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UNIVERSIDAD DE COSTA RICA
FACULTAD DE CIENCIAS AGROALIMENTARIAS
ESCUELA DE TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS
Trabajo Final de Graduación bajo la modalidad de Proyecto de Graduación
presentado a la Escuela de Tecnología de Alimentos para optar por el grado de
Licenciatura en Ingeniería de Alimentos
Escalamiento a nivel semi-industrial de la producción de una bebida de
agua de coco (Cocos nucifera L.) microfiltrada adicionada con el cultivo
probiótico Lactobacillus paracasei subsp. paracasei (cepa CRL431®)
Oscar Hernández Ulate
Carné B03057
Ciudad Universitaria Rodrigo Facio
San José, Costa Rica
Mayo de 2017
Tribunal examinador
Proyecto de graduaci6n presentado a Ia Escuela de Tecnologia de Alimentos como requisito
parcial para optar por el grado de Licenciatura en Ingenieria de Alimentos.
Elaborado por:
Oscar Andres Hernandez Ulate
Aprobado por:
~~. ' ~; Lie. Ana Lucia Mayorga Gross
Presidenta del Tribunal
~Carvajal Directora del Proyecto
Dr. Fabrice Vaillant Barka Asesor del Proyecto·
onzalez Vargas del Proyecto
M.Sc. Cannela Velazquez Carrillo
Profesora Designada
ii
iii
Dedicatoria
A mi papá y a mi mamá
El cumplimiento de esta meta es gracias a su trabajo, sacrificio y ejemplo para que yo
pueda ser una persona de bien, con valores y con conciencia de lo que se puede alcanzar
con esfuerzo y dedicación.
Los amo.
iv
Agradecimientos
Por supuesto que mi principal agradecimiento es para Dios, que tantas bendiciones
me ha regalado a lo largo de toda mi vida, gracias a Él he podido llegar hasta donde estoy
ahora.
Quiero agradecerle además a mi papá, Oscar, por comprender cada situación que he
enfrentado a lo largo de mi carrera universitaria, y a mi mamá, Mayi, quiero agradecerle por
siempre creer que soy capaz de lograr lo que me proponga y por velar porque siempre me
mantuviera tranquilo; agradezco a ambos por todos los sacrificios que hacen para darme lo
mejor, y sobre todo, por su ejemplo para que pueda ser una persona de bien para el mundo.
Junto a ellos quiero agradecer a mis hermanos Adri y Sebas por acompañarme y hacerme reír
en tantos momentos que lo necesitaba, y a Karla por estar siempre a mi lado, apoyándome y
tratando de sacar siempre mi actitud optimista. Sin ustedes habría sido mucho más difícil
cumplir metas como esta.
También quiero agradecer a todos mis compañeros, en especial a Carlos, Ana, Vane,
Luci, Val, Sebas y Johan, con los que compartí la mayor parte de mi carrera universitaria y
con los que espero seguir compartiendo muchos momentos más, gracias por todo bolas.
Además, quiero mencionar a Xime, Nati, Glori, Vale y Ana María, ustedes son un ejemplo
para mí.
No puedo dejar atrás a todos mis profesores de la ETA y todos los funcionarios de la
UCR que tanto me han enseñado. Quiero agradecer a mis profesoras tutoras Ana Mercedes
y Marcy por aceptar trabajar conmigo y ayudarme a lo largo de todo este proceso, a Fabrice
por tomarme en cuenta para este proyecto, a la profesora Carmen por ayudarme a realizar las
sesiones de grupo y a la profe Ileana Morales y al profe Eric Wong por ayudarme con el
análisis estadístico. También quiero manifestar mi eterno agradecimiento y mi gran aprecio
por Fernando Camacho, Alonso Contreras, Juan Carlos Cordero, Vanny Mora, Eduardo
Calderón y todos los demás funcionarios del CITA a los que tantas veces molesté durante mi
trabajo final de graduación, este proyecto se los debo en gran parte a todos ustedes.
v
Por supuesto que deseo agradecer inmensamente a las participantes de las sesiones de
grupos focales: Georgeanna, Roci, doña Guiselle, Ana Vargas, tía Lidia, Hilda Camacho,
Vivi, Heidy, Ana Catalina, doña Angélica Soto y doña Alexandra Soto, gracias por sacar de
su tiempo y ayudarme a alcanzar mi título como profesional.
En fin, estoy agradecido con todas las personas que me han acompañado a lo largo de
este camino, que, aunque ha sido difícil y extenso, ha valido la pena cada minuto.
“Dale a Dios tu debilidad y Él te dará su fortaleza”
-Anónimo-
vi
Índice general
Tribunal examinador ........................................................................................................................ ii
Dedicatoria .........................................................................................................................................iii
Agradecimientos ................................................................................................................................ iv
Índice general .................................................................................................................................... vi
Índice de cuadros ............................................................................................................................... ix
Índice de figuras ................................................................................................................................ xi
Nomenclatura ................................................................................................................................... xii
Resumen ........................................................................................................................................... xiii
1. ....................................................................................................................................... Justificación
............................................................................................................................................................. 1
2. ............................................................................................................................................ Objetivos
............................................................................................................................................................. 7
2.1. Objetivo general ............................................................................................................ 7
2.2. Objetivos específicos ..................................................................................................... 7
3. .................................................................................................................................... Marco teórico
............................................................................................................................................................. 8
3.1. Alimentos funcionales ................................................................................................... 8
3.1.1. Microorganismos probióticos ................................................................................... 9
3.2. Agua de coco ................................................................................................................ 20
3.2.1. Composición del agua de coco ................................................................................ 20
3.2.2. Propiedades y beneficios del agua de coco ............................................................ 22
3.2.3. Preservación del agua de coco ................................................................................ 23
3.3. Tecnología de membranas .......................................................................................... 24
3.4. Mediciones fisicoquímicas en el análisis de bebidas ................................................. 25
3.5. Investigación cualitativa de mercado ........................................................................ 26
3.5.1. Grupos focales como técnica de investigación cualitativa ................................... 27
4. ........................................................................................................................ Materiales y métodos
........................................................................................................................................................... 30
4.1. Localización del proyecto ........................................................................................... 30
4.2. Materias primas ........................................................................................................... 30
vii
4.3. Procesamiento para la producción de una bebida de agua de coco microfiltrada
con adición de probióticos ....................................................................................................... 31
4.3.1. Descripción de las etapas de procesamiento ......................................................... 31
4.4. Descripción del equipo de microfiltración tangencial .............................................. 34
4.4.1. Descripción del equipo de microfiltración tangencial acoplado al sistema de
envasado ultralimpio ............................................................................................................... 35
4.5. Pruebas preliminares .................................................................................................. 38
4.5.1. Definición de las condiciones de proceso para la elaboración a escala semi-
industrial de agua de coco microfiltrada adicionada con probióticos ................................ 38
4.5.2. Definición del porcentaje de adición del inóculo .................................................. 38
4.5.3. Recuento de bacterias ácido lácticas durante la fermentación del inóculo ........ 39
4.6. Pruebas definitivas ...................................................................................................... 39
4.6.1. Pruebas de estabilidad microbiológica y carga del probiótico durante 28 días de
almacenamiento a 4 °C ........................................................................................................... 39
4.6.2. Pruebas de propiedades físico- químicas en la bebida microfiltrada durante 28
días de almacenamiento a 4 °C............................................................................................... 40
4.6.3. Evaluación del producto por parte de consumidores potenciales en dos sesiones
de mini grupos focales ............................................................................................................. 41
4.7. Métodos de análisis ...................................................................................................... 41
4.7.1. Análisis microbiológicos ......................................................................................... 41
4.7.2. Análisis fisicoquímicos ............................................................................................ 42
4.7.3. Análisis cualitativo mediante mini grupos focales ................................................ 44
5. ...................................................................................................................... Resultados y discusión
........................................................................................................................................................... 45
5.1. Pruebas preliminares .................................................................................................. 45
5.1.1. Definición de las condiciones de proceso para la elaboración a escala semi-
industrial de agua de coco microfiltrada adicionada con probióticos ................................ 45
5.1.2. Definición del porcentaje de adición inóculo ........................................................ 47
5.1.3. Recuento de bacterias ácido lácticas durante la fermentación del inóculo ........ 49
5.2. Pruebas definitivas ...................................................................................................... 50
5.2.1. Parámetros fisicoquímicos ...................................................................................... 50
5.2.2. Análisis microbiológicos ......................................................................................... 56
5.2.3. Investigación de mercado mediante mini grupos focales ..................................... 62
6. ...................................................................................................................................... Conclusiones
........................................................................................................................................................... 71
viii
7. .............................................................................................................................. Recomendaciones
........................................................................................................................................................... 72
8. ........................................................................................................................................ Bibliografía
........................................................................................................................................................... 73
9. ................................................................................................................................................ Anexos
........................................................................................................................................................... 81
9.1. Investigación de consumidores ................................................................................... 81
9.1.1. Screener para la selección de los participantes de las sesiones de mini-focus group
81
9.1.2. Guía de sesiones para la aplicación de los mini-focus group ............................... 85
9.1.3. Envase y etiquetas propuestas para la bebida de agua de pipa adicionada con
probióticos ................................................................................................................................ 88
9.2. Pruebas preliminares .................................................................................................. 90
9.3. Pruebas definitivas ...................................................................................................... 93
9.4. Ficha técnica del Lactobacillus paracasei subsp. paracasei (cepa CRL-431®). .... 116
ix
Índice de cuadros
Cuadro I. Implementaciones realizadas en el equipo de microfiltración tangencial semi-
industrial para permitir la obtención de una bebida de agua de coco microfiltrada adicionada con
probióticos envasada en condiciones ultra-limpias. .................................................................. 45
Cuadro II. Recuento de bacterias aerobias mesófilas en agua de pipa microfiltrada para evaluar
la eficacia de la etapa de desinfección del equipo de microfiltración con soluciones de NaOH al
2%, HNO3 al 1% y cloro a 500 ppm. ........................................................................................ 46
Cuadro III. Recuento de mohos y levaduras en agua de pipa microfiltrada para evaluar la
eficacia de la etapa de desinfección del equipo de microfiltración. .......................................... 47
Cuadro IV. Recuento de bacterias ácido lácticas en el producto final al adicionar dos
porcentajes distintos de inóculo al agua de pipa microfiltrada. ................................................. 48
Cuadro A1. Número de colonias contabilizadas en las placas de Agar estándar para el análisis
de bacterias aerobias mesófilas en agua de pipa microfiltrada para evaluar la eficacia de la etapa
de desinfección del equipo de microfiltración con soluciones de NaOH al 2%, HNO3 al 1% y
cloro a 500 ppm. ........................................................................................................................ 90
Cuadro A2. Número de colonias contabilizadas en las placas de Agar papa dextrosa para el
análisis de mohos y levaduras en agua de pipa microfiltrada para evaluar la eficacia de la etapa
de desinfección del equipo de microfiltración. ......................................................................... 90
Cuadro A3. Número de colonias contabilizadas en Agar MRS para el análisis de Lactobacillus
paracasei subsp. paracasei al añadir concentraciones de inóculo de 1% y 3% en el agua de coco
microfiltrada. ............................................................................................................................. 91
Cuadro A4. Número de colonias contabilizadas en el Agar MRS para el análisis de
Lactobacillus paracasei subsp. paracasei para elaborar la curva de crecimiento del cultivo
probiótico durante un tiempo de fermentación de 24 h a 35 ºC sin agitación. Réplica 1. ......... 91
Cuadro A5. Número de colonias contabilizadas en el Agar MRS para el análisis de
Lactobacillus paracasei subsp. paracasei para elaborar la curva de crecimiento del cultivo
probiótico durante un tiempo de fermentación de 24 h a 35 ºC sin agitación. Réplica 2. ......... 92
Cuadro A6. Determinación del pH de distintas muestras de agua de pipa microfiltrada
adicionada con probióticos medidas por triplicado durante 28 días para tres repeticiones. ...... 93
Cuadro A7. Determinación de la acidez titulable de distintas muestras de agua de pipa
microfiltrada adicionada con probióticos medidas por triplicado durante 28 días para tres
repeticiones. .............................................................................................................................. 94
Cuadro A8. Determinación de los sólidos solubles expresados como °Brix de distintas muestras
de agua de pipa microfiltrada adicionada con probióticos medidas por triplicado durante 28 días
para tres repeticiones. ................................................................................................................ 96
Cuadro A9. Determinación de la turbidez de distintas muestras de agua de pipa microfiltrada
adicionada con probióticos medidas por triplicado durante 28 días para tres repeticiones. ...... 97
x
Cuadro A10. Número de colonias presentes en Agar estándar para el análisis de
microorganismos aerobios mesófilos en distintas muestras de agua de pipa microfiltrada
adicionada con probióticos medidas por triplicado durante 28 días para tres repeticiones.
Repetición 1. ............................................................................................................................. 98
Cuadro A11. Número de colonias presentes en Agar estándar para el análisis de
microorganismos aerobios mesófilos en distintas muestras de agua de pipa microfiltrada
adicionada con probióticos medidas por triplicado durante 28 días para tres repeticiones.
Repetición 2. ........................................................................................................................... 100
Cuadro A12. Número de colonias presentes en Agar estándar para el análisis de
microorganismos aerobios mesófilos en distintas muestras de agua de pipa microfiltrada
adicionada con probióticos medidas por triplicado durante 28 días para tres repeticiones.
Repetición 3. ........................................................................................................................... 102
Cuadro A13. Número de colonias presentes en Agar MRS para el análisis de bacterias ácido
lácticas en distintas muestras de agua de pipa microfiltrada adicionada con probióticos medidas
por triplicado durante 28 días para tres repeticiones. Repetición 1. ........................................ 103
Cuadro A14. Número de colonias presentes en Agar MRS para el análisis de bacterias ácido
lácticas en distintas muestras de agua de pipa microfiltrada adicionada con probióticos medidas
por triplicado durante 28 días para tres repeticiones. Repetición 2. ........................................ 105
Cuadro A15. Número de colonias presentes en Agar MRS para el análisis de bacterias ácido
lácticas en distintas muestras de agua de pipa microfiltrada adicionada con probióticos medidas
por triplicado durante 28 días para tres repeticiones. Repetición 3. ........................................ 107
Cuadro A16. Número de colonias presentes en Agar papa dextrosa acidificado para el análisis
de mohos y levaduras en distintas muestras de agua de pipa microfiltrada adicionada con
probióticos medidas por triplicado durante 28 días para tres repeticiones. Repetición 1........ 108
Cuadro A17. Número de colonias presentes en Agar papa dextrosa acidificado para el análisis
de mohos y levaduras en distintas muestras de agua de pipa microfiltrada adicionada con
probióticos medidas por triplicado durante 28 días para tres repeticiones. Repetición 2........ 110
Cuadro A18. Número de colonias presentes en Agar papa dextrosa acidificado para el análisis
de mohos y levaduras en distintas muestras de agua de pipa microfiltrada adicionada con
probióticos medidas por triplicado durante 28 días para tres repeticiones. Repetición 3........ 112
Cuadro A19. Datos finales utilizados en el análisis estadístico de regresión lineal para cada uno
de los parámetros evaluados. ................................................................................................... 114
Cuadro A20. Valores de delta seleccionados en el análisis estadístico de los parámetros
fisicoquímicos y microbiológicos para la bebida de agua de pipa microfiltrada adicionada con
probióticos, durante 28 días de almacenamiento a 4 °C. ......................................................... 115
xi
Índice de figuras
Figura 1. Diagrama del procesamiento de agua de coco para la obtención de la bebida de agua
de coco microfiltrada adicionada con probióticos. .................................................................... 32
Figura 2. Equipo de microfiltración tangencial de tres membranas con membrana de refuerzo
acoplado a un sistema de envasado ultralimpio. (a) Sistema de microfiltración (b) Sistema de
mezclado y envasado. ................................................................................................................ 34
Figura 3. Curva de crecimiento del cultivo probiótico durante un tiempo de fermentación de 24
h a 35 ºC sin agitación. h=horas. ............................................................................................... 49
Figura 4. Comportamiento promedio del valor de pH en la bebida de agua de pipa microfiltrada
adicionada con probióticos, durante 28 días de almacenamiento en condiciones de refrigeración
a 4 ºC (n=3). .............................................................................................................................. 51
d= días. ...................................................................................................................................... 51
Figura 5. Comportamiento promedio del valor de acidez titulable en la bebida de agua de pipa
microfiltrada adicionada con probióticos, durante 28 días de almacenamiento en condiciones de
refrigeración a 4 ºC (n=3). ......................................................................................................... 51
d= días; eq= equivalente. ........................................................................................................... 51
Figura 6. Comportamiento del valor promedio de sólidos solubles (ºBrix) en la bebida de agua
de pipa microfiltrada adicionada con probióticos, durante 28 días de almacenamiento en
condiciones de refrigeración a 4 ºC (n=3). ................................................................................ 53
d= días. ...................................................................................................................................... 53
Figura 7. Comportamiento del valor promedio de turbidez en la bebida de agua de pipa
microfiltrada adicionada con probióticos, durante 28 días de almacenamiento en condiciones de
refrigeración a 4 ºC (n=3). ......................................................................................................... 55
d= días. ...................................................................................................................................... 55
Figura 8. Comportamiento del promedio del recuento total aerobio en la bebida de agua de pipa
microfiltrada adicionada con probióticos, durante 28 días de almacenamiento en condiciones de
refrigeración a 4 ºC (n=3). d= días. ........................................................................................... 56
Figura 9. Comportamiento del promedio del recuento de bacterias ácido lácticas en la bebida de
agua de pipa microfiltrada adicionada con probióticos, durante 28 días de almacenamiento en
condiciones de refrigeración a 4 ºC (n=3). d= días. .................................................................. 58
Figura 10. Comportamiento del valor promedio del recuento de mohos y levaduras en la bebida
de agua de pipa microfiltrada adicionada con probióticos, durante 28 días de almacenamiento en
condiciones de refrigeración a 4 ºC (n=3). d= días. .................................................................. 60
Figura A1. Botella de PET de 500 mL propuesta para la bebida de agua de pipa microfiltrada
adicionada con probióticos. ....................................................................................................... 88
Figura A2. Propuesta de etiquetas para la bebida de agua de pipa microfiltrada adicionada con
probióticos. ................................................................................................................................ 89
xii
Nomenclatura
AP Agua de pipa mL Mililitros
APE Agua peptonada estéril M y L Mohos y levaduras
ºBrix Grados brix min Minutos
BAL Bacterias ácido lácticas MRS Agar Man, Rogosa y Sharpe
ºC Grados Celsius PET Tereftalato de polietileno
cal Calorías Prom Promedio
d Días RTA Recuento total aerobio
Eq. Equivalente s Segundos
g Gramos T Temperatura
h Horas t Tiempo
Inc Incontable UFC Unidades Formadoras de Colonias
kg Kilogramos V Volumen
L Litros % Porcentaje
xiii
Resumen
Se realizó el escalamiento para la producción a nivel industrial de una bebida de agua
de pipa microfiltrada adicionada con el cultivo probiótico Lactobacillus paracasei subsp.
paracasei, utilizando un microfiltrador de tres membranas de cerámica con un tamaño
promedio de poro de 0,2 µm y un área de superficie total de filtración de 1 m2, acopladas a
un sistema de envasado ultra limpio.
Se efectuó la evaluación de la estabilidad microbiológica de la bebida, mediante el
recuento de bacterias ácido lácticas y mohos y levaduras, así como la determinación del pH,
sólidos solubles, turbidez y acidez titulable durante 28 días de almacenamiento en
condiciones de refrigeración a 4 ºC, realizando tres repeticiones del experimento. El análisis
estadístico de regresión lineal permitió determinar que durante el tiempo de almacenamiento
evaluado no hubo evidencia de deterioro por mohos y levaduras y además, se logró evidenciar
un contenido de probióticos de al menos 106 UFC/mL en la bebida, al cabo de 28 días de
almacenamiento en refrigeración. Por otro lado, en relación con las propiedades
fisicoquímicas, no se obtuvieron diferencias significativas en el pH, la acidez titulable ni en
el contenido de sólidos solubles expresados como ºBrix, mientras que la turbidez mostró una
tendencia de crecimiento durante el tiempo de evaluación.
Se analizó el concepto propuesto de la bebida mediante una investigación cualitativa,
utilizando la técnica de mini grupos focales. Se realizaron dos sesiones con 5 participantes
en la primera y 6 en la segunda, mujeres entre los 29 años y 51 años, consumidoras de
productos saludables. A partir de estas sesiones se determinó que las participantes estarían
dispuestas a comprar la bebida, principalmente motivadas por los beneficios asociados al
consumo de la misma.
1
1. Justificación
A lo largo de los últimos años, distintos estudios han podido relacionar que ciertos
alimentos o patrones dietéticos son beneficiosos en la prevención primaria de enfermedades
(Assman et al., 2014). Además de esto, ahora es bien sabido que los nutrientes y otras
sustancias obtenidas a partir de variedad de alimentos, ayudan a promover la salud, mantener
la homeostasis metabólica y a suplir los requerimientos energéticos necesarios (Pang et al.,
2012).
De acuerdo con lo que se menciona en la literatura, en general se comparte el criterio de
que los alimentos funcionales son aquellos que se consumen como parte de la dieta normal,
que brindan beneficios más allá de sus funciones nutricionales, tanto para mejorar el estado
de salud y bienestar o para reducir el riesgo de enfermedades (Chen, 2011; Fabiansson, 2014;
Siegrist et al., 2015).
A pesar de carecer de un consenso en su definición, es importante resaltar que en general
se destaca el efecto positivo sobre la salud, lo cual se fundamenta en que sí existe evidencia
científica de que los alimentos funcionales tienen efectos beneficiosos sobre el organismo
(Chen, 2011). Por esta razón se asegura que la adición de compuestos funcionales a alimentos
portadores provee de beneficios potenciales para la dieta de los consumidores (Annunziatta
& Vecchio, 2013).
Entre los efectos favorables mencionados, se indica que prometen mejorar la salud, dar
mayor bienestar o mejorar el funcionamiento de procesos fisiológicos (Siegrist et al., 2015).
Además, se reconoce que disminuyen el riesgo de desarrollar ciertas enfermedades (Chen,
2011) o promueven una salud óptima (Fabiansson, 2014). Consecuentemente generan
mejoras físicas y bienestar mental (Chen, 2011).
Como se menciona, los productos funcionales proveen a los consumidores una forma
moderna de mantener un estilo de vida saludable, diferente de la dieta saludable convencional
(Siró et al., 2008). Esto se asocia directamente con el hecho de que una adecuada nutrición
es fundamental para tener buena salud, un crecimiento y desarrollo adecuado y para prevenir
enfermedades (Pang et al., 2012). Sin embargo, en muchas sociedades contemporáneas, gran
2
parte de los individuos no mantiene dietas balanceadas, lo cual repercute en un aumento de
la incidencia de desbalances metabólicos serios. Esto hace que aumente el riesgo de contraer
enfermedades como obesidad, diabetes tipo 2, hipertensión, alergias e intolerancias
alimentarias, y desórdenes gastrointestinales e inflamatorios (Pang et al., 2012).
A pesar de esto, a lo largo de los últimos años se ha logrado identificar que los
consumidores se preocupan cada vez más por su salud y por esto prestan más atención a su
dieta (Szakály et al., 2012). Esto coincide con el hecho de que hay un incremento en los
consumidores que creen que los alimentos contribuyen con su salud, además de que están
cada vez más dispuestos a adoptar cambios orientados a mejorar su salud con hábitos
alimenticios (Chen, 2011).
Dado el aumento en la consciencia de los beneficios para mantener una buena salud y
bienestar, la investigación de ingredientes bioactivos para consumo humano se ha
incrementado en los últimos tiempos (Paz et al., 2015). Las principales razones por las que
se ha dado este aumento en la demanda por alimentos funcionales corresponden al aumento
en la población de la tercera edad, que ha causado que se perciba como prioridad mantener
la salud física y mental (Fabiansson, 2014), lo que coincide con el aumento de la expectativa
de vida y el aumento del costo de servicios de salud (Chen, 2011; Siró et al., 2008).
Este último aspecto se puede ver relacionado con el elevado costo del tratamiento de
enfermedades crónicas, lo cual ha elevado el interés por buscar diferentes alternativas, entre
las que ha aparecido el interés por mejorar la dieta, para lo cual pueden incluirse alimentos
funcionales como parte de la misma (Ding et al., 2015).
Por otro lado, puede considerarse como un factor importante en el consumo de alimentos
funcionales, el hecho de que, en algunos casos, las personas que ingieren este tipo de
productos pueden reducir la dosis de alguna droga prescrita sin disminuir el efecto terapéutico
(Eussen et al., 2011).
Como se ha mencionado anteriormente, el mercado de alimentos funcionales está
creciendo rápidamente y esta tendencia muestra condiciones para mantenerse en el futuro
(Szakály et al., 2012). Debido a esto se ha identificado la necesidad de que las empresas
desarrollen y lancen nuevos productos que permitan prevenir o disminuir el desarrollo de
3
enfermedades, o que permitan una vida más larga y saludable para las personas (Szakály et
al., 2012).
Dado que se ha mencionado que los alimentos funcionales proporcionan beneficios para
la salud, es necesario conocer cuál es el efecto que poseen y cuál es la razón de asociar este
tipo de alimentos con efectos positivos. Este hecho se basa en la composición de dichos
alimentos, los cuales son asociados con funcionalidad por poseer componentes como
vitaminas, suplementos minerales, hierbas, fitoquímicos como polifenoles y carotenoides, y
probióticos, los cuales están relacionados con la prevención de enfermedades y la promoción
de la salud (Shin et al., 2015). Por otro lado, también se reporta un efecto antioxidante,
antiinflamatorio, cicatrizante de heridas y anticancerígeno de algunos alimentos funcionales
lipofílicos (Shin et al., 2015).
Desde años atrás, el mercado de alimentos funcionales en distintas regiones del mundo
ha vivido un papel importante por parte de aquellos productos beneficiosos para la salud
intestinal, en los que resaltan especialmente los adicionados con probióticos (Siró et al.,
2008). Estos efectos sobre el intestino son importantes ya que este órgano actúa como interfaz
entre la dieta y los eventos metabólicos, lo cual se encuentra ligado a su microflora (Pang et
al., 2012).
Muchos de los alimentos funcionales que han sido desarrollados incluyen probióticos
(Pang et al., 2012). Esto se debe a que estos pueden generar efectos positivos sobre el
organismo, ya que son capaces de modificar la flora intestinal y mejorar ciertas funciones
inmunológicas, además de promover la absorción de ciertos minerales esenciales y proteger
contra enfermedades del intestino delgado y colon (Fabiansson, 2014).
El mercado de los alimentos funcionales con probióticos, principalmente, está siendo
dominado por productos lácteos (Annunziata & Vecchio, 2013) y la razón de esta aceptación
por los consumidores se debe a la imagen positiva que generan sobre los consumidores (Siró
et al., 2008). En general, el yogur ha sido percibido como uno de los alimentos portadores de
probióticos de mayor aceptación para alimentos funcionales (Siegrist et al., 2015). Se ha
comparado este producto con otros alimentos portadores y este ha presentado los mejores
resultados de acuerdo con su aceptación (Annunziata & Vecchio, 2013). Además, en la
4
mayoría de casos, los probióticos son agregados a alimentos lácteos ya que no se requieren
modificaciones considerables en los procesos de manufactura y la tecnología involucrada
(Pimentel et al., 2015).
A pesar del papel importante que juegan los productos lácteos en el campo de los
alimentos funcionales, es importante buscar alternativas, por ejemplo, para el uso de
probióticos, de manera que se genere una mayor variedad en la oferta de productos colocados
en el mercado y también para ofrecer una opción viable para el consumo por parte de aquellas
personas que presentan alergia o intolerancia a la lactosa e hipercolesterolemia (Pimentel et
al., 2015). Este segmento de la población puede llegar a ser importante ya que la falta de
lactasa es el tipo más común de deficiencia enzimática en humanos (Craveiro et al., 2012).
Esto último es importante ya que muchos pacientes, en especial aquellos con enfermedades
gastrointestinales en general, presentan actitudes marcadas de evasión de diferentes
alimentos, entre los que destacan los productos lácteos (Yang et al., 2013). Por otro lado, el
desarrollo de alimentos funcionales no lácteos puede ser de gran importancia para el mercado
conformado por vegetarianos y veganos (Camargo et al., 2015).
Se ha sugerido que los jugos de frutas pueden ser un medio novedoso y apropiado para
su fortificación con cultivos probióticos, dado que ya se encuentran posicionados como
productos saludables, además de que son de consumo frecuente y leal por un amplio
porcentaje de los consumidores (Siró et al., 2008). Por esta razón, este tipo de productos
puede ser una alternativa interesante para elaborar alimentos funcionales, ya que es vital que
los productos sean diseñados de manera que los consumidores los acepten con facilidad (Siró
et al., 2008). Por otro lado, los jugos de frutas también son ricos en azúcares, minerales y
vitaminas que pueden ser utilizados por los probióticos (Pimentel et al., 2015).
Según lo que se ha encontrado en distintos estudios, los alimentos funcionales basados
en un alimento portador percibido como saludable tienden a ser más aceptados por los
consumidores (Annunziatta & Vecchio, 2013; Siegrist et al., 2015). Además de esto, el sabor
del alimento funcional debe ser agradable porque muchos consumidores no estarían
dispuestos a sacrificar el sabor por el beneficio otorgado a la salud (Siegrist et al., 2015).
5
A pesar de esto, es importante mencionar que la suplementación de probióticos en jugos
es, usualmente, más complicada que en los productos lácteos, ya que en general, los jugos
presentan cantidades insuficientes de péptidos y aminoácidos, los cuales son requeridos por
los cultivos probióticos. Por otra parte, las distintas cepas son usualmente más sensibles a
condiciones ácidas y además, el cultivo probiótico puede generar grandes cambios en las
características sensoriales (Pimentel et al., 2015).
En el caso del agua de coco, este es un producto de gran importancia y alto consumo en
regiones tropicales (Camargo et al., 2015; Mahnot et al., 2014) y su demanda ha ido en
aumento alrededor del mundo; además, debido a sus propiedades hidratantes y refrescantes,
a su sabor y a sus propiedades funcionales y nutritivas, este producto representa uno de los
de mayor crecimiento en la categoría de bebidas (Camargo et al., 2015; Mahnot et al., 2014).
Conocer las actividades biológicas del coco puede ser de gran importancia, ya que la
evaluación de las propiedades bioactivas de un producto puede fortalecer su posición en el
mercado, logrando satisfacer la demanda de los consumidores por productos nuevos capaces
de mantener la salud y prevenir enfermedades (Paz et al., 2015). Esto último, en adición al
hecho de que el coco es un producto muy versátil en cuanto a sus aplicaciones (Ng et al.,
2015), puede favorecer el desarrollo de una bebida de este producto que sea exitosa con los
consumidores.
La microfiltración tangencial surge como una de las mejores opciones de proceso para
producir bebidas estériles, al utilizar una membrana con el diámetro promedio de poro
adecuado, abarca poco espacio físico, no requiere de cambios de fase de producto ni el uso
de agentes químicos, permite preservar sabores y aromas y además se pueden obtener
productos con apariencia atractiva (Cardoso De Oliveira et al., 2012; Yin et al., 2015). Sin
embargo, uno de los principales problemas que presenta la microfiltración corresponde a la
disminución del flujo de permeado, por lo cual deben buscarse soluciones para no afectar la
eficiencia del proceso. A pesar de esto, la microfiltración es un proceso que tiene potencial
para ser escalado (Yin et al., 2015) a niveles superiores y dicho escalamiento de la producción
de este tipo de productos puede llegar a ser de gran importancia, ya que favorece que esta
clase de tecnologías puedan ser adoptadas y aplicadas por la industria (Stratakos et al., 2016).
6
Por otro lado, es importante emplear técnicas de investigación de mercado que permitan
obtener la información necesaria sobre un producto, lo cual puede ser logrado con las
sesiones de gupos focales o focus groups, ya que permite recopilar información acerca de
cómo las personas se sienten o piensan acerca de un producto (Krueger & Casey, 2000). Por
otro lado, como en distintas investigaciones los recursos pueden ser limitados, pueden
realizarse sesiones de mini grupos focales, que consisten en grupos de 4 a 6 personas. Esta
metodología ha adquirido importancia debido a que facilita el reclutamiento y el manejo del
grupo y permite que los participantes se sientan más cómodos (Krueger & Casey, 2000).
En cuanto a investigaciones relacionadas con la elaboración de bebidas de agua de coco
adicionadas con microorganismos, actualmente existen reportes del desarrollo de bebidas
fermentadas, elaboradas utilizando una bacteria ácido láctica. Esto responde a una tendencia
mundial, ya que sus beneficios han sido científicamente demostrados, aparte de que se ha
identificado que los productos fermentados han ganado popularidad y aceptación por sus
beneficios funcionales, y además se menciona el mercado promisorio que pueden tener las
bebidas con probióticos (Camargo et al., 2015). Por otro lado, Vargas (2015) realizó la
elaboración de una bebida de este tipo a escala piloto y como parte de su investigación
recomienda que se realicen pruebas con un sistema de envasado ultralimpio en un equipo de
mayor capacidad. A pesar de esto, se reportan pocos estudios que evalúen el efecto que tiene
la suplementación de jugos de frutas con probióticos (Pimentel et al., 2015).
Es importante destacar que no se ha evidenciado la presencia en el mercado nacional de
una bebida de agua de coco procesada con la técnica de microfiltración tangencial ni con
adición de probióticos, por lo que este trabajo pretende innovar con la producción de la
misma de manera que esta pueda ser introducida en el mercado.
7
2. Objetivos
2.1. Objetivo general
Implementar el proceso de elaboración a escala semi-industrial de una bebida de agua de
coco (Cocos nucifera L.) microfiltrada adicionada con el cultivo probiótico Lactobacillus
paracasei subsp. paracasei (cepa CRL431®), evaluando las propiedades fisicoquímicas y
microbiológicas durante 28 días de almacenamiento a 4 °C, así como el concepto de producto
percibido por los consumidores.
2.2. Objetivos específicos
- Definir un tiempo adecuado de propagación del cultivo probiótico en 2 L de inóculo
que permita obtener recuentos mínimos de 106 UFC/mL, a partir del recuento de
bacterias ácido lácticas determinados en distintos tiempos de muestreo durante urante
24 h.
- Implementar un sistema de microfiltración a escala semi-industrial acoplado a un
envasado ultralimpio para la definición de las condiciones de proceso que permitan
la producción de agua de coco adicionada con probióticos.
- Determinar los cambios en la estabilidad microbiológica, la carga del probiótico y las
propiedades fisicoquímicas durante 28 días de almacenamiento a 4 °C del agua de
coco adicionada con el probiótico Lactobacillus paracasei subsp. paracasei (cepa
CRL431®), elaborada mediante microfiltración tangencial a escala semi-industrial
acoplada a un sistema de envasado ultralimpio.
- Determinar el concepto de producto percibido por consumidores sobre la bebida de
agua de coco microfiltrada adicionada con probióticos mediante la aplicación de
sesiones de mini grupos focales para el conocimiento del impacto que este producto
pueda generar en los consumidores.
8
3. Marco teórico
3.1. Alimentos funcionales
Con el avance del conocimiento que se tiene sobre los efectos de ciertos alimentos en el
organismo, ha surgido el concepto de alimentos funcionales. Sobre este término no existe
una definición estandarizada (Annunziata & Vecchio, 2013; Fabiansson, 2014). Esto se
refleja en la variedad de definiciones reportadas en la literatura.
En algunos casos se menciona que los alimentos funcionales son aquellos alimentos que
afectan en forma beneficiosa una o más funciones específicas del cuerpo, más allá de los
efectos nutricionales, en una manera relevante para mejorar el estado de salud y bienestar, o
bien, reducir el riesgo de enfermedades (Chen, 2011; Assmann et al., 2014). Por otro lado,
el Instituto de Tecnólogos de Alimentos (IFT) lo define como los alimentos o los
componentes de alimentos que proveen beneficios para la salud más allá de la nutrición
básica (Fabiansson, 2014). Mientras tanto, otros autores los definen como aquellos productos
alimenticios que prometen mejoras en funciones fisiológicas específicas (Siegrist et al.,
2015).
Por otro lado, algunos autores incluyen como alimentos funcionales aquellos que se
encuentran tanto en su estado natural (integral) como aquellos que son fortificados,
enriquecidos o mejorados, siempre que sean consumidos regularmente como parte de una
dieta variada, en niveles efectivos, mientras que otros sólo consideran aquellos que son
enriquecidos, fortificados o mejorados con la adición de componentes beneficiosos para la
salud más allá de la nutrición básica (Fabiansson, 2014).
Generalmente se considera que los alimentos funcionales son aquellos a los que se añade
ingredientes desarrollados tecnológicamente que brindan beneficios específicos para la salud
(Annunziatta & Vecchio, 2013). Dicho componente puede ser añadido, removido o
modificado (Chen, 2011). Los avances en la ciencia y tecnología de alimentos actualmente
permiten que un alimento pueda ser formulado de manera que este sea una fuente
significativa de nutrientes u otros componentes nutricionales importantes. Esto combinado
con el hecho de que la biotecnología moderna puede ser utilizada para aumentar los niveles
9
de ciertas características en los alimentos (Ding et al., 2015), hace posible el diseño de
alimentos funcionales.
Por otro lado, es importante mencionar que no puede ser considerado como alimento
funcional aquel que cuyos componentes funcionales se encuentran en forma de pastillas,
cápsulas o como suplementos alimenticios (Assmann et al., 2014). Más aun, para considerar
un alimento como funcional, debe existir evidencia científica del efecto beneficioso que se
declara sobre él. Puesto que cualquier alimento que se catalogue como funcional debe ser
basado en ciencia, estos deben ser evaluados mediante bioquímica, fisiología, biología
celular y molecular y otras biociencias relevantes (Fabiansson, 2014).
Los estudios epidemiológicos pueden confirmar la relación entre los patrones dietarios y
los biomarcadores de enfermedades u ocurrencia de enfermedades (Fabiansson, 2014), y a
pesar de que debe realizarse más investigación al respecto, se ha encontrado relación entre el
consumo de alimentos funcionales y ciertos beneficios para el organismo. Tal es el caso del
consumo de alimentos con fitoesteroles y la reducción de colesterol LDL en adultos y niños
con hiperlipidemia. También el consumo de alimentos altos en fibra se asocia con una
disminución en la concentración sanguínea del colesterol LDL, en el índice glicémico y de
inflamaciones asociadas a enfermedad cardiovascular (Assmann et al., 2014). Más aún se
encuentran los compuestos antioxidantes, los cuales se relacionan con roles de prevención
contra enfermedades cardiovasculares por la reducción de la inflamación crónica y mejora
en la función del endotelio, además de proteger contra ciertas formas de cáncer y efectos
citotóxicos (Paz et al., 2015).
3.1.1. Microorganismos probióticos
Actualmente es de gran importancia tomar el rol de los cultivos probióticos como
componente de algunos alimentos funcionales. Se puede entender por estos como aquellos
microorganismos vivos que si se consumen en cantidades adecuadas pueden otorgar
beneficios a su hospedador (Pimentel et al., 2015; Siró et al., 2008). Desde otra perspectiva,
también pueden ser definidos como suplementos alimenticios microbianos que producen
efectos beneficiosos sobre los consumidores (Pang et al., 2012).
10
Entre los microorganismos probióticos que se han identificado hasta ahora se encuentran
mohos, levaduras y bacterias. En el grupo de los mohos y levaduras destacan: Saccharomyces
cerevisiae, Saccharomyces bourlardii, Aspergillus niger, Aspergillus orzue y Candida
pintolopesii. Sin embargo, los microorganismos que han sido más estudiados y empleados
en el campo de los probióticos son las bacterias ácido lácticas y las bífidobacterias, las cuales
son componentes de la microbiota intestinal y es importante resaltar que su aplicación a lo
largo de los años ha sido muy segura (Siró et al., 2008). Entre las principales bacterias
catalogadas como probióticas se encuentran: Bifidobacterium: bifidum, infantis,
adolescentes, longum, thermophilum, breve, lactis, cremoris, aliviarus, intermedius,
thermophilis, diacetylactis; Leuconostoc mesenteroides; Pediococcus; Propionibacterium;
Bacillus; Enterococcus; Enterococcus faecium; Lactobacillus: acidophilus, sporogenes,
plantarum, rhamnosus, delbrueck, reuteri, fermentum, lactus, cellobiosus, brevis, casei,
farciminis, gasseri, crispatus, paracasei (Amara & Shibl, 2015).
En general, la mayoría de los probióticos pertenecen al grupo de bacterias ácido lácticas,
que pueden ser consumidas principalmente en yogur, leches fermentadas u otros alimentos
fermentados (Pang et al., 2012). Muchas cepas de bacterias ácido lácticas que han sido
aisladas a partir de alimentos fermentados, son utilizadas como probióticos debido a que son
capaces de resistir las condiciones gastrointestinales del hospedero, también pueden
adherirse al epitelio intestinal y prevenir el crecimiento o la invasión de bacterias patógenas
en el intestino del hospedero (Rivera & Gallardo, 2010).
Como es sabido, existen distintos grupos de microorganismo que desarrollan diferentes
funciones, destacándose aquellas relacionadas con el sistema digestivo. Dichos
microorganismos participan en la digestión y son capaces de complementar algunas
deficiencias del sistema digestivo, por lo que disminuyen la cantidad de etapas requeridas
por el organismo para degradar estructuras alimentarias complejas a otras más simples
(Amara & Shibl, 2015). Sin embargo, también existen variantes de distintos microrganismos
que pueden tomar el lugar de los que forman parte de la flora digestiva y que pueden digerir
los alimentos de manera incorrecta y además, que pueden secretar toxinas durante el proceso
de la digestión (Amara & Shibl, 2015).
11
Son numerosos los factores que pueden generar estos cambios en el balance de la flora
intestinal, tales como el estrés, el consumo excesivo de alcohol, dietas con elevado consumo
de grasas, carne, azúcar, además de desórdenes genéticos, alto contenido de cloro y flúor en
agua potable, antibióticos, exposición a toxinas ambientales, entre otros muchos factores
(Amara & Shibl, 2015). Los probióticos actúan contra estos desbalances en la flora intestinal,
ya que se considera que son capaces de regenerar el sistema digestivo con microorganismos
que neutralicen aquellos que producen efectos negativos, mediante la fermentación adecuada
de los alimentos y mejorando la salud en general (Amara & Shibl, 2015).
Aunque deben realizarse más investigaciones para identificar de mejor manera los
beneficios que pueden producir los probióticos en el organismo, hasta ahora se han
identificado múltiples casos en los que se han observado estos efectos. En la literatura se
señala que estos microorganismos participan en la proliferación y diferenciación de las
células del epitelio y en el desarrollo y homeostasis del sistema inmune (Amara & Shibl,
2015). Por otro lado, se menciona que es de vital importancia que las personas sanas
consuman probióticos de manera preventiva, es decir, con el fin de mejorar su salud en
general y protegerlos de diferentes tipos de enfermedades (Amara & Shibl, 2015).
3.1.1.1. Efectos positivos de los cultivos probióticos sobre la salud gastrointestinal
Como el uso de los probióticos por parte de los consumidores se realiza por medio de
la ingestión de los mismos, es de esperar que su uso principal sigue teniendo como fin mejorar
la salud intestinal (Ouwehand & Röytiö, 2015). Son numerosos los estudios que relacionan
el consumo de probióticos con la salud del sistema gastrointestinal. La mayoría de los
estudios coinciden en que los mejores efectos por parte de los probióticos se dan cuando estos
colonizan el epitelio intestinal, ya que pueden modular el sistema inmune del intestino,
desplazar microorganismos patógenos, proveer antimutagénicos y antioxidantes, entre otros
posibles efectos (Rivera & Gallardo, 2010).
En relación con una enfermedad tan perjudicial como el cáncer, se han logrado
observar efectos positivos en el desarrollo de factores antiproliferativos y proaptoptóticos por
12
parte de microorganismos genéticamente modificados (Butel, 2014). Además, se ha
evidenciado un efecto protector de ciertas bacterias lácticas contra la cancerogénesis,
asociada a la producción de metabolitos tóxicos (Butel, 2014).
Otro rol importante de los probióticos que ha sido identificado, corresponde a su
funcionalidad para reducir la incidencia o duración de diarrea, en muchos casos asociada a
antibióticos, causada principalmente por el efecto adverso de los mismos sobre la microbiota
intestinal en el tratamiento de enfermedades por infección bacteriana. En estos casos, aunque
los probióticos no sustituyen dicha flora intestinal, sí ayudan a controlar estos
microrganismos, así como a lograr una recuperación rápida de su composición original
(Ouwehand & Röytiö, 2015). Se menciona también que los probióticos pueden competir
contra los virus o bacterias patógenas que producen la diarrea, al evitar que se unan a las
células del epitelio, o bien, mediante la producción de bacteriocinas como la nisina (Amara
& Shibl, 2015). En diversos estudios se menciona la disminución de la duración de la diarrea
y en algunos casos, una disminución de la incidencia de la misma (Butel, 2014). En muchos
casos, al administrar antibióticos, se da una colonización por parte de Clostridium difficile,
habiendo demostrado algunos probióticos efectos favorables para combatir este
microorganismo (Butel, 2014).
Otro caso en el que los probióticos pueden beneficiar la salud, corresponde a su papel
preventivo contra microorganismos potencialmente patogénicos que pueden ser causantes de
necrotización enterocolítica, que afecta principalmente a niños prematuros y recién nacidos
bajo peso (Ouwehand & Röytiö, 2015). En este caso, aunque la mayoría de probióticos no
ha logrado reducir la incidencia de esta patología, con meta-análisis sí se han encontrado
evidencias de disminución en la incidencia y mortalidad de la misma (Ouwehand & Röytiö,
2015).
Por otro lado, existen microorganismos patógenos como Helicobacter pylori que
pueden causar úlceras gástricas e incluso estar asociados con cáncer gástrico, por lo que se
han evaluado los efectos de distintos probióticos contra este microorganismo. Aunque en
algunos casos los cultivos probióticos no han tenido efectos directos contra esta bacteria, se
ha encontrado que pueden ayudar a contrarrestar los efectos secundarios producidos por la
13
terapia de erradicación de la misma, por lo cual mejoran los resultados y aumentan su tasa de
éxito (Ouwehand & Röytiö, 2015). Por otro lado, aunque no produzcan resultados suficientes
por sí solos, es recomendable el consumo de probióticos para combatir los efectos de
Helicobacter pylori, como auxiliares del tratamiento con antibióticos (Butel, 2014). Más aun,
a pesar de la falta de evidencia en algunos estudios, se ha determinado que ciertos probióticos
como Lactobacillus salivarius son capaces de producir altas cantidades de ácido láctico, con
lo cual se ha logrado inhibir el crecimiento de Helicobacter pylori (Amara & Shibl, 2015).
Asimismo, se ha logrado identificar que los cultivos probióticos pueden tener efectos
sobre la normalización del tránsito intestinal lento, identificado como causa de estreñimiento.
El mecanismo de acción de los probióticos sobre estos síntomas para acelerar el tránsito
intestinal aún debe ser establecido, aunque se considera que la producción de ácidos grasos
de cadena corta puede ser uno de esos factores que influyen en este caso (Ouwehand &
Röytiö, 2015).
Es sabido que ninguna cepa bacteriana podrá proveer de todos los beneficios deseados
e incluso, cepas de la misma especie pueden no ser efectivas contra condiciones de salud
determinadas (Rivera & Gallardo, 2010). En algunos casos, los beneficios que brinda el
cultivo probiótico pueden ser sumamente específicos de la cepa bacteriana, así como de la
dosis de consumo y la duración del mismo. Tal es el caso de los cultivos que logran tener
efectos positivos contra el síndrome de colon irritable (Bifidobacterium infantis 35624 y
Lactobacillus acidophilus NCFM). Es probable que los pacientes que padecen esta patología
presenten una microbiota alterada con respecto a personas sanas, y se ha logrado observar
efectos sobre la reducción de dolor, así como una colonización del intestino que evita el
crecimiento de bacterias patógenas productoras de gas (Ouwehand & Röytiö, 2015). En
relación con esto, también se han encontrado casos en los que se han visto efectos positivos
de productos que contienen varias cepas probióticas sobre alguna patología, como el colon
inflamado; en este caso, existen evidencias de que se ha logrado tener resultados positivos en
el tratamiento de pouchitis, que corresponde a una inflamación en una bolsa presente en el
íleon, causada por colitis ulcerativa severa (Butel, 2014; Ouwehand & Röytiö, 2015). En
relación con el colon inflamado, también se han podido encontrar resultados en los que se
evidencia la disminución o desaparición completa de los síntomas asociados (Butel, 2014).
14
3.1.1.2. Efectos positivos de los probióticos sobre el sistema inmune
Si bien es cierto, el consumo de probióticos ha sido asociado principalmente con
efectos positivos sobre la salud gastrointestinal, estos microorganismos juegan distintos roles
en el organismo, por lo que es importante mencionar que muchos de sus beneficios también
impactan en zonas distintas al tracto gastrointestinal (Ouwehand & Röytiö, 2015). Diversos
estudios han determinado que el consumo de probióticos ha sido favorable para prevenir
algunas alergias, principalmente en familias de alto riesgo (Butel, 2014). La literatura reporta
que más del 70% de las células inmunes se encuentran a nivel del intestino, formando parte
del tejido linfoide del intestino (Butel, 2014).
Diversas investigaciones sobre el consumo de probióticos han encontrado de una u
otra manera, resultados favorables contra infecciones en el tracto respiratorio superior.
Dichos resultados dependen de la cepa de microorganismos utilizada, así como de los
pacientes tratados. Se ha determinado efectividad en la reducción de fiebre, rinorrea y
duración del síntoma de la tos en niños, disminución del tiempo de infección y la severidad
de los síntomas en adultos jóvenes, con una menor frecuencia de infecciones en atletas
adultos, quienes tienden a padecer de estas infecciones por su actividad física de alta
resistencia (Ouwehand & Röytiö, 2015). Por todos estos beneficios se ha llegado a concluir
que el consumo de probióticos puede reducir la incidencia de esta enfermedad, siendo su
principal beneficio disminuir la ausencia de estudiantes y trabajadores en sus funciones y así
evitar los efectos económicos que esto conlleva (Ouwehand & Röytiö, 2015). Aunque no se
ha determinado con exactitud su mecanismo de acción, se considera que, por su competencia
contra microorganismos patógenos, mejoran la función de barrera del epitelio respiratorio y
estimulan la inmunidad celular para sus efectos protectores contra estas infecciones.
Por otro lado, se han encontrado algunos beneficios asociados con el consumo de
probióticos contra alergias, asma y dermatitis atópica, en las que los probióticos logran
mejorar el balance de la composición normal de microrganismos, lo cual permite reforzar la
función inmune de las células y así impactar contra los síntomas de distintas alergias
(Ouwehand & Röytiö, 2015). También se ha encontrado que algunos probióticos pueden
producir lactasa (Amara & Shibl, 2015), lo cual favorece a aquellas personas con intolerancia
15
a la lactosa, al igual que aquellos cultivos productores de β-galactosidasa (Butel, 2014). En
estos casos los probióticos pueden actuar de distintas maneras, como puede ser proveyendo
al organismo del producto genético faltante, productos alternativos adecuados para actuar
contra la condición, o bien con los productos finales de la ruta metabólica involucrada y
además pueden dar soporte a rutas metabólicas defectuosas (Amara & Shibl, 2015).
Los probióticos también han sido identificados como microorganismos beneficiosos
contra infecciones urogenitales, principalmente asociados a inflamaciones en el área vaginal
causadas por la presencia de bacterias patógenas. Los resultados obtenidos han demostrado
mejoras en el tratamiento de infecciones de este tipo, lo cual puede ser aún más relevante al
conocer que la microbiota vaginal es la primera flora que enfrenta el recién nacido durante
el parto (Ouwehand & Röytiö, 2015).
Si bien es cierto, no en todos los casos se encuentran efectos significativos
directamente sobre la variable en estudio, se ha podido evidenciar que se pueden producir
mejoras en la calidad de vida y el bienestar de los pacientes durante la terapia con el
probiótico. Esto se ha evidenciado en pacientes con artritis reumatoide, lo cual no deja de ser
un hecho beneficioso para los mismos, aún más cuando estos cultivos no han mostrado
evidencias de interferir con el tratamiento médico utilizado para combatir dichas
enfermedades. Este consumo de probióticos en este caso específico puede causar beneficios,
ya que se ha encontrado que la disbiosis en la microflora del colon contribuye con la
generación de enfermedades de inflamación de articulaciones (Ouwehand & Röytiö, 2015).
En general se considera que las propiedades antimicrobianas de las bacterias ácido
lácticas y Bifidobacterium pueden ser atribuidas a la competencia por nutrientes y a la
producción de compuestos inhibidores como los ácidos orgánicos, que en el intestino pueden
tener un efecto bactericida o bacteroistático; pero también su capacidad de producir dichos
componentes puede ser una de las características principales que permite tener un efecto
contra bacterias patógenas y así también, mostrar un efecto probiótico (Rivera & Gallardo,
2010).
16
3.1.1.3. Efectos positivos de los probióticos sobre la salud metabólica
Diversos estudios han permitido evidenciar efectos favorables de distintas cepas de
probióticos sobre la reducción de grasa visceral abdominal y subcutánea e índice de masa
muscular en personas que presentaban un alto valor al inicio del estudio, así como en la
adiposidad central en período postparto en mujeres, además de haber inhibido la ganancia de
peso excesivo en niños (Ouwehand & Röytiö, 2015).
En cuanto al tratamiento de síndrome metabólico y diabetes, diversos estudios señalan
haber mejorado la tolerancia a la glucosa y la sensibilidad a la insulina en mujeres
embarazadas y en los 12 meses posteriores al parto, con el consumo de probióticos, además
se disminuyó el riesgo de contraer diabetes gestacional por parte de las madres; por estas
razones se considera que los probióticos pueden desempeñar un papel importante en la
regulación del metabolismo de glucosa e insulina así como disminuir el riesgo de contraer
enfermedades metabólicas (Ouwehand & Röytiö, 2015). Asimismo, se han encontrado
relaciones entre la microbiota y la obesidad, así como con diabetes tipo 2, y a través de
marcadores de metagenómica fecal se ha logrado diferenciar entre personas obesas y no
obesas, lo que fortalece la idea de la relación que pueden tener los microorganismos con estas
patologías (Butel, 2014).
Por otro lado, se ha demostrado que ciertas bacterias ácido lácticas pueden tener
efectos positivos contra la hipercolesterolemia, ya que poseen enzimas que participan en el
metabolismo de sales biliares para formar ácidos grasos primarios, lo que impide la
formación de micelas, la absorción de colesterol en el intestino y la circulación
enterohepática del colesterol (Ouwehand & Röytiö, 2015).
En resumen, los probióticos pueden favorecer la salud al combatir los efectos de
microorganismos patógenos, proveyendo al organismo subproductos favorables, reduciendo
el trabajo del sistema digestivo, disminuyendo el efecto de compuestos dañinos mediante el
uso de una biopelícula o biofilm que protege el sistema digestivo, además de ser menor la
cantidad de alimentos requeridos por el organismo al favorecer la digestión y el metabolismo.
Por otra parte, los probióticos pueden complementar las deficiencias de material genético en
el organismo al hacer uso de los genes de estos microorganismos, tal como ocurre en algunos
17
casos en los que favorecen la fermentación de la lactosa en seres humanos que no pueden
hacerlo por cuenta propia (Amara & Shibl, 2015).
3.1.1.4. Propiedades y efectos del cultivo Lactobacillus paracasei ssp. paracasei
Como se mencionó anteriormente entre el grupo de microorganismos que se considera
como probióticos se encuentra la bacteria ácido láctica Lactobacillus paracasei ssp.
paracasei, la cual ha podido ser relacionada con diversos beneficios asociados con actividad
antimicrobiana en infecciones gastrointestinales y propiedades antimutagénicas,
antioxidantes, anticancerígenas, además de favorecer la función del sistema inmune
(Pimentel et al., 2015). Por otro lado, se ha encontrado también que este microorganismo
puede tener efectos sobre la disminución de la incidencia de caries dentales en ratas (Tzu &
Tzu, 2014).
Además de esto, Lactobacillus paracasei sp. ha logrado inducir un mejor estado de alerta
en el sistema inmune de su hospedero, reducir síntomas de estreñimiento, inhibir el
crecimiento de patógenos presentes en alimentos como Yersinia enterocolitica y presentar
actividad antiproliferativa en células cancerígenas gástricas y actividad anti inflamatoria
(Lavermiocca et al., 2016). Más aún, este microorganismo ha demostrado actividad
antidiabética en ratas, reduciendo la resistencia a la insulina; dicha actividad podría estar
asociada a una reducción de lipopolisacáridos en el sistema circulatorio, así como a una
reducción de la inflamación inducida por lipopolisacáridos (Szu et al., 2016).
Por otro lado, se ha evidenciado la producción de sustancias antimicrobianas por parte de
Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6, las cuales han logrado actuar sobre bacterias
patógenas tanto Gram positivas como Gram negativas y esporas, así como en hongos, aunque
en estos últimos con menor magnitud. Dichas sustancias antimicrobianas han mostrado
resistencia ante tratamientos térmicos y degradación enzimática digestiva y evidencian aún
mejores efectos que con agentes antimicrobianos comerciales como la nisina (Miao et al.,
2015).
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Específicamente para la cepa CRL 431 ®, se ha evidenciado que mejora la función
inmunológica al aumentar las respuestas a nivel de mucosas, otorga protección sistemática
de las células contra infecciones virales al aumentar la producción de anticuerpos
neutralizantes de virus, permite controlar la persistencia de diarrea en niños y el
sobrecrecimiento bacteriano asociado a diarrea crónica. Además, mejora la digestión de la
lactosa, influye en el tiempo de tránsito orocecal y disminuye los síntomas de intolerancia en
personas intolerantes a la lactosa. Por otro lado, puede ser utilizado en aplicaciones clínicas
para la prevención de desórdenes gastrointestinales y su uso es sugerido para la prevención
de diarrea en niños de poblaciones de alto riesgo (CHR- Hansen, 2014).
3.1.1.5. Uso de probióticos en el desarrollo de productos
Actualmente los consumidores y las empresas están demostrando interés en ampliar el
espectro de alimentos con probióticos para distintos mercados y se ha logrado incorporar
Lactobacillus paracasei sp. y otros probióticos en diferentes fuentes vegetales y bebidas
(Lavermiocca et al., 2016; Vargas, 2015)
Es importante mencionar que la matriz alimentaria utilizada es de gran importancia
para la estabilidad del cultivo probiótico, sin embargo, se considera que la dieta puede
representar una mayor causa de variación en dicha estabilidad, más que la propia matriz
alimentaria en la que se encuentre presente el cultivo probiótico (Ouwehand & Röytiö, 2015).
Se han realizado productos con adición de probióticos utilizando como matriz alimentaria
jugos de frutas, lo cual ha representado un reto principalmente por su bajo pH y la presencia
de algunos compuestos antimicrobianos presentes en las frutas, tales como los antocianos
(Ouwehand & Röytiö, 2015). Al momento de adicionar cultivos probióticos a alimentos para
que estos ejerzan efectos funcionales sobre el organismo, es importante hacerlo de manera
que estos microorganismos logren realizar dichas funciones al momento de consumo, por lo
tanto, deben tomarse en cuenta distintos aspectos al desarrollar productos con probióticos,
para garantizar su sobrevivencia y actividad.
Uno de los factores por tomar en consideración corresponde al estado fisiológico de estos
microorganismos, lo cual es dado por su fase de crecimiento. Además, debe tomarse en
19
cuenta la concentración del mismo al momento del consumo, ya que se ha observado que
diversos productos no logran mantener viable la población de bacterias probióticas durante
su vida útil (Rivera & Gallardo, 2010). Según lo que se ha encontrado en diversas
investigaciones, los probióticos deben estar en concentraciones a partir de 106 UFC/mL al
momento del consumo para que puedan producir realmente efectos beneficiosos para la salud
(Mushtaq, 2016; Shori, 2015).
Por otro lado, las condiciones fisicoquímicas juegan un papel preponderante en relación
con la sobrevivencia y actividad de los probióticos, ya que se ha visto que la temperatura, el
pH, la actividad de agua, concentración de carbono, nitrógeno, minerales y el contenido de
oxígeno pueden afectar el desempeño de estos microorganismos de una u otra manera; se ha
encontrado que en jugos de frutas, por ejemplo, las condiciones óptimas de crecimiento se
encuentran entre 35-40 ºC y a un valor de pH de 6,4-4,5 (Rivera & Gallardo, 2010).
Actualmente existe un elevado interés en desarrollar jugos de frutas adicionados con
probióticos, principalmente por los perfiles de sabores que poseen, además de ser apetecibles
para personas de todas las edades, porque son percibidos como alimentos saludables, aunque
en algunos casos los probióticos pueden generar características sensoriales no deseadas por
ciertos consumidores (Rivera & Gallardo, 2010). A pesar de esto, numerosas investigaciones
indican que se espera que, por motivos de aceptación del consumidor, los productos lácteos
sigan siendo los principales alimentos utilizados como vehículos para probióticos, y que,
además, hay potencial para utilizar nuevas cepas en productos que se vayan a introducir en
el mercado (Ouwehand & Röytiö, 2015).
En la elaboración de bebidas con cultivos probióticos es recomendable utilizar sustratos
como oligosacáridos, inulina, lactulosa u oligofructosa por ejemplo, que pueden actuar como
prebióticos (Rastall, 2010), lo que permitiría aumentar la viabilidad del microorganismo
durante el procesamiento y el almacenamiento. Esto debido a que estos compuestos se
encuentran disponibles para ser metabolizados por el probiótico, que los utilizaría como
sustrato, sirviendo como una fuente de carbono que puede proteger al probiótico de
ambientes ácidos. Además, el uso de un fructooligosacárido, como la oligofructosa, puede
tener un efecto positivo sobre la generación de aromas y texturas en el producto y puede
20
proveer un efecto beneficioso para la salud al inhibir el crecimiento de patógenos a nivel
intestinal, aumentar la absorción del calcio y aliviar el estreñimiento. Asimismo, como en el
agua de coco la fructosa es uno de los azúcares que se encuentra en mayor concentración, el
sabor que otorga la oligofructosa puede que no genere cambios significativos de acuerdo con
este atributo, según lo que se ha podido evaluar en otros estudios (Pimentel et al., 2015).
El panorama para los productos frutales con adición de probióticos es promisorio,
principalmente por la capacidad de estos para tolerar ambientes ácidos, aunque siempre se
recomienda utilizar empaques que actúen como buena barrera contra condiciones externas
adversas que afecten la estabilidad del microorganismo en el producto final (Rivera &
Gallardo, 2010).
3.2. Agua de coco
Se conoce como agua de coco al líquido dulce y refrescante que se obtiene del interior
del coco (Prades et al., 2012). Debido a que no es tan extensivo como otros cultivos, el agua
de coco puede ser considerada como una bebida exótica, en especial para aquellas personas
que habitan en zonas lejanas al área de producción, que además de ser una bebida tropical,
es utilizada como medicamento, medio de crecimiento de microorganismos y hasta como
regalo en ceremonias de distintas culturas y puede también ser procesado para hacer vinagre
y vino (Prades et al., 2012).
3.2.1. Composición del agua de coco
La composición del agua de coco puede variar según su etapa de maduración, la
variedad de la planta, así como las condiciones de cultivo (Prades et al., 2012). En la literatura
se menciona que el contenido de agua de coco que se puede obtener de cada fruto ronda entre
15% a 30% de su peso, y se pueden obtener cerca de 300 mL, aunque varía de acuerdo con
distintos factores (Prades et al., 2012).
En comparación con otros jugos de frutas, el peso seco de un coco maduro es muy
bajo, ya que se encuentra entre 5% y 6%, contra 12% a 15% en jugo de manzana, por ejemplo.
21
Aunque este fruto contiene proteínas, sales y aceites, uno de sus componentes principales
corresponde a azúcares solubles, y, aun así, posee un valor calórico que ronda las 44 kcal/L
(Prades et al., 2012).
Entre los azúcares principales que se encuentran en el agua de coco destacan:
sacarosa, sorbitol, glucosa y fructosa, con presencia de otros azúcares minoritarios como la
galactosa, xilosa y manosa (Prades et al., 2012); dichos azúcares son importantes ya que
actúan como fuente de energía para el organismo (Prabhakar & Mohana, 2014).
En segundo lugar en proporción, en el agua de coco se encuentran los minerales, entre
los que destaca el potasio como el principal, y aunque solamente representan entre 0,4% a
1% de la composición del agua de coco, son suficientes para otorgarle sus propiedades
isotónicas (Prades et al., 2012). Además de potasio, el agua de coco también contiene sodio,
magnesio, fósforo, calcio, hierro, cobre, sulfuro y cloruros (Prabhakar & Mohana, 2014).
En relación con los aminoácidos presentes, destacan: alanina, arginina, cisteína y
serina, entre otros. Algunos de estos aminoácidos junto con la fibra dietética sirven para
regular la absorción de azúcares y aumentar la sensibilidad a la insulina (Prabhakar &
Mohana, 2014). Asociado a estos aminoácidos, el contenido proteico del agua de coco se
relaciona estrechamente con la presencia de enzimas como la polifenoloxidasa y la
peroxidasa, las cuales están involucradas en el cambio de coloración que ocurre en el agua
de coco (Prades et al., 2012).
Asimismo, el agua de coco también contiene vitamina C, que aunque no se encuentra
en cantidades tan elevadas como en otras frutas, sí es suficiente como para prevenir la
oxidación durante un período determinado, además de tener vitaminas del complejo B
(Prades et al., 2012); estas últimas son necesarias como coenzimas para reacciones
enzimáticas esenciales para la función de las células, además están asociadas a una reducción
del riesgo de contraer cáncer de mama y pueden prevenir la toxicidad inducida por el metanol
en las mitocondrias (Prabhakar & Mohana, 2014).
Por otro lado, el agua de coco también contiene compuestos aromáticos, tal como los
ácidos orgánicos, entre los que se pueden encontrar: ácido málico, succínico, cítrico, acético
22
y tartárico, los cuales son en gran parte responsables del sabor y aroma de la misma (Prades
et al., 2012).
3.2.2. Propiedades y beneficios del agua de coco
Debido a su composición, el agua de coco, o agua de pipa como se le conoce en Costa
Rica, tiene numerosas propiedades y otorga gran variedad de beneficios al organismo. Es
importante mencionar que la mayoría de dichas propiedades se deben a los compuestos
minoritarios que se encuentran en ella, tales como los minerales, compuestos aromáticos
volátiles, polioles y péptidos (Prades et al., 2012).
Una de las características del agua de coco es que, gracias a su nutritiva composición,
puede llegar a ser un excelente medio de cultivo para bacterias probióticas, en las que, en
algunos casos, pueden crecer aún mejor que en medios de cultivo especializados como MRS
(Rivera & Gallardo, 2010).
En relación con los efectos que pueda tener en el organismo, se asocia el agua de coco
con el tratamiento de la diarrea y con propiedades antioxidantes, cardioprotectoras,
antitrombóticas, antiateroscleróticas, hipolipidémicas, anticolecistíticas, antibacteriales,
antivirales, antifúngicas, antiprotozoarias, anticancerígenas, inmunoestimuladoras,
antidiabéticas, hepatoprotectoras, así como también presenta propiedades con funciones
similares a las que realizan las hormonas (Camargo et al., 2015). Además, el agua de coco
se ha utilizado para combatir la gastroenteritis, disolver piedras en el tracto urinario, eliminar
infecciones en la vejiga y hasta como hidratante intravenoso de corto tiempo (Prabhakar &
Mohana, 2014), lo cual puede ser muy útil para condiciones de emergencia, aunque no
sustituye a los sueros diseñados especialmente para esto (Prades et al., 2012).
Más aún, el potasio y el magnesio se encuentran asociados con la reducción de la
presión sanguínea, e incluso gracias a esto, la FDA (Food and Drug Administration) permite
declarar que el agua de coco puede reducir el riesgo de tener alta presión sanguínea e infarto
(Prabhakar & Mohana, 2014).
En la literatura se menciona que también el agua de coco contiene fitohormonas que
actúan como factores promotores del crecimiento, entre ellas las citoquinas. Más allá de su
23
función en el crecimiento vegetal, se destaca que, en el ser humano, algunas de estas
fitohormonas pueden tener efectos de antienvejecimiento de la piel y reducen el riesgo de
contraer enfermedades degenerativas (Prabhakar & Mohana, 2014; Prades et al., 2012).
Además, estas han sido asociadas con actividad anti-trombótica, y con capacidad para reducir
ciertos tipos de tumores mamarios (Prades et al., 2012).
Además de esto, se ha evaluado que el agua de coco podría tener péptidos con
propiedades bactericidas, lo cual podría ser muy útil para desarrollar antibióticos novedosos
a partir de fuentes naturales (Prades et al., 2012).
Por otro lado, la composición y el contenido de azúcar del agua de coco, hacen que
esta sea una bebida isotónica natural y funciona como bebida rehidratante y refrescante,
recomendada como bebida para deportistas por su contenido de electrolitos y minerales y
además de esto, es baja en calorías y grasa (Mahnot et al., 2014; Prades et al., 2012).
Más aún, la presencia de L-arginina en el agua de coco podría otorgarle propiedades
cardioprotectoras debido a la producción de óxido de nitrógeno, que puede favorecer la vaso-
relajación. Además, se ha encontrado en estudios con animales también que podría tener
efectos hipolipidémicos (Prades et al., 2012).
En relación con los efectos nutracéuticos del agua de coco, se han obtenido
reducciones de cambios histopatológicos en el cerebro, los cuales son inducidos por el
desbalance hormonal en mujeres con menopausia (Prades et al., 2012).
3.2.3. Preservación del agua de coco
En cuanto a la preservación del agua de coco, se sabe que esta se deteriora rápidamente
por contaminación microbiana y por oxidación, por lo que pierde sus características
sensoriales y nutricionales en gran parte (Mahnot et al., 2014). Además, se sabe que los jugos
de frutas en el almacenamiento se encuentran sujetos a degradación de propiedades
fitoquímicas y cambios en color, textura y apariencia (Laorko et al., 2013). Por esto es
necesario encontrar una manera de preservar el producto para alargar su vida útil.
24
En muchos casos el agua de coco se trata térmicamente mediante el procesamiento de
alta temperatura por corto tiempo y ultra alta temperatura (HTST y UHT por sus siglas en
inglés, respectivamente), con lo que a pesar de que se obtiene una vida útil prolongada, se
tiende a disminuir su contenido nutricional y además se destruye completamente su aroma
natural, lo cual no sucede con las técnicas no térmicas (Mahnot et al., 2014; Prabhakar &
Mohana, 2014). Debido a las razones anteriormente mencionadas, se recomienda que para
preservar el agua de coco con sus aromas y nutrientes se utilice una técnica de preservación
no térmica (Prabhakar & Mohana, 2014).
3.3. Tecnología de membranas
La microfiltración con membranas es un proceso amigable con el ambiente, en
comparación con otros métodos convencionales, con bajo consumo energético, factible para
escalar y con la capacidad de aumentar la vida útil de los productos (Yin et al., 2015), que
surge como solución a la necesidad de producir jugos libres de aditivos, de alta calidad y con
sabor fresco (Cardoso de Oliveira et al., 2012).
Debido a esto, puede considerarse como una buena alternativa el uso de la tecnología de
membranas, ya que esta permite reducir las pérdidas nutricionales y de cualidades
funcionales asociadas a la aplicación de tratamientos térmicos. Asimismo, ha sido
exitosamente aplicada e introducida para la producción comercial de alimentos líquidos
como los jugos (Laorko et al., 2013), además de que se ha evidenciado que es posible
esterilizar el agua de coco con técnica de microfiltración no térmica (Mahnot et al., 2014).
Aunado a esto, esta tecnología permite obtener productos de alta calidad, con sabor natural
fresco y libres de aditivos y permite escalar el proceso fácilmente y puede ser catalogado
como de bajo consumo energético (Laorko et al., 2013).
En la microfiltración de jugos se han utilizado sistemas de filtración en dos etapas para
lograr una primera separación de partículas que facilite la filtración en la segunda etapa, y
con un envasado en botellas de plástico, sustituyendo el espacio de cabeza con nitrógeno y
con almacenamiento a 4 ºC (Mahnot et al., 2014). Además, como es importante mantener la
esterilidad del producto, en algunos casos el envasado del agua de coco se ha realizado en
25
sistemas de envasado aséptico, como en cámaras de flujo laminar (Mahnot et al., 2014). Para
efectos de producción a mayor escala y bajo costo, debe encontrarse una manera de lograr
esta esterilidad, sin la necesidad de recurrir a un sistema de envasado aséptico industrial.
Los aditivos pueden ser de gran importancia para disminuir el deterioro en el agua de
coco procesada (Mahnot et al., 2014). En relación con la vida útil que podrían presentar
bebidas similares, según lo que se reporta en la literatura, usando microfiltración con adición
de ácido ascórbico se ha logrado preservar agua de pipa de coco tierno durante 21 días en
condiciones de refrigeración (Mahnot et al., 2014). En otros casos, en diferentes estudios se
ha agregado ácido cítrico, ácido ascórbico y L- cisteína y se ha obtenido una vida útil de 46
días (Mahnot et al., 2014). Por último, para jugo de manzana adicionado con probióticos se
ha logrado establecer una vida útil de 14-28 días en almacenamiento a 4 ºC, hasta que la
carga del mismo estuvo por debajo de la carga mínima recomendada (Pimentel et al., 2015).
3.4. Mediciones fisicoquímicas en el análisis de bebidas
La evaluación de las propiedades fisicoquímicas es necesaria ya que permite comprobar
que el producto mantiene a lo largo de su vida útil, características similares a las que presenta
en el momento de elaboración (Pimentel et al., 2015). Entre los principales análisis que se
realizan en bebidas semejantes a las de este estudio se encuentra el pH, la acidez, los sólidos
solubles como ºBrix y la turbidez (Pimentel et al., 2015).
La turbidez corresponde a la proporción entre la intensidad de luz incidente y la
intensidad de luz dispersada, en este caso, por el cultivo microbiológico (Métris et al., 2003).
El uso de este método es favorable debido a que los sistemas automatizados de medición de
turbidez permiten obtener numerosos datos, lo cual beneficia el análisis estadístico de los
mismos (Métris et al., 2003). La medición de turbidez es importante ya que es una
característica relevante para la aceptación de una bebida por parte de los consumidores, la
cual generalmente representa un problema para jugos clarificados (Pimentel et al., 2015).
Para estudios de bebidas con adición de probióticos puede ser muy valioso utilizar la
turbidez como parámetro de medición, ya que diversos estudios han logrado identificar una
relación entre la turbidez de una muestra con la carga microbiológica del mismo (Métris et
26
al., 2003; Power & Nagy, 1999). Esto es posible ya que cuando la concentración del
microorganismo es elevada (entre 106 y 107 UFC/mL), la turbidez se comporta de acuerdo
con la ecuación (1) establecida en la Ley de Beer, que relaciona la absorbancia con la
concentración de un analito (Skoog et al., 2008), lo cual indica que la turbidez es
proporcional a la concentración de células presentes.
(1) A=-log T= log (P0/P) = εbc
Sin embargo, este rango de proporcionalidad depende del tamaño, la forma, la especie e
incluso la cepa utilizada, y, además, al ser tan limitado, en muchos casos este método podría
ser inexacto para determinar el crecimiento microbiológico (Métris et al., 2003). Además,
debe asegurarse que no se esté excediendo el límite de turbidez al hacer el estudio, ya que, si
se supera este punto, la turbidez deja de presentar correlación con la carga microbiológica
(Power & Nagy, 1999).
3.5. Investigación cualitativa de mercado
En la investigación cualitativa la recolección de información se realiza con frecuencia de
manera no estructurada, lo que implica que la obtención de datos se completa según las
circunstancias, considerando tanto el contacto con las personas, así como las situaciones. Por
esta razón es recomendable que sea un proceso flexible, con el fin de poder obtener la
información deseada (Sandoval, 2002).
La investigación depende de la relación que logre establecer el investigador con las
personas individuales o bien, el grupo, dependiendo de la finalidad de dicha investigación
(Sandoval, 2002).
Los métodos cualitativos deben partir de lo más general, para generar fluidez en el
proceso y aumentar la confianza por parte de los participantes para que se expresen
libremente; las preguntas posteriores estarán planteadas en función de lo que se ha
establecido con las respuestas derivadas de la pregunta o tema inicial. Sin embargo, es
necesario contar con una guía, que, de igual manera, no debe seguirse con rigidez (Sandoval,
2002).
27
Para recolectar la información, debe considerarse que la fuente de esta debe provenir de
aquellas personas que puedan aportar la información más útil para la finalidad de la
investigación y debe garantizarse que se cuente con datos suficientes para poder obtener la
información deseada (Sandoval, 2002).
Al realizar investigación cualitativa es necesario que se lleve a cabo en el lugar adecuado
y con una estrategia que le permita al investigador obtener los datos buscados, al posicionarse
socialmente dentro del grupo de interés (Sandoval, 2002).
3.5.1. Grupos focales como técnica de investigación cualitativa
Una de las estrategias más utilizadas en la actualidad, principalmente asociadas a estudios
de mercadeo, es la entrevista de grupo focal, principalmente por su carácter colectivo
(Escobar & Bonilla, 2009), lo cual está relacionado con el hecho de que el género, la edad y
el lugar de residencia ya no son parámetros suficientes como para proveer información
adecuada del mercado. Por eso la segmentación por conducta y por estilo de vida cada vez
son más utilizados en mercadeo (Szakály, 2012).
Esta metodología se puede definir como “técnicas de recolección de datos mediante una
entrevista grupal semiestructurada, la cual gira alrededor de una temática propuesta por el
investigador” que tiene como finalidad principal obtener manifestaciones de los
participantes, asociadas a sentimientos, actitudes, creencias, experiencias y reacciones de los
mismos (Escobar & Bonilla, 2009). Su nombre se deriva de su enfoque en pocas temáticas o
problemas y, además, el grupo es conformado por participantes que poseen alguna
característica en común deseada, y generalmente se busca que sean entre seis y ocho personas
(Sandoval, 2002).
El eje central de las sesiones de grupos focales corresponde a la interacción que se
presenta dentro del grupo, de acuerdo con el tema propuesto por el investigador (Escobar &
Bonilla, 2009). Esto se relaciona con la dinámica social que se desarrolla entre los
participantes y que es relevante al analizar los resultados obtenidos (Escobar & Bonilla,
2009), principalmente porque se obtiene un efecto sinérgico de esas reacciones generadas al
existir una interacción de grupo (Rabiee, 2004).
28
Una particularidad de una sesión de grupo focal es que es semiestructurada, ya que
aumenta su aprovechamiento conforme avanza el proceso y puede ser reorientada de acuerdo
con lo que se ha planteado durante la sesión. Además, al aplicar este tipo de técnicas es
necesario establecer un presupuesto y tiempo disponible, determinar la cantidad de grupos
que se desean evaluar, determinar el nivel en el que el moderador debe involucrarse durante
la sesión, además de decidir el tamaño de los grupos y las características que deben poseer
los participantes de las mismas (Sandoval, 2002).
Para realizar una investigación exitosa con la técnica de grupos focales debe cubrirse un
rango máximo de temas de interés, en el que se obtengan los datos más específicos posibles,
y se profundice en los sentimientos de los participantes, contemplando el contexto de cada
uno al dar su opinión acerca de un tema determinado (Sandoval, 2002).
Esta técnica de investigación cualitativa puede ser muy beneficiosa cuando se deben
generar ideas para estrategias publicitarias, así como para posicionar un producto en el
mercado y para obtener información asociada a la percepción del consumidor sobre
diferentes aspectos (Escobar & Bonilla, 2009).
Además de esto, los grupos focales presentan distintas ventajas, entre las que sobresale
que es una técnica que permite obtener opiniones por parte de personas que creen no tener
nada que mencionar sobre un tema, las opiniones que se generen durante la sesión pueden
producir diferentes reacciones que enriquecen la investigación y se pueden abordar temas
que no fueron planificados, de acuerdo con lo que plantean los participantes (Escobar &
Bonilla, 2009). Otra capacidad que poseen las sesiones de grupos focales es que permiten
evidenciar diferencias entre grupos de personas que comparten ciertas características
(Rabiee, 2004). Por otro lado, esta técnica permite tener resultados con mayor rapidez y con
menor costo que otras metodologías (Escobar & Bonilla, 2009).
Un tema importante de mencionar es el tamaño de los grupos de cada sesión, el cual
depende del nivel de profundidad que desea el investigador (Escobar & Bonilla, 2009).
Debido a esto es que existen las técnicas de mini grupos focales, en los que en algunos casos
se plantea que pueden estar compuestos por cuatro a seis personas (Krueger & Cassey, 2014).
Este tipo de sesiones puede ser de gran utilidad ya que facilita el proceso de reclutamiento
29
de los participantes y además permiten generar un ambiente de mayor confianza entre los
participantes (Krueger & Cassey, 2014). Además, los mini grupos focales son funcionales
cuando es necesario profundizar sobre las experiencias de los participantes, lo cual no es tan
sencillo cuando el número de participantes aumenta (Dilshad & Latif, 2013), ya que con
pocos participantes se permite la exploración profunda de diferentes argumentos con
mayores posibilidades de intercambio de experiencias y puntos de vista. Además, se
recomienda que tengan una duración entre una hora y dos horas (Escobar & Bonilla, 2009).
De acuerdo con lo que se reporta en la literatura sobre investigaciones cualitativas
asociadas con productos funcionales, se ha visto que estos alimentos son mercadeados hacia
grandes subgrupos de la población total dependiendo de las necesidades del consumidor
(Eussen et al., 2011). Para esto es necesario conocer cuáles son dichas necesidades y también
cuál es el conocimiento del consumidor sobre los mismos (Godnic, 2007). Muchas de estas
necesidades se encuentran asociadas al estilo de vida de los mismos, considerando esto como
la relación entre la personalidad del individuo y su entorno, y se asocia con el nivel
económico, el lugar de residencia y dónde gastan su dinero e invierten su tiempo (Szakály,
2012). Por esta razón, es fundamental reclutar participantes que compartan dichas
características, con el fin de tener grupos más homogéneos de consumidores en cada sesión.
Se ha encontrado además una estrecha relación entre los consumidores que se preocupan
por su salud, lo cual implica que consideran importante el ejercicio, la salud psíquica, higiene,
evitan el consumo de drogas recreacionales y realizan escogencias conscientes de la dieta
(Szakály, 2012). Por esta razón se ha visto que es fundamental comunicar a los consumidores
enérgicamente los beneficios a la salud (Godnic, 2007).
Además, entre otras cosas que la investigación cualitativa evidencia acerca de los
alimentos funcionales, es que no se debe comprometer el sabor, el consumidor debe obtener
una conveniencia óptima, el producto debe tener adecuada disponibilidad en tiendas, deben
ser productos seguros y eficaces, con precio aceptable y que generen confianza. Esto se logra
contando con el apoyo de diferentes fuentes, incluyendo líderes de opinión científica y un
claro marco regulatorio para realizar declaraciones en el producto (Godnic, 2007).
30
4. Materiales y métodos
4.1. Localización del proyecto
El proyecto se llevó a cabo en los Laboratorios de Microbiología y Química y en la planta
piloto del Centro Nacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos (CITA), así como en el
Laboratorio de Análisis Sensorial del CITA, ubicados en la sede Rodrigo Facio de la
Universidad de Costa Rica, en San Pedro de Montes de Oca, San José.
4.2. Materias primas
- Agua de pipa
Se utilizó agua de coco fresca con pH entre 5 y 6 y 5,5 a 6,0 ºBrix, extraída en la planta
piloto del CITA a partir de pipas adquiridas en el Mercado del Mayoreo localizado en la
provincia de San José y compradas a productores de la zona de Guápiles de Pococí.
- Ácido ascórbico
Se adicionó ácido ascórbico del proveedor Shandong Luwei Pharmaceutical Co., Ltd, el
cual funciona como antioxidante en el agua de pipa, a una concentración de 250 ppm.
- Cultivo probiótico
Se empleó el cultivo probiótico comercial liofilizado Lactobacillus paracasei subsp.
paracasei (cepa CRL431®) de la marca CHR-Hansen, el cual se almacenó a -18 °C,
evaluando una concentración de 1% y 3% de inóculo en la bebida microfiltrada.
- Azúcar
Para formular los medios de fermentación para el cultivo probiótico, se utilizó azúcar
comercial marca Doña María, a una concentración de 5% (m/v).
- Extracto de levadura
Para la formulación de los medios de fermentación, se usó extracto de levadura de la
marca OXOIDTM, calidad reactivo, a una concentración de 0,5% (m/v); el extracto se
encuentra en polvo y se almacenó a temperatura ambiente.
31
4.3. Procesamiento para la producción de una bebida de agua de coco microfiltrada
con adición de probióticos
A continuación, se presenta el diagrama de bloques que corresponde al procesamiento de
la bebida de agua de coco microfiltrada con adición de probióticos, el cual se puede ver en la
Figura 1, desarrollado a partir de los resultados obtenidos en pruebas preliminares y los
reportados por Vargas (2015).
4.3.1. Descripción de las etapas de procesamiento
- Selección
La selección de los cocos se llevó a cabo mediante una inspección visual y considerando
las propiedades sensoriales como el aroma, para detectar si presentan algún tipo de deterioro
físico o microbiológico que evidencie que el coco no es apto para consumo.
- Lavado
El lavado de los cocos se efectuó en una tina de acero inoxidable en la que se sumergieron
los cocos para extraer partículas indeseables y luego se lavaron con jabón utilizando una
esponja y se enjuagaron para eliminar el jabón.
- Desinfección
La desinfección se llevó a cabo en una tina de acero inoxidable por inmersión en el
desinfectante comercial Vortexx (solución concentrada de 1300 ppm a 2600 ppm de ácido
peracético) durante 5 min (Ecolab, s.f.).
- Extracción y tamizado
La extracción del agua de coco se realizó perforando el coco con un cuchillo y se hizo
pasar a través de un colador metálico para separar partículas sólidas gruesas y se depositó el
agua extraída en baldes de plástico.
32
Figura 1. Diagrama del procesamiento de agua de coco para la obtención de la bebida
de agua de coco microfiltrada adicionada con probióticos.
33
- Mezclado 1
El primer mezclado se realizó manualmente adicionando 250 ppm de ácido ascórbico
(Das Purkayastha et al., 2012) al agua de coco previamente extraída, el cual actúa como
antioxidante; este se mezcló utilizando una cuchara de acero inoxidable.
- Microfiltración
La etapa de microfiltración se aplicó utilizando un microfiltrador de tres membranas de
cerámica Membralox P19-60 de 16 canales de 6 mm de diámetro con diámetro promedio de
poro de 0,2 µm, con un área de filtración de 1 m2 conectadas en serie y con una membrana
de refuerzo con las mismas condiciones de las membranas acopladas en serie, pero con un
área de filtración de 0,33 m2. Esto con el objetivo retener cualquier partícula que se haya
podido fugar a través de los empaques de las membranas anteriores, a una temperatura
aproximada de 30 ºC.
- Adición de probiótico
La adición del cultivo probiótico se realiza utilizando una bomba peristáltica que bombea
el inóculo desde el reactor de plástico hasta el tanque de mezclado, mediante mangueras de
silicona con un dispositivo de acople a la tubería del tanque. Se adiciona el inóculo para
alcanzar una concentración de un 3% en la formulación de la bebida. El inóculo se prepara
según se detalla en la sección 4.5.3.
- Mezclado 2
El segundo mezclado se realiza en el tanque de acero inoxidable, en el que se adiciona el
inóculo al agua de coco microfiltrada; el burbujeo de nitrógeno durante aproximadamente 1
min permite que el producto se homogenice adecuadamente.
- Envasado
El envasado se realiza manualmente en la cámara de envasado ultralimpio en botellas de
plástico PET de 500 mL, que se encuentran sumergidas en una solución de ácido peracético
y se enjuagan con agua, previo al llenado.
34
- Almacenamiento
El producto se almacenó en condiciones de refrigeración a 4 ºC.
4.4. Descripción del equipo de microfiltración tangencial
A continuación, en la Figura 2 se muestra el equipo de microfiltración de tres membranas
de un tamaño de poro de 0,2 µm y 1 m2 de área de filtración con una membrana de refuerzo
con un diámetro promedio de poro de 0,2 µm. El equipo posee 0,33 m2 de área de filtración
y está acoplado a un sistema de envasado ultralimpio. En la sección 4.4.1. se describen en
detalle cada una de las partes del equipo señaladas con números del 1 al 24.
(a)
(b)
Figura 2. Equipo de microfiltración tangencial de tres membranas con membrana de
refuerzo acoplado a un sistema de envasado ultralimpio. (a) Sistema de
microfiltración (b) Sistema de mezclado y envasado.
35
4.4.1. Descripción del equipo de microfiltración tangencial acoplado al sistema de
envasado ultralimpio
1) Tanque de alimentación
Tanque de alimentación de acero inoxidable de 60 L utilizado para contener el
producto que será microfiltrado.
2) Bomba neumática
Bomba neumática utilizada para el llenado del equipo y permitir la presión necesaria
del producto en el equipo, mediante bombeo del producto desde el tanque de alimentación
hasta la tubería del equipo.
3) Manguera de alimentación
Manguera de teflón que permite el trasiego desde la bomba neumática hasta la tubería
del equipo, para llenar el equipo con el producto.
4) Bomba centrífuga
Bomba centrífuga de acero inoxidable utilizada para dar la velocidad interna del
producto, necesaria para permitir el proceso de microfiltración tangencial.
5) Intercambiador de calor
Intercambiador de calor que permite regular la temperatura del producto mediante
calentamiento con vapor o circulación con agua de enfriamiento.
6) Membranas de microfiltración
Membranas de microfiltración cerámica de alúmina zirconio marca Membralox P19-
60 de 16 canales de 6 mm de diámetro, acopladas en serie con tamaño de poro de 0,2 µm
y un área total de filtración de 1 m2.
7) Purga
Manguera que permite la salida del aire que se encuentra en las tuberías del equipo.
36
8) Medidor de flujo
Sistema digital que permite conocer la cantidad de litros por hora que están siendo
microfiltrados.
9) Membrana de refuerzo
Membrana de microfiltración de cerámica de 16 canales de 6 mm de diámetro
cerámica de alúmina zirconio marca Membralox P19-60, con tamaño de poro de 0,2 µm
con un área de superficie filtrante de 0,33 m2.
10) Tanque de mezclado 1
Tanque de acero inoxidable con capacidad de 60 L.
11) Tanque de mezclado 2
Tanque de acero inoxidable con capacidad de 100 L, con sistema de enfriamiento y
entrada adicional para adición de inóculo o inyección de nitrógeno.
12) Salida de retenido
Manguera de plástico PVC que permite la salida del producto retenido.
13) Entrada de inoculación
Entrada de acero inoxidable acoplada a la manguera del fermentador y al tanque de
mezclado 2.
14) Fermentador
Recipiente tipo carboy de plástico de 5 L con filtro de aire, manguera de toma de
muestra y manguera de salida del inóculo.
15) Cámara de envasado ultralimpio
Cámara de acero inoxidable que contiene una solución de ácido peracético
(concentración de 270 ppm) para desinfección de los envases. Presenta un sobre de vidrio
temperado de seguridad.
37
16) Lámpara ultravioleta
Lámpara de luz ultravioleta necesaria para mantener la esterilidad dentro de la cámara
de envasado ultralimpio.
17) Dispensador de producto
Dispensador mecánico de acción manual que permite la salida del producto para el
envasado del mismo.
18) Boquilla de agua para enjuague
Boquilla por la que sale agua clorada filtrada que permite enjuagar el ácido peracético
contenido en las botellas de plástico PET de 500 mL.
19) Llaves de paso
Llaves de paso de esfera que permiten la circulación del producto y el cierre de las
tuberías respectivas.
20) Filtros de aire y de agua
Filtros que permiten la separación de impurezas contenidas en el nitrógeno que
ingresa al tanque de mezclado 2, a la tubería de filtrado previo a la membrana de refuerzo
y a la cámara de envasado ultralimpio, así como un filtro culinario para separar impurezas
contenidas en el vapor utilizado en la esterilización de los tanques de mezclado. Además,
se utilizan filtros de polipropileno hilado con cloro para la purificación del agua que se
utiliza en el enjuague de los envases.
21) Cilindro de nitrógeno y manguera de alimentación de nitrógeno
Cilindro que contiene el nitrógeno necesario para mezclar el producto en el tanque de
mezclado 2, crear la atmósfera modificada en dicho tanque y en la cámara de envasado
ultralimpio, así como para permitir la expulsión del producto residual en la membrana de
refuerzo, con la respectiva manguera que se acopla a los filtros de aire para alimentar el
nitrógeno.
38
22) Entrada de vapor
Manguera y tubería de trasiego del vapor proveniente de la caldera.
23) Salidas de condensados
Mangueras de salida de condensado producido por el vapor de esterilización y de
calentamiento del intercambiador de calor.
24) Mangueras de agua de enfriamiento
Mangueras de PVC que permiten la entrada y retorno del agua utilizada en el sistema
de enfriamiento.
4.5. Pruebas preliminares
4.5.1. Definición de las condiciones de proceso para la elaboración a escala semi-
industrial de agua de coco microfiltrada adicionada con probióticos
Se realizaron múltiples pruebas de procesamiento de agua de pipa en el equipo de
microfiltración semi-industrial y de acuerdo con los resultados de recuento total aerobio (por
triplicado) y de mohos y levaduras (por duplicado), se implementaron mejoras en el equipo
de manera que se lograra su adecuado funcionamiento. Esto para producir exitosamente una
bebida de agua de coco microfiltrada adicionada con probióticos con un recuento de 106
UFC/mL que cumpliera lo exigido por la reglamentación vigente (RTCA, 2010).
4.5.2. Definición del porcentaje de adición del inóculo
Se realizó la determinación del porcentaje de inóculo que debe ser adicionado al agua
de pipa para garantizar que, desde el primer día de producción, la bebida posee la carga de
probiótico establecida por el Reglamento Técnico Centroamericano para declarar probióticos
en la etiqueta del producto. Este procedimiento fue desarrollado efectuando pruebas de
adición de distintos porcentajes de inóculo en la bebida de agua de pipa microfiltrada. Es
importante destacar que para la primera concentración (1%) se montaron pruebas por
39
triplicado, sin embargo, por falta de recursos, la segunda concentración (3%) solamente se
realizó el montaje de una muestra.
4.5.3. Recuento de bacterias ácido lácticas durante la fermentación del inóculo
Se realizó por duplicado el recuento de bacterias ácido lácticas presentes en el
inóculo, durante 24 h de fermentación, con la composición utilizada por Vargas (2015), la
cual comprende una solución de agua de coco microfiltrada con 5% de sacarosa y 0,5% de
extracto de levadura añadidos y aproximadamente 0,02 g de probiótico por cada L de inóculo
preparado. Dichos componentes se agregaron a un recipiente plástico de 5 L, con filtro de
aire y entradas para la toma de muestra acoplada a una jeringa estéril y una manguera para la
inoculación en el equipo de microfiltración. El montaje del sistema de fermentación fue
llevado a cabo en una cámara de flujo laminar.
Al finalizar su preparación, se realizó la fermentación a una temperatura de 35 ºC sin
agitación. Se tomaron muestras cada 2 h durante las primeras 12 h de fermentación, y por
último se realizó una última toma de muestras a las 24 h de fermentación. Cada una de las
muestras se montó mediante el procedimiento de recuento de bacterias ácido lácticas para
determinar la cantidad de UFC/mL. Se realizaron dos repeticiones a partir de agua
microfiltrada de coco proveniente de un mismo lote.
4.6. Pruebas definitivas
4.6.1. Pruebas de estabilidad microbiológica y carga del probiótico durante 28 días
de almacenamiento a 4 °C
4.6.1.1. Diseño experimental
Se utilizó un diseño irrestricto aleatorio con arreglo unifactorial cuyo factor
correspondió a la variable continua tiempo, con 5 niveles de medición (0 d, 7 d, 14 d, 21 d y
28 d), para un total de 5 tratamientos, con 3 repeticiones, utilizando como variable respuesta
el recuento de UFC/mL para cada análisis microbiológico.
40
Para esta prueba se realizaron análisis microbiológicos de recuento total aerobio,
bacterias ácido lácticas y mohos y levaduras para la bebida de agua de coco microfiltrada
adicionada con probióticos, cada 7 días durante 28 días de almacenamiento a 4 °C de acuerdo
con lo recomendado por Vargas (2015). Cada día de medición se analizaron tres botellas de
500 mL con el producto terminado, que pertenecen al mismo lote de producción, lo cual
funciona como réplicas para cada día de medición. Dichas pruebas se llevaron a cabo para
conocer si el producto no presentaba carga microbiana indeseada y además, para asegurar si
la carga del probiótico se mantenía en el recuento exigido por la reglamentación durante los
28 días de almacenamiento.
4.6.1.2. Análisis estadístico
Se realizó un análisis estadístico de regresión lineal con estimación con intervalo,
para determinar la carga de microorganismos presentes durante el tiempo de almacenamiento
de la bebida de agua de coco microfiltrada adicionada con probióticos.
El análisis de los datos se llevó a cabo con el paquete estadístico JMP 5.0.1.2. a un
nivel de significancia del 5%. Se llevaron a cabo tres repeticiones de este experimento.
4.6.2. Pruebas de propiedades físico- químicas en la bebida microfiltrada durante 28
días de almacenamiento a 4 °C
4.6.2.1. Diseño experimental
Se utilizó un diseño irrestricto aleatorio con arreglo unifactorial cuyo factor
correspondió a la variable continua tiempo, con 5 niveles de medición (0 d, 7 d, 14 d, 21 d y
28 d), para un total de 5 tratamientos, utilizando como variables respuesta el contenido de
sólidos solubles como grados Brix, pH, acidez titulable y turbidez.
Para esta prueba se realizaron las mediciones de las variables respuesta mencionadas
cada 7 días durante 28 días de almacenamiento a 4 °C. Cada día de medición se analizaron
tres muestras (tres botellas de 500 mL) y cada muestra se analizó por triplicado.
41
4.6.2.2. Análisis estadístico
Se realizó un análisis estadístico de regresión lineal con estimación con intervalo, para
determinar el valor de cada variable respuesta durante el tiempo de almacenamiento de la
bebida de agua de coco microfiltrada adicionada con probióticos.
El análisis de los datos se llevó a cabo con el paquete estadístico JMP 5.0.1.2. a un nivel
de significancia del 5%. Se realizaron tres repeticiones de este experimento.
4.6.3. Evaluación del producto por parte de consumidores potenciales en dos sesiones
de mini grupos focales
Se desarrollaron dos sesiones de mini grupos focales con mujeres entre 25 y 60 años, ya
que se ha establecido que ellas son las que generalmente escogen y se hacen cargo de la
compra de los alimentos en el hogar (Wattson, 2010). Además, las participantes debían ser
consumidoras de agua de pipa y bebidas saludables, lo que en principio debía permitir
analizar el concepto percibido del producto por los consumidores sobre la bebida de agua de
coco microfiltrada adicionada con probióticos, así como su empaque y etiqueta. Esto para
obtener una aproximación del impacto que este producto podría generar en las consumidoras.
4.7. Métodos de análisis
4.7.1. Análisis microbiológicos
4.7.1.1. Recuento total aerobio
Para el recuento de mesófilos aerobios totales se empleó la metodología establecida en el
procedimiento P-SA-MM-001 del CITA (2014a) y el método del Bacteriological Analytical
Manual (Maturin & Peeler, 2001) se realizó la determinación a tres muestras de la bebida
(tres botellas de 500 mL) escogidas al azar cada uno de los días de medición (0 d, 7 d, 14 d,
21 d y 28 d).
42
4.7.1.2. Recuento de bacterias ácido lácticas del cultivo Lactobacillus paracasei subsp.
paracasei (cepa CRL431 ®)
Para la determinación del microorganismo probiótico Lactobacillus paracasei subsp.
paracasei (cepa CRL431®), se siguió el método descrito por CHR-Hansen (2007) en su guía
para el recuento de bacterias probióticas y por el CITA (2012) y se realizó a tres muestras
(botellas de 500 mL) escogidas al azar cada 7 días durante 28 días de almacenamiento a 4
°C. El método emplea la técnica de esparcimiento en placa, utilizando como medio de cultivo
el agar MRS de la marca OXOIDTM.
4.7.1.3. Recuento de mohos y levaduras
El recuento de mohos y levaduras se llevó a cabo según lo establecido en el
procedimiento P-SA-MM-007 del (CITA, 2014b) y el método de la Norma Oficial Mexicana
(1994), con la modificación de que se montó la dilución 10-1 distribuyendo 1 mL de esta
dilución en tres placas con agar papa dextrosa acidificado, de manera que se vertió 0,3 mL,
0,3 mL y 0,4 mL en cada placa, respectivamente. El análisis se realizó a tres muestras
(botellas de 500 mL) escogidas al azar cada siete días durante 28 días de almacenamiento a
4 °C.
4.7.2. Análisis fisicoquímicos
4.7.2.1. Determinación de acidez titulable
La medición de acidez titulable se realizó mediante titulación directa con NaOH 0,1
mol/L con indicador de fenolftaleína, según el método establecido en el procedimiento P-
SA-MQ-011 del CITA (2014c) basado el en método 950.15 de la AOAC (2012) tomando
como referencia el contenido de ácido málico (Vargas, 2015), el ácido mayoritario en el agua
de pipa. Dicha medición se realizó por triplicado para cada una de tres muestras (botellas de
500 mL) escogidas al azar cada siete días durante 28 días de almacenamiento a 4 °C y se
reportó el resultado como el promedio de los valores obtenidos en las tres réplicas.
43
4.7.2.2. Determinación de pH
La medición del pH de las muestras se realizó utilizando un pH-metro, según el
método establecido en el procedimiento P-SA-MQ-012 del CITA (2014d) y el método
981.12 de la AOAC (2005). Dicha medición se efectuó por triplicado para cada una de tres
muestras (botellas de 500 mL) escogidas al azar cada siete días durante 28 días de
almacenamiento a 4 °C y se reportó el resultado como el promedio de los valores obtenidos
en las tres réplicas.
4.7.2.3. Determinación de turbidez
La medición de turbidez se realizó utilizando un turbidímetro HACH modelo 2100
AN disponible en la planta piloto. El equipo se encendió 1 h antes de su uso para lograr una
lectura certera. Una vez calibrado el equipo se procedió a llenar la cubeta de vidrio limpia y
seca con la muestra de agua de pipa microfiltrada adicionada con probióticos hasta la marca
correspondiente. Se agitó tres veces con movimientos suaves para evitar la formación de
burbujas. Seguidamente se insertó la cubeta en la celda y se esperó 30 s antes de tomar la
primera de tres lecturas realizadas cada 30 s. Los valores reportados se expresaron en
Unidades Nefelométricas de Turbidez (NTU por sus siglas en inglés). Dicha medición se
realizó por triplicado para cada una de tres muestras (botellas de 500 mL) escogidas al azar
cada siete días durante 28 días de almacenamiento a 4 °C y se reportó el resultado como el
promedio de los valores obtenidos en las tres réplicas.
4.7.2.4.Determinación de sólidos solubles como grados Brix
La medición de sólidos solubles se llevó a cabo mediante la medición de grados Brix
de la muestra para lo cual se utilizó un refractómetro de Abbé, con control de temperatura
según el método 932.12 de la AOAC (1999). Dicha medición se realizó por triplicado para
cada una de tres muestras (botellas de 500 mL) escogidas al azar cada siete días durante 28
44
días de almacenamiento y se reportó el resultado como el promedio de los valores obtenidos
en las tres réplicas.
4.7.3. Análisis cualitativo mediante mini grupos focales
Para realizar las sesiones de mini grupos focales se siguió lo establecido en el
“Screener para la selección de los participantes de las sesiones de mini- focus group” (ver
Anexo 1) y en la “Guía de sesiones para la aplicación de los mini grupos focales” (ver Anexo
2).
En estas sesiones se tomaron en cuenta diferentes puntos, similar a lo recomendado
por Escobar & Bonilla (2009), con algunas modificaciones, según se detalla a continuación:
- Establecimiento de los objetivos.
- Diseño de la investigación.
- Desarrollo del cronograma.
- Selección de los participantes.
- Selección del moderador.
- Preparación de preguntas de estímulo.
- Selección del sitio de reunión.
- Logística.
- Desarrollo de la sesión.
- Análisis de la información.
45
5. Resultados y discusión
5.1. Pruebas preliminares
5.1.1. Definición de las condiciones de proceso para la elaboración a escala semi-
industrial de agua de coco microfiltrada adicionada con probióticos
Con el objetivo de obtener satisfactoriamente una bebida de agua de pipa adicionada
con probióticos, se realizaron constantes mejoras en el equipo de microfiltración tangencial
a escala semi-industrial, de acuerdo con lo observado en distintas pruebas de producción de
esta bebida. Dichas mejoras efectuadas se muestran a continuación en el Cuadro I.
Cuadro I. Implementaciones realizadas en el equipo de microfiltración tangencial semi-
industrial para permitir la obtención de una bebida de agua de coco microfiltrada adicionada
con probióticos envasada en condiciones ultra-limpias.
Mejora Observaciones
Membrana de
refuerzo acoplada
antes del tanque de
mezclado.
Durante las primeras pruebas con el equipo de microfiltraciòn no se logró la
esterilidad del producto, evidenciado por problemas de turbidez en el producto
microfiltrado, lo cual se asocia principalmente a los empaques utilizados en la
tubería que podrían dar origen a micro fuga. Se decició acoplar una membrana
de 0,33 m2 de área de filtración, con poros de 0,02 µm de diámetro en la tubería
previa al tanque de mezclado, con lo cual se logró la esterilidad del producto.
Uso de nitrógeno
con acople de
filtros de aire.
Fue necesario acoplar filtros de aire con conexión a un tanque con nitrógeno
que permitiera realizar dichas funciones para aumentar el rendimiento del
proceso, así como crear una atmósfera modificada en la cámara de envasado,
para reducir el riesgo de crecimiento microbiológico y favorecer la etapa de
mezclado del inóculo y el agua microfiltrada con burbujeo. Con respecto al
mezclado, es necesario implementar un sistema mecánico de agitación para
obtener un producto más homogéneo.
Acople de tanque
especializado para
adición del inóculo
con un sistema de
enfriamiento.
Se identificó la necesidad de crear un sistema de adición del inóculo que
permitiera realizar esta acción en las condiciones de mayor esterilidad posible.
Para esto fue necesario instalar otro tanque, el cual posee una entrada para el
acople del fermentador en el tanque de mezclado y además implementar un
sistema de enfriamiento de manera que permitiera acelerar el proceso de
disminución de temperatura del tanque con el fin de acortar el tiempo de
procesamiento. También posee un filtro de aire al que se le acopla el tanque
de nitrógeno.
46
Cuadro I. Continuación.
Mejora Observaciones
Sistema de
esterilización.
Se identificó la necesidad de realizar simultáneamente la esterilización de los
dos tanques de mezclado que posee el equipo, por falta de una llave que
permita realizar la esterilización de cada tanque por separado y dado que la
instalación de dicha llave es complicada, ya que, si se realiza solamente la
esterilización del tanque en uso, podría haber una eventual contaminación por
parte del tanque secundario. La eficacia del proceso de esterilización se evaluó
mediante el análisis de bacterias aerobias mesófilas y de mohos y levaduras
en botellas de agua de pipa microfiltrada sin adición de probióticos (ver
Cuadro II y Cuadro III).
Lavado del
equipo.
Se consideró necesario acoplar una manguera en la salida del producto
terminado para realizar la recirculación de la solución de NaOH al 2% m/m y
de HNO3 al 1% m/m, de manera que se permitiera una limpieza profunda de
la tubería total del equipo. Además, se identificó la necesidad de realizar un
lavado general del tanque utilizando agua con cloro (500 ppm) para lograr la
eliminación de cualquier tipo de residuo de jugo presente en el tanque; esto ya
que la solución de NaOH al 2% m/m y de HNO3 al 1% m/m no llenan el tanque
por completo (llenar el tanque con dichas soluciones de limpieza puede
representar un gasto innecesario de recursos). Para realizar el lavado general
del tanque fue necesario agregar una entrada adicional al mismo, de manera
que permitiera realizar el lavado profundo.
Se puede observar en los Cuadros II y III que al realizar el lavado y la esterilización
del equipo se está logrando eliminar los microorganismos que podrían haber estado presentes
en el equipo de microfiltración. Esto dado que se obtuvieron dos resultados con recuentos de
mohos y levaduras con valores de 10 o menos UFC/mL.
A pesar de ser pruebas preliminares, para obtener resultados más confiables se
montaron muestras por triplicado y duplicado en cada análisis, respectivamente.
Cuadro II. Recuento de bacterias aerobias mesófilas en agua de pipa microfiltrada para
evaluar la eficacia de la etapa de desinfección del equipo de microfiltración con soluciones
de NaOH al 2%, HNO3 al 1% y cloro a 500 ppm.
Muestra Recuento UFC/mL AP1 <10 AP2 <10 AP3 <10
AP: agua de pipa microfiltrada
47
Cuadro III. Recuento de mohos y levaduras en agua de pipa microfiltrada para evaluar la
eficacia de la etapa de desinfección del equipo de microfiltración.
Muestra Recuento UFC/mL
AP1 1,0x101
AP2 <10
Es importante mencionar que para obtener la información presente en el Cuadro III,
se realizaron pruebas por triplicado, sin embargo una de las muestras fue descartada ya que
evidenciaba contaminación ajena al producto, lo cual sucedió probablemente al momento de
realizar el montaje de muestras.
Con base en estos resultados, se puede considerar que las membranas de
microfiltración sí logran retener los microorganismos presentes en el agua de pipa y además,
que el método de envasado en condiciones ultra limpias logra evitar una recontaminación
con microorganismos al realizar el llenado de las botellas. Esto indica que el montaje del
equipo presenta las condiciones deseadas para realizar la producción de la bebida de agua de
pipa microfiltrada adicionada con probióticos. A pesar de que una de las muestras presenta
crecimiento microbiológico, se considera que este podría ser debido a un error en la técnica
aséptica utilizada para realizar el recuento microbiológico.
5.1.2. Definición del porcentaje de adición inóculo
De acuerdo con lo establecido por Vargas (2015), para obtener la carga de probióticos
de 106 UFC/mL, establecida en la reglamentación vigente (RTCA, 2010), en la bebida de
agua de pipa microfiltrada elaborada a escala piloto, se debe adicionar el probiótico de
manera que se obtenga una concentración de 1% de inóculo en el producto microfiltrado. Sin
embargo, al emplear esta concentración a nivel semi-industrial no produjo los resultados
deseados, ya que, como se puede observar en el Cuadro IV, se obtuvo un recuento de <10
UFC/mL, por lo que se decidió realizar pruebas adicionando 3% de inóculo al agua de pipa
microfiltrada. Con este último porcentaje de inóculo, se logró obtener un recuento suficiente
que sí cumple con el mínimo requerido de probióticos establecidos por la reglamentación
respectiva.
48
Cuadro IV. Recuento de bacterias ácido lácticas en el producto final al adicionar dos
porcentajes distintos de inóculo al agua de pipa microfiltrada.
Día Concentración de inóculo (%) Recuento
(UFC/mL)
0 1 <10
3 1,28x106
Como la metodología del experimento a escala piloto realizado por Vargas (2015) es
distinta a la que se emplea en este caso en un experimento a escala semi-industrial, pueden
presentarse variaciones en los resultados esperados, en este caso principalmente debidas al
diseño de los equipos utilizados y al método de adición del inóculo al agua de pipa
microfiltrada. En la metodología del experimento a escala piloto realizado por Vargas (2015)
se realizó la adición del probiótico directamente a cada botella evaluada, por lo que se tenía
la garantía de que cada unidad contenía el volumen deseado de inóculo.
En el caso de este experimento realizado a escala semi-industrial, como se mencionó
en la metodología, el inóculo fue adicionado por completo a un tanque de acero inoxidable
en el que se mezcla con toda el agua de pipa microfiltrada. Por lo tanto, cualquier residuo
que permanezca en la manguera que conecta el biorreactor con el tanque puede haber
afectado el contenido total de inóculo presente en la bebida, sin embargo se realizaron
esfuerzos para que no hubiera remanentes del inóculo en dichas mangueras.
Adicional a esto, debe considerarse que el envasado en este experimento se realizó en
una cámara de envasado ultra-limpio que utiliza exposición a una lámpara de luz ultravioleta
y si bien es cierto, su efecto antimicrobiano depende de diferentes condiciones y del tiempo
de exposición a esta radiación, sí se reportan reducciones de bacterias ácido lácticas al ser
expuestas a luz ultra violeta (Millán et al., 2015). Además, como se podrá observar en el
apartado 5.1.3., el inóculo utilizado se encuentra en fase de crecimiento logarítmico, y en
esta fase es cuando los microorganismos son más sensibles a condiciones adversas, como
puede serlo la exposición a radiación (Tortora et al., 2007).
Al no conocer las condiciones exactas de la radiación que emite la lámpara utilizada
y el tiempo de exposición de la bebida a dicha radiación, no puede asegurarse que el efecto
49
sucedió tal como se reporta en la literatura, además de que las matrices utilizadas en dicho
estudio son distintas a la utilizada en la bebida realizada en este experimento. Sin embargo
es necesario tomar en consideración este factor como posible causa por la que no se
obtuvieron los resultados esperados en una concentración de inóculo de 1%.
5.1.3. Recuento de bacterias ácido lácticas durante la fermentación del inóculo
Los resultados obtenidos en la determinación del recuento de bacterias ácido lácticas
presentes en el inóculo durante la fermentación del mismo por 24 h se pueden observar a
continuación en la Figura 3.
Figura 3. Recuento de bacterias ácido lácticas del inóculo durante un tiempo de
fermentación de 24 h a 35 ºC sin agitación. h=horas.
Como puede observarse en la Figura 3, durante las primeras 12 h de fermentación, la
carga de microorganismos permanece relativamente estable, mientras que el tiempo de 24 h
representa el punto más alto de crecimiento del probiótico durante el tiempo establecido de
fermentación.
Con la información obtenida, no puede conocerse el estado fisiológico del
microoganismo. Es sabido que la curva de crecimiento microbiano presenta cuatro fases: fase
y = 0,0885x + 6,9346R² = 0,6081
0
2
4
6
8
10
12
0 5 10 15 20 25 30
Log 1
0 U
FC
/mL
Tiempo (h)
50
de retraso (o fase de latencia), fase logarítmica o exponencial, fase estacionaria y fase de
declinación (muerte) (Cayré et al., 2007; Tortora et al., 2007). La fase de retraso consiste en
la etapa en la cual el número de células cambia muy poco, ya que, al ingresar a un medio
nuevo, estas no se reproducen de inmediato, puede durar desde 1 h hasta varios días y durante
ese tiempo las bacterias presentan intensa actividad metabólica que incluye principalmente
síntesis de enzimas y otras moléculas (Tortora et al., 2007).
Según lo que se puede observar en la Figura 3, el lapso que comprende desde las 0 h
hasta las 12 h podría corresponder a la fase de latencia y se esperaría ver un aumento
exponencial en el que la reproducción alcanza su actividad máxima, (Tortora et al., 2007) lo
que comenzó en algún momento después de las 12 h; sin embargo, no se puede saber si a las
24 h de fermentación aún se mantiene en crecimiento logarítmico, o bien, si está en fase
estacionaria o si ya se encuentra en la fase de muerte celular; con la Figura 3 solamente
puede determinarse que sí ocurre un crecimiento durante el período de incubación de 24 h.
Para efectos del experimento, esta información es suficiente como para considerar que dicho
tiempo permite obtener un inóculo con la carga de bacterias requerida para obtener una
bebida con un recuento de al menos 106 UFC/mL (RTCA, 2010). Es importante mencionar
que en la industria se prefiere utilizar microorganismos que se encuentren en fase de
crecimiento exponencial ya que estos presentan su máxima actividad metabólica (Tortora et
al., 2007).
5.2. Pruebas definitivas
5.2.1. Parámetros fisicoquímicos
A continuación, se procede a analizar los resultados obtenidos para los distintos
parámetros fisicoquímicos evaluados.
51
5.2.1.1. pH y acidez titulable
En el caso del pH y la acidez titulable, se puede observar en la Figura 4 y Figura 5, el
comportamiento que presentaron estos parámetros durante los 28 días de almacenamiento a
4 ºC.
Figura 4. Comportamiento promedio del valor de pH en la bebida de agua de pipa
microfiltrada adicionada con probióticos, durante 28 días de almacenamiento en
condiciones de refrigeración a 4 ºC (n=3). d= días.
Figura 5. Comportamiento promedio del valor de acidez titulable en la bebida de agua
de pipa microfiltrada adicionada con probióticos, durante 28 días de almacenamiento
en condiciones de refrigeración a 4 ºC (n=3). d= días; eq= equivalente.
3,00
3,50
4,00
4,50
5,00
5,50
6,00
6,50
7,00pH
-5 0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (d)
52
Es importante denotar que en el caso del pH no se encontraron diferencias significativas
entre los valores de cada variable durante los 28 días de almacenamiento a 4 °C (Prob
>|t|=0,3876; 1-β= 0,0648). Además, es necesario mencionar que el rango de pH obtenido,
entre 4,87 a 5,02, se mantiene dentro del rango de pH típico del agua de pipa, el cual puede
variar entre 4,9 a 6,5, de acuerdo con Prades et al. (2012). En relación con la acidez titulable,
tampoco se obtuvieron diferencias significativas entre los valores asociados a esta variable
durante el tiempo de evaluación del producto (Prob >|t|=0,2538; 1-β= 0,093), los cuales se
mantuvieron entre un rango entre 0,0715 a 0,0813 g eq. de ácido málico/ 100 g. Los
resultados obtenidos indican que, de acuerdo con estos dos parámetros, el producto es estable
durante el tiempo de almacenamiento evaluado en condiciones de refrigeración.
Al comparar este resultado con estudios similares sobre jugos de frutas, como el de
manzana con adición de probióticos, se reportan casos en los que los productos han
presentado aumentos en la acidez titulable y disminución en el valor de pH durante su
almacenamiento en refrigeración (Pimentel et al., 2015). Por otro lado, también se reportan
estudios similares en los que el pH no cambió significativamente, mientras que sí hubo un
aumento significativo en la acidez titulable (Mahnot et al., 2014). Esto puede deberse a que
el pH no presenta una relación lineal con la cantidad de ácido producido, sino que responde
a una función logarítmica por lo que puede detectarse un cambio significativo en la acidez,
aunque el pH no presente diferencias significativas (Peña et al., 2004). Además, un aumento
en la acidez titulable puede estar relacionado con crecimiento microbiano (Mahnot et al.,
2014). Esto se debe a que, al ser una bacteria ácido láctica, puede metabolizar carbohidratos
para producir distintos ácidos orgánicos, tales como los ácidos D,L-láctico y acético
(Pimentel et al., 2015; Rodríguez, 2008). A pesar de esto, probablemente si se extendiera el
tiempo de estudio, se podrían presentar diferencias considerables en el pH, ya que este tiende
a disminuir conforme aumenta la producción de ácido.
Es necesario mencionar que, si bien es cierto, al producto se adiciona ácido ascórbico,
este se encuentra en una concentración de 0,025 g/100 g de producto, por lo que, de acuerdo
con la cuantificación de ácidos presentes en la bebida, realizado por Vargas (2015), este valor
sigue siendo menor al contenido de ácido málico, el cual, se encuentra en cantidades
53
superiores a 0,03 g/100 g de producto. Por otro lado, sería recomendable cuantificar el ácido
láctico para conocer cuál es la producción real de ácido por parte del microorganismo.
En comparación con los resultados obtenidos por Vargas (2015), dicha investigación
reporta diferencias significativas en los valores de pH también durante 28 días de
almacenamiento en refrigeración, con una tendencia a aumentar con el tiempo de
almacenamiento, mientras que reporta una tendencia de decrecimiento en el caso de la acidez,
sin embargo, para este parámetro no se reportan datos estadísticos de respaldo.
5.2.1.2. Sólidos solubles
En lo que respecta a los sólidos solubles presentes en la bebida, el comportamiento
presentado durante el tiempo de estudio puede observarse en la Figura 6.
Figura 6. Comportamiento del valor promedio de sólidos solubles (ºBrix) en la
bebida de agua de pipa microfiltrada adicionada con probióticos, durante 28 días de
almacenamiento en condiciones de refrigeración a 4 ºC (n=3). d= días.
Al igual que en el caso del pH y la acidez, no se obtuvo diferencias significativas en las
mediciones de los sólidos solubles presentes en la bebida a lo largo de 28 días de
almacenamiento en refrigeración (Prob>|t| = 0,3718; 1-β= 0,1692). Este resultado, cuyos
3,00
3,50
4,00
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Sól
idos
sol
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s (º
Bri
x)
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (d)
54
valores se encuentran en un rango entre 4,87 a 5,35 ºBrix, nuevamente indica que la bebida
mantiene características estables a lo largo del tiempo de almacenamiento establecido, ya que
una disminución en los sólidos solubles también puede responder a un fenómeno esperado y
corresponde nuevamente a la actividad metabólica de los microorganismos presentes, ya que
las bacterias metabolizan los azúcares disponibles para su crecimiento (Mahnot et al., 2014;
Pimentel et al., 2015).
En algunos estudios se ha encontrado que la reducción de los sólidos solubles no es
significativa a lo largo del estudio (Mahnot et al., 2014), lo cual puede indicar que a pesar de
que se muestre una tendencia a disminuir, dicha reducción no sucede con gran magnitud
durante el tiempo que conlleva el estudio. En el caso del estudio realizado por Vargas (2015)
en agua de pipa microfiltrada con probióticos, el comportamiento de los sólidos solubles
también fue estable durante el tiempo de almacenamiento a 4 °C. Asimismo, Naranjo (2014),
reportó un comportamiento estable de los sólidos solubles en agua de pipa microfiltrada
durante 28 días de almacenamiento a 4 °C.
5.2.1.3. Turbidez
En lo que respecta al análisis de turbidez, el comportamiento de dicho parámetro durante
el tiempo de almacenamiento de la bebida puede observarse en la Figura 7.
55
Figura 7. Comportamiento del valor promedio de turbidez en la bebida de agua de pipa
microfiltrada adicionada con probióticos, durante 28 días de almacenamiento en
condiciones de refrigeración a 4 ºC (n=3).
d= días.
En relación con este parámetro, sí existen diferencias significativas entre los valores
medidos durante el tiempo de almacenamiento de 28 días a 4 °C (Prob>|t| = 0,0227; 1-β=
0,050), los cuales se encuentran en un rango entre 11,39 a 26,20. Los resultados muestran
una tendencia creciente con el tiempo de almacenamiento. Este resultado es esperable ya que,
según lo reportado en la literatura, la turbidez tiende a aumentar con el tiempo en bebidas
similares principalmente por la acumulación de células muertas (Pimentel et al., 2015).
En este caso puede utilizarse la turbidez para relacionar este parámetro con la carga de
microorganismos, ya que el cultivo se encuentra suspendido en la bebida en forma de
partículas, las cuales son muy pequeñas como para precipitar, pero lo suficientemente
grandes como para refractar la luz (Pimentel et al., 2015).
Como se podrá observar en el análisis de recuentos microbiológicos, la carga presente es
lo suficientemente alta como para que se pueda utilizar la Ley de Beer con el fin de relacionar
la turbidez y el recuento de microorganismos en la bebida de agua de pipa microfiltrada
adicionada con probióticos, según lo encontrado en algunos estudios (Skoog et al., 2008).
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10
20
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40
Tur
bide
z (N
TU
)
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (d)
56
En la literatura se reportan comparaciones entre jugos control (clarificados sin adición de
probióticos) y jugos clarificados con adición de probióticos, y se ha obtenido como resultado
que para estos últimos sí existe evidencia de aumento de la turbidez al ser adicionados con
probióticos (Pimentel et al., 2015), lo cual refuerza los resultados obtenidos en este estudio.
En relación con el estudio realizado por Vargas (2015), dicha investigación también
reporta una tendencia de crecimiento en la turbidez del producto evaluado durante los 28 días
de almacenamiento en condiciones de refrigeración, obteniéndose un valor promedio de
turbidez de 5,8 NTU al adicionar 1% de inóculo y 29,2 NTU al agregar 5% de inóculo.
5.2.2. Análisis microbiológicos
A continuación, se presentan los resultados obtenidos en el análisis microbiológico
de la bebida de agua de pipa microfiltrada adicionada con probióticos.
5.2.2.1.Recuento total aerobio
En el caso del recuento total aerobio, el comportamiento de este parámetro puede
observarse a continuación en la Figura 8.
Figura 8. Comportamiento del promedio del recuento total aerobio en la bebida de agua de
pipa microfiltrada adicionada con probióticos, durante 28 días de almacenamiento en
condiciones de refrigeración a 4 ºC (n=3). d= días.
3,0
4,0
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RT
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10 (U
FC
/mL
)
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (d)
57
De acuerdo con el análisis estadístico realizado, no existen diferencias significativas en
el recuento de bacterias aerobias mesófilas durante el tiempo de almacenamiento de 28 días
en condiciones de refrigeración (Prob>|t| =0,3559; 1-β=1,0000).
Como el producto sufre un proceso de esterilización en frío, en principio todos los
microorganismos deben ser retenidos en la membrana durante este proceso, y además, en
pruebas preliminares se obtuvieron resultados que indicaban que el producto microfiltrado
presentaba recuentos menores a 10 UFC/mL, por lo que se puede considerar que todas las
colonias presentes en el recuento total aerobio corresponden únicamente al cultivo
probiótico.
Es importante mencionar que aunque se considere que las colonias presentes
corresponden al probiótico, los recuentos tienden a ser diferentes en comparación con lo
obtenido para el recuento de bacterias ácido lácticas, ya que la composición de los medios
utilizados es distinta y cambian las condiciones de incubación para cada uno; por ejemplo,
para determinar mesófilos aerobios, como su nombre lo indica, se requiere de una atmósfera
aerobia, mientras que para determinar bacterias ácido lácticas se utiliza una atmósfera con
anaerobiosis. En relación con esto, la mayoría de especies de Lactobacillus sp. pueden ser
catalogadas como aerotolerantes, por lo que pueden resistir la presencia de oxígeno, aunque
muestran aumento en su crecimiento y metabolismo en condiciones anaerobias (Tammam et
al., 2011).
La explicación del comportamiento observado se desarrollará con mayor profundidad en
el apartado de recuento de bacterias ácido lácticas.
5.2.2.2. Recuento de bacterias ácido lácticas
En cuanto a los resultados asociados a los recuentos de bacterias ácido lácticas, los
resultados se pueden observar en la Figura 9.
58
Figura 9. Comportamiento del promedio del recuento de bacterias ácido lácticas en la
bebida de agua de pipa microfiltrada adicionada con probióticos, durante 28 días de
almacenamiento en condiciones de refrigeración a 4 ºC (n=3). d= días.
En este caso, el análisis estadístico muestra que tampoco existen diferencias
significativas en el recuento de bacterias ácido lácticas durante los 28 días de almacenamiento
en condiciones de refrigeración (Prob>|t|= 0,3992; 1-β= 1,0000).
Al observar los recuentos de bacterias ácido lácticas obtenidos, se pudo determinar
que, durante los 28 días de almacenamiento a 4 ºC, se logró cumplir con el recuento
microbiológico establecido por el Reglamento Técnico Centroamericano para declarar
probióticos en la etiqueta del producto (RTCA, 2010). En cuanto al comportamiento obtenido
en los recuentos microbiológicos, si bien es cierto, no se conoce el estado fisiológico del
microorgansmo, esto no es determinante, ya que se sabe que en el almacenamiento bajo
condiciones de refrigeración a 4 ºC, se mantiene un ambiente que dificulta el crecimiento del
cultivo probiótico, ya que sus condiciones óptimas se encuentran entre los 35 ºC y 40 ºC
(Rivera & Gallardo, 2010). Por esta razón puede explicarse que el recuento de bacterias ácido
lácticas se mantuviera estable durante el tiempo de estudio.
En el caso de la acidez y pH de la bebida, estos parámetros pueden afectar el
crecimiento del probiótico ya que, en ambientes ácidos con bajo pH, la célula debe aumentar
su energía para mantener su pH intracelular, lo que implica un déficit de ATP para realizar
3,0
4,0
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Rec
uent
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BA
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10 (
UF
C/m
l)
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (d)
59
otras funciones necesarias, lo que puede provocar su muerte (Pimentel et al., 2015). Sin
embargo, como la bebida reporta valores de pH cercanos a 5,00, puede considerarse que el
microorganismo no se encuentra expuesto a condiciones extremas de pH, por lo que esto
puede favorecer su estabilidad durante los 28 días de almacenamiento en condiciones de
refrigeración.
Por otro lado, en relación con la presencia de oxígeno, este puede causar formación y
acumulación de metabolitos tóxicos en el probiótico, lo cual puede culminar con la muerte
del mismo y en general, la combinación de la presencia de oxígeno en un ambiente ácido es
la principal causa asociada con la reducción de la carga del probiótico, según lo que se ha
podido evidenciar en algunos estudios (Pimentel et al., 2015). Más aún, el polietileno es
permeable a gases, por lo que se podría considerar que hay difusión de oxígeno a través del
empaque de la bebida (Pimentel et al., 2015). Por tanto, podría haber presencia de oxígeno
en el producto a pesar de la atmósfera modificada que se busca generar con el nitrógeno
durante el envasado, conllevando a una disminución en la carga del probiótico.
Más aún, al considerar el contenido de compuestos nitrogenados en la bebida, estos deben
mantenerse en un mínimo del 0,3% en el producto (Pimentel et al., 2015), según lo reportado
en la literatura. En este caso, como la fermentación del microorganismo se lleva a cabo en
un medio que contiene extracto de levadura y como se evidencia estadísticamente que la
bacteria es estable durante el tiempo de almacenamiento, puede considerarse que el contenido
de compuestos nitrogenados no representa una limitante para la sobrevivencia del cultivo
probiótico.
Por último, debe tomarse en cuenta que diversos estudios han asociado ciertos péptidos
presentes en el agua de pipa con propiedades antimicrobianas (Mandal et al., 2009), por lo
que también debe considerarse que esta materia prima podría estar ejerciendo un efecto sobre
los microorganismos presentes en la bebida, aunque de acuerdo con los resultados obtenidos
para el recuento de bacterias ácido lácticas, no existen evidencias de que dicho efecto sea
considerable.
60
En relación con la investigación realizada por Vargas (2015), dicho estudio obtuvo
resultados similares, ya que no se reportan diferencias significativas en el recuento de
bacterias aerobias mesófilas ni ácido lácticas.
5.2.2.3. Recuento de mohos y levaduras
A continuación, se presenta la Figura 10, la cual se obtuvo en el análisis microbiológico
de mohos y levaduras.
Figura 10. Comportamiento del valor promedio del recuento de mohos y levaduras en
la bebida de agua de pipa microfiltrada adicionada con probióticos, durante 28 días de
almacenamiento en condiciones de refrigeración a 4 ºC (n=3). d= días.
En relación con este parámetro, el análisis estadístico indica que no existen
diferencias significativas en la carga de mohos y levaduras durante el tiempo de
almacenamiento evaluado (Prob>|t| = 0,2533; 1-β= 1,0000).
Idealmente se hubiera esperado que, al ser una bebida microfiltrada, no existiera
presencia de mohos y levaduras en el producto en ningún momento a lo largo del estudio, ya
que estos deben ser retenidos en la membrana, la cual tiene un diámetro de poro de 0,2 µm,
debido a que el tamaño de estos microorganismos es superior a 1 µm (Montoya, 2008;
Walker, 1998). Por otro lado, estos resultados microbiológicos podrían asociarse a una
0,0
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Rec
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C/m
L)
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (d)
61
inadecuada acidificación del medio de cultivo para el análisis, lo que permitiría el
crecimiento de otros microorganismos, o bien, agua peptonada que no fue esterilizada en su
momento, y no necesariamente al producto microfiltrado. Esto ya que se realizó una
determinación con agua de pipa sin adición de probióticos en pruebas preliminares y esta no
tenía presencia de mohos y levaduras; además, el inóculo tampoco evidenció crecimiento de
hongos, por lo que también se excluye como fuente de contaminación.
A pesar de esto, el comportamiento estable de los mohos y levaduras a lo largo de la
vida útil puede ser un indicador de que los probióticos ejercen un efecto que inhibe el
crecimiento de otros microorganismos, incluidos mohos y levaduras y psicrótrofos,
probablemente por la alta competencia que ejercen por el consumo de los nutrientes
presentes. Asimismo, podría darse la producción de compuestos antimicrobianos por parte
de las bacterias ácido lácticas, lo que permite que se extienda la vida útil estimada del
producto; esto ha sido respaldado en estudios que han evaluado el efecto de los probióticos
sobre el crecimiento de microorganismos en otras matrices alimentarias (Mushtaq et al.,
2016).
De acuerdo con los resultados obtenidos por Mahnot et al. (2014), el agua de coco
microfiltrada envasada en botellas de plástico puede presentar crecimiento microbiológico a
los 22 días de almacenamiento a 4 ºC, lo cual difiere de los resultados obtenidos en este
estudio, ya que no hubo evidencia de un crecimiento significativo de microorganismos
durante el tiempo de almacenamiento de 28 días a 4 ºC.
Además, al comparar estos resultados con los obtenidos por Vargas (2015), puede
notarse que en dicho estudio sí se dio un aumento significativo en el recuento de mohos y
levaduras, con lo que se puede evidenciar que las condiciones de envasado en este proceso
cumplen eficazmente con el objetivo de evitar la presencia de microorganismos de deterioro
en el producto final.
62
5.2.3. Investigación de mercado mediante mini grupos focales
Con el fin de conocer aspectos necesarios para una eventual comercialización de una
bebida de agua de pipa microfiltrada adicionada con probióticos, se efectuaron dos sesiones
de mini- focus group con mujeres entre los 29 y los 51 años. Para la primera sesión
participaron cinco mujeres, de las cuales cuatro viven en la provincia de Heredia, mientras
que la otra participante vive en la provincia de San José. En el caso de la segunda sesión,
hubo un total de seis mujeres participantes, todas residentes en la provincia de San José.
Durante las sesiones de mini grupos focales se obtuvo información valiosa
relacionada con la bebida de agua de pipa. Las participantes tuvieron la oportunidad de
evaluar sensorialmente la bebida, de mencionar sus hábitos de consumo de bebidas y de
evaluar el concepto de la bebida de agua de pipa microfiltrada adicionada con probióticos,
junto con un prototipo de etiqueta, así como generar un listado de beneficios relacionados
con el agua de pipa. Los resultados obtenidos más importantes se mencionan a continuación.
5.2.3.1. Evaluación sensorial
Para evaluar sensorialmente la bebida de agua de pipa microfiltrada adicionada con
probióticos, a las participantes se les dio una muestra del producto, en vasos de vidrio
transparentes con el fin de evaluar características como el aroma, la apariencia y el sabor de
la bebida. La muestra fue evaluada sensorialmente por las participantes sin haber visto la
etiqueta y sin haber sido informadas acerca de los beneficios y características principales que
encierra el concepto del producto.
Cabe resaltar que en la primera sesión de mini-focus group, una vez que evaluaron el
producto, las participantes destacaron su deseo por cambiar el aroma de la bebida, debido a
que presenta tonos ácidos indeseables para ellas. Sin embargo, en la segunda sesión, esta
opinión no fue compartida, ya que en su mayoría indicaron que no sería necesario cambiar
este atributo. Por otro lado, todas las participantes manifestaron su agrado por la apariencia
de la bebida, la cual consideraron que refleja frescura y una apariencia normal que tendría
una bebida de agua de pipa. En cuanto al sabor de la bebida, la mayoría de participantes
63
manifestaron que sí es de su agrado el sabor, aunque indicaron que presentaba un sabor ácido
“como fermentado”, que podía significar que la bebida ya presentaba deterioro
microbiológico. Esto último coincide con lo reportado en la literatura, en la que los
consumidores han identificado sabores ácidos, agrios y astringentes en jugos de frutas
adicionados con probióticos (Pimentel et al., 2015).
Para conocer con mayor acierto el agrado sensorial por la bebida, las participantes
evaluaron el producto utilizando una escala hedónica de siete puntos, en la cual la gran
mayoría evaluó positivamente el producto. Cabe destacar que, de once participantes en total,
cinco calificaron el producto entre las categorías “rico” y “súper rico”, mientras que otras
cinco participantes lo calificaron en la categoría “quizás rico, quizás feo” y solamente una
participante evaluó el producto como “feo”. Es importante mencionar que siete participantes
indicaron que sí comprarían la bebida, otra más indicó que tal vez la compraría y solamente
tres participantes manifestaron que no la comprarían. Por otro lado, las participantes
mencionaron que el producto lo comprarían principalmente para consumo propio y para sus
familias.
De acuerdo con lo que se reporta en la literatura, se han elaborado bebidas de frutas
adicionadas con probióticos, y por ejemplo, en jugo de naranja, los consumidores siguen
prefiriendo las muestras del jugo sin probióticos, ya que identifican sabores y aromas
indeseables que relacionan con productos lácteos y agrios (Vasudha & Mishra, 2013). Por lo
tanto, los resultados obtenidos en la evaluación sensorial de la bebida de agua de pipa
microfiltrada adicionada con probióticos por parte de las participantes, coincide con lo
reportado en la literatura, en vista de los sabores que identifican y la posible razón por la que
la bebida no tiene un mayor agrado. Esto aunque al no realizar una comparación directa
contra una bebida de agua de pipa sin adición de probióticos, no es posible identificar la
preferencia de las consumidoras por uno u otro producto.
5.2.3.2. Evaluación del concepto
En cuanto a la evaluación del concepto del producto, las sesiones de mini grupos
focales se centraron en analizar la percepción acerca de la leyenda que se incluyó en el
64
prototipo de la etiqueta propuesta y en la percepción acerca del beneficio de los probióticos
y del agua de pipa.
En relación con la leyenda que se incluye en la etiqueta, esta puede observarse en la
“Guía de sesiones para la aplicación de los mini-focus group” que se encuentra en el
Anexo 9.2.
De acuerdo con este enunciado, todas las participantes manifestaron su agrado por el
texto incluido. Indicaron que les agradó mucho que incluye los términos “orgánico”,
“antioxidantes”, “probióticos”, “electrolitos”, “anti cancerígenas”, “procesada sin calor” y
que se indica que “preserva las vitaminas”.
Es importante destacar la buena percepción que tuvieron al enterarse de que la bebida
contiene probióticos, lo cual también fue de gran agrado para las participantes, ya que estas
los asocian con numerosos beneficios para el organismo, principalmente por su acción
positiva en el sistema digestivo y que “ayudan a la flora intestinal”.
Como oportunidades de mejora para el enunciado destacaron que prefieren que se
utilice en todo momento el término agua de pipa en lugar de “agua de coco”, ya que esto
puede generar confusión. Además, indicaron que la frase “bebida a base de agua de pipa”
puede generar desconfianza sobre el contenido total de agua de pipa en el producto final, por
lo cual sugirieron utilizar la frase “la nueva bebida de agua de pipa”.
Adicional a esto, se entregó a cada participante un listado de los beneficios que posee
el agua de pipa (ver anexo 9.1.2.). De dicha lista, las participantes mencionaron las diferentes
palabras y frases que más captaron su atención, en la que se destacaron:
1. Hidratante,
2. Electrolitos,
3. Baja en calorías, cardioprotectoras,
4. Bebida para deportistas,
5. Inmunoestimuladoras.
El tipo de propiedades que se dan a conocer a los consumidores debe ser una decisión
estratégica, ya que estos están más interesados por alimentos funcionales con declaraciones
65
de salud fisiológicas que con declaraciones psicológicas (Siegrist et al., 2008). Por otro lado,
el alimento que se utilice como vehículo de los componentes funcionales también debe ser
elegido cuidadosamente, ya que estos son mejor evaluados cuando se encuentran ligados a
un producto con una imagen saludable (Siegrist et al., 2008) y en general son preferidos sobre
aquellos que presentan alta funcionalidad o declaraciones saludables (Siró, 2008). Esto
coincide con la información obtenida en las sesiones de mini grupos focales, en las que en
general las participantes evaluaron bien el producto adicionado con probióticos, y el hecho
de que tengan una percepción del agua de pipa como un producto saludable pudo haber
influido considerablemente.
Por otra parte, que haya habido algunas propiedades que les llamaron más la atención es
algo esperable, ya que algunas funciones de los alimentos funcionales pueden ser percibidas
como de mayor importancia que otras (Fabiansson, 2014). Esto se complementa con el
disgusto que les genera cuando una etiqueta menciona numerosos beneficios, ya que lo
consideran como “exagerado” y no les gusta que se mencionen muchas funciones que lleven
el prefijo “anti”; por ejemplo: antitrombóticas, antiprotozoarias, entre otras, y que, a su vez,
en muchos casos no conocen el significado de los beneficios mencionados. Además, se señaló
que es importante que cuando se haga referencia a algún beneficio, debe garantizarse que
este ha sido comprobado de alguna manera, lo cual les da mayor confianza en el producto.
Esto coincide con lo encontrado en estudios similares, donde se menciona que los
beneficios potenciales de los alimentos funcionales deben ser informados al consumidor para
que estos tengan credibilidad sobre los productos, (Siegrist et al., 2015), y el hecho de que
los consumidores crean que sí suceden estos efectos sobre el organismo, corresponde al
principal factor que influye en la aceptación de alimentos funcionales por parte de los mismos
(Chen, 2011). La importancia de que los consumidores crean firmemente que sí pueden
obtener beneficios para la salud, radica en que la recompensa percibida por el uso de
alimentos funcionales se concentra principalmente en salud, estado de ánimo y bienestar
general (Chen, 2011).
66
5.2.3.3. Evaluación del empaque y etiqueta
En general las participantes de las dos sesiones de mini-focus group manifestaron el
agrado por el empaque. Se mencionó que la forma de la botella plástica (Ver Figura A1) es
atractiva y es acorde con lo que esperarían para una bebida de agua de pipa, ya que su forma
redondeada da la apariencia de un coco, y, además, este empaque es reciclable, lo cual fue
resaltado por las participantes como un requerimiento primordial para un empaque de una
bebida. Como principal observación indicaron que no les agrada que la tapa de la botella sea
de color blanco; lo consideran poco atractivo y aburrido.
Por otro lado, la etiqueta evaluada por las participantes fue diferente entre la primera
y la segunda sesión; las participantes de la primera sesión, solamente tuvieron acceso a la
etiqueta (a) (Ver Figura A2), mientras que las de la segunda sesión pudieron observar las
dos versiones de la misma (Ver Figura A2) (a) y (b), aunque es importante mencionar que
la diferencia entre ambas es únicamente por el color de fondo de la misma. A pesar de dicha
diferencia, ambas fueron del agrado de las participantes; el color verde utilizado en el arte
fue uno de los factores de mayor aceptación ya que da la apariencia de ser natural y
refrescante. Además, las participantes indicaron que el producto tenía una excelente
apariencia general, lo cual reflejaba que podía ser destinado para exportación y más aún, el
significado del nombre Siwà fue de gran agrado. A pesar de esto, surgieron varias
oportunidades de mejora para la etiqueta, entre las que se encuentran:
1) Agregar el significado del nombre en el texto que explica el concepto del producto,
2) Utilizar menor cantidad de tipografías diferentes, aunque les gustó bastante la tipografía
de la palabra “Pipa”,
3) Agregar una imagen relativa a una palmera, coco o playa,
4) Aumentar el tamaño de la declaración de los probióticos,
5) Que no se utilice el color crema en la etiqueta (b), ya que puede dar la apariencia de un
producto cosmético,
6) Que el nombre Siwà juices no sea tan grande y que se incremente el tamaño de la frase
“Agua de pipa orgánica”,
67
7) En el caso de la primera sesión de mini grupo focal, las participantes resaltaron que el
nombre Siwà no debería indicar la palabra juices, ya que, al ser una palabra autóctona
de Costa Rica, es contradictorio incluir un término del idioma inglés.
Es necesario mencionar que a pesar de que el color crema de fondo de la etiqueta (b)
puede dar la apariencia de un producto cosmético, este fue de mayor agrado que el color
blanco de la etiqueta (a).
5.2.3.4. Determinación del mercado de consumo
Durante las dos sesiones de mini grupos focales, las participantes dieron a conocer
información valiosa en cuanto a la decisión de compra de la bebida, el precio que estarían
dispuestas a pagar por dicha bebida, así como el nicho de mercado que podría presentar la
misma.
En relación con la decisión de compra, tras conocer todos los beneficios asociados a
la bebida, así como la tecnología utilizada para su elaboración, todas las consumidoras
estuvieron dispuestas a comprar la bebida, a pesar de que, juzgando únicamente por la
evaluación sensorial, algunas de las participantes indicaron que no la comprarían o que tal
vez estarían dispuestas a comprarla. Esto demuestra que las consumidoras se vieron
claramente influenciadas por las propiedades que se dieron a conocer acerca de la bebida. Si
bien es cierto, siempre existe una posibilidad de que alguna de las participantes se inhiba a
decir públicamente lo que realmente piensa, la confianza evidenciada en el grupo permitiría
pensar que la información obtenida es confiable.
Podría considerarse que las participantes presentan un alto nivel de confianza en la
industria de alimentos que desarrolla los productos de su interés, esto basado en el
comportamiento observado, aunque no se evaluó explícitamente. Este resultado concuerda
con lo reportado en otras investigaciones, en las que se ha encontrado que las personas que
confían en la industria alimentaria presentan mayores intenciones de consumo por los
alimentos funcionales, en comparación con las que manifiestan desconfianza (Siegrist et al.,
2015).
68
Por otro lado, el hecho de que las participantes consideren comprar o consumir el
producto en mayor medida después de conocer todos los beneficios que podrían obtener con
la bebida, contrasta con lo establecido en algunos estudios en los que se menciona que los
consumidores no están dispuestos a sacrificar el sabor del producto por el beneficio para la
salud (Siegrist et al., 2008); aunque la bebida no les disgustó en general, hay evidencias de
que los beneficios de la bebida sí pueden influir considerablemente en la decisión de compra
de la misma. Más aún, se ha encontrado en estudios de bebidas de frutas adicionadas con
probióticos, que, aunque inicialmente los consumidores tienden a preferir las bebidas control
(bebida de la misma fruta sin el probiótico), al dar a conocer los beneficios asociados, la
preferencia por la bebida con probióticos aumenta sobre la bebida control (Vasudha &
Mishra, 2013).
En cuanto al precio al que las participantes estarían dispuestas a pagar por la bebida,
inicialmente se hizo un sondeo sobre el monto que pueden pagar por bebidas saludables en
general (incluidas bebidas a base de agua de pipa), para lo cual las consumidoras indicaron
un rango de entre los ₡500 y ₡1300 para una bebida en presentación personal. A pesar de
esto, en otras ocasiones algunas participantes pagan hasta ₡1800 colones por una bebida para
deportistas varias veces a la semana.
Una vez que las participantes probaron la bebida y tuvieron la oportunidad de conocer
las propiedades de la misma, hubo dos rangos de precios muy distintos entre las participantes
de la primera sesión y las de la segunda sesión, para una bebida con una presentación de 500
mL. En el caso de la primera sesión, las participantes establecieron un monto máximo de
pago que rondaría entre los ₡600 y ₡1000 colones, mientras que, en la segunda sesión, las
participantes establecieron un rango máximo de precio entre los ₡1500 y ₡2500 y con una
frecuencia de consumo de una hasta tres veces por semana.
Aunque la metodología de selección de las participantes de las sesiones establece un
filtro de acuerdo con los ingresos económicos, este se selecciona en un rango, por lo que no
se descartaría que en general haya alguna influencia en función del ingreso económico
promedio de ambos grupos de participantes. Esto tendría sentido ya que se ha encontrado que
69
los consumidores con mayores ingresos económicos tienden a valorar más los alimentos
funcionales y sus beneficios para la salud (Ding et al., 2015).
Otra razón por la que puede que haya diferencias en los resultados entre las dos
sesiones de grupos, son las características sociodemográficas como la edad, el género o el
nivel de educación, las actitudes y el estilo de vida de los consumidores, lo cual llega a
influenciar directamente sobre la aceptación o la intención de los mismos por el consumo de
alimentos funcionales (Chen, 2011; Ding et al., 2015). Aunque todas las participantes de las
sesiones pertenecen a un mismo país, como se mencionó anteriormente, viven en provincias
distintas y se sabe que los factores geográficos, históricos y económicos de países afectan
significativamente las preferencias de alimentos de las personas (Siegrist et al., 2015).
Culturalmente no hay mayores diferencias entre ambos grupos, pero deben tomarse en cuenta
estos factores para conocer con mayor profundidad su influencia sobre la compra de bebidas
de este tipo.
Es importante rescatar que en ambas sesiones, las participantes indicaron que
pagarían más por la bebida que probaron, que por otras bebidas de consumo regular. Esto es
esperable ya que también se ha encontrado en distintos estudios que los consumidores están
dispuestos a pagar más por alimentos que pueden brindar beneficios comprobados para su
salud. Sin embargo, esta intención de compra puede que aún sea más baja que la esperada
por la industria (Siegrist et al., 2015), ya que los consumidores sólo estarían dispuestos a
aceptar un precio limitado por el producto (Siró, 2008).
Por otro lado, se considera que la recompensa percibida, la necesidad por alimentos
funcionales, la conciencia por la salud, un estilo de vida saludable y la confianza en los
mismos, pueden influenciar de forma positiva la disposición por su consumo, siendo los
principales la recompensa y la confianza (Chen, 2011) y sí existe evidencia de que las
personas que se preocupan por su salud son las que estarían más interesadas en los alimentos
funcionales (Siegrist et al., 2015). Debido a esto, es importante que las áreas de mercadeo se
enfoquen en resaltar las propiedades de los alimentos funcionales (Chen, 2011).
Además, seguramente existirán consumidores que no estén dispuestos a adquirir una
bebida funcional como esta, lo que principalmente podría deberse a falta de conocimiento,
70
baja importancia percibida y el elevado precio, como razones para no consumir estos
productos (O’Connor & White, 2010). Esto concuerda con las observaciones realizadas en
las dos sesiones de mini grupos focales llevadas a cabo, principalmente en lo que respecta al
precio de la bebida, ya que las participantes sí demostraron conocer acerca de productos
similares y además los consideran importantes para su dieta. Es interesante mencionar que la
inocuidad de los alimentos funcionales no influye sobre la disposición para consumirlos
(Chen, 2011); probablemente porque los consumidores consideran que la inocuidad de estos
productos está implícita y confían más en que las bebidas de este tipo cumplen con todos los
requerimientos que deben tomarse en cuenta para elaborar un producto inocuo, ya que en
este caso ninguna de las participantes mencionó nada al respecto.
En cuanto a las personas que consumirían el producto evaluado, las participantes
indicaron que bebidas como esta pueden ser para ellas mismas, así como para sus familias.
También se hizo hincapié en que la bebida podría ser destinada además para adultos mayores
y para personas deportistas, así como para personas que tengan algún padecimiento
gastrointestinal. Dichos mercados fueron establecidos tomando en consideración tanto el
sabor, el tamaño de presentación y las propiedades de la bebida que fueron presentadas a las
participantes.
71
6. Conclusiones
El presente estudio demostró que es posible implementar un proceso de
microfiltración a escala semi-industrial, acoplado a un envasado ultralimpio, para la
obtención de una bebida de agua de pipa adicionada con probióticos, la cual es estable
durante al menos 28 días de almacenamiento en refrigeración a 4 °C.
Adicionalmente, se encontró que 24 h es un tiempo adecuado para la propagación del
cultivo probiótico Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, ya que su inoculación en la
bebida permitió obtener una carga de probiótico de al menos 106 UFC/mL.
Además, se determinó que la bebida de agua de pipa adicionada con probióticos
presenta estabilidad microbiológica al no evidenciar deterioro por mohos ni levaduras a lo
largo de 28 días de almacenamiento en refrigeración. Asimismo, el proceso desarrollado
permite asegurar una concentración del cultivo probiótico en la bebida desarrollada de al
menos 106 UFC/mL durante 28 días de almacenamiento en condiciones de refrigeración a 4
°C.
Por último, mediante la realización de dos sesiones de mini grupos focales, se definió
un concepto de la bebida de agua de pipa microfiltrada adicionada con probióticos, que es
aceptada sensorialmente por los consumidores y que presenta además potencial para su
comercialización, en vista de la intención de compra por parte de los mismos.
72
7. Recomendaciones
1) Realizar un estudio de vida útil de la bebida mediante análisis microbiológicos,
físicoquímicos y sensoriales, para determinar si es viable su consumo en un período
superior a los 28 días de almacenamiento a 4 ºC.
2) Realizar la curva de crecimiento del cultivo probiótico con el fin de determinar el tiempo
en el que el microorganismo se encuentra en fase logarítmica y así poder obtener un
inóculo que se encuentre en este estado fisiológico.
3) Determinar la temperatura óptima de crecimiento del cultivo microbiológico para obtener
mayores recuentos durante la fermentación y así, aumentar la eficiencia del proceso.
4) Validar el método de desinfección del coco (utilizando preferiblemente el desinfectante
Tsunami 100) y del equipo de microfiltración a escala semi-industrial mediante la
aplicación del producto comercial Vortexx.
5) Incorporar un sistema mecánico de agitación en el tanque de mezclado del equipo.
6) Evaluar nuevos prototipos de etiquetas mediante sesiones de grupos focales para
seleccionar la de mayor agrado por parte de los consumidores, considerando en el diseño,
elementos sugeridos durante el presente estudio, tales como color, tamaño y tipo de letra,
y demás declaraciones.
7) Realizar un análisis de costos evaluando el envasado de la bebida en botellas de vidrio.
8) Estudiar la adición de prebióticos para evaluar su efecto sobre el recuento del cultivo
probiótico y la aceptación sensorial de la bebida por parte de los consumidores.
9) Realizar análisis del perfil de azúcares para determinar si la fructosa es el mayoritario en
el coco cultivado en Costa Rica, así como determinar el perfil de ácidos orgánicos para
expresar la acidez de la bebida final en términos del ácido mayoritario.
73
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81
9. Anexos
9.1. Investigación de consumidores
9.1.1. Screener para la selección de los participantes de las sesiones de mini-focus
group
Proyecto: Desarrollo de una bebida a base de agua de coco
Enero de 2016
Segmento: mujeres consumidoras de bebidas saludables (25 a 60 años)
Introducción
Mi nombre es _____________________, y estudio en la Universidad de Costa Rica.
Estamos desarrollando un producto por lo que le agradecemos si nos contesta las siguientes
preguntas. Lo que nos diga es confidencial. Trabajo con el
profesor_________________________ y le damos las gracias por su colaboración.
Nombre y apellido de la participante: Edad _____ años
Lugar de residencia:
Consume bebidas saludables Sí ____ No____
Dónde acostumbra vacacionar
Escuela o Colegio en donde estudian sus hijos
Recuerde que no se permite personas que trabajen en mercadeo
Preguntas para el (la) participante:
1. ¿Trabaja usted o algún miembro de su familia en alguna de las actividades que voy a leer
a continuación?
82
EMPRESAS O ACTIVIDAD SI NO
- Agencia de Publicidad
- Agencia de Investigación de Mercados
- Departamento de publicidad de diario / revista / radio / televisión
- Empresa donde fabrican o distribuyen cualquier producto de
consumo/comida/bebida
- Tiene/atiende pulpería, abastecedor, supermercado u otro tipo de tienda de
abarrotes
Si responde “sí” en alguna empresa o actividad termine el proceso de selección
2. ¿Participó en los últimos seis meses en encuestas o reuniones de grupos de discusión?
1. Sí 1 FINALIZAR 2. No Xx CONTINUAR
3. ¿Usted diría que le gusta hablar en grupo?, ¿es sociable y conversadora?
( x ) sí ( ) no FINALIZAR
4. ¿Padece alergia?
( ) sí
¿qué tipo de alergia padece?
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
(x ) no
Preguntas
83
5. ¿Me podría decir cuáles de los siguientes productos que le voy a mencionar
consumió/tomó en el último mes? (anote en A). ¿Y qué comió/tomó la última vez
de…?. (anote en B marca). ¿Y por lo general cada cuánto come/toma…? (anote
en C) ¿Y generalmente qué cantidad come/toma? (anote en D).
Producto a. Último mes b. Marca c. Frecuencia Cantidad
1. Bebidas 1. SI
2. NO
3. Preguntar por las
bebidas que
consume
Dos Pinos
V8
Tropicana
Welch
V8
Otro____________
( ) semanal
( ) quincenal
2. Agua de
pipa o agua de
coco
1. SI 2. NO Dónde compra ( x ) semanal
( ) quincenal
( ) Otra________
3.Galletas 1. SI 2. NO
Soda
Bizcochos
( x ) semanal
( ) quincenal.
PERFIL han consumido bebidas saludables con alguna frecuencia?
Bloque NSE (Nivel Socioeconómico)
Aplicación NSE indicador
Sólo con el fin de establecer ciertos estilos de vida de las personas, necesito que por favor
me diga, ¿cuáles de los artículos que le mencionaré tiene usted o algún miembro del
hogar o tienen en general en la casa? (leer opciones)
84
Vehículo
de uso
personal
1.SI 2.NO Home
Theater/Teatro
en casa
1.SI 2.NO D.V.D. 1.SI 2.NO
Tarjeta
de
crédito
1.SI 2.NO Computadora
portátil
1.SI 2.NO IPOD 1.SI 2.NO
Internet
en el
hogar
1.SI 2.NO Teléfono
celular
1.SI 2.NO
Contando todas las personas que trabajan en esta casa ¿En cuál de los siguientes rangos de
ingreso familiar mensual se encuentra este hogar? (MOSTRAR TARJETA)
1....Menos de 200.000 2...De 201.000 a
300.000
3.. De 301.000 a
400.000
4....De 401.000 a
500.000
5...De 501.000 a
600.000
6... De 601.000 a
1.000.000
7. De 1.000.100 a
2.500.000
8. Más de 2.500.000
¿A qué se dedica la persona que más aporta en su
familia?_________________________________________
Le gustaría participar en un grupo hablando sobre diferentes bebidas y degustando una
bebida para que nos dé su opinión sobre la misma.
Fecha y hora de la sesión a participar Día xx/xx/xx 00:00 p.m.
Lugar___________________________________________________________
Teléfono para confirmar día__________________________________________
Mi número de teléfono es____________________________ y el del
profesor____________________________ es
_____________ por si tiene alguna consulta que hacer.
85
9.1.2. Guía de sesiones para la aplicación de los mini-focus group
Guía de sesiones sobre bebida enriquecida (CITA-UCR)
I. Explicación introductoria para la sesión y presentación (10 minutos)
Explicación breve de cómo funcionan los focus o sesiones de grupo
Explicar que no hay respuestas buenas ni malas, solo opiniones
Explicar sobre la grabación
Indicar que las personas deben hablar una a la vez
Presentación de las participantes
II. Producto ideal 10 minutos
Ahora les voy a dar este lápiz y esta hoja y van a dibujar y escribir en forma individual…Lo que
importa es lo que piensan sobre lo que les voy a decir y no importa la ortografía…” Si alguien les
pudiera hacer una bebida de pipa o agua de coco, enriquecida con prebióticos, ¿qué le
pedirían?” (características de la bebida, empaque, precio, lo que quieran …)
Ahora sí, ¿qué pidieron? ¿Qué les gusta?
III. Generalidades sobre las bebidas consumidas (10 minutos)
Hablando en general de las bebidas que acostumbran comprar ¿cuáles son?
¿En qué se fijan cuando compran una bebida? ¿Qué tienen las bebidas que ustedes compran?
En el caso de las bebidas que consideren saludables, ¿cuáles consumen?
¿Qué tamaños de empaque prefieren cuando compran bebidas y en qué ocasiones consumen esas
bebidas que mencionaron?
En cuestión de precios, ¿cuánto pagan por las bebidas que consumen según su tamaño?
Además de las bebidas que consumen, ¿preparan alguna en sus hogares?
En el caso de pipas y agua de coco, ¿qué conocen?, ¿qué han oído?
Actualmente se vende el agua de coco en dos presentaciones en varios súper mercados, la han visto,
han comprado). También en la Feria Verde de Aranjuez se vende este producto.
¿Cuáles son las presentaciones que han visto? , ¿Y cuáles han probado?
¿Qué les motivó a buscar esta bebida?
86
¿Qué beneficios han oído?, ¿tiene el agua de coco?
IV. Degustación. 20 minutos
Ahora les vamos a dar a degustar una bebida y ustedes evalúan en una boleta cuánto les agrada o no
las mismas. Siéntanse en la confianza de comentarnos lo que les parece la bebida. Esta primera parte es
individual y luego comentamos en grupo.
Se evalúa cada atributo
¿Qué les parece la apariencia, el color, el olor, el sabor y la consistencia?
¿Le harían algún cambio a esa bebida?
V. Evaluación del concepto
Probióticos
¿Qué han oído de los probióticos?, ¿qué opinan de los mismos?, ¿qué opinan de la siguiente
información?
Los probióticos son microorganismos vivos que en
cantidades adecuadas pueden otorgar beneficios en el
intestino, manteniendo activa la flora intestinal
Nueva bebida
Les vamos a pasar otro texto, para que lo lean y lo adecuen para que otras personas lo entiendan:
La nueva bebida a base de agua de pipa orgánica es única, procesada sin
calor mediante una nueva tecnología de microfiltrado para eliminar en frío los
gérmenes microbianos, preservando las vitaminas, enzimas y todos los
compuestos nutricionales bioactivos propios del agua de pipa fresca.
La nueva bebida al ser enriquecida con probióticos otorga mayores
beneficios al mantener activa la flora intestinal y fortalece las defensas
naturales del organismo.
87
El agua de coco o agua de pipa, contiene antioxidantes, es excelente para
reponer electrolitos, ideal después del ejercicio, posee propiedades anti
cancerígenas.
A continuación les vamos a presentar una lista de beneficios del agua de coco para que nos den su
opinión y tachen la información que no les parece creíble. (Se entrega una lista individual)
Agua de coco
El agua de coco se caracteriza por ser un producto de alto consumo en
países tropicales, además de que posee propiedades hidratantes y refrescantes,
sabor agradable y propiedades funcionales y nutritivas y es recomendada
como bebida para deportistas por su contenido de electrolitos y minerales.
Además de esto, el agua de coco es baja en calorías y grasa y puede ser
un excelente medio para la reposición de electrolitos al hacer ejercicio.
Más aun, se le asocia con el tratamiento de diarrea y con propiedades:
antioxidantes, cardioprotectoras, antitrombóticas, antiateroscleróticas,
hipolipidémicas, anticolecistíticas, antibacteriales, antivirales, antifúngicas,
antiprotozoarias, anticancerígenas, inmunoestimuladoras, antidiabéticas,
hepatoprotectoras y propiedades con funciones similares a las hormonales.
VI. Evaluación de botella y etiqueta (20 minutos)
Las botellas en las que se va a comercializar esta bebida van a ser de plástico, ¿qué les parece este
diseño?
¿Qué les parece el diseño, qué les dice?
Estos son algunos ejemplos de botellas, ¿qué opinan de ésta? (identificar por forma).
¿Cuál de las botellas les gusta más para la bebida de agua de pipa que probaron?
¿Qué tipo de persona consumiría un producto como éste?
¿Qué precio podría tener esta bebida? (En colones (₡))
(Pendiente diseños de etiqueta)
VII. Mercado
88
La bebida de agua de pipa se van a comercializar refrigerada porque no tiene preservante, o sea se
ubicarán en el área de refrigeración de los súper mercados. ¿Qué les parece la idea?
¿Para quién sería este ésta bebida?, ¿por qué?
¿Comprarían estas bebidas?, ¿en qué momento? (cuáles), ¿en qué ocasión?
En general ¿qué les parece la idea de contar con bebida como esta?
9.1.3. Envase y etiquetas propuestas para la bebida de agua de pipa adicionada con
probióticos
Figura A1. Botella de plástico PET de 500 mL propuesta para la bebida de agua de pipa
microfiltrada adicionada con probióticos.
89
(a)
(b)
Figura A2. Propuesta de etiquetas para la bebida de agua de pipa microfiltrada adicionada
con probióticos.
VIII. Agradecimiento
90
9.2. Pruebas preliminares
Cuadro A1. Número de colonias contabilizadas en las placas de Agar estándar para el
análisis de bacterias aerobias mesófilas en agua de pipa microfiltrada para evaluar la eficacia
de la etapa de desinfección del equipo de microfiltración con soluciones de NaOH al 2%,
HNO3 al 1% y cloro a 500 ppm.
Muestra Réplica Dilución
10-1 10-2 10-3
AP1
1 0 0 0
2 0 0 0
Promedio 0 0 0
AP2
1 0 0 0
2 0 0 0
Promedio 0 0 0
AP3
1 0 0 0
2 0 0 0
Promedio 0 0 0
AP: agua de pipa microfiltrada
Cuadro A2. Número de colonias contabilizadas en las placas de Agar papa dextrosa para el
análisis de mohos y levaduras en agua de pipa microfiltrada para evaluar la eficacia de la
etapa de desinfección del equipo de microfiltración.
Muestra Réplica Dilución
10-1 10-2 10-3
AP1 1 1 0 0
2 0 0 0
3 0 1 0
Promedio 0,33 0,33 0
AP2 1 0 0 0
2 0 0 0
3 0 0 0
Promedio 0 0 0
91
Cuadro A3. Número de colonias contabilizadas en Agar MRS para el análisis de
Lactobacillus paracasei subsp. paracasei al añadir concentraciones de inóculo de 1% y 3%
en el agua de coco microfiltrada.
Día Muestra Réplica Dilución
10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8
0 9 1 0 0 0 0 NA NA
2 0 0 0 0 NA NA
Promedio 0 0 0 0 NA NA
2 1 0 0 0 0 NA NA
2 0 0 0 0 NA NA
Promedio 0 0 0 0 NA NA
16 1 0 0 0 0 NA NA
2 0 0 0 0 NA NA
Promedio 0 0 0 0 NA NA
Inóculo 1 NA Inc Inc 72 0 0
2 NA Inc Inc 78 0 0
Promedio NA Inc Inc 75 0 0
Cuadro A4. Número de colonias contabilizadas en el Agar MRS para el análisis de
Lactobacillus paracasei subsp. paracasei para elaborar la curva de crecimiento del cultivo
probiótico durante un tiempo de fermentación de 24 h a 35 ºC sin agitación. Réplica 1.
Tiempo (h)
Réplica
Dilución
10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8
0 1 Inc Inc 179 62 0 0
2 Inc Inc 165 40 0 0
Promedio Inc Inc 172 51 0 0
2 1 Inc Inc 92 89 0 0
2 Inc Inc 245 125 0 0
Promedio Inc Inc 168,5 107 0 0
4 1 Inc 227 46 2 5 0
2 Inc 212 44 0 0 0
Promedio Inc 219,5 45 1 2,5 0
6 1 Inc Inc 195 4 2 0
2 Inc Inc 158 36 0 0
Promedio Inc Inc 176,5 20 1 0
8 1 Inc Inc 67 60 0 0
2 Inc Inc 302 32 0 0
Promedio Inc Inc 184,5 46 0 0
10 1 Inc Inc Inc 67 5 1
2 Inc Inc Inc 58 4 0
92
Promedio Inc Inc Inc 62,5 4,5 0,5
12 1 Inc Inc Inc 178 0 0
2 Inc Inc Inc 135 112 0
Promedio Inc Inc Inc 156,5 56 0
24 1 Inc Inc Inc 135 112 35
2 Inc Inc Inc inc Inc 19
Promedio Inc Inc Inc 135 Inc 27
Cuadro A5. Número de colonias contabilizadas en el Agar MRS para el análisis de
Lactobacillus paracasei subsp. paracasei para elaborar la curva de crecimiento del cultivo
probiótico durante un tiempo de fermentación de 24 h a 35 ºC sin agitación. Réplica 2.
Tiempo (h) Réplica Dilución
10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8
0 1 Inc Inc 114 7 NA NA
2 Inc Inc 88 10 NA NA
Promedio Inc Inc 101 8,5 NA NA
2 1 Inc Inc 117 14 NA NA
2 Inc Inc 119 7 NA NA
Promedio Inc Inc 118 10,5 NA NA
4 1 Inc Inc 155 6 NA NA
2 Inc Inc 176 11 NA NA
Promedio Inc Inc 165,5 8,5 NA NA
6 1 Inc Inc 101 7 NA NA
2 Inc Inc 85 105 NA NA
Promedio Inc Inc 93 56 NA NA
8 1 Inc Inc 90 40 0 0
2 Inc Inc 97 31 0 0
Promedio Inc Inc 93,5 35,5 0 0
10 1 Inc Inc 89 9 0 0
2 Inc Inc 74 10 1 0
Promedio Inc Inc 81,5 9,5 0,5 0
12 1 Inc Inc Inc 38 0 0
2 Inc Inc 106 80 0 0
Promedio Inc Inc Inc 59 0 0
24 1 Inc Inc Inc Inc 135 9
2 Inc Inc Inc 199 89 79
Promedio Inc Inc Inc 199 112 44
93
9.3. Pruebas definitivas
Cuadro A6. Determinación del pH de distintas muestras de agua de pipa microfiltrada
adicionada con probióticos medidas por triplicado durante 28 días para tres repeticiones.
Día Repetición 1 Repetición 2 Repetición 3
Muestra Réplica pH Muestra Réplica pH Muestra Réplica pH
0 19 1 4,91 14 1 4,91 4 1 4,96
2 4,84 2 4,9 2 4,95
3 4,77 3 4,9 3 4,94
20 1 4,84 19 1 4,9 13 1 4,95
2 4,88 2 4,9 2 4,94
3 4,81 3 4,9 3 4,93
24 1 4,86 20 1 4,88 15 1 4,93
2 4,80 2 4,90 2 4,93
3 4,82 3 4,89 3 4,93
7 16 1 4,87 6 1 4,9 1 1 5,11
2 4,87 2 4,89 2 5,1
3 4,86 3 4,9 3 5,1
17 1 4,86 8 1 4,93 6 1 5,11
2 4,87 2 4,9 2 5,1
3 4,87 3 4,91 3 5,1
18 1 4,84 21 1 4,92 9 1 5,11
2 4,85 2 4,92 2 5,11
3 4,86 3 4,91 3 5,11
14 1 1 5,09 1 1 4,98 5 1 5,03
2 5,08 2 4,98 2 5,05
3 5,08 3 4,97 3 5,04
9 1 5,01 2 1 4,98 7 1 5,01
2 5,00 2 4,97 2 5
3 4,98 3 4,97 3 5,08
23 1 5,09 13 1 4,97 18 1 5,04
2 5,08 2 4,96 2 5,09
3 5,08 3 4,97 3 5,04
21 4 1 4,78 3 1 4,96 8 1 4,8
2 4,82 2 4,94 2 4,81
3 4,83 3 4,94 3 4,8
10 1 4,89 15 1 4,93 10 1 4,82
2 4,92 2 4,93 2 4,81
3 4,91 3 4,92 3 4,82
21 1 4,89 18
1 4,92 11 1 4,82
2 4,90 2 4,92 2 4,82
94
3 4,92 3 4,92 3 4,82
28 3 1 4,92 11 1 4,95 12 1 4,75
2 4,89 2 4,95 2 4,74
3 4,87 3 4,94 3 4,74
5 1 4,83 16 1 4,92 14 1 4,74
2 4,85 2 4,92 2 4,74
3 4,84 3 4,92 3 4,74
14 1 4,99 17 1 4,94 19 1 4,75
2 4,98 2 4,94 2 4,75
3 4,96 3 4,94 3 4,75
Cuadro A7. Determinación de la acidez titulable de distintas muestras de agua de pipa
microfiltrada adicionada con probióticos medidas por triplicado durante 28 días para tres
repeticiones.
Día Repetición 1 Repetición 2 Repetición 3
Muestra Réplica Volumen
(mL
NaOH
0,1
mol/L)
Acidez
(%)
Muestra Réplica Volumen
(mL
NaOH
0,1
mol/L)
Acidez
(%)
Muestra Réplica Volumen
(mL
NaOH
0,1
mol/L)
Acidez
(%)
0 19 1 1,080 0,0729 14 1 1,300 0,0878 4 1 1,060 0,0716
2 1,400 0,0946 2 1,280 0,0864 2 1,050 0,0709
3 1,280 0,0864 3 1,300 0,0878 3 1,050 0,0709
20 1 1,260 0,0851 19 1 1,240 0,0837 13 1 1,080 0,0729
2 1,200 0,0810 2 1,280 0,0864 2 1,100 0,0743
3 1,300 0,0878 3 1,280 0,0864 3 1,100 0,0743
24 1 1,220 0,0824 20 1 1,260 0,0851 15 1 1,130 0,0763
2 1,220 0,0824 2 1,260 0,0851 2 1,120 0,0756
3 1,180 0,0797 3 1,280 0,0864 3 1,180 0,0797
7 16 1 1,110 0,0750 6 1 0,950 0,0642 1 1 1,015 0,0685
2 1,220 0,0824 2 1,040 0,0702 2 0,855 0,0577
3 1,280 0,0864 3 1,050 0,0709 3 0,865 0,0584
17 1 1,280 0,0864 8 1 1,070 0,0723 6 1 0,870 0,0588
2 1,320 0,0891 2 0,940 0,0635 2 0,925 0,0625
3 1,280 0,0864 3 0,930 0,0628 3 0,860 0,0581
95
18 1 1,320 0,0891 21 1 1,070 0,0723 9 1 0,925 0,0625
2 1,340 0,0905 2 0,975 0,0658 2 0,895 0,0604
3 1,360 0,0918 3 0,990 0,0669 3 0,835 0,0564
14 1 1 1,200 0,0810 1 1 0,905 0,0724 5 1 0,845 0,0676
2 1,220 0,0824 2 0,890 0,0712 2 0,770 0,0616
3 1,260 0,0851 3 0,855 0,0684 3 0,780 0,0624
9 1 1,160 0,0783 2 1 0,870 0,0696 7 1 0,765 0,0612
2 1,160 0,0783 2 0,915 0,0732 2 0,760 0,0608
3 1,140 0,0770 3 0,860 0,0688 3 0,720 0,0576
23 1 1,280 0,0864 13 1 0,845 0,0676 18 1 0,765 0,0612
2 1,300 0,0878 2 0,905 0,0724 2 0,765 0,0612
3 1,300 0,0878 3 0,915 0,0732 3 0,745 0,0596
21 4 1 1,280 0,0864 3 1 0,990 0,0792 8 1 1,030 0,0824
2 1,220 0,0824 2 0,980 0,0784 2 0,875 0,0700
3 1,240 0,0837 3 0,915 0,0732 3 0,885 0,0708
10 1 1,260 0,0851 15 1 0,915 0,0732 10 1 0,885 0,0708
2 1,240 0,0837 2 0,920 0,0736 2 0,895 0,0716
3 1,240 0,0837 3 0,940 0,0752 3 0,865 0,0692
21 1 1,240 0,0837 18 1 0,955 0,0764 11 1 0,855 0,0684
2 1,200 0,0810 2 0,895 0,0716 2 0,790 0,0632
3 1,160 0,0783 3 0,915 0,0732 3 0,750 0,0600
28 3 1 1,160 0,0783 11 1 1,050 0,0840 12 1 0,365 0,0750
2 1,160 0,0783 2 0,975 0,0780 2 0,340 0,0698
3 1,180 0,0797 3 1,350 0,1079 3 0,335 0,0688
5 1 1,180 0,0797 16 1 0,885 0,0708 14 1 0,320 0,0657
2 1,180 0,0797 2 0,925 0,0740 2 0,310 0,0637
3 1,200 0,0810 3 0,885 0,0708 3 0,315 0,0647
14 1 1,080 0,0729 17 1 0,930 0,0744 19 1 0,265 0,0544
2 1,080 0,0729 2 0,995 0,0796 2 0,315 0,0647
3 1,080 0,0729 3 0,995 0,0796 3 0,285 0,0585
96
Cuadro A8. Determinación de los sólidos solubles expresados como °Brix de distintas
muestras de agua de pipa microfiltrada adicionada con probióticos medidas por triplicado
durante 28 días para tres repeticiones.
Día Repetición 1 Repetición 2 Repetición 3
Muestra Réplica S.S.
(ºBrix)
Muestra Réplica S.S.
(ºBrix)
Muestra Réplica S.S.
(ºBrix)
0 19 1 4,94 14 1 5,50 4 1 6,00
2 4,94 2 5,00 2 6,00
3 4,94 3 5,00 3 6,00
20 1 4,94 19 1 5,50 13 1 6,00
2 4,94 2 5,00 2 6,00
3 4,94 3 5,00 3 6,00
24 1 4,94 20 1 5,00 15 1 6,00
2 4,94 2 5,00 2 6,00
3 4,94 3 5,00 3 6,00
7 16 1 4,75 6 1 5,19 1 1 5,55
2 4,75 2 5,19 2 5,55
3 4,75 3 5,19 3 5,55
17 1 4,94 8 1 5,19 6 1 5,55
2 4,94 2 5,19 2 5,55
3 4,94 3 5,19 3 5,55
18 1 4,94 21 1 5,19 9 1 5,55
2 4,94 2 5,19 2 5,55
3 4,94 3 5,19 3 5,55
14 1 1 5,35 1 1 5,31 5 1 5,15
2 4,85 2 5,31 2 5,15
3 4,85 3 5,31 3 5,15
9 1 4,35 2 1 5,31 7 1 5,15
2 4,85 2 5,31 2 5,15
3 4,85 3 5,31 3 5,15
23 1 4,85 13 1 5,31 18 1 5,15
2 4,85 2 5,31 2 5,15
3 4,85 3 5,31 3 5,15
21 4 1 4,94 3 1 5,25 8 1 5,55
2 4,94 2 5,25 2 5,55
3 4,94 3 5,25 3 5,55
10 1 4,94 15 1 5,00 10 1 5,55
2 4,94 2 5,00 2 5,55
97
3 4,94 3 5,00 3 5,55
21 1 4,94 18 1 5,00 11 1 5,55
2 4,94 2 5,00 2 5,55
3 4,94 3 5,00 3 5,55
28 3 1 5,00 11 1 5,25 12 1 5,55
2 5,00 2 5,25 2 5,55
3 5,00 3 5,25 3 5,55
5 1 5,00 16 1 5,25 14 1 5,55
2 5,00 2 5,25 2 5,55
3 5,00 3 5,25 3 5,55
14 1 4,50 17 1 5,25 19 1 5,55
2 4,50 2 5,19 2 5,55
3 4,50 3 5,19 3 5,55
Cuadro A9. Determinación de la turbidez de distintas muestras de agua de pipa microfiltrada
adicionada con probióticos medidas por triplicado durante 28 días para tres repeticiones.
Día Repetición 1 Repetición 2 Repetición 3
Muestra Réplica Turbidez Muestra Réplica Turbidez Muestra Réplica Turbidez
0 19 1 5,04 14 1 15,00 4 1 11,80
2 4,99 2 15,90 2 10,90
3 5,04 3 16,20 3 11,60
20 1 6,59 19 1 16,70 13 1 11,40
2 6,71 2 16,00 2 11,40
3 7,09 3 16,70 3 11,30
24 1 5,68 20 1 17,70 15 1 12,00
2 5,53 2 18,30 2 12,10
3 5,77 3 17,70 3 12,40
7 16 1 4,29 6 1 20,80 1 1 36,00
2 4,43 2 20,80 2 38,50
3 4,33 3 21,20 3 38,50
17 1 4,94 8 1 20,30 6 1 28,80
2 4,96 2 20,40 2 28,60
3 4,92 3 21,80 3 28,90
18 1 3,56 21 1 16,60 9 1 22,40
2 3,37 2 17,40 2 23,10
3 3,46 3 17,10 3 24,70
14 1 1 7,17 1 1 20,20 5 1 31,30
2 7,53 2 20,80 2 33,40
98
3 7,11 3 21,50 3 32,60
9 1 16,50 2 1 21,20 7 1 32,20
2 16,90 2 21,40 2 33,90
3 17,10 3 21,10 3 35,00
23 1 19,40 13 1 20,30 18 1 29,60
2 20,20 2 21,90 2 31,50
3 20,30 3 20,20 3 30,00
21 4 1 6,47 3 1 17,10 8 1 46,90
2 6,36 2 17,70 2 46,80
3 6,50 3 17,20 3 46,50
10 1 13,00 15 1 21,30 10 1 44,20
2 13,10 2 20,70 2 45,60
3 13,50 3 20,50 3 43,80
21 1 10,10 18 1 20,20 11 1 44,00
2 10,30 2 20,50 2 45,20
3 10,20 3 20,60 3 45,20
28 3 1 5,03 11 1 14,90 12 1 54,40
2 5,36 2 14,70 2 54,00
3 5,20 3 15,10 3 54,70
5 1 4,54 16 1 19,60 14 1 54,10
2 4,48 2 20,50 2 54,60
3 4,59 3 20,70 3 55,10
14 1 10,30 17 1 17,40 19 1 54,80
2 10,40 2 17,20 2 53,00
3 10,50 3 18,30 3 53,80
Cuadro A10. Número de colonias presentes en Agar estándar para el análisis de
microorganismos aerobios mesófilos en distintas muestras de agua de pipa microfiltrada
adicionada con probióticos medidas por triplicado durante 28 días para tres repeticiones.
Repetición 1.
Día Muestra Réplica Dilución
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8
0 19 1 NA Inc Inc Inc Inc 86 NA NA
2 NA Inc Inc Inc Inc 103 NA NA
Promedio NA Inc Inc Inc Inc 94,5 NA NA
20 1 NA Inc Inc Inc Inc 96 NA NA
2 NA Inc Inc Inc Inc 125 NA NA
Promedio NA Inc Inc Inc Inc 110,5 NA NA
99
24 1 NA Inc Inc Inc Inc 78 NA NA
2 NA Inc Inc Inc Inc 87 NA NA
Promedio NA NA NA Inc Inc 82,5 NA NA
Inóculo 1 NA NA NA Inc Inc Inc 0 0
2 NA NA NA Inc Inc Inc 3 0
Promedio NA NA NA Inc Inc Inc 1,5 0
7 16 1 NA Inc Inc 93 8 0 NA NA
2 NA Inc Inc 192 8 0 NA NA
Promedio NA Inc Inc 142,5 8 0 NA NA
17 1 NA Inc Inc 204 16 1 NA NA
2 NA Inc Inc 188 14 0 NA NA
Promedio NA Inc Inc 196 15 0,5 NA NA
18 1 NA Inc Inc 123 10 1 NA NA
2 NA Inc Inc 118 5 3 NA NA
Promedio NA Inc Inc 120,5 7,5 2 NA NA
14 1 1 NA Inc Inc 51 7 1 NA NA
2 NA Inc Inc 58 2 0 NA NA
Promedio NA Inc Inc 54,5 4,5 0,5 NA NA
9 1 NA Inc Inc 99 14 1 NA NA
2 NA Inc Inc 192 12 3 NA NA
Promedio NA Inc Inc 145,5 13 2 NA NA
23 1 NA Inc Inc 240 27 1 NA NA
2 NA Inc Inc 276 25 3 NA NA
Promedio NA Inc Inc 258 26 2 NA NA
21 4 1 NA NA Inc 129 26 1 NA NA
2 NA NA Inc 116 20 0 NA NA
Promedio NA NA Inc 122,5 23 0,5 NA NA
10 1 NA NA Inc Inc 55 5 NA NA
2 NA NA Inc Inc 46 6 NA NA
Promedio NA NA Inc Inc 50,5 5,5 NA NA
21 1 NA NA Inc Inc 35 2 NA NA
2 NA NA Inc Inc 53 5 NA NA
Promedio NA NA Inc Inc 44 3,5 NA NA
28 3 1 NA NA Inc 84 10 0 NA NA
2 NA NA Inc 75 8 0 NA NA
Promedio NA NA Inc 79,5 9 0 NA NA
5 1 NA NA Inc 111 18 1 NA NA
100
2 NA NA Inc 126 15 2 NA NA
Promedio NA NA Inc 118,5 16,5 1,5 NA NA
14 1 NA NA Inc Inc Inc Inc NA NA
2 NA NA Inc Inc Inc Inc NA NA
Promedio NA NA Inc Inc Inc Inc NA NA
Cuadro A11. Número de colonias presentes en Agar estándar para el análisis de
microorganismos aerobios mesófilos en distintas muestras de agua de pipa microfiltrada
adicionada con probióticos medidas por triplicado durante 28 días para tres repeticiones.
Repetición 2.
Día Muestra Réplica Dilución
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8
0 14 1 NA NA Inc Inc 24 6 NA NA
2 NA NA Inc Inc 164 1 NA NA
Promedio NA NA Inc Inc 94 3,5 NA NA
19 1 NA NA Inc 8 152 2 NA NA
2 NA NA Inc 9 4 0 NA NA
Promedio NA NA Inc 8,5 78 1 NA NA
20 1 NA NA Inc 14 0 0 NA NA
2 NA NA Inc 0 0 1 NA NA
Promedio NA NA Inc 7 0 0,5 NA NA
Inóculo 1 NA NA NA NA NA Inc NA NA
2 NA NA NA NA NA Inc NA NA
Promedio NA NA NA NA NA Inc NA NA
7 6 1 NA NA Inc Inc Inc 30 NA NA
2 NA NA Inc Inc Inc 43 NA NA
Promedio NA NA Inc Inc Inc 36,5 NA NA
8 1 NA NA Inc Inc Inc 35 NA NA
2 NA NA Inc Inc Inc 36 NA NA
Promedio NA NA Inc Inc Inc 35,5 NA NA
101
21 1 NA NA Inc Inc Inc 26 NA NA
2 NA NA Inc Inc Inc 28 NA NA
Promedio NA NA Inc Inc Inc 27 NA NA
14 1 1 NA NA Inc Inc 195 26 NA NA
2 NA NA Inc Inc 214 20 NA NA
Promedio NA NA Inc Inc 204,5 23 NA NA
2 1 NA NA Inc Inc 205 20 NA NA
2 NA NA Inc Inc 171 22 NA NA
Promedio NA NA Inc Inc 188 21 NA NA
13 1 NA NA Inc Inc 205 13 NA NA
2 NA NA Inc Inc 176 24 NA NA
Promedio NA NA Inc Inc 190,5 18,5 NA NA
21 3 1 NA NA Inc Inc 104 11 NA NA
2 NA NA Inc Inc 114 9 NA NA
Promedio NA NA Inc Inc 109 10 NA NA
15 1 NA NA Inc Inc 160 12 NA NA
2 NA NA Inc Inc 147 12 NA NA
Promedio NA NA Inc Inc 153,5 12 NA NA
18 1 NA NA Inc Inc 109 9 NA NA
2 NA NA Inc Inc 104 11 NA NA
Promedio NA NA Inc Inc 106,5 10 NA NA
28 11 1 NA NA Inc Inc 38 1 NA NA
2 NA NA Inc Inc 49 1 NA NA
Promedio NA NA Inc Inc 43,5 1 NA NA
16 1 NA NA Inc Inc 123 5 NA NA
2 NA NA Inc Inc 89 7 NA NA
Promedio NA NA Inc Inc 106 6 NA NA
102
17 1 NA NA Inc Inc 91 11 NA NA
2 NA NA Inc Inc 92 9 NA NA
Promedio NA NA Inc Inc 91,5 10 NA NA
Cuadro A12. Número de colonias presentes en Agar estándar para el análisis de
microorganismos aerobios mesófilos en distintas muestras de agua de pipa microfiltrada
adicionada con probióticos medidas por triplicado durante 28 días para tres repeticiones.
Repetición 3.
Día Muestra Réplica Dilución
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8
0 4 1 NA Inc Inc Inc 248 42 NA NA
2 NA Inc Inc Inc 352 55 NA NA
Promedio NA Inc Inc Inc 300 48,5 NA NA
13 1 NA Inc Inc Inc 216 30 NA NA
2 NA Inc Inc Inc 236 27 NA NA
Promedio NA Inc Inc Inc 226 28,5 NA NA
15 1 NA Inc Inc Inc 240 37 NA NA
2 NA Inc Inc Inc 218 36 NA NA
Promedio NA Inc Inc Inc 229 36,5 NA NA
Inóculo 1 NA NA NA Inc Inc Inc 71 6
2 NA NA NA Inc Inc Inc 86 7
Promedio NA NA NA Inc Inc Inc 78,5 6,5
7 1 1 NA NA Inc Inc Inc 74 NA NA
2 NA NA Inc Inc Inc 82 NA NA
Promedio NA NA Inc Inc Inc 78 NA NA
6 1 NA NA Inc Inc Inc 79 NA NA
2 NA NA Inc Inc Inc 81 NA NA
Promedio NA NA Inc Inc Inc 80 NA NA
9 1 NA NA Inc Inc Inc 47 NA NA
2 NA NA Inc Inc Inc 49 NA NA
Promedio NA NA Inc Inc Inc 48 NA NA
14 5 1 NA NA NA Inc Inc 101 6 NA
2 NA NA NA Inc Inc 102 10 NA
Promedio NA NA NA Inc Inc 101,5 8 NA
7 1 NA NA NA Inc Inc 97 12 NA
2 NA NA NA Inc Inc 68 6 NA
103
Promedio NA NA NA Inc Inc 82,5 9 NA
18 1 NA NA NA Inc Inc 32 5 NA
2 NA NA NA Inc Inc 39 5 NA
Promedio NA NA NA Inc Inc 35,5 5 NA
21 8 1 NA NA NA Inc Inc 75 6 NA
2 NA NA NA Inc Inc 119 10 NA
Promedio NA NA NA Inc Inc 97 8 NA
10 1 NA NA NA Inc Inc 65 11 NA
2 NA NA NA Inc Inc 55 8 NA
Promedio NA NA NA Inc Inc 60 9,5 NA
11 1 NA NA NA Inc Inc 40 6 NA
2 NA NA NA Inc Inc 72 5 NA
Promedio NA NA NA Inc Inc 56 5,5 NA
28 12 1 NA NA NA Inc Inc 95 5 NA
2 NA NA NA Inc Inc 92 3 NA
Promedio NA NA NA Inc Inc 93,5 4 NA
14 1 NA NA NA Inc Inc 94 13 NA
2 NA NA NA Inc Inc 74 8 NA
Promedio NA NA NA Inc Inc 84 10,5 NA
19 1 NA NA NA Inc Inc 118 16 NA
2 NA NA NA Inc Inc 140 11 NA
Promedio NA NA NA Inc Inc 129 13,5 NA
Cuadro A13. Número de colonias presentes en Agar MRS para el análisis de bacterias ácido
lácticas en distintas muestras de agua de pipa microfiltrada adicionada con probióticos
medidas por triplicado durante 28 días para tres repeticiones. Repetición 1.
Día Muestra Réplica Dilución
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8
0 19 1 Inc Inc Inc 100 26 NA NA NA
2 Inc Inc Inc 200 10 NA NA NA
3 Inc NA NA NA NA NA NA NA
4 Inc NA NA NA NA NA NA NA
5 Inc NA NA NA NA NA NA NA
Promedio Inc Inc Inc 150 18 NA NA NA
20 1 Inc Inc Inc 100 54 NA NA NA
2 Inc Inc Inc 65 19 NA NA NA
3 Inc NA NA NA NA NA NA NA
104
4 Inc NA NA NA NA NA NA NA
5 Inc NA NA NA NA NA NA NA
Promedio Inc Inc Inc 82,5 36,5 NA NA NA
24 1 Inc Inc Inc 150 24 NA NA NA
2 Inc Inc Inc 150 20 NA NA NA
3 Inc NA NA NA NA NA NA NA
4 Inc NA NA NA NA NA NA NA
5 Inc NA NA NA NA NA NA NA
Promedio Inc Inc Inc 150 22 NA NA NA
Inóculo 1 NA NA Inc 200 150 90 0 0
2 NA NA Inc 200 31 11 3 0
Promedio NA NA Inc 200 90,5 50,5 1,5 0
7 16 1 NA Inc Inc 187 20 1 NA NA
2 NA Inc Inc 217 21 2 NA NA
Promedio NA Inc Inc 202 20,5 1,5 NA NA
17 1 NA Inc Inc Inc 149 0 NA NA
2 NA Inc Inc Inc 49 0 NA NA
Promedio NA Inc Inc Inc 99 0 NA NA
18 1 NA Inc Inc Inc 94 5 NA NA
2 NA Inc Inc Inc 59 6 NA NA
Promedio NA Inc Inc Inc 76,5 5,5 NA NA
14 1 1 NA Inc Inc 47 2 0 NA NA
2 NA Inc Inc 170 4 0 NA NA
Promedio NA Inc Inc 108,5 3 0 NA NA
9 1 NA Inc Inc Inc 98 0 NA NA
2 NA Inc Inc 103 121 6 NA NA
Promedio NA Inc Inc Inc 109,5 3 NA NA
23 1 NA Inc Inc Inc Inc 28 NA NA
2 NA Inc Inc Inc Inc 53 NA NA
Promedio NA Inc Inc Inc Inc 40,5 NA NA
21 4 1 NA NA Inc 104 3 3 NA NA
2 NA NA Inc 118 5 1 NA NA
Promedio NA NA Inc 111 4 2 NA NA
10 1 NA NA Inc Inc 29 0 NA NA
2 NA NA Inc Inc 27 2 NA NA
Promedio NA NA Inc Inc 28 1 NA NA
23 1 NA NA Inc Inc 65 3 NA NA
105
2 NA NA Inc Inc 19 1 NA NA
Promedio NA NA Inc Inc 42 2 NA NA
28 3 1 NA NA Inc 108 10 9 NA NA
2 NA NA Inc 106 18 63 NA NA
Promedio NA NA Inc 107 14 36 NA NA
5 1 NA NA Inc 110 9 2 NA NA
2 NA NA Inc 162 11 6 NA NA
Promedio NA NA Inc 136 10 4 NA NA
14 1 NA NA Inc 77 13 1 NA NA
2 NA NA Inc 66 0 0 NA NA
Promedio NA NA Inc 71,5 6,5 0,5 NA NA
Cuadro A14. Número de colonias presentes en Agar MRS para el análisis de bacterias ácido
lácticas en distintas muestras de agua de pipa microfiltrada adicionada con probióticos
medidas por triplicado durante 28 días para tres repeticiones. Repetición 2.
Día Muestra Réplica Dilución
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8
0 14 1 NA NA Inc Inc Inc Inc NA NA
2 NA NA Inc Inc Inc 65 NA NA
Promedio NA NA Inc Inc Inc 65 NA NA
19 1 Inc Inc Inc Inc Inc 60 NA NA
2 Inc Inc Inc Inc Inc Inc NA NA
3 Inc NA NA NA NA NA NA NA
4 Inc NA NA NA NA NA NA NA
5 Inc NA NA NA NA NA NA NA
Promedio Inc Inc Inc Inc Inc 60 NA NA
20 1 Inc Inc Inc Inc Inc 122 NA NA
2 Inc Inc Inc Inc Inc 116 NA NA
3 Inc NA NA NA NA NA NA NA
4 Inc NA NA NA NA NA NA NA
5 Inc NA NA NA NA NA NA NA
Promedio Inc Inc Inc Inc Inc 119 NA NA
Inóculo 1 NA NA Inc Inc Inc Inc Inc 35
2 NA NA Inc Inc Inc Inc Inc 29
Promedio NA NA Inc Inc Inc Inc Inc 32
7 6 1 NA NA Inc Inc Inc 1 NA NA
106
2 NA NA Inc Inc Inc 0 NA NA
Promedio NA NA Inc Inc Inc 0,5 NA NA
8 1 NA NA Inc Inc Inc 164 NA NA
2 NA NA Inc Inc Inc 275 NA NA
Promedio NA NA Inc Inc Inc 219,5 NA NA
21 1 NA NA Inc Inc Inc 131 NA NA
2 NA NA Inc Inc Inc Inc NA NA
Promedio NA NA Inc Inc Inc 131 NA NA
14 1 1 NA NA Inc Inc 281 24 NA NA
2 NA NA Inc Inc 302 19 NA NA
Promedio NA NA Inc Inc 291,5 21,5 NA NA
2 1 NA NA Inc Inc Inc 105 NA NA
2 NA NA Inc Inc Inc 111 NA NA
Promedio NA NA Inc Inc Inc 108 NA NA
13 1 NA NA Inc Inc Inc 35 NA NA
2 NA NA Inc Inc Inc 26 NA NA
Promedio NA NA Inc Inc Inc 30,5 NA NA
21 3 1 NA NA Inc Inc 120 10 NA NA
2 NA NA Inc Inc 99 19 NA NA
Promedio NA NA Inc Inc 109,5 14,5 NA NA
15 1 NA NA Inc Inc Inc 50 NA NA
2 NA NA Inc Inc Inc 50 NA NA
Promedio NA NA Inc Inc Inc 50 NA NA
18 1 NA NA Inc Inc Inc 49 NA NA
2 NA NA Inc Inc Inc 209 NA NA
Promedio NA NA Inc Inc Inc 129 NA NA
28 11 1 NA NA Inc Inc 59 59 NA NA
2 NA NA Inc Inc 48 67 NA NA
Promedio NA NA Inc Inc 53,5 63 NA NA
16 1 NA NA Inc Inc 80 22 NA NA
2 NA NA Inc Inc 52 15 NA NA
Promedio NA NA Inc Inc 66 18,5 NA NA
17 1 NA NA Inc Inc 204 6 NA NA
2 NA NA Inc Inc 87 7 NA NA
Promedio NA NA Inc Inc 145,5 6,5 NA NA
107
Cuadro A15. Número de colonias presentes en Agar MRS para el análisis de bacterias ácido
lácticas en distintas muestras de agua de pipa microfiltrada adicionada con probióticos
medidas por triplicado durante 28 días para tres repeticiones. Repetición 3.
Día Muestra Réplica Dilución
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8
0 4 1 NA NA NA Inc Inc Inc 15 NA
2 NA NA NA Inc Inc Inc 36 NA
3 NA NA NA NA NA NA NA NA
4 NA NA NA NA NA NA NA NA
5 NA NA NA NA NA NA NA NA
Promedio NA NA NA Inc Inc Inc 25,5 NA
13 1 NA NA NA Inc Inc 41 65 NA
2 NA NA NA Inc Inc 227 113 NA
3 NA NA NA NA NA NA NA NA
4 NA NA NA NA NA NA NA NA
5 NA NA NA NA NA NA NA NA
Promedio NA NA NA Inc Inc 134 89 NA
15 1 NA NA NA Inc Inc 114 12 NA
2 NA NA NA Inc Inc Inc 0 NA
3 NA NA NA NA NA NA NA NA
4 NA NA NA NA NA NA NA NA
5 NA NA NA NA NA NA NA NA
Promedio NA NA NA Inc Inc 114 6 NA
inóculo 1 NA NA NA Inc Inc Inc 135 9
2 NA NA NA Inc Inc 199 89 79
Promedio NA NA NA Inc Inc 199 112 44
7 1 1 NA NA Inc Inc Inc 71 NA NA
2 NA NA Inc Inc Inc 70 NA NA
Promedio NA NA Inc Inc Inc 70,5 NA NA
6 1 NA NA Inc Inc Inc 65 NA NA
2 NA NA Inc Inc Inc 111 NA NA
Promedio NA NA Inc Inc Inc 88 NA NA
9 1 NA NA Inc Inc Inc 47 NA NA
2 NA NA Inc Inc Inc 129 NA NA
Promedio NA NA Inc Inc Inc 88 NA NA
14 5 1 NA NA NA Inc Inc 131 2 NA
2 NA NA NA Inc Inc 287 10 NA
108
Promedio NA NA NA Inc Inc 209 6 NA
7 1 NA NA NA Inc Inc 59 4 NA
2 NA NA NA Inc Inc 44 10 NA
Promedio NA NA NA Inc Inc 51,5 7 NA
18 1 NA NA NA Inc Inc 133 0 NA
2 NA NA NA Inc Inc 30 0 NA
Promedio NA NA NA Inc Inc 81,5 0 NA
21 8 1 NA NA NA Inc Inc 202 21 NA
2 NA NA NA Inc Inc 103 15 NA
Promedio NA NA NA Inc Inc 152,5 18 NA
10 1 NA NA NA Inc Inc 35 13 NA
2 NA NA NA Inc Inc 43 8 NA
Promedio NA NA NA Inc Inc 39 10,5 NA
11 1 NA NA NA Inc Inc 154 2 NA
2 NA NA NA Inc Inc 43 52 NA
Promedio NA NA NA Inc Inc 98,5 27 NA
28 12 1 NA NA NA Inc Inc 59 12 NA
2 NA NA NA Inc Inc 68 8 NA
Promedio NA NA NA Inc Inc 63,5 10 NA
14 1 NA NA NA Inc Inc 238 51 NA
2 NA NA NA Inc Inc 65 99 NA
Promedio NA NA NA Inc Inc 151,5 75 NA
19 1 NA NA NA Inc Inc Inc Inc NA
2 NA NA NA Inc Inc Inc Inc NA
Promedio NA NA NA Inc Inc Inc Inc NA
Cuadro A16. Número de colonias presentes en Agar papa dextrosa acidificado para el
análisis de mohos y levaduras en distintas muestras de agua de pipa microfiltrada adicionada
con probióticos medidas por triplicado durante 28 días para tres repeticiones. Repetición 1.
Día Muestra Réplica Dilución
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8
0 19 1 Inc Inc Inc 57 9 1 0 1
2 Inc Inc Inc 26 9 0 0 0
3 Inc Inc Inc 44 7 0 0 0
Promedio Inc Inc Inc 42,3 8,3 0,33 0,0 0,33
20 1 Inc Inc Inc 18 12 1 0 0
109
2 Inc Inc Inc 60 17 1 0 0
3 Inc Inc Inc 15 4 2 0 0
Promedio Inc Inc Inc 31,0 11,0 1,3 0,0 0,0
24 1 Inc Inc Inc 42 3 5 0 1
2 Inc Inc Inc 41 40 1 0 0
3 Inc Inc Inc inc 36 7 0 0
Promedio Inc Inc Inc 41,5 26,3 4,3 0,0 0,33
Inóculo 1 Inc Inc 25 5,0 1,0 0,0 1,0 0,0
2 Inc Inc 5 1,0 1,0 0,0 0,0 0,0
3 Inc Inc 19 7,0 0,0 0,0 1,0 0,0
Promedio Inc Inc 16,33 4,33 0,67 0,00 0,67 0,00
7 16 1 NA 0 1 0 0 0 0 0
2 NA 0 0 0 0 0 0 0
3 NA 0 0 0 0 0 0 0
Promedio NA 0 0,33 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
17 1 NA 0 0 0 0 0 1 0
2 NA 0 0 0 0 0 0 0
3 NA 0 0 0 0 0 0 0
Promedio NA 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,33 0,0
18 1 NA 1 1 0 0 1 0 0
2 NA 1 0 0 0 0 0 0
3 NA 0 0 0 0 0 0 0
Promedio NA 0,7 0,33 0,0 0,0 0,33 0,0 0,0
14 1 1 NA 0 0 0 0 0 NA NA
2 NA 0 0 0 0 0 NA NA
3 NA 2 0 1 0 0 NA NA
Promedio NA 0,67 0,00 0,33 0,00 0,00 NA NA
9 1 NA 1 0 0 2 0 NA NA
2 NA 1 0 0 0 0 NA NA
3 NA 0 0 0 0 0 NA NA
Promedio NA 0,67 0,00 0,00 0,67 0,00 NA NA
23 1 NA 4 0 0 0 0 NA NA
2 NA 1 0 0 0 0 NA NA
3 NA 1 0 0 0 0 NA NA
Promedio NA 2 0 0 0 0 NA NA
110
21 4 1 0 0 1 NA NA NA NA NA
2 0 0 0 NA NA NA NA NA
3 0 0 0 NA NA NA NA NA
Promedio 0 0 0,33 NA NA NA NA NA
10 1 0 0 1 NA NA NA NA NA
2 0 0 0 NA NA NA NA NA
3 0 0 0 NA NA NA NA NA
Promedio 0 0 0,33 NA NA NA NA NA
21 1 0 0 0 NA NA NA NA NA
2 0 0 0 NA NA NA NA NA
3 0 0 0 NA NA NA NA NA
Promedio 0 0 0 NA NA NA NA NA
28 3 1 0 0 0 NA NA NA NA NA
2 0 0 0 NA NA NA NA NA
3 0 0 0 NA NA NA NA NA
Promedio 0 0 0 NA NA NA NA NA
5 1 0 0 0 NA NA NA NA NA
2 0 0 0 NA NA NA NA NA
3 0 0 0 NA NA NA NA NA
Promedio 0 0 0 NA NA NA NA NA
14 1 0 0 0 NA NA NA NA NA
2 0 0 0 NA NA NA NA NA
3 0 0 0 NA NA NA NA NA
Promedio 0 0 0 NA NA NA NA NA
Cuadro A17. Número de colonias presentes en Agar papa dextrosa acidificado para el
análisis de mohos y levaduras en distintas muestras de agua de pipa microfiltrada adicionada
con probióticos medidas por triplicado durante 28 días para tres repeticiones. Repetición 2.
Día Muestra Réplica Dilución
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8
0 14 1 1 0 0 0 1 1 1 0
2 0 0 0 0 0 1 1 0
3 0 0 0 0 0 0 0 0
Promedio 0,33 0 0 0 0,33 0,7 0,7 0,0
19 1 1 0 0 0 0 0 2 0
2 0 0 0 0 0 1 1 1
111
3 0 0 0 0 0 5 0 3
Promedio 0 0 0 0,0 0,0 2,0 1,0 1,3
20 1 1 0 0 0 0 1 0 0
2 0 0 0 0 0 0 0 0
3 0 0 0 0 0 0 0 0
Promedio 0,33 0 0 0 0 0,33 0 0
Inóculo 1 Inc Inc 25 5,0 1,0 0,0 1,0 0,0
2 Inc Inc 5 1,0 1,0 0,0 0,0 0,0
3 Inc Inc 19 7,0 0,0 0,0 1,0 0,0
Promedio Inc Inc 16,33 4,33 0,67 0,00 0,67 0,00
7 6 1 0 0 0 NA NA NA NA NA
2 0 0 0 NA NA NA NA NA
3 0 0 0 NA NA NA NA NA
Promedio 0 0 0 NA NA NA NA NA
8 1 0 0 0 NA NA NA NA NA
2 0 0 0 NA NA NA NA NA
3 0 0 0 NA NA NA NA NA
Promedio 0 0 0 NA NA NA NA NA
21 1 0 0 1 NA NA NA NA NA
2 0 0 NA NA NA NA NA
3 0 0 0 NA NA NA NA NA
Promedio 0 0 0,3 NA NA NA NA NA
14 1 1 0 0 0 NA NA NA NA NA
2 0 0 0 NA NA NA NA NA
3 0 0 0 NA NA NA NA NA
Promedio 0 0 0 NA NA NA NA NA
2 1 1 1 3 NA NA NA NA NA
2 0 0 0 NA NA NA NA NA
3 0 0 0 NA NA NA NA NA
Promedio 0,33 0,33 1 NA NA NA NA NA
13 1 0 0 0 NA NA NA NA NA
2 0 0 0 NA NA NA NA NA
3 0 0 0 NA NA NA NA NA
Promedio 0 0 0 NA NA NA NA NA
21 3 1 0 1 0 NA NA NA NA NA
2 0 0 0 NA NA NA NA NA
3 0 0 0 NA NA NA NA NA
112
Promedio 0 0,33 0 NA NA NA NA NA
15 1 0 0 0 NA NA NA NA NA
2 0 0 0 NA NA NA NA NA
3 0 0 0 NA NA NA NA NA
Promedio 0 0 0 NA NA NA NA NA
18 1 0 1 0 NA NA NA NA NA
2 0 0 0 NA NA NA NA NA
3 0 0 0 NA NA NA NA NA
Promedio 0 0,33 0 NA NA NA NA NA
28 11 1 1 0 0 NA NA NA NA NA
2 0 0 0 NA NA NA NA NA
3 0 0 0 NA NA NA NA NA
Promedio 0,33 0 0 NA NA NA NA NA
16 1 0 1 0 NA NA NA NA NA
2 0 0 0 NA NA NA NA NA
3 0 0 0 NA NA NA NA NA
Promedio 0 0,33 0 NA NA NA NA NA
17 1 0 2 0 NA NA NA NA NA
2 0 0 0 NA NA NA NA NA
3 0 0 0 NA NA NA NA NA
Promedio 0 0,7 0 NA NA NA NA NA
Cuadro A18. Número de colonias presentes en Agar papa dextrosa acidificado para el
análisis de mohos y levaduras en distintas muestras de agua de pipa microfiltrada adicionada
con probióticos medidas por triplicado durante 28 días para tres repeticiones. Repetición 3.
Día Muestra Réplica Dilución
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
0 4 1 12 2 0 NA NA NA
2 30 0 0 NA NA NA
3 14 0 0 NA NA NA
Promedio 18,7 0,7 0,0 NA NA NA
13 1 4 4 1 NA NA NA
2 10 2 1 NA NA NA
3 13 0 0 NA NA NA
Promedio 9,0 2,0 0,7 NA NA NA
15 1 12 33 0 NA NA NA
2 1 4 1 NA NA NA
113
3 2 1 4 NA NA NA
Promedio 5,0 12,7 1,7 NA NA NA
Inóculo 1 0 0 0 0 0 0
2 0 0 0 0 0 0
3 0 1 0 0 0 0
Promedio 0 0,33 0 0 0 0
7 1 1 4 0 0 NA NA NA
2 15 0 0 NA NA NA
3 0 0 0 NA NA NA
Promedio 6,3 0 0 NA NA NA
6 1 0 0 1 NA NA NA
2 0 0 0 NA NA NA
3 0 0 0 NA NA NA
Promedio 0 0 0,33 NA NA NA
9 1 0 1 0 NA NA NA
2 0 0 0 NA NA NA
3 0 0 0 NA NA NA
Promedio 0 0,33 0 NA NA NA
14 5 1 0 0 15 NA NA NA
2 0 0 13 NA NA NA
3 0 0 13 NA NA NA
Promedio 0 0 13,7 NA NA NA
7 1 0 0 0 NA NA NA
2 0 0 0 NA NA NA
3 0 0 0 NA NA NA
Promedio 0 0 0 NA NA NA
18 1 0 0 1 NA NA NA
2 0 0 0 NA NA NA
3 0 0 0 NA NA NA
Promedio 0 0 0,33 NA NA NA
21 8 1 0 0 0 NA NA NA
2 0 0 0 NA NA NA
3 0 0 0 NA NA NA
Promedio 0 0 0 NA NA NA
10 1 0 0 0 NA NA NA
2 0 0 0 NA NA NA
3 0 0 0 NA NA NA
Promedio 0 0 0 NA NA NA
114
11 1 0 3 38 NA NA NA
2 0 0 43 NA NA NA
3 0 0 40 NA NA NA
Promedio 0 1 40,3 NA NA NA
28 12 1 1 1 0 NA NA NA
2 0 0 0 NA NA NA
3 0 0 0 NA NA NA
Promedio 0,33 0,33 0 NA NA NA
14 1 0 0 0 NA NA NA
2 0 0 0 NA NA NA
3 0 0 0 NA NA NA
Promedio 0 0 0 NA NA NA
19 1 0 0 0 NA NA NA
2 0 0 0 NA NA NA
3 0 0 0 NA NA NA
Promedio 0 0 0 NA NA NA
Cuadro A19. Datos finales utilizados en el análisis estadístico de regresión lineal para cada uno de
los parámetros evaluados.
Tiempo
(d)
Repetición Turbidez
(NTU)
pH Sólidos solubles
(ºBrix)
Acidez (g/100 g eq.
ácido málico)
RTA
log 10
BAL
log 10
M y L
log 10
0 1 5,83 4,84 4,94 0,0836 7,981 6,107 0,954
0 2 16,69 4,9 5,11 0,0861 ND 7,910 0,954
0 3 11,66 4,94 6,00 0,0741 7,577 8,623 2,713
7 1 4,25 4,86 4,88 0,0864 6,185 6,814 1,279
7 2 19,6 4,91 5,19 0,0676 7,502 8,076 0,954
7 3 23,1 5,11 5,55 0,0604 7,837 8,076 1,433
14 1 14,69 5,05 4,85 0,0827 6,185 7,243 1,279
14 2 20,96 4,97 5,31 0,0707 7,288 7,727 0,954
14 3 32,17 5,04 5,15 0,0614 7,865 8,057 0,954
21 1 9,95 4,87 4,94 0,0831 6,859 6,431 0,954
21 2 19,53 4,93 5,08 0,0748 7,090 7,799 0,954
21 3 45,36 4,81 5,55 0,0696 7,851 7,986 0,954
28 1 6,71 4,89 4,83 0,0729 6,660 6,021 0,954
28 2 17,6 4,94 5,24 0,0799 6,905 7,393 0,954
28 3 54,28 4,74 5,55 0,0651 8,009 8,610 0,954
115
Cuadro A20. Valores de delta seleccionados en el análisis estadístico de los parámetros
fisicoquímicos y microbiológicos para la bebida de agua de pipa microfiltrada adicionada con
probióticos, durante 28 días de almacenamiento a 4 °C.
Parámetro fisicoquímico o microbiológico Valor delta (ɗ)
pH 0,01
Acidez titulable (g/100g) eq. Ácido málico 0,001
Sólidos solubles (°Brix) 0,05
Turbidez (NTU) 0,01
Recuento total aerobio (Log 10 UFC/mL) 1,0
Recuento de bacterias ácido lácticas (Log10 UFC/mL) 1,0
Recuento de mohos y levaduras (Log 10 UFC/mL) 1,0
116
9.4. Ficha técnica del Lactobacillus paracasei subsp. paracasei (cepa CRL-431®).
![San Sebas[1]](https://img.pdfslide.es/doc/110x75/55a31cab1a28abd2178b4602/san-sebas1.jpg)
