Upload
others
View
9
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
1
UNIVERSIDAD DE CONCEPCION DIRECCIÓN DE POSTGRADO
FACULTAD DE CIENCIAS FORESTALES-PROGRAMA DE DOCTORA DO EN CIENCIAS FORESTALES
VALIDACIÓN DE RUTAS MORFOGÉNICAS PARA LA CLONACIÓN DE RAULÍ (Nothofagus alpina (poepp. et endl.) oerst) A PARTIR DE TEJIDOS EMBRIONARIOS
Y ADULTOS.
PRISCILA NATALIA CARTES RIQUELME CONCEPCIÓN – CHILE
2012
Profesor Guía: Manuel Sánchez Olate Dpto. de Silvicultura
Facultad de Ciencias Forestales Universidad de Concepción
2
UNIVERSIDAD DE CONCEPCION DIRECCIÓN DE POSTGRADO
FACULTAD DE CIENCIAS FORESTALES-PROGRAMA DE DOCTORA DO EN CIENCIAS FORESTALES
VALIDACIÓN DE RUTAS MORFOGÉNICAS PARA LA CLONACIÓN DE RAULÍ (Nothofagus alpina (poepp. et endl.) oerst) A PARTIR DE TEJIDOS EMBRIONARIOS
Y ADULTOS.
PRISCILA NATALIA CARTES RIQUELME CONCEPCIÓN – CHILE
2012
Profesor Guía: Manuel Sánchez Olate Dpto. de Silvicultura
Facultad de Ciencias Forestales Universidad de Concepción
3
VALIDACIÓN DE RUTAS MORFOGÉNICAS PARA LA CLONACIÓN DE RAULÍ (Nothofagus alpina (poepp. et endl.) oerst) A PARTIR DE TEJIDOS EMBRIONARIOS
Y ADULTOS.
COMISIÓN EVALUADORA:
MANUEL SÁNCHEZ OLATE (Profesor. Guía)
Ing. Forestal, Dr. __________________________________
DARCY RÍOS LEAL (Profesor Co-guía)
Bióloga, Dra. __________________________________
RODRIGO HASBÚN ZAROR (Comisión evaluación)
Ing, Forestal, Dr. __________________________________
CRISTIAN GÓMEZ HERNÁNDEZ (Comisión evaluación)
Biólogo, Dr. __________________________________
DIRECTORA DE POSTGRADO:
DARCY RÍOS LEAL
Bióloga, Dra. __________________________________
DECANO FACULTAD DE CIENCIAS FORESTALES:
MANUEL SÁNCHEZ OLATE
Ing. Forestal, Dr. __________________________________
4
DEDICADO
A Dios A mi familia y seres queridos
5
AGRADECIMIENTOS
Creo que para la mayoría, el término de la Tesis Doctoral genera sentimientos encontrados, por un lado “alivio” de culminar satisfactoriamente una etapa de mucho esfuerzo e interrogantes, y “tristeza” de saber que culminan tantos momentos satisfactorios y logros obtenidos durante esta etapa. No obstante, estos momentos fueron posibles gracias al apoyo de muchas personas que me han ayudado en el desarrollo científico de mi tesis doctoral o que han sabido estar a mi lado en los momentos buenos y malos. Por ello quiero expresar mi gratitud: A Dios, quien me brindo la fuerza interior necesaria para llegar al final de este camino A mis padres Victoria y Benjamín por su confianza, cariño, apoyo y es esfuerzo constante para permitirme ser una mejor persona y profesional cada día. A mis hermanos Carlos, Cristhopher y mi abuelita Victoria por su apoyo y confianza contribuyendo a ser más grata mi vida universitaria. A Boris por su infinito amor, apoyo, compresión y compañía en este proceso. A mi amiga y socia Catherine Delaveau a quien estimo mucho y forma parte activa del término de este proceso. Proceso que no culmina hoy, ya que comenzamos juntas otro camino como amigas, empresarias e investigadoras independientes que espero se consolide con el tiempo. (Como no agradecer al doctorado de haber reunido a semejantes complementos jajja). A mis profesores tutores Manuel Sánchez y Darcy Ríos por su confianza y apoyo incondicional. Además por darme la oportunidad de comenzar a trabajar en el laboratorio de biotecnología vegetal en mi carrera de pregrado y desarrollar mis sueños en los estudios de postgrado. A la profesora Matilde Uribe y profesor Rodrigo Hasbún, por su apoyo como docentes y benefactores de mi tesis doctoral (jaja). A las secretarias y funcionarios, Patricia, Margarita, María Isabel, Blanquita, Pamela, Luchito, Guardias entre otros del Cetro de Biotecnología y de la Facultad de Ciencias Forestales de la Universidad de Concepción, por el saludo diario y por ayudarme siempre que lo necesité. En especial a la Sra Libet Alarcón por sus retos y risas o carcajadas diarias (jaja) y estar disponible siempre ayudar, no tan solo a mí, sino al que lo necesitara. No creo ser la única que la extraño en el laboratorio durante los últimos años.
6
A todos mis compañeros del laboratorio de biotecnología vegetal por su paciencia y ayuda, en especial a mi “alumna-amiga” Francisca Beltrán a quien más de una vez moleste con mis exigencias y preguntas, no obstante, siempre tuvo buena disposición para ayudarme y escuchar. A CONICYT -Gobierno de Chile y la Dirección de Postgrado de la Universidad de Concepción por haber financiado mis estudios y pasantías durante el doctorado. A todos ellos que se quedan en el tintero (profesores y amigos) y no es mi intención olvidar y que sin su ayuda no habría sido posible concluir satisfactoriamente esta etapa. ………….A TODOS USTEDES GRACIAS
7
ABREVIATURAS.
ABA: (±)-cis, trans-ácido abscísico.
ADN: Ácido desoxiribonucleico.
AFLPs: Polimorfismo de Longitud de Fragmentos Amplificados
AIB: ácido indolbutírico.
AIA: ácido indol 3 acético.
ANA: ácido α-naftalenacético.
BAP: 6-bencilaminopurina.
BE: brote epicórmico.
BTM: Broadleaved Tree Medium.
CNE: callo no embriogénico.
2,4-D: ácido 2,4-diclorofenoxiacético.
EcoRI: Endonucleasa de digestión
ES: Embriogénesis somática
Es: embrión somático.
ESS: embriogénesis somática secundaria.
Ec: embrión cigótico.
GA3: ácido giberélico.
HPLC: cromatografía líquida de alta eficacia e Alta Resolución.
IPF: incremento en peso fresco.
MPE: masas pro-embriogénicas.
MS: Murashige y Skoog.
PCR: Reacción en cadena de la ADN polimerasa.
8
INDICE GENERAL.
TEMA
INTRODUCCIÓN GENERAL………………………………………………...
CAPÍTULO 1. CUANTIFICACIÓN ENDÓGENA DE ÁCIDO
ABSCÍSICO Y ÁCIDO INDOL-3 ACÉTICO EN EMBRIONES
SOMÁTICOS Y CIGÓTICOS DE Nothofagus alpina.
…………………………………………….........................................................
CAPÍTULO 2 . REVIGORIZACIÓN DE MATERIAL ADULTO DE N.
alpina: ASPECTOS HORMONALES E HISTOLÓGICOS
…………………………………………………………………………………
CAPÍTULO 3 . COMPARACIÓN DE EMBRIONES SOMÁTICOS Y
CIGÓTICOS DE Nothofagus alpina: MADURACIÓN, MORFOLOGÍA E
HISTOLÓGIA.
…………………………………………………………………………………
CAPÍTULO 4 . ANALISIS DE VARIACIÓN SOMACLONAL EN
EMBRIONES SOMATICOS Y BROTES ADVENTICIOS ADULTOS DE
N. alpina, MEDIANTE AFLP.
…………………………………………………………………………………
DISCUSIÓN GENERAL……………………………………………………...
CONCLUSIONES……………………………………………………………..
Nº
PAGINA
15
34
57
77
99
120
127
9
INDICE DE TABLAS .
TITULO TABLA:
2.1 Tratamientos de inducción organogénica.………………………………
2.2. Tratamientos de inducción rizogénica aplicados a microtallos de N.
alpina, según concentraciones de AIB y ontogenia……………………………...
3.1 Concentración de ABA aplicada en tratamientos de frío para la
maduración de embriones somáticos de Nothofagus alpina.…………………...
3.2 Reguladores del crecimiento aplicados en los tratamientos de
germinación de embriones somáticos de Nothofagus
alpina.…………………......................................................................................
4.1. Partidores selectivos de AFLPS ensayados en N. alpina……………..
4.2. Calidad y concentración promedio de ADN de material embriogénico
y organogénico de N. alpina ……………..........................................................
4.3. Número de bandas y grado de polimorfismo revelado por las
combinaciones de AFLP para embriones somáticos y brotes adventicios de
N. alpina.………………………………………………………………………
4.4. Análisis de varianza molecular (AMOVA) para embriones somáticos
y brotes adventicios de N. alpina según dos niveles jerárquicos: entre
subcultivos y dentro del subcultivo …………..………………………………
Nº
PÁGINA
49
51
72
73
100
101
102
103
10
INDICE DE FIGURAS.
TITULO FIGURA:
1.1. Diferentes aspectos de las MPE de Nothofagus alpina. A) MPE
sometidas a los tratamientos de maduración. B) MPE presentando
Embriogénesis somática secundaria. C) Embrión somático en estado
cotiledonar.………………………………….......................................................
1.2. Efecto de tratamientos con ABA sobre el Incremento en peso fresco
(IPF) de las MPE somáticos de N. alpina.……………………………………...
1.3. Efecto de tratamientos con ABA sobre la embriogénesis somática
secundaria MPE de raulí (Ess), en embriones somáticos de N. alpina ………...
1.4. Número de embriones somáticos presentando un polo caulinar y
radicular desarrollado (Plántula) y solo desarrollo caulinar …………………...
1.5. Embriones somáticos germinados y sometidos a los tratamientos de
maduración. (A) Embrión somático presentando desarrollo caulinar. (B)
Embrión somático presentando sólo desarrollo caulinar después de 3 semanas
de cultivo. (C) Embrión con desarrollo caulinar y radicular. (D) Plántula……..
1.6. Cromatogramas que indican el tiempo de retención de AIA y ABA,
según standard utilizado (a) y concentraciones de AIA y ABA obtenidas
desde muestras de embriones cigóticos inmaduros (Ei) de N.alpina (b)………
1.7. Niveles endógenos de AIA y ABA contenida en Embrión inmaduro
(Ei), Embrión cigótico maduro (Ec) y Eje embrionario (Eec) de N. alpina……
Nº
PAGINA
30
32
32
34
34
35
36
11
TITULO FIGURA:
1.8. Niveles endógenos de AIA y ABA contenida, en embriones somáticos
en comparación con embriones cigóticos maduros (Ec) de N. alpina …............
2.1. Respuesta organogénica por tratamiento de inducción (I), proliferación
(P) y árbol ensayado (A)………………………………………………………..
4.2. Gramos de callo fresco, según ontogenia del árbol (BE: brote
epicórmico y copa) y concentración hormonal…………………………............
2.3. Número de brotes por gramos de peso fresco, según ontogenia del
árbol (BE: brote epicórmico y copa) y concentración
hormonal.………………………………………………………………………
2.4. Cortes histológicos longitudinales de brotes adventicios de N. alpina. A)
Callo organogénico con brotes adventicios. B) Flechas indican la formación de
brotes adventicios y zonas meristemáticas. C) Domo meristemático con activa
división celular periclinal………………………………………………………
2.5. Porcentaje de enraizamiento según ontogenia (BE: brote epicórmico y
copa) y concentración auxínica (A). Porcentaje de supervivencia en condiciones
ex vitro según ontogenia (BE: brote epicórmico y copa) y concentración
auxínica (B)……………………………………………………………………
2.6. . Respuesta rizogénica en condiciones in vitro y ex vitro según
ontogenia (BE: brote epicórmico y copa) y concentración auxínica ………….
3.1. . Efecto del frio y ABA sobre el Incremento en peso fresco (IPF) de
embriones somáticos de N. alpina ………..………………………..................
Nº
PAGINA
38
54
55
55
57
58
60
75
12
TITULO FIGURA:
3.2. . Efecto del frio y ABA sobre la embriogénesis somática secundaria
(Ess), en embriones somáticos de N. alpina.…...................................................
3.3. Efecto de los tratamientos de germinación aplicados a los embriones
somáticos de N. alpina. A) Porcentaje de embriogénesis somática secundaria
(Ess) según tratamiento de germinación aplicado. B) porcentaje de embriones
somáticos con presencia solo caulinar. C) porcentaje de embriones somáticos
con presencia solo radicular. D) porcentaje de conversión a
plántula…………………………………………………………………………
3.4. Embriones somáticos sometidos a los tratamientos de maduración y
germinación. (A) Flechas indican embrión somático con presencia de Ess.
(B) Embrión somático presentando sólo desarrollo caulinar. (C) Embrión con
sólo desarrollo radicular. (D) Plántula.…………………………......................
3.5. Morfología e histología de estructuras embriogénicas y no-
embriogénicas.…………………………………………………………………
3.6. Escáner de estructuras embriogénicas cigóticas y somáticas de N.
alpina. A) Embrión cigótico B) Masa Proembriogénica (MPE) C) Embrión
somático en estado globular, D) Embrión somático en estado torpedo con
protuberancias globulares………………………………………………………
4.1. Análisis de Componentes Principales (PCA) representando la
variación encontrada entre los subcultivos S0: Subcultivo cero y S6:
Subcultivo 6 para embriones somáticos (A) y brotes adventicios
(B).……………………………………………………………………………..
Nº
PAGINA
75
76
78
82
83
104
13
RESUMEN
Raulí (Nothofagus alpina ((Poepp. et Endl.) Oerst.) es considerada la principal
especie maderera del grupo de los Nothofagus y debido a su excesiva tala en bosques
naturales, ha entrado en franco deterioro, quedando escasos individuos de alto valor,
siendo imprescindible estudiar las alternativas de micropropagación y la aplicación de
herramientas biotecnológicas para la clonación de estos ejemplares.
Entre las vías de propagación vegetativa, la micropropagación permite lograr una
vía regenerativa de plantas a partir de una célula o tejido donante (rutas morfogénicas),
pero esta vía de propagación debe ser confiable, reproducible y productiva. Por lo tanto
es necesario generar un material sin variabilidad intraclonal y que sea susceptible a la
automatización. En tal sentido este estudio tiene por objetivo validar las rutas
morfogénicas, obtenidas desde material embrionario y adultos de N. alpina, a través de
análisis hormonales, histológicos y genéticos, con el fin de obtener plantas con
fidelidad clonal. El tejido embrionario o de inicio corresponde a masas
proembriogénicas de la línea embriogénica existente (Línea RaC-01), además del tejido
adulto que corresponde a yemas extraídos desde varetas forzadas a brotar in vitro
colectadas desde árboles adultos en fase madura o reproductiva.
Los resultados histológicos y hormonales obtenidos desde el material adulto
indican presencia de brotes adventicios de origen multicelular, vía organogénesis
indirecta, es decir, a partir de la formación de células indiferenciadas (callo) con un alto
grado de proliferación de brotes por callo organogénico. Por otro lado, la aplicación de
acido abscísico al medio de cultivo aumentó significativamente el número de embriones
somáticos germinados lo que permite optimizar el proceso de conversión a planta de
embriones somáticos. A su vez, mediante AFLP se pudo comprobar fidelidad clonal en
la línea embriogénica y determinar el grado de variación somaclonal presente en brotes
adventicios de material adulto. Estos resultados aportan información valiosa para
desarrollar a futuro protocolos eficaces que permitan la multiplicación confiable de
genotipos selectos de raulí.
14
ABSTRACT.
Raulí (Nothofagusalpina ((Poepp. etEndl.) Oerst.)is considered the main timber
species of Nothofagus group and due to excessive logging in natural forests, has entered
deteriorating, leaving few high-value individuals, being essential to study micropropagation
alternatives and application of biotechnology tools for cloning these species.
Vegetative propagation like micropropagation can achieve plants from a cell or a
donor tissue (morphogenic routes), but this way must be reliable, reproducible and
productive. Therefore it is necessary to generate a material without intraclonal variability
and which is susceptible to automation. The aim of this study is validate morphogenic
routes, obtained from embryonic and adult materials of N. alpina through hormonal
analysis, histological and genetic to obtain fidelity clonal plants. The embryonic tissue or
proembryogenic masses correspond to embryogenic existing line (Line RaC-01). The adult
tissue belongs to sprout buds forced in vitro collected from mature or reproductive adult
trees.
The results obtained from histological and hormonal adult material indicates the
presence of adventitious shoots from multicellular origin, via indirect organogenesis from
undifferentiated cell formation (callis) with a high proliferation degree of organogenic
callus buds. On the other hand, application of abscisic acid to the culture medium
increasedsignificantly the number of somatic embryos germinatedwhich optimizes the
changefrom somatic embryos into a plant. In turn, by AFLP it was found embryogenic
clonal fidelity and the somaclonal variation degree of adult adventitious shoots was
determined. These results provide valuable information to develop future protocols
multiplication of selected genotypes of raulí.
15
INTRODUCCION GENERAL
Raulí, Nothofagus alpina ((Poepp. et Endl.) Oerst, (= N. nervosa,= N. procera) es una especie
de la familia Nothofagáceae y una de las diez especies del género Nothofagus que vegetan en
Chile, distribuyéndose a lo largo de la Cordillera de la Costa desde la región del Bío Bío (río
Itata, 36º 30’ S) hasta la región de Los Lagos (provincia de Llanquihue, 41ºS), y a través de la
Cordillera de los Andes desde la región del Maule (provincia de Curicó, 35º S) hasta la región
de Los Ríos (Valdivia, 40º 30’ S). Su nicho altitudinal se sitúa entre los 300 y los 1.200
m.s.n.m, especialmente en laderas interiores y en valles cordilleranos (Donoso et al., 2006).
Esta especie, junto con otros Nothofagus, tales como roble y coigüe, es componente principal
de variados tipos forestales del bosque nativo chileno. Raulí presenta cualidades madereras
que lo han hecho muy solicitado para, entre otros usos, la construcción y mueblería (Loewe et
al., 1997). El empleo de la madera de raulí va muy de la mano con el establecimiento de
asentamientos poblacionales en el centro y sur de Chile en los siglos XIX y XX (Burschel et
al., 1976; Grosse y Quiroz, 1998). Esta demanda histórica, sumado a la ausencia de políticas
claras para la extracción de madera de la especie, ha provocado una merma alarmante en su
existencia como componente fundamental del bosque nativo templado, tanto en su cantidad y
distribución, como en la calidad de los individuos hoy existentes (INFOR, 1996).
Además, la propagación de N. alpina presenta dificultades que radican en características
intolerantes de la especie, mediante siembra directa, sólo es exitosa en lugares donde el suelo
mineral se encuentra expuesto a la luz (Donoso y Lara 1995; Loewe et al., 1997), sumado a la
baja viabilidad de las semillas, periodicidad en la producción de semillas (alta producción en
ciclos cortos de 2 a 3 años) y ataque de insectos, factores que dificultan el desarrollo de esta
especie (Burschel et al., 1976).
16
Por esta razón, con la promulgación de la Ley de Recuperación del Bosque Nativo y Fomento
Forestal que pretende incentivar el manejo de bosques naturales y de plantaciones con
especies nativas, se precisa de información respecto de los métodos de regeneración y
multiplicación de las distintas especies que conforman estos bosques
Considerando las actuales demandas de la sociedad por productos y servicios procedentes del
bosque, raulí se constituye como una fuente de diversificación de la producción forestal
(Cabrera, 2000). Lo anterior queda avalado por el potencial de producción que poseen los
renovales de raulí, las características tecnológicas de su madera, así como por sus hábitos y
potencial de crecimiento similares a los que presentan especies exóticas como Pinus radiata,
características que la convierten en una especie apta para ser establecida y manejada bajo
regímenes de silvicultura clonal, en esquemas de manejo similares a los aplicados hoy en pino
y eucalipto (Ipinza y Gutíerrez, 2000; Sabja et al., 2008). Sin embargo, por tratarse de
esquemas de manejo en etapas iníciales (Gezan et al., 2007), aun no existe un flujo continuo
en abastecimiento y calidad, lo cual ha impedido generar una demanda industrial rentable y
sostenible en el tiempo.
PROPAGACION CLONAL DE NOTHOFAGUS ALPINA
Las diversas técnicas de propagación vegetativa, ya sea in vitro o ex vitro, ofrecen la ventaja
común de transferir toda la ganancia genética desde el árbol donante hacia la descendencia. La
totipotencia de las células vegetales, mediante un manejo adecuado, hace posible la generación
de diversos órganos de una planta, para obtener de esta manera un individuo completo,
genéticamente idéntico al material de origen (Márgara, 1988; Pierik, 1990). Es así como
mediante la clonación de material seleccionado, se han obtenidos logros con los cuales se han
17
duplicado las ganancia genéticas respecto al mejoramiento por vía sexual (Sánchez-Olate et
al., 2005).
Pese a las múltiples ventajas de las técnicas de propagación vegetativa, se pueden mencionar
algunas trabas que se oponen muchas veces al éxito de un esquema de propagación a nivel
operacional (Orellana, 1998). La dificultad para generar raíces funcionales que permitan el
desarrollo de la planta, adecuada aclimatación a las condiciones de vivero y establecimiento en
terreno, clonación de material adulto por pérdida de la capacidad regenerativa y competencia
morfogénica, son algunas de ellas (Fraga et al., 2002). No obstante, clonar individuos adultos
nos permite conocer ciertas características de interés como calidad de los frutos, volumen y
calidad de la madera lo que hace interesante su propagación mediante técnicas de
revigorización (Rodríguez et al., 2005).
En N. alpina se han obtenido modestos resultados en enraizamiento adventicio a partir de
material juvenil mediante macroestacas (Santelices, 1993), por lo cual ha sido necesaria la
revigorización del material a emplear, mediante la aplicación de técnicas de
micropropagación, a partir de la cual se han obtenido resultados auspiciosos en embriogénesis
somática, rescate de embriones y organogénesis adventicia a partir de material juvenil (Jordan
et al., 1996; Martinez-Pastur y Arena, 1996; Castellanos et al., 2005).
Los tejidos de individuos juveniles poseen cierta facilidad de ser propagados a diferencia de
individuos adultos o los que ya han experimentado el cambio de fase (Rodríguez et al., 2005),
no obstante aún no pueden ser evaluadas sus características fenotípicas (Greenwood, 1995;
Fraga et al., 2002). Por lo tanto, el éxito de la micropropagación va a depender de la facilidad
18
que presentan los individuos para propiciar la desdiferenciación de sus tejidos o del grado de
madurez en la que se encuentren.
REJUVENECIMIENTO Y /O REVIGORIZACIÓN DE NOTHOFAGUS ALPINA,
MEDIANTE CULTIVO IN VITRO.
La capacidad morfogénica o facilidad con que cuentan los individuos para propiciar la
desdiferenciación de sus tejidos va a depender del grado de madurez o fase de desarrollo en la
que se encuentren; es decir, los tejidos de individuos juveniles poseen cierta facilidad de ser
propagados, no obstante aún no pueden ser evaluadas sus características fenotípicas
definitivas, a diferencia de individuos adultos o los que ya han experimentado el cambio de
fase (Greenwood, 1995; Fraga et al., 2002). Los procesos de desdiferenciación en cultivo in
vitro están influenciados por la exposición de los tejidos a reguladores del crecimiento vegetal
(auxinas y citoquininas principalmente) que permiten la división y elongación celular
(Margara, 1988; Azcon y Talón, 2000).
Normalmente, se consideran dos aspectos del envejecimiento vegetal o madurez: a) el
envejecimiento cronológico, que se expresa en cambios morfológicos paralelos a la pérdida de
competencia morfogénica, la que aumenta con el tiempo a medida que se desarrolla el ciclo
vital de un individuo. Por otro lado, b) el envejecimiento fisiológico, que hace referencia a
cambios intrínsecos y específicos originados por un incremento de la complejidad de la planta
o árbol. En la actualidad, ambos son relacionados al envejecimiento ontogénico (Rodríguez et
al., 2005)
Algunos autores plantean que el desarrollo ontogénico en leñosas abarca varias etapas,
caracterizadas por la expresión de diferentes competencias morfogénicas (Greenwood, 1995;
Hasbún, 2006; Valledor et al., 2007).
19
i) Fase embrionaria, comienza con la formación del eje embrionario a partir del cigoto y
finaliza con la maduración del embrión que se mantiene en dormición hasta su
germinación.
ii) Fase juvenil, a partir de la germinación del embrión hasta la adquisición de la
capacidad de floración tras el cambio de fase juvenil-adulto.
iii) Fase adulta reproductiva, determinada principalmente por la adquisición y
mantenimiento de la capacidad de floración.
Mediante la aplicación de técnicas de micropropagación en individuos adultos, es posible,
recuperar el vigor característico de etapas juveniles sin que medie reproducción sexual para la
revigorización in vivo o in vitro del material adulto. Sin embargo, en este caso no se debe
hablar de rejuvenecimiento total sino de revigorización, la recuperación total de las
características juveniles, fenómeno denominado rejuvenecimiento, implicaría la reversión
completa del proceso de maduración (Fraga et al., 2002) simulando la reproducción sexual
(Pennel y Bell, 1987) y lograda en cultivo de tejidos vegetales a través de la embriogénesis
somática (Pierik, 1990).
Embriogénesis somática
A comienzos del siglo XX Haberlandt predijo que si todas las células de un organismo tenían
la misma información genética que la célula inicial, el cigoto, sería posible una «marcha atrás»
en su expresión génica, de tal forma que volvieran a expresar el patrón de desarrollo
embriogénico hasta formar auténticos embriones de origen somático, expresando la
totipotencia celular. Esta posibilidad se verificó en células del parénquima de raíz de zanahoria
20
a finales de los años 50, y desde entonces se ha ampliado a cientos de especies diferentes
(Celestino et al., 2005)
Entre las estrategias de mejoramiento y propagación masiva, la embriogénesis somática es
considerada por algunos autores como la vía más poderosa de micropropagación (Bueno y
Manzanera, 1992; Mauri et al., 2001; Cevallos et al., 2002; Celestino et al., 2005). Esta vía de
regeneración tiene su origen en células somáticas de la planta donante las cuales se
“reprograman” y siguen un patrón de desarrollo idéntico al del embrión de origen cigótico
(bipolar) sin conexión con el tejido materno, pero conservando el genotipo de la planta
donadora (Merkle y Dean, 2000; Mauri et al., 2001).
La embriogénesis somática, presenta ventajas como su elevado potencial de multiplicación en
cultivo semisólido, líquido o en biorreactores, la opción de aplicar técnicas de encapsulación
para fabricar semillas sintéticas y la posibilidad de utilizar los cultivos embriogénicos como
dianas adecuadas para la transformación genética (Celestino et al., 2005).
En el proceso de embriogénesis somática la maduración de los embriones es el problema
principal, debido a que la mayoría de los embrioides necesitan de la aplicación de agentes
inductores de maduración, que permitan un completo desarrollo hasta su conversión a planta
(Corredoira et al., 2003; Miguel et al., 2004). En general, se busca obtener una producción
sincrónica y de calidad de los embriones; es decir, que se asemejen o tengan un desarrollo
similar a los embriones cigóticos (Ec) maduros de la especie (Celestino et al., 2005).
Organogénesis (caulogénesis adventicia)
La organogénesis es una vía eficaz para la propagación de genotipos seleccionados y, a
diferencia de la embriogénesis somática, presenta un desarrollo unipolar a partir de un
primordio o brote vegetativo, existiendo siempre una conexión con el tejido materno o callo
21
(organogénesis indirecta) (Jiménez, 1998). Diversos estudios señalan que tejidos iníciales de
origen embrionario (cotiledones y eje embrionario) reaccionan con mayor facilidad para
generar embriogénesis somática (Bueno y Manzanera, 1992; Fernández et al., 1997; Onay,
2000; Mauri et al., 2001; Zegzouti et al., 2001; Cangahuala et al., 2007). No obstante, tejidos
adultos más diferenciados como pecíolos, yemas y hojas generalmente siguen una ruta
organogénica generando una estructura caulinar y/o rizogénica (Lara et al., 2003; Concepción
et al., 2004; Larson et al., 2006).
Independiente de la ruta morfogénica a seguir, existen limitaciones dentro de sus etapas de
desarrollo que pueden explicarse por condiciones de cultivo, genotípicas y ontogénicas entre
otras (Orellana, 1998). Para obtener plantas completas y viables en condiciones ex vitro, la
caulogénesis adventicia necesita pasar por una fase de enraizamiento que es clave para tener
éxito en este sistema de propagación (Gómez et al., 2007).
CERTIFICACIÓN CLONAL DE NOTHOFAGUS ALPINA, MEDIANTE
MARCADORES MOLECULARES.
¿Clonación y estabilidad genética?
Las diferentes rutas morfogénicas utilizadas como sistema de propagación en cultivos de
tejidos, suponen una rápida sucesión de divisiones celulares, durante las cuales las
microplantas en desarrollo están sometidas a una amplia variedad de situaciones estresantes
(Larkin y Scowcroft, 1981). Estas condiciones con frecuencia afectan la estabilidad del
genoma, con lo cual es posible obtener variación de origen nuclear y/o citoplasmática, por lo
tanto, encontrar individuos fenotípicamente y/o genéticamente distintos a la planta madre
(Smýkal et al., 2007), los cuales podrían ser inducidos por las condiciones de cultivo, aunque
22
las causas más comunes de variación se asocian a modificaciones en el ADN o cambios
epigenéticos que podrían ser útiles en programas específicos de mejora, pero en la clonación
de individuos la variación de cualquier tipo es indeseada (Phillips et al., 1994; Rani y Raina,
2000). Este fenómeno se denomina “variación somaclonal” y se define como la variación
fenotípica y genética entre plantas propagadas clonalmente a partir de un clon donador simple
(Larkin y Scowcroft, 1981; Medina et al., 2007).
El cultivo de tejidos vegetales in vitro, como proceso de producción de plantas conlleva una
serie de riesgos que implica generar a corto o largo plazo individuos fenotípicamente y/o
genéticamente distintos a la planta madre. Por lo tanto, antes que las diferentes rutas
morfogénicas puedan ser explotadas como sistemas de propagación masivos, es necesario
evaluar mediante el uso de marcadores moleculares, los regenerantes no fieles al genotipo,
previo a su manifestación fenológica (Merkle y Dean, 2000; Botta et al., 2004).
Un marcador molecular es cualquier fenotipo molecular que proviene de la expresión de un
gen o de segmentos específicos de ADN, que puede ser detectado y su herencia monitoreada.
En un cruzamiento genético, las características de interés seguirán generalmente unidas a los
marcadores moleculares. Por lo tanto, se pueden seleccionar individuos en los que el marcador
molecular esté presente (Semagn et al., 2006) También son utilizados para detectar la
variación somaclonal con gran precisión y en menos tiempo que los análisis fenotípicos
(Medina et al., 2007).
A pesar de su importancia ecológica y económica dentro de las especies nativas, aún son
pocos los estudios moleculares (Marchelli et al., 1998; Mattioni et al., 2002), filogenéticos
(Hill y Jordan, 1993; Manos, 1997; Setoguchi et al., 1997) y de variación genética entre
23
poblaciones mediante marcadores genéticos isoenzimaticos que se han llevado a cabo en
especies del género Nothofagus (Marchelli y Gallo, 2000a, b; Gallo et al., 2006).
Marcadores como los RAPD (Amplificación aleatoria de fragmentos polimórficos de DNA) e
ISSR (Inter-microsatelites) han sido utilizados en la caracterización de N. nervosa, N. obliqua
y N. dombeyi, evaluado el grado de polimorfismo generado y la detección de polimorfismos en
el inter-loci, utilizando un cebador diseñado a partir de dinucleótido o trinucleótidos de
secuencia repetitiva (Mattioni et al., 2002). Sin embargo, no se reportan estudios de su
aplicación en detección de variación somaclonal en N. alpina, a pesar de que sí han sido
utilizados en otras especies y particularmente, durante embriogénesis somática de Quercus
robur (Wilhelm et al., 2005).
Los RAPDs, polimorfismos derivados de amplificación aleatoria de PCR de sitios específicos
e identificables del ADN, han mostrado ser una herramienta efectiva para detectar variación
somaclonal en un gran número de especies (Hashmi et al., 1997; Santana et al., 1999;
Linacero et al., 2000), sin embargo, algunos estudios los han reportado como problemáticos y
poco claros en comparación con otros marcadores como los AFLPs (Polimorfismo de
Longitud de los Fragmentos Amplificados), al momento de detectar variación somaclonal
(Fourré et al., 1997). Los AFLPs, permiten la identificación de un gran número de
polimorfismos con respecto a otras técnicas como los RFLPs (polimorfismos de longitud de
fragmentos de restricción) o los RAPDs (Gonzaga, 2004). Consisten en polimorfismos
derivados de la digestión de ADN genómico, ligación de pequeños oligonucleótidos a los
extremos de corte y amplificación utilizando iniciadores homólogos al adaptador. Es una
técnica relativamente fácil de ejecutar, es reproducible y utiliza pequeñas cantidades de ADN
(Medina et al., 2007).
24
Visto así, todas estas herramientas biotecnológicas, son hoy una realidad en varias especies y
pueden ser aplicadas para rescatar lo mejor de la micropropagación en N. alpina, de manera de
experimentar un salto definitivo desde la eterna promesa de ésta especie con potencial
silvícola, hacia la consolidación como alternativa real con aplicación industrial en el sector
forestal. Sin embargo, y tal como se analiza en los apartados anteriores, es necesario disponer
de metodologías eficaces que permitan la multiplicación de árboles juveniles y adultos de
manera de prever de un modo fiable el comportamiento de los individuos propagados
(Rodríguez et al., 2005; Sánchez-Olate et al., 2005).
HIPÓTESIS
Debido a lo expuesto anteriormente, en esta Tesis Doctoral se postula las siguientes hipótesis
de trabajo:
a) La maduración de los embriones somáticos, regulada por condiciones hormonales es
determinante para obtener plantas in vitro, y mediante la técnica molecular AFLP es
posible determinar su fidelidad clonal.
b) La respuesta morfogénica de material adulto implica revigorización y está regulada
por condiciones hormonales que permiten obtener plantas in vitro, y mediante la
técnica molecular AFLP es posible determinar su fidelidad clonal.
OBJETIVO GENERAL
Estudiar el efecto ontogénico y validar las rutas morfogénicas, obtenidas desde material
embrionario y adultos de N. alpina, a través de análisis hormonales, histológicos y genéticos,
con el fin de obtener plantas con fidelidad clonal.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
25
1. Evaluar el efecto de ABA exógeno sobre la maduración de embriones somáticos en
comparación con niveles endógenos de embriones somáticos y cigóticos de Nothofagus
alpina
2. Establecer metodologías de cultivo in vitro de material adulto evaluando tipo de tejido a
introducir y respuesta de inducción morfogénica (organogénesis y/o embriogénesis
somática).
3. Caracterización histológica de los estados embriogénicos y respuestas morfogénicas
obtenidas, para determinar revigorización y/o rejuvenecimiento del material adulto.
4. Evaluar la estabilidad genética de las líneas morfogénicas obtenidas a través de la técnica
molecular AFLP.
26
LITERATURA CITADA
Azcón-Bieto J. y M. Talón. 2000. Fundamentos de Fisiología Vegetal (Ed)
McGrawHill/Interamericana. Barcelona. España.
Botta, R. Marinoni, D. y G. Bounous. 2004. Molecular marker and certification. In: R.
Kellison, S. Mccord y K. Gatland (Eds). Proceedings of the Forestry Biotechnology
Workshop, Global Biotechnological Forum. 2-5 March, 2004, Concepción, Chile. pp. 63-72.
Bueno, M.A. y J.A. Manzanera. 1992. Primeros ensayos de inducción de embriones somáticos
de Quercus suber L. Scientia Gerundesis 18: 29-37.
Burschel, P; Gallegos, C; Martínez, O. y W. Moll. 1976. Composición y Dinámica
regenerativa de un bosque virgen mixto de raulí y coigue. Universidad Austral de Chile,
Valdivia. Bosques (Chile) 1:55-74.
Cabrera, J. 2000. Importancia económica de los bosques de Nothofagus alpina y Nothofagus
obliqua pp: 11-23. En: Ipinza, R; B, Gutiérrez y V, Emhart (Eds). Domesticación y mejora
genética de raulí y roble. Universidad Austral de Chile. Instituto Forestal.
Cangahuala, G; L, Dal; D, Steinmacher; A, Torres y M, Guerra. 2007. Improvements in
somatic embryogenesis protocol in Feijoa (Acca sellowiana (Berg) Burret): Induction,
conversion and synthetic seeds. Scientia Horticulturae 111: 228–234
Castellanos, H; M. Sánchez-Olate y D. Ríos. 2005. Embriogénesis somática como alternativa
potencial para la regeneración in vitro del género Nothofagus. pp: 59-74. In: Gutiérrez B., O.
Ortiz, y M. P. Molina (Eds). Clonación de Raulí. Estado Actual y Perspectivas. INFOR
CEFOR UACH.
27
Celestino, C; I. Hernández; E. Carneros; D. López-Vela y M. Toribio. 2005. La embriogénesis
somática como elemento central de la biotecnología foerestal. Invest Agrar: Sist Recur For:
14(3): 345-357.
Cevallos, M; S. Sánchez y S. Montes. 2002. Caracterización histológica de la embriogénesis
en Coffea canephora P.var. robusta. Rev. Protección Veg. 17 (1):14-19.
Concepción, O; L, Nápoles; A, Pérez; N, Peralta y R, Trujillo. 2004. Regeneración de brotes
adventícios de brotes adventicios en hojas de guayaba (Psidium guajava L.) cultivadas in
vitro. Revista Colombiana de Biotecnología. 2:54-61.
Corredoira, E; Ballester, A. y A. M. Vieitez. 2003. Proliferation, maturation and germination
of Castanea sativa Mill. somatic embryos originated from leaf explants. Annals of Botany.
92: 129-136.
Donoso C, Lara A. (1995). Utilización de los bosques nativos en Chile: pasado, presente y
futuro. In: Ecología de los bosques nativos de Chile., Armesto J.J., et al (ed). Editorial
Universitaria, Santiago de Chile, Chile. Pp.363-388.
Donoso, P., Donoso, C., Marchelli, P., Gallo, L., and Escobar, B. (2006). Nothofagus nervosa
(Phil.) Dim. Et Mil. In Las especies arbóreas de los bosques templados de Chile y Argentina
Autoecología, C. Donoso, ed. (Valdivia, Chile, Marisa Cuneo Ediciones), pp. 448-461.
Fernández-Galiano, E.; Mauri, P. V. and G. García. 1997. Somatic embryogenesis induction
on Quercus faginea LAMK. Acta Horticulturae. 447: 143-145.
Fraga M.F., Rodríguez R. and Cañal M.J. 2002. Genomic DNA methylationdemethylation
during ageing-reinvigoration of Pinus radiata D.Don. Tree Physiol. 22:813–816.
28
Fourré, J.L; P. Berger; L. Niquet and P. André. 1997. Somatic embryogenesis and somaclonal
variation in Norway spruce: morphogenetic, cytogenetic and molecular approaches,
Theoretical and Applied Genetics. 94: 159 169.
Gallo, L; Marchelli, P; Azpilicueta, M. y P. Crego. 2006. El uso de marcadores genéticos en el
género Nothofagus con especial referencia a raulí y roble. Bosque 27 (1): 3-15.
Gezan, S. Ortega, A. Andenmatten, E. 2007. Diagramas de manejo de densidad para renovales
de roble, raulí y coigüe en Chile. Bosque (Valdivia) [online]. 2007, vol.28, n.2, pp. 97-105.
ISSN 0717-9200.
Gómez, C; D, Ríos y M, Sánchez-Olate. 2007. Efecto del subcultivo sucesivo sobre la
caulogénesis adventicia de Eucalyptus globulus. Bosque 28 (1):13-17.
Gonzaga, L. 2004. Marcadores moleculares AFLP de plantas donadoras de aliso Alnus
acuminata H.B.K. Scientia et Technica. 25:285-289.
Greenwood, M. 1995. Juvenility and maturation in conifers: current concepts. Tree.
Physiology 15:433-438.
Grosse, H. y I, Quiroz. 1998. Silvicultura de los bosques de segundo crecimiento de Roble,
Raulí y Coigüe en la región Centro Sur de Chile. pp:95-128. En: Donoso, C. y Lara, A.
(Eds.) Silvicultura de los Bosques Nativos de Chile. Editorial Universitaria. Santiago. Chile.
Hasbún R. 2006. Monitorización (epi)-genética del desarrollo y producción de planta de
castaño (Castanea sativa Mill.). Tesis Doctoral. Universidad de Oviedo.
Hashmi G; R. Huettel; R. Meyer; L. Krusberg and F. Hammerschlag.1997. RAPD analysis of
somaclonal variants derived from embryo callus culture of peach, Plant Cell Rep. 16: 624-
627.
29
Hill, RS, and GJ, Jordan. 1993. The evolutionary history of Nothofagus (Nothofagaceae). Aust
Syst Bot 6:111–12.
Instituto Forestal.1996. El Sector Forestal en Chile. Informe Técnico N° 137. INFOR-
CORFO.Chile.
Ipinza, R. y B, Gutiérrez. 2000. Estrategia de Mejora Genética para Nothofagus alpina y
Nothofagus obliqua en Chile. En: Ipinza, R; B, Gutiérrez y V, Emhart (eds). Domesticación
y Mejora genética de Raulí y Roble. Universidad Austral de Chile. Instituto Forestal.
Jiménez, E. 1998. Generalidades del cultivo in vitro. pp. 13–24. En: J.N. Pérez P. (Ed.)
Propagación y Mejora Genética de Plantas por Biotecnología. Instituto de Biotecnología de
las Plantas, Santa Clara, Cuba.
Jordan, M.; Velozo, J. y A. M. Sabja. 1996. Organogénesis in vitro of Nothofagus alpina (P. et
E.) Oerst. Fagaceae. Plant Cell Reports. 15 (10): 795-798.
Lara, A; Valverde, R y L, Gómez. 2003. Histología de embriones somáticos y brotes
adventicios inducidos en hojas de Psychotria acuminata. Agronomía Costarricense. 27(1):
37-48. 2003
Larkin, PJ and WR, Scowcroft 1981. Somaclonal variation a novel source of variability from
cell cultures for plant improvement. Theor Appl Genet 60:443–455.
Larson, C; C. Gómez; M, Sánchez-Olate y D, Ríos. 2006. Inducción de caulogénesis indirecta
en Eucalyptus globulus. Bosque 27 (3): 250-257.
Linacero, R; E, Freitas Alves y A.M. Vázquez. 2000. Hot spots of DNA instability revealed
through the study of somaclonal variation in rye. Theoretical and Applied Genetics. 100:506-
511.
30
Loewe, V.; Toral, M.; Freitte, G.; Camelio, M.; Mery, M.; López, C y E. Urquieta. 1997.
Monografía de Raulí. Nothofagus alpina. CONAF, INFOR, FIA. Santiago. Chile.
Manos, PS. 1997. Systematics of Nothofagus (Nothofagaceae) based on rDNA spacer
sequences (ITS): taxonomic congruence with morphology and plastid sequence. Am J Bot
84:1137–1155.
Margara, J. 1988. Multiplicación vegetativa y cultivo in Vitro. Ediciones Mundi-Prensa.
Madrid. España.
Martínez-Pastur, G. and M. Arena. 1996. In vitro propagation of Nothofagus nervosa (Phil.)
Dim. et Mil. Phyton. 58 (1/2): 1-7.
Marchelli P; L, Gallo; F, Scholz and B, Ziegenhagen.1998. Chloroplast DNA markers reveal a
geographical divide across the Argentinean southern beech Nothofagus nervosa (Phil.) Dim
et Mill. distribution area. Theor Appl Genet 97:642–646.
Marchelli, P and L.A. Gallo. 2000a. Genetic analysis of isozyme variants in open-pollinated
families of Southern beech Nothofagus nervosa (Phil.) Dim. et Mill. Silvae Genet, 4:90–98.
Marchelli, P y L.A. Gallo. 2000b. Variación aloenzimática, de ADN de cloroplasto y de ADN
nuclear en poblaciones y progenies de raulí en Argentina. En: Ipinza Carmona R, Gutiérrez
Caro B, Emhart Schmidt V (eds) Domesticación y Mejora Genética de raulí y roble,
Universidad Austral de Chile-Instituto Forestal. Valdivia, Chile, pp 157–180
Mattioni, C; M, Casasoli; M, Gonzalez; R, Ipinza and F. Villani. 2002. Comparison of ISSR
and RAPD markers to characterize three Chilean Nothofagus species. Theor Appl Genet
104:1064–1070.
Mauri, P. V.; Manzanera, J. A. y M, Marcote. 2001. Cyclic somatic embryogenesis and
scheme for multiplication of Quercus ilex L. Acta Horticulturae. 560: 517-520.
31
Medina, C; I, García; M, Caro y F, Aristizábal. 2007. Análisis AFLP de variación somaclonal
en embriones somáticos de Hevea brasiliensis. Rev. Col. Cienc. Quím. Farm. Vol. 36 (1),
70-80.
Merkle S.A. and J.F.D. Dean 2000. Forest tree biotechnology. Current Opinion Biotech 11,
298-302.
Miguel, C; S. Gonçalves; S. Tereso, L. Marum and M.M. Oliveira. 2004. Somatic
embryogenesis from 20 open-pollinated seed families of Portuguese plus trees of maritime
pine. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 76:121–130.
Onay, A. 2000. Histology of Somatic Embryogenesis in Cultured Leaf Explants of Pistachio
(Pistacia vera L). Turk J Bot. 24: 91–95
Orellana, P. 1998. Introducción a la Propagación Masiva. pp 125-133. En: J.N. Pérez P. (Ed.)
Propagación y Mejora Genética de Plantas por Biotecnología. Instituto de Biotecnología de
las Plantas, Santa Clara.Cuba.
Pennell, R. I. Bell, P. R. 1987. Megasporogenesis and the subsequent cell lineage within the
ovule of Taxus baccata L. Ann. Bot. 59, 693-704.
Phillips, R; S, Keppler and P, Olhoft. 1994. Genetic variability of plant tisúes cultures:
Breakdown of normal controls. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :5222- 5226.
Pierik, R.1990. Cultivo in vitro de las plantas superiores. Ediciones Mundi-Prensa. Madrid
España.
Rani, V. and S, Raina. 2000. Genetic fidelity of organized meristem-derived micropropagated
plants: A critical reappraisal. In vitro Cell. Dev. Biol., Plant 36:319-330.
32
Rodríguez, R; M, Fernández; J. Pacheco y M.J, Cañal. 2005. Envejecimiento vegetal, una
barrera a la propagación. Alternativas. Pp 29-48. En: Sánchez-Olate. M. y Ríos. D. (Eds.)
Biotecnología Vegetal en Especies Leñosas de Interés Forestal. Departamento de
Silvicultura. Facultad de Ciencias Forestales. Universidad de Concepción. Concepción –
Chile.
Sabja, A.M, O. Ortiz y C. Triviño. 2008. Avances de clonación in vitro de árboles adultos de
Raulí (Nothofagus alpina poepp. et endl.) oerst.) para propagación comercial. Agrociencia.
42: 595-603.
Sánchez-Olate, M.; Ríos, D. y Escobar, R.2005. La Biotecnología Vegetal y el Mejoramiento
Genético de Especies Leñosas de Interés Forestal y sus Proyecciones en Chile, pp 17-28. En:
Sánchez-Olate. M. y Ríos. D. (Eds.) Biotecnología Vegetal en Especies Leñosas de Interés
Forestal. Departamento de Silvicultura. Facultad de Ciencias Forestales. Universidad de
Concepción. Concepción – Chile.
Satelices, R. 1993. Propagación vegetativa de Raulí, Roble y Coigue a partir de estacas.
Ciencia e investigación forestal. INFOR. Volumen 7- Número 1.
Santana, C; Oliveira, C. and T, Valdivieso. 1999. Molecular typing of rootstock hybrids
(Castanea sativa x Castanea crenata) and Portuguese Castanea sativa cultivars based on
RAPD markers. Acta Hort. 494:295-301.
Setoguchi H; M, Ono; Y Doi; H, Koyama and M, Tsuda 1997. Molecular phylogeny of
Nothofagus (Nothofagaceae) based on the atpB-rbcL intergenic-spacer of chloroplast DNA. J
Plant Res 110: 469–484.
Semagn, K; Bjørnstad, Å and M. N. Ndjiondjop. 2006. An overview of molecular marker
methods for plants. African Journal of Biotechnology Vol. 5 (25): 2540-2568.
33
Smýkal, P; L. Valledor; R. Rodrıíguez and M, Griga. 2007. Assessment of genetic and
epigenetic stability in long-term in vitro shoot culture of pea (Pisum sativum L.). Plant Cell
Rep 26:1985–1998.
Valledor, L; Hasbún, R; Meijón, M; Rodríguez, J.L; Santamaría, E; Viejo, M; Berdasco, M;
Feito, I; Fraga, M; Cañal, M.J and R, Rodríguez. 2007. Involvement of DNA methylation in
tree development and micropropagation. Plant Cell Tiss Organ Cult 91:75–86.
Wilhelm, E; Hristoforoglu, K; Fluch, S. and K. Buró, 2005. Detection of microsatellite
instability during somatic embriogénesis of oak (Quercus robur L.). Plant Cel. Rep. 23:790-
795.
Zegzouti, R; Arnould, M.F and J.M, Favre. 2001. Histological investigation of the
multiplication step in secondary somatic embryogenesis of Quercus robur L. Ann. For. Sci.
58:681–690.
34
CAPITULO 1
CUANTIFICACIÓN ENDÓGENA DE ÁCIDO ABSCÍSICO Y ÁCIDO INDOL-3
ACÉTICO EN EMBRIONES SOMÁTICOS Y CIGÓTICOS DE Nothofagus alpina
(Poepp. & Endl.) Oerst.
Priscila Cartes Riquelme1*, Darcy Rios Leal1, Kátia Sáez Carrillo1, Matilde Uribe Moraga1, Sofia
Valenzuela Aguilar1, Stephen Joseph Bolus2, Manuel Sánchez Olate1
1Universidad de Concepción, Facultad Ciencias Forestales, Casilla 160-C, Concepción, Chile. *Autor para correspondenciar ([email protected]). 1Universidad de Concepción, Facultad de Ciencias Físicas y Matemáticas, Av. Esteban Iturra s/n - Barrio Universitario, Concepción, Chile. 2Clemson University, Department of Biochemistry, 100 Jordan Hall Clemson, SC 29634 USA.
RESUMEN
El acido abscísico (ABA) y el ácido indol 3 acético (AIA) participan en el proceso de
propagación de plantas mediante embriogénesis somática, ya que permiten la diferenciación
de la estructura polar del embrión, órganos y regiones meristemáticas de éste. En este estudio
se llevó a cabo un ensayo de maduración de masas proembriogénicas en estado cotiledonar
con la adición de diferentes concentraciones de ABA exógeno para luego comparar niveles
endógenos de ABA y AIA en embriones somáticos (Es) y cigóticos (Ec) de Nothofagus
alpina, previa determinación de niveles endógenos entre embrión cigótico inmaduro, embrión
cigótico maduro y eje embrionario aislado desde el embrión maduro. La cuantificación se
realizó mediante cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC). Los tratamientos de
maduración estudiados incrementan los niveles endógenos de ABA en Es no existiendo
diferencias significativas entre las diferentes concentraciones estudiadas. Al comparar los
niveles de ABA y AIA endógeno entre Es sometidos a los diferentes tratamientos de
maduración y los embriones cigóticos maduros de N. alpina, se observan niveles
significativamente mayor en los Ec. La aplicación de ABA exógeno al medio de cultivo
35
aumentó significativamente el número de embriones somáticos germinados lo que permite
optimizar el proceso de conversión a planta de embriones somáticos de raulí.
Palabras clave: embriogénesis somática, maduración, germinación, ácido abscísico.
ABSTRACT
Abscisic acid (ABA) and indole-3-acetic acid (IAA) participate in the propagation of plants by
somatic embryogenesis, causing polar structural differentiation of the embryo. The goal of the
assay was to compare endogenous levels of ABA and IAA between somatic embryos (SE) and
zygotic embryos (ZE) of N. alpina. In this study, a somatic embryo maturation assay involving
the addition of varying concentrations of exogenous ABA was performed on cotyledonary-
stage of Nothofagus alpina (Poepp. & Endl.) Oerst. Furthermore, the endogenous levels of
ABA and IAA were quantified in the immature ZE, the mature ZE, and the embryonic axis of
a mature embryo of N. alpina. The current study utilized high performance liquid
chromatography (HPLC) for quantification. The maturation treatments performed did not
present significant differences in the endogenous ABA levels in SE. However, significant
differences did exist in the levels of ABA and IAA between SE submitted to the different
maturation treatments and mature ZE of N. alpina. The application of exogenous ABA to the
culture medium increased endogenous ABA levels, therefore, increasing the number of
germinated somatic embryos. Thus, the plant conversion process was also successfully
completed in somatic embryos of N. alpina.
Keywords: Somatic embryogenesis, maturation, germination, HPLC.
36
INTRODUCCION
Nothofagus alpina (Poepp. et Endl.) Oerst, raulí, es una de las especies integrantes del bosque
nativo con mayor potencial de uso comercial por su rápido crecimiento y calidad de su madera
(Gutiérrez 2000). En la actualidad ésta especie cobra gran importancia como factor de
diversificación de la producción forestal. Sin embargo, el deterioro y reducción dramática de
su superficie por la implementación de sistemas agroganaderos y sustitución por plantaciones
con especies exóticas de rápido crecimiento (Donoso y Lara 1995) establecen la necesidad de
aplicar herramientas biotecnológicas, con el fin de potenciar caracteres y cualidades internas
de las plantas que aumenten la productividad y sostenible del recurso en el tiempo (Pérez
1998).
Entre las técnicas de propagación masiva, la embriogénesis somática es considerada por
algunos autores como la vía más poderosa de micropropagación basada en el cultivo de tejidos
vegetales in vitro (Cevallos et al. 2002). Esta vía de regeneración tiene su origen en células
somáticas de la planta donante las cuales se “reprograman” y siguen un patrón de desarrollo
idéntico al del embrión de origen cigótico, conservando el genotipo de la planta donadora
(Merkle y Dean 2000; Celestino et al. 2005).
En raulí se ha logrado obtener embriones somáticos a partir de semilla madura, previa
generación de masas proembriogénicas condicionado por la aplicación de altas dosis de
auxinas y citoquininas en la fase de inducción. La multiplicación y mantenimiento de la línea
clonal se ha realizado mediante embriogénesis somática secundaria (Ess), la cual es
aparentemente ilimitada en el tiempo y proporciona un potencial multiplicativo a esta técnica
(Castellanos et al. 2005).
37
En el proceso de embriogénesis somática la maduración deficiente de los embriones es el
problema principal, por lo tanto es necesaria la aplicación de tratamientos de maduración que
permitan el desarrollo de los embriones a etapas posteriores (Corredoira et al. 2003; Miguel et
al. 2004). En general, se busca obtener una producción sincrónica y de calidad de los
embriones; es decir, que se asemejen o tengan un desarrollo similar a los embriones cigóticos
(Ec) maduros de la especie (Celestino et al. 2005).
Se han reportado numerosas similitudes morfológicas y bioquímicas entre un proceso
embriogénico de origen somático y cigótico (Tereso et al. 2007). Sin embargo, se presentan
diferencias encontradas principalmente en el proceso de desarrollo y maduración de los
embriones somáticos, por lo tanto, generalmente deben practicarse secuencias de cultivo que
incluyan una fase que promueva la maduración de embriones somáticos, previo a la
germinación, simulando el proceso cigótico (Palada-Nicolau y Hausman 2001).
En general, los estudios señalan al ácido abscísico (ABA) como el regulador principal de la
maduración de embriones somáticos (Es), observando un efecto positivo en el control de la
Ess en Quercus suber (García–Martin et al. 2005) y la acumulación de sustancias de reserva
(Gupta y Grob 1995).
El desarrollo de la semilla consta de tres fases; embriogénesis o fase temprana, maduración o
fase media y desecación o fase tardía, dentro de estas fases el ABA juega un papel
fundamental (Azcon y Talón 2000). Tanto en la embriogénesis somática como cigótica el
incremento en los niveles de ABA al principio y durante la etapa media del desarrollo de la
semilla controla y regula la síntesis de proteínas implicadas en la tolerancia a la desecación.
38
Estas proteínas son abundantes en los estados medios y avanzados de las semillas acumulando
ARNm que codifican proteínas de reserva conocidas como proteínas LEA (Late–
embryogenesis-abundant) (Dodeman et al. 1997; Azcon y Talón 2000; Finkelstein et al. 2002;
Von Arnold et al. 2002; Pandey et al. 2008).
Algunos estudios señalan al ácido indol 3-acético (AIA) como un factor importante para
describir el comportamiento que presenta el ABA en el proceso de embriogénesis. La
biosíntesis de AIA aumenta durante el desarrollo del embrión cigótico hasta llegar a la fase de
maduración temprana (Von Arnold et al. 2002). Sin embargo, Hansen y Grossman (2000)
reportan que la auxina puede inducir la síntesis de novo de ABA endógeno en Galium aparine.
En este sentido, Miller et al. (1994) postulan que la diferencia de desarrollo observada entre Es
y Ec, expresada en las tasas de germinación, debería atribuirse a la falta de señales maternales
por parte del tejido somático, las que permitan la síntesis de novo de ABA y de otros
reguladores necesarios para el desarrollo, lo cual es un aspecto clave en la fase de maduración
del embrión.
De acuerdo a lo anterior, este estudio tiene como objetivo evaluar el efecto de la aplicación de
ABA exógeno, sobre la maduración de embriones somáticos en comparación con niveles de
ABA endógenos de embriones somáticos y cigóticos maduros de N. alpina, con el fin de
obtener embriones somáticos de calidad para la germinación.
39
MATERIALES Y MÉTODOS. Material vegetal.
Se empleó material vegetal procedente de la línea embriogénica de N. alpina RaC-01 (raulí
explanto cotiledonar 01), inducida desde cotiledones aislados de semillas maduras, las cuales
fueron obtenidas a través de polinización controlada (Castellanos et al. 2005). Luego de la
inducción de callo embriogénico y manifestación de embriones somáticos, el cultivo se
dispuso en medio de mantención, consistente en la solución mineral y vitaminas Broadleaved
Tree Medium (BTM) (Chalupa 1983), más los reguladores del crecimiento 6-
bencilaminopurina (BAP) y ácido indolbutírico (AIB) a concentraciones de 0,1 mgL-1
suplementado con 30 gL-1 de sacarosa y 7,0 gL-1 de agar. Se practicaron subcultivos a medio
fresco cada 28 días, los subcultivos en medio nutritivo se alternaron conteniendo reguladores
del crecimiento y en medio base BTM, sin reguladores. Los explantos permanecieron en estas
últimas condiciones hasta el comienzo de los ensayos.
Material de inicio.
El material de inicio para cada uno de los ensayos de maduración consistió en masas pro-
embriogénicas (MPE) de la línea clonal RaC-01, con presencia de embriones somáticos en
estado cotiledonar. Se seleccionaron MPE, cuyo peso fresco al inicio de los tratamientos de
maduración fuera entre a 40 -70 mg. El peso fresco inicial de cada explanto fue registrado.
Para la cuantificación de ABA se extrajo desde semillas colectadas durante el mes de
diciembre, el embrión inmaduro y de semillas colectadas durante el mes de marzo, el embrión
maduro. Además para evaluar el almacenamiento de ABA dentro del embrión maduro se aisló
40
el eje embrionario y los cotiledones, con el fin de obtener el mejor parámetro al comparar los
niveles endógenos de ABA entre embriones somáticos y cigóticos.
Ensayo de Maduración de Embriones somáticos
Se llevaron a cabo cuatro tratamientos de maduración con la aplicación de ABA al medio de
cultivo incluyendo al testigo en concentraciones de 0, 2, 3 y 5 mgL-1 (T1, T2, T3 y T4,
respectivamente). En todos los casos, se empleó la solución mineral BTM como medio base,
más 60 gL-1 de sacarosa y 7,0 gL-1 de agar. El cultivo se mantuvo en oscuridad continua a una
temperatura de 25 ± 1ºC de día y 22 ± 1ºC de noche. Después de tres semanas de cultivo se
procedió a evaluar el incremento en peso fresco (IPF) de las MPE, registrando el peso final.
Además se evalúa presencia de embriogénesis somática secundaria (Ess) por cada tratamiento.
Ensayo de Germinación de Embriones somáticos
Posterior a la fase de maduración, se procedió a subcultivar las MPE en BTM base sin
reguladores del crecimiento, por un periodo de tres semanas. Luego se procede a la fase de
germinación, aislando 10 muestras al azar de MPE sometidos a los tratamientos de
maduración, se procura dejar en la MPE embriones somáticos en estado cotiledonar y luego
son cultivados en medio BTM con los macronutrientes diluidos a un 25% (v/v), suplementado
con 30 gL-1 de sacarosa, 7,0 gL-1 de agar y 0,1 mg l-1 GA3, ésta última fue esterilizada
mediante filtración y aplicada al medio después de ser autoclavada a 121ºC y 1 atmósfera de
presión, durante 20 min. El cultivo se mantuvo durante los primeros 7 días en oscuridad y
posteriormente bajo condiciones de fotoperíodo de 16 h, temperatura de 25 ± 1ºC en el día y
22 ± 1ºC en la noche, durante tres semanas.
Cuantificación de ABA y AIA.
41
Extracción de ABA y AIA
La extracción de ABA y AIA libre se realizó según la metodología propuesta por Valenzuela
et al. (1998) con algunas modificaciones. Para realizar la comparación de niveles endógenos
de ABA entre embriones somáticos y cigóticos se tomaron como muestra 100 mg de tejido
fresco para embriones cigóticos maduros (Ec), embriones cigóticos inmaduros (Ei), eje
embrionario aislado desde el embrión maduro (Eec). Luego se cuantificaron los niveles de
ABA y AIA de embriones somáticos (Es) en estado cotiledonar de N .alpina aislados desde las
MPE sometidas a los diferentes tratamientos de maduración.
El tejido fue homogenizado en nitrógeno líquido y resuspendido en 10 ml de metanol al 80%
(v/v) en agitación constante de 150 rpm a 4°C durante 12 h. Posteriormente las muestras
fueron filtradas con papel hidrofóbico de 0,22 µm de porosidad y el extracto concentrado en
rotavapor a 50 °C para eliminar el metanol. Luego se agregaron 5 mL de agua des-ionizada y
se ajustó el pH a 2.0 para realizar una nueva extracción con 10 mL de acetato de etilo, la cual
fue repetida tres veces formando una fase acuosa que contenía ABA y AIA conjugado y otra
orgánica que contenía ABA y AIA libre. Nuevamente las muestras de la fase orgánica (ABA y
AIA libre) fueron concentradas en rotavapor a 50°C hasta obtener un residuo completamente
seco. Finalmente el residuo fue resuspendido en 300 µl de metanol absoluto y mantenido en
frío (-80°C) hasta la cuantificación.
Calibración de la curva Standard de ABA y AIA
Para realizar la curva standard de ABA y AIA se preparó una solución de ABA Sigma® y AIA
Merk® con un 99% de pureza a una concentración de 25 µg mL-1. Para la calibración de la
42
curva se prepararon diluciones sucesivas de 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 µg mL-1 de ABA y 0.5, 1.0, 1.5
y 2.5 µg mL-1 de AIA.
Cuantificación de ABA y AIA mediante HPLC.
El extracto resuspendido en 300 µL de metanol absoluto en la fase de extracción fue filtrado
en papel hidrofóbico de 0,22 µm para luego realizar la cuantificación en HPLC Shimadzu con
detector arreglo de diodo SPD- M 10 A vp, sistema controlador SCL-10 AVP y bomba FCV-
10 AL vp. ABA y AIA fueron separados mediante BioRad HPLC columna RP -18
Lichrospher® 100 (250 mm) a una temperatura de 30 °C con un flujo de 0,8 mL min-1.
Finalmente fueron comparados los cromatogramas obtenidos desde la cuantificación de las
muestras con los cromatogramas de los standard de ABA y AIA.
Variables Evaluadas
Para la fase de maduración se registró el peso inicial y final de las MPE sometidas a los
tratamientos de maduración (Figura 1.1 A), obteniendo el incremento en peso fresco (mg) al
cabo de tres semanas de cultivo. Además se evaluó por tratamiento la incidencia de
embriogénesis somática secundaria (Ess) (Figura 1.1 B) expresada en porcentaje (%). La fase
de germinación de Es en estado cotiledonar (Figura 1.1 C), se evaluó al cabo de cuatro
semanas
Como la germinación de embriones somáticos se ve alterada por las condiciones de cultivo
(inducción y maduración de los embriones) se presentan diferentes grados de germinación o
desarrollo a plántula. Para ello se utilizó una adecuación de los criterios de clasificación de la
germinación de Es descrita por (Vahdati et al. 2008), por lo cual se evaluó la germinación
según:
43
- Solo presencia caulinar
- Solo presencia radicular
- Presencia caulinar y radicular (plántula)
Figura 1.1 Diferentes aspectos de las MPE de Nothofagus alpina. A) MPE sometidas a los tratamientos de maduración. Barra 2 mm B) MPE presentando Embriogénesis somática secundaria. Barra 5 mm C) Embrión somático en estado cotiledonar. Barra 2 mm. Diseño Experimental.
En todos los casos se estableció un diseño experimental completamente aleatorio. En la etapa
de maduración, la unidad experimental estuvo constituida por una placa petri de 9 cm de
diámetro, conteniendo 6 MPE. En fase de cuantificación de ABA y AIA se realizaron 3
extracciones por tratamiento de maduración, Ec, Ei y Eec.
Del mismo modo, en la fase de germinación, la unidad experimental estuvo constituida por un
tubo de ensayo conteniendo MPE con embriones somáticos en estado cotiledonar. Se
realizaron 10 réplicas por tratamiento.
En todos los casos, los efectos de los tratamientos se evaluaron mediante ANDEVA, seguido
del test de Tukey al nivel p≤0,05 para comparar medias en fase de maduración. Previo al
A B C
44
análisis, los datos de cuantificación para ABA fueron transformados mediante la raíz
cuadrada; sin embargo, en los resultados se muestran los datos originales sin transformar.
Además para la fase de cuantificación se aplicó el test Dunnett de comparaciones múltiples,
para ver el efecto del ABA en los tratamientos de maduración en comparación con el ABA
endógeno encontrado en la Ec (control).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Ensayo de Maduración de Embriones somáticos
Durante la fase de maduración de las MPE se obtuvo una disminución significativa (p<
0,0019) del incremento en peso fresco (IPF) con respecto al control en las tres concentraciones
de ABA exógeno aplicado al medio de cultivo (Figura 1.2). Estos resultados coinciden con lo
planteado por García–Martin et al. (2005) que señalan una disminución significativa del peso
fresco a medida que aumenta la concentración de ABA exógeno al medio de cultivo. Esto se
fundamenta en que el ABA no influye de manera concluyente como regulador osmótico del
medio en que se encuentran los embriones somáticos. El aumento del peso fresco (IPF) según
estudios realizados en Quercus ilex y Juglans regia estaría relacionado con las condiciones de
cultivo y principalmente con la aplicación de altas concentraciones de sacarosa al medio (entre
30 y 90 g l-1) que se expresaría en la acumulación de sustancias de reservas por parte de los
embriones contribuyendo a la maduración de éstos (Mauri y Manzanera 2003; Vahdati et al.
2008).
45
Figura 1.2. Efecto de tratamientos con ABA sobre el Incremento en peso fresco (IPF) de las MPE somáticos de N. alpina. Tratamientos: T1: sin ABA; T2: ABA 2 mg l-1; T3: ABA 3 mg l-1; T4: ABA 5 mg l-1. Distintas letras indican diferencias significativas de acuerdo a test Tukey (P < 0.05).
Figura 1.3. Efecto de tratamientos con ABA sobre la embriogénesis somática secundaria (Ess), en embriones somáticos de N. alpina. Tratamientos: T1: sin ABA; T2: ABA 2 mg l-1; T3: ABA 3 mg l-1; T4: ABA 5 mg l-1. Distintas letras indican diferencias significativas de acuerdo a test Tukey (P < 0.05). La respuesta de la embriogénesis somática secundaria, como se aprecia en la Figura 1.3 no
presenta diferencias significativas en los tratamientos donde se adicionó ABA al medio de
46
cultivo, sin embargo, existen diferencias con el control que indican la disminución en la
frecuencia de Ess con la aplicación de ABA. Esto se reporta en diversos estudios realizados en
Quercus ilex (Mauri y Manzanera 2004), Castanea dentata (Robichaud et al. 2004), Quercus
suber (García–Martin et al. 2005) y Juglans regia (Vahdati et al. 2008) donde se busca
controlar la Ess para entrar en una fase de maduración o acumulación de sustancias de
reservas. La disminución del IPF y de la Ess en los tratamientos donde se aplicó ABA se
puede explicar por el efecto osmótico sumado a la capacidad del ABA de inhibir la
germinación precoz y control de la Ess (Manoj et al. 2008). Esto genera un mayor número de
divisiones y formación de embriones inmaduros en el tratamiento control, por lo tanto, se ve
reflejado en un mayor IPF en ausencia de ABA (T1), coincidiendo con resultados encontrados
en Quercus ilex (Mauri y Manzanera 2004).
Ensayo de Germinación de Embriones somáticos. La germinación de embriones somáticos se ve alterada por las condiciones de cultivo
(inducción y maduración de los embriones) por lo tanto generalmente se presentan diferentes
grados de desarrollo (germinación) y conversión a plántula. Al evaluar el número de
embriones somáticos germinados por gramo de peso fresco, según las categorías descritas en
la metodología se puede apreciar (Figura 1.4), que no se obtienen Es con presencia radicular y
que el mayor número de Es presenta solo desarrollo caulinar (Figura 1.5A y 1.5B) no
existiendo diferencias significativas en las concentraciones de ABA aplicados al medio de
cultivo.
47
Figura 1.4. Número de embriones somáticos presentando un polo caulinar y radicular desarrollado (Plántula) y solo desarrollo caulinar. T1: sin ABA; T2: ABA 2 mg l-1; T3: ABA 3 mg l-1; T4: ABA 5 mg l-1. Distintas letras indican diferencias significativas de acuerdo a test Tukey (P < 0.05).
A B C D
Figura 1.5. Embriones somáticos germinados y sometidos a los tratamientos de maduración. (A) Embrión somático presentando desarrollo caulinar. Barra 2mm. (B) Embrión somático presentando sólo desarrollo caulinar después de 3 semanas de cultivo. Barra 3 mm (C) Embrión con desarrollo caulinar y radicular. Barra 3mm (D) Plántula. Barra 8 mm. El mayor numero de Es con presencia radicular y caulinar (Figura 1.5C) fueron obtenidos al
aplicar 5 mgL-1 de ABA al medio de cultivo, esto coincide con lo reportado en Juglans regia,
donde se obtuvo 41% de los embriones somáticos con conversión a plántula (Vahdati et al.
2008). Sin embargo, el mayor número de Es obtenidos en este estudio presentó sólo desarrollo
48
caulinar lo que puede estar causado por una inhibición de la germinación de los embriones,
sometidos a altas concentraciones de ABA, por lo cual la literatura sugiere que es más
adecuado aplicar solo pulsos cortos de ABA en estados tempranos del desarrollo del embrión
con el fin de lograr una adecuada maduración y posterior conversión a planta (Figura 1.5D)
(Manoj et al. 2008).
Cuantificación de ABA y AIA.
Las numerosas similitudes morfológicas y bioquímicas entre un proceso embriogénico de
origen somático y cigótico, indica que se deben aplicar secuencias de cultivo que incluyan una
fase que promueva la maduración de embriones somáticos, para lo cual se debe contar con
información del embrión cigótico al cual se quiera homologar (Schmidt et al. 2006).
Los resultados de HPLC (Figura 1.6a) muestran la curva standard obtenida para AIA y ABA
con un tiempo de retención de 5.9 y 7.3 min, respectivamente. Aunque se registraron algunas
impurezas en los extractos, el proceso de extracción fue adecuado para las características del
tejido y comprobado en cada cuantificación definiendo los picos (Figura 1.6b).
b a
49
Figura 1.6. Cromatogramas que indican el tiempo de retención de AIA y ABA, según standard utilizado (a) y concentraciones de AIA y ABA obtenidas desde muestras de embriones cigóticos inmaduros (Ei) de N.alpina (b). Los resultados de cuantificación endógena de ABA y AIA obtenida desde Ei, Ec, y Eec de N.
alpina (Figura 1.7), corroboran lo planteado por Karssen et al. (1983) en Arabidopsis thaliana
y diversos autores, que señalan menores niveles de ABA y mayores de AIA durante la
embriogénesis (Ei) (Quatrano 1997; Finkelstein et al. 2002). Este comportamiento se revierte
con el comienzo de la maduración y la inhibición de la germinación precoz, aumentando el
ABA en el desarrollo medio de la semilla (Ec) para luego disminuir nuevamente en el periodo
de desecación.
Figura 1.7. Niveles endógenos de AIA y ABA contenida en Embrión inmaduro (Ei), Embrión cigótico maduro (Ec) y Eje embrionario (Eec) de N. alpina. Distintas letras indican diferencias significativas de acuerdo a test Dunnett (P < 0.05). Los mayores niveles de AIA (24 ug g-1PF) durante la fase inmadura de la semilla o
embriogénesis se explica por una mayor división y expansión celular que disminuye cuando la
semilla entra en la fase media de desarrollo y permite la inducción de proteínas de reserva
50
(Azcon y Talón. 2000; Von Arnold et al. 2002) e inhibición de la germinación precoz como se
señala en Hevea brasilensis mediada por el aumento en los niveles de ABA en el endosperma
más que en el embrión (Etienne et al. 1993).
Al comparar los niveles endógenos de ABA entre embrión cigótico maduro y eje embrionario
aislado, podemos observar que los niveles tanto de ABA como AIA descienden
significativamente (Figura 1.7). Similares resultados reportan Bianco et al. (1997) en
Pseudotsuga menziesii donde los ejes embrionarios presentaron niveles de ABA endógeno 20
veces menor en comparación con la semilla completa. Esto se atribuye a que los reguladores
se sintetizan en mayor proporción en las zonas cercanas al eje embrionario (cotiledones)
impidiendo la pérdida y la degradación oxidativa del ABA lo que contribuye a la disminución
de esta hormona en embriones aislados (Kong et al. 1997).
Como se determinó anteriormente el embrión cigótico maduro (Ec) que se compone del eje
embrionario más los cotiledones, es el indicador más idóneo para comparar los niveles
endógenos de ABA y AIA con los embriones somáticos.
Según los resultados obtenidos, existen diferencias significativas entre los niveles de ABA
alcanzados en Ec (22 µg g-1) y los niveles de ABA obtenidos en Es provenientes del
tratamiento con la aplicación de 5 mgL-1 (T4) (Figura 1.8). Esto coincide con autores que
postulan que la inmadurez de los Es se basa en los deficientes niveles de ABA endógeno y por
ende en un déficit de proteínas de reserva que permitan la madurez y posterior germinación de
los embriones (Alemanno et al. 1997).
51
Figura 1.8. Niveles endógenos de AIA y ABA contenida, en embriones somáticos en comparación con embriones cigóticos maduros (Ec) de N. alpina. Tratamientos: T1: sin ABA; T2: ABA 2 mg L-1; T3: ABA 3 mg L-1; T4: ABA 5 mgL-1. Distintas letras indican diferencias significativas de acuerdo a test Dunnett (P < 0.05).
En Quercus suber, se determinó que la adición de 0,25 mg L-1 de ABA al medio de cultivo,
promueve la maduración de embriones somáticos, presentando un patrón de variación similar
a lo observado en el ABA de carácter endógeno (García- Martín et al. 2005). Así, se determinó
que el contenido de ABA endógeno, durante la embriogénesis secundaria es muy similar al
observado en un estado inmaduro, demostrándose que los embriones secundarios son
producidos desde embrioides primarios con bajos niveles de ABA.
Las diferencias entre Ec y Es pueden ser un resultado de la ausencia de una fuente maternal,
que emita señales que induzcan la síntesis de ABA en el cultivo in vitro (Miller et al. 1994).
Por lo tanto la adición de ABA al medio de cultivo en los estadios iniciales de los embriones
somáticos, puede inferir ciertas señales que permitan la acumulación de proteínas de reserva
generando embriones similares a los obtenidos de manera cigótica.
52
Como se aprecia en la Figura 1.8 no existen diferencias significativas en la cuantificación de
ABA entre el control (T1) y los tratamientos T2, T3 y T4 donde se aplicó ABA. Esto es
reportado en algunos estudios realizados en coníferas, donde se indica que embriones
somáticos son capaces de sintetizar ABA endógeno en concentraciones bajas, en respuesta a
ABA exógeno o en ausencia de éste (Kong and Yeung 1995; Kong and Von Aderkas 2007).
Por lo tanto el momento de la adición de ABA exógeno al medio de cultivo, es vital en el
proceso de inducción a la maduración de los Es.
En consecuencia, el proceso de maduración de embriones somáticos debe estudiarse para cada
especie y/o sistema embriogénico, en particular en cada estado embriogénico (globular-
torpedo –cotiledonar), con el fin de manejar las concentraciones que permitan homologar, en
lo posible, las condiciones naturales que promueven la maduración embrionaria para lograr
tasas de germinación y conversión a planta a niveles aceptables.
CONCLUSIONES
De este trabajo se concluye que es necesaria la aplicación de ABA al medio de cultivo para
disminuir la incidencia de embriogénesis somática secundaria. Por otra parte, se encuentran
bajos niveles de ABA endógeno en los embriones cigoticos inmaduros (embriogénesis) de N.
alpina, para luego aumentar significativamente en embriones cigoticos maduros. A su vez, los
embriones cigoticos maduros presentan niveles endógenos de ABA significativamente mayor
en comparación con los embriones somáticos en estado cotiledonar y sometidos a las
diferentes concentraciones de ABA exógeno. Finalmente, el número de embriones somáticos
53
germinados por gramo de tejido, aumenta significativamente al aplicar ABA al medio de
cultivo.
LITERATURA CITADA
Alemanno L, Berthouly M, Michaux-ferriere N (1997) A comparison between theobroma
cacao L. Zygotic embryogenesis and Somatic embryogenesis from floral explants. In Vitro Cell. Dev. Biol Plant. 33:163-172.
Azcón-Bieto J, Talón M. 2000. Fundamentos de Fisiología Vegetal (Ed)
McGrawHill/Interamericana. Barcelona. España. Bianco J; Garello G, M Th Le Page-Degivry. (1997). De novo ABA synthesis and expression
of seed dormancy in a gymnosperm: Pseudotsuga menziesii. Plant Growth Regulation 21: 115–119.
Castellanos H, Sánchez-Olate M, Ríos D. (2005). Embriogénesis somática como alternativa
potencial para la regeneración in vitro de género Nothofagus. In: Gutierrez B, Ortiz O, Molina MP (eds). Clonación de Raulí. Estado Actual y Perspectivas. INFOR CEFOR UACH. pp:59-74.
Celestino C, Hernández I, Carneros E, López-Vela D, Toribio M. (2005). La embriogénesis
somática como elemento central de la biotecnología foerestal. Invest Agrar: Sist Recur For: 14(3), 345-357.
Cevallos M, Sumac Sánchez I, Montes S. (2002). Caracterización histolólogica de la
embriogénesis en Coffea canephora P.var. robusta. Rev. Protección Veg. 17(1):14-19. Chalupa V, (1983). Micropropagation of conifer and broadleaved forest trees.
Communicationes Instituti Forestalis Cechosloveniae. 13: 7-39. Corredoira E; Ballester A, Vieitez AM. (2003). Proliferation, maturation and germination of
Castanea sativa Mill. somatic embryos originated from leaf explants. Annals of Botany. 92: 129-136.
Dodeman VL, Ducreux G, Kreis M. (1997). Zygotic embryogenesis versus somatic
embryogenesis. J. Exp. Bot. 48: 1493–1509.
54
Donoso C, Lara A. (1995). Utilización de los bosques nativos en Chile: pasado, presente y futuro. In: Ecología de los bosques nativos de Chile., Armesto J.J., et al (ed). Editorial Universitaria, Santiago de Chile, Chile. Pp.363-388.
Etienne H, Sotta B, Montoro P, Miginiac E, Carron MP. (1993). Relations between
exogenous growth regulators and endogenous indole-3-acetic acid and abscisic acid in the expression of somatic embryogenesis in Hevea brasiliensis (Müll. Arg). Plant Sci. 88:91–96.
Finkelstein R, Srinivas S, Gampala L, Rock CD. (2002). Abscisic Acid Signaling in Seeds and
Seedlings. The Plant Cell, S15–S45. García-Martín G, Manzanera JA, González-Benito M. (2005). Effect of exogenus ABA on
embryo maturation and quantification of endogenous levels of ABA and IAA in Quercus suber somatic embryos. Plant Cell Tissue and Organ Culture. 80: 171–177.
Gutiérrez B. (2000). Áreas productoras de semillas en el mejoramiento genético de
Nothofagus. In: Ipinza R., B. Gutiérrez y V. Emhart (eds). Domesticación y mejora genética de Raulí y Roble. Universidad Austral de Chile/Instituto Forestal. pp: 215-235.
Gupta PK, Grob JA. (1995). Somatic embryogenesis in conifers (pp: 81-98). En: Somatic
embryogenesis in woody plants. S. Jain, P. Gupta y R. Newton, (eds.). Vol 1. Kluwer Academic Publishers. Netherlands. 460.pp
Hansen H, Grossmann K. (2000). Auxin induced ethylene triggers abscisic acid biosynthesis
and growth inhibition. Plant Physiology. 124: 1437–1448. Karssen CM, Brinkhorst-van der Swan DLC, Breekland AE, Koornneef M. (1983). Induction
of dormancy during seed development by endogenous abscisic acid: Studies of abscisic acid deficient genotypes of Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Planta 157: 158–165.
Kong L, Yeung EC. (1995). Effects of silver nitrate and polyethylene glycol on white spruce
(Picea glauca) somatic embryo development: enhancing cotyledonary embryo formation and endogenous ABA content. Physiologia Plantarum 93: 298–304.
Kong L, Attree SM, Fowke LC. (1997). Changes of endogenous hormone levels in developing
seeds, zygotic embryos and megagametophytes in Picea glauca. Physiologia Plantarum 101: 23-30.
55
Kong L, Von Aderkas P. (2007). Genotype effects on ABA consumption and somatic embryo maturation in interior spruce (Picea glauca x engelmanni). Journal of Experimental Botany. 58 (6):1525–1531.
Manoj K, Jaiswal VS, Jaiswal U. (2008). Effect of ABA and sucrose on germination of
encapsulated somatic embryos of guava (Psidium guajava L.). Scientia Horticulturae 117: 302–305.
Mauri PV, Manzanera JA. (2003). Induction, maturation and germination of holm oak
(Quercus ilex L.) somatic embryos. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 74: 229-235. Mauri PV, Manzanera JA. (2004). Effect of abscisic acid of stratification of somatic embryo
maturation and germination of holm oak (Quercus ilex L.). In vitro Cell, Dev Biol-Plant. 40: 495-498.
Merkle SA, Dean JFD. (2000). Forest tree biotechnology.Current Opinion Biotech 11: 298-
302. Miguel C, Gonçalves S, Tereso S, Marum L, Oliveira MM. (2004). Somatic embryogenesis
from 20 open-pollinated seed families of Portuguese plus trees of maritime pine. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 76:121–130.
Miller HB, Fong F, Smith JD. (1994). Abscisic acid biosynthesis during corn embryo
development Planta. 195:17-21. Palada-Nicolau M, Hausman JF. (2001). Comparison between somatic and zygotic embryo
development in Quercus robur L. Plant Biosystems. 135 (1):47-55. Pandey GK, Grant JJ, Cheong YH, Kim BG, Li LG, Luan S. (2008). Calcineurin-B-Like
Protein CBL9 Interacts with Target Kinase CIPK3 in the Regulation of ABA Response in Seed Germination. Molecular Plant. 1(2):238-248.
Pérez JN. (1998). Introducción a la Mejora de Plantas. pp. 285–295. In Pérez JN. (ed.)
Propagación y Mejora Genética de Plantas por Biotecnología. Instituto de Biotecnología de las Plantas, Santa Clara, Cuba.
Quatrano R, Bartels D; Tuan-Hua D, Pagés M. (1997). New lnsights into ABA-Mediated
Processes. The Plant Cell. Pp: 470-475. Robichaud R, Lessard V, Merkle S. (2004). Treatments affecting maturation and germination
of American chesnut somatic embryos. Journal of Plant Physiology. 161: 957-969.
56
Schmidt Th, Ewald A, Seyring M, Hohe A. (2006). Comparative analysis of cell cycle events
in zygotic and somatic embryos of Cyclamen persicum indicates strong resemblance of somatic embryos to recalcitrant seeds. Plant Cell Rep 25: 643–650.
Tereso S, Zoglauer K, Milhinhos A, Miguel C, Oliveira M. (2007). Zygotic and somatic
embryo morphogenesis in Pinus pinaster: comparative histological and histochemical study. Tree physiology. 27: 661–669.
Vahdati K, Bayat S, Ebrahimzadeh H, Jariteh M, Mirmasoumi M. (2008). Effect of exogenous
ABA on somatic embryo maturation and germination in Persian walnut (Juglans regia L.). Plant Cell Tiss Organ Cult. 93:163–171.
Valenzuela S, Hevia F, Tello M, Minoletti L, Wilkens R, Urbina A. (1998). Determinación de
ABA en hojas de Eucalyptus globulus a través de HPLC. Agrociencia. 14: 29–34. Von Arnold S, Sabala I, Bozhkov P, Dyachok J, Filonova L. (2002). Developmental pathways
of somatic embryogenesis. Plant Cell Tissue and Organ Culture. 69: 233-249.
57
CAPITULO 2.
REVIGORIZACIÓN DE MATERIAL ADULTO DE N. alpina: ASPECTOS
HORMONALES E HISTOLOGICOS
Priscila Cartes R1; Katia Sáez2; María Francisca Beltrán1. Darcy Ríos1; Manuel
Sánchez1
1Universidad de Concepción. Facultad Ciencias Forestales, Departamento Silvicultura y Centro de Biotecnología, casilla 160-C, Concepción, Chile, teléfono (56) 41-2207241, fax: (56) 41-2207310, [email protected] 2Universidad de Concepción, Facultad de Ciencias Físicas y Matemáticas, Avda. Esteban Iturra s/n - Barrio Universitario, Concepción, Chile.
RESUMEN
El Raulí (Nothofagus alpina (Poepp. et Endl.) Oerst.), es una especie endémica de los bosques
subantárticos de Chile y Argentina. Posee potencial comercial en Chile por la calidad de su
madera. Para aumentar la productividad del recurso, hoy en día, se enfatiza en la aplicación de
herramientas biotecnológicas, con el fin de obtener un beneficio sostenible en el tiempo. El
presente estudio plantea como objetivo evaluar el efecto de componentes hormonales en el
proceso de inducción organogénica y rizogénico de N. alpina a partir de material adulto y
realizar estudios histológicos del proceso de regeneración in vitro, con el fin de caracterizar el
origen de los brotes obtenidos. Se obtuvieron yemas provenientes de varetas forzadas a brotar
in vitro de árboles adultos de raulí. Estas yemas fueron dispuestas en medio Broadleaved Tree
Medium (BTM) con reguladores del crecimiento 6-bencilaminopurina (BAP) y ácido
indolbutírico (AIB) a diferentes concentraciones en la fase de inducción y proliferación, en
esta última se practicaron subcultivos a medio fresco cada 28 días, se alternaron conteniendo
reguladores del crecimiento y en medio base BTM, sin reguladores. Los cortes histológicos de
10µm de espesor fueron realizados al cabo del segundo subcultivo fijando las muestras en
FAA y se incluyeron en parafina. La tinción se realizó con Fast green y safranina acuosa. La
mayor respuesta organogénica se obtuvo a partir de la superficie adaxial de la hoja,
principalmente sobre la nervadura. El estudio histológico permitió corroborar la presencia de
brotes adventicios de origen multicelular, vía organogénesis indirecta, es decir, a partir de la
formación de células indiferenciadas (callo) con un alto grado de proliferación de brotes. La
confirmación del origen de brotes adventicio y el porcentaje de enraizamiento obtenido a partir
58
de material adulto, indica la posibilidad de desarrollar un sistema de propagación viable para
la especie.
Palabras clave: Raulí; organogénesis adventicia; histología; cultivo in vitro.
INTRODUCCIÓN
La propagación natural de Nothofagus alpina (Poepp. et Endl.) Oerst.) se produce a través de
semillas, aunque debido a las características intolerantes de la especie esta sólo es exitosa en
lugares donde el suelo mineral se encuentra expuesto y en presencia de luz (Donoso et al,
2006). A su vez, la propagación mediante siembra directa no se encuentra exenta de
dificultades debido a factores como baja viabilidad, condiciones especiales requeridas para la
germinación, producción cíclica de semillas y ataque de insectos consumidores del embrión
(Loewe et al, 1997).
En cuanto a su propagación asexual, en diversas especies de Nothofagus se ha aplicado la
micropropagación por vía organogénica, principalmente con material juvenil de roble
(Martínez-Pastur y Arena, 1995), raulí (Jordan et al, 1996; Martínez-Pastur y Arena, 1996;
Sánchez-Olate et al, 2004), ñirre (N. antarctica) (Martínez-Pastur et al, 1997) y lenga (N.
pumilio) (Martínez-Pastur y Arena, 1999), obteniéndose desarrollo adventicio de brotes y
raíces in vitro. En general, las tasas de proliferación caulinar y niveles de enraizamiento son
bajas, presentándose la mayoría de las limitantes de la propagación organogénica, entre ellas,
falta de funcionalidad de las nuevas raíces generadas y una alta variación de las respuestas
entre especies.
Dentro de la propagación in vitro y revigorización del material vegetal, la organogénesis se
utiliza en la producción comercial de diversas especies forestales por la alta capacidad de
59
multiplicación, revigorización y/o mantención del estado juvenil ( Sabja et al 2008; Aggarwal
et al, 2010).
La organogénesis puede generar brotes adventicios apicales y radiculares vía directa o
indirecta, es decir, directamente del explanto o indirectamente a partir de un callo (Pierik,
1990). Si bien la vía directa se considera más estable desde el punto de vista de estabilidad
genética, la producción de plantas vía indirecta posee la ventaja de generar una fuente
inagotable de explantos (Orellana, 1998; Lara et al, 2003). No obstante, la propagación vía
organogénesis posee limitantes que se acentúan en la fase adulta del árbol, además de
manifestarse las características de interés tales como volumen de madera, cantidad de lignina,
calidad de madera, cantidad y calidad de frutos entre otras, se produce un descenso
generalizado de la capacidad regenerativa y competencia morfogénica (Greenwood, 1995).
La capacidad morfogénica o facilidad con que cuentan los individuos para propiciar la
desdiferenciación de sus tejidos va a depender del grado de madurez o fase de desarrollo en la
que se encuentren (Greenwood, 1995; Fraga et al., 2002) sin embargo, existe una diferencia
clara entre los conceptos de maduración y envejecimiento. Mientras que el envejecimiento
implica la pérdida gradual de vigor, y eventualmente senescencia y muerte, la maduración se
refiere a cambios específicos relacionados, sobre todo, con el estado fisiológico que permite la
inducción de la evocación floral (Fraga, 2000). Por lo tanto, la maduración no siempre está
relacionada necesariamente con la pérdida de vigor.
60
La revigorización de material adulto durante el cultivo está influenciada por factores como
genotipo, reguladores del crecimiento y tipo o estado fisiológico del explanto entre otros
(Gómez, 1998). El efecto del genotipo en la respuesta organogénica, también ha sido
reportado por diversos autores en una amplia gama de especies (Orellana, 1998; Shen et al,
2008). Algunos genotipos de la misma especie exhiben una alta capacidad de regeneración,
mientras que otros, son recalcitrantes o no muestran la capacidad de regenerar órganos
(Nontaswatsri et al, 2002; Landi y Mezzetti, 2006).
Hasbún, (2006) señala que los explantos de Castanea sativa como brotes epicormicos o
explantos desde la base del árbol, independiente de la edad cronológica de la planta madre,
responden con facilidad frente a los tomados desde la copa, ya que han sido generados a partir
de tejidos meristemáticos latentes los cuales son cronológicamente más antiguos, pero por su
estado de quiescencia sus meristemos han experimentado menor número de divisiones
celulares, manteniendo su identidad juvenil. Sin embargo, el tipo de explanto no es único
factor que determina el éxito de la respuesta morfogénica.
Por otro lado, reguladores del crecimiento como auxinas y citoquininas juegan un papel
fundamental en el proceso de revigorización, formación y desarrollo de las plantas (Su et al,
2011). Las citoquininas son moléculas de señalización hormonal que puede jugar un papel
esencial en la regulación de la citocinesis, el crecimiento y el desarrollo de las plantas (Azcon
y Talón, 2000; Howell et al, 2003). Estudios realizados en Castanea sativa y Actinidia
deliciosa señalan el efecto positivo de 6-bencilaminopurina (BAP) en la formación de raíces y
la proliferación de brotes, especialmente cuando se utiliza en conjunto con otros reguladores
como ácido indolbutírico (AIB) y ácido giberélico respectivamente (Giovannelli et al, 2004;
Ariguita et al, 2005).
61
Durante la revigorización de los tejidos, los procesos morfogénicos que ocurren son muy
variados; de allí que se requiera de un estudio histológico con el fin de comprender los
procesos morfogénicos que están ocurriendo y diseñar estrategias de micropropagación como
conocer la estabilidad genética de los materiales producidos y en última instancia determinar
los posibles usos de los tejidos generados mediante esta técnica. (Puigderrajol et al, 2000; Lara
et al, 2003)
El presente estudio plantea como objetivo evaluar el efecto de componentes hormonales en el
proceso de inducción organogénica y rizogénico de N. alpina a partir de material adulto y
realizar estudios histológicos del proceso de regeneración in vitro, con el fin de caracterizar el
origen de los brotes obtenidos.
MATERIALES Y MÉTODOS.
Establecimiento in vitro.
Se utilizaron varetas de N. alpina, obtenidas desde 5 árboles adultos en etapa reproductiva. Las
varetas fueron recolectadas en época de invierno, desde la copa del árbol y desde brotes
epicórmicos (BE). El tamaño de éstas varió entre 25 y 35 cm de largo y de 1,0 cm de diámetro
basal aproximadamente, importando que el número de yemas en cada vareta fuera homogéneo.
A las varetas se les efectuó una asepsia superficial con captan y benomilo (2 gL-1) durante 1 h.
Luego se realizaron 3 lavados frecuentes en agua destilada estéril (5, 15 y 20 minutos) en
cámara de flujo laminar. Posteriormente se colocaron en un recipiente de vidrio conteniendo
150 ml de agua destilada estéril y cubiertas con una bolsa de polietileno, ajustándola con cinta
adhesiva en la base. Para evitar condensación, se realizaron pequeñas perforaciones en la parte
superior de la bolsa. La estimulación se llevó a cabo en cámara de incubación con fotoperiodo
de 16 h, temperatura de 25 ±1ºC y densidad de flujo fotónico de 30 µmol m-2 s-1.
62
Inducción Organogénica.
Trascurridas dos semanas de estimulación de las varetas, se comenzaron a obtener las primeras
yemas abiertas que fueron transferidas a los tratamientos de inducción organogénica (Figura
2.1-A1I 0). Se empleó como medio base la solución mineral BTM, suplementado con 30 gL-1
sacarosa y solidificado con 7,0 gL-1 de agar agar, adicionando los reguladores del crecimiento
BAP y AIB como se muestra en la Tabla 2.1.
Tabla 2.1: Tratamientos de Inducción Organogénica
Tratamiento BAP (mgL-1) AIB (mgL -1)
I0 0 0
I1 0,5 0,1
I2 1 0,1
Proliferación de Brotes.
Posteriormente, los brotes organogénicos obtenidos en la fase de inducción se llevaron a la
fase de proliferación. Se utilizaron brotes que respondieron a la inducción organogénica desde
la copa y BE. Fueron sometidos a tratamientos de proliferación conteniendo la solución
mineral base BTM, suplementado con 30 gL-1 sacarosa y solidificado con 7,0 gL-1 de agar
agar, adicionando los reguladores del crecimiento a concentraciones de 0,1 mL-1 de BAP más
0,01 mL-1 de AIB (P1) y 1 mL-1 de BAP más 0,1 mL-1 de AIB (P2). Se utilizo una cámara de
crecimiento controlado (Famure Ltda.) a una temperatura de 25 ± 2 °C, con una humedad relativa
del 60%, fotoperiodo de 16 horas luz y densidad de flujo fotónico de 30 µmol m-2 s-1.
63
Histología.
Las muestras fueron fijadas en FAA 70 % durante 48 horas y posteriormente en etanol al 70%
v/v. Las muestras fueron embebidas en parafina luego de la deshidratación. Se cortaron
secciones transversales de callo y secciones longitudinales de embriones somáticos, de 10 µm
de espesor, siendo teñidas con hematoxilina.
Enraizamiento.
Tras el establecimiento de cadenas proliferativas vía organogénesis indirecta, se seleccionaron
microtallos provenientes del sexto subcultivo de origen copa y BE que poseían un diámetro de
tallo de aproximadamente 2 mm y 4 cm de longitud. Se dispusieron en medio base BTM con pH
ajustado a 5,8 suplementado con 30 gL-1 de sacarosa y 7 gL-1 de agar-agar® Merck durante 20
días. Después los microtallos fueron sometidos a una inducción lenta en medio BTM a diferentes
concentraciones de AIB (Tabla 2.2), mantenidos durante 15 días. Todo el proceso de
proliferación e inducción rizogénica se realizó en una cámara de crecimiento controlado (Famure
Ltda.) a una temperatura de 25 ± 2 °C, con una humedad relativa del 60%, fotoperiodo de 16
horas luz y densidad de flujo fotónico de 30 µmol m-2 s-1. Finalmente los microtallos fueron
dispuestos en sustrato de compost de corteza de pino, esterilizado a lo menos 3 veces y posterior
a un mes de cultivo en condiciones ex vitro se evaluó supervivencia según ontogenia y
concentración auxínica.
Tabla 2.2: Tratamientos de inducción rizogénica aplicados a microtallos de N. alpina, según
concentraciones de AIB y ontogenia.
Ontogenia Tratamiento AIB BAP
(mgL-1)
T0 0,0 0,1
64
BE T1 1,0 0,1
T2 3,0 0,1
T3 5,0 0,1
T0 0,0 0,1
COPA T1 1,0 0,1
T2 3,0 0,1
T3 5,0 0,1
Diseño Experimental
En la fase de proliferación se utilizó un diseño completo aleatorio con arreglo factorial de
contrastes específicos con dos factores y dos niveles. Se realizaron 16 repeticiones compuestas
por un frasco con un brote homogenizado por callo. Posterior a un mes de cultivo se evaluó: peso
fresco del callo y número de brotes nuevos por callo en relación a un gramo de peso fresco, se
considero el número de brotes mayores a 5mm. Los datos fueron analizados mediante ANDEVA
y para establecer los tratamientos en los que existieron diferencias estadísticas se aplicó la prueba
de Tukey para comparaciones múltiples con nivel de significancia de P < 0,05. Para ello se utilizó
el software estadístico SAS (SAS Institute, 2002).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Establecimiento in vitro e inducción organogénica.
Las respuestas se evidenciaron luego de 1 mes de cultivo en medio de inducción, comenzó con
el proceso de desdiferenciación desde los bordes y zona de central de la yema. Conforme
transcurrió la etapa de inducción y principalmente al final de ésta, luego de 2 meses de cultivo,
se pudo identificar de manera macromorfológica nula respuesta en el tratamiento control, tanto
para los genotipos como tipo de material vegetal ensayados (Figura 2.1-A2I0: A4I 0). Solo se
65
observo apertura de la yema, con a lo más un par de hojas abiertas en algunos de los genotipos
ensayados y que no prosperó en desarrollo caulinar. Estos resultados son esperados, ya que
diversos estudios señalan necesaria la aplicación de citoquininas al medio de cultivo para
activar un complejo de genes que se traduce en la formación de brotes (Howell et al, 2003; Su
et al, 2011). Si bien la presencia de BAP en menor concentración aplicada permitió observar
estructuras organogénicas a mediados del proceso de inducción (Figura 2.1 a-A5I 1),
finalmente, las estructuras no prosperaron, presentándose una callo necrosado, disgregándose
con facilidad en pequeños fragmentos al ser manipulado y sin capacidad de proliferación
(Figura 2.1 b-A5I 1). Sin embargo, al aplicar el tratamiento I2, con mayor concentración de
BAP, se obtuvo menor desarrollo callogénico y aparición de estructuras organogénicas desde
la base del callo (Figura 2.1 a-A5I2) que se fueron multiplicando hasta finalizar la etapa de
inducción generando un callo compacto y reducido en proporción a la masa organogénica
generada (Figura 2.1 b-A5I 2). En la literatura es conocido el papel de las citoquininas
exógenas en la inducción y desarrollo de brotes “ectópicos” o “adventicios” y generalmente su
acción está relacionada con la concentración aplicada en el cultivo (Ramage y Williams, 2004;
Hwang et al, 2012). Estudios realizados en especies de importancia comercial como
Eucalyptus globulus, Eucalyptus tereticornis, (Larson et al, 2006; Aggarwal et al, 2010),
reportan necesaria la aplicación de BAP acompañado de una auxina para obtener
organogénesis adventicia. Incluso en especies más relacionadas como Quercus suber
(Puigderrajols et al, 2000), C. sativa (Hasbún, 2006) y Juglans sp (Payghamzadeh y
Kazemitabar, 2011), obtienen una respuesta organogénica exitosa al aplicar al medio de
cultivo concentraciones de BAP en rangos de 0,5 a 2 mg L-1 (Figura 2.1-A5P1: A5P2), y
siempre acompañado de auxina exógena. Esto se explicaría por la función antagonista que
poseen ambas hormonas, en el proceso de formación de brotes la citoquinina promueve la
66
proliferación de células madre e inhibe su diferenciación, mientras que la auxina provoca la
iniciación de órganos a través de la represión de la citoquinina (Su et al, 2011).
Es importante señalar que solamente se obtuvo respuesta organogénica en el genotipo A5. Es
por esto que se decidió realizar sólo una observación macromorfológica en la etapa de
inducción. Se ha informado de la respuesta genotipo dependiente que poseen diversas especies
cultivadas in vitro (Landi y Mezzetti, 2006; Aggarwal et al, 2010) específicamente en raulí
Sabja et al, (2008) señala las diferentes tasas de multiplicación de brotes obtenidas según el
genotipo ensayado. Como se observó en este estudio, el genotipo es un factor de gran
importancia, ya que la respuesta morfogénica obtenida o índice de propagación a obtener
puede variar entre especies e incluso entre clones de la misma especie (Orellana, 1998), por lo
tanto es necesario aumentar el número de individuos a muestrear y establecer condiciones de
cultivo especificas, ya que en algunos genotipos los genes implicados en la organogénesis
adventicia pueden verse suprimidos por un cultivo inadecuado (Shen et al, 2008).
Actualmente no se ha reportado la obtención de organogénesis adventicia a partir de material
adulto en el género Nothofagus, algunos acercamiento han reportado Sabja et al, (2008) con la
multiplicación de brotes in vitro provenientes de arboles adultos y organogénesis directa a
partir de material juvenil (Jordan et al, 1996; Martínez-Pastur y Arena, 1996).
67
Figura 2.1: Respuesta organogénica por tratamiento de inducción (I ), proliferación (P) y árbol ensayado (A): I0: sin BAP y AIB; I1: (0,5 mg l-1BAP y 0,1 mg l-1AIB) ; I2: (1 mg l-1BAP y 0,1 mg l-1AIB) . P1: (0,1 mL-1 de BAP y 0.01 mL-1 de AIB) P2: (1 mL-1 de BAP más 0.1 mL-1 de AIB) A1:Genotipo1; A2: Genotipo 2; A3: Genotipo 3; A4: Genotipo 4; A5:Genotipo5.
Proliferación de Brotes.
La proliferación obtenida desde el genotipo A5 estuvo modulada por la concentración de BAP
utilizada. En la Figura 2.2 se aprecia el peso de callo fresco obtenido según ontogenia y
concentración hormonal, de estos resultados podemos observar un peso fresco de callo
significativamente mayor en la concentración de P2 que en P1, independiente del origen
ontogénico del material (brote epicórmico o copa). La literatura plantea que un tejido
ontogénicamente más joven debería tener una mejor respuesta morfogénica debido a que han sido
generados a partir de tejidos meristemáticos latentes los cuales son cronológicamente más
68
antiguos, pero sus meristemos han experimentado menor número de divisiones celulares,
manteniendo su identidad juvenil (Sánchez et al, 2005; Hasbún, 2006). Sin embargo, en este
estudio no se presentaron diferencias significativas entre el material vegetal de BE y copa.
Estudios realizados en Quercus petraea por Morisset et al, (2012), señalan que la importancia de
los brotes epicórmicos como material morfogénico radica no tan solo en su edad ontogénica, sino
que en la cantidad de agua, luz y carbohidratos que percibieron desde el material parental durante
su desarrollo.
En la etapa de proliferación se obtuvo una respuesta inversa en relación a la concentración de
BAP aplicada. Ambas respuestas fueron positivas, ya que la aplicación de una alta
concentración de BAP (P2) refleja un aumento significativo en gramos de callo morfogénico
Figura 2.3. Número de brotes por gramos de peso fresco, según ontogenia del árbol (BE : brote epicórmico y copa) y concentración hormonal. Distintas letras indican diferencias significativas de acuerdo a test Tukey (P < =0.05).
Figura 2.2. Gramos de callo fresco, según ontogenia del árbol (BE: brote epicórmico y copa) y concentración hormonal. Distintas letras indican diferencias significativas de acuerdo a test Tukey (P <= 0.05).
69
(Figura 2.2) en comparación con la concentración menor BAP (P1) que produjo un número
de brotes por gramo de peso fresco significativamente mayor (Figura 2.3) en comparación
con la alta concentración de BAP aplicada. El número de brotes promedio obtenido de 1:12 en
un mes de cultivo es superior al reportado por Sabja et al, (2008) en la especie de 1: 12 en dos
meses de cultivo.
A nivel macromorfológico, la respuesta morfogénica obtenida con mayor concentración de
BAP se caracterizó por presentar forma de roseta con gran cantidad de callo circundante
(Figura 2.4A), a diferencia de los brotes en presencia de menor concentración hormonal que
se caracterizaron por ser elongados y con una altura promedio de 3 cm (datos no mostrados).
Características similares presentan brotes organogénicos obtenidos en Persea lingue por Cob
et al, (2010), sometidos a las mismas concentraciones de BAP.
Histología de brotes adventicios.
La secuencia histológica de la diferenciación del brote corrobora el proceso de regeneración in
vitro en N. alpina vía organogénesis indirecta (Figura 2.4). Particularmente en la Figura 2.4B,
que corresponde a una sección longitudinal, se aprecia un nivel de organización mayor por la
presencia de las células que están en continua división o proliferación, dando formación a los
domos meristemáticos y primordios foliares (flechas) constituyendo de esta forma un meristemo
caulinar. Asimismo, el tejido vascular del brote estableció conexión con el tejido materno (callo),
lo que indica que son brotes de origen organogénico adventicio originados desde la cara adaxial
del explanto de origen, comportamiento similar se describe en Actinidia deliciosa por Popielarska
et al, (2006).
70
Figura. 2.4. Cortes histológicos longitudinales de brotes adventicios de N. alpina. A) Callo organogénico con brotes adventicios. B) Flechas indican la formación de brotes adventicios y zonas meristemáticas. C) Domo meristemático con activa división celular periclinal. En diversos estudios histológicos se ha logrado corroborar el proceso de regeneración de plantas
vía organogénesis adventicia evidenciando la división celular y los procesos que implican la
formación de brotes (Lara et al, 2003; Popielarska et al, 2006; Cob et al, 2010), observándose
que la principal actividad morfogenética de las células que conforman la región meristemática
(Figura 2.4C), presentan divisiones anticlinales y periclinales (Flecha).
Enraizamiento de brotes adventicios.
La respuesta rizogénica se manifestó de manera positiva en presencia de AIB, el mayor
porcentaje obtenido de raíces alcanzo el 50 % para los brotes de origen ontogénico BE (Figura
2.5A). En cambio la menor respuesta rizogénica para ambos tipo de brotes alcanzo el 10 % en el
tratamiento control Esto indica que la edad ontogénica con la concentración de AIB y de BAP
usada no afecta significativamente el potencial de enraizamiento de los brotes epicórmicos
(p=0,0671) y de copa (p=0,1571).
El procedimiento usado para el cultivo ex vitro permitió alcanzar porcentajes que bordearon el 90
% de supervivencia de plantas de origen BE (P=0,1895) y copa (p=0,8893) (Figura 2.5B). Sin
embargo no existieron diferencias significativas en los tratamientos ensayados.
71
Figura. 2.5. Porcentaje de enraizamiento según ontogenia (BE: brote epicórmico y copa) y concentración auxínica (A). Porcentaje de supervivencia en condiciones ex vitro según ontogenia (BE: brote epicórmico y copa) y concentración auxínica (B). Donde T0: 0,0 mgL-1 de AIB y 0,1 mgL-1 de BAP, T1: 1,0 mgL-1 de AIB y 0,1 mgL-1 de BAP, T2: 3,0 mgL-1 de AIB y 0,1 mgL-1 de BAP, T3: 5,0 mgL-1 de AIB y 0,1 mgL-1 de BAP. Estudios similares se han reportado por Jordan et al, (1996) en presencia de AIB a una
concentración de 0,5 y 1,0 mgL-1, el material juvenil de 2 años de cultivo in vitro de N. alpina
alcanzó un 45% y 35 % de enraizamiento respectivamente. Caro et al, (2003) reportó un 33% de
enraizamiento en brotes juveniles en presencia de 5 mgL-1 de AIB. Mayores porcentajes fueron
reportados por Martínez- Pastur et al, (2003), en material juvenil obteniendo un 95% de
enraizamiento en presencia de 0,125 mgL-1 de AIB, flavonoides y oscuridad.
72
Figura. 2.6. Respuesta rizogénica en condiciones in vitro y ex vitro según ontogenia (BE: brote epicórmico y copa) y concentración auxínica A) brote organogénico sometido al T0. B) brote organogénico de origen de copa sometido al T3. C) brote organogénico de origen brote epicórmico (BE) sometido al tratamiento T3 D) respuesta rizogénica de brotes adventicios de origen de copa tras un mes de cultivo en condiciones ex vitro E) supervivencia de brotes adventicios de origen de BE tras un mes de cultivo en condiciones ex vitro. Tratamientos: T0: 0,0 mgL-1 de AIB y 0,1 mgL-1 de BAP, T1: 1,0 mgL-1 de AIB y 0,1 mgL-1 de BAP, T2: 3,0 mgL-1 de AIB y 0,1 mgL-1 de BAP, T3: 5,0 mgL-1 de AIB y 0,1 mgL-1 de BAP. A nivel morfológico como se observa en la Figura 2.6A el tratamiento control presentó una base
callosa sin un número significativo de raíces, tanto para material de origen BE y copa. En
aspecto, las raíces originadas en presencia de AIB y el número de raíces obtenido (datos no
mostrados) fue homogéneo para ambas edades ontogénicas ensayadas (Figura 2.6B y 2.6C). Sin
embargo, cabe señalar que en presencia de lupa estereoscópica se aprecia una gran cantidad de
primordios radiculares en todos los tratamientos aplicados. Lo anterior se puede ver representado
en la fase de supervivencia a condiciones ex vitro (Figura 2.6D y 2.6E) la cual alcanzo
porcentajes cercanos al 90 %. Esto se explicaría por el cultivo sucesivo realizado durante la fase
de proliferación, sometiendo los brotes adventicios a altas concentraciones de BAP y AIB por
73
periodos prolongados lo cual pudo conllevar a una inhibición de los tratamientos rizogénicos
utilizados y provocar una respuesta rizogénica tardía que se observó en condiciones ex vitro.
En la actualidad se reporta solo un trabajo realizado en revigorización de material adulto de N.
alpina (Sabja et al, 2008), el cual permite obtener niveles de enraizamientos superiores a los
obtenidos en este estudio (cercanos al 80 %), pero con tasas de proliferación inferior, debido
principalmente a que al origen de sus brotes no es adventicio.
CONCLUSIONES
El cultivo in vitro de Nothofagus alpina a partir de yemas, reflejó resultados exitosos,
permitiendo la revigorización del material vegetal adulto. Mediante la presencia de BAP en el
medio de cultivo se obtuvo organogénesis adventicia corroborada por los análisis histológicos.
Asimismo, este estudio, evidencia la viabilidad en las fases de proliferación, elongación caulinar
y enraizamiento como etapas clave en el proceso de propagación vía organogénesis in vitro. Si
bien este estudio aporta con datos científicos que ayudan a aminorar algunas de las problemáticas
de propagación que afronta esta especie nativa chilena, también plantea nuevas interrogantes que
deben ser incorporadas en estudios futuros.
LITERATURA CITADA.
Aggarwal, D. Kumar, A. Reddy, M.S. 2010. Shoot organogenesis in elite clones of Eucalyptus
tereticornis. Plant Cell Tiss Organ Cult. 102:45–52.
Arigita, L. Fernández, B. González, A. Sánchez Tamés, R. 2005. Effect of the application of
benzyladenine pulse on organogenesis, aclimatisation and endogenous phytohormone content
in kiwi explants cultured under autotrophic conditions. Plant Physiology and Biochemistry 43
(2005) 161–167.
Azcón-Bieto J. y M. Talón. 2000. Fundamentos de Fisiología Vegetal (Ed)
McGrawHill/Interamericana. Barcelona. España.
74
Caro, L. Santecchia, N. Marinangeli, P. Curvetto, N. Hernández, L. 2003. Agrobacterium
rhizogenes vs auxinic induction for in vitro rhizogenesis of Prosopis chilensis and Nothofagus
alpine. Biocell. 27(3): 311-318.
Cob, J. Sabja, A.M. Ríos, D. Lara, A. Donoso, P. Arias, L. Escobar, B.2010. Potencial de la
organogénesis como estrategia para la masificación in vitro de Persea lingue en la zona
centro-sur de Chile. Bosque. 31(3): 202-208.
Donoso, P., Donoso, C., Marchelli, P., Gallo, L., and Escobar, B. (2006). Nothofagus nervosa
(Phil.) Dim. Et Mil. In Las especies arbóreas de los bosques templados de Chile y
Argentina Autoecología, C. Donoso, ed. (Valdivia, Chile, Marisa Cuneo Ediciones), pp.
448-461
Fraga, M. 2000. Indicadores moleculares de envejecimiento-revigorización, problemas y
soluciones para la micropropagación de genotipos élite de Pinus radiata D. Don. Tesis
Doctoral. Universidad de Oviedo. 233 pp.
Fraga M.F., Rodríguez R. and Cañal M.J. 2002. Genomic DNA methylationdemethylation
during ageing-reinvigoration of Pinus radiata D.Don. Tree Physiol. 22:813–816.
Giovannelli, A. Giannini, R. Bennici A y Mori B. 2004. In vitro organogenesis of chestnut
(Castanea sativa Mill) cotyledon explants: responses to growth regulators and development
aspects. In vitro cell. Dev. Biol_ Plant. 40: 509_514.
Gómez, R. 1998. Cultivo de células y tejidos. pp 25-44. En: J.N. Pérez P. (Ed.) Propagación y
Mejora Genética de Plantas por Biotecnología. Instituto de Biotecnología de las Plantas,
Santa Clara.Cuba.
Greenwood, M. 1995. Juvenility and maturation in conifers: current concepts. Tree.
Physiology 15:433-438.
Hasbún R. 2006. Monitorización (epi)-genética del desarrollo y producción de planta de
castaño (Castanea sativa Mill.). Tesis Doctoral. Universidad de Oviedo.
Howell, S.H. Lall, S. Che, P. 2003. Cytokinins and shoot development. Trends Plant Sci.8,
453–459.
Hwang, I. Sheen, J. Muller, B. 2012. Cytokinin Signaling Networks. Annu. Rev. Plant Biol.
63:353–80.
Jordan, M.; Velozo, J. y A. M. Sabja. 1996. Organogénesis in vitro of Nothofagus alpina (P. et
E.) Oerst. Fagaceae. Plant Cell Reports. 15 (10): 795-798.
75
Landi L.; Mezzetti B. 2006. TDZ, anxin and genotype effects on leaf organogenesis in
Fragaria. Plant Cell Rep. 25: 281–288.
Lara, A. Valverde, R. Gómez, L.2003. Histología de embriones somáticos y brotes adventicios
inducidos en hojas de Psychotria acuminata. Agronomía Costarricense 27(1): 37-48.
Larson, C; C. Gómez; M, Sánchez-Olate y D, Ríos. 2006. Inducción de caulogénesis indirecta
en Eucalyptus globulus. Bosque 27 (3): 250-257.
Loewe, V.; Toral, M.; Freitte, G.; Camelio, M.; Mery, M.; López, C y E. Urquieta. 1997.
Monografía de Raulí. Nothofagus alpina. CONAF, INFOR, FIA. Santiago. Chile.
Martínez-Pastur, G. y Arena, M. 1995. In vitro propagation of Nothofagus obliqua (Fagaceae).
Austral Journal Botany. 43: 601-607.
Martínez-Pastur, G. and M. Arena. 1996. In vitro propagation of Nothofagus nervosa (Phil.)
Dim. et Mil. Phyton. 58 (1/2): 1-7.
Martínez-Pastur, G.; Arena, M. y Caso, O. H. 1997. In vitro propagation of Nothofagus
antartica from Sphaeroblasts and saplingns. Biocell. 21 (3): 231-236.
Martínez-Pastur, G. y Arena, M. 1999. Micropropagation of Nothofagus pumilio (Poepp. et
Endl.) Krasser. Bosque. 18 (2): 43-50.
Martínez-Pastur, G. Arena, M. Curvetto, N. Zappacosta, D. Eliasco, E. 2003. Successive
media to improve the in vitro rhizogenesis of Nothofagus nervosa (Phil.) Dim. et Mil. New
Forests 26: 201–215.
Morisset, J. B. Mothe, F. Bock, J. Breda, N . Colin, F.2012. Epicormic ontogeny in Quercus
petraea constrains the highly plausible control of epicormic sprouting by water and
carbohydrates. Annals of Botany 109: 365–377.
Nontaswatsri C.; Fukai S.; Touma T.; Goi M. 2002. Comparison of adventitious shoot
formation of various carnation (Dianthus caryophyllus L.) cultivars. J. Hort. Sci. Biotech.
77: 520–525.
Orellana, P. 1998. Introducción a la Propagación Masiva. pp 125-133. En: J.N. Pérez P. (Ed.)
Propagación y Mejora Genética de Plantas por Biotecnología. Instituto de Biotecnología de
las Plantas, Santa Clara.Cuba.
Payghamzadeh, K. Kazemitabar, S.K. 2011. In vitro propagation of walnut - A review.
African Journal of Biotechnology Vol. 10(3), pp. 290-311.
76
Pierik, R.1990. Cultivo in vitro de las plantas superiores. Ediciones Mundi-Prensa. Madrid
España.
Popielarska, M. Slesak, H. Góralski, G. 2006. H istological and SEM studies on organogenesis in
endosperm derived callus of Kiwifruit (Actinidia deliciosa cv Hayward) Acta Biologica
Cracoviensia Series Botanica 48/2: 97–104.
Puigderrajols, P. Celestino, C. Suils, M. Toribio, M. Molinas, M. 2000. Histology of
Organogenic and Embryogenic Responses in Cotyledons of Somatic Embryos of Quercus
suber L. Int. J. Plant Sci. 161(3):353-362.
Ramage, C. Williams, R. 2004. Cytokinin-induced abnormal shoot organogenesis is associated
with elevated Knotted1-type homeobox gene expression in tobacco. Plant Cell Rep.
22:919–924.
Sabja, AM. Ortiz, O. Triviño, C. 2008. Avances de clonación in vitro de árboles adultos de
Rulí (Nothofagus alpina Poepp. et Endl.) Oerst.) para propagación comercial. Agrociencia
42: 595-603.
Sánchez-Olate, M.; Ríos, D.; Pedraza, M.; Pereira, G.; Castellanos, H. y Escobar, R. 2004.
Propagación in vitro de Nothofagus procera ((Poepp. et Endl.) Oerst.) a partir de embriones
aislados. Bosque: 25 (1): 123-128.
Sánchez-Olate, M.; Ríos, D. y Escobar, R.2005. La Biotecnología Vegetal y el Mejoramiento
Genético de Especies Leñosas de Interés Forestal y sus Proyecciones en Chile, pp 17-28.
En: Sánchez-Olate. M. y Ríos. D. (Eds.) Biotecnología Vegetal en Especies Leñosas de
Interés Forestal. Departamento de Silvicultura. Facultad de Ciencias Forestales.
Universidad de Concepción. Concepción – Chile.
SAS Institute. 2002. SAS® User’s guide: Statistics. Version 9.0. SAS Institute, Cary, North
Carolina, USA
Shen, X. Kane, M. Chen, J. 2008. Effects of genotype, explant source, and plant growth
regulators on indirect shoot organogenesis in Dieffenbachia cultivars. In Vitro
Cell.Dev.Biol.-Plant. 44:282–288.
Su, Y.H., Liu, Y.B. Zhang, X.S. 2011. Auxin–Cytokinin Interaction Regulates Meristem
Development. Molecular Plant, Pages 1–10.
77
CAPITULO 3.
COMPARACIÓN DE EMBRIONES SOMÁTICOS Y CIGÓTICOS DE Nothofagus
alpina: MADURACIÓN, MORFOLOGÍA E HISTOLÓGIA.
Priscila Cartes1; Katia Sáez2; Darcy Ríos1; Manuel Sánchez1
1Universidad de Concepción. Facultad Ciencias Forestales, Departamento Silvicultura y Centro de Biotecnología, casilla 160-C, Concepción, Chile, teléfono (56) 41-2207241, fax: (56) 41-2207310, [email protected]. 2Universidad de Concepción, Facultad de Ciencias Físicas y Matemáticas, Avda. Esteban Iturra s/n - Barrio Universitario, Concepción, Chile
RESUMEN
Obtener embriogénesis somática en el género Nothofagus, establece la necesidad de
comprender los cambios morfológicos y estructurales que sufren los tejidos, para generar un
embrión somático maduro y viable en el tiempo. Con el fin de validar la vía morfogénica
obtenida, comparar y caracterizar embriones somáticos sometidos a los tratamientos de
maduración frente a embriones cigóticos maduros de N. alpina. Se realizaron estudios
anatómicos y ultraestructurales (microscopía electrónica de barrido) a callos embriogénicos y
no embriogénicos, así como a embriones somáticos (Es) en diferentes estados de desarrollo,
sometidos a tratamientos de maduración. Se llevó a cabo un ensayo de maduración de masas
proembriogénicas en estado cotiledonar con la adición de diferentes concentraciones de ABA
exógeno. Para la histología los tejidos fueron fijados en FAA 70 % durante 48 horas y
posteriormente en etanol al 70% v/v. Las muestras fueron embebidas en parafina luego de la
deshidratación. Se cortaron secciones transversales de callo y secciones longitudinales de
embriones somáticos, de 10 µm de espesor, siendo teñidas con Safranina-Fast Green. Para los
estudios ultraestructurales, las muestras fueron fijadas en FAA 70%, deshidratadas en una
serie creciente de etanol, realizándose un cubrimiento iónico-metalización con oro. Tras ser
sometidos a tratamientos de maduración y germinación, las MPE presentaron embriones
somáticos globulares con células de forma redondeada, pared gruesa, citoplasma denso y
núcleo prominente. También se visualizaron estados torpedo y cotiledonar, caracterizados por
el alargamiento del eje hipocótilo-radícula. Los resultados obtenidos demostraron las
similitudes entre embriones somáticos y cigóticos, posibilitando de esta manera obtener
embriones somáticos viables, y así lograr optimizar el proceso de conversión a planta en raulí.
Palabras clave: embriogénesis somática, histología, maduración, conversión a planta.
78
INTRODUCCIÓN
La embriogénesis somática (ES) o formación de embriones somáticos (embrioides) tiene su
origen en células somáticas de la planta donante, las cuales se “reprograman” y siguen un
patrón de desarrollo idéntico al del embrión de origen cigótico, conservando el genotipo de la
planta donadora (Merkle y Dean. 2000; Celestino et al. 2005; Peña et al. 2010). En el cultivo
de tejidos vegetales in vitro la ES es considerada por algunos autores como la vía más
poderosa de micropropagación (Cevallos et al. 2002). Sin embargo, la necesidad de
comprender el proceso de formación de los embriones somáticos (Es) está empezando a
emerger, ya que los detalles de los mecanismos de señalización implicados en los procesos de
inducción siguen siendo desconocidos (Rose et al. 2010; Wang et al., 2011).
Estudios han demostrado que los Es tienen las mismas etapas de desarrollo que sus homólogos
cigóticos, estas etapas en especies dicotiledóneas se denominan estadio globular, corazón,
torpedo y cotiledonar (Dodeman et al. 1997; Lopes et al. 2011). Sin embargo, en algunos
casos el éxito del proceso embriogénico para llegar a conversión a planta, va a depender del
grado de maduración que los Es desarrollen durante su cultivo, debido a que pocos genotipos
responden positivamente frente a los tratamientos de maduración y los que responden en
algunos casos no se desarrollan o presentan anormalidades (Corredoira et al. 2003; Miguel et
al.2004). Por lo tanto, se busca obtener una producción sincrónica y de calidad de los
embriones, es decir, que se asemejen o tengan un desarrollo similar a los embriones cigóticos
(Ec) maduros de la especie (Celestino et al. 2005).
A pesar que el desarrollo de los embrioides transcurre a través de sucesivas etapas, tal como se
observa en la embriogénesis cigótica, éstos no experimentan dormancia (Zimmerman. 1993).
Tejidos importantes como los tegumentos y el endospermo, los cuales son requeridos para
79
conservación y germinación, respectivamente, no se forman (Dodeman et al. 1997; Vales et
al. 2007). Si bien, los productos de reserva y los compartimentos subcelulares a los cuales son
dirigidos estas sustancias son análogos en ambos casos (Von Arnold et al. 2002). La cantidad
de almacenamiento de una sustancia en particular, así como el momento de tal acumulación,
puede variar entre Es y Ec (Merkle et al. 1995; Bandyopadhyay y Hamill. 2000; George et al.
2008).
En el proceso de maduración embriogénica, período de desarrollo del embrión en el cual
ocurre la expansión celular y la acumulación de reservas, se han evaluado diferentes
componentes del medio de cultivo que desempeñan un papel importante en este proceso, entre
los que se encuentran principalmente fuentes nitrogenadas, carbonadas, reguladores del
crecimiento, así como tratamientos a bajas temperaturas sobre estados embriogénicos
avanzados (Cuenca et al. 1999; Corredoira et al. 2003; Robichaud et al. 2004).
En condiciones naturales, la aplicación de bajas temperaturas como sistema de estratificación
también ha sido reportado como necesario en Nothofagus (Donoso et al. 1998), en donde las
semillas reciben un prolongado período de frío en el suelo antes de recibir las condiciones de
temperatura y humedad necesarias para gatillar la germinación.
En laboratorio, se ha empleado ácido abscísico (ABA) en un amplio rango de concentraciones
para mejorar la maduración de las masas proembriogénicas (MPE) que contienen los Es,
observando a su vez un efecto positivo en el control de la embriogénesis somática secundaria
(Ess) en Quercus suber y N. alpina (García-Martin et al. 2005; Cartes et al. 2011). Además el
ABA desempeña un papel fundamental en la maduración de los embriones y su posterior
germinación. Actúa en la acumulación de reservas nutritivas, la inducción de la dormancia y la
adquisición de la tolerancia a la desecación, mediante la acumulación de proteínas LEA (Late–
embryogenesis-abundant) (Ooms et al. 1993; Finch-Savage et al. 1994; Pandey et al. 2008),
80
aunque los mecanismos de estos procesos todavía no están del todo claros. También inhibe la
germinación precoz y promueve la latencia de las semillas (Singh y Browning. 1991; Rock y
Quatrano. 1995; Hernández et al. 2010).
Los procesos implicados en la ES, explican la posibilidad de las células vegetales de lograr la
desdiferenciación de los tejidos y como consecuencia cambiar su destino o re-diferenciarse en
vías de desarrollo, tales como, crecimiento no organizado (callo no morfogénico) o generar
órganos y un crecimiento organizado (callo morfogénico) (Wang et al. 2011). Generalmente,
la localización de la diferenciación de los tejidos en Es coincide en diferentes especies como
Feijoa sellowiana y Psychotria acuminata, donde los eventos morfogénicos conducentes a la
micropropagación, ocurren únicamente en la superficie adaxial de los cotiledones y hojas
respectivamente (Canhoto y Cruz 1996; Lara et al. 2003).
Hasta ahora, no se ha reportado una descripción del origen y desarrollo de los Es en raulí. Un
estudio ontogénico y comparativo entre la embriogénesis somática y cigótica puede
determinar cuáles tejidos en particular se derivan en meristemos embriogénicos o en cuáles
estados posteriores de desarrollo se detiene el proceso. Esta información podría servir para
aumentar o manipular la respuesta embriogénica en el tiempo que se requiera (Vidal et al.
2000; Tereso et al. 2007; Moura et al. 2008).
En ocasiones la distinción entre Es y órganos dentro del las MPE puede ser difícil de
identificar. Determinar las características histológicas más distintivas de los Es tales como el
polo caulinar y radicular, existencia de conexión vascular con los tejidos maternos, similitudes
de tejidos cigóticos y somáticos entre otros, es vital para validar el proceso embriogénico de
toda especie (Lara et al. 2003; Celestino et al. 2005).
De acuerdo a lo afirmado anteriormente, es necesario establecer un modelo para estudiar los
mecanismos involucrados que subyacen no sólo a la embriogénesis somática, sino también a la
81
embriogénesis cigótica y la totipotencia de las células vegetales. En tal sentido, este estudio
tiene como objetivo validar la vía morfogénica obtenida, comparar y caracterizar embriones
somáticos sometidos a los tratamientos de maduración frente a embriones cigóticos maduros
de N. alpina.
MATERIALES Y MÉTODOS. Material vegetal.
Se empleó material vegetal procedente de la línea embriogénica de N. alpina (raulí cotiledonar
01 RaC-01), inducida desde cotiledones aislados de semillas maduras, las cuales fueron
obtenidas a través de polinización controlada. Luego de la inducción de callo embriogénico y
manifestación de embriones somáticos el cultivo se dispuso en medio de mantención,
consistente en la solución mineral y vitaminas Broadleaved Tree Medium (BTM) (Chalupa.
1983), más los reguladores del crecimiento 6-bencilaminopurina (BAP) y ácido naftalén
acético (ANA) a concentraciones de 0,1 mgL-1 ambos reguladores suplementado con 30 gL-1
de sacarosa y solidificado con 7,0 gL-1 de agar. Se practicaron subcultivos a medio fresco cada
28 días, alternando dos subcultivos en medio con reguladores del crecimiento con un
subcultivo en medio base BTM, sin reguladores. Los explantos permanecieron en estas últimas
condiciones hasta el comienzo de los ensayos.
Material de inicio.
El material de inicio para cada uno de los ensayos de maduración consistió en MPE de la línea
clonal RaC-01, con presencia de embriones somáticos en estado cotiledonar. Se seleccionaron
MPE, cuyo peso fresco al inicio de los tratamientos de maduración fuera entre a 80 a 100 mg.
82
Maduración de embriones somáticos
Se llevaron a cabo cuatro tratamientos de maduración con distintas concentraciones de ABA al
en el medio de cultivo incluyendo al testigo en concentraciones de 0, 2, 3, y 5 mg L-1 (T0, T1,
T2 y T3, respectivamente) y dos condiciones de temperatura 4ºC y 25ºC durante 4 semanas
(Tabla 3.1), En todos los casos, se empleó la solución mineral BTM como medio base, más
60 gL-1 de sacarosa y 7,0 g L1 de agar. El cultivo se mantuvo en oscuridad continua a una
temperatura de 25 ± 1ºC de día y 22 ± 1ºC de noche. Después de cuatro semanas de cultivo se
procedió a evaluar el incremento en peso fresco (IPF) de las MPE, registrando el peso final.
Además se evaluó la presencia de embriogénesis somática secundaria (Ess) por tratamiento.
Tabla 3.1. Concentración de ABA aplicada en tratamientos de frío para la maduración de embriones somáticos de Nothofagus alpina.
Tratamiento
Temperatura
(ºC)
ABA (mg L-1)
T0 4 25 0
T1 4 25 2
T2 4 25 3
T3 4 25 5
Germinación de embriones somáticos in vitro Luego de la fase de maduración, se procedió a subcultivar las MPE en BTM base sin
reguladores del crecimiento, por un período de tres semanas. Luego se procedió a la fase de
germinación, aislando 10 muestras al azar de MPE sometidas a los tratamientos de
maduración, con ayuda de pinzas y lupa estereoscópica se procuró dejar en la MPE embriones
83
somáticos en estado cotiledonar, siendo transferidos a 5 tratamientos de germinación, los que
consistieron en la aplicación de GA3, BAP y AIB a diferentes combinaciones en medio BTM
con macronutrientes diluidos a un 25%, durante 4 semanas (Tabla 3.2). En todos los casos, la
hormona GA3 fue esterilizada mediante filtración y aplicada al medio después del
autoclavado. En este caso, luego de 7 días de oscuridad, el cultivo fue transferido a la luz con
un fotoperiodo de 16 horas, temperaturas de 25 ± 1ºC en el día y 20 ± 1ºC en la noche.
Se evaluó por tratamiento la presencia de Ess expresada en porcentaje (%). La fase de
germinación de Es en estado cotiledonar, se determinó al cabo de cuatro semanas. Puesto que
la germinación de embriones somáticos se ve alterada por las condiciones de cultivo
(inducción y maduración de los embriones) se presentan diferentes grados de germinación o
desarrollo a plántula. Para ello se utilizó una adecuación de los criterios de clasificación de la
germinación de Es descrita por (Cartes et al. 2011), por lo cual se evaluó la germinación
según: solo presencia caulinar, solo presencia radicular, presencia caulinar y radicular
(plántula).
Tabla 3.2. Reguladores del crecimiento aplicados en los tratamientos de germinación de
embriones somáticos de Nothofagus alpina.
Tratamiento BAP(mgL -1) AIB (mgL -1) GA3 (mgL-1)
G0 0 0 0
G1 0 0 1,0
G2 0,1 0 1,0
G3 0 0,01 1,0
G4 0,1 0,01 1,0
Diseño Experimental.
84
En todos los casos se estableció un diseño experimental completamente aleatorio. En la etapa
de maduración, la unidad experimental estuvo constituida por una placa petri de 9 cm de
diámetro, conteniendo 6 MPE. Del mismo modo, en la fase de germinación, la unidad
experimental estuvo constituida por un tubo de ensayo conteniendo MPE con embriones
somáticos en estado cotiledonar. Se realizaron 10 réplicas por tratamiento. En todos los casos,
los efectos de los tratamientos se evaluaron mediante ANDEVA, seguido del test de Tukey al
nivel p≤0,05 para comparar medias.
Histología y ultraestructura de embriones somáticos y cigóticos.
Para los estudios anatómicos, se llevó a cabo una caracterización histológica tanto de las MPE
como de los embriones somáticos generados mediante embriogénesis secundaria. Para tal
efecto, las muestras fueron fijadas en FAA 70 % (formaldehido 5%- ácido acético 5%-alcohol
90%) durante 48 horas y posteriormente en etanol al 70% v/v. Las muestras fueron embebidas
en parafina luego de la deshidratación. Se cortaron secciones transversales de callo y secciones
longitudinales de embriones somáticos, de 10 µm de espesor, siendo teñidas con hematoxilina.
Para los estudios ultraestructurales, las muestras fueron fijadas en FAA 70%, deshidratadas en
una serie creciente de etanol, realizándose un cubrimiento iónico-metalización con oro.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
Maduración de Embriones somáticos
En este estudio queda de manifiesto que la exposición de las MPE a bajas temperaturas (4°C)
por un periodo de cuatro semanas no afecta significativamente el IPF y la variable Ess. Sin
embargo, el efecto de las crecientes concentraciones de ABA aplicadas en los tratamientos
85
muestra una disminución del IPF (control: 23 mg; T3: 15 mg) y de la variable Ess (control: 60
%; T3: 25 %) con respecto al control (p<0,05) (Figura 3.1 y 3.2). Estos resultados corroboran
lo reportado en la especie por Cartes et al (2011), bajo condiciones similares y obteniendo una
disminución del IPF y Ess, sumado a lo expuesto por García–Martin et al. (2005) que señalan
una disminución significativa del peso fresco a medida que aumenta la concentración de ABA
exógeno al medio de cultivo por el control de la Ess. El aumento de IPF estaría relacionado
con la aplicación de altas concentraciones de fuentes de carbono más que la aplicación ABA
(George et al. 2008).
Diversos autores señalan a la Ess como una limitante para que el embrión somático complete
su desarrollo y germine hasta lograr su conversión a planta (García –Martín et al. 2005).
Estudios realizados indican que los niveles de ABA durante la Ess es similar a lo observado en
un estado inmaduro demostrándose que los embriones somáticos secundarios son producidos
desde embriones somáticos primarios con bajos niveles de ABA, lo cual indica que altas a
Figura 3.1. Efecto del frio y ABA sobre el Incremento en peso fresco (IPF) de embriones somáticos de N. alpina. Tratamientos: T0: sin ABA; T1: ABA 2 mg L-1; T2: ABA 3 mg L-1; T3: ABA 5 mg L-1 sometidos a 4°C y 25°C. Distintas letras indican diferencias significativas de acuerdo a test Tukey (P < 0.05).
Figura 3.2. Efecto del frio y ABA sobre la embriogénesis somática secundaria (Ess), en embriones somáticos de N. alpina. Tratamientos: T0: sin ABA; T1: ABA 2 mg L-1; T2: ABA 3 mgL-1; T3: ABA 5 mg L-1 sometidos a 4°C y 25°C .Distintas letras indican diferencias significativas de acuerdo a test Tukey (P < 0.05).
86
concentraciones es un indicador de madurez, pero el momento de ser expuestos los Es a la
presencia de ABA es vital para no ocasionar respuestas adversas en la germinación de los Es
(Garcia –Martín et al. 2005; Vega y Prehn. 2005; George et al. 2008).
En la figura 3 se muestra los resultados obtenidos de los Es en estadio cotiledonar sometidos a
la adición de GA3 posterior a la fase de maduración. En la Figura 3.3A se aprecia que la
temperatura solo tuvo un efecto significativo en la variable Ess cuando se aplicaron las
mayores concentraciones de ABA al medio de cultivo e incluso obteniendo mejores resultados
cuando los Es no se sometieron a bajas temperaturas. Estudios realizados en Juglans nigra
señala que una exposición a periodos de frío provoca una disminución en los niveles
disponibles de ABA endógeno, generando un aumento de la sensibilidad a GA3, que en
algunos casos puede promover el desarrollo de embriones secundarios (Figura 3.4A) (Deng y
Cornu. 1992).
Germinación de Embriones somáticos in vitro
Figura 3.3. Efecto de los tratamientos de germinación aplicados a los embriones somáticos de N. alpina. A) Porcentaje de embriogénesis somática secundaria (Ess) según tratamiento de germinación aplicado. B) porcentaje de embriones somáticos con presencia solo caulinar. C) porcentaje de embriones somáticos con presencia solo
87
radicular. D) porcentaje de conversión a plántula. Tratamientos: G0: sin reguladores del crecimiento; G1: BAP 0 mg l-1+ AIB 0 mg l-1 + GA3 1,0 mg l-1; G2 BAP 0,1 mg l-1+ AIB 0 mg l-1 + GA3 1,0 mg l-1; G3: BAP 0 mg l-1+ AIB 0,01 mg l-1 + GA3 1,0 mg l-1 G4: BAP 0,1 mg l-1+ AIB 0,01 mg l-1 + GA3 1,0 mg l-1.sometidos a 4°C y 25°C El rol del ABA y la GA3 en el proceso maduración y germinación respectivamente, ha sido
reportado por un gran número de autores en el proceso de ES (Tang et al. 2000; Robichaud et
al. 2004; Vahdati et al. 2008; Peña et al. 2010; Quainoo y Dwomon. 2012). La finalidad es
obtener mejores resultados en las tasas de conversión a plántula. La germinación de los Es en
especies recalcitrantes se presenta asincrónica en los polos, generando en algunos casos el
desarrollo solo del polo apical o radicular. (Tang et al. 2000; Cartes et al. 2011). La Figura
3.3B y 3.3C muestra la alta y baja respuesta obtenida de los Es presentando desarrollo caulinar
(hasta el 100%) (Figura 3.4B) y radicular (40%) (Figura 3.4C), respectivamente. Sin
embargo, el porcentaje de conversión a plántula obtenido fue nulo en casi todos los
tratamiento aplicados, excepto, en aquellos Es sometidos a 4 °C y 5mg L-1 de ABA en la etapa
de maduración y aplicando la acción combinada de BAP, AIB y GA3 en el proceso de
germinación, obteniendo niveles de conversión a plántula del 50% (Figura 3.3D) y (Figura
3.4D). Si bien existen autores que señalan que la exposición de ABA y periodos de frío ayuda
a las MPE en el proceso de maduración y posterior germinación de los Es (Von Arnold et al.
2002; Vahdati et al. 2008), estudios realizados en Juglans regia señalan que periodos de frío
no ayudaron a la germinación de Es, presentado solo un 6% de desarrollo caulinar, 18% de
solo desarrollo radicular y 19% de ambos (Tang et al. 2000). Este comportamiento se podría
explicar debido a que periodos prolongados de frío estimulan la actividad de GA3 y por
consiguiente la inhibición de ABA endógeno, estimulando la germinación precoz de los Es y
perjudicando la maduración de estos (Deng y Cornu. 1992). Además George et al, (2008)
indica que exponer a los Es a tratamiento de maduración o germinación cuando no han
completado su desarrollo con la presencia de auxina en la etapa de inducción, puede ser la
88
respuesta a los bajos niveles obtenidos en conversión a planta. Por otra parte, en Pinus taeda
Pullman et al. (2003) señala que en contraste con los Ec, al germinar los Es primero
desarrollan su parte caulinar y más tarde la radicular, solo si han alcanzado el nivel de
maduración requerido para ello.
Figura 3.4. Embriones somáticos sometidos a los tratamientos de maduración y germinación. (A) Flechas indican embrión somático con presencia de Ess. (B) Embrión somático presentando sólo desarrollo caulinar. (C) Embrión con sólo desarrollo radicular. (D) Plántula. Histología y ultraestructura de embriones somáticos y cigóticos de N. alpina
En la figura 3.5 se observa la secuencia de los diferentes estados celulares y tisulares del
desarrollo de un Es de raulí en comparación con un Ec. De la figura 3.5 A) y Aa) se muestra
la morfología e histología de callo no-embriogénico (CNE). En la literatura y en este estudio el
CNE se presenta de un color traslucido, acuoso, poco compacto de superficie lisa y sin
evidencia de formación de estructuras morfogénicas (Cevallos et al. 2002; Yang et al. 2012).
Además presenta células grandes alargadas con grandes espacios intercelulares y
89
fundamentalmente del tipo parenquimatoso, esto coincide con lo reportado por Popielarska et
al. (2006) en Actinidia deliciosa.
En la Figura 3.5B se evidenció la presencia de un callo compacto con estructuras globulares y
torpedo característico de una MPE (Gómez. 1998). En la Figura 3.5Ba se observó el tejido
circundante de células pequeñas, compactas e isodiamétricas, con alto contenido
citoplasmático, característico de células pro-embriogénicas (Claret et al. 2003; Yang et al.
2012). Además como muchos estudios en los subcultivos sucesivos de las MPE la
proliferación de estructuras se sitúa en dirección adaxial del callo y experimentan un
desarrollo directo e indirecto, es decir, directamente de embriones primarios o directamente
desde el callo (Cevallos et al. 2003; Corredoira et al. 2006)
La morfología de un embrión cigótico maduro (Figura 3.5C- Ca) se caracteriza por ser
compacto, con tejido epidérmico formado y procambial definido en su ápice y base
(Beeckman et al. 2000). La Figura 3.5Cb muestra la proyección apical del Ec con células de
núcleo grande, bien organizadas de citoplasma denso y vacuolas pequeñas, idénticas
características se han reportado en la literatura (Beeckman et al. 2000; Danial et al. 2011).
Con divisiones en dirección periclinal para el desarrollo caulinar del embrión y hacia su base
con divisiones anticlinales para el desarrollo radicular, características similares han sido
descritas en Psychotria acuminata y Pinus pinaster (Lara et al. 2003; Tereso et al. 2007). El
tejido vascular o xilema primario consistió en 4 a 6 “hebras celulares” con engrosamiento de
sus paredes (Figura 3.5Cc), necesario para ser utilizados en la germinación (Fras et al. 2008).
Durante la ES conforme las divisiones celulares aumentan en las MPE las estructucturas
globulares proliferan y se diferencian embrioides en estado globular avanzado, con zonas
tisulares diferenciadas en tejidos vasculares primarios, iniciándose la vascularización de las
nuevas estructuras embriogénicas, a diferencia de zonas tisulares cercanas que permanecen
90
indiferenciadas (Figura 3.5D-Dc). Subsecuentemente a la fase globular, el embrioide tiende a
aplanarse, formar una concavidad en uno de sus lados y desconectarse del tejido materno, la
fase continua con el estadio corazón, que es donde se inicia la polarización de las zonas
caulinar y radical, para culminar en el estadio torpedo- cotiledonar (Figura 3.5E-Eb). Al
comparar éstos estadios con el Ec, se puede observar que ambos poseen similitudes en cuanto
a organización tisular, presencia de células pequeñas con núcleos prominentes, proceso de
división periclinal y anticlinal, desarrollo de células epidérmicas y bandas procambiales desde
fases iníciales (estadio globular). Resultados con características morfológicas e histológicas
similares entre Es y Ec se han reportado en una gran variedad de especies como: Eucalyptus
nitens; Musa sp; Pinus pinaster; Pinus taeda Acrocomia aculeata; Passiflora edulis entre
otras (Bandyopadhyay y Hamill. 2000; Vidal et al. 2000; Pullman et al. 2003; Tereso et al.
2007; Moura et al. 2008; Lopes et al. 2011)
En la Figura 3.5Ec se presenta la zona apical de un Es estado torpedo. Se observan células
típicas del tejido meristemático (meristemo central o domo meristemático) que dará origen a
las hojas iníciales. En esta etapa los embrioides muestran sus polos apical y radical definidos,
sin ningún nexo con el tejido vascular materno. Iguales características fueron descritas en
Coffea canephora por Cevallos et al. (2002).
Los Ec se consideran germinados, cuando emerge la radícula. Sin embargo, estudios
realizados en P. taeda y N. alpina (Pullman et al. 2003; Cartes et al. 2011) se presenta con
mayor frecuencia de manera inversa, parte con la emergencia caulinar y luego radicular. No
obstante, a nivel histológico (Figura 3.5F-Fa) se puede visualizar un meristemo apical y un
meristemo radical desarrollado, caracterizado además, por poseer conexión vascular entre
estas dos zonas (Figura 3.5Fb-Fc), células procambiales que generan los elementos
traqueales, que se formaron probablemente a partir de células con división periclinal y
91
predeterminadas para diferenciarse en xilema. Como se señala en estudios realizados en A.
aculeata; (Moura et al. 2008).
Figura 3.5. Morfología e histología de estructuras embriogénicas y no-embriogénicas. Callo no embriogenico (A-Aa), embrión cigótico (C-Cc) y embriones somáticos (D-Fc) de N. alpina. A) Masa no embriogénica (MNE), Aa) Células grandes e irregulares con poca presencia de núcleos B) Masa Proembriogénica (MPE), Ba) Masa embriogénica con diferentes estadios en desarrollo. C) Embrión cigótico, Ca) Embrión cigótico con presencia visible de
92
bandas procambiales Cb) Zona apical de embrión cigótico que muestra división celular organizada en forma periclinal y anticlinal. Cc) Zonal apical de embrión cigótico que muestra bandas procambiales desarrolladas D) Embrioide en estado globular, Da) Embrioide en estado globular sin conexión vascular al tejido materno Db) Embrión somático en cambio de fase globular a corazón- torpedo. Dc) Zona epidérmica con actividad meristemática. E) Embrioide en estado corazón- torpedo. Ea) Corte de embrioide en estado corazón. Eb) embrioide en estado corazón- torpedo con presencia de bandas procambiales en desarrollo. Ec) Domo meristemático (DM). F) Germinación de embrión somático. Fa) Corte de Es germinado que muestra el tejido vascular de ápice a raíz Fb) Parte aérea de Es germinado con presencia de tejido conductor. Fc).Células del tejido vascular en ordenamiento y desarrollo. Las observaciones en microscopio de barrido superficial (Figura 3.6A) evidencian un Ec de
superficie compacta y lisa con ordenamiento celular definido hacia el polo radical. En cambio,
en la Figura 3.6B se presenta una MPE con embriones somáticos fusionados y asincrónicos
en diferentes etapas de desarrollo de manera simultánea, comunes en la etapa de inducción y
proliferación de las MPE, pero poco deseadas para la fase de maduración (Canhoto et al.
1996; Bandyopadhyay y Hamill. 2000)
Figura 3.6. Escáner de estructuras embriogénicas cigóticas y somáticas de N. alpina. A) Embrión cigótico B) Masa Proembriogénica (MPE) C) Embrión somático en estado globular, D) Embrión somático en estado torpedo con protuberancias globulares. El análisis de ultraestructuras permitió visualizar la formación de estructuras globulares en
forma continua (Figura 3.6C), lo que sugiere la presencia de un proceso de embriogénesis
93
somática repetitivo, esto coincide con la presencia de grupos de células embriogénicas de 30 a
40 µm de longitud de forma isodiamétricas en continua división reportadas en C. odorata
(Peña et al. 2010). En la Figura 3.6D se observa el grado de organización celular de un
embrión somático en estado torpedo, el más similar al Ec en ordenamiento celular por su
estado avanzado de desarrollo, presentando múltiples zonas meristemáticas, incluyendo
grupos globulares con conexiones vasculares entre el embrión emergente y el tejido original,
generando un posible embrión secundario, reportes similares se presentan en el estudio
realizado a P. edulis por Lopes et al. (2011)
Por su parte, la similitud entre Es y Ec de N. alpina permite avanzar hacia la automatización
del proceso de ES y la encapsulación de embriones somáticos de raulí (Cartes et al. 2009). No
obstante, antes de considerar a gran escala la aplicación de esta tecnología, es necesario seguir
trabajando para comprender el proceso de desarrollo que conduce a la producción de
embriones somáticos sincrónicos y optimizar el proceso de conversión a planta.
CONCLUSIONES
El presente estudio ha demostrado la necesidad de modificar las condiciones de cultivo en una
fase previa a la germinación, donde las horas de frío son necesarias para alcanzar niveles de
germinación que se manifiesten en mejores tasas de conversión a planta. Lo anterior, sumado
al efecto positivo del ABA en el control de la germinación precoz, permitirá por medio de
estudios sucesivos mejorar el protocolo de multiplicación de clones de N. alpina mediante
embriogénesis somática.
A pesar de no existir reportes acerca de la morfohistología de embriones somáticos en N.
alpina, este estudio permitió validar el proceso morfogénico de embriogénesis somática
conducentes a la micropropagación de la especie, mediante las similitudes encontradas en el
94
proceso embriogénico entre los homólogos cigóticos de N .alpina y de otras especies
relacionadas. Además se logro la diferenciación de los tipos celulares con capacidad
embriogénica y no embriogénica. Estos hallazgos abren el camino para futuras investigaciones
relacionadas con el mejoramiento del proceso de embriogénesis somática en N. alpina.
LITERATURA CITADA
Bandyopadhyay S. y Hamill, J. 2000. Ultrastructural Studies of Somatic Embryos of Eucalyptus nitens and Comparisons with Zygotic Embryos Found in Mature Seeds. Annals of Botany (86): 237-244.
Beeckman, T. De Rycke, R. Mane, R. Viane, R. Inze, D. 2000.Histological Study of Seed
Coat Development in Arabidopsis thaliana. J. Plant Res. 113: 139-148. Canhoto, J. Mesquita, J.Cruz, G.1996. Ultrastructural Changes in Cotyledons of Pineapple
Guava (Myrtaceae) During Somatic Embryogenesis. Annals of Botany 78: 513±521. Cartes P, Castellanos, H. Ríos D, Sáez K, Spierccolli, S. Sánchez Olate, M. 2009.
Encapsulated somatic embryos and zygotic embryos for obtaining artificial seeds of Rauli-Beech (Nothofagus alpina (Poepp. & Endl.) Oerst. Chilean journal of agricultural research 69(1):112-118.
Cartes P, Ríos D, Sáez K, Uribe M, Valenzuela S, Bolus S, Sánchez Olate, M. 2011.
Endogenous quantification of abscisic acid and indole 3-acetic acid in somatic and zygotic embryos of Nothofagus alpina (Poepp. & Endl.) Oerst. Chilean journal of agricultural research 71(4):542-548.
Celestino, C., I. Hernández, E. Carneros, D. López-Vela y M. Toribio. 2005. La embriogénesis somática como elemento central de la biotecnología forestal. Invest Agrar: Sist. Recur. For. 14(3), 345-357.
Cevallos, M. I. Sumac Sánchez y S. Montes. 2002. Caracterización histolólogica de la
embriogénesis en Coffea canephora P.var. robusta. Rev. Protección Veg. Vol 17 No. 1:14-19.
Claret C. Michelangeli de Clavijo, Paola I. Artioli G. Ada M. Medina M. 2003. Anatomía y ultraestructura de la embriogénesis somática en Onoto. Agronomía Tropical 53(1): 33-48.
Chalupa V. 1983. Micropropagation of conifer and broadleaved forest trees. Communicationes Instituti Forestalis Cechosloveniae. 13: 7-39.
95
Corredoira, E; Ballester, A. y Vieitez, A. M. 2003. Proliferation, maturation and germination of Castanea sativa Mill. somatic embryos originated from leaf explants. Annals of Botany. 92: 129-136.
Corredoira, E; Valladares, S. y Vieitez, A. M. 2006. Morphohistological analysis of the origin
and development of somatic embryos from leaves of mature Quercus robur. In Vitro Cell. Dev. Biol.—Plant 42:525–533.
Cuenca, B; San-José, M; Martínez, M; Ballester, A. y Vieitez, A. 1999. Somatic
embryogenesis from stem and leaf explants of Quercus robur L. Plant Cell Reports. 18:
538-543.
Danial, M. Lai Keng, C. Rabiah Syed Alwee, S. Subramania, S. 2011. Seed histology of recalcitrant Eurycoma longifolia plants during germination and its beneficial attribute for hairy roots production. Journal of Medicinal Plants Research Vol. 5(1), pp. 93-98,
Deng MD, Cornu D. 1992. Maturation and germination of walnut somatic embryos. Plant Cell
Tissue Organ Cult 28:195–202. Dodeman VL, Ducreux G, Kreis M. 1997. Zygotic embryogenesis versus somatic
embryogenesis. J. Exp. Bot. 48: 1493–1509. Donoso, P.; González, M.; Escobar, B.; Basso, I. y Otero, L. 1998. Viverización y plantación
de Raulí, Roble y Coigüe en Chile (pp: 177-244). En: Donoso, C. y Lara, A. (eds.).
Silvicultura de los Bosques nativos de Chile. Editorial Universitaria. Santiago. Chile. 421
páginas.
Finch-Savage WE, Blake PS. 1994. Indeterminate development in desiccation-sensitive seeds
of Quercus robur L. Seed Science Research 4, 127-33.
Fras, A. Smolen, B. Maluszynska, J. 2008. Vascularization of zygotic and somatic embryos of
Arabidopsis thaliana. Acta Biologica Cracoviensia. Series Botanica 50/2: 43–48.
García-Martín G, Manzanera JA, González-Benito M. 2005. Effect of exogenus ABA on
embryo maturation and quantification of endogenous levels of ABA and IAA in Quercus
suber somatic embryos. Plant Cell Tissue and Organ Culture. 80: 171–177.
George, E. Hall, M.Jan De Klerk G. 2008. Plant Propagation by Tissue Culture. 3rd Edition
Volume 1. 335-354.
96
Hernández, J. Martín, I. Esteban, R. Dopico, B. Labrador, E. 2010. Abscisic acid delays chickpea germination by inhibiting water uptake and down-regulating genes encoding cell wall remodelling proteins. Plant Growth Regul. 61:175–183.
Lara, A. Valverde, R. Gómez, L.2003. Histología de embriones somáticos y brotes adventicios
inducidos en hojas de Psychotria acuminata. Agronomía Costarricense 27(1): 37-48. Lopes, D. Rocha, AM. Monteiro M. Lemes da Silva, M. Jardim de Oliveira, M. Campos, W.
2011. Somatic embryogenesis from mature zygotic embryos of commercial passionfruit (Passiflora edulis Sims) genotypes. Plant Cell Tiss Organ Cult.
Merkle S.A., Dean J.F.D., 2000. Forest tree biotechnology.Current Opinion Biotech 11, 298-
302. Miguel, C., S. Gonçalves, S. Tereso, L. Marum and M.M. Oliveira. 2004. Somatic
embryogenesis from 20 open-pollinated seed families of Portuguese plus trees of maritime pine. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 76:121–130.
Moura, E. Contin M, Yoshimitsu S. Quirino A. Carvalho M, Manfio C.E.2008. Histological
study of somatic embryogenesis induction on zygotic embryos of macaw palm (Acrocomia aculeate (Jacq.) Lodd. ex Martius). Plant Cell Tiss Organ Cult. 175-183.
Ooms, J. J. J., Leon-Kloosterziel, K. M., Bartels, D., Koornneef, M. andKarssen, M. 1993.
Acquisition of desiccation tolerance and longevity in seeds of Arabidopsis thaliana. A comparative study using abscisic acid insensitive AB3 mutants. Plant Physiol. 102, 1185-1191.
Pandey GK, Grant JJ, Cheong YH, Kim BG, Li LG, Luan S. 2008. Calcineurin-B-Like Protein
CBL9 Interacts with Target Kinase CIPK3 in the Regulation of ABA Response in Seed Germination. Molecular Plant. 1(2):238-248.
Peña Y, García I, Hernández A, Domínguez A, Barredo F, González´ JA, Robert M. 2010. Induction of somatic embryogenesis and plant regeneration in the tropical timber tree Spanish red cedar [Cedrela odorata L.(Meliaceae)]. Plant Cell Tiss Organ Cult.
Popielarska, M. Slesak, H. Goralski, G.2006. Histological and SEM studies on organogenesis
in endosperm derived callus of kiwifruit Actinidia deliciosa. Acta biologica cracoviensia. Series Botanica 48/2: 97–104.
´ Pullman, G.S. Johnson, S. Peter, G. Cairney, J.·Xu, N. 2003 Improving loblolly pine somatic
embryo maturation:comparison of somatic and zygotic embryo morphology, germination, and gene expression. Plant Cell Rep 21:747–758.
Quainoo, A.K.Dwomon I.B. 2012. The Effect of abscisic acid in the conversion of Cocoa
somatic embryos into plantlets. Frontiers in Science 2012, 2(2): 6-10. Robichaud R, Lessard V, Merkle S. 2004. Treatments affecting maturation and germination of
American chesnut somatic embryos. Journal of Plant Physiology. 161: 957-969.
97
Rock, C., and R. S. Quatrano. 1995. The role of hormones during seed development. In P.
Davies, ed. Plant Hormones: Physiology, Biochemistry and Molecular Biology. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands. pp. 671-697.
Rose RJ, Mantiri F.R, Kurdyukov S et al. 2010. The developmental biology of somatic
embryogenesis. In: Pua EC, Davey MR. eds. Plant developmental biology: biotechnology perspectives, Vol. 2. Berlin: Springer-Verlag, 3 –26.
Singh Z, Browning G. 1991. The role of ABA in the control of appleseed dormancy re-
appraised by combined gas chromatography mass spectrometry. Journal of Experimental Botany 42: 269±275.
Tang, H. Ren, Z. Krczal, G. Improvement of English walnut somatic embryo germination and
conversion by desiccation treatments and plantlet development by lower medium salts. In Vitro Cell. Dev. Biol.—Plant 36:47–50.
Tereso S, Zoglauer K, Milhinhos A, Miguel C, Oliveira M. 2007. Zygotic and somatic embryo
morphogenesis in Pinus pinaster: comparative histological and histochemical study. Tree physiology. 27: 661–669.
Vahdati K, Bayat S, Ebrahimzadeh H, Jariteh M, Mirmasoumi M. 2008. Effect of exogenous
ABA on somatic embryo maturation and germination in Persian walnut (Juglans regia L.). Plant Cell Tiss Organ Cult. 93:163–171.
Vales T, Feng X, Ge L, Xu N, Cairney J, Pullman GS, Peter GF. 2007. Improved somatic embryo maturation in loblolly pine by monitoring ABA-responsive gene expression. Plant Cell Rep 26:133–143. Vidal, M C; Vargas T. E y García E. 2000. Estudios anatomicos y morfológicos de la
iniciación de embriones somáticos obtenidos a partir de apices meristematicos de Musa sp. Acta Científica Venezolana, 51: 78–83.
Von Arnold S, Sabala I, Bozhkov P, Dyachok J, Filonova L. 2002. Developmental pathways
of somatic embryogenesis. Plant Cell Tissue and Organ Culture. 69: 233-249. Wang, X.D., Nolan, K.E., Irwanto, R.R., Sheahan, M.B. & Rose, R.J. (2011). Ontogeny of
embryogenic callus in Medicago truncatula: the fate of the pluripotent and totipotent stem cells. Annals of Botany, Vol. 107, No. 4. pp. 599-609.
Yang, J. Wang, Y, J. Li, J. Tao, L. Deng, Q and Xiu-lan Lv. 2012. Morphological and
histological observations on the induction of anther calluses and embryos in loquat (Eriobotrya japonica Lindl.). African Journal of Agricultural Research Vol. 7(1), pp. 123-127.
98
Zimmerman, J. L. 1993. Somatic Embryogenesis: A model for early development in higher
plants. The Plant Cell: 5: 1411-1423.
99
CAPITULO 4.
ANALISIS DE VARIACIÓN SOMACLONAL EN EMBRIONES SOMAT ICOS Y
BROTES ADVENTICIOS ADULTOS DE N. alpina, MEDIANTE AFLP
Priscila Cartes R1;María Francisca Beltrán1. Darcy Ríos1; Rodrigo Hasbún1; Manuel
Sánchez-Olate1
1Universidad de Concepción. Facultad Ciencias Forestales, Departamento Silvicultura y Centro de Biotecnología, casilla 160-C, Concepción, Chile, teléfono (56) 41-2207241, fax: (56) 41-2207310, [email protected]
RESUMEN
La variación somaclonal es un evento que puede aparecer durante el cultivo in vitro, mediante
modificaciones genéticas en las células y los tejidos cultivados. Esta variación se ha usado en
procesos de mejoramiento genético y para ampliar la variación genética natural; sin embargo,
cuando el objetivo es la propagación clonal, como en el caso de la micropropagación del
Nothofagus alpina no es deseada. El objetivo de este estudio fue determinar estabilidad
genética o variación somaclonal en regenerantes de embriones somáticos y brotes adventicios
de N. alpina, obtenidos desde cultivos sucesivos, mediante la técnica molecular de AFLP.
Utilizando 6 combinaciones de partidores se obtuvo un 5,2% y un 14,8 % de fragmentos
polimórficos para embriones somáticos y brotes adventicios respectivamente. Estos resultados
contrastantes permiten determinar estabilidad genética en la línea embriogénica e inestabilidad
para la línea organogénica, sin embargo, en ambos cultivos no se presentan individuos con
características fenotípicas anómalas.
Palabras clave: marcadores moleculares, cultivo in vitro, variación somaclonal,
embriogénesis somática.
100
INTRODUCCIÓN.
Considerando las actuales demandas de la sociedad por productos y servicios procedentes del
bosque, Nothofagus alpina, constituye una fuente de diversificación en la producción forestal
nacional (Cabrera 2000, Gutiérrez 2003), ya que actualmente el 92% de la superficie plantada
corresponde Pinus spp. (Pino) y Eucalyptus spp. (Eucalipto) (INFOR 2009).
En la actualidad en Nothofagus se han obtenido importantes resultados de propagación
mediante micro o macroestacas (Santelices, 1993) entre las que se destacan las ventajas de las
técnicas de micropropagación, en la cual se pueden emplear diversos tipos de tejido vegetativo
o somático (Jordan et al., 1996; Martinez-Pastur y Arena, 1996; Castellanos et al., 2005; Sabja
et al, 2008).
Los procesos que ocurren durante el cultivo in vitro están ayudados por la exposición de los
tejidos a reguladores del crecimiento (auxinas y citoquininas principalmente) que permiten la
división y elongación celular (Margara, 1988; Azcon y Talón, 2000). Las diferentes rutas
morfogénicas utilizadas como sistema de propagación en cultivos de tejidos, suponen una
rápida sucesión de divisiones celulares, durante las cuales las microplantas en desarrollo están
sometidas a una amplia variedad de situaciones estresantes (Larkin y Scowcroft, 1981). Estas
condiciones con frecuencia afectan la estabilidad del genoma, con lo cual es posible obtener
variación de origen nuclear y/o citoplasmática, por lo tanto, encontrar individuos
fenotípicamente y/o genéticamente distintos a la planta madre (Smýkal et al., 2007), los cuales
podrían deberse a errores operacionales, aunque las causas más comunes de variación se
asocian a modificaciones en el ADN o cambios epigenéticos que podrían ser útiles en
programas específicos de mejora, pero en la clonación de individuos la variación de cualquier
tipo es indeseada (Phillips et al., 1994; Rani y Raina, 2000). Este fenómeno se denomina
101
“variación somaclonal” y se define como la variación fenotípica y genética entre plantas
propagadas clonalmente a partir de un clon donador simple (Larkin y Scowcroft, 1981;
Medina et al., 2007). Es importante aclarar que durante el cultivo in vitro, el material vegetal
sufre de cambios hormonales y morfológicos temporales (como aparición o desaparición de
raíces, callo, ramificaciones, morfología de la hoja, etc.), esto se debe al proceso de
rejuvenecimiento, promovido en muchos casos por reguladores de crecimiento, y no a causa
de variación somaclonal (Sánchez y Jiménez, 2009).
La variación somaclonal generalmente es espontánea y los cambios pueden ser heredables,
asociados a “rearreglos” cromosomales, delecciones y mutaciones (Larkin y scowcroft 1981,
Kaeppler et al. 2000, Anu et al. 2004, Sánchez y Jiménez, 2009) o variación somaclonal
asociada a factores epigenéticos que puede ser resultado de un cambio en la expresión de los
genes asociado a cambios en los patrones de metilación del ADN, que puede ser o no
reversible (Kaeppler et al. 2000, Jain 2001; Baránek et al. 2010)
En programas de mejoramiento genético, la variación somaclonal ha sido utilizada para
obtener características agronómicas deseables y heredables en una diversidad de especies
como por ejemplo ajo (Allium sativum L) (Al-Zahim et al. 1999), arroz (Oryza sativa)
(Araújo et al. 2004), chile dulce (Capsicum annuum) (Anu et al. 2004), palma aceitera (Elaeis
guineensis) (Tregear et al. 2002) y crisantemo (Chrysanthemum sp.) (Martín et al. 2002).
Otras variantes somaclonales han sido utilizadas comercialmente por sus características de
resistencia a enfermedades, mejora en la apariencia de la planta, flores y frutos, tamaño, sabor,
fragancia y presencia de metabolitos de interés. Tal es el ejemplo de variantes somaclonales de
fresa (Fragaria x ananassa), resistentes a antracnosis (Hammerschlag et al. 2006).
102
Sin embargo, durante la micropropagación y en bancos de germoplasma in vitro, donde es
necesario conservar la estabilidad del material vegetal y las características fenotipicas de la
especie, este tipo de variación es indeseable (Sánchez y Jiménez, 2009).
Es posible detectar variación somaclonal mediante la comparación de cambios fenotípicos
entre el material parental y en cual se produjo el cambio. Además en los últimos años los
marcadores moleculares utilizados en estudios de evolución genética, poblaciones, ecología,
mapeo genético, clonación de genes entre otras han sido una herramienta útil para detectar
variación somaclonal a nivel de ADN (Cassells y Curry 2001; Gupta y Roy, 2002, Martín et
al. 2002).
Un marcador molecular es cualquier fenotipo molecular oriundo de la expresión de un gen o
de segmentos específicos de ADN, que puede ser detectado y su herencia monitoreada. En un
cruzamiento genético, las características de interés seguirán generalmente unidas a los
marcadores moleculares. Por lo tanto, se pueden seleccionar individuos en los que el marcador
molecular esté presente (Semagn et al., 2006) También son utilizados para caracterizar la
variación somaclonal con gran precisión y en menos tiempo que los análisis fenotípicos
(Medina et al., 2007).
A pesar de su importancia ecológica y económica dentro de las especies nativas, hasta ahora
pocos estudios moleculares (Marchelli et al., 1998; Mattioni et al., 2002), filogenéticos (Hill y
Jordan, 1993; Manos, 1997; Setoguchi et al., 1997) y de variación genética entre poblaciones,
mediante isoenzimas (Marchelli y Gallo, 2000a, b) se han llevado a cabo en especies del
género Nothofagus. Marcadores como los RAPD (Amplificación aleatoria de fragmentos
polimórficos de DNA) e ISSR (Inter-microsatelites) han sido utilizados en la caracterización
de N. nervosa, N. obliqua y N. dombeyi, evaluando el grado de polimorfismo generado y la
103
detección de polimorfismos en el inter-loci, utilizando un cebador diseñado a partir de
dinucleótido o trinucleótidos de secuencia repetitiva (Mattioni et al., 2002).Sin embargo, no se
reportan estudios de su aplicación en detección de variación somaclonal en N. alpina , a pesar
de que si han sido utilizados en otras especies familiarizadas como Quercus robur (Wilhelm et
al., 2005) durante el proceso de embriogénesis somática.
Los RAPDs, polimorfismos derivados de amplificación aleatoria de PCR de sitios específicos
e identificables del ADN, han mostrado ser una herramienta efectiva para detectar variación
somaclonal en un gran número de especies (Hashmi et al., 1997; Santana et al., 1999;
Linacero et al., 2000), sin embargo, algunos estudios los han reportado como problemáticos y
poco claros en comparación con otros marcadores como los AFLPs (Polimorfismo de
Longitud de Fragmentos Amplificados), al momento de detectar variación somaclonal (Fourré
et al., 1997). Los AFLPs, permiten la identificación de un gran número de polimorfismos con
respecto a otras técnicas como los RFLPs (polimorfismos de longitud de fragmentos de
restricción) o los RAPDs (Gonzaga, 2004). Consisten en polimorfismos derivados de la
digestión de ADN genómico, ligación de pequeños oligonucleótidos a los extremos de corte y
amplificación utilizando iniciadores homólogos al adaptador. Es una técnica relativamente
fácil de ejecutar, es reproducible y utiliza pequeñas cantidades de ADN (Medina et al., 2007).
Numerosos estudios de AFLP se han llevado a cabo con la aplicación del protocolo publicado
por Vos et al, (1995), pero sin duda que varias modificaciones se han debido implementar
según la complejidad del genoma de la especie en estudio. Hasbún et al, (2011) plantea para
especies complejas en su genoma como Pinus radiata y entre ellas N. alpina la aplicación de
un protocolo de AFLP utilizando fluorescencia con el fin de lograr una alta reproducibilidad y
sensibilidad junto con detección de una amplia gama de fragmentos utilizando un
secuenciador capilar.
104
En síntesis el cultivo de tejidos in vitro, como proceso de producción de plantas conlleva una
serie de riesgos que implica encontrar a corto o largo plazo individuos fenotípicamente y/o
genéticamente distintos a la planta madre. Por lo tanto, antes que las diferentes rutas
morfogénicas puedan ser explotadas como sistemas de propagación masivos, es necesario
evaluar mediante el uso de marcadores, los regenerantes no fieles al genotipo previo a su
manifestación fenológica (Merkle y Dean, 2000; Botta et al., 2004).
En relación a lo expuesto anteriormente el objetivo de este estudio fue determinar estabilidad
genética o variación somaclonal en regenerantes de embriones somáticos y brotes adventicios
de N. alpina, obtenidos desde cultivos sucesivos, mediante la técnica molecular AFLP.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material Vegetal Embriogénico Se empleó material vegetal procedente de la línea embriogénica de N. alpina RaC-01 (raulí
explanto cotiledonar 01), inducida desde cotiledones aislados de semillas maduras, las cuales
fueron obtenidas a través de polinización controlada (Castellanos et al., 2005). Luego de la
inducción de callo embriogénico y manifestación de embriones somáticos, el cultivo se
dispuso en medio de mantención, consistente en la solución mineral y vitaminas Broadleaved
Tree Medium (BTM) (Chalupa 1983), más los reguladores del crecimiento 6-
bencilaminopurina (BAP) y ácido indolbutírico (AIB) a concentraciones de 0,1 mgL-1
suplementado con 30 gL-1 de sacarosa y 7,0 gL-1 de agar. Se practicaron subcultivos a medio
fresco cada 28 días, los subcultivos en medio nutritivo se alternaron conteniendo reguladores
del crecimiento y en medio base BTM, sin reguladores. Los explantos permanecieron en estas
últimas condiciones hasta el comienzo de los ensayos. El material de inicio para la extracción
105
de ADN consistió en masas pro-embriogénicas (MPE) sometidas a tratamientos de
maduración con presencia de embriones somáticos en estado cotiledonar. Para determinar si
existe variación somaclonal en los embriones somáticos, se denominó de manera arbitraria un
subcultivo 0 y un subcultivo 6 ambos pertenecientes al mismo clon donde se realizaron las
mediciones. En cada caso se extrajo ADN a 10 muestras con tres repeticiones por muestra.
Material Vegetal Organogénico El material organogénico se obtuvo desde yemas y hojas obtenidas de varetas forzadas a brotar
in vitro. La inducción y proliferación organogénica se realizó en medio de cultivo Broadleaved
Tree Medium (BTM) (Chalupa 1983) más los reguladores del crecimiento 1 mgL-1 6-
bencilaminopurina (BAP) y 0,1 mgL-1 ácido indolbutírico (AIB). Para la etapa de elongación
de los brotes se utilizó BTM con la adición de 0,1 mgL-1 BAP y 0.01 mgL-1 de AIB. Se
realizaron 6 subcultivos sucesivos a medio fresco cada 20 días, alternando un sub-cultivo para
proliferación de explantos; y un subcultivo para elongación de las plantas. Para determinar la
frecuencia de variación somaclonal en los brotes adventicios, se denominó de manera
arbitraria un subcultivo 0 y un subcultivo 6 ambos pertenecientes al mismo clon, donde se
realizaron las mediciones. En cada caso se extrajo ADN a 10 muestras con tres repeticiones
por muestra.
Extracción de ADN Se tomaron porciones de entre 100-120 mg de peso fresco del material embriogénico y
organogénico, que fueron homogenizados empleando el equipo de lisis celular (Precellys 24)
adicionándole microesferas de cerámica a una velocidad de vibración de 6000rpm durante
106
15s, posteriormente, se siguió el protocolo de extracción de DNeasy Plant Mini Kit
(QIAGEN®) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La calidad y concentración del
ADN obtenido fue medido por el espectrofotómetro ND-1000, Nanodrop®. La pureza de las
muestras se determinó a través de los índices de absorbancia OD260/280 y OD260/230, donde se
realizaron dos mediciones analíticas. La integridad del ADN fue medida mediante
electroforesis (cámara electroforesis Cole-Parmer, modelo Submarine Horizontal Gel System)
en gel de agarosa al 1% corrido durante 30min a 70V visualizado en un trasiluminador
Vilberlourmat (modelo Rainbow CCTV RMB92).
Analisis AFLPs.
La técnica de AFLP se desarrolló según el protocolo reportado por Hasbún et al. (2011),
utilizando fluoróforos adheridos a los partidores de la amplificación selectiva, con el fin de ser
separados por electroforesis capilar y reconocidos con un secuenciador automático.
La técnica consta de tres pasos: 1) Digestión- ligación: se realizó la digestión a 10 ng µL-1 de
ADN de N. alpina con las enzimas EcoRI y MseI, posteriormente se ligó el producto de la
digestión con adaptadores de doble cadena, específicos para cada enzima, 2) Amplificación
preselectiva: con el producto del paso anterior se realizó una reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) utilizando partidores del tipo EcoRI +0 y MseI +0, 3) Amplificación
selectiva: se probaron 16 combinaciones de partidores selectivos del tipo EcoRI+2 o +3 /
MseI+2 o +3 marcados con fluoróforos.
Para realizar el análisis genético de todos los individuos, se procedió primero a elegir las
combinaciones más informativas (Tabla 4.1). Esta selección se realizó según los siguientes
107
criterios; capacidad de amplificación, cantidad de fragmentos polimórficos (entre 50 y 500 pb)
y nitidez de banda. El producto de amplificación fue visualizado en un gel de agarosa al 1 %
(p/v) con 2 µL de bromuro de etidio, posteriormente se realizó la electroforesis capilar con el
secuenciador automático ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer.
Tabla 4.1. Partidores selectivos de AFLPS ensayados en N. alpina
EcoRI MseI CC / CC
CC / CAG
CC / CCA
CC / CCC
CC / CCG
TC / CCG
Análisis de datos.
Los datos fueron analizados utilizando el software GeneMapper v4.0 con el cual se
confeccionó una matriz binaria (1/0) representando la presencia o ausencia del fragmento. Para
esto, se realizó un análisis de varianza molecular (AMOVA) con dos criterios de
jerarquización de los grupos de poblaciones, a priori y a posteriori.
Para el análisis se utilizó el programa GenAlex v. 6.4 (Peakall y Smouse 2006) se realizó una
matriz de distancia genética, que fue utilizada para el análisis de varianza molecular
(AMOVA) entre los subcultivos del material embriogénico y organogénico, realizado según el
método de Michalakis y Excoffier (1996). El análisis AMOVA se realizó con los datos
binarios de todas las combinaciones, mediante permutaciones al azar y significancia de 95%.
A partir del análisis AMOVA se estimó la proporción de varianza atribuida entre y dentro de
108
las muestras; y se realizó el test de significancia de FST entre los tejidos (Michalakis y
Excoffier 1996). Para visualizar el patrón de diferenciación de los tejidos, se construyó un
Análisis de Coordenadas Principales (PCA) a partir de la matriz de distancia usando GenAlex
6.4, basado en el algoritmo de Orloci (1978).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Extracción de ADN El ADN obtenido del material vegetal en estudio poseía la calidad y concentración de ADN
requerida para el procedimiento de AFLP (Tabla 4.2). No obstante, en algunas muestras el
índice de absorbancia 260/230 se encontró fuera de rango óptimo (NanoDrop Technologies
2007). Esto probablemente se debió a la presencia de restos de azúcares en las muestras o
presencia de compuestos aromáticos que afectan la extracción de ADN en muchas especies
(Kundu et al. 2011). La pureza del ADN inicial es clave para la técnica de los AFLP
(Pompanon et al. 2005; Benjak et al. 2006), ya que sólo así se garantiza la completa digestión
por parte de las enzimas de restricción. De lo contrario, la amplificación podría generar
polimorfismo falso (Vos et al. 1995).
Tabla 4.2. Calidad y concentración promedio de ADN de material embriogénico y
organogénico de N. alpina.
Subcultivo Embriones somáticos Brotes adventicios
[ng µL-1] A260/A280 A260/A230 [ ng µL-1] A260/A280 A260/A230
S0 16,1 2,01 2,69 41,2 1,74 1,40
S6 35,7 1,80 1,70 28,1 1.88 1,63
Análisis de AFLP. AFLP es conocida por su aplicabilidad universalidad (no requiere oligonucleótidos específicos
para cada especie), posee una alta reproducibilidad y poder discriminativo entre y dentro
109
especies (Hasbún et al. 2011). Ha demostrado en un gran número de especies ser una
herramienta muy eficaz para la caracterización de variación somaclonal o validación de
fidelidad genética (Gagliardi et al, 2007; Mehta et al, 2011). En el presente estudio de un total
de 288 fragmentos amplificados para el tejido embriogénico, el 2,1 % fue polimórfico para el
subcultivo 0 y un 9,8 % polimórfico para el subcultivo 6, generando un 97,9 % y 90, 2% de
fragmentos monomórficos respectivamente. El en caso de los brotes adventicios se obtuvo un
total de 334 fragmentos amplificados, de los cuales el 8,3% fue polimórfico para el subcultivo
0 y un 21,2% polimórfico para el subcultivo 6, generando un 91,7 % y 78,8% de fragmentos
monomórficos respectivamente. El número de fragmentos detectados por combinación de
partidores osciló entre 26 (E-CC/M-CCG) a 98 (E-CC/M-CC) en ambos tejidos estudiados
(Tabla 4.3). En promedio se registro una frecuencia de polimorfismo en tejido embriogénico
de 5,2 % y en tejido organogénico de 14,8%.
Tabla 4.3: Número de bandas y grado de polimorfismo revelado por las combinaciones de AFLP
para embriones somáticos y brotes adventicios de N. alpina.
Embriones somáticos Brotes adventicios
Partidores Subcultivo 0 Subcultivo 6 Subcultivo 0 Subcultivo 6
EcoRI MseI Total Fragmentos / Bandas
polimórficas
Total Fragmentos / Bandas
polimórficas
E-CC M-CAG 34 (2) 34 (3) 40 (0) 40 (7)
E-CC M-CCA 51(4) 51(8) 60 (5) 60 (13)
E-CC M-CCC 45(0) 45(9) 54(4) 54 (6)
E-CC M-CCG 26(0) 26(3) 38 (9) 38 (18)
E-CC M-CC 92(0) 92(0) 98 (1) 98 (12)
E-TC M-CCG 40(0) 40(10) 44 (9) 44 (15)
Número de bandas 288 (6) 288 (33) 334 (28) 334(71)
110
total
Porcentaje de
polimorfismo
2,1% 9,8% 8,3 % 21,2 %
Los resultados referentes a variación somaclonal en embriones somáticos de raulí en este
estudio alcanzaron un 3% de variación somaclonal al ser comparados entre subcultivo (S0 vs
S6) con un valor- p no significativo (P=0,080) como se presenta en la Tabla 4.4. En cambio,
la variación obtenida entre los subcultivos de los brotes adventicios alcanzo el 19% con un
valor-p significativo (p=0,000).
Tabla 4.4: Análisis de varianza molecular (AMOVA) para embriones somáticos y brotes adventicios de N. alpina según dos niveles jerárquicos: entre subcultivos y dentro del subcultivo.
Fuente de
variación
Embriones somáticos Brotes adventicios
gl SC Variación gl SC Variación
Entre subcultivo 1 1,464 3% 1 10,839 19%
Dentro del
subcultivo 40 35,464 97% 40 84,684 81%
Total 41 36,929 100% 41 95,524 100%
PhiPT o FST 0,034 0,187
Valor- p 0,080 0,000
gl: grados de libertad; SC: suma de cuadrados; V: varianción somaclonal.; valor-p: nivel de significancia.
La ocurrencia de variación somaclonal en los procesos morfogénicos estudiados, se determinó
por comparación de los perfiles moleculares de los subcultivos propagados en forma
convencional, de tal modo que la presencia o ausencia de productos de amplificación
diferentes puede considerarse como una alteración inducida por el cultivo de tejidos, sumado a
los errores de la técnica (Sánchez y Jimenez. 2009).
111
Los resultados del Análisis de Componentes Principales (PCA) mostraron que los dos
primeros componentes para la variable embriones somáticos (Figura 4.1A) fueron
capaces de recoger el 76,6% de la varianza. Dentro del 3% de variación somaclonal
obtenida en los embriones somáticos el 59, 7% estaría explicado por la diferencia que se
produce entre los subcultivos y un 16, 9 % se explicaría por la variación presente dentro
del subcultivo. En el caso de los brotes adventicios dentro del 19 % de variación
somaclonal obtenido las dos componentes principales abarcan el 50,1% de variabilidad,
por lo cual se produce un 30,4% de variación entre los subcultivos y un 19,9% dentro del
subcultivo. En síntesis la vía organogénica entrega mayor variabilidad en comparación
con los embriones somáticos, ya sea entre subcultivo o dentro de este. Esto se refleja en
la dispersión de los datos graficados y puntos atípicos (5-22) presentados en la Figura
4.1B
Figura 4.1. Análisis de Componentes Principales (PCA) representando la variación encontrada entre los subcultivos S0: Subcultivo cero y S6: Subcultivo 6 para embriones somáticos (A) y brotes adventicios (B). Si bien no existen reportes a la fecha de estudios moleculares referentes a variación
somaclonal en raulí. En otras especies la literatura reporta información variada respecto a los
resultados obtenidos en variación somaclonal. En Hevea brasiliensis (Medina et al. 2007) y
Saccharum officinarum (Perera et al. 2010) se reporta variación genéticas en sus líneas
112
estudiadas tanto para sistemas embriogénicos como organogénicos. En cambio en especies
como Quercuas suber (Homero et al. 2001), Bactris gasipaes (Steinmacher et al. 2007),
Arachis retusa (Gagliardi et al, 2007), Secale cereale (Puente et al. 2008) y Bambusa nutans
(Metha et al. 2011), se demostró su estabilidad genética en el tiempo.
Hasta el momento, a pesar de existir variación somaclonal en la línea organogénica de material
adulto de N. alpina, no se presentan alteraciones fenotípicas visibles. Sánchez y Jiménez,
(2009) plantean que además de la tasa normal de variación, propia de las células vegetales en
condiciones normales, formando parte de un tejido en un órgano, hay factores externos,
propios del cultivo in vitro, como medio de cultivo, patrón de desarrollo, edad y número de
subcultivo, entre otros que pueden inducir a la acumulación de variaciones genéticas como por
ejemplo inserción o deleción de un nucleótido, mutaciones puntuales, metilación del ADN etc
(Kaepple et al, 2000), y se pueden manifestar o no, en el fenotipo. La variación significativa
obtenida en el clon de brotes adventivios puede estar directamente relacionada con las
condiciones de cultivo, ya que es una línea que se encuentra en la fase más activa de
proliferación y acumulación de reguladores del crecimiento, principalmente BAP. En
comparación con los embriones somáticos que ya constituye una línea de 6 años de cultivo por
lo cual puede haber alcanzado un grado de adaptabilidad al medio.
CONCLUSIONES
La técnica de marcadores moleculares AFLP permitió obtener productos de amplificación en
la totalidad de las muestras, con 6 combinaciones de partidores utilizados. Los perfiles
moleculares obtenidos posibilitaron caracterizar y diferenciar entre el subcultivo y dentro del
subcultivo, tanto para embriones somáticos como brotes adventicios. Esta información permite
concluir que la línea embriogénica es más estable en comparación con la organogénica, ya que
113
presenta una variación somaclonal despreciable y propia del cultivo. En cambio la vía
organogénica presenta una variación somaclonal significativa, aunque sin anormalidades
visibles en cultivo.
.LITERATURA CITADA
Al-Zahim, M. A. Ford-Lloyd, B. V. Newbury, H. J. 1999. Detection of somaclonal variation in
garlic (Allium sativum L.) using RAPD and cytological analysis. Plant Cell Reports: 18:
473–477
Anu, A. Babu, K.N. Peter. K.V. 2004. Variations among somaclones and its seedling progeny
in Capsicum annuum. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 76: 261–267.
Araujo, L. G. Prabhu, A. Pereira, P.A. 2004. RAPD marker linked to a gene conferring
resistance to race IB-9 of Pyricularia grisea in a somaclone of the rice cultivar Araguaia.
Plant Cell, Tissue and Organ Culture 78: 151–158.
Azcón-Bieto J. y M. Talón. 2000. Fundamentos de Fisiología Vegetal (Ed)
McGrawHill/Interamericana. Barcelona. España.
Baránek, M. Bretislav, K. Ondrusíková, E. Pidra, M. 2010. DNA-methylation changes in
grapevine somaclones following in vitro culture and thermotherapy. Plant Cell Tiss Organ
Cult. 101:11–22. DOI 10.1007/s11240-009-9656-1.
Benjak A, J Konradi, R Blaich, A Forneck. 2006. Different DNA extraction methods can cause different AFLP profiles in grapevine (Vitis vinifera L.). Vitis 45(1): 15-21.
Botta, R. Marinoni, D. y G. Bounous. 2004. Molecular marker and certification. In: R.
Kellison, S. Mccord y K. Gatland (Eds). Proceedings of the Forestry Biotechnology
Workshop, Global Biotechnological Forum. 2-5 March, 2004, Concepción, Chile. pp. 63-72.
Cabrera, J. 2000. Importancia económica de los bosques de Nothofagus alpina y Nothofagus
obliqua. In Domesticación y mejora genética de Raulí y Roble. R. Ipinza, B. Gutiérrez y V.
Emhart (eds). Instituto Forestal, Universidad Austral de Chile. pp. 11-23.
114
Cassells, A.C. Curry, R. F. 2001. Oxidative stress and physiological, epigenetic and genetic
variability in plant tissue culture: implications for micropropagators and genetic engineers.
Plant Cell, Tissue and Organ Culture 64: 145–157.
Castellanos, H; M. Sánchez-Olate y D. Ríos. 2005. Embriogénesis somática como alternativa
potencial para la regeneración in vitro del género Nothofagus. pp: 59-74. In: Gutiérrez B.,
O. Ortiz, y M. P. Molina (Eds). Clonación de Raulí. Estado Actual y Perspectivas. INFOR
CEFOR UACH.
Fourré, J.L; P. Berger; L. Niquet and P. André. 1997. Somatic embryogenesis and somaclonal
variation in Norway spruce: morphogenetic, cytogenetic and molecular approaches,
Theoretical and Applied Genetics. 94: 159 169.
Gagliardi RF, Hanai LR, Pacheco G, Oliveira CA, Carneiro LA, Valls JFM, Mansur E, Vieira
MLC 2007. Assessment of genetic stability among in vitro plants of Arachis retusa using
RAPD and AFLP markers for germplasm preservation. J of Integ Plant Biol. 49:307–312.
Gonzaga, L. 2004. Marcadores moleculares AFLP de plantas donadoras de aliso Alnus
acuminata H.B.K. Scientia et Technica. 25:285-289.
Gupta, P. K. Roy, J. K. 2002. Molecular markers in crop improvement: Present status and
future needs in India. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 70: 229–234.
Gutiérrez, B. 2003. Mejoramiento genético y Conservación de recursos forestales nativos en
Chile. Investigación agraria: Sistemas y recursos forestales 12: 145-153.
Hammerschlag, F. Garcés, S. Koch-Dean, M. Ray, S. Lewers, K. Maas, J. Smith, B.J. 2006. In
vitro response of strawberry cultivars and regenerants to Colletotrichum acutatum. Plant
Cell, Tissue and Organ Culture. 84: 255–261.
115
Hasbún, R. Iturra, C. Moraga, P. Wachtendorff, P. Quiroga, P. Valenzuela, S. 2011. An
efficient and reproducible protocol for production of AFLP markers in tree genomes using
fluorescent capillary detection. Tree Genetics & Genomes. DOI 10.1007/s11295-011-0463-
6.
Hashmi G; R. Huettel; R. Meyer; L. Krusberg and F. Hammerschlag.1997. RAPD analysis of
somaclonal variants derived from embryo callus culture of peach, Plant Cell Rep. 16: 624-
627.
Hill, RS, and GJ, Jordan. 1993. The evolutionary history of Nothofagus (Nothofagaceae). Aust
Syst Bot 6:111–12.
Hormero, J. Martínez, I. Celestino, C. Gallego, FJ. Torres,V†. Toribio. M. 2001. Early
Checking of Genetic Stability of Cork Oak Somatic Embryos by AFLP Analysis.
International Journal of Plant Sciences, Vol. 162, No. 4:, pp. 827-833.
Instituto Forestal (INFOR). 2009. Superficie de bosques plantados por especie. Centro de
información forestal, Sede Metropolitana, Chile.
Jain, SM. 2001. Tissue culture-derived variation in crop improvement. Euphytica 118: 153–
166.
Jordan, M.; Velozo, J. y A. M. Sabja. 1996. Organogénesis in vitro of Nothofagus alpina (P. et
E.) Oerst. Fagaceae. Plant Cell Reports. 15 (10): 795-798.
Kaeppler, SM; Kaeppler, HF; Rhee, Y. 2000. Epigenetic aspects of somaclonal variation in
plants. Plant molecular Bi-ology 43: 179–188.
Kundu, A. Sarkar, D. Bhattacharjee, A. Topdar, N. Kumar, M. S. Sinha, B. M. 2011. A simple
ethanol wash of the tissue homogenates recovers high-quality genomic DNA from
Corchorus species characterized by highly acidic and proteinaceous mucilages. Electronic
Journal of Biotechnology ISSN: 0717-3458.
Larkin, PJ and WR, Scowcroft 1981. Somaclonal variation a novel source of variability from
cell cultures for plant improvement. Theor Appl Genet 60:443–455.
116
Linacero, R; E, Freitas Alves y A.M. Vázquez. 2000. Hot spots of DNA instability revealed
through the study of somaclonal variation in rye. Theoretical and Applied Genetics. 100:506-
511.
Manos, PS. 1997. Systematics of Nothofagus (Nothofagaceae) based on rDNA spacer
sequences (ITS): taxonomic congruence with morphology and plastid sequence. Am J Bot
84:1137–1155.
Marchelli P; L, Gallo; F, Scholz and B, Ziegenhagen.1998. Chloroplast DNA markers reveal a
geographical divide across the Argentinean southern beech Nothofagus nervosa (Phil.) Dim
et Mill. distribution area. Theor Appl Genet 97:642–646.
Marchelli, P and L.A. Gallo. 2000a. Genetic analysis of isozyme variants in open-pollinated
families of Southern beech Nothofagus nervosa (Phil.) Dim. et Mill. Silvae Genet, 4:90–98.
Marchelli, P y L.A. Gallo. 2000b. Variación aloenzimática, de ADN de cloroplasto y de ADN
nuclear en poblaciones y progenies de raulí en Argentina. En: Ipinza Carmona R, Gutiérrez
Caro B, Emhart Schmidt V (eds) Domesticación y Mejora Genética de raulí y roble,
Universidad Austral de Chile-Instituto Forestal. Valdivia, Chile, pp 157–180
Margara, J. 1988. Multiplicación vegetativa y cultivo in Vitro. Ediciones Mundi-Prensa.
Madrid. España.
Martín, M. Uberhuaga, E. Pérez, C. 2002. Application of RAPD markers in the
characterisation of Chrysanthemum varieties and the assessment of somaclonal variation.
Euphytica 127: 247–253.
Martínez-Pastur, G. and M. Arena. 1996. In vitro propagation of Nothofagus nervosa (Phil.)
Dim. et Mil. Phyton. 58 (1/2): 1-7.
117
Mattioni, C; M, Casasoli; M, Gonzalez; R, Ipinza and F. Villani. 2002. Comparison of ISSR
and RAPD markers to characterize three Chilean Nothofagus species. Theor Appl Genet
104:1064–1070.
Medina, C; I, García; M, Caro y F, Aristizábal. 2007. Análisis AFLP de variación somaclonal
en embriones somáticos de Hevea brasiliensis. Rev. Col. Cienc. Quím. Farm. Vol. 36 (1),
70-80.
Merkle S.A. and J.F.D. Dean 2000. Forest tree biotechnology. Current Opinion Biotech 11,
298-302.
Mehta, R. Sharma, V. S. Anil, S. M. Kumar, R.S. 2011. Induction of somatic embryogenesis
and analysis of genetic fidelity of in vitro-derived plantlets of Bambusa nutans Wall., using
AFLP markers. Eur J Forest Res 130:729–736.
Michalakis, Y. y L. Excoffier. 1996. A generic estimation of population subdivision using
distances between alleles with special reference for microsatellite loci. Genetics 142: 1061-
1064
NanoDrop Technologies, Inc. 2007. 260/280 and 260/230 Ratios NanoDrop® ND-1000 and
ND-8000 8-Sample Spectrophotometers. Technical Support Bulletin, Wilmington, Delaware
USA.
Orloci, L. 1978. Multivariate analysis in vegetation research. The Hague: Dr W. Junk B. V.
276 p.
Peakall, R. y P.E. Smouse. 2006. GENALEX 6: Genetic analysis in Excel. Population genetic
software for teaching and research. Molecular Ecology Notes 6: 288-295.
118
Perera, M. F. García, M. Noguera, A. Sepúlveda, M. Filippone, M.P. Castagnaro, A.2010.
Evaluación de la variación somaclonal en vitroplantas de caña de azúcar mediante
marcadores moleculares. Rev. Ind. y Agríc. de Tucumán. Tomo 87 (2): 13-21;
Phillips, R; S, Keppler and P, Olhoft. 1994. Genetic variability of plant tisúes cultures:
Breakdown of normal controls. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :5222- 5226.
Pompanon F, A Bonin, E Bellemain, P Taberlet. 2005. Genotyping errors: causes, consequences and solutions. Nature Reviews Genetics 6: 847-846.
Puente, R. González, A. Ruiz, M.L. Polanco, C.2008. Somaclonal variation in rye (Secale
cereale L.) analyzed using polymorphic and sequenced AFLP markers. In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant. 44:419–426
Rani, V. and S, Raina. 2000. Genetic fidelity of organized meristem-derived micropropagated
plants: A critical reappraisal. In vitro Cell. Dev. Biol., Plant 36:319-330.
Sabja, A.M, O. Ortiz y C. Triviño. 2008. Avances de clonación in vitro de árboles adultos de
Raulí (Nothofagus alpina poepp. et endl.) oerst.) para propagación comercial. Agrociencia.
42: 595-603.
Sánchez, N. C. Jimenez, V. 2009. Técnicas moleculares para la detección de variantes
somaclonales. Agronomía mesoamericana 20(1): 135-151. Issn: 1021-7444.
Santana, C; Oliveira, C. and T, Valdivieso. 1999. Molecular typing of rootstock hybrids
(Castanea sativa x Castanea crenata) and Portuguese Castanea sativa cultivars based on
RAPD markers. Acta Hort. 494:295-301.
Satelices, R. 1993. Propagación vegetativa de Raulí, Roble y Coigue a partir de estacas.
Ciencia e investigación forestal. INFOR. Volumen 7- Número 1.
Semagn, K; Bjørnstad, Å and M. N. Ndjiondjop. 2006. An overview of molecular marker
methods for plants. African Journal of Biotechnology Vol. 5 (25): 2540-2568.
119
Smýkal, P; L. Valledor; R. Rodrıíguez and M, Griga. 2007. Assessment of genetic and
epigenetic stability in long-term in vitro shoot culture of pea (Pisum sativum L.). Plant Cell
Rep 26:1985–1998.
Setoguchi H; M, Ono; Y Doi; H, Koyama and M, Tsuda 1997. Molecular phylogeny of
Nothofagus (Nothofagaceae) based on the atpB-rbcL intergenic-spacer of chloroplast DNA. J
Plant Res 110: 469–484.
Steinmacher†, D. Krohn ,N.M. Dantas, A.C. Stefenon, M.V. Clement‡, C.R. Guerra, M.P.
2007. Somatic Embryogenesis in Peach Palm Using the Thin Cell Layer echnique: Induction,
Morpho-histological Aspects and AFLP Analysis of Somaclonal Variation. Annals of Botany
100: 699–709.
Tregear, JW; Morcillo, F; Richaud, F; Berger, A. Singh, R. Cheah, SC.; Hartmann, C. Rival,
A.; Duval, Y. 2002. Characterization of a defensin gene expressed in oil palm inflorescences:
induction during tissue culture and possible association with epigenetic somaclonal variation
events. Journal of experimental Botany 53: 1381–1396.
Vos, P. Hogers, R. Bleeker, M. Reijans, M., Van de Lee T, Hornes M, Frijters A, Pot J,
Peleman J, Kuiper M, Zabeau M.1995. AFLP a new technique for DNA fingerprinting.
Nucleic Acids Res. 23:4407–4414.
Wilhelm, E; Hristoforoglu, K; Fluch, S. and K. Buró, 2005. Detection of microsatellite
instability during somatic embriogénesis of oak (Quercus robur L.). Plant Cel. Rep. 23:790-
795.
120
DISCUSION GENERAL
Los estudios existentes a la fecha, referentes a técnicas de propagación en raulí con fines
productivos, se han basado en el establecimiento de áreas productoras y huertos semilleros
clonales para la producción de plantas por vía generativa (Emhart et al., 2000),
macropropagación, a través del enraizamiento de estacas (Santelices, 1993) y
micropropagación mediante organogénesis in vitro, induciendo la formación de brotes
adventicios, multiplicación y posterior enraizamiento de los microtallos juveniles (Jordán et
al., 1996; Martínez-Pastur et al., 2003; Sánchez-Olate et al. 2004), y adultos (Sabja et al.,
2008). Considerando las actuales demandas de la sociedad por productos y servicios
procedentes del bosque, Nothofagus alpina, constituye una fuente de diversificación en la
producción forestal nacional (Cabrera 2000; Gutiérrez 2003), ya que actualmente el 92% de la
superficie plantada corresponde Pinus spp. (Pino) y Eucalyptus spp. (Eucalipto) (INFOR
2009).
Estos aspectos motivaron gran parte del trabajo desarrollado en esta Tesis, en la que se planteó
como objetivo fundamental la propagación y validación de las rutas morfogénicas obtenidas
desde material embrionario y adultos de N. alpina, a través de análisis hormonales,
histológicos y genéticos, con el fin de obtener plantas con fidelidad clonal. Los resultados
obtenidos aportan información valiosa para en el futuro generar o dinamizar el desarrollo
sostenible del raulí en Chile. Conjuntamente desde el punto de vista teórico se obtuvieron
importantes conclusiones relacionadas con la propagación y revigorización de material adulto.
El relación al proceso de embriogénesis somática estudiado a nivel histológico y hormonal, y
comparado con el proceso cigótico muestra numerosas similitudes no tan solo en la especie,
sino que con otras especies relacionadas (Corredoira et al. 2003; Robichaud et al. 2004;
121
Prewein et al. 2004), los resultados obtenidos en las fases de maduración, germinación y
conversión a planta, mostraron cómo mediante la modificación de las condiciones de cultivo,
especialmente en lo referente a la aplicación de reguladores exógenos como ABA y
exposición de las MPE a bajas temperaturas (4°C), fue posible, lograr la proliferación
sostenida de embriones somáticos e incorporar nuevos criterios de germinación con el fin de
mejorar los niveles de germinación como se ha desarrollado en otras especies (Pullman et al.
2003;Vahdati et al. 2008), mostrando parámetros de desarrollo normales e incluso el proceso
de conversión a planta bajo condiciones in vitro.
Adicionalmente, la similitud entre Es y Ec de N. alpina permite avanzar hacia la
automatización del proceso de ES y la encapsulación de embriones somáticos de raulí (Cartes
et al. 2009) o conseguir la complementación de esta técnica de propagación con un sistema de
transformación genética y realizar mejoramiento genético forestal, mediante la transferencia
de caracteres específicos a genotipos seleccionados, sin afectar la riqueza genética de la
especie, como se ha conseguido con éxito en Quercus suber, (Álvarez et al. 2004). No
obstante, antes de considerar a gran escala la aplicación de esta tecnología, es necesario seguir
trabajando para comprender el proceso de desarrollo que conduce a la producción de
embriones somáticos sincrónicos y optimizar el proceso de conversión a planta.
En cuanto a la edad del explanto inicial en este estudio se ha demostrado la posibilidad de
multiplicar in vitro y producir plantas a partir de tejidos juveniles y adultos de raulí, esto es
importante ya que en determinados esquemas de producción y mejora, se requiere retener la
memoria fisiológica del tejido de procedencia. (Gallo et al. 2006). Sin embargo, no es
suficiente con lograr un protocolo de propagación exitosos, es necesario evaluar las posibles
variaciones que se puedan presentar durante y posterior al cultivo in vitro que se desarrolla.
122
Detectar variación somaclonal mediante la comparación de cambios fenotípicos o moleculares
entre el material parental y en cual se produjo el cambio es necesario hoy en día en todo
esquema de propagación clonal (Sánchez y Jimenez. 2009). Además en los últimos años los
marcadores moleculares utilizados en estudios de evolución genética, poblaciones, ecología,
mapeo genético, clonación de genes entre otras han sido una herramienta útil para homologar
en el cultivo in vitro (Cassells y Curry 2001; Gupta y Roy, 2002, Martín et al. 2002). Esto
queda demostrado en este estudio que se puedo determinar el porcentaje de variación
somaclonal obtenida desde regenerantes de un clon embriogénico y otro organogénico
mediante la técnica de AFLP y generar una aproximación valida de certificación genética para
la especie.
La importancia de los resultados obtenidos en esta investigación, radica en generar los
antecedentes de un nuevo modelo de propagación en la especie Nothofagus alpina, ésta vez
por medio de embriogénesis somática de material selecto o propagación de material vegetal
adulto de de características fenotípicas conocidas generando una nueva ventana en la
propagación de una especie leñosa de interés forestal. Producto de lo anterior, queda
establecida la factibilidad técnica de su empleo futuro como una alternativa de masificación de
clones selectos, mediante su certificación con marcadores moleculares, incorporando a la
especie dentro del marco de un programa de mejoramiento genético y del mismo modo, su
empleo como modelo experimental en la investigación científica de procesos de diferenciación
celular en plantas.
123
LITERATURA CITADA
Álvarez, R.; Alonso, P.; Cortizo, M.; Celestino, C.; Hernández, I.; Toribio, M. y Ordás, R. J.
2004. Genetic transformation of selected mature cork oak (Quercus suber L.) trees. Plant
Cell Reports. 23: 218–223.
Cabrera, J. 2000. Importancia económica de los bosques de Nothofagus alpina y Nothofagus
obliqua. In Domesticación y mejora genética de Raulí y Roble. R. Ipinza, B. Gutiérrez y V.
Emhart (eds). Instituto Forestal, Universidad Austral de Chile. pp. 11-23.
Cartes P, Castellanos, H. Ríos D, Sáez K, Spierccolli, S. Sánchez Olate, M. 2009.
Encapsulated somatic embryos and zygotic embryos for obtaining artificial seeds of Rauli-
Beech (Nothofagus alpina (Poepp. & Endl.) Oerst. Chilean journal of agricultural research
69(1):112-118.
Cassells, A.C. Curry, R. F. 2001. Oxidative stress and physiological, epigenetic and genetic
variability in plant tissue culture: implications for micropropagators and genetic engineers.
Plant Cell, Tissue and Organ Culture 64: 145–157.
Corredoira, E; Ballester, A. y Vieitez, A. M. 2003. Proliferation, maturation and germination
of Castanea sativa Mill. somatic embryos originated from leaf explants. Annals of
Botany. 92: 1-8.
Emhart, V.; Gutiérrez, B.; Ipinza, R.; Bello, A.; Navarrete, M. y Clasing, G. 2000.
Establecimiento de huertos semilleros de Nothofagus (pp: 283-295). En: Ipinza, R.;
Gutiérrez, B. y Emhart, V. (eds.). Domesticación y mejora genética de raulí y roble.
Universidad Austral de Chile, Instituto Forestal. Valdivia. Chile. 468 páginas.
Gallo, L. Marchelli, P. Azpilicueta, M. Crego, P. 2006. El uso de marcadores genéticos en el
género Nothofagus con especial referencia a raulí y roble. Bosque. 27(1): 3-15.
124
Gupta, P. K. Roy, J. K. 2002. Molecular markers in crop improvement: Present status and
future needs in India. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 70: 229–234.
Gutiérrez, B. 2003. Mejoramiento genético y Conservación de recursos forestales nativos en
Chile. Investigación agraria: Sistemas y recursos forestales 12: 145-153.
Instituto Forestal (INFOR). 2009. Superficie de bosques plantados por especie. Centro de
información forestal, Sede Metropolitana, Chile.
Jordan, M.; Velozo, J. y A. M. Sabja. 1996. Organogénesis in vitro of Nothofagus alpina (P. et
E.) Oerst. Fagaceae. Plant Cell Reports. 15 (10): 795-798.
Martín, M. Uberhuaga, E. Pérez, C. 2002. Application of RAPD markers in the
characterisation of Chrysanthemum varieties and the assessment of somaclonal variation.
Euphytica 127: 247–253.
Martínez-Pastur, G. Arena, M. Curvetto, N. Zappacosta, D. Eliasco, E. 2003. Successive media to improve the in vitro rhizogenesis of Nothofagus nervosa (Phil.) Dim. et Mil. New Forests 26: 201–215.
Prewein, C.; Vagner, M. y Wilhelm, E. 2004. Changes in water status and proline and abscisic
acid concentrations in developing somatic embryos of pedunculate oak (Quercus robur)
during maturation and germination. Tree Physiology. 24: 1251-1257.
Pullman, G.S. Johnson, S. Peter, G. Cairney, J.·Xu, N. 2003 Improving loblolly pine somatic
embryo maturation:comparison of somatic and zygotic embryo morphology, germination,
and gene expression. Plant Cell Rep 21:747–758.
Sabja, A.M, O. Ortiz y C. Triviño. 2008. Avances de clonación in vitro de árboles adultos de
Raulí (Nothofagus alpina poepp. et endl.) oerst.) para propagación comercial. Agrociencia.
42: 595-603.
125
Sánchez, N. C. Jimenez, V. 2009. Técnicas moleculares para la detección de variantes
somaclonales. Agronomía mesoamericana 20(1): 135-151. Issn: 1021-7444.
Sánchez-Olate, M.; Ríos, D.; Pedraza, M.; Pereira, G.; Castellanos, H. y Escobar, R. 2004. Propagación in vitro de Nothofagus procera ((Poepp. et Endl.) Oerst.) a partir de embriones aislados. Bosque: 25 (1): 123-128.
Satelices, R. 1993. Propagación vegetativa de Raulí, Roble y Coigue a partir de estacas.
Ciencia e investigación forestal. INFOR. Volumen 7- Número 1.
Vahdati K, Bayat S, Ebrahimzadeh H, Jariteh M, Mirmasoumi M. (2008). Effect of exogenous
ABA on somatic embryo maturation and germination in Persian walnut (Juglans regia
L.). Plant Cell Tiss Organ Cult. 93:163–171.
126
CONCLUSIONES.
• En relación al efecto de ABA exógeno sobre la maduración de embriones somáticos de
Nothofagus alpina.
La exposición a bajas temperaturas de los embriones somáticos y la aplicación de ABA
exógeno al medio de cultivo tiene un efecto positivo sobre el control de la embriogénesis
somática secundaria y germinación precoz de los embriones somáticos, reduciendo su
incidencia y permitiendo mejorar los niveles de conversión a planta de los embriones
somáticos. A su vez, los embriones cigóticos maduros presentan niveles endógenos de ABA
significativamente mayor en comparación con los embriones somáticos en estado cotiledonar
y sometidos a las diferentes concentraciones de ABA exógeno, lo cual explica la brecha en
conversión a planta que todavía existe entre embriones somáticos y cigóticos.
• En relación a la revigorización de material adulto y establecer metodologías de cultivo
in vitro de Nothofagus alpina.
La revigorización de material vegetal adulto a partir de yemas es una alternativa válida de
propagación para genotipos seleccionados de N. alpina, independiente de la edad ontogénica.
Mediante la presencia de BAP en el medio de cultivo se obtuvo organogénesis adventicia
corroborada por los análisis histológicos, que permitió establecer cadenas proliferativas y dar
viabilidad al proceso de propagación in vitro en las fases de proliferación, elongación caulinar y
enraizamiento, etapas claves en el proceso de propagación vía organogénesis in vitro.
127
• En relación a la caracterización histológica de los estados embriogénicos y respuestas
morfogénicas de Nothofagus alpina.
A pesar de no existir reportes acerca de la morfohistología de embriones somáticos en N.
alpina, este estudio permitió validar el proceso morfogénico de embriogénesis somática
conducentes a la micropropagación de la especie, mediante las similitudes encontradas en el
proceso embriogénico entre los homólogos cigóticos de N .alpina y de otras especies
relacionadas. Además se logro la diferenciación de los tipos celulares con capacidad
embriogénica y no embriogénica. Por otro lado, la secuencia histológica de brotes adventicios
permitió corroborar el proceso de regeneración in vitro en N. alpina vía organogénesis indirecta,
evidenciado a través de la formación de domos meristemáticos y conexión al tejido materno
(callo).
• En relación a evaluar posibles variaciones somaclonales de las líneas morfogénicas en
Nothofagus alpina.
La variación somaclonal se ha usado en procesos de mejoramiento genético y para ampliar la
variación genética natural; sin embargo, cuando el objetivo es la propagación clonal, como en
el caso de la micropropagación del Nothofagus alpina no es deseada. Este estudio permitió
determinar variación somaclonal en regenerantes de embriones somáticos y brotes adventicios
de N. alpina, obtenidos desde cultivos sucesivos. Independiente del resultado obtenido,
presencia de estabilidad genética para embriones somáticos y una variación considerable para
la línea organogénica. La importancia radica en generar un acercamiento entre las
herramientas moleculares y el cultivo de tejido que permita en el tiempo trabajar de manera
masiva con la certificación genética de los individuos propagados.
128