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UNIVERSIDAD DE COLIMA.
FACULTAD DE MEDICINA.
“PRESENCIA DE LA MUTACIÓN Ala53Thr CAUSANTE DE PARK1, EN FAMILIAS DE COLIMA CON LA ENFERMEDAD DE PARKINSON
AUTOSÓMICO DOMINANTE”.
Tesis para obtener el grado de Maestro en Ciencias Médicas.
Que presenta el Médico Cirujano y Partero ROBERTO ACEVES THEMSEL.
ASESOR CLÍNICO: DRA. REBECA O. MILLAN GUERRERO. ASESOR BÁSICO: DRA. LUZ MARGARITA BALTAZAR. COASESOR: DR. IVAN DELGADO ENCISO.
Colima, Col. 05 de Diciembre del 2005
INDICE GENERAL.
Página Abstract. 1 Resumen. 2 Introducción. 3 Justificación. 14 Planteamiento del problema 15 Objetivos. 15 Diseño del Estudio. 15 Universo de trabajo. 15 Criterios de Inclusión, de Exclusión y de Eliminación. 15 Variables. 16 Procedimiento. 17 Resultados. 18 Discusiones. 26 Conclusiones. 29 Anexo 1. 30 Anexo 2. 31 Anexo 3. 32 Anexo 4. 34 Anexo 5. 36 Bibliografía. 37
INDICE DE TABLAS, FIGURAS Y GRÁFICOS. Página.Figura 1 Componentes básicos de la anatomía cerebral. 3
Figura 2. Pieza anatómica del mesencéfalo. 4
Figura 3 Cuerpos de Lewy. 4
Figura 4 Mecanismos de neurodegeneración en la enfermedad de
Parkinson. 6
Tabla 1 Genes involucrados en la enfermedad de Parkinson familiar 10
Tabla 2 Características generales de las mutaciones asociadas a la herencia autosómica dominante.
12
Tabla 3 Datos generales de los pacientes. 19
Figura 5 Árbol genealógico de la familia 1 20
Figura 6 Árbol genealógico de la familia 2. 21
Figura 7 Árbol genealógico de la familia 3. 22
Tabla 4 Frecuencias de la escala UPDRS. 23
Tabla 5 Análisis de medias edad contra síntomas. 23
Grafica 1 Regresión lineal edad contra síntomas. 24
Grafica 2 Regresión lineal edad de inicio contra síntomas. 24
Figura 8 Patrón de electroforesis en agarosa al 2% de la digestión de los productos de la reacción en cadena de la polimerasa con la enzima Tsp45I.
26
1
Abstract.-
Introduction: The autosomal dominant Parkinson disease, is a variant of the
Parkinson disease that is transmitted through the different generations, pronouncing
itself to earlier ages and with difficulty for its medical checkup. Mutation Ala53Thr
(associated to familial Parkinson disease type 1 or PARK1) in exon 4 of the gene of
the alpha-synuclein has been identified. The individuals with mutation Ala53Thr show
a clinical picture characteristic of the Parkinson disease being the early presentation
and the fast progression of the disease. A cause rare of the Parkinson disease is
considered.
Objective: To identify the prevalence of mutation Ala53Thr in families of Colima on
with autosomal dominant Parkinson disease.
Material and Methods: A neurological study was made to determine the disease and
its evolution, was made a genealogical tree to determine the pattern of inheritance of
the disease, and look for mutation A53T in the region 4q21.3 by means of the
technique of chain reaction of the polymerase and digestion with the Tsp45I
endonuclease.
Results: Were 3 families with Parkinson disease, a pattern of autosomal dominant
inheritance, and clinical characteristics that agree with the reported ones in patients
with mutation Ala53Thr. No member of the studied families presented the Ala53Thr
mutation.
Conclusion: In our families with familiar Parkinson disease of the state of Colima,
mutation Ala53Thr associated to PARK1 it was not identified, it is probable that other
mutations in the alpha-synuclein gene or other genes are altered and we must look
for them.
2
Resumen.-
Introducción: La enfermedad de Parkinson autosómica dominante, es una variante
de la enfermedad de Parkinson que se transmite a través de las diferentes
generaciones, manifestándose a edades más tempranas y con dificultad para su
control médico. Ha sido identificada la mutación Ala53Thr (asociada a la enfermedad
de Parkinson familiar tipo 1, PARK1) en el exon 4 del gen de la alfa-sinucleina. Los
individuos con la enfermedad PARK1 manifiestan un cuadro clínico característico de
la enfermedad de Parkinson siendo los más representativos el inicio temprano y la
rápida progresión de la enfermedad. Es considerada una causa rara de la
enfermedad de Parkinson.
Objetivo: Identificar la prevalencia de la mutación Ala53Thr en familias de Colima
con enfermedad de Parkinson autosómica dominante.
Material y Métodos: Se realizó un estudio neurológico para determinar la
enfermedad y su evolución, se hizo un árbol genealógico para determinar el patrón
de herencia de la enfermedad, y se busco la mutación A53T en la región 4q21.3
(PARK1) mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa y digestión con
la endonucleasa Tsp45I.
Resultados: Se encontraron 3 familias con la enfermedad de Parkinson autosómica
dominante y sus características clínicas concuerdan con las reportadas en pacientes
con la mutación Ala53Thr. Ningún miembro de las familias estudiadas presentó dicha
mutación.
Conclusión: En nuestras familias con Parkinson Familiar del estado de Colima, la
mutación Ala53Thr asociada a PARK1 no se identificó, es probable que otras
mutaciones en el gen de la alfa-sinucleina o en otros genes se encuentren alterados
y debemos buscarlas.
3
Introducción.-
Generalidades sobre la enfermedad de Parkinson.-
La enfermedad de Parkinson (EP) es la segunda enfermedad neurodegenerativa
más común después de la enfermedad de Alzheimer. Afecta principalmente a la
población mayor de 55 años y mientras continúan las expectativas de vida, el total de
pacientes con EP se incrementa. (1). Fue descrita en 1817 por James Parkinson, un
médico británico que publicó una ponencia sobre lo que él llamó "la parálisis agitante"
(2). En ese documento expone los síntomas principales de la enfermedad que
posteriormente llevaría su nombre. Normalmente las neuronas que se encuentran en
la Sustancia Nigra, producen un neurotransmisor conocido como dopamina, la cual
es responsable de transmitir las señales nerviosas entre la Sustancia Nigra y la
siguiente "estación de relevo" del cerebro el llamado Corpus Striatum. La pérdida de
dopamina hace que las células nerviosas del Striatum actúen sin control, dejando a
los pacientes incapaces de dirigir o controlar sus movimientos de forma normal (2).
(Figura 1)
Figura 1. Componentes básicos de la anatomía cerebral. Fuente: www.institutobiologico.com/ neuroestimulo.htm
4
En la enfermedad de Parkinson las neuronas productoras de dopamina, localizadas
en la Pars Compacta de la Sustancia Nigra, mueren o presentan degeneración, con
una pérdida de hasta un 80%. (Figura 2)
Figura 2. Pieza anatómica del mesencéfalo. Del lado derecho se observa la sustancia nigra en los pedúnculos cerebrales y en el lado izquierdo existe palidez de los pedúnculos, por pérdida de la misma. Fuente: med.javeriana.edu.co/ fisiologia/fw/c56.htm
En el estudio histopatológico de cerebro de enfermos con Parkinson, se observan
corpúsculos de inclusión intracitoplasmáticas eosinofílicos denominados cuerpos de
Lewy (7).(Figura 3)
Figura 3. Cuerpos de Lewy. Características diferenciales entre un los cerebros de un paciente
normal y uno con enfermedad de Parkinson, y sus respectivas características de los cuerpos de Lewy. Fuente: Christophe Lo Bianco. www.wissenschaft-online.de/abo/ticker/766724
5
A nivel mundial, la prevalencia de la EP es de aproximadamente el 1% entre las
personas de 55 a 65 años de edad, incrementándose al 4-5% a partir de los 85 años
(1-5). En Estados Unidos existen entre 500000- 1000000 pacientes con esta
enfermedad. En México, la prevalencia de la EP se sitúa en un rango de media a
baja: 50-100 por 100,000 habitantes (6).
Teorías sobre el inicio de la enfermedad de Parkinson.-
Existen dos teorías propuestas para el desarrollo la enfermedad de Parkinson. Se
desconoce cual de ellas ocurre primero, pero al iniciar una, se forma un circulo
vicioso que desencadena la presencia del siguiente proceso.
1. Teoría de Correlación Neuroquímica
Las neuronas de la Sustancia Nigra presentan degeneración selectiva, a través de la
producción del metabolito oxidativo (MPP+) (1-metil-4-fenilpiridinium) a partir del
1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MTTP). (1,3) El metabolito MPP+ es
capturado activamente por las neuronas dopaminérgicas mediante los
transportadores de Dopamina y se concentra en su interior, desencadenándose un
mecanismo de muerte neuronal, ya que el MPP+ inhibe el complejo I de la cadena
transportadora de electrones de la mitocondria; también inhibe el complejo
alfa-cetoglutarato deshidrogenasa de el Ciclo de Krebs. Las mutaciones patogénicas
pueden inducir directamente conformaciones anormales de proteínas (como se cree
sucede en el caso de la alfa-sinucleina) o dañar la habilidad de la maquinaria celular
para detectar y degradar proteínas desdobladas (Parkin, UCH-L1); el papel de la
DJ-1 todavía esta en estudio. (ver figura 4)
2. Teoría sobre el Estrés Oxidativo.
El estrés oxidativo es una condición en la cual se incrementa la producción de
especies activas del oxígeno, tales como aniones superóxido y radicales hidroxil.
También hay un incremento en la actividad de la enzima super oxido dismutasa
(SOD); se aumenta la peroxidación lipídica y hay un decremento en nivel de la forma
reducida de glutathione. Los radicales hidroxil inducen reacciones en cadena que son
6
adversas, produciendo peroxidación lipídica, ligaciones cruzadas de proteínas y
daños en el ácido desoxirribonucleico (ADN), mediados por la oxidación de guanina
en la 8-hidroxiguanina (la cual es leída como adenina durante el proceso de
replicación, induciendo el cambio del par GC por el par AT). (1,3) (ver figura 4)
Figura 4. Mecanismos de neurodegeneración en la enfermedad de Parkinson. Mientras que el daño oxidativo y la disfunción mitocondrial son considerados como dos mecanismos que se encuentran presentes, se ha sugerido que la acumulación de proteínas “desdobladas”, puede ser un evento clave en la neurodegeneración en la enfermedad de Parkinson. pero sin determinar el mecanismo desencadenante Las mutaciones patogénicas pueden inducir directamente conformaciones anormales de proteínas (como se cree sucede en el caso de la alfa-sinucleina) o dañar la habilidad de la maquinaria celular para detectar y degradar proteínas desdobladas (Parkin, UCH-L1); el papel de la DJ-1 todavía esta en estudio. Fuente: Dauer, W., Przedborski S., Parkinson´s Disease: Mechanisms and Models. Neuron, 39: 889-909, 2003
7
Mecanismos fisiopatológicos de la alfa-sinucleina en la enfermedad de Parkinson
autosómica dominante.-
La alfa-sinucleina es una proteína de 140 aminoácidos, Se encuentra en numerosas
regiones cerebrales (Néocortex, Hipocampo, Gyrus Dentado, Bulbo Olfativo,
Striatum, Tálamo, Cerebelo) principalmente en las terminaciones sinápticas. Su
función dista mucho de aclararse. In vivo, la alfa-sinucleina está altamente
relacionada con las vesículas sinápticas. In vitro, se asocia con vesículas de
fosfolípidos sintéticos o purificadas en el cerebro. Esta interacción se efectúa por
medio de la región terminal amino y podría ser alterada por los cambios Ala30Pro y
Ala53Thr (7)
La alfa-sinucleina inhibe de manera selectiva las fosfolipasas D1 y D2, enzimas de
las membranas cuya actividad de hidrólisis de fosfolípidos se regula por una serie de
proteínas efectoras indispensables para los fenómenos de endocitosis. Estos datos
sugieren un papel principal de alfa-sinucleina en el reciclaje de vesículas sinápticas.
La toxicidad de la alfa-sinucleina parece estar en relación con su tendencia a formar
fibrillas de tipo amiloideo; la presencia de éstas ocasionaría la neurodegeneración
observada tanto en los síndromes parkinsonianos debidos a los cambios del gen de
la alfa-sinucleina como en la enfermedad de Parkinson idiopatica o en la demencia
con cuerpos de Lewy. (7)
Algunos estudios sugieren que la dopamina es responsable de la vulnerabilidad de
las neuronas dopaminérgicas a la acumulación de la alfa-sinucleina, debido al
metabolismo fisiológico de la dopamina; lo que podría volver a las neuronas
dopaminérgicas especialmente vulnerables a una situación de tensión oxidante. La
autooxidación química de la dopamina y su catabolismo por la monoaminooxidasa B
conducen a la producción de radicales libres tóxicos. Hay teorías que sugieren
también que un producto de oxidación de la dopamina estabiliza "in vitro" a las
protofibrillas de la alfa-sinucleina, impidiendo la producción de fibrillas insolubles.
Estas protofibrillas podrían ser las causantes de sus efectos neurotóxicos y su
selectividad por las neuronas dopaminérgicas.
La asociación de estas protofibrillas en las vesículas de fosfolípidos conduce a la
formación a verdaderos poros en las membranas celulares de las neuronas de las
8
Sustancia Nigra. Favorecida por los cambios Ala30Pro y Ala53Thr, la formación de
estos poros conduciría a la liberación de moléculas de pequeño tamaño, como de la
dopamina. Otro mecanismo que se activa es la producción de radicales libres que
aparecen después de la autooxidación de la dopamina (que se produce cuando este
neurotransmisor se acumula de manera anormal en el citoplasma) lo que podría
desempeñar un papel crucial en la patogenia de la enfermedad de Parkinson. (7)
Clasificación de la enfermedad de Parkinson.-
La enfermedad de Parkinson se clasifica en:
1. Esporádica o Ideopática. Cuando la enfermedad de Parkinson se
presenta por arriba de los 55 años, y no hay antecedentes familiares de la
enfermedad. Existe la sintomatología característica de ella y su evolución es
insidiosa.
2. Familiar. Es aquella en la existen antecedentes familiares de la enfermedad
de Parkinson. Puede tener herencia autosómica dominante o herencia
autosómica recesiva. 3. Toxicológica. Se presenta cuando el enfermo estuvo en contacto
permanente con sustancias químicas (como algunos insecticidas). 4. Farmacológica. Asociada al uso de algunos medicamentos. 5. Parkinson plus. Es la presencia de enfermedades en donde se puede
encontrar Parkinson asociado a otras entidades neurológicas.
Factores genéticos asociados a la enfermedad de Parkinson.-
En cerca del 85% de los casos de la enfermedad de Parkinson, aparentemente no
hay herencia genética y es referido como Parkinson esporádico. En los casos
restantes, se hereda la enfermedad. Este rasgo de herencia bien puede ser
autosómico dominante o recesivo.(1,3,4) (ver figura 3)
Los primeros estudios en donde se busca la herencia en la enfermedad de Parkinson
fueron realizados por Golbe en 1990 (8,9), cuando reporto dos grandes familias
originarias de Contursi, una villa en la provincia de Palermo en Italia, en la cual 4
individuos en 4 generaciones presentaron la enfermedad de Parkinson con un patrón
de herencia autosómica dominante. La transmisión varón-varón ocurrió y la
9
penetrancia fue estimada en el 96%. En ellos la enfermedad se caracterizaba por la
aparición temprana (alrededor de los 46.5 años) y una rápida progresión (en
promedio 9.7 años hasta la muerte). La aparición clínica y la respuesta a la levodopa
fue típica de la enfermedad de Parkinson.
En 1996 Golbe (10) reportó 60 individuos afectados en 5 generaciones,.siendo las
características clínicas el retardo en la aparición, el tremor y la respuesta a la
levodopa, lo que sugirió una mutación que pudo producir un fenotipo heterogéneo de
la enfermedad de Parkinson.
En 1996 Polymeropoulus (11) perfeccionó una exploración de marcadores genéticos
en un gran grupo de italianos emparentados reportados por Golbe (10). El ligamiento
de los marcadores en la región 4q21-q23 fue encontrado con una puntuación de Lod
máximo de 6.00 y una fracción recombinante theta=0.00 para el marcador D4s2380.
Este hallazgo identificó a la enfermedad de Parkinson familiar tipo 1, PARK1 o
enfermedad de Parkinson autosómico dominante con cuerpos de Lewy con una
ubicación específica en el cromosoma 4, brazo q, área 21 (4q21.3). La característica
principal de esta enfermedad de Parkinson es la mutación en el gen de la alfa-
sinucleina (SNCA).
Existen por lo menos 2 mutaciones en el gen de la alfa-sinucleina:
1.- Mutación Ala53Thr, que es resultante de una transición de G---A en la posición
209. Esta mutación fue encontrada en los Contursi y en muchos griegos, fue la
primera reconocida como responsable de una forma rara de la enfermedad de
Parkinson; transmitiéndose a través de un patrón autosómico dominante. Los
pacientes portadores de esta mutación presentaron la enfermedad de Parkinson de
manera severa, donde el inicio se presentó entre la 4ta y la 6ta década de la vida.
2.- Mutación Ala30Pro, que resulta de la transición de G---C en la posición 88,
identificada en un grupo de origen Alemán con consanguinidad.
En la enfermedad de Parkinson se considera que entre el 13 y 15% de casos existe
el tipo de Parkinson familiar, asociada a herencia autosómica dominante o recesiva.
En la enfermedad de Parkinson autosómica dominante se han realizado infinidad de
10
estudios en los diferentes grupos étnicos buscando las diferentes mutaciones que
están asociadas a esta enfermedad, siendo la mutación Ala53Thr la más estudiada.
Esta mutación ha sido encontrada en poblaciones con descendencia italiana y griega
en 13 familias ; pero en la población japonesa, francesa, americana, española,
inglesa no se encontró esta mutación. La mutación Ala30Pro se ha encontrado en
algunas familias de descendencia alemana y en algunos griegos Se ha observado
que las mutaciones en el gen de la alfa-sinucleina pueden ser una causa rara para la
enfermedad de Parkinson. (7-20)
Existen otros genes que también están involucrados en el desarrollo de la
enfermedad de Parkinson, los cuales son descritos en la tabla 1. Tabla 1. Genes involucrados en la enfermedad de Parkinson familiar
Locus. Localización en el cromosoma.
Gen. Modo de transmisión. Edad de inicio.
Frecuen-cia *
PARK1 4q21.3 alfa-sinucleina. SCNA
autosómico dominante. >> 45 ( 20-85 años)
15
PARK2 6q25.2-27 Parkin. autosómico recesivo. Precoz (3-64 años)
>100
PARK3 2p13 desconocido. autosómico dominante. 59 (37-89 años)
6
PARK4 4p15 desconocido. autosómico dominante. 33 años 1 PARK5 4p14 UCH-L1 autosómico dominante. 50 años 1 PARK6 1p35-p36 PINK1. autosómico recesivo. >> 40 ( 30-
68 años) 9
PARK7 1p36 DJ-1 autosómico recesivo. >> 33 ( 27-40 años)
2
PARK8 12p11.2-q13.1 LRRK2 autosómico dominante. 51 1 PARK9 1p36 desconocido. autosómico recesivo. ? ? PARK10 1p32 desconocido. gen de susceptibilidad de
aparición tardía. ? ?
Características generales de cada uno de los tipos de los genes asociados a la enfermedad de Parkinson familiar. Fuente: 1. Dawson Ted M., Dawson Valina L., Rare genetic mutations shed light on the phatogenesis of Parkinson disease. J. Clin. Invest. 111:145-151, 2003. 2. Corti O, Brice A. Parkinson's disease: what have we learned from the genes responsible for familial forms?] Med Sci (Paris). 2003 May;19(5):613-9. * Número de Familias.
11
12
Cuadro clínico de la enfermedad de Parkinson.-
La enfermedad de Parkinson pertenece a un grupo de condiciones llamadas
desórdenes del sistema motor, las cuales son crónicas y neurodegenerativas.
La sintomatología característica de la enfermedad es la triada de temblor, rigidez y
bradicinecia, agregándose además otros datos clínicos (1,3):
1.- Tremor. Ocurre en reposo, pero disminuye con los movimientos voluntarios.
2.- Rigidez. Resistencia incrementada al movimiento pasivo.
3.- Bradicinecia. Lentitud de movimientos.
4.- Hipocinecia. Reducción en la amplitud de los movimientos.
5.- Acinesia. Ausencia de movimientos inconscientes normales.
6.- Hipomimia. Disminución de la expresión facial normal.
7.- Micrografia. Tamaño disminuido al escribir y lentitud al escribir.
8.- Pérdida de reflejos posturales.
9.- Freezing. Pérdida de la habilidad de iniciar un movimiento voluntario.
10.- Afecto anormal.
11.- Anormalidades para aprender.
12.- Bradifrenia. Procesos cognitivos lentos.
13.- Depresión. Mas observada en ancianos.
14.- Demencia. Que se presenta solo en algunos casos.
Esta sintomatología, es importante para establecer el diagnóstico adecuado de la
enfermedad de Parkinson, y se ha establecido un cuestionario por la Asociación
Británica de estudio de la enfermedad de Parkinson, el UPDRS (Unified Parkinson
Disease Rating Scale). El UPDRS es un sistema de clasificación para seguir el curso
longitudinal de la enfermedad del Parkinson. Consta de las siguientes secciones:
1. Estado mental, conducta y humor
2. Actividades de la vida diaria (AVD)
3. Sección motora
Éstas son evaluadas mediante una entrevista. Algunas secciones requieren múltiples
grados asignados a cada extremidad. La cantidad total de puntos puede ser 199,
donde 199 representa incapacidad total y 0 ninguna incapacidad. (Anexo 3).
13
Existen diferencias entre la sintomatología presentada en la enfermedad de
Parkinson esporádico, las mediadas por factores genéticos (varia la presencia de
algunos síntomas, edad de inicio, progresión y presencia de demencia), por
sustancias químicas (dependiendo del tiempo de exposición y de la sustancia a la
que se expuso, es la progresión de la enfermedad), por medicamentos (que remiten
generalmente al suspender los medicamentos), y en Parkinsonismo plus (que se
pueden encontrar diversas entidades neurológicas con sus sintomatologías
características), lo cual condiciona que la enfermedad de Parkinson sea una
enfermedad sumamente compleja de identificar, diagnosticar y tratar.
En la enfermedad de Parkinson autosómico dominante, se encuentran 5 diferentes
cuadros clínicos de acuerdo al tipo de gen que esta involucrado, tal y como se
observa en la Tabla 2.
Tabla 2. Características generales de las mutaciones asociadas a la herencia autosómica dominante.
Denominación. Locus. Gen Fenotipo. PARK1 4q21-q23 alfa-sinucleina EP típica.
Inicio joven. Rápida progresión
PARK3
2p13 desconocido EP típica. Comienzo variable. Progresión lenta.
PARK4 4p15
desconocido. EP típica. Temblor esencial. Demencia.
PARK5 4p14-p15.1
UCH-L1 EP típica. Temblor variable. Inicio joven. Rápida progresión
PARK8 12p11.2-q13.1 desconocido. EP típica. Comienzo variable.
Fuente: Dawson Ted M., Dawson Valina L., Rare genetic mutations shed light on the phatogenesis of Parkinson disease. J. Clin. Invest. 111:145-151, 2003
14
En la ciudad de Colima, no existe una prevalencia descrita de la enfermedad de
Parkinson idiopática o Parkinson familiar; sin embargo en los servicios de Neurología
del Sector Salud como SSA, IMSS e ISSSTE se cuenta con registros que muestran
una frecuencia de Parkinson ideopático similar a la de nivel mundial y se espera un
aumento de la prevalencia de la enfermedad ya que también ha aumentado la
esperanza de vida en nuestro país.
En el Hospital General de Zona # 1 del IMSS desde 1987 tenemos el registro de
pacientes con enfermedad de Parkinson familiar que tienen a varios miembros de su
familia afectados; se ha llevado un seguimiento y control clínico de la enfermedad y
el motivo del siguiente trabajo fue estudiar la enfermedad desde un punto de vista
genético, buscando por las características del grupo estudiado, la mutación Ala53Thr
(característica del PARK1) que es la más frecuente en el gen de la alfa-sinucleina.
15
Justificación.-
La enfermedad de Parkinson es una enfermedad neurológica degenerativa, la cual
afecta la calidad de vida de los pacientes que la poseen, ya que se trata de una
enfermedad discapacitante. La variedad esporádica de esta enfermedad se
encuentra en aumento por mayor esperanza de vida de la población. El
descubrimiento de los genes para la enfermedad de Parkinson renovó el interés
sobre esta enfermedad para la búsqueda de factores hereditarios y de
susceptibilidad a nivel mundial.
La enfermedad de Parkinson familiar tipo 1, o PARK1, originada por la mutación
Ala53Thr en el exón 4 del gen de la alfa-sinucleina, se presenta con la sintomatología
característica de temblor en reposo, rigidez y bradicinecia, con la variante de que su
edad se inicia desde los 20 años con una progresión rápida. Las características
utilizadas para ubicar a los pacientes dentro de este tipo son: edad de inicio, cuadro
clínico y herencia autosómica dominante.
Tomando los criterios arriba mencionados, las tres familias aquí estudiadas son
compatibles clínicamente con la enfermedad de Parkinson familiar tipo 1 o PARK1
por lo es importante buscar la mutación Ala53Thr como la condicionante de esta
enfermedad.
Identificando los factores genéticos relacionados con la enfermedad de Parkinson en
estas familias podríamos brindar un diagnóstico temprano, un manejo inicial
temprano, y un asesoramiento genético adecuado para nuestros pacientes y sus
familiares expuestos a esta enfermedad.
16
Planteamiento del problema.-
¿Se encuentra presente la mutación Ala53Thr causante de PARK1 en familias de
Colima con enfermedad de Parkinson autosómica dominante?
Objetivo.-
Identificar la prevalencia de la mutación Ala53Thr, causante de PARK1, en familias
de Colima con enfermedad de Parkinson autosómica dominante.
Material y Métodos.-
Diseño del Estudio.-
Descriptivo transversal. Universo de trabajo.-
Pacientes del servicio de neurología del HGZ UMF No 1 IMSS con diagnóstico de
enfermedad de Parkinson autosómico dominante y sus familiares.
Criterios de Inclusión, de Exclusión y de Eliminación.-
- Inclusión.
1) Pacientes con la enfermedad de Parkinson familiar.
2) Familiares de los pacientes anteriores
- Exclusión.
1) Pacientes con Parkinson no familiar
- Eliminación.
1) Pacientes con información incompleta
2) Muestras de ADN insuficientes en calidad y cantidad
17
Variables
1. Enfermedad de Parkinson autosómica dominante.- Enfermedad del sistema
nervioso, que presenta sintomatología específica (temblor en manos, brazos,
piernas, mandíbula y cara; rigidez de las extremidades y el tronco;
bradicinecia; Inestabilidad de postura o la coordinación y balance afectados) y
que tiene un patrón de transmisión autosómica dominante.
Naturaleza de la variable: cualitativa nominal, que se califica en forma
dicotómica (si o no).
2. Mutación Ala53Thr.- Mutación en el gen de la alfa-sinucleina en el exon 4,
cromosoma 4, brazo q, región 21.3, la cual esta presente en algunos
pacientes con la enfermedad de Parkinson autosómica dominante tipo1
(PARK1) y se caracteriza por el inicio temprano de la enfermedad,
sintomatología clásica, rápida progresión y su patrón de herencia autosómica
dominante. Naturaleza de la variable: cualitativa nominal, que se califica en forma
dicotómica (si o no).
18
PROCEDIMIENTO.-
Se estudiaron tres familias en las que se sugería una patrón de herencia autosómica
dominante procedentes del estado de Colima. El diagnóstico de Parkinson se realizó
por un neurólogo tomando como base los criterios establecidos por la United
Kingdom Parkinson Disease Brain Bank Criteria (21a).
y se realizó una reacción en cadena de la polimerasa y digestión a través de RFPS.
Extracción del ADN:
Se tomó a cada paciente 10 ml de sangre venosa periférica en tubos con EDTA
como anticoagulante, se realizó la extracción del ADN según el método SDS-
proteinasa K descrito en el anexo 4.
Determinación de la mutación
Para la búsqueda de la mutación en ADN genómico, se utilizaron los iniciadores
3 (5´-GCTAATCAGCAATTTAAGGCTAG-3´) y el iniciador 13
(5´-GATATGTTCTTAGATGCTCAG-3´) obtenidos de la secuencia de DNA del gen de
la alfa–Sinucleina, en el exon 4 (GenBank ID U46898, ver anexo 2) (11 y 19)
utilizando las condiciones para la reacción en cadena de la polimerasa descrita en el
anexo 5.
La digestión fue hecha después de la PCR con la enzima Tsp45I de acuerdo a los
protocolos del fabricante (New England Biolabs). En caso de estar presente la
mutación Ala53Thr, el producto amplificado de 216pb se divide en dos fragmentos de
128 y 88pb. El producto de digestión de la PCR fue separado mediante electroforesis
en un agarosa al 2% y visualizado mediante la tinción con bromuro de etidio. (11 y
19).
Análisis estadístico: La frecuencia alotípica y genotípica se obtuvieron por método de
conteo, la diferencia en distribución de sexo, alotipos y frecuencia de genotipos. Para
el análisis de las manifestaciones clínicas se utilizo un modelo de regresión logística
para evaluar el efecto de covariantes o fenotipos. Todos los análisis fueron
realizados con el método SPSS.
19
Resultados.-
Se estudiaron tres familias en las que se sugería una patrón de herencia autosómica
dominante. Con relación a la edad encontramos una media de 30.33 años, sin
predomino de ningún sexo. Las características de los pacientes las podemos ver en
la tabla 3 y el árbol genealógico de cada familia en las figuras 5, 6 y 7.
20
Tabla 3. Datos generales de los pacientes.
Paciente Edad Edad inicio Cuadro inicial UPDRS F1-I-1,-2 * ? ? ? ? F1-II-1 * ? ? ? ? F1-II-2 62 33 Temblor 83 F1-II-3 59 26 Disminución de fuerza/temblor 92 F1-II-4 56 26 Rigidez 2 F1-II-5 53 24 Disminución de fuerza/
dificultad a la marcha 73
F1-II-6 50 40 Temblor ocasional 8 F1-III-1,-4,-5 * ? ? ? ? F1-III-2 28 20 Rigidez 2 F1-III-3 21 18 Rigidez/Temblor en reposo 6 F1-III-6 25 18 Rigidez/Temblor en reposo 6 F1-III-7 20 18 Rigidez/Temblor en reposo 4 F1-III-8 38 35 Rigidez/Temblor en reposo 4 F1-III-9 36 17 Dificultad de
movimiento/temblor. 122
F1-III-10 18 15 Rigidez/Temblor en reposo 4 F1-III-11 13 0 0 0 F1-IV-1 19 17 Rigidez 2 F1-IV-2 10 0 0 0 F1-IV-3 2 0 0 0 F1-IV-4 5 0 0 0 F1-IV-5 2 0 0 0 F2-I-1 56 35 Rigidez 132 F2-I-2,-3,-4,-5 * ? ? ? ? F2-II-1,-5,-6 * ? ? ? ? F2-II-2 36 35 Rigidez 2 F2-II-3 28 22 Rigidez 2 F2-II-4 23 0 0 0 F2-III-1,-2,-3,-4 * ? ? ? ? F3-I-1,-2 * ? ? ? ? F3-II-1 44 22 Temblor/ Dificultad de
movimiento 64
F3-II-2,-3 * ? ? ? ? F3-III-1 17 0 0 0 F3-III-2,-3,-4,-5,-6 * ? ? ? ? F3-IV-1 * ? ? ? ? La nomenclatura usada para referir a los pacientes es la siguiente: F# indica a que familia pertenece (1, 2, 3); los números romanos del I al IV indican a que generación pertenecen; y el número final indica su lugar en el árbol genealógico. El símbolo * corresponde a los pacientes que no se les realizó el estudio neurológico y toma de muestra sanguínea debido a que no estuvieron disponibles.
21
Figura 5.- Árbol genealógico de la familia 1.
Familia 1
I
II
III
IV
1 2
1
1
1
2 3
3 2
2 3 4 5
4
4
5
5 6
6 7 8 9 10 11
Hombre Normal / Mujer Normal
Hombre / Mujer con coordinación afectada.
Aborto.
Mujer Fallecida.
Hombre / Mujer con Rigidez.
Hombre / Mujer con Temblor generalizado.
Hombre / Mujer con bradicinesia.
Caso Índice.
Hombre / Mujer Analizada.
22
Figura 6.- Árbol genealógico de la familia 2.
Familia 2
I
II
III
1 2 3 4 5
1 2 3 4 5 6
1 3 2 4
Hombre Normal / Mujer Normal
Hombre / Mujer con Rigidez.
Hombre / Mujer con rigidez, temblor generalizado, bradicinecia, y coordinación afectada.
Caso Índice.
Hombre / Mujer Analizada.
23
Figura 7.- Árbol genealógico de la familia 3.
I
II
III
IV
Familia 3
1 2
1 3 2
1 2 3 4 5 6
1
Hombre Normal / Mujer Normal
Hombre / Mujer con rigidez, temblor generalizado, bradicinecia, y coordinación
Caso Índice.
Hombre / Mujer Analizada.
24
Análisis de las características clínicas de la enfermedad de Parkinson familiar.-
Con relación a la calificación del United Kingdom Parkinson Disease Brain Bank
Criteria (UPDRS), la mayor calificación obtenida fue de 132, mientras que la menor
calificación fue de 0. (Tablas 4)
Tabla 4. Frecuencias de la escala UPDRS.
SINTOMAS
Frecuencia Porcentaje
1 4 16.7 2 5 20.8
3 1 4.2 4 7 29.2
Total 17 70.8
Sin síntomas * 7 29.2 Total 24 100.0
* sin síntomas al momento de realizar la genealogía. Al relacionar los síntomas encontrados, vemos que hubo pacientes con un síntoma
(temblor, rigidez, bradicinecia) con una media de 56años, y pacientes con 4 síntomas
con una media de 29 años. (Tabla 5)
Tabla 5. Análisis de medias edad contra síntomas.
EDAD SINTOMAS Media N Desv. típ.
1 56.75 4 5.12
2 33.40 5 13.99
3 56.00 1 .
4 29.43 7 10.98
Total 38.59 17 15.67
25
Al realizar una correlación síntomas contra edad de inicio no se observaron
observamos diferencias significativas.
Se realizaron dos análisis de regresión lineal, el primero en donde se enfrentan edad
contra síntomas (Gráfica 1), y el segundo entre la edad de inicio y los síntomas
(Gráfica 2), sin observar en ambos diferencia significativa.
SINTOMAS
EDAD
706050403020100
5
4
3
2
1
0
-1
Observada
Lineal
Grafica 1. Regresión lineal edad contra síntomas.
SINTOMAS
EDADINIC
50403020100-10
5
4
3
2
1
0
-1
Observada
Lineal
Grafica 2. Regresión lineal edad de inicio contra síntomas.
26
Análisis genético del gen de la alfa-sinucleina.-
Los resultados obtenidos en la búsqueda de la mutación Ala53Thr a través de la
digestión de productos de reacción en cadena de la polimerasa de los pacientes
candidatos, fueron negativos a la presencia de dicha mutación. Los resultados se
muestran en la figura 7.
Figura 8.- Patrón de electroforesis en agarosa al 2% de la digestión de los productos de la reaccion en cadena de la polimerasa con la enzima Tsp45I. El carril 1 es un marcador de peso molecular; en el carril 2 se muestra un producto no digerido, procedente de una región adenoviral y que posee diversos sitios para la enzima Tsp45I, el Carril 3 es la digestión con Tsp45I del producto amplificado colocado en el carril 2, que evidencia la actividad enzimatica; el Carril 4.es el producto amplificado del gen alfa-sinucelina de un caso índice; en los Carriles 5 a 7 se colocaron Productos de PCR de los casos índice incubados con la enzima Tsp45I, pero que no presentaron el corte de la enzima.
1 2 3 4 5 6 7
216pb
200p250p
150p100p
50pb
27
Discusiones.-
En México, la prevalencia de la enfermedad de Parkinson no se ha explorado con
precisión, pero se ha estimado sobre la base de los datos obtenidos en el Instituto
Nacional de Neurología y Neurocirugía MVS (centro de concentración de tercer nivel
de atención), que existen al menos 500,000 pacientes con enfermedad de Parkinson
en el país. Situando la prevalencia de la enfermedad en un rango de media a baja:
50-100 por 100,000 habitantes (6). Mientras que la enfermedad de Parkinson en
general se encuentra en el 1% de la población a nivel mundial, se ha determinado
que entre el 13 y el 15% de estos casos corresponde a la variante de la enfermedad
conocida como familiar, siendo un porcentaje demasiado pequeño, ya que esta
variante concentra tanto a los presentan herencia autosómica dominante como a los
autosómicos recesivos, considerando la presencia de cualquier mutación como un
evento raro de encontrar por su baja prevalencia. (18,19)
Se menciona que la EP puede ser heredada de manera autosómica dominante o
autosómica recesiva, aunque en muchos de los casos de la EP esta puede ser el
resultado del efecto de múltiples genes así como también la intervención de factores
de riesgo ambientales. (22)
Aunque en algunos casos, existen otras entidades neurológicas que comúnmente se
disfrazan como si fuera la enfermedad de Parkinson, las cuales incluyen
parkinsonismo – predominando atrofia de múltiples sistemas: degeneración striato-
nigral, degeneración corticobasal, temblor esencial, parkinsonismo inducido por
drogas, condiciones postencefálicas, demencia por cuerpos de Lewy, enfermedad de
Alzheimer. (22)
28
El parkinsonismo puede ser una presentación prominente de condiciones
neurológicas autosómicas dominantes que incluye a algunas ataxias
espinocerebelares, enfermedad de Huntington, demencia frontotemporal con
parkinsonismo-17. (22)
En Colima, llama la atención la concentración de estas 3 familias con 3 y 4
generaciones de Parkinson familiar, hallazgo sorprendente ya que la literatura
reporta seguimientos de 2 generaciones. Llama la atención que estos pacientes
presentan inicio temprano y rápida progresión de la enfermedad coincidiendo con las
características descritas la enfermedad de Parkinson familiar tipo 1 (PARK1),
originada por la mutación Ala53Thr en el gen de la alfa-sinucleina. En nuestros
pacientes la edad media de daño fue de 30 años, sin predominio de sexo, pero
presentando transmisión de la enfermedad de varón a varón en 2 de las 3 familias,
confirmando el patrón de herencia autosómico dominante en estas dos familias. (8, 9,
10). La única familia (número 2) que no presenta la transmisión documentada varón-
varón puede ser debido a que el único varón afectado y registrado en la primera
generación, no ha tenido descendencia, siendo la transmisión autosómica dominante
muy probable ya que el cuadro clínico concuerda con PARK1.
Contrariamente a lo reportado por la literatura de que a inicio temprano hay mayor
enfermedad, en nuestros pacientes encontramos algunos pacientes con inicio
temprano y mayor enfermedad, así como también había otros pacientes con inicio
temprano y menor enfermedad o lo contrario inicio tardío y mayor enfermedad; lo que
indica que en estas familias afectadas no existe relación entre la edad de inicio y lo
avanzado de la enfermedad. Sin embargo, clínicamente los datos obtenido en estas
familias nos hace pensar fuertemente en una mutación del gen de la alfa-sinucleina y
29
en la enfermedad PARK1. Los demás cuadros descritos para la enfermedad de
Parkinson autosómica dominante, presentan edades de aparición cerca de los 50
años y progresión normal de la enfermedad. Normalmente, la presencia del cuadro
clínico solo nos permite el diagnóstico de la enfermedad de Parkinson y evaluar la
afectación del paciente, pero en este caso para confirmar el diagnóstico de la
enfermedad PARK1, fue necesario hacer pruebas de laboratorio para buscar la
presencia de una mutación que se relacionara a esta enfermedad. De las mutaciones
descritas para la alfa-sinucleina causantes de PARK1, la Ala53Thr es la más
estudiada a nivel mundial, por lo que dicha mutación fue buscada en las tres familias
colectadas, siendo el resultado negativo. Este resultado solo muestra que esta
mutación en particular no esta involucrada en el desarrollo del la enfermedad de
Parkinson autosómica dominante en familias de Colima, sin embargo, otras
mutaciones (previamente descritas o de novo) en el gen de la alfa-Sinucleina o en
otro gen pueden ser las causantes de esta enfermedad, por lo que es necesario
continuar su búsqueda para poder tener un marcador que ayude a identificar a los
individuos portadores.
30
Conclusiones.-
1. Confirmamos que la mutación Ala53Thr no se encuentra en estas familias con
la enfermedad de Parkinson a pesar de presentar las características clínicas
clásicas de PARK1.
2. Una posibilidad es que sea una mutación diferente a la buscada en el gen de
la alfa-sinucleina causante de PARK1 en estas familias.
3. Otra posibilidad es que se trate de alguna mutación ya conocida causante de
PARK3, PARK4, PARK5, PARK8 a pesar de no tener el cuadro clínico
descrito en cada una de ellas.
4. Por último, puede que se trate de una mutación no descrita en otros genes.
31
Anexo 1.-
UNIVERSIDAD DE COLIMA
CARTA DE CONSENTIMIENTO INFORMADO PROYECTO : Presencia de la mutación PARK1 en familias de Colima con Enfermedad de Parkinson Autosómica Dominante. Lugar y fecha:___________________________________________________ Por medio de la presente yo__________________________________________________ de______ años de edad, manifiesto que acepto participar en este proyecto de investigación, el cual tiene como objetivo conocer más sobre el problema del Parkinson Familiar para tratar de disminuir los problemas que acarrea. Se me ha explicado que mi participación consistirá en: Aceptar que las muestras tomadas como parte del procedimiento de mi atención diagnóstica: sangre (10 ml. sangre venosa del brazo), sean incluidas para su estudio dentro de este proyecto de investigación para estudios de laboratorio molecular siempre y cuando se mantenga la confidencialidad de mis datos personales. Declaro que he sido informada que: • Mi participación es voluntaria y que mi negación a participar no representaría ningún
problema para mi atención en las diferentes instituciones de salud. • Que el riesgo ( peligro) que enfrento de ninguna forma es mayor al que enfrentaría
cualquier individuo al que se le toman este tipo de muestras ya que son parte de la atención médica habitual diagnóstica y que generalmente consiste en cierto tipo de molestia local en el sitio de punción (piquete de la aguja) y que de presentarse estos, contaré con la atención necesaria en la unidad médica donde se toma las muestras.
• Que mi participación en el proyecto no obliga a la investigación ni sus responsables a otorgarme atención en cuanto a los problemas de salud que fueran diagnosticados a partir de las muestras que me serán tomadas, pero si ha informarme si yo lo deseo los resultados y ha ofrecerme asesoría para buscar la atención correspondiente.
Nombre y firma de la persona otorgante del consentimiento___________________________________________________ Nombre y firma del testigo Nombre y firma del testigo _______________________ _____________________ Nombre de la persona que proporciona la información y recabo firma:_______________________________________
32
Anexo 2.- Secuencia obtenida de GeneBank ID U46898. Donde se muestra la secuencia del gen de la alfa–synuclein, en el exon 4 en Homo Sapiens.. U46898. Reports Homo sapiens NACP...[gi:1230570] LOCUS HSNACP03 650 bp DNA linear PRI 13-JAN-1998 DEFINICION Homo sapiens NACP/alpha-synuclein gene, exon 4. ACCESO U46898 VERSION U46898.1 GI:1230570 CLAVES SEGMENTO 3 of 6 FUENTE Homo sapiens (humano) ORGANISMO Homo sapiens Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Euarchontoglires; Primates; Catarrhini; Hominidae; Homo. ORIGEN 1 ctgcaggtca acggatctgt ctctagtgct gtacttttaa agcttctaca gttctgaatt 61 caaaattatc ttctcactgg gccccggtgt tatctcattc ttttttctcc tctgtaagtt 121 gacatgtgat gtgggaacaa aggggataaa gtcattattt tgtgctaaaa tcgtaattgg 181 agaggacctc ctgttagctg ggctttcttc tatntattgt ggtggttagg agttccttct 241 tctagtttta ggatatatat atatattttt ttctttccct gaagatataa taatatatat 301 acttctgaag attgagattt ttaaattagt tgtattgaaa actagctaat cagcaattta 361 aggctagctt gagacttatg tcttgaattt gtttttgtag gctccaaaac caaggaggga 421 gtggtgcatg gtgtggcaac aggtaagctc cattgtgctt atatcaaaga tgatatntaa 481 agtatctagt gattagtgtg gcccagtatc aagattccta tgaaattgta aaacaatcac 541 tgagcatcta agaacatatc agtcttattg aaactgaatt ctttataaag tatttttaaa 601 taggtaaata ttgattataa ataaaaaata tacttgccaa gaataatgag
33
Anexo 3.- ESTADIOS DE EVOLUCIÓN DE LA ENFERMEDAD DE PARKINSON: Unified Parkinson Disease Rating Scale (UPDRS) Tabla de recolección de Puntaje. Sintomatología. Puntuación. (0-4) *
1. Estado mental, Conducta, Humor Afectación Intelectual Trastorno del pensamiento Depresión Motivación/Iniciativa
2. Actividades de la Vida Diaria Lenguaje Salivación Deglución Escritura Cortar alimentos/Manejar Utensilios Vestir Higiene Volverse en la Cama/ Ajustar las sábanas Caídas-Sin relación al Freezing Freezing al caminar Andar Temblor Molestias sensoriales relacionadas con el Parkinsonismo
3. Examen Motor Lenguaje Expresión Facial
Temblor de Reposo Cara Extremidad Superior Derecha (ESD) Extremidad Superior Izquierda (ESI) Extremidad Inferior Derecha (EID) Extremidad Inferior Izquierda (EII)
Temblor Postural o de Acción Extremidad Superior Derecha (ESD) Extremidad Superior Izquierda (ESI)
Rigidez Cuello Extremidad Superior Derecha (ESD) Extremidad Superior Izquierda (ESI) Extremidad Inferior Derecha (EID) Extremidad Inferior Izquierda (EII)
34
Tocarse la Punta de los Dedos Derechos Izquierdos
Movimientos de la mano (abrir y cerrar las manos en rápida sucesión) Derecha Izquierda
Movimientos Alternativos Rápidos (pronación y supinación de las manos) Derecha Izquierda
Agilidad en la pierna (movimientos con el talón sobre el suelo, amplitud debería ser de 8 cm) Derecha Izquierda
Levantarse de una silla (con brazos cruzados) Postura Marcha Estabilidad Postural (test de retropulsión) Bradicinesia/ Hipocinesia * 0 Sin sintomatología; 1 sintomatología leve; 2 sintomatología moderada; 3 sintomatología severa; 4 sintomatología incapacitante
35
Anexo 4.- Método de extracción de ADN a partir de sangre periférica por el método SDS-PK. Modificado de: Gilbert J., Isolation of Genomic DNA from Mammalian Cells. Current
Protocols in Human Genetics. 1994.
1. Extracción de 10ml de sangre, a través de punción venosa en brazo,
recolectada en un tubo de ensayo con anticoagulante EDTA.
2. Pasar el contenido del tubo de sangre a un tubo cónico de 50ml. Adicionar dos
volúmenes de buffer de lisis de eritrocitos 10:1
3. Agitar por inversión varias veces para favorecer la lisis de eritrocitos.
4. Refrigerar de 20 a 30 minutos.
5. Centrifugar a 4500 rpm durante 20 minutos a 4°C.
6. Decantar y lavar el botón con solución amortiguadora de lisis de eritrocitos.
7. Repetir los pasos 4 y 5 hasta que se observe limpio el botón de leucocitos
(aproximadamente 3 veces).
8. Al botón limpio de leucocitos se le agregan 3ml de solución amortiguadora de
lisis de leucocitos y agitar ligeramente.
9. Agregar 200ul SDS al 10% y 500ul de proteinasa k
10. Agitar en el vortex hasta que el botón se disuelva
11. Incubar a 37°C durante 24 hrs
12. Adicionar 1ml de sol saturada de cloruro de sodio (6M).
13. Agitar vigorosamente durante 15 segundos.
14. Centrifugar inmediatamente a 5000 rpm/15 min.
15. Transferir el sobrenadante (contiene el ADN) a un tubo falcon de 15 ml limpio
y estéril.
16. Adicionar 2 volúmenes de etanol absoluto frío e invertir varias veces hasta que
se observen las hebras de ADN.
17. Transferir el SDN a un microtubo eppendorff estéril con ayuda de una
micropipeta.
18. Lavar 3 veces con etanol al 70%.
36
19. Secar el ADN, dejando el tubo abierto por 24 hrs.
20. Diluir el ADN con 200 Ml de solución amortiguadora TE.
21. Agitar el tubo que contiene ADN para homogeneizar.
22. Colocar el microtubo a 37°C hasta la disolución total del ADN ( 24-36h).
Posteriormente se cuantifica el ADN en espectrofotómetro. Del ADN aislado se
hicieron 2 alícuotas de 100 μl con una concentración de 100ng/ μl. Posteriormente
se procede a realizar reacción en cadena de la polimerasa.
37
Anexo 5.- Técnica y condiciones usadas en la Reacción de la Cadena de la Polimerasa (PCR). Modificada de Luccotte G, J Neurol Neurosurg Psychiatry; 1998; 65(6)948-949. El ADN genómico fue amplificado con el Primer 3
(5´-GCTAATCAGCAATTTAAGGCTAG-3´) y el primer 13
(5´-GATATGTTCTTAGATGCTCAG-3´) obtenidos de la secuencia de DNA del gen de
la alfa–Sinucleina, en el exon 4 con (GenBank ID U46898, ver anexo 2) en un
volumen de Reacción de 50 ml:
10 mM TrisHCl (Buffer 10x) pH 8.3
50 mM KCl
1.5 mM MgCl
200mM dNTP
1U Taq polymerasa
Proceso de la PCR
Se utilizan las siguientes condiciones para el termociclador:
- Hibridación 94°C x 5 minutos.
- 35 ciclos de PCR:
- Hibridación 60°C x 40 segundos.
- Extensión 72°C x 40 segundos.
- Desnaturalización 94°C x 40 segundos.
- Extensión final 74°C x 5 minutos.
Condiciones de la Digestión.
Se utiliza una alícuota de 20ml del producto de PCR, al cual se le aplica la enzima de
restricción Tsp45I y se coloca a temperatura de 65°C por 5 horas. La eficacia se
verifica con un producto de producto procedente de una región adenoviral y que
posee diversos sitios para la enzima Tsp45I .
Los productos digeridos fueron separados por electroforesis en un gel de Agarosa al
2% y fue teñido con Bromuro de Etidio.
38
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