.A. Pinzas...83

1.D.1.B. Porta agujas Mayo-Hegar de 12,7 cms83

1.D.1.C. Tijeras..83

1.D.2. Material de sutura y ligadura..84

1.D.3. Material quirrgico complementario...84

1.D.4. Otros materiales para el procedimiento operatorio y la extraccin

de muestras.84

1.D.5 Material de laboratorio.85

1.E. EQUIPOS DE LABORATORIO...86

1.E.1. Procesado de muestras.86

1.E.2. Estudios bioqumicos en suero ...86

1.E.3. Estudio protenas de fase aguda en sangre...86

1.E.4 Determinacin de los niveles de mediadores inflamatorios en hgado, ileon

y ganglios linfticos mesentricos...86

1.E.5. Laboratorio de anatoma patolgica87

1.E.5.1. Laboratorio general..87

1.E.5.2. Laboratorio de inmunohistoqumica....87

1.E.5.3. Laboratorio de anlisis de imagen con dos sistemas de anlisis de

imagen.88

1.F. REACTIVOS DE LABORATORIO.88

1.F.1 Estudios bioqumicos en suero.88

- Bilirrubina total y directa89

- ALP.89

- Acidos biliares89

- AST.89

- ALT.89

- GGT....90

NDICE GENERAL

- LDH90

- Proteinas totales..90

- Albmina ...90

- Urea.90

- Creatinina91

1.F.2. Concentraciones sricas de lpidos y lipoprotenas...91

- TGC.91

- Acidos grasos libres.91

- Colesterol.91

- HDL-c..91

- LDL-c...91

- VLDL-c...91

1.F.3. TGF1 en sangre...92

1.F.4. Niveles de Pptido relacionado con el gen de la Calcitonina (Calcitonin gen

related peptide, CGRP) e IL-13 en lquido asctico....92

1.F.5. Niveles de citoquinas en hgado, leon y ganglios linfticos mesentricos..92

1.F.6. Reactivos para estudio histolgico...93

- Fijacin.93

- Inclusion93

- Tincion de Hematoxilina-Eosina..93

- Tincion de Rojo Sirio93

2. MTODOS ..94

2.A. CONDICIONES DE UTILIZACIN Y ESTABULACIN DE

LOS ANIMALES..94

2.B. DISEO EXPERIMENTAL..94

Serie I...95

Serie II..95

2.C. TCNICA ANESTSICA.96

NDICE GENERAL

2.D. TCNICA QUIRRGICA DE LA PSEUDOPERACION...97

2.E. TECNICA QUIRURGICA DE LA COLESTASIS MICROQUIRRGICA98

2.F. MANTENIMIENTO Y TRATAMIENTO POSTOPERATORIO..104

2.G. SACRIFICIO DE LOS ANIMALES...106

2.G.1. Determinacion de la presin venosa portal106

2.G.2. Circulacin venosa colateral......108

Circulacion venosa colateral portosistminca....108

Area Esplenorrenal.....108

Area Gastroesofgica..108

Area colorrectal..109

Circulacion venosa colateral portoheptica....110

2.G.3. Vasculopata venosa mesentrica...110

2.G.4. Extraccin sangunea .112

2.G.5.Recogida de muestras histolgicas para determinacines de mediadores

inflamatorios.113

2. G. 6. Recogida de muestras para estudio histopatolgico....114

2.H. DETERMINACIN SRICA DE PRUEBAS DE FUNCIN HEPTICA...115

Bilirrubina total y directa ..115

Transaminasas hepticas (AST y ALT)..115

Fosfatasa alcalina (ALP).116

Gamma-glutamil transferasa (GGT)116

Lactato deshidrogenasa (LDH) ...116

Acidos biliares.117

2.I. DETERMINACION DE PROTEINAS .117

Proteinas totales ..117

Albmina 117

Urea 117

NDICE GENERAL

Creatinina.118

2.J. DETERMINACIN DE LPIDOS Y LIPOPROTEINAS ...118

2.K. DETERMINACION DE TGF-1 119

2.L. VALORACIN DE LOS NIVELES DE PPTIDO RELACIONADO CON EL

GEN DE LA CALCITONINA (CALCITONIN GEN RELATED PEPTIDE,

CGRP) E IL-13 EN EL LQUIDO ASCTICO......119

2. M. DETERMINACIN DE LOS NIVELES DE CITOQUINAS EN HGADO,

LEON Y GANGLIOS LINFTICOS MESENTRICOS..120

2.M.1. Homogeneizacin de los tejidos 120

2.M.2. Valoracin de los niveles tisulares de citoquinas 120

2.M. 3. Determinacin de los niveles tisulares de protenas ..121

2.N. ESTUDIO MICROSCPICO E HISTOPATOLGICO122

2.N.1. Fijacin...122

2.N.2. Inclusin 122

2.N.3. Procesado de los cortes ..123

2.N.4. Tincin y montaje...123

Hematoxilina & Eosina...123

Tricrmico de Masson.124

2. . ESTUDIO HISTOMORFOMTRICO DE FIBROSIS EN EL PARNQUIMA

HEPTICO CON TINCIN DE ROJO SIRIO ..124

2.O. ANALISIS ESTADISTICO DE LOS RESULTADOS..125

IV. RESULTADOS 127

1. SUPERVIVENCIA Y COMPLICACIONES POSTOPERATORIAS129

1.A. Supervivencia.129

1.B. Complicaciones postoperatorias 129

- Pared abdominal129

- Complicaciones neurolgicas....129

NDICE GENERAL

- Colestasis .130

2. HALLAZGOS MACROSCPICOS EN LA NECROPSIA...130

- Pared abdominal ...130

- Complicaciones hemorrgicas..130

- Afectacin heptica...130

- Sistema digestivo..132

- Torax.....132

- Sistema genito-urinario 132

3. EVOLUCIN DEL PESO CORPORAL.135

4. EVOLUCIN DEL PESO HEPTICO..137

5. EVOLUCIN DEL PASO ESPLNICO ...141

6. EVOLUCIN DEL PESO TESTICULAR... .144

7. CIRCULACION COLATERAL VENOSA PORTOSISTMICA.146

8. VASCULOPATIA VENOSA MESENTERICA.150

9. PRESIN PORTAL 151

10. ASCITIS..153

10.a. Presencia de ascitis ..153

10.b. Volumen de lquido asctico 153

10.c. Concentraciones de proteina relacionada con el gen de la Calcitonina

(CGRP) y de Interleuquina 13 (IL-13) en el liquido asctico..154

11. BIOQUIMICA SANGUNEA ......156

11a. BT, BD, ALP Y Acidos biliares156

11b. AST, ALT, cociente, GGT, LDH...159

11c. Proteinas totales, albumina, urea, creatinina y TGF1..162

12. CONCENTRACIONES SRICAS DE LIPIDOS Y LIPOPROTEINAS.166

13. ESTUDIO HISTOPATOLGICO171

14. CONCENTRACIONES TISULARES DE MEDIADORES

NDICE GENERAL

INFLAMATORIOS...176

14.A. MEDIADORES ANTIOXIDANTES 176

- Catalasa ..176

- Glutation transferasa ..178

- Glutation peroxidasa..181

14.B. CITOQUINAS PROINFLAMATORIAS ..183

- TNF .183

- IL-1 .186

14.C. CITOQUINAS ANTIINFLAMATORIAS ...188

- IL-4 ..188

- IL-10.191

- IL-13 193

- IL-17A .195

- MCP-1 ..197

14.D. FACTORES DE CRECIMEINTO ..200

- TGF-1 .200

- VEGF ...202

V. DISCUSIN205

VI. CONCLUSIONES227

VII. BIBLIOGRAFIA231

I.INTRODUCCIN

I-INTRODUCCIN

35

1. COLESTASIS

Las enfermedades colestsicas hepticas son consecuencia de trastornos de la

sntesis hepatobiliar y de la excrecin de la bilis, lo cual comporta la llegada a la

circulacin sangunea de productos biliares (Hirschfield y cols, 2010). En stas

patologas, la lesin de los conductos biliares o de los hepatocitos puede inducir un

amplio rango de manifestaciones clnicas que incluyen desde alteraciones aisladas de

la bioqumica heptica hasta el fallo heptico o el cncer hepatobiliar. Las causas del

sndrome colestsico pueden ser congnitas, inmunolgicas, estructurales,

obstructivas/vasculares y txicas (Hirschfield y cols, 2010). Se pueden desarrollar

varias formas de colestasis, bien por una alteracin de la secrecin biliar, por una

obstruccin del flujo biliar, o por una combinacin de ambas. A su vez, el deterioro

en el flujo biliar que conduce a la colestasis puede acontecer de forma aguda o

crnica. Como consecuencia se produce una retencin de cidos biliares, bilirrubina

y otros solutos coleflicos en el hgado y en la sangre y un dficit de cidos biliares

en el intestino.

Aunque los colangiocitos slo representan una pequea proporcin (3-5%) de

las clulas que forman el parnquima heptico (Alpini y cols., 2001; Hirschfield y

cols, 2010), desempean un papel fisiopatolgico relevante en la composicin de la

bilis durante su transito por la va biliar, que implica la secrecin y absorcin de

agua, electrolitos y otros solutos orgnicos de la bilis hepatocelular (Alvaro y cols.,

1997; Alpini y cols., 2001; Racanelli and Rehermann, 2006; Glaser y cols. 2006).

Los colangiocitos son unas clulas epiteliales ciliadas que delinean la va biliar, una

intrincada red de conductos biliares interconectados que aumentan progresivamente

su dimetro desde los conductos de Hering hasta la va biliar extraheptica (Alpini y

cols., 2002; Lorente L y cols., 2009) (Figura 1).

I-INTRODUCCIN

36

Figura 1. Unidad funcional heptica. Los canalculos biliares drenan en los canales de Hering y estos a su vez en los dctulos biliares, que desembocan en los conductos biliares interlobulares, situados en los espacios porta (EP). (Arias y cols, 1993)

Los colangiocitos de los grandes conductos biliares interlobulares intervienen

fundamentalmente en funciones secretoras, en tanto que los que delimitan los

conductos biliares intrahepticos ms pequeos, los colangiolos y los conductos de

Hering estn implicados en las respuestas inflamatoria y proliferativa (Alpini y cols,

1996; Alpini y cols, 1997). Los cilios de los colangiocitos se extienden desde la

membrana plasmtica apical hasta la luz del conducto biliar y regulan funciones

mecanosensoriales, osmosensoriales y quimiosensoriales (Masyuk y cols., 2006;

Masyuk y cols., 2008). La estimulacin de los colangiocitos por vas paracrina y

endocrina induce la secrecin de agua y la alcalinizacin de la bilis (Srazzabosco y

cols, 1991; Kanno y cols., 2001; Esteller, 2008). En ste proceso se integran

estimulos prosecretores (secretina, glucagon, polipeptido intestinal vasoactivo, VIP,

acetilcolina, Ach y bombesina) y antisecretores (somatostatina y endotelina-1)

(Fiorotto y cols., 2007; Minagawa y cols., 2007; Srazzabosco y cols, 2009).

El hepatocito es una clula poligonal polarizada que posee una membrana

plasmtica con una superficie basolateral, localizada en el espacio de Disse,

I-INTRODUCCIN

37

subyacente a las clulas endoteliales del sinusoide, y una cara apical que delimita el

canalculo biliar (Li y Crawford, 2004). El transporte de proteinas desde la

membrana basolateral (sinusoidal) hasta la apical (canalicular) desplaza los cidos

biliares desde la sangre sinusoidal hasta el canalculo biliar mediante una eficiente

circulacin enteroheptica estrechamente regulada (Zollner y Trauner, 2008; Boyer,

2009). La membrana plasmtica basolateral contiene protenas transportadoras que

utilizan gradientes de Na+ y de pH para captar solutos orgnicos desde la sangre

hacia el interior del hepatocito. Y la membrana canalicular tiene sistemas de

transporte activo que facilitan la secrecin de solutos orgnicos hacia la luz

canalicular. Receptores nucleares regulan la transcripcin de genes que codifican

proteinas implicadas en los sistemas de transporte hepatobiliar, de sntesis y

detoxificacin de cidos biliares y de fibrognesis (Fiorucci y cols, 2004; Fickert y

cols, 2009; Wagner y cols., 2010). Los cidos biliares son internalizados a travs de

la membrana basolateral de los hepatocitos por las proteinas cotransportadora de

Na+/taurocolato y transportadora de aniones orgnicos (Na+/taurocholate

cotransporter and organic anion transporting proteins, OATP2/OATPB1) (Konig y

cols., 2006). Los principales solutos orgnicos secretados en la bilis son sales biliares

conjugadas con taurina o con glicina (ursodeoxicolato, colato, quenodeoxicolato,

deoxicolato y litocolato), fosfatidilcolina, colesterol, glucurnidos de bilirrubina y

glutation (Nathanson y Boyer, 1991; Li y Crawford, 2004). La exportacin activa

hacia la bilis es mediada por la bomba canalicular exportadora de sales biliares

(canalicular bile SALT export pump, ABCB11) y por la bomba canalicular

exportadora conjugada (canalicular conjugate export pump; MRP2). MRP2 regula el

transporte canalicular de aniones orgnicos, como la bilirrubina (Hirschfield y cols,

2010). Por ltimo, La formacin de micelas mixtas en la bilis resulta de la presencia

de cidos biliares, colesterol y fosfatidilcolina y la bomba exportadora de

fosfolpidos proteina 3 resistente a multifrmacos (multi-drug- resistant 3 protein;

MDR3) controla activamente ste proceso (Hirschfield y cols, 2010)

Si la etiologa de la colestasis es obstructiva, dependiendo del nivel

anatmico de la obstruccin, se clasifica en intraheptica y extraheptica. Las causas

ms frecuentes de colestasis intraheptica en la clnica humana son la colangitis

esclerosante, la cirrosis biliar primaria, la atresia biliar y las hepatopatas de etiologa

alcohlica, vrica, o farmacolgica (Trauner y cols. 1998; Rutherford y cols, 2006;

I-INTRODUCCIN

38

Hirschfield y cols, 2010; Pakarinen y Rintala, 2011) en tanto que la patologa

litisica y tumoral predominan en la colestasis extraheptica (Hirschfield y cols,

2010).

Pero, independientemente de cual sea su causa, este sndrome se manifiesta

clnicamente por ictericia, coluria, acolia y prurito (Schaffner y cols. 1979; Sherlock,

1984; Bergasa y cols. 1995a; Bergasa y cols. 1995b; Li y cols. 2004; Heathcote EJ,

2007; Oude Elferink y cols. 2011). Desde el punto de vista bioqumico, la colestasis

cursa con niveles sricos elevados de bilirrubina, cidos biliares (AB), fosfatasa

alcalina y -Glutamil transferasa e hipercolesterolemia (Li y Crawford, 2004; Shiha y

cols. 2009). Finalmente cursa con fibrosis, cirrosis y signos clnicos de insuficiencia

heptica y encefalopata heptica (Boyer y cols 2007; Newton y cols. 2008) Incluso,

si la obstruccin es crnica se ha demostrado la evolucin tumoral de ste proceso

(Xia y cols., 2007; Aller y cols., 2010; Yang y cols., 2011). En conclusin, la

patologa derivada de la colestasis incluye aspectos morfolgicos: acmulo o estasis

de bilis en la va biliar y en los hepatocitos; funcionales: disminucin de la secrecin

heptica de bilis y del flujo biliar canalicular; y clnicos: retencin en la circulacin

sangunea de sustancias que normalmente son excretadas en la bilis (Sherlock, 1997;

Li y cols. 2004; Zollner y cols, 2008; Chu y cols., 2010; Hirschfield y cols., 2010;

Kremer y cols., 2011).

2. ANATOMA DE LA VA BILIAR EN LA RATA.

El higado de la rata se compone de cuatro lbulos, denominados medio

(LM), lateral izquierdo (LLI), lateral derecho (LLD) y caudado (LC) que, a su vez

poseen una vascularizacin porto-arterial y un drenaje biliar y venoso

individualizado (Castaing y cols. 1980; Lorente y cols. 1995, Lorente y cols., 2009)

(Figura 2). Adems, algunos autores describen el proceso caudado (PC) como el

segmento de parnquima comprendido entre los lbulos caudado y lateral derecho

(Aller y cols. 2008; Lorente y cols. 2009).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hirschfield%20GM%22%5BAuthor%5D

I-INTRODUCCIN

39

Figura 2. El hgado de la rata se compone de cuatro lbulos: lateral derecho (LLD), medio (LM), lateral izquierdo (LLI) y caudado (LC) que, a su vez poseen una vascularizacin porto-arterial y un drenaje biliar y venoso individualizado.

La va biliar tiene una estructura similar a un rbol, en el cual el coldoco y

los conductos biliares lobulares corresponderan al tronco que se ramificaran

progresivamente en los conductos biliares interlobulares (Figura 3), los ductulos

biliares o canales de Hering y finalmente los canalculos biliares (Figura1)

(Benedetti y cols. 1996; Ref.29; Aller y cols. 2008; Lorente y cols. 2009).

La via biliar extrahepatica en la rata esta constituida por el coledoco, que en

su trayectoria ascendente recibe en el hilio hepatico los siguientes conductos biliares

lobulares: conductos inferiores o caudales, correspondientes a los lbulos caudado y

lateral derecho; y conductos superiores o craneales, correspondientes a los lbulos

lateral izquierdo y medio (Aller y cols., 2008; Lorente y cols., 2009) (Figura 3).

I-INTRODUCCIN

40

Figura 3: Distribucion mas frecuente de las ramas lobares de primer orden en la rata. CBD:Conducto coldoco; E:Esofago; S:Estmago; D: Duodeno.

3. COLESTASIS EXTRAHEPATICA EXPERIMENTAL

La ictericia obstructiva causa una elevada incidencia de morbi-mortalidad en

la clnica humana (OConnor, 1985; Poupon y cols, 2000). Las severas repercusiones

hepticas y sistmicas de la colestasis (Schaffner y cols. 1979; OConnor, 1985;

Sherlock 1986; Li y cols. 2004; Nguyen y cols., 2010; Chu y cols., 2010; Hirschfield

y cols., 2010; Kremer y cols., 2011) han sido la causa de la creacin de diversos

modelos experimentales que permitan una mejor comprensin de su patognesis,

profilaxis y tratamiento.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hirschfield%20GM%22%5BAuthor%5D

I-INTRODUCCIN

41

La ligadura del coldoco en la rata es un modelo experimental utilizado tanto

para el estudio de la hipertensin portal (Katsuta y cols., 2005; Abraldes y cols.

2006) como, en especial, de la colestasis extraheptica (Rodrguez-Garay, 2003;

Aller y cols, 2009; Aller y cols., 2010). En esencia, la tcnica quirrgica consiste en

la reseccin del coldoco entre dos ligaduras. Esta tcnica es macroquirrgica, ya

que no requiere medios de magnificacin para su realizacin. Sin embargo, las ratas

con colestasis extraheptica macroquirrgica desarrollan un pseudoquiste biliar hiliar

por dilatacin del extremo proximal ligado del coldoco, que se infecta en muchas

ocasiones por microorganismos Gram negativos de procedencia intestinal y los

animales fallecen durante las dos primeras semanas de evolucin postoperatoria por

sepsis secundaria a la existencia de mltiples abscesos intraperitoneales, hepticos y

pulmonares (Aller y cols., 1993, Aller y cols., 2004; Aller y cols., 2009a). El cultivo

de la bilis almacenada en stos pseudoquistes hiliares es positivo y los grmenes ms

frecuentes Escherichia coli y Enterococcus (Aller y cols. 2000), lo cual evidencia

que en ste modelo experimental se produce traslocacin bacteriana intestinal.

Para evitar estas complicaciones infecciosas propusimos la realizacin de una

tcnica microquirrgica consistente en la reseccin de la va biliar extraheptica, que

incluye el coldoco hasta el inicio de su porcin intrapancreatica, en continuidad con

los conductos biliares que drenan cada uno de los cuatro lbulos hepticos en la rata

(Aller y cols., 1993; Lorente y cols., 1995, Aller y cols., 2009a, Aller y cols., 2009b;

Aller y cols., 2010). Con esta tcnica microquirrgica la inexistencia de va biliar

extraheptica residual previene la formacin de pseudoquistes biliares hiliares, as

como de abscesos abdomino-torcicos y reduce la mortalidad respecto al modelo

clsico de ligadura y seccin del coldoco (Aller y cols., 1993; Aller y cols., 2004;

Aller y cols., 2009a, Aller y cols., 2009b; Aller y cols., 2010).

En particular, ste modelo de colestasis extraheptica microquirrgica, al

conseguir mayor supervivencia, permite obtener a largo plazo un nuevo modelo de

fibrosis heptica que puede ser de gran utilidad para el estudio de nuevas terapias

antifibrognicas. En ste sentido, los dos modelos experimentales ms utilizados para

estudiar la insuficiencia heptica crnica son la administracin de tetracloruro de

Carbono y la colestasis por ligadura y seccin del coldoco (Assimakopoulos y

Vagianos, 2009). En el modelo de colestasis extraheptica en la rata se consideran

I-INTRODUCCIN

42

dos fases evolutivas: precoz, si la colestasis se mantiene cuatro semanas, y tardo

cuando se supera este perodo postoperatorio (Assimakopoulos y Vagianos, 2009).

As, cuando la ictericia obstructiva es aguda la colemia predomina sobre la lesin

del parnquima heptico, no existiendo todava ni hipertensin portal ni cirrosis, si

bien induce efectos inotrpicos y cronotrpicos negativos sobre el corazn (Joubert,

1978; Liu y cols., 2000; Nahavandi y cols. 2001; Mani y cols. 2002; Hajrasouliha y

cols. 2004), altera la respuesta vasoconstrictora simptica (Bomzon y cols., 1985;

Jacob y cols., 1993) y causa una intensa diuresis y natriuresis, que pueden incluso

desembocar en hipovolemia (Green y Better, 1995; Kramer , 1997). Como

consecuencia, se producen hipotensin arterial y disfuncin renal prerrenal, que es

agravada por la endotoxemia que acompaa a ste modelo experimental. Por el

contrario, cuando la evolucin de la colestasis es crnica (ms de cuatro semanas),

adems de la colemia, la endotoxemia y la traslocacin bacteriana intestinal (Deitch

y cols., 1990; Clements y cols, 1996; Clements y cols., 1998), se produce una lesin

significativa heptica, con cirrosis biliar, hipertensin portal y ascitis (Green y

Better, 1995; Geerts y cols., 2008) que se asocia a una lesin renal similar

fisiopatolgicamente al sndrome hepatorrenal de los enfermos cirrticos. Por ste

motivo la colestasis obstructiva extraheptica crnica en la rata se ha propuesto como

un modelo experimental valido para el estudio de la fisiopatologia y de nuevas

opciones terapeticas en sta grave situacin en la clnica humana (Assimakopoulos

y Vagianos, 2009)

En general, la mayora de estos modelos experimentales han sido utilizados para

el estudio de aquellos mecanismos patognicos implicados en los procesos

inflamatorios causantes de diversas patologas. En particular, en el caso del modelo

experimental de colestasis, se han estudiado la anatoma de la via biliar extraheptica

en la rata Wistar (Lorente y cols. 1995), la incidencia de infecciones postoperatorias

(Aller y cols. 1993a), la tcnica microquirrgica de colestasis extraheptica en la rata

(Aller y cols., 1993b), y, entre las alteraciones hepticas secundarias a colestasis,

los parmetros sanguneos propios de lesin hepatobiliar, el grado de fibrosis y

proliferacin biliar (Aller y cols. 2004a; Aller y cols. 2004b) y el metabolismo

oxidativo hepato-intestinal (Lpez y cols. 1999) y cerebral (Garca-Moreno y cols.,

2002).

I-INTRODUCCIN

43

Esta tcnica microquirrgica de colestasis extraheptica puede ser tambin

realizada en el ratn (Aller y cols. 2009a; Aller y cols. 2009b). El hgado del ratn,

al igual que el de la rata, est compuesto por cuatro lbulos que reciben los mismos

nombres La principal diferencia en la va biliar de ambos roedores es que el ratn

posee vescula biliar. Por ello, si se efecta ligadura del coldoco se produce una

marcada dilatacin de la vescula biliar que puede evolucionar a perforacin y

coleperitoneo (Abraldes y cols. 2006). Por ello la colestasis extraheptica

microquirrgica en el ratn precisa aadir una colecistectoma. La diseccin,

ligadura y seccin de los conductos biliares de los lbulos medio y lateral izquierdo

se simplifica si se realiza previamente la diseccin de la vescula biliar y del

conducto cstico (Aller y cols. 2009a; Aller y cols. 2009b).

La utilizacin profilctica de antibiticos de amplio espectro (Ceftacidima

50mg/kg) y la administracin semanal de vitamina K1 (8 mg/kg i.m.) permite reducir

la mortalidad precoz de stos animales (Beck y Lee, 1995; Huang y cols. 2003;

Akimoto y cols, 2005; Abraldes y cols. 2006).

A largo plazo, ambos modelos de colestasis extraheptica, macro y

microquirrgica, cursan con hepatomegalia asociada al desarrollo de una intensa

fibrosis y proliferacin biliar, fibrosis y de un moderado grado de infiltracin

inflamatoria portal, as como de muerte hepatocitaria por necrosis y/o apoptosis, si

bien la prdida de la arquitectura heptica normal tpica de cirrosis se observa en

raras ocasiones (Kountouras y cols. 1984; Aller y cols. 1993; Aller y cols. 2004;

Abraldes y cols. 2006).

Respecto de las alteraciones extrahepticas destacan la ictericia, la coluria

(Huang y cols. 2003; Aller y cols. 2004), la hipertensin portal con esplenomegalia y

circulacin colateral portosistmica (Aller y cols. 1993; Huang y cols. 2003; Aller y

cols. 2004; Chan y cols. 2004; Katsuta y cols. 2005), la insuficiencia renal

(Assimakopoulos y Vagianos, 2009) la encefalopata heptica (Bergasa y cols., 1992;

Garcia-Moreno y cols. 2002; Garca-Moreno y cols. 2005; Butterworth y cols.,

2009; Huang y cols. 2010; Magen y cols. 2010; Assimakopoulos y cols. 2010; Eslimi

y cols. 2011) y la ascitis (Huang y cols. 2003; Aller y cols., 2010a; Aller y cols.

2010b). Por lo tanto, la colestasis extraheptica experimental no es slo un modelo

I-INTRODUCCIN

44

idneo para estudiar la patologa heptica secundaria a la obstruccin biliar, sino

tambin sus complicaciones extrahepticas.

4. FISIOPATOLOGIA DE LA COLESTASIS

Las alteraciones hepticas que se producen como consecuencia de la colestasis

extraheptica han sido comparadas a las que protagonizan la curacin de las heridas,

esto es, la proliferacin epitelial y, en particular, la fibrognesis (Bissell, 2004; Aller

y cols., 2008; Meran y Steadman; 2011). La patogenia de la fibrosis heptica

consiste en un depsito excesivo de colageno fibrilar y otras proteinas de la matriz

extracelular que distorsiona la arquitectura heptica e induce capilarizacin

sinusoidal e hipertensin portal. En esencia, la fibrosis heptica es un proceso

dinmico de reparacin tisular aberrante en el que los fenmenos claves son la

activacin y transformacin de las clulas estrelladas hepticas quiescentes en

clulas similares a miofibroblastos, por un proceso de transicin epitelio-

mesenquimal de tipo 2, con el subsiguiente incremento en la sntesis de proteinas,

como actina de musculo liso-, de colageno, metaloproteasas de la matriz,

inhibidores tisulares de metaloproteasas y proteoglicanos (Mormone y cols., 2011;

Meran y Steadman, 2011; Fragiadaki y Mason, 2011).

Inmediatamente despus de la obstruccin completa de la va biliar en la rata se

produce un intenso incremento (60%) de la presin biliar intraductal (Slott y cols.

1990; Azmaiparashvili y cols. 2009) y sto es seguido por alteraciones patolgicas de

la matriz extracelular (Desmouliere y cols. 1997). Por el contrario, la descompresin

biliar, al suprimir el estrs mecnico, revierte las lesiones hepticas inducidas por la

ligadura del coldoco (Ramm y cols. 2000; Matsumoto y cols., 2002; Costa y cols.

2003; Kirkland y cols. 2010). Estos estudios demuestran la relevancia de la energa

mecnica en la etiopatogenia de la patologa heptica secundaria a la obstruccin de

la va biliar.

I-INTRODUCCIN

45

La respuesta del hgado de los roedores a la lesin obstructiva biliar implica su

reprogramacin transcripcional, favoreciendo la activacin de genes reguladores del

metabolismo, de la proliferacin celular y de la remodelacin de la matriz de forma

secuencial y limitada en el tiempo (Campbell y cols. 2004; Wang y cols. 2008).

Aunque se produce una activacin predominante de genes metablicos en todas las

fases posteriores a la ligadura del coldoco, desde una fase inmediata (1 da) hasta

una fase tarda (21 das), la afectacin de vas metablicas especficas es diferente

dependiendo de la duracin de la obstruccin (Campbell y cols. 2004). En tanto que

algunos genes son activados en el periodo precoz de la colestasis, por ejemplo genes

implicados en la disrupcin del metabolismo lipdico y en la fibrosis, otros genes,

como son los implicados en mecanismos de proteccin celular frente a la agresin

por acumulacin txica de cidos biliares, son inhibidos (Kojima y cols. 2004).

Despus de la ligadura del coldoco el hgado de la rata sufre severas

alteraciones hemodinmicas, portales y arteriales, que pueden comportar lesiones por

isquemia-reperfusin y estrs oxidativo (Huang y cols. 2009; Yang y cols. 2012;

Oguz y cols., 2012). El aumento de la resistencia vascular en el sistema portal

heptico secundario a colestasis extraheptica produce hipertensin portal (Ohara y

cols. 1993; Li y Yang, 2005; Van Steenkiste y cols. 2010) e isquemia heptica,

asociadas a una sntesis deficitaria del enzima Oxido Ntrico Sntasa-inducible

(iNOS) y de oxido ntrico (NO) (Barn y cols. 2000; Lee y cols., 2011).

La va biliar es vascularizada por el plexo peribiliar (Gaudio y cols. 1996; Li y

cols. 2007; Toki y cols. 2011), localizado alrededor de los conductos biliares de

menor calibre, hacindose as progresivamente ms estrecho y ms simple (Gaudio y

cols. 1996). Estas caractersticas del plexo peribiliar permiten asumir que el aumento

de presin intraductal con dilatacin de la va biliar en la colestasis extraheptica

podra comprimir el plexo peribiliar con la consiguiente isquemia de la va biliar. Sin

embargo, se ha descrito que despus de la disminucin del flujo sanguneo a travs

de la vena porta se produce un aumento del flujo arterial heptico o hepatic arterial

buffer response (Lautt, 1983). Adems, dos semanas despus de ligadura del

I-INTRODUCCIN

46

coldoco en la rata se produce una proliferacin significativa del plexo peribiliar, que

drena por pequeas vnulas en ramas de la vena porta y en los sinusoides hepticos

(Gaudio y cols. 1996). A su vez, la lesin por isquemia-reperfusin ha sido implicada

en la patognesis de la colestasis intraheptica (Tanaka y cols. 2006; Toki y cols.,

2011).

Las ratas con ligadura del coldoco sufren una excesiva acumulacin de cidos

biliares hidrofbicos que son considerados la causa principal de hepatotoxicidad

(Gartung y cols., 1996; Poli, 2000). Adems, se produce un deterioro parcial de las

funciones de la cadena transportadora de electrones mitocondriales y estrs oxidativo

(Poli, 2000; Huang y cols. 2003). La retencin y el acmulo de sales biliares

hidrofbicas (tauro- y glicoquenodesoxicolato) puede inhibir la actividad

antioxidante heptica de catalasa, glutation peroxidasa, glutation reducido y

superxido dismutasa, as como inducir necrosis hepatocitaria al activar la

permeabilidad de la membrana mitocondrial (Orellana y cols. 1997; Wang y cols.

2007; Portincasa y cols. 2007; Assimakopoulos, 2007; Arduini y cols. 2011). Existe

por tanto una estrecha relacin entre la ictericia obstructiva experimental y el estrs

oxidativo (Orellana y cols. 1997; Assimakopoulos y cols. 2004; Wang y cols. 2007).

As, se ha demostrado que el tratamiento con antioxidantes mejora el estado redox

celular heptico (Assimakopoulos y cols. 2004; Soylu y cols. 2006), y las funciones

hepticas al inhibir la formacin de especies reactivas del oxgeno (ROS) (Soylu y

cols. 2006; Assimakopoulos y cols. 2007; Portincasa y cols. 2007; Tahang y cols.

2007).

Por consiguiente, en la fase precoz tras ligadura del coldoco en la rata el

insuficiente aporte de oxgeno que sufre el hgado, como consecuencia de las

alteraciones hemodinmicas, as como a la incorrecta utilizacin del oxgeno por la

hepatotoxicidad de las sales biliares, constituiran factores etiolgicos esenciales de

la inhibicin del metabolismo energtico heptico. Como consecuencia, el hgado

reduce su capacidad funcional para poder satisfacer las necesidades metablicas

tisulares. La lesin oxidativa heptica podra disminuir el contenido intracelular de

protenas que participan en la sntesis energtica y en las funciones de membrana,

como son las protenas reguladoras del transporte de H2O e iones (Portincasa y cols.

I-INTRODUCCIN

47

2007), lo cual inducira edema intersticial y celular. Adems, el aumento de

peroxidacin lipdica heptica, un marcador de estrs oxidativo (Portincasa y cols.

2007), puede relacionarse con el aumento de la permeabilidad de membrana, el

aumento de la degradacin de los componentes de la matriz extracelular y el edema

(Kenett y Davies, 2007).

La acumulacin intersticial de fragmentos de Glicosaminoglicanos (GAGs)

sera un importante mecanismo de la formacin del edema debido a las propiedades

hidroflicas de GAGs, en particular de hialuronan (Day y de la Motte, 2005; Cantor y

Nadkarni, 2006; Stern y cols. 2006; Kennett y Davies, 2007; Yung y Chan 2007;

Bartlett y cols. 2007; Jiang y cols. 2007). GAGs son largas cadenas de polisacridos

no ramificadas compuestas de unidades repetidas de disacridos que tienden a

adoptar conformaciones en espiral, muy extendidas y que ocupan un gran volumen

en relacin con su masa. Estos polisacridos atraen y atrapan agua e iones, con lo

cual forman geles hidratados, aunque permiten el flujo a su travs de nutrientes para

las clulas (Alberts y cols. 1983; Rhodes y Simons, 2007; Jiang y cols. 2007; Sols-

Herruzo y cols., 2011). En situaciones de inflamacin hialuronan es ms polidisperso

y tiende a formas de menor peso molecular, favoreciendo as la infiltracin

edematosa de los tejidos (Jiang y cols. 2007), el flujo del lquido intersticial y el

gradiente de presin del sistema linftico (Chen y Fu, 2005).

Adems, la tensin mecnica producida por la ligadura del coldoco puede

alterar por mecanotransduccin la remodelacin de los proteoglicanos y de GAGs en

el intersticio (Evanko y cols. 2007). Virtualmente todos los rganos y tejidos estn

organizados en jerarquas estructurales y poseen una capacidad de respuesta

mecnica inmediata aumentando su rigidez en proporcin directa al estrs mecnico

aplicado (Ingber, 2006). La rigidez de la matriz extracelular y la tensin mecnica

que resulta de la adhesin celular a sustratos rgidos es fundamental para determinar

el fenotipo expresado por muchas clulas en cultivo (Bischofs y Schwarz, 2003).

En el modelo de fibrosis biliar por CCl4

en la rata se ha descrito la induccin

precoz de rigidez heptica. Este aumento de la consistencia y/o rigidez heptica

parece ser el resultado del aumento de la cantidad de matriz neoformada, de la

reticulacin de la matriz y, posiblemente de otras variables desconocidas (Georges y

I-INTRODUCCIN

48

cols. 2007). Este aumento precoz en la rigidez heptica podra ser la causa de la

diferenciacin de los miofibroblastos en las patologas hepticas (Georges y cols.

2007; Muddu y cols. 2007). La expresin de la funcin miofibroblasto aporta a las

clulas estrelladas hepticas activadas la capacidad para comportarse como clulas

musculares lisas y, por consiguiente, responden a las sustancias vasoactivas

contrayndose (Lee y Friedman, 2011). Adems, la contraccin de las clulas

estrelladas activadas regula el dimetro de la vascularizacin heptica y altera el

flujo sanguneo y la presin heptica (Winau y cols. 2008).

La adquisicin posterior en la evolucin del hgado colestsico de un fenotipo

inmune afecta a las clulas parenquimatosas (hepatocitos y colangiocitos), a las no

parenquimatosas (clulas endoteliales sinusoidales, clulas de Kupffer y

miofibloblastos) y a las clulas sanguneas que migran al intersticio heptico (Azouz

y cols. 2004; Morwood y Nicholson, 2006; Szabo y cols. 2007; Muddu y cols. 2007;

Winaw y cols. 2008). Sin embargo, el espacio intersticial parece ser el que modula la

actividad inflamatoria de las clulas inmunes tras la ligadura del coldoco en la rata

(Aller y cols, 2008). En particular, los fragmentos de matriz extracelular y sus

receptores ejercen importantes efectos sobre las clulas inflamatorias y, por ello, se

considera que estn claramente implicados en la evolucin de la respuesta inmune

intersticial (Morwood y Nicholson, 2006; Adair-Kirk y Seor, 2007; Yung y Chan

2007). Las Metaloproteasas de la matriz (MMPs) son una familia de enzimas que

degradan componentes de la matriz extracelular que son expresadas en los tejidos

inflamados (Cuenca y cols. 2006; Malemud , 2006; Zitka y cols., 2010; Lffek y

cols., 2011) y, en particular, en el hgado colestsico (Roeb y cols. 1997; Harty y

cols. 2005; Bergheim y cols. 2006). La destruccin enzimtica de la matriz

extracelular cursa con la liberacin inmediata de los mediadores secuestrados en

dicha matriz (Stern y cols. 2006; Yung y Chan, 2007).

Los fragmentos de la matriz extracelular estn constituidos por molculas con

funciones proinflamatorias que pueden potenciar la respuesta inmune activando la

respuesta inmune innata y la adquirida (Morwood y Nicholson, 2006). As, las

proteinas de la matriz extracelular y el hialuronan ejercen una funcin

proinflamatoria unindose a los receptores Toll-like (TLR)-4 y TLR-2 (Szabo y cols.

2007), con activacin del complejo regulador transcripcional NFB/IB y la

I-INTRODUCCIN

49

produccin de citoquinas proinflamatorias, como TNF- e IL-1, y de quimioquinas

que inducen la activacin y el reclutamiento intersticial de leucocitos (Morwood y

Nicholson, 2006). Los linfocitos T, una vez activados, se polarizan hacia la

produccin de distintos perfiles de citoquinas (Zhu y cols., 2010; Yagi y cols., 2011).

El tipo 1 (Th1) sintetiza Interferon (IFN-) e IL-2 y, los de tipo 2 (Th

2) producen

IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 e IL-13. Las citoquinas Th2

estn implicadas

fundamentalmente en la mediacin de la inflamacin alrgica y los trastornos

fibroproliferativos crnicos (Azouz y cols. 2004).

Los macrfagos residentes en el hgado, o clulas de Kupffer, se localizan

fundamentalmente en el rea periportal del lobulillo y, debido a su localizacin,

podran desempear un papel fundamental en la lesin secundaria a isquemia-

reperfusin (Kolios y cols. 2006; Abu-Amara y cols, 2010; Jaeschke y cols., 2012).

Pero las clulas de Kupffer estn tambin implicadas en la inflamacin heptica que

produce la colestasis mediante la liberacin de sustancias biolgicamente activas que

inducen un proceso inmunopatognico (Minter y cols. 2005; Abrahm y cols., 2008;

Zandieh y cols., 2011; Cheng y cols., 2011).

Las clulas de Kupffer estn claramente afectadas en la obstruccin biliar

(Minter y cols. 2005; Abrahm y cols., 2008; Zandieh y cols., 2011; Cheng y cols.,

2011) y muestran una activacin de la fagocitosis y una marcada respuesta

proinflamatoria frente a endotoxina y a la protena de unin a lipopolisacrido

(lypopolysacharide-binding protein, LBP), ambas aumentadas en colestasis

extraheptica (ONeil y cols. 1997; Minter y cols. 2005; Kolios y cols. 2006;

Isayama y cols. 2006; Minter y cols., 2008; Kassel y cols., 2011). La

hipersensibilidad a endotoxina en colestasis es la causa de la sntesis aumentada de

citoquinas proinflamatorias y del aumento de la peroxidacin lipdica (Harry y cols.

1999; Isayama y cols. 2006; Abrahm y cols., 2008), con agravamiento de la

apoptosis que, finalmente progresa a necrosis (Moazzam y cols. 2002; Iida y cols.,

2010). Sin embargo, la depleccin de clulas de Kupffer agrava la inflamacin y la

necrosis hepatocelular en ratones con colestasis (Gehring y cols. 2006). La respuesta

proinflamatoria inducida por LPS en ratas con ligadura de coledoco es inhibida por

lipoprotenas de alta densidad (HDL), que, a su vez, inhibe las vas proinflamatorias

I-INTRODUCCIN

50

hepticas, restaura la actividad de eNOS y reduce la presin portal (Thabut y cols.

2007).

La inflamacin se asocia siempre a la infiltracin intersticial por leucocitos, un

proceso que es regulado por quimioquinas (Aller y cols. 2006; Mantovani y cols.,

2011). En la colestasis extraheptica monocitos/macrfagos infiltran el hgado, que

hiperexpresa a su vez protena quimioatractora de monocitos (monocyte

chemoatractant protein, MCP-1), una quimioquina CC y, como resultado stos

monocitos favorecen la respuesta inflamatoria (Imamura y cols. 2005; Sigal y cols.,

2010). Adems, la colestasis extraheptica estimula la sntesis de quimioquinas CXC

que son, en parte, responsables de la infiltracin de los tractos portales por

neutrfilos (Saito y cols. 2000; Gujral y cols. 2003; Patsenker y cols., 2008; Aller y

cols 2010)

Los neutrfilos son componentes esenciales de la respuesta inflamatoria precoz

a la agresin que sufre el hgado por colestasis (Shivakumar y cols. 2004; Laschke y

cols., 2010; Jaeschke 2011; ). En la colestasis extraheptica experimental la

infiltracin intersticial por neutrfilos ocurre y a los tres das de la ligadura del

coldoco (Levy y cols. 1993; Gujral y cols. 2003; Georgiev y cols. 2008). Las clulas

del epitelio biliar contribuyen a la inflamacin produciendo quimioatractantes de

neutrfilos (Saito y Maher, 2000; Dold y cols., 2010). Adems, las clulas de

Kupffer activadas por la endotoxemia portal secundaria a colestasis, estimulan la

liberacin de quimioquinas por los hepatocitos, lo cual implica a su vez la

infiltracin por neutrfilos (Wakabayashi y cols., 2008)

En esencia, la inflamacin crnica heptica y la fibrognesis constituyen un

agregado dinmico de linfocitos, macrfagos y clulas del estroma relacionadas por

interacciones autocrinas y paracrinas (Holt y cols., 2008). En ratas con ligadura de

coldoco a largo plazo persiste una importante migracin celular alrededor de la

triada portal y de la vena central que se asocia con un aumento de citoquinas

proinflamatorias en el hgado (Fernndez-Martnez y cols. 2006). Sin embargo, las

citoquinas proinflamatorias inducen una respuesta hepatocitaria heterognea al

estmulo colestsico con una inhibicin selectiva de los hepatocitos de la zona

periportal (Donner y cols. 2007).

I-INTRODUCCIN

51

Ambos tipos celulares presentes en el intersticio heptico, las clulas

estrelladas y los miofibroblastos, tienen la capacidad de expresar un fenotipo inmune.

En particular, las clulas estrelladas hepticas sintetizan un amplio espectro de

mediadores inflamatorios, como quimioquinas (MCP-1, RANTES), factor de

activacin plaquetario (platelet activation factor, PAF), IL-8 y molculas de

adhesin leucocitaria (ICAM-1, VCAM), que son necesarias para el reclutamiento y

la activacin de los leucocitos en el intersticio (Bataller y Brenner, 2005; Rockey,

2006; Iredale, 2007; Gressner y cols. 2007; Friedman, 2008; Wasmuth y cols, 2010;

Wasmuth y Weiskirchen, 2010). El alojamiento de leucocitos en el espacio

intersticial heptico es favorecido por las clulas estrelladas hepticas ya que stas

clulas expresan MMPs, lo cual aumenta la degradacin de la matriz extracelular

(Rockey, 2006; Gressner y cols., 2007; Aller y cols., 2010a; Day y cols., 2005). Por

lo tanto, las clulas estrelladas hepticas cambian su fenotipo contrctil a un fenotipo

inmune. Se considera que stos dos fenotipos estn ntimamente relacionados, e

incluso son interdependientes (Rockey, 2006 ;Aller MA, 2010a.)

La infiltracin del hgado colestsico por clulas inflamatorias (monocitos,

neutrfilos) tambin sera secundaria a traslocacin bacteriana intestinal.

Endotoxinas y bacterias de procedencia intestinal alcanzaran el hgado en elevadas

concentraciones como consecuencia del aumento de la permeabilidad de la barrera

mucosa intestinal (Balzan y cols. 2007). La traslocacin bacteriana intestinal es una

complicacin de la hipertensin portal y, por consiguiente, se produce en ratas con

ligadura de coldoco (Garcia-Tsao y Wiest, 2004; Sztrymf y cols. 2005; Karatepe y

cols., 2010; Huang y cols., 2011). Las bacterias que colonizan la luz intestinal

constituyen un gran reservorio de productos microbianos, como LPS, endotoxinas y

otros fragmentos de la pared bacteriana, que son capaces de inducir la sntesis de

citoquinas proinflamatorias (Garcia-Tsao y Wiest, 2004). Por lo tanto, la traslocacin

bacteriana es un mecanismo etiopatognico de infecciones bacterianas en la

colestasis experimental (Sztrymf y cols. 2005; Abdeldayem y cols., 2007). El

aumento de la produccin de TNF- puede inducir traslocacin bacteriana en ratas

con cirrosis y ascitis ya que el bloqueo de TNF- es capaz de inhibirlo sin aumentar

la incidencia de infecciones sistmicas (Sztrymf y cols., 2004; Francs y cols. 2007;

Aller y cols. 2010b; Corradi y cols., 2011)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Wasmuth%20HE%22%5BAuthor%5D

I-INTRODUCCIN

52

Las fases evolutivas tardas del modelo experimental de colestasis

extraheptica se caracterizan por el desarrollo de angiognesis, esto es, el

crecimiento de nuevos vasos sanguneos a expensas de vasos pre-existentes (Kurz y

cols. 2003; Davis y cols., 2011; Geudens y Gerhardt, 2011). Aunque el objetivo final

de la proliferacin endotelial es formar nuevos vasos sanguneos para el transporte de

oxgeno, sustratos y clulas sanguneas (fase vascular), el endotelio posee otras

funciones antes de que los nuevos vasos se desarrollen (fase prevascular) (Aller y

cols. 2007a, Aller y cols. 2007b). As, en las fases iniciales de la respuesta

inflamatoria (fenotipos de isquemia-reperfusin y leucocitario), las nuevas clulas

endoteliales podran adoptar una funcin anti-inflamatoria. Dichas propiedades, anti-

oxidantes y anti-inmunes, favoreceran la resolucin, as como la progresin al

fenotipo angiognico vascular (Aller y cols. 2007b). La angiognesis requiere la

migracin de clulas endoteliales al espacio intersticial, con la consiguiente

proliferacin y diferenciacin en capilares (Aller y cols. 2007b).

En ratas con ligadura de coldoco la proliferacin de los conductillos biliares,

como ocurre en la organognesis heptica, precede a la proliferacin de los

microvasos que los vascularizan. Despus de una semana de ligadura de coldoco, a

pesar de la intensa proliferacin biliar, el plexo arterial peribiliar mantiene su

arquitectura normal. Por el contrario, despus de 2 a 4 semanas de evolucin se

desarrolla una significativa proliferacin de la microvascularizacin que se extiende

desde el plexo peribiliar de los tractos biliares (Gaudio y cols. 1996; Glaser y cols,

2009; Glaser y cols., 2011).

El papel fundamental que ejercen los colangiocitos en la angiognesis que

ocurre despus de la ligadura del coldoco en la rata ha sido corroborado al asociar la

ligadura de la arteria heptica a la colestasis por ligadura del coldoco. En sta

situacin, el hgado sufre un aumento de la apoptosis de colangiocitos, se altera la

proliferacin de los colangiolos con disminucin de la secrecin de factor de

crecimiento de endotelio vascular (vascular endotelial growth factor, VEGF) por los

colangiolos y desaparece el plexo peribiliar. Curiosamente, las funciones de los

colangiocitos y, por lo tanto, la integridad del plexo peribiliar son preservadas

mediante el tratamiento con VEGF-A recombinante (Gaudio y cols. 2006).

Igualmente, en el trasplante de hgado en el ser humano la regeneracin biliar se

I-INTRODUCCIN

53

produce a expensas de una proliferacin inicial del compartimento epitelial, seguido

del compartimento vascular que parece ser inducido por la expresin epitelial de

VEGF-A (Van den Heuvel y cols. 2006).

5. LAS CELULAS CEBADAS COMO MEDIADORAS DE INFLAMACIN Y

FIBROSIS.

En la produccin de la fibrosis biliar secundaria a colestasis extraheptica por

ligadura y seccin del coldoco han sido implicados mediadores de los sistemas

nervioso: Norepinefrina; inmune: citoquinas, quimioquinas y factores de

crecimiento, y endocrino: el sistema renina-angiotensina. A su vez, la fibrosis

heptica que se produce en roedores tras la ligadura y seccin del coldoco es la

consecuencia de un proceso inflamatorio de origen biliar (Kershenobich y Weissbrod

2003; Li y Crawford 2004; Aller y cols., 2011) cursando, por lo tanto, con las

alteraciones propias de la inflamacin: estrs oxidativo y nitrosativo y deterioro de la

actividad antioxidante, edema de los tractos portales, activacin de los macrfagos

hepticos y reclutamiento de clulas inflamatorias, en particular infiltracin

neutroflica de los espacios periductulares hepticos y de clulas cebadas en los

espacios porta y en los septos portales en la vecindad de los capilares del plexo

arterial peribiliar (Rioux y cols., 1996; Takechita y Shibayama 2005). En este

sentido, la fibrosis biliar es similar al proceso de reparacin tisular que ocurre en la

curacin de las heridas y que se caracteriza por acmulo de protenas de la matriz

extracelular, en particular de colgeno (Aller MA y cols., 2008).

Aunque todas las clulas hepticas tienen un potencial fibrognico, son las

clulas estrelladas hepticas las principales productoras de colgeno en el hgado. Sin

embargo, en tanto que las clulas estrelladas hepticas activadas son el principal tipo

celular fibrognico en las reas pericentrales, los miofibroblastos portales pueden

predominar cuando la lesin heptica tiene lugar alrededor de los tractos portales,

como es el caso de la colestasis extraheptica, en la cual se produce una intensa

respuesta fibrtica en los tractos portales (Lazaridis y cols., 2004; Mormone y cols,

2011; Lee y Friedman 2011). De hecho, se ha demostrado que los fibroblastos

portales son capaces de transdiferenciarse en miofibroblastos en modelos

I-INTRODUCCIN

54

experimentales de fibrosis en roedores, tras ligadura del coldoco, y en la cirrosis

biliar humana (Kinnman y Housset, 2002; Kruglov y cols., 2006; Omenetti y cols.,

2008, Omenetti y cols., 2011).

Las clulas cebadas o mastocitos estn ampliamente distribuidas por

prcticamente todos los tejidos vascularizados del organismo, donde se localizan en

estrecha proximidad con los vasos sanguneos y los nervios (Galli y cols. 2005). Son

especialmente abundantes en los lugares anatmicos que estn directamente

expuestos al medio ambiente, como son el tracto gastrointestinal, la piel y las vas

areas (Galli y cols. 2005; Metz y cols. 2007). Se ha demostrado que las clulas

cebadas estn presentes en el higado, tanto en condiciones normales como

patolgicas en el ser humano y en la rata (Farrel y cols. 1995; Rioux y cols. 1996).

Mltiples estudios han comprobado que los mastocitos estn implicados en diversas

hepatopatas (Farrel y cols. 1995; Armbrust y cols. 1997; Yamashiro y cols. 1998;

Matsunaga y Terada, 2000), demostrndose as que stas clulas inmunes tienen un

papel ms amplio de lo que se pensaba originalmente (Franceschini y cols. 2006).

Las clulas cebadas contienen histamina, heparina, serinproteasas, como

quimasa y triptasa, y citoquinas multifuncionales (Theoharides y cols., 2012), que

son importantes mediadoras de los procesos de cicatrizacin y curacin de las

heridas (Artuc y cols.. 1999). Por lo tanto, las clulas cebadas desempean un papel

clave en la remodelacin tisular y la fibrosis. Diversos mediadores sintetizados por

estas clulas, como triptasa, TGF- y TNF-, pueden inducir la proliferacin de

fibroblastos y de clulas estrelladas hepticas y la sntesis de colgeno por distintos

tipos celulares (Gordon y Galli 1994; Vliagoftis y Befus 2005; Moon y cols., 2013).

Las clulas cebadas producen adems Metaloproteasas de la matriz (MMP-1, MMP-

2 y MMP-9), as como inhibidores tisulares de MMPs (TIMP-1) (Atamas y White

2003), lo cual indica que esn tambin implicadas en la degradacin de la matriz

extracelular, contribuyendo por tanto a un desequilibrio entre su sntesis y su

degradacin (Armbrust y cols., 1997).

Las clulas cebadas activadas producen gran cantidad de factores fibrognicos

y quimiotcticos que inducen la proliferacin de los fibroblastos y la sntesis de

colgeno (Welle 1997; Valent y cols., 1998). Las clulas cebadas, por tanto,

I-INTRODUCCIN

55

contribuyen a la fibrosis, remodelacin y reparacin tisular y se acumulan en la

enfermedad inflamatoria intestinal en el ser humano, incluyendo la colitis ulcerosa, el

sndrome de intestino irritable y la enfermedad de Crohn (He 2004), as como en la

enteropata hipertensiva portal en la rata (Dez-Arias y cols., 2001; Prieto y cols.,

2005). Adems, las clulas cebadas estn implicadas en el desarrollo de fibrosis en

patologas del cartlago articular, la piel, el pulmn, el rin y el hgado (Armbrust y

cols., 1997; Kondo y cols., 2001).

En el hgado se acumulan clulas cebadas en mltiples enfermedades (Farrel

y cols., 1995), como son la hepatopata alcohlica, la cirrosis biliar primaria, la

colangitis esclerosante primaria, la atresia biliar, la hepatolitiasis, el rechazo crnico

del injerto heptico y en la colestasis biliar. Al igual que en otros rganos y tejidos,

en el hgado las clulas cebadas deben estar implicadas en la respuesta inmune local

y en el mantenimiento y la reparacin del tejido conectivo (Kennelly y cols., 2011).

En el hgado, las clulas cebadas secretan varios mediadores que promueven

el crecimiento y la proliferacin de los fibroblastos y que estimulan la produccin de

protenas de la matriz extracelular por los fibroblastos y las clulas estrelladas

(Takeshita y Shibayama 2005). De hecho, existe una correlacin positiva entre el

grado de acumulacin de clulas cebadas y la extensin del depsito de matriz en

pacientes con hepatopatas crnicas (Farrel y cols. 1995). Incluso en la actualidad se

considera que la proliferacin ductular biliar, unido a la fibrosis y a la infiltracin

heptica por clulas cebadas son los cambios caractersticos de la hepatopata

colestsica (Takeshita y Shibayama 2005).

Se ha comprobado que la degranulacin de las clulas cebadas est implicada

en la disrupcin de los complejos motores celulares secundaria a la accin de la

colecistoquinina, por lo tanto, las clulas cebadas estn activamente implicadas en el

control fisiolgico y patolgico de la motilidad intestinal (Saavedra 2003), as como

en la permeabilidad de la mucosa intestinal, en la adherencia bacteriana a la mucosa

y en el inicio de la inflamacin intestinal.

En el hgado colestsico se produce la infiltracin por clulas inflamatorias

(monocitos, neutrfilos, clulas cebadas), en parte como consecuencia de

I-INTRODUCCIN

56

traslocacin bacteriana intestinal. Sin embargo, el origen de la respuesta inflamatoria

podra estar localizada en los propios colangiocitos, que sufren tanto la hiperpresin

biliar y el efecto txico de los cidos biliares, como la posible isquemia secundaria a

la compresin del plexo arterial peribiliar (Nakamura y cols. 1997; Gaudio y cols.

2006; Allen y cols., 2011). En ste sentido, la respuesta inflamatoria inicial en los

colangiocitos estimulara su proliferacin, activara las clulas hepticas que poseen

capacidad proinflamatoria (clulas de Kupffer y macrfagos), inducira la

angiognesis secundaria a la isquemia arterial, favorecera la infiltracin portal por

leucocitos y, finalmente promovera la fibrognesis.

Las clulas cebadas participan en el desarrollo de fibrosis heptica, tanto en

roedores como en el ser humano (Armbrust y cols. 1997; Matsunaga y cols. 1999).

La ligadura del coldoco en la rata, un modelo de fibrosis heptica (Kountouras y

cols. 1984), cursa con un aumento de las clulas cebadas en el hgado (Mori y cols.

1966; Rioux y cols. 1996). Sin embargo, todava se desconoce el mecanismo por el

cual las clulas cebadas participan en el desarrollo de fibrosis. Ya que la ligadura del

coldoco en la rata produce una inflamacin heptica (Ramadori y Saile, 2004a) y

muchos mediadores liberados por las clulas cebadas son pro-inflamatorios (Galli y

cols. 2005; Metz y cols. 2007; Theoharides y cols., 2012), se podra especular que la

activacin de las clulas cebadas influira en la fibrosis heptica en el contexto de

una respuesta inflamatoria crnica. En este sentido, la fibrosis asociada a la

remodelacin tisular, ambas mediadas por los mastocitos, podran ser una de las

principales consecuencias de la inflamacin heptica crnica (Bachelet y cols. 2006;

Metz y cols. 2007). Por ello, se ha sugerido que la fibrognesis heptica se asemeja a

un proceso de cicatrizacin (Ramadori y Saile, 2004a; Ramadori y Saile, 2004b;

Aller , 2008).

Las interacciones entre las clulas cebadas y los fibroblastos son

fundamentales en la gnesis de la fibrosis (Gruber, 2003; Albrecht y cols. 2005). Las

clulas cebadas pueden comunicarse con los fibroblastos, lo cual induce su

activacin y la subsiguiente modulacin de algunos aspectos de la fibrosis (Albrecht

y cols. 2005; Au y cols. 2007). Sin embargo, los resultados de un estudio que

utilizaba ratas Ws/Ws, deficientes en clulas cebadas, sugiri que un aumento de

clulas cebadas en el hgado podra estar asociado con fibrosis, pero que no era la

I-INTRODUCCIN

57

causa (Sugihara y cols., 1999). Adems, las clulas cebadas deben participar en la

fibrinolisis produciendo MMP-1 en los estados tardos, tanto de la fibrosis como de

la cirrosis experimental (Jeong y cols., 2002). Ya que las terapias efectivas de la

cirrosis heptica deben estar basadas en la comprensin de su patogenia (Friedman,

2007), un mejor conocimiento de sta accin dual, pro- y anti-fibrognica de las

clulas cebadas en la fibrosis biliar experimental sera de gran inters.

Las clulas cebadas en el hgado fibrtico pueden adems estar implicadas en

la arterializacin heptica ya que la estructura de los sinusoides cambia y es similar

a la de los capilares (Zimmermann y cols., 1999). Este cambio se denomina

capilarizacin sinusoidal y las clulas cebadas pueden ser elementos clave en ste

proceso de transformacin de las clulas endoteliales sinusoidales en clulas

endoteliales de tipo capilar (Zimmermann y cols., 1999; Franceschini y cols., 2006).

La capilarizacin altera el intercambio fisiolgico entre el plasma y los hepatocitos y

es la causa principal del empeoramiento de la funcin heptica (Zimmermann y cols.,

1999).

La hiperplasia de las clulas cebadas se asocia con la proliferacin biliar

durante la colestasis extraheptica (Takeshita y Shibayama, 2005; Franceschini y

cols., 2006). Este hallazgo sugiere que la acumulacin de clulas cebadas en las

tradas portales puede estar implicado en la proliferacin biliar. La recanalizacin del

coldoco previamente ligado comporta un incremento brusco y transitorio del

nmero de clulas cebadas, que se asocia con un rpido aumento del nmero de

clulas epiteliales biliares apoptticas. As, las clulas cebadas intersticiales

hepticas pueden estar implicadas en la remodelacin heptica mediante la induccin

de apoptosis (Takeshita y Shibayama, 2005).

Por lo tanto, se podra especular que el papel de las clulas cebadas en la

colestasis extraheptica experimental es doble, es decir, que cambia a lo largo de la

evolucin del hgado colestsico. En fases evolutivas precoces las clulas cebadas

participaran en el proceso proinflamatorio que induce la proliferacin biliar y la

fibrognesis (Rioux y cols., 1996). Sin embargo, la colestasis prolongada al

modificar el medio ambiente inducira un cambio en el fenotipo de los mastocitos,

promoviendo la fibrolisis al inducir metaloproteasas y, subsiguientemente la

I-INTRODUCCIN

58

degradacin de la matriz (Jeong y cols., 2002). Este supuesto papel protector y

antifibrtico de las clulas cebadas en la colestasis crnica explicara el incremento

persistente de su nmero durante la produccin de fibrosis y/o cirrosis heptica, que

se asocia con un marcado descenso de miofibroblastos y de macrfagos en las

regiones periportales (Jeong y cols., 2002). Las clulas cebadas, debido a su

localizacin periportal, induciran la apoptosis del epitelio biliar reduciendo la

apoptosis hepatocitaria y ste puede ser otro mecanismo por el cual las clulas

cebadas inducen una actividad antifibrognica, as como la preservacin de los

hepatocitos (Canbay y cols., 2004; Ghavami y cols., 2005).

Al corregir el imbalance epitelial producido por la colestasis entre los dos

tipos de clulas epiteliales hepticas, biliar (proliferacin) y hepatocitario

(apoptosis), los mastocitos intentaran limitar la fibrosis caracterstica de la

inflamacin heptica crnica. Estas acciones protectoras pueden ser asumidas en

algunas circunstancias por las clulas cebadas que protagonizaran entonces el

control de la inflamacin (Kinet, 2007). La hiperexpresin de citoquinas

proinflamatorias por los colangiocitos colestsicos tambin podra regular tanto las

alteraciones en la secrecin biliar (Geier y cols., 2003) como la supervivencia de los

propios colangiocitos (Wolf y Vierling 1993).

La ligadura del coldoco en la rata causa la proliferacin biliar con

elongacin del rbol biliar, as como su ramificacin (Nakanuma y cols., 1997;

Masyuk y cols., 2001). A su vez, la proliferacin biliar induce la proliferacin

vascular o angiognesis. La va biliar se rodea de un plexo vascular arterial que

procede de las ramas de la arteria heptica (Nakamura y cols., 1997). Durante el

desarrollo embrionario las clulas epiteliales biliares migran a travs del mesnquima

y se transforman en tbulos durante el estado de formacin de la va biliar

intraheptica (Roberts y cols., 1997). A su vez, el plexo vascular arterial peribiliar se

desarrolla y madura en relacion con el tracto biliar. Sin embargo, en tanto la va biliar

madura, el plexo vascular periarterial permanece inmaduro y contina proliferando

hasta que alcanza su madurez a lo largo de la vida postnatal (Nakamura y cols.,

1997). En la colestasis extraheptica la proliferacin biliar tambin parece preceder a

la proliferacin vascular (Gaudio y cols., 2006). Trs la ligadura del coldoco en la

rata la proliferacin de colangiocitos es un proceso rpido que consigue ocupar el

I-INTRODUCCIN

59

30% del total de las clulas hepticas, en tanto que en el hgado normal los

colangiocitos representan el 2% de la masa celular heptica (Alvaro y cols., 2006).

La proliferacin de colangiocitos es modificada por neuropptidos, factores de

crecimiento y hormonas. En particular, el factor de crecimiento de endotelio vascular

(VEGF) protagoniza la hiperplasia ductular. VEGF-A y VEGF-C aumentan en los

conductos biliares de ratas con ligadura del coldoco ya que que pueden ser

secretados por los colangiocitos (Gaudio y cols., 2006). Puesto que VEGF tambin

regula la angiognesis, parece lgico suponer que los colangiocitos proliferantes

controlan, mediante la liberacin de VEGF, la formacin de un plexo vascular que

suministre sangre para cubrir las demandas funcionales del epitelio biliar

intraheptico proliferante (Gaudio y cols., 2006)

La inflamacin de origen biliar tambin puede inducir la apoptosis de los

hepatocitos. La hiperproduccin de citoquinas (TNF-) se ha asociado a la apoptosis

hepatocitaria (Ding y Yin, 2004). En los sndromes colestsicos destaca la activacin

del factor de transcripcin NF-B ya que las elevadas concentraciones de cidos

biliares en los hepatocitos activan NF-B (Miyoshi y cols., 2001; Zollner y cols.,

2005). La activacin de NF-B, a su vez, promueve la expresin de ligandos

asociados a muerte celular por las clulas de Kupffer, como Fas y TNF, que son

citotxicos para el hgado (Nanji y cols., 1999; Ding y cols., 2004; Malhi y cols.,

2006).

Las clulas progenitoras de clulas hepticas clulas madre tambin podran

desempear un importante mecanismo en la proliferacin biliar. En lesiones

hepticas por D-Galactosamina la regeneracin del hgado ocurre a expensas de

clulas epiteliales biliares, denominadas clulas ovales, que derivan probablemente

de los canales de Hering. Ya que las clulas biliares que proliferan expresan -1-

fetoprotena, esta reactivacin de genes fetales ha planteado la existencia de un

proceso de retrodiferenciacin en la colestasis (Kuhlmann y Peschke 2006).

En la colestasis extraheptica la alteracin heptica predominante es la

marcada proliferacin ductular con una infiltracin inflamatoria portal moderada y

apoptosis hepatocitaria (Snchez-Patn y cols., 2008), constituyendo un modelo

I-INTRODUCCIN

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experimental de fibrosis biliar a largo plazo (Aube y cols., 2007; Snchez-Patn y

cols., 2008).

La fibrosis heptica post-ligadura del coldoco en roedores es la consecuencia

de un proceso inflamatorio de origen biliar (Kerhenobich y Weissbrod, 2003; Li y

Crawford, 2004). La fibrosis heptica es la acumulacin excesiva de protenas de la

matriz extracelular entre las que se incluye el colgeno (Bataller y Brenner, 2005;

Rockey 2006; Gressner y cols., 2007). Un concepto fundamental respecto de la

etiopatogenia de la fibrosis heptica es que ste proceso representa una respuesta de

cicatrizacin por parte del organismo frente a otra agresin que es similar a la

respuesta de otros rganos a una agresin recurrente (Rockey, 2006; Aller y cols.,

2008; Aller y cols., 2010c)

El estrs oxidativo y enzimtico y la infiltracin por clulas inflamatorias en

la colestasis obstructiva experimental podran estar implicados en la patogenia de la

proliferacin de clulas epiteliales biliares y en la reduplicacin y ramificacin de los

conductos y conductillos biliares (Kilicoglu y cols., 2008). As, se ha sugerido que el

efecto hepatoprotector de la miel en ratas con ligadura del coldoco podra ser

secundario a sus actividades antioxidante y anti-inflamatoria (Kilicoglu y cols.,

2008).

Una intensa proliferacin biliar en los espacios porta caracteriza a la

colestasis extraheptica microquirrgica a largo plazo en la rata. Los conductos

biliares proliferantes invaden las zonas 1 y 2 del acino de Rapapport, pero no la zona

3 o pericentral (Aller y cols., 2004) y sta es la razn de que sea considerada una

proliferacin atpica (Alvaro y cols., 2007).

En esencia, la respuesta fisiopatolgica del hgado cuando se alteran tanto el

flujo biliar (colestasis extraheptica) com