UNIVERSIDAD DE CHILE€¦ · Daniela Seelenfreund _ Dr. Roberto Vidal _ "Los animales no se comunican con el fin de exhibirse, sino con el fin de la gestión de un entorno

UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACEUTICAS

"Construcción de vacunas de ADN de Salmonella

enterica serovar Enteritidis y evaluación de la respuesta inmune generada en un modelo murino"

Tesis para Optar al Grado Académico de Magíster en Bioquímica

Área de Especialización: Bioquímica Ambiental

Memoria para Optar al Título de Bioquímico

PAULA ELIZABETH VELOZO HERMOSILLA

Directores de Tesis

Dra. Lucía Inés Contreras Osorio

Dr. Carlos Alberto Santiviago Cid

SANTIAGO- CHILE 2010

UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS

INFORME DE APROBACIÓN

TESIS DE MAGISTER

Se informa a la Dirección de Postgrado de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas que la Tesis de Magister presentada por el candidato:

PAULA ELIZABETH VELOZO HERMOSILLA

Ha sido aprobada por la Comisión Informante de Tesis como requisito para optar al grado de Magister en Bioquímica área de especialización Bioquímica Ambiental y al título de Bioquímica, en el examen de defensa de Tesis rendido el día _____________________del 2010. Directores de Tesis: Dra. Lucía Inés Contreras Osorio ___________________________ Dr. Carlos Alberto Santiviago Cid ___________________________ Comisión Informante de Tesis: Dr. Javier Puente (Presidente) ___________________________ Dra. Daniela Seelenfreund ___________________________ Dr. Roberto Vidal ___________________________

"Los animales no se comunican con el fin de exhibirse, sino con el fin de la

gestión de un entorno social."

West y King

Ecology and evolution of acoustic communication in birds

Agradecimientos

Esta memoria representa el término de largos años de estudio, durante los

cuales he recibido el apoyo y confianza de familiares y amigos que me han

acompañado en cada momento.

Ha sido el proceso de crecer como persona, aprender valores,

conocimientos y desafíos. No podría haber llegado a esta etapa de investigación si

no hubiese sido por el apoyo siempre presente de todos ellos.

Quiero expresar mis agradecimientos personales en primera instancia a mis

padres y hermanos, quienes han sido un pilar fundamental en todo aspecto de mi

vida, por su continuo apoyo y esfuerzo, entregándome toda la energía y ánimo

para continuar en los momentos difíciles.

Agradecer a la Dra. Inés Contreras y al Dr. Carlos Santiviago por permitirme

trabajar bajo su dirección, por su apoyo y preocupación constante, formación y

cariño.

A la Profesora Mercedes Zaldívar y al Dr. Sergio Álvarez por su disposición

y ayuda.

Agradecer también a la Dra. Cecilia Toro por permitirme realizar el trabajo

de tesis es su laboratorio.

A mis amigas y compañeras Alicia Marcoleta, Verónica Bravo, Ruby

Carrasco y Valeria Caballero por su guía, consejos y todos los gratos momentos

compartidos.

También quiero mencionar a mis grandes amigos Valentina Parra y Ernesto

Muños, quienes han estado conmigo todos estos años y son parte importante de

todo este largo proceso.

Finalmente, quiero agradecer a todos mis compañeros de carrera y grandes

amigos, ya que gracias a ellos las intensas horas de estudio... no se hicieron tan

intensas.

Esta tesis se realizó en el laboratorio de Biología Molecular del Programa

de Microbiología y Micología del Instituto de Ciencias Biomédicas de la Facultad

de Medicina de la Universidad de Chile, bajo la dirección de los profesores Dres.

Inés Contreras O. y Carlos Santiviago C. El trabajo asociado a ratones se realizó

en conjunto con el profesor Dr. Ángel Oñate C. en el laboratorio de Inmunología

Molecular del Departamento de Microbiología de la Facultad de Ciencias

Biológicas de la Universidad de Concepción. Financiada por el Proyecto Anillo de

Investigación en Ciencia y Tecnología ADI 08/2006.

INDICE DE CONTENIDOS Pág.INDICE DE CONTENIDOS vi

INDICE DE TABLAS Y FIGURAS ix

ABREVIATURAS xi

RESUMEN xiii

SUMMARY xv

1. INTRODUCCION 1

1.1 Epidemiología de Salmonella enterica serovar Enteritidis 1

1.2 Salmonella Enteritidis en aves y su transmisión zoonótica al hombre 2

1.3 Mecanismos moleculares de patogenicidad de S. Enteritidis 3

1.4 Inmunidad frente a Salmonella 4

1.5 Estrategias de control de la infección por S. Enteritidis 4

1.6 Nuevas estrategias de protección inmune. Vacunas de ADN 5

1.7 Genes inmunogénicos de S. Enteritidis 6

1.7.1 Isla genómica SPI-19 6

1.7.2 Isla genómica ΦSE14 7

1.8 Hipótesis 9

1.9 Objetivo General 9

1.10 Objetivos Específicos 9

2. MATERIALES Y METODOS 10

2.1 Reactivos 10

2.2 Cepas bacterianas 12

2.3 Líneas celulares 12

2.4 Modelo animal 12

2.5 Medios y condiciones de cultivo bacteriano 13

2.6 Medios y condiciones de cultivo celular 13

2.7 Plasmidios 14

2.8 Partidores 14

vi

2.9 Construcción del vector de clonamiento pVAXFlag 15

2.9.1 Extracción de ADN plasmidial 15

2.9.2 Cuantificación de ADN 16

2.9.3 Electroforesis en gel de agarosa 16

2.9.4 Digestión con enzimas de restricción 16

2.9.5 Obtención de productos de PCR 17

2.9.6 Reacciones de ligación 17

2.9.7 Transformación por electroporación 18

2.9.8 Purificación de ADN desde gel de agarosa 18

2.10 Construcción de vectores de expresión 19

2.10.1 Extracción de ADN genómico 19

2.10.2 Obtención de los genes SEN1395 y SEN1002 para el

clonamiento

19

2.11 Evaluación de la producción de proteínas recombinantes en E. coli 20

2.11.1 Ensayo de inducción con IPTG 20

2.11.2 Separación electroforética de proteínas 20

2.11.3 Tinción de gel de proteínas con azul de Coomassie 21

2.11.4 Western blot 21

2.11.5 Extracción de proteína recombinante 21

2.11.6 Cuantificación de proteínas 22

2.12 Evaluación de producción proteica in vitro en células eucariontes 22

2.12.1 Estandarización de la técnica de transfección 22

2.12.2 Ensayo de transfección en células HEK 23

2.12.3 Lisis celular 23

2.13 Caracterización de vacunas in vivo en ratones BALB/c 24

2.13.1 Vacunación de ratones BALB/c 24

2.13.1.1 Extracción de plasmidio a gran escala 24

2.13.1.2 Inmunización 25

2.13.2 Linfoproliferación 25

2.13.3 Cuantificación de citoquinas 25

2.13.4 Desafío 26

vii

2.14 Análisis estadístico 26

3. RESULTADOS 27

3.1 Construcción del vector de clonamiento pVAXFlag 27

3.1.1 Construcción de los plasmidios intermediarios pLTS y pVAXFlag/bla.

27

3.1.2 Eliminación de gen bla y generación del vector pVAXFlag. 28

3.2. Construcción de vectores de expresión. Vacunas de ADN 30

3.2.1 Preparación de insertos (genes SEN1002 y SEN1395). 30

3.2.2 Clonamiento de SEN1002 y SEN1395 en pVAXFlag. Construcción de vacunas.

31

3.3. Evaluación de expresión de proteínas in vitro. 37

3.3.1 Expresión de proteínas en bacteria. 37

3.3.2 Expresión de proteínas en células eucariontes. 37

3. 4. Caracterización de las vacunas in vivo en ratones BALB/c 41

3.4.1 Planificación temporal de los ensayos. 41

3.4.2 Respuesta inmune 42

3.4.2.1 Linfoproliferación 43

3.4.2.2 Cuantificación de citoquinas secretadas 43

3.4.3 Desafío con LK5 de ratones BALB/c inmunizados 46

4. DISCUSION 47

5. CONCLUSIONES 53

6. REFERENCIAS 54

viii

INDICE DE TABLAS Y FIGURAS Pág.Tabla 1 Cepas bacterianas utilizadas en la presente Tesis 12

Tabla 2 Líneas celulares utilizadas en esta Tesis 12

Tabla 3 Grupos de ratones Balb/c utilizados en esta Tesis 13

Tabla 4 Plasmidios utilizados en esta Tesis 14

Tabla 5 Partidores utilizados en esta Tesis 14

Tabla 6 Secuenciación de pVAXFlag 34

Tabla 7 Secuenciación de pVAXFlag/SEN1002 35

Tabla 8 Secuenciación de pVAXFlag/SEN1395 36

Tabla 9 Condiciones de estandarización de transfección 39

Tabla 10 Recuento de Salmonella enterica LK5 a partir del bazo de

ratones vacunados

46

Figura 1 Ciclo infectivo de Salmonella enterica serovar Enteritidis 2

Figura 2 Esquema representativo de una vacuna de ADN 6

Figura 3 Esquema de la organización genética de la isla genómica

SPI-19 en S. Enteritidis

7

Figura 4 ΦSE14 8

Figura 5 Diagrama de residuos antigénicos de la proteína SEN1395 8

Figura 6 Diagrama de la deleción del gen de resistencia a kanamicina

del plasmidio pSUB11 y la construcción del plasmidio pLTS

27

Figura 7 Diagrama de vectores de expresión 28

Figura 8 Comprobación de la correcta construcción de los plasmidios 29

Figura 9A Esquema de partidores de PCR para clonamiento 30

Figura 9B Productos de PCR para clonamiento 30

Figura 10 Esquema de clonamiento del fragmento de interés en

pVAXFlag y la proteína recombinante generada por la

transcripción y traducción en procariontes y eucariones

31

Figura 11 PCR de confirmación de la transformación en DH5α con los

plasmidios construidos

32

ix

Figura 12 Confirmación de las construcciones por tamaño plasmidial 33

Figura 13 Expresión de proteínas recombinantes en bacteria 38

Figura 14 Estandarización del ensayo de transfección en células

HEK293 con pVAXFlag/GFP

40

Figura 15 Expresión de proteínas recombinantes en HEK293 41

Figura 16 Planificación temporal de ensayos 42

Figura 17 Ensayo de Linfoproliferación 44

Figura 18 Cuantificación de citoquinas 45

Figura 19 Secuencia de pVAXFlag, nucleótidos 661 al 960 48

x

ABREVIATURAS AL : Agar Luria

Amp : Ampicilina

C : Celsius

CL : Caldo Luria

DO : Densidad óptica

g : Gramos

g/l : Gramos por litro

IM : Intramuscular

IN : Intranasal

IPTG : Isopropil-β-D-tiogalactósido

Kan : Kanamicina

kb : Kilobases

kDa : Kilodalton

KZ : Kozak

l : Litros

M : Molar

mg : Miligramos

min : Minutos

ml : Mililitros

ng : Nanogramos

p/v : Peso/volumen

pb : Pares de bases

RBS : Sitio de unión a ribosoma (Ribosome Binding Site)

rpm : Revoluciones por minuto

SC : Subcutánea

SD : Shine-Dalgarno

SDS : Dodecilsulfato sódico (sodium dodecyl sulfate)

seg : Segundos

SFB : Suero fetal bovino

u/μl : Unidades por microlitro

xi

UV : Ultra Violeta

V : Volts

v/v : Volumen/volumen

μg : Microgramos

μl : Microlitros

xii

RESUMEN Salmonella enterica serovar Enteritidis es el principal agente etiológico de la

salmonelosis, una enfermedad de transmisión alimenticia que afecta a diversas

especies animales y se transmite al hombre a través del consumo de productos

avícolas contaminados, principalmente huevos. La salmonelosis constituye en la

actualidad un problema global de salud pública y un riesgo importante para la

economía asociada a la producción animal. Por este motivo se han desarrollado

estrategias de control para S. Enteritidis que incluyen terapias antimicrobianas y

vacunación de las aves de postura con bacterias muertas o atenuadas. Sin embargo,

la creciente resistencia a antibióticos por parte de algunas cepas de Salmonella y la

limitada eficacia de las vacunas existentes han impulsado el estudio de los

mecanismos moleculares de patogenicidad de la bacteria para desarrollar nuevos

métodos de control.

La isla de patogenicidad ΦSE14 (presente sólo en S. Enteritidis) contiene 21

ORFs, dentro de los cuales se encuentra SEN1395, que codifica una proteína con

dominios pertenecientes a una nueva superfamilia de lisozimas. Por su parte, la isla

SPI-19 (presente en los serovares Enteritidis, Agona, Dublin y Gallinarum) contiene

una serie de genes que codifican proteínas asociadas a un sistema de secreción tipo

6 (T6SS). Entre estos genes se encuentra SEN1002, que codifica la proteína Hcp

que posee propiedades inmunogénicas. En este trabajo, se escogieron los genes

SEN1002 y SEN1395 de S. enterica serovar Enteritidis para desarrollar vacunas de

ADN. De esta manera, se postuló la hipótesis “Vacunas de ADN diseñadas a partir

de los genes SEN1002 y SEN1395 de S. Enteritidis inducen una respuesta inmune

protectora en ratones BALB/c”.

Para construir las vacunas de ADN se amplificaron los ORFs y se clonaron en

el vector comercial pVAX1 modificado por la inserción del gen que codifica el epítope

3xFlag (pVAX1-FLAG). Los ORFs SEN1002 y SEN1395 se clonaron de tal forma que

este epítope quedara fusionado al extremo 3’ de las proteínas recombinantes,

pudiendo ser detectadas con el anticuerpo comercial anti-Flag M2.

xiii

Una vez construidas las vacunas, se detectó la producción de las proteínas

recombinantes fusionadas a Flag (SEN1002/Flag y SEN1395/Flag) tanto en bacterias

(E. coli BL21 (DE3)) como en células eucariontes (HEK293) mediante Westernblot,

comprobándose la funcionalidad de los vectores.

Las vacunas se probaron en un modelo in vivo (ratones BALB/c). Para esto, se

inocularon seis ratones vía subcutánea, intramuscular e intranasal en las semanas

cero, dos y tres del ensayo, respectivamente, con 100 μg de plasmidio o con PBS

solo, mientras que la inoculación con bacterias se realizó vía oral con 108 unidades

formadoras de colonias en los mismos tiempos. Al cabo de dos semanas se

obtuvieron los bazos de los ratones inmunizados, se preparó una suspensión celular

y posterior a la estimulación con SEN1002/Flag, SEN1395/Flag, PBS, vector vacío o

lisado de bacteria, se midió la linfoproliferación mediante la incorporación de timidina

tritiada (H3) y se cuantificó mediante ELISA la secreción de las citoquinas IFNγ e IL-4.

Los resultados mostraron que en un cultivo in vitro de linfocitos obtenidos de

ratones vacunados con pVAXFlag/SEN1002, se produjo un aumento en la

proliferación luego de ser estimulados con la proteína SEN1002/Flag. En estos

linfocitos, y también en los obtenidos de los ratones vacunados con

pVAXFlag/SEN1395 (estimulados con SEN1395/Flag), se detectó un aumento

considerable en los niveles de INFγ secretados, así como bajas cantidades de IL-4,

demostrando que las construcciones son capaces de generar una respuesta inmune

de tipo celular Th1. No obstante, en las condiciones estudiadas en este trabajo, esta

respuesta no fue capaz de generar protección frente a un desafío con LK5 en ratones

inmunizados.

xiv

SUMMARY Salmonella enterica serovar Enteritidis is the main cause of salmonellosis, a

food-borne disease that affects several animal species. This disease is transmitted

from poultry to humans through the consumption of contaminated poultry products,

where eggs are the main vehicle of infection. Nowadays, Salmonellosis is a global

public health issue and a significant risk in the economy associated with animal

production. To affront this situation, control strategies for S. Enteritidis have been

developed, including antimicrobial therapy and vaccination of laying hens with killed

or attenuated bacteria. However, the growing resistance to antibiotics by some strains

of Salmonella and the limited effectiveness of existing vaccines has motivated the

study of the molecular mechanisms of bacterial pathogenicity to develop new control

methods.

ΦSE14 pathogenicity island (only present in S. Enteritidis) has 21 ORFs. One

of these is SEN1395 that encodes a protein containing a domain from a new

superfamily of lysozymes. On the other hand, SPI-19 pathogenicity island (present in

Enteritidis, Agona, Dublin and Gallinarum serovars) contains several genes that

encode type 6 secretion system associated proteins (T6SS). Within these genes,

SEN1002 encodes Hcp, a protein with immunogenic properties.

In this work, genes SEN1002 and SEN1395 were selected to develop DNA

vaccines. The following hipótesis was proposed: “DNA vaccines designed from S.

Enteritidis SEN1395 and SEN1002 genes induce a protective immune response in

BALB/C mice.”

To construct the DNA vaccines, the corresponding ORFs were amplified by

PCR and cloned into commercial vector pVAX1 modified by the insertion of the gene

encoding the 3xFlag epitope (pVAX1-FLAG). Orfs SEN1002 and SEN1395 were

cloned in such a way that 3xFlag epitope was fused to the 3’ end of the recombinant

protein, to be later detected by the anti-Flag M2 antibody.

After vaccines were constructed, the expression of the Flag fused recombinant

proteins (SEN1002/Flag y SEN1395/Flag), both in bacteria (E. coli BL21 (DE3)) and

xv

eukaryotic cells (HEK293), were assessed by Western blot, confirming the

functionality of the constructs.

The vaccines were assayed in an in vivo model using BALB/c mice. To do this,

six mice were inoculated intradermically, intramuscular and intranasally at weeks

zero, two and three, respectively, with 100 μg of each plasmid or with PBS while the

bacteria inoculation was done by oral way with 108 colony forming units, at the same

time points. After two weeks, the mice were sacrified, their spleens were removed

and homogenized. The cell suspensions were stimulated with SEN1002/Flag,

SEN1395/Flag, PBS, empty vector or bacterial lysate, and linfoproliferation was

measured by H3 incorporation. The production of IFNγ and IL-4 was quantified by

ELISA.

The results showed an increased proliferation of linfocites obtained from mice

vaccinated with pVAXFlag/SEN1002 when stimulated with the recombinant protein

SEN1002/Flag. Also, linfocites obtained from these mice, as well as those obtained

from mice vaccinated with pVAXFlag/SEN1395 (stimulated with SEN1395/Flag)

produced high levels of IFNγ, but low levels of IL-4. These results indicate that

recombinant DNA vaccines constructed in this study were able to induce a Th1

cellular immune response. However, under the tested conditions, this response was

not able to give protection against a challenge in LK5 mmunized mice.

xvi

Introducción

1. INTRODUCCION

1.1 Epidemiología de Salmonella enterica serovar Enteritidis La salmonelosis es una enfermedad de transmisión alimenticia, asociada

principalmente a productos de origen animal, que constituye un problema global de

salud pública y un riesgo importante para la economía asociada a la producción

animal. Su incidencia aumenta mundialmente y se estima que cerca de 400.000

personas mueren anualmente de salmonelosis aguda, principalmente niños,

ancianos y personas inmunocomprometidas, especialmente en países en vías de

desarrollo (Dunkley y cols., 2009).

Esta enfermedad es causada por bacterias del género Salmonella, el cual

comprende dos especies (S. bongori y S. enterica) y agrupa a más de 2500

serovares (Popoff y cols., 2003, Brenner y cols., 2000). Entre los principales

serovares de S. enterica se destaca el serovar Enteritidis, el cual es capaz de infectar

un amplio rango de hospederos que incluye roedores, aves de corral, reptiles y

humanos, entre muchos otros.

Para los humanos, el principal vehículo de infección por S. Enteritidis son los

huevos de las aves de corral (Galan y cols., 1996, Hidalgo-Vila y cols., 2007, Dunkley

y cols., 2009), infección cuya principal manifestación clínica es una enterocolitis

(inflamación de intestino y colon) y/o gastroenteritis (inflamación del estómago e

intestinos) con diarrea, fiebre y dolor abdominal, que se asocian a una incorrecta

manipulación y consumo de productos avícolas contaminados (Luber, 2009). Desde

hace ya más de 10 años, S. Enteritidis es la principal causa de la salmonelosis en los

humanos (Fica y cols., 2001, Dunkley y cols., 2009). En Chile, este serovar aparece

como la Salmonella aislada con mayor frecuencia en muestras clínicas humanas,

dejando atrás a S. typhi (Prat y cols., 2001, Fica y cols., 2001, Prado y cols., 2002).

1

Introducción

1.2 Salmonella Enteritidis en aves y su transmisión zoonótica al hombre El ciclo infectivo de S. Enteritidis se inicia con la contaminación de gallineros a

través de diversos vectores, incluyendo roedores e insectos. La bacteria sobrevive y

se multiplica en el corral, infectando a las gallinas por vía oral. En ellas, S. Enteritidis

coloniza e invade el epitelio intestinal y órganos internos, principalmente bazo,

hígado y oviductos. En este último, se presentan dos posibles rutas de

contaminación del huevo. Una de ellas es la transmisión vertical, que consiste en la

contaminación directa de yema, clara y membranas de la cáscara, mientras que la

otra alternativa es la transmisión horizontal, asociada al contacto de los huevos con

heces fecales de la gallina durante o después de la postura (Gantois y cols., 2009,

Callaway y cols., 2008).

En aves adultas (más de dos semanas de vida), la infección por S. Enteritidis

es asintomática y crónica, mientras que en animales jóvenes se genera una

enfermedad sistémica severa que conduce a la muerte debido a una combinación de

anorexia y deshidratación causada por una diarrea difusa. Esto es debido a que a

una edad temprana, las aves carecen de una flora intestinal adecuada para competir

con S. Enteritidis (Guard-Petter, 2001).

En la Figura 1 se muestra un esquema de la infección de aves por S.

Enteritidis y su transmisión zoonótica al hombre.

Figura 1. Ciclo infectivo de Salmonella enterica serovar

Enteritidis. Transmisión zoonótica al hombre.

2

Introducción

1.3 Mecanismos moleculares de patogenicidad de S. Enteritidis Los mecanismos moleculares de patogenicidad de la especie Salmonella

enterica son complejos e involucran una gran variedad de genes, generalmente

agrupados en regiones denominadas islas genómicas (IGs). Estas islas se definen

como segmentos de ADN adquiridos por transferencia horizontal que se insertan en

el cromosoma bacteriano, usualmente mediado por la acción de elementos genéticos

móviles como bacteriófagos (Groisman y Ochman, 1996). Estas secuencias pueden

codificar factores de virulencia o vías metabólicas entre otros, otorgando

características que le permitan realizar un ciclo infectivo exitoso o directamente

contribuir a la virulencia. En este caso particular, las IGs se denominan islas de

patogenicidad.

Para alcanzar el sitio de colonización, S. Enteritidis tiene mecanismos

evolucionados de evasión de los mecanismos de defensa de su hospedero

basándose principalmente en proteínas reguladoras, chaperonas, factores de

transcripción y traducción, proteínas de envoltura y fimbrias (Foley y cols., 2008,

Dunkley y cols., 2009). Luego, es capaz de colonizar el intestino, donde accede a las

células epiteliales normalmente no fagocíticas a través de un sistema de secreción

tipo III (T3SS) codificado en la Isla de Patogenicidad 1 de Salmonella (SPI-1). Este

sistema inyecta proteínas efectoras al citoplasma de la célula epitelial, produciendo

un reordenamiento del citoesqueleto que promueve la internalización de la bacteria

(McGhie y cols., 2009, Galan, 1999). Una vez en el interior de la célula, Salmonella

prolifera en el fagosoma para luego ser liberada al subepitelio, donde es fagocitada

por macrófagos y células dendríticas residentes.

En humanos, la bacteria genera normalmente una inflamación local debido a la

liberación de citoquinas proinflamatorias por los macrófagos, las cuales reclutan

neutrófilos polimorfonucleares que finalmente eliminan la infección. No obstante, en

niños, ancianos e individuos inmunocomprometidos puede ocurrir una infección

sistémica. En este caso, la bacteria prolifera en el interior de las células fagocíticas,

alcanza los nódulos linfáticos mesentéricos y desde ellos ingresa al torrente

sanguíneo, alcanzando los tejidos linfoides principales (bazo, hígado). En contraste,

S. Enteritidis genera una infección sistémica persistente y asintomática en aves.

3

Introducción

1.4 Inmunidad frente a Salmonella Ante una infección por Salmonella, el hospedero desencadena tanto la

respuesta inmune humoral como celular, siendo esta última de mayor importancia

(Tam y cols., 2008). En el primer caso, las inmunoglobulinas IgG, IgA e IgM

producidas en la mucosa intestinal y suero, se ven incrementadas durante la

salmonelosis (Lillehoj y cols., 2007). Desde el punto de vista de la inmunidad celular,

las citoquinas de la respuesta proinflamatoria Th1 son cruciales para la inmunidad

protectora frente a una infección primaria (Barrow, 2007). En este sentido, TNF-α e

IFN-γ juegan un papel importante en el control de la infección debido a la capacidad

de reclutamiento de células mononucleares y de activación de macrófagos,

respectivamente (Mastroeni y cols., 1998, Barrow, 2007). En la respuesta

inmunosupresora Th2, IL-4 e IL-10 son capaces de inhibir la defensa contra el

patógeno, por lo que se ven cuantitativamente disminuidas (Eckmann y cols., 2001,

Lin y cols., 2008). Cabe hacer notar que se ha descrito un aumento en la

linfoproliferación en respuesta a la vacunación de algunas aves con flagelina y LPS

de S. Enteritidis, indicando el desarrollo de la respuesta de memoria de células T

CD4+ específicas para los antígenos (Lillehoj y cols., 2007).

1.5 Estrategias de control de la infección por S. Enteritidis La transmisión horizontal en el huevo es fácil de prevenir con medidas de

limpieza y desinfección de los huevos. No así la transmisión vertical, que requiere

disminuir la colonización intestinal o erradicar la bacteria del reservorio avícola. Una

vez infectado el ser humano, en la mayor parte de los casos la salmonelosis se

presenta como una enfermedad localizada y de corta duración, por lo que sólo se

combate la deshidratación. No obstante, en su forma más grave se requiere además

una terapia antimicrobiana, estrategia que se ha visto afectada debido al creciente

aumento de la resistencia a antibióticos por algunas cepas de Salmonella enterica

(Arlet y cols., 2006, Threlfall y cols., 2006, Velge y cols., 2005). Por estos motivos, el

control de la infección por S. Enteritidis se ha abordado mediante el diseño de

vacunas para aves de postura, utilizando estrategias convencionales como

generación de mutantes vivas atenuadas o bacterias muertas. En el primer caso, se

4

Introducción

ha demostrado la inducción de respuesta inmune celular, mientras que en el

segundo, se induce mayormente una respuesta inmune humoral. Sin embargo,

ambas alternativas sólo han tenido un éxito relativo debido a que no alcanzan a

proteger durante todo el período de producción avícola, que puede llegar a un

máximo de 25 meses (Covacevic y cols. 2008, Babu y cols., 2004, Betancor y cols.,

2005, Cerquetti y cols., 2000).

Los antecedentes mencionados nos presentan un panorama en el que se

hace indispensable la generación de nuevas vacunas, que otorguen una protección

efectiva y de larga duración, para prevenir la infección aviar y la transmisión de S.

Enteritidis al hombre.

1.6 Nuevas estrategias de protección inmune. Vacunas de ADN En el campo del desarrollo de vacunas, una nueva e importante estrategia son

las vacunas de ADN, que consisten en ADN plasmidial que contiene un gen

codificante para una proteína inmunogénica de un patógeno (Figura 2). Este

plasmidio se inocula en un hospedero, donde el gen mencionado es transcrito y

traducido para inducir una respuesta inmune específica.

Estas vacunas tienen muchas ventajas por sobre los métodos tradicionales

como su fácil manipulación, bajos costos de producción, seguridad y flexibilidad. Esta

última relacionada a la posibilidad de utilizar diferentes tipos de genes

inmunogénicos, así como combinarlos simultáneamente para generar vacunas

multivalentes. Por otra parte, las desventajas del uso de estas vacunas consisten en

la posible integración al genoma del hospedero y activación de proto-oncogenes. Sin

embargo, estas desventajas sólo son teóricas, pues aún no han sido probadas

(Dhama y cols. 2008).

5

Introducción

Figura 2. Esquema representativo de una vacuna de ADN. El plasmidio

recombinante posee un promotor

eucarionte, un gen inmunogénico, una

secuencia señal de poliadenilación, un

origen de replicación bacteriano (ori) y un

gen de resistencia a antibiótico. Estos

dos últimos para permitir el crecimiento y

selección del plasmidio en bacterias

(modificado de Dhama y cols. 2008).

1.7 Genes inmunogénicos de S. Enteritidis En este proyecto de Tesis se propone diseñar y evaluar la capacidad

protectora de dos posibles vacunas contra S. Enteritidis utilizando un modelo de

salmonelosis murina. Estas consisten en vacunas de ADN, diseñadas a partir de las

secuencias genómicas de marcos de lectura abiertos (ORFs) conservados,

presentes en dos islas genómicas de esta especie. Estas islas, identificadas como

SPI-19 e ΦSE14, se describen a continuación.

1.7.1 Isla genómica SPI-19 La isla genómica SPI-19, identificada por nuestro laboratorio mediante un

análisis bioinformático, está presente sólo en los serovares Agona, Dublin,

Weltevreden, Gallinarum y Enteritidis. En este último serovar, esta isla tiene una

extensión de ~14kb (Figura 3) y su secuencia presenta genes que codifican algunos

componentes de un sistema de secreción tipo 6 (T6SS). Entre estos, se encuentra el

gen SEN1002 que codifica una proteína de 28 kDa denominada “haemolysin co-

regulated protein” (Hcp) (Williams y cols., 1996). Esta proteína, descubierta en Vibrio

cholerae, polimeriza formando anillos hexaméricos que generan nanotubos. Se

piensa que estas estructuras forman parte del sistema de secreción (Ballister y cols.,

2008, Filloux, 2009). Está descrito que la proteína Hcp de Burkholderia mallei es un

6

Introducción

buen inmunógeno en ratones, caballos y humanos, por lo que es un buen candidato

para desarrollar una vacuna (Bingle y cols., 2008, Schell y cols., 2007).

Figura 3. Esquema de la organización genética de la isla genómica SPI-19 en S. Enteritidis.

1.7.2 Isla genómica ΦSE14 S. Enteritidis presenta además una isla genómica específica para dicho

serovar (Figura 4). Esta isla, denominada ΦSE14, contiene 21 genes que codifican

mayormente proteínas de fago cuyas funciones aún son desconocidas (Santiviago y

cols., 2010). Entre ellos se encuentra el gen SEN1395, que según nuestros análisis

bioinformáticos codifica una proteína que posee dos dominios conservados: DUF847

(presente en proteínas con actividad lisozima) y PG_binding_3 (dominio de unión a

peptidoglicán). Esta característica es de gran relevancia, ya que esta proteína sería

parte de la superfamilia de lisozimas "COG3926/DUF847", descubierta

recientemente (Pei y cols., 2005), abriendo campo a un nuevo grupo de proteínas

cuya secuencia dista ampliamente de las lisozimas clásicas. Esta familia de

lisozimas, sin embargo, adopta la misma estructura secundaria, manteniendo los

mismos residuos catalíticos y localización del sitio activo.

7

Introducción

Figura 4. ΦSE14. Isla genómica específica de S. Enteritidis identificada mediante análisis

bioinformático.

Como se muestra en la Figura 5, tras una predicción de sitios antigénicos

(http://www.bioinformatics.org/JaMBW/3/1/7/) se determinó que la proteína SEN1395

posee múltiples regiones antigénicas a lo largo de la cadena polipeptídica,

ajustándose a las características necesarias para su uso en el desarrollo de una

vacuna.

Figura 5. Diagrama de residuos antigénicos de la proteína SEN1395. En el esquema

se observa la variación del índice de antigenicidad en función de los aminoácidos de la

proteína. Mientras mayor es el índice, mayor es la probabilidad de que dicho grupo de

residuos sea reconocido por anticuerpos (Diagrama obtenido en

http://www.bioinformatics.org/JaMBW/3/1/7/). En rojo, se muestran algunas de las zonas

potencialmente antigénicas.

8

http://www.bioinformatics.org/JaMBW/3/1/7/

Introducción

En este trabajo se construyeron dos nuevas vacunas de ADN a partir de los

genes SEN1002 de SPI-19 y SEN1395 de ΦSE14 y se analizó su capacidad de

generar respuesta inmune en un modelo de salmonelosis murina, así como su

capacidad inmunoprotectora frente a un desafío con la cepa virulenta S. Enteritidis

LK5.

1.8 Hipótesis

Vacunas de ADN diseñadas a partir de los genes SEN1002 y SEN1395 de S.

Enteritidis inducen una respuesta inmune protectora en ratones BALB/c.

1.9 Objetivo General

Caracterizar la respuesta inmune inducida por vacunas de ADN diseñadas a

partir de los genes SEN1002 y SEN1395 de S. Enteritidis y evaluar la efectividad de

la protección inmune en ratones BALB/c.

1.10 Objetivos Específicos

Para verificar la hipótesis se llevaron a cabo los siguientes objetivos

específicos:

1.- Generar vacunas de ADN diseñadas a partir de los genes SEN1002 y

SEN1395 de S. Enteritidis.

2.- Evaluar la respuesta inmune generada por las vacunas de ADN en ratones

BALB/c.

3.- Evaluar la capacidad protectora de las vacunas de ADN frente a un desafío

con la cepa virulenta LK5 de S. Enteritidis.

9

Materiales y Métodos

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 Reactivos A continuación se indican proveedores y los productos que de ellos se

obtuvieron:

Biorad (CA, EEUU): Solución Acrilamida/bisacrilamida 40%, membrana de

nitrocelulosa poro 0,45μm.

Difco Laboratories (MI, EEUU): Triptona, extracto de levadura, Bacto-Agar.

Drag Pharma (STGO, CHILE): Ketamina (Ketostop®), acepromacina

(Pacifor®).

e-Bioscience (CA, EEUU): Mouse IL-4 ELISA kit, Mouse INF-γ ELISA kit.

IDT (IO, EEUU): Todos los oligonucleótidos partidores utilizados.

Fermentas (MD, EEUU): Estándares de peso molecular GeneRuler 100pb,

100pb plus y 1kb, enzimas de restricción, estándar de proteínas preteñido

PageRuler, High Fidelity DNA polimerasa, RNAsa.

Gibco BRL (NY, EEUU): Bromuro de etidio, agarosa, dodecilsulfato de sodio

(SDS).

Invitrogen Life Technologies (CA, EEUU): Lipofectamina 2000, N,N,N’,N’-

tetrametiletilendiamina (TEMED), anticuerpo Anti IgG de ratón (conjugado

peroxidasa), RPMI 1640, penicilina, estreptomicina.

ISCONOVA (UP, SUECIA): Adjuvante AbISCO®.

10


J. T. Baker Chemical Co. (NJ, EEUU): Tween-20, glicerol.

Merck Química Chilena Soc. Ltda (STGO, CHILE): Cloruro de sodio, citrato

de sodio, glucosa, cloroformo, cloruro de potasio, cloruro de magnesio

hexahidratado, cloruro de litio, ácido clorhídrico, isopropanol, ácido acético glacial,

hidróxido de sodio, amoniaco, formaldehído 37%, etanol absoluto, propionato de

potasio, bicarbonato de potasio, cloruro de amonio, buffer TAE 50x, Tritón X-100,

Tris-base, Fenol/Cloroformo/Alcohol isoamilico, MOPS.

Promega (WI, EEUU): T4 DNA ligasa, dNTPs, Go-Taq DNA polimerasa.

Qiagen (CA, EEUU): “QlAquick PCR purification kit”, “QlAprep Spin Miniprep

kit”, “Gel extraction kit”,

Roche (STGO, CHILE): Mezcla de inhibidores de proteasa Complete Mini

EDTA-free.

Sigma Chemical Co (MO, EEUU): Kanamicina, ampicilina, azul de

bromofenol, ácido etilendiamino-tetraacético (EDTA), β-mercaptoetanol, glicina,

persulfato de amonio (APS), desoxicolato de sodio, azul de Coomassie Brilliant Blue

R, kit de extracción de ADN genómico “GenElute Bacterial Genomic DNA”,

concanavalina A, lisozima, timidina (H3).

Stratagene (CA, EEUU): Anticuerpo monoclonal anti-Flag M2.

Thermo Scientific (HyClone) (IL, EEUU): Dulbecco’s Modified Eagle Medium

(DMEM) PBS 10x, films fotográficos CL-X, sustratos quimioluminiscentes para

peroxidasa de rábano (HRP) Super Signal West Pico.

11


2.2 Cepas bacterianas Tabla 1. Cepas bacterianas utilizadas en la presente Tesis.

Cepa Genotipo / Fenotipo relevante Fuente

Salmonella enterica serovar Enteritidis

S. Enteritidis NCTC13349 Fagotipo PT4, Cepa silvestre Stock de Laboratorio

S. Enteritidis LK5 Fagotipo PT8, Cepa silvestre Stock de Laboratorio

Escherichia coli

DH5α

endA1 hsdR17 supE44 thi-1 recA1 gyrA

relA1 del(lac-argF)U169 deoR phi80

del(lac)M15

Stock de Laboratorio

DH5α λ pir

endA1 hsdR17 supE44 thi-1 recA1 gyrA

relA1 del(lac-argF)U169 deoR phi80

del(lac)M15 λpir

Stock de Laboratorio

BL21(DE3) ompT gal dcm lon hsdSB λ(DE3) Dr. J.C.Salazar

2.3 Líneas celulares Tabla 2. Líneas celulares utilizadas en esta Tesis.

Línea celular Características Fuente

HEK293 Células embrionarias de riñón humano,

>90% transfección Dr. A. Quest

2.4 Modelo animal

Se utilizaron ratones hembra BALB/c (7 a 8 semanas de edad) obtenidos del

Instituto de Salud Pública (ISP). Estos animales se distribuyeron aleatoriamente entre

los grupos experimentales (Tabla 3) y tuvieron acceso a comida y agua ad libitum.

12


Tabla 3. Grupos de ratones Balb/c utilizados en esta Tesis

Grupo Número de animales

pVAXFlag/SEN1002 11

pVAXFlag/SEN1395 11

pVAXFlag 11

PBS 11

Total 66

2.5 Medios y condiciones de cultivo bacteriano Las cepas bacterianas se cultivaron a 37°C en Caldo Luria (CL, triptona 10 g/l,

extracto de levadura 5 g/l, cloruro de sodio 5 g/l) en forma aeróbica durante toda la

noche. En medio sólido se mantuvo el medio base y se agregó 15 g/l de Bacto agar.

En algunos casos, para la selección de cepas resistentes se utilizaron ampicilina

(Amp) y kanamicina (Kan) a las concentraciones finales de 100 μg/ml y 50 μg/ml,

respectivamente.

2.6 Medios y condiciones de cultivo celular Las células embrionarias de riñón humano HEK293 se mantuvieron en

botellas de cultivo con medio DMEM (con L-glutamina, glucosa y piruvato de sodio)

suplementado con 10% de SFB en un incubador a 37°C con 5% CO2 95% aire. El

medio de cultivo se cambió por medio fresco cada 2 a 3 días. El día previo a los

ensayos, las células se desprendieron de la botella con tripsina/EDTA a 37°C durante

2 min, se lavaron con PBS estéril y se resuspendieron en medio fresco para ser

contabilizadas en una cámara de Neubauer. Finalmente, se sembraron en una placa

de 6 pocillos a una razón de 2 x 106 células por pocillo en 2 ml de DMEM

suplementado con suero, de modo de que formaran una monocapa celular con una

confluencia de aproximadamente 90 a 100%.

Para los ensayos de linfoproliferación, los esplenocitos (macrófagos y

linfocitos) se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con L-glutamina 2 mM,

10% SFB y 50 μl de penicilina-estreptomicina.

13


2.7 Plasmidios Tabla 4. Plasmidios utilizados en esta Tesis.

Plasmidio Características Fuente

pVAX1 PCMV, PT7, BGH poliA, KanR, oripUC Invitrogen

pSUB11 AmpR, KanR, 3xFlag epítopo Stock de Laboratorio

pLTS AmpR, 3xFlag epítopo Este trabajo

pEGFP-C1 PCMV, EGFP, oriSV40, KanR/NeoR, oripUC Dr. Andrew Quest

pVAXFlag/bla PCMV, PT7, BGH poliA, KanR, oripUC, AmpR,

3xFlag epítopo Este trabajo

pVAXFlag PCMV, PT7, BGH poliA, KanR, oripUC, 3xFlag

epítopo Este trabajo

pVAXFlag/SEN1002 Gen SEN1002 de S. Enteritidis NCTC13349

clonado en pVAXFlag Este trabajo

pVAXFlag/SEN1395 Gen SEN1395 de S. Enteritidis NCTC13349

clonado en pVAXFlag Este trabajo

pVAXFlag/GFP Gen GFP de pEGFP-C1 clonado en pVAXFlag Este trabajo

pET-15b/gluQ-rs AmpR, oripBR22, PT7, His-Tag, LacI, gen gluQ-rs Dr. Juan Carlos Salazar

2.8 Partidores Tabla 5. Partidores utilizados en esta Tesis.

Nombre Secuencia Elementos

adicionales*

pSUB11_XbaI(F) CATCCGGGGTCAGCACCGTT -

pSUB11_XbaI(R) CTGGATGATCCTCCAGCGCG -

pLTS_BamHI(F) AATTCGGGATCCGACTACAAAGACCATGACGGTGATT BamHI

pLTS_XhoI(R) CCGCTCGAGCGTGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTAC XhoI

pLTS_bla(R) AGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAG -

14


pV3F_bla (F) TCACGCTCGAGTCTAGAGGGCC -

pV3F_bla_XhoI (R) CCGCTCGAGAGCCTACATTACTATTTATC XhoI

SEN1395_SD_Koz_Hind(F) CCCAAGCTTAAGGAGGCCACCATGAAACCGAAGGAC

GAAATTTTTG HindIII, SD, KZ

SEN1395_BamHI(R)2 ATTCGGGATCCTATCAATACGCGCTCTTTCATCCAG BamHI

SEN1002_SD_Koz_Hind(F) CCCAAGCTTAAGGAGGCCACCATGGCCAATTTAATTT

ATTTAACACTGAACGGT HindIII, SD, KZ

SEN1002_BamHI(R)2 GACGGGATCCAAACACCCTCTCATCCCATAAACTGAA

TGC BamHI

GFP_HindIII_SD (F) CCCAAGCTTAAGGAGGCCACCATGGTGAGCAAGGG HindIII, SD

GFP_BamHI (R) ATTCGGGATCCGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCC BamHI

K1 CAGTCATAGCCGAATAGCCT -

T7 (universal) TAATACGACTCACTATAGGG -

* Los elementos adicionales (subrayados en la columna secuencia) consideran

principalmente sitios de corte de enzimas de restricción, de modo de obtener

productos de PCR compatibles con el ligamiento en los vectores. De las secuencias

Shine-Dalgarno (SD) y Kozak (KZ) se hará mención más adelante.

2.9 Construcción del vector de clonamiento pVAXFlag

2.9.1 Extracción de ADN plasmidial

A partir de un cultivo de E. coli en CL (100 μg/ml de Amp y/o 50 μg/ml de Kan)

durante toda la noche, se extrajo ADN plasmidial utilizando el kit para alto número de

copias “QlAprep Spin Miniprep” (Qiagen) de acuerdo al protocolo del fabricante,

eluyendo en 50 μl de H20 miliQ estéril. La muestra se mantuvo a 4°C hasta su uso.

15


2.9.2 Cuantificación de ADN La cuantificación de los plasmidios se realizó mediante la medición de

absorbancia de la muestra a 260 nm en un espectrofotómetro. El valor obtenido se

transformó a concentración mediante la siguiente fórmula:

Concentración (μg/ml) = Abs260nm x factor de dilución x 50 μg/ml

2.9.3 Electroforesis en gel de agarosa Los geles se prepararon con agarosa 1% en tampón TAE (Tris-acetato 0,04 M

pH 8,0; EDTA 1 mM). Las muestras a analizar se cargaron en el gel previa

incorporación de tampón Blue II 10x (glicerol 20% (v/v), azul de bromofenol 0,25%

(p/v), xileno-cianol 0,25% (p/v), EDTA 0,1 M). La electroforesis se realizó a 90 V

constantes y luego el gel se tiñó en una solución de bromuro de etidio (5 μg/ml)

durante 15 min. Las bandas de ADN se visualizaron y fotografiaron sobre un

transiluminador UV.

2.9.4 Digestión con enzimas de restricción Las digestiones enzimáticas de plasmidios y productos de PCR de este trabajo

se realizaron utilizando los protocolos sugeridos por el proveedor de las enzimas

(Fermentas): Muestra de ADN Producto de PCR Agua 16 μl 18 μl Tampón 2 μl 2 μl ADN (0.5-1 μg/μl) 1 μl - Producto de PCR - 10 μl Enzima 10 u/μl 1 μl 1 μl Volumen final 20 μl 30 μl Temperatura de incubación 37°C 37°C Tiempo de incubación 2 horas 2 horas

16


2.9.5 Obtención de productos de PCR Las reacciones de PCR en este trabajo se realizaron bajo los siguientes

protocolos:

Protocolo PCR enzima High Fidelity: Tampón 2,5 μl Programa de amplificación dNTPs 2 mM 0,5 μl Temperatura Tiempo MgCl2 25 mM 1,875 μl 94° 3min P1 10 µM 2 μl 94° 30 seg P2 10 µM 2 μl 55° 30 seg Enzima HF 0,375 μl 72° 2,5 min

30 ciclos

H20 40 μl 72° 7 min DNA 1,5 μl 4° ∞ Volumen Final 50 μl

Protocolo PCR enzima GoTaq:

Tampón 4 μl Programa de amplificación dNTPs 2 mM 0,4 μl Temperatura Tiempo MgCl2 25 mM 1,2 μl 95° 2 min P1 10 µM 0,4 μl 95° 30 seg P2 10 µM 0,4 μl 55° 30 seg Enzima GoTaq 0,1 μl 72° 1 min

30 ciclos

H20 13 μl 72° 5 min DNA* 0,5 μl 4° ∞

Volumen Final 20 μl

* Los ensayos de PCR de colonias bacterianas, se realizaron a partir de 0,5 μl de una suspensión de dicha colonia en 50 μl de H20 destilada estéril.

Los productos obtenidos se purificaron con “QlAquick PCR Purification Kit”

(Qiagen), se confirmaron por electroforesis en gel de agarosa y se mantuvieron a 4°C

hasta su uso.

2.9.6 Reacciones de ligación Las reacciones de ligación de vector-inserto o recircularización se realizaron

con la enzima ligasa de ADN del fago T4 (New England Biolabs) según el protocolo

sugerido por el fabricante:

17


Ligación vector-inserto Recircularización H20 destilada 8 μl 2 μl Tampón 2,5 μl 1,5 μl ADN digerido - 10 μl Vector 2 μl - Inserto 6 μl - Enzima 1,5 μl 1,5 μl Volumen final 20 μl 30 μl Temperatura de reacción 22°C 22°C Tiempo de reacción 2 horas 2 horas

2.9.7 Transformación por electroporación Los plasmidios construidos se purificaron con “QlAquick PCR Purification Kit”

(Qiagen) y luego se transformaron por electroporación en células de E. coli

competentes (DH5α o BL21(DE3), según correspondiese en la etapa de trabajo) a

1.800 V (60 μl de suspensión bacteriana con 5 μl de plasmidio en cubetas de 0,2 mm

de separación entre los electrodos). Las células se resuspendieron en 1 ml de CL y

se mantuvieron 90 min a 37°C. Pasado dicho tiempo, se centrifugaron y

resuspendieron en 100 μl de CL, volumen que se sembró en placas de Agar Luria

(AL) con el antibiótico correspondiente para selección, manteniéndolas durante toda

la noche a 37°C.

La presencia de los plasmidios en las colonias seleccionadas se confirmó

mediante PCR con GoTaq según el protocolo descrito previamente.

2.9.8 Purificación de ADN desde gel de agarosa El ADN se sometió a electroforesis en gel de agarosa y posterior tinción con

bromuro de etidio. Luego, se cortaron las bandas de interés utilizando una hoja de

bisturí. El ADN se extrajo desde el trozo de del utilizando “QlAquick Gel Extraction

Kit” (Qiagen) de acuerdo al protocolo descrito por el fabricante, eluyendo en H20

miliQ estéril.

18


2.10 Construcción de vectores de expresión 2.10.1 Extracción de ADN genómico Se cultivó la cepa S. Enteritidis NCTC13349 en 3 ml de CL durante toda la

noche a 37°C con agitación. Se centrifugó 1,5 ml de cultivo por 2 min a 13.000 rpm.

Se eliminó el sobrenadante y el sedimento se sometió a extracción de ADN

genómico utilizando “Gen Elute Bacterial Genomic DNA kit” (Sigma) y el producto

obtenido se mantuvo a 4°C hasta su uso.

2.10.2 Obtención de los genes SEN1395 y SEN1002 para el clonamiento El marco de lectura abierto de los genes SEN1395 y SEN1002 se amplificó

por PCR a partir del ADN genómico de S. Enteritidis NCTC13349 con las parejas de

partidores SEN1395_SD_Koz_Hind(F) - SEN1395_BamHI(R)2 y

SEN1002_SD_Koz_Hind(F) - SEN1002_BamHI(R)2 respectivamente, con la enzima

High Fidelity.

Los partidores en 5’ (Forward) poseen un sitio de corte para la enzima HindIII

y las secuencias SD y KZ para mejorar la eficiencia de traducción en procariontes y

eucariontes, respectivamente. Los partidores 3’ (Reverse) poseen un sitio de corte

para la enzima BamHI como se muestra en la Tabla 5.

El producto de PCR obtenido en ambos casos se confirmó por electroforesis

en geles de agarosa al 1% y se sometió a digestión con las enzimas de restricción

BamHI y HindIII, para luego ligar independientemente en el vector pVAXFlag y

transformar en E. coli DH5α. El correcto clonamiento se confirmó mediante PCR de

colonias con GoTaq.

19


2.11 Evaluación de la producción de proteínas recombinantes en E. coli

2.11.1 Ensayo de inducción con IPTG Los plasmidios pVAXFlag/SEN1002 y pVAXFlag/SEN1395 fueron

transformados en la cepa BL21(DE3) para evaluar la producción de las proteínas

SEN1002 y SEN1395, respectivamente. Para ello, de un cultivo durante toda la

noche de las cepas con plasmidio (en presencia de 50 μg/ml Kan y 1% glucosa) se

tomó una alícuota de 1 ml y se dispuso en 9 ml de CL (50 μg/ml Kan y 1% glucosa).

Esta dilución se cultivó a 37°C con agitación constante hasta alcanzar una densidad

óptica a 600nm (DO600) de 0,6. Luego de ello, la muestra se centrifugó a 13.000 rpm

en una microcentrífuga durante 1 min y se resuspendió en 10 ml de medio fresco, de

los cuales se separaron dos fracciones de 3 ml. Una de ellas se mantuvo

suplementada con 50 μg/ml Kan y 1% glucosa (condición represora) y la otra con 50

μg/ml Kan y 1 mM de IPTG (condición inductora), ambas a 37°C con agitación

constante durante 1 hora. Posteriormente, los cultivos se centrifugaron a 13.000 rpm

durante 1 min y el sedimento se resuspendió en 200 μl de tampón de carga de

proteínas 1x (Tris-HCl 0,06 M; SDS 2% (p/v); glicerol 14% (v/v); azul de bromofenol

5%; β-mercaptoetanol 0,02%; pH 6,8). Estas muestras se hirvieron a 100°C durante

5min y luego se congelaron a -20°C hasta su uso.

Como controles se utilizaron E. coli BL21(DE3) transformada con el vector

vacío pVAXFlag (control negativo) y E. coli BL21(DE3) transformada con

pET-15b/gluQ-rs (control positivo de inducción)

2.11.2 Separación electroforética de proteínas

Se depositaron alícuotas de 15 μl dentro de los bolsillos de un gel de

poliacrilamida al 5% y se cubrieron con tampón de corrida (Tris 0,025 M; glicina

1,44% (p/v); SDS 0,1% (p/v); pH 8,3). La separación electroforética se inició con la

aplicación de 80 V hasta que el azul de bromofenol alcanzó el gel de separación

20


(12% de concentración). Luego se aplicó 100 V durante aproximadamente 150 min

hasta que la muestra llegó al final del gel separador.

2.11.3 Tinción de gel de proteínas con azul de Coomassie Una vez finalizada la electroforesis, el gel se dispuso en un recipiente con

solución de tinción (azul de Coomassie 0,1%; metanol 50%; ácido acético 10%)

durante 30 min a temperatura ambiente y agitación continua. Para desteñir, el gel se

sumergió en solución de destinción (metanol 20%; ácido acético 15%) y se mantuvo

en agitación constante con renovación frecuente de la solución hasta evidenciar las

bandas de proteína color azul y el fondo casi transparente.

2.11.4 Western blot Las proteínas fueron transferidas vía húmeda a membranas de nitrocelulosa

empleando tampón de transferencia (Tris-HCl 20 mM; glicina 150 mM; isopropanol

20% (v/v); SDS 0,05% (p/v)) a 100 V durante 70 min. Luego, las membranas se

lavaron en PBS (NaCl 8 g/l; KCl 0,2 g/l; Na2HPO4 2,7 g/l; KH2PO4 0,2 g/l; pH 7,4) y

bloqueadas con leche descremada 3% en PBS (solución de bloqueo) durante toda la

noche a 4°C. A continuación, se realizó una incubación con el anticuerpo primario

anti-Flag M2 (Stratagene) diluido 1:15.000 en solución de bloqueo, durante 1 hora a

temperatura ambiente. Luego se realizaron 3 lavados de 10 min cada uno con PBS-T

(PBS; Tween-20 1%, pH 7,4) y se incubó con el anticuerpo secundario (1:15.000 en

PBS) durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se realizaron 3 lavados de

10 min cada uno con PBS-T y se reveló por quimioluminiscencia (West Pico).

2.11.5 Extracción de proteína recombinante

La cepa E. coli BL21(DE3) con el plasmidio se cultivó en 3 ml de CL

suplementado con Kan y glucosa durante toda la noche. Con este cultivo se inoculó

200 ml de CL con Kan y glucosa (dilución 1/100) y se mantuvo a 37°C con agitación

21


durante 4 horas. A continuación se centrifugó a 13.000 rpm durante 2 min y el

sedimento se resuspendió en 50 ml de CL fresco suplementado con Kan e IPTG

1 mM y se mantuvo a 37°C con agitación durante 90 min. Luego, se centrifugó y el

sedimento se lavó con 5 ml de PBS 1x para centrifugar nuevamente y mantener el

sedimento a -20°C por 18 horas. Posteriormente la muestra se resuspendió en 1 ml

de tampón de lisis (PBS 1x; inhibidor de proteasas) y se sometió a sonicación.

Finalmente, se centrifugó a 8.000 rpm por 3 min y el sobrenadante se mantuvo a

-20°C hasta su uso.

2.11.6 Cuantificación de proteínas Se empleó el método de cuantificación de proteínas de Bradford, en el cual se

incuban 50 μl de extracto de proteínas con 200 μl de reactivo de Bradford (azul de

Coomasie G-250) y 750 μl de solución de dilución (NaCl 0,15 M), durante 5 min a

temperatura ambiente. Luego se midió la absorbancia a 595 nm. Para la curva de

calibración se usó albúmina de suero bovino. Cada muestra se midió por duplicado.

2.12 Evaluación de producción proteica in vitro en células eucariontes 2.12.1 Estandarización de la técnica de transfección

Para optimizar las condiciones de transfección, se utilizó el plasmidio

pVAXFlag/GFP en distintas variantes de la reacción. Se evaluaron concentraciones

de plasmidio y lipofectamina, así como cantidad de células y tiempo de reacción.

Finalizada las transfecciones, las células se lavaron cuidadosamente con

500 μl de PBS frío y luego se fijaron con formaldehido 4% (en PBS) durante 10 min a

temperatura ambiente y en oscuridad. A continuación, las células fijadas se lavaron

con PBS y se mantuvieron a 4°C en oscuridad hasta su observación al microscopio.

22


2.12.2 Ensayo de transfección en células HEK El día anterior al ensayo (~24 horas antes), se sembraron 2 x 106 células por

pocillo en una placa de 6 pocillos, de modo que formaran una monocapa celular con

una confluencia de aproximadamente 90 a 100% al momento del ensayo.

Cuando las células alcanzaron la confluencia esperada, se lavaron con 500 μl

de PBS estéril y resuspendieron en 2 ml de DMEM sin suero. Luego, a cada pocillo

se agregó 100 μl de una mezcla 1:2 de plasmidio y Lipofectamina 2000 (Invitrogen) y

se mantuvo en incubación (37°C, 5% CO2, 95% aire). A las 5 horas de reacción, se

agregó 1 ml de medio DMEM suplementado con suero y se continuó con incubación

hasta completar las 24 horas.

2.12.3 Lisis celular Una vez terminado el ensayo de transfección, las células se lavaron

cuidadosamente con 500 μl de PBS frío y luego se soltaron en 500 μl de tampón

RIPA (50 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl; 1% Tritón X-100; 0,5% desoxicolato de sodio;

0,1% SDS) con inhibidor de proteasas (Complete, Mini, EDTA-free; Protease Inhibitor

Cocktail Tablets; Roche). A continuación, cada muestra se transfirió a un tubo

eppendorf, se agitaron en vortex durante 30 seg y se mantuvieron a 4°C durante 30

min. Finalmente, se les agregó 100 μl de tampón de carga de proteínas 1x, se

hirvieron a 100°C durante 5 min y se mantuvieron a -20°C hasta su posterior análisis

mediante SDS-PAGE y Western blot.

23


2.13 Caracterización de vacunas in vivo en ratones BALB/c 2.13.1 Vacunación de ratones BALB/c 2.13.1.1 Extracción de plasmidio a gran escala La cepa E. coli DH5α con el plasmidio se cultivó durante toda la noche en 5 ml

de CL suplementado con Kan. Con este cultivo se inoculó 2 litros de CL con Kan

(dilución 1/500) y se mantuvo a 37°C con agitación durante 18 horas. A continuación

se centrifugó a 10.000 rpm en una centrífuga SORVALL durante 10 min, se descartó

el sobrenadante y el sedimento se resuspendió en 50 ml de la Solución I (Glucosa 50

mM; Tris-HCl 25 mM, pH 8, EDTA 10 mM, pH 8) y 2 mg/ml de lisozima y se incubó

durante 30 min en hielo. Luego se agregó 50 ml de Solución II (NaOH 0,2 N, SDS

1%) y finalmente 50 ml de Solución III (KC2H5O2 3M) con una incubación de 15 min

en hielo después de cada dilución. Posteriormente, se centrifugó a 10.000 rpm

durante 20 min a 4°C y el sobrenadante se traspasó a un tubo limpio, al que se

agregó isopropanol frío (1:1) y se incubó en hielo durante 10 min. Luego se

centrifugó a 10.000 rpm durante 10 min a 4°C y el sedimento se resuspendió en 5 ml

de agua nanopura. Se agregó 5 ml de LiCl 4 M (1:1) e incubó en hielo durante 5 min,

para luego centrifugar a 10.000 rpm durante 5 min a 4°C y recuperar el

sobrenadante, muestra que se incubó en baño termorregulado a 65°C durante 5 min.

A continuación se agregó 10 ml de agua nanopura y se precipitó el ADN mediante la

adición de 20 ml isopropanol (1:1) e incubación a -20°C durante 18 horas. Luego se

centrifugó a 12.000 rpm durante 15 min a 4°C y el sedimento se resuspendió en agua

nanopura y se incubó a temperatura ambiente durante 30 min. Posteriormente se

adicionó Tritón X-100 y se calentó a 37°C durante 10 min. Luego se centrifugó y se

sometió a separación con Fenol:cloroformo:alcohol isoamílico para purificar la fase

acuosa. Seguidamente, se precipitó el ADN en una solución de etanol frío y acetato-

MOPS (CH3COONa 0,1 M; MOPS 0,005 M, pH 8), se centrifugó a 12.000 rpm

durante 10 min a 4°C y se lavó el sedimento con alcohol 80%. Para finalizar, se

resuspendió en 300 μl de agua nanopura y se mantuvo a -20°C hasta su uso.

24


2.13.1.2 Inmunización

Se utilizaron ratones hembra BALB/c (7 a 8 semanas de edad) obtenidos del

Instituto de Salud Pública (ISP). Estos animales se distribuyeron aleatoriamente entre

los grupos experimentales (Tabla 3) y se inmunizaron vía subcutánea (SC),

intramuscular (IM) e intranasal (IN) en las semanas cero, dos y tres del ensayo,

respectivamente, con 100 μg de plasmidio y 12 μg de adjuvante (AbISCO®) por ratón

en PBS, en un volumen final de 100 μl en SC e IM, mientras que 50 μl en IN. Para

esta última vía, los ratones fueron anestesiados previamente con una mezcla de

ketamina y acepromacina. Como grupo control, seis ratones se inmunizaron con

PBS.

2.13.2 Linfoproliferación Luego de dos semanas posterior a las inmunizaciones, seis ratones de cada

grupo experimental se sacrificaron por dislocación cervical y se les extrajo el bazo en

condiciones asépticas. A partir de los órganos removidos, se preparó una suspensión

celular de acuerdo a protocolos estándar (Oñate y cols., 1999) y los glóbulos rojos se

lisaron con solución ACK (150 mM NH4Cl; 1 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA; pH 7,3). Las

células de bazo se cultivaron en una placa de 96 pocillos a 37°C y 5% CO2 a una

concentración de 4 x 105 células/pocillo, en presencia de la proteína recombinante

(20 μg/ml), o la bacteria S. Enteritidis NCTC13349 muerta por calor (20 μg/ml), o

concanavalina A (10 μg/ml, control positivo de linfoproliferación) o sin estimulación

(control negativo) durante 3 días. Posteriormente, se dio un pulso de 8 horas con 0,4

μCi de timidina tritiada (H3) por pocillo y la radiactividad incorporada en el ADN se

midió en un contador de centelleo líquido.

2.13.3 Cuantificación de citoquinas

La presencia de las citoquinas IFN-γ e IL-4 se determinó mediante ELISA. Para

ello, se recolectó el sobrenadante de los cultivos de esplenocitos del ensayo de

25


linfoproliferación después de 24 horas de estimulación y analizó usando los sistemas

comerciales Mouse INF-γ ELISA y Mouse IL-4 ELISA, respectivamente. La

concentración de las citoquinas se calculó usando regresión polinómica a partir de

los valores de absorbancia obtenidos de muestras estándar a DO450.

2.13.4 Desafío

Cinco ratones de cada grupo experimental se desafiaron con la cepa virulenta

LK5. Para ello, dos semanas luego de la última inmunización los ratones se

inocularon vía intraperitoneal (IP) con 104 UFC de S. Enteritidis LK5. Dos semanas

después, se sacrificaron y se les extrajo el bazo, órgano que fue homogenizado en

3 ml de PBS estéril y plaqueado en diluciones seriadas para determinar el número de

UFC de Salmonella por bazo.

2.14 Análisis estadístico

Los resultados de linfoproliferación y cuantificación de citoquinas se analizaron

comparando la muestra experimental (pVAXFlag/SEN1002 o pVAXFlag/SEN1395,

según correspondiese) con los controles negativos pVAXFlag y PBS.

Para analizar dichos resultados, se realizó el test ANOVA y los valores de p

obtenidos menores a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

26

Resultados

3. RESULTADOS

3.1. Construcción del vector de clonamiento pVAXFlag 3.1.1 Construcción de los plasmidios intermediarios pLTS y pVAXFlag/bla.

A partir del vector comercial pVAX1 (Invitrogen) se construyó pVAXFlag/bla,

un vector que manteniendo las características originales permite dar seguimiento a

las proteínas producidas debido a la fusión de los genes de interés con el epítopo

3xFlag.

Para obtener este vector, se eliminó el gen de resistencia a kanamicina del

plasmidio pSUB11 mediante la amplificación por PCR del plasmidio con los

partidores pSUB11_XbaI(F) y pSUB11_XbaI(R). Luego, se realizó una digestión con

la enzima de restricción XbaI y finalmente recircularización, obteniendo un plasmidio

que denominamos pLTS (Figura 6).

Figura 6. Diagrama de la deleción del gen de resistencia a kanamicina del plasmidio pSUB11 y la

construcción del plasmidio pLTS.

Usando pLTS como templado, se realizó una amplificación por PCR de 3xFlag

y el gen bla (resistencia a ampicilina) con los partidores pLTS_BamHI(F) y

pLTS_XhoI(R) que poseen sitios de corte en sus extremos 5’ (BamHI) y 3’ (XhoI)

27

Resultados

para realizar una inserción dirigida dentro del sitio de múltiple clonamiento del vector

pVAX1 (Figuras 7A y 7B). El producto de ligación (pVAXFlag/bla) se transformó en

E. coli DH5α y se seleccionaron cepas resistentes a kanamicina y ampicilina

simultáneamente.

A B C

Figura 7. Diagrama de vectores de expresión. A: vector comercial pVAX1 (Invitrogen). B: pVAXFLAG/bla, pVAX1 con una inserción del epítopo 3xFlag asociado al gen bla para su seguimiento,

extraído de la construcción pLTS. C: vector final pVAXFlag.

3.1.2 Eliminación de gen bla y generación del vector pVAXFlag.

Dado que el gen de resistencia a Amp presente en pVAXFlag/bla genera un

distanciamiento cercano a 1kb entre el codón stop y la zona de poliadenilación, se

procedió a eliminar este fragmento mediante amplificación por PCR de todo

pVAXFlag/bla a excepción del gen bla con los partidores pV3F_bla(F) y

pV3F_bla_XhoI(R). El producto se digirió con la enzima de restricción XhoI y luego

se ligó para obtener el vector final y transformar en E. coli DH5α (Figura 7C).

Debido a la baja eficiencia del proceso, posterior a la ligación la muestra se

sometió a digestión doble con las enzimas EcoRI y PstI para eliminar todo el

templado remanente (pVAXFlag/bla) y aumentar la eficiencia de transformación del

nuevo plasmidio generado.

Luego de la transformación, se seleccionaron cepas resistentes a kanamicina

y sensibles a ampicilina, cepas que se confirmaron por PCR usando el partidor de

inserción 5’ (pLTS_BamHI(F)) y un partidor interno del vector pVAX1 (K1).

28

Resultados

Los productos amplificados con estos partidores que se esperan para cada

construcción son los siguientes:

Plasmidio templado Tamaño del plasmidio Tamaño del producto esperado

pVAXFlag 3.030 pb 597 pb

pVAXFlag/bla 4.200 pb 1.716 pb

pVAX1 3.000 pb No amplifica

En la Figura 8A se muestran los productos de amplificación resueltos en un

gel de agarosa 1%, donde en cada caso se obtuvo un producto de amplificación del

tamaño esperado. Igualmente ocurre para los plasmidios (Figura 8B) en donde se

correlacionan el patrón de migración en un gel de agarosa 1% con el tamaño

esperado.

Figura 8. Comprobación de la correcta construcción de los plasmidios. A: Productos de

PCR de confirmación resueltos en un gel de agarosa 1%. B: ADN plasmidial de dos clones

independientes por cada cepa resueltos en un gel de agarosa 1%. En todos los casos se obtuvieron

bandas correspondientes al tamaño esperado.

29

Resultados

3.2. Construcción de vectores de expresión. Vacunas de ADN 3.2.1 Preparación de insertos (genes SEN1002 y SEN1395).

Se diseñaron partidores de PCR para amplificar los genes SEN1002 y

SEN1395 a partir del ADN genómico de Salmonella Enteritidis PT4. Los partidores en

5’ (SEN1002_SD_Koz_Hind(F) y SEN1395_SD_Koz_Hind(F)) poseen un sitio de

corte para la enzima HindIII (AAGCTT) y las secuencias Shine-Dalgarno

(TAAGGAGG) y Kozak (GGCCACCATG) para mejorar la eficiencia de traducción en

procariontes y eucariontes, respectivamente. Los partidores 3’

(SEN1002_BamHI(R)2 y SEN1395_BamHI(R)2) poseen un sitio de corte para la

enzima BamHI (GGATCC), como se muestra en la Figura 9A.

El producto de PCR obtenido en ambos casos se confirmó por electroforesis

en geles de agarosa al 1% y se sometió a digestión con las enzimas de restricción

BamHI y HindIII (Figura 9B).

A B

Figura 9. Esquema de partidores y productos de PCR para clonamiento. (A) Partidores utilizados para amplificar

los genes SEN1002 y SEN1395. Secuencias adheridas: KOZAK

(rojo), Shine-Dalgarno (negro), sitios de corte HindIII y BamHI

(azul). (B) Productos de PCR generados con los partidores

recién descritos. Ambos corresponden al tamaño esperado de

501 pb (SD.KZ.1002) y 564 pb (SD.KZ.1395) como se observa

en la fotografía de un gel de agarosa 1%.

30

Resultados

3.2.2 Clonamiento de SEN1002 y SEN1395 en pVAXFlag. Construcción de vacunas.

Los productos de PCR de SEN1002 y SEN1395 digeridos se clonaron

independientemente en el vector pVAXFlag entre los sitios HindIII (5’) y BamHI (3’)

del sitio de múltiple clonamiento, quedando en fase con la secuencia 3xFlag y

permitiendo la generación de una proteína fusionada a este epítopo.

La Figura 10 muestra un esquema de clonamiento de los insertos en

pVAXFlag y de la proteína recombinante que se espera obtener luego de los

procesos de transcripción y traducción tanto en células procariontes como

eucariontes.

Inserto SD

KOZAK 3xFlag

BamHI HindIII

Transcripción y Traducción

Fragmento de interés 3xFlag

H2N COOH

Figura 10. Esquema de clonamiento del fragmento de interés en pVAXFlag (arriba) y la

proteína recombinante generada por la transcripción y traducción en procariontes y eucariones (abajo). Las secuencias SD y KZ mejoran la eficiencia de traducción del ARN mensajero, mas no

afectan la constitución de la proteína producida. Así mismo, la secuencia de corte BamHI, no genera

desfase en la traducción y permite la mantención del marco de lectura.

31

Resultados

Los plasmidios, generados en la ligación entre productos de PCR y vector, se

transformaron en E. coli DH5α y las colonias obtenidas se confirmaron por PCR

usando el partidor de inserción 5’ (SEN1002_SD_Koz_Hind o

SEN1395_SD_Koz_Hind, según correspondiese) y el partidor interno del vector

pVAXFlag (K1). Para cada caso, se esperan productos de PCR de 1.092 pb (vacuna

SEN1002) y 1.155 pb (vacuna SEN1395), lo que se ve reflejado en la fotografía de

un gel de agarosa 1% de la Figura 11.

Figura 11. PCR de confirmación de la transformación en DH5α con los plasmidios

construidos. En la fotografía se muestran los productos obtenidos de la reacción de PCR de

confirmación a partir de las colonias obtenidas de la transformación, resueltos en geles de agarosa al

1%. A la izquierda, se observan los productos obtenidos de 7 colonias distintas de la vacuna

SEN1395. A la derecha, se observan los productos de 8 colonias distintas de la vacuna SEN1002. En

ambos casos, los tamaños observados corresponden a lo esperado.

De aquellas colonias en que se confirmó la presencia de los plasmidios, se

seleccionó aleatoriamente una de cada vacuna y se extrajo el ADN plasmidial. Cada

una de estas muestras más el vector vacío pVAXFlag, se analizaron en un gel de

agarosa 1%. Los resultados se muestran en la Figura 12. En este caso, los tamaños

esperados corresponden a los observados en el gel.

Finalmente, los plasmidios obtenidos (pVAXFlag, pVAXFlag/SEN1002 y

pVAXFlag/SEN1395) se secuenciaron para confirmar la correcta construcción y

32

Resultados

descartar modificaciones perjudiciales para nuestro estudio. Dichos resultados

describen dos mutaciones puntuales; una en la secuencia del epítopo 3xFlag que se

mantiene en todas las construcciones y otra en la región 3’ de la secuencia de

SEN1395 (Tablas 6, 7 y 8).

Plasmidio Tamaño

pVAXFlag 3.030 pb

pVAXFlag/SEN1002 3.506 pb

pVAXFlag/SEN1395 3.569 pb

Figura 12. Confirmación de las construcciones por

tamaño plasmidial. Una alicuota de 3 μl de cada extracción

plasmidial se resolvió en un gel de agarosa 1%. (Arriba)

Tamaño esperado de los plasmidios construidos. (Izquierda) En

la fotografía se observan los plasmidios con un patrón de

migración que corresponde al tamaño esperado.

33

Resultados

Tabla 6. Secuenciación de pVAXFlag. Las secuencias corresponden a la real entregada por

Macrogen (superior) y a los nucleótidos esperados (inferior). En gris se describen las coincidencias

entre ambas secuencias. El fragmento que corresponde al epítopo 3xFlag se describe dentro del

encuadre negro y las mutaciones se especifican con un asterisco (*).

34

Resultados

Tabla 7. Secuenciación de pVAXFlag/SEN1002. Las secuencias corresponden a la real entregada

por Macrogen (superior) y a los nucleótidos esperados (inferior). En gris se describen las

coincidencias entre ambas secuencias. El fragmento que corresponde al epítopo 3xFlag se describe

dentro del encuadre negro, mientras que la secuencia SEN1002 se describe en el encuadre con línea

punteada. Las mutaciones se especifican con un asterisco (*).

35

Resultados

Tabla 8. Secuenciación de pVAXFlag/SEN1395. Las secuencias corresponden a la real entregada

por Macrogen (superior) y a los nucleótidos esperados (inferior). En gris se describen las

coincidencias entre ambas secuencias. El fragmento que corresponde al epítopo 3xFlag se describe

dentro del encuadre negro, mientras que la secuencia SEN1395 se describe en el encuadre con línea

punteada. Las mutaciones se especifican con un asterisco (*).

36

Resultados

3.3. Evaluación de expresión de proteínas in vitro. 3.3.1 Expresión de proteínas en bacteria.

Para determinar la funcionalidad de las construcciones y la producción de las

proteínas recombinantes SEN1002/FLAG y SEN1395/FLAG, los plasmidios se

transformaron en E. coli BL21(DE3), cepa que contiene el gen de la RNA polimerasa

del fago T7 inducible por IPTG. De este modo, la adición del compuesto permite la

transcripción del gen de interés contenido en el vector de expresión.

Con la cepa transformada se realizó un ensayo de inducción con IPTG 1 mM y

otro de represión con glucosa 1% durante 1 hora. Se utilizó el vector vacío como

control negativo y un derivado del plasmidio pET-15b que tiene clonado el gen

gluQ-rs como control positivo de inducción. Posteriormente, se recolectó el

sedimento de bacterias y las proteínas recombinantes se detectaron mediante

inmunoblot usando anticuerpos monoclonales anti-Flag.

Como se observa en la Figura 13, las bacterias trasformadas con

pVAXFlag/SEN1002 y pVAXFlag/SEN1395 expresaron fuertemente las proteínas

recombinantes codificadas en las vacunas, las que incluso en condiciones de

represión fueron producidas en cantidades detectables (Figura 13, derecha).

3.3.2 Expresión de proteínas en células eucariontes.

Para confirmar la producción de las proteínas recombinantes en células

eucariontes, se utilizaron células embrionarias humanas de riñón HEK 293 debido a

su alta eficacia en transfección. Estas células se cultivaron en medio DMEM

suplementado con suero fetal bovino (10% SFB) hasta el ensayo de transfección con

lipofectamina 2000.

37

Resultados

Figura 13. Expresión de proteínas recombinantes en bacteria. E. coli BL21(DE3) produce las

proteínas recombinantes codificadas en las vacunas en condiciones de cultivo estándar de inducción

(IPTG 1 mM) y represión (glucosa 1%). Izquierda, Fotografía SDS-PAGE 12% teñido con azul de

Coomassie. Derecha, fotografía del revelado de Western blot. Para estandarizar la técnica utilizamos la construcción pVAXFlag/GFP, en que

se clonó el gen de la proteína fluorescente verde (GFP) proveniente del plasmidio

pEGFP-C1 en nuestro vector pVAXFlag. Este plasmidio permite determinar

rápidamente la producción de la proteína recombinante GFP/FLAG por microscopía

de fluorescencia y, por consiguiente, la funcionalidad de los constructos en células

eucariontes.

Este plasmidio se utilizó en distintas variantes de la reacción. Se evaluaron

concentraciones de plasmidio y lipofectamina, así como cantidad de células y tiempo

de reacción, como se muestra en la Tabla 9.

38

Resultados

Tabla 9. Condiciones de estandarización de transfección

HEK Plasmidio

(pVAXFlag/GFP) Lipofectamina Tiempo de reacción Figura 14

2x106 400 ng 1 μg 2 horas B

2x106 400 ng 1 μg 4 horas C

2x106 400 ng 1 μg 24 horas E

2x106 800 ng 2 μg 24 horas F

2x106 400 ng 1 μg 48 horas H

2x106 800 ng 2 μg 48 horas I

HEK Plasmidio (pVAXFlag) Lipofectamina Tiempo de reacción Figura 14

2x106 400 ng 1 μg 4 horas A

2x106 800 ng 2 μg 24 horas D

2x106 800 ng 2 μg 48 horas G

En la Figura 14, se muestran 9 imágenes provenientes de células con

diferentes condiciones de transfección. Es posible observar que las condiciones

evaluadas generan diversos efectos en la eficiencia de transfección, siendo la

condición F la de mayor rendimiento (2x106 células por pocillo con 800 ng de

plasmidio y 2 μg de lipofectamina durante 24 horas de reacción).

39

Resultados

Figura 14. Estandarización del ensayo de transfección en células HEK293 con pVAXFlag/GFP. Se evaluaron distintas condiciones de reacción para optimizar la transfección (Tabla 9). En las

fotografías (A), (B), (C), (E) y (H) se transfectó con 400 ng del vector, mientras que en (D), (F), (G) e

(I) se transfectó con 800 ng del plasmidio. (Barra: 2 mm)

Utilizando el protocolo con mejor rendimiento (Figura 14F), se realizó un

ensayo de transfección con los plasmidios pVAXFlag/SEN1002 y

pVAXFlag/SEN1395 para determinar la producción de proteínas. Como controles se

utilizaron pVAXFlag/GFP (control positivo) y el vector vacío pVAXFlag (control

negativo). Finalizado el ensayo, las células se recuperaron y lisaron con tampón

RIPA y tampón de carga de proteínas 1x para realizar una separación electroforética

40

Resultados

de proteínas y Western blot. El resultado de estos ensayos se muestra en la Figura

15, donde se observa la presencia de las proteínas estudiadas y con tamaño

conforme a lo esperado.

Figura 15. Expresión de proteínas recombinantes en HEK293. Las células

eucariontes HEK293 son capaces de producir las proteínas recombinantes codificadas

en las vacunas. La imagen muestra una fotografía del revelado de westernblot. Como

controles se utilizaron pVAXFlag/GFP (producción de GFP/Flag; 30 kDa) y el vector

vacío pVAXFlag (control negativo). Además se comparó con la proteína SEN1395/Flag

(23,7 kDa) producida en bacteria. Los dos carriles SEN1395/Flag y SEN1002/Flag

(21 kDa) corresponden a dos ensayos independientes de transfección bajo las mismas

condiciones en HEK293. 3.4. Caracterización de las vacunas en ratones BALB/c 3.4.1 Planificación temporal de los ensayos A continuación se presenta un esquema de la planificación temporal de los

ensayos con ratones (Figura 16). En primer lugar se realizó la inmunización de los

grupos de ratones especificados en la Tabla 3, en tres dosis vías SC, IM e IN en los

tiempos cero, dos y tres semanas. Luego, de cada grupo experimental se utilizaron 6

ratones para los ensayos de linfoproliferación y cuantificación de citoquinas, mientras

41

Resultados

que los ratones restantes (5 de cada grupo) fueron utilizados para los ensayos de

desafío.

Figura 16. Planificación temporal de ensayos. Todos los ratones fueron inmunizados con tres dosis

a las semanas 0, 2 y 3, por las vías subcutánea (SC), intramuscular (IM) e intranasal (IN)

respectivamente. Durante la quinta semana se realizaron los ensayos de linfoproliferación de

citoquinas. Durante la quinta y sexta semana se realizaron los ensayos de desafío.

3.4.2 Respuesta inmune Frente a una infección bacteriana, la respuesta inmune de tipo celular es

crucial para la inmunidad protectora de un hospedero. En este tipo de respuesta

existen dos tipos de células T ayudantes (Th, del inglés T helper) llamadas Th1 y

Th2, donde la interacción entre uno u otro tipo celular está fuertemente mediada por

la secreción de citoquinas. Las células de tipo Th1 secretan interleuquina 2 (IL-2) e

interferón-γ (IFN-γ) generando la activación de macrófagos y reclutamiento de

células mononucleares, mientras que aquellas del tipo Th2 secretan interleuquinas 4

y 10 (IL-4 e IL-10), responsables de una fuerte respuesta por anticuerpos e inhibición

de muchas funciones de los macrófagos. Las respuestas Th1 se desarrollan

preferentemente durante las infecciones por patógenos intracelulares (como es el

caso de S. Enteritidis), mientras que las células del tipo Th2 otorgan mayor

42

Resultados

protección frente a patógenos extracelulares (Fishman y Perelson, 1999, Lin y cols.,

2008). Por esta razón, se determinó el perfil de secreción de las citoquinas IFN-γ e

IL-4 para determinar el tipo de respuesta generada por la inmunización. Además, se

evaluó la linfoproliferación, efecto relacionado directamente con la generación de

memoria en las células efectoras del sistema inmunológico.

3.4.2.1 Linfoproliferación Para evaluar el efecto de las vacunas sobre el sistema inmune del ratón, se

realizó un ensayo de linfoproliferación, en donde una suspensión de células de bazo

de cada grupo experimental (descrito previamente) se expuso a la proteína

recombinante o a la bacteria S. Enteritidis PT4 muerta por calor. Frente a este

estímulo, se evaluó la proliferación celular mediante la cuantificación de

radioactividad incorporada en el ADN (Figura 17).

Según los resultados obtenidos, se puede observar un aumento en la

linfoproliferación en el grupo de ratones vacunados con pVAXFlag/SEN1002

respecto de los grupos controles vacunados con el vector vacío y solución salina,

efecto que se aprecia tanto en inducción con la proteína recombinante SEN1002/Flag

como en la inducción con la bacteria muerta por calor (Figura 17 A-B). En contraste,

esta respuesta no ocurre en los ratones vacunados con pVAXFlag/SEN1395 (Figura

17 C-D).

3.4.2.2 Cuantificación de citoquinas secretadas La cuantificación de citoquinas se realizó mediante kits ELISA y se ajustó la

absorbancia a valores de concentración en pg/ml mediante una curva de calibración

con muestras estándar.

Según se observa en la Figura 18, los sobrenadantes de los cultivos de

esplenocitos, tanto de ratones vacunados con pVAXFlag/SEN1002 como con

pVAXFlag/SEN1395, contienen altos niveles de IFN-γ respecto de sus controles

43

Resultados

negativos. En contraste, los niveles de IL-4 se mantuvieron bajos en todos los

grupos.

Figura 17. Ensayo de Linfoproliferación. Cuatro grupos de ratones BALB/c se inmunizaron

independientemente con pVAXFlag/SEN1002, pVAXFlag/SEN1395, pVAXFlag o PBS.

Los esplenocitos obtenidos de los ratones de cada grupo se estimularon con distintos

antígenos: (A) proteína recombinante SEN1002/Flag (20 μg/ml), (B y D) S. Enteritidis PT4 muerta por

calor (4 μg/ml) y (C) proteína recombinante SEN1395/Flag (20 μg/ml). Cada barra equivale a las

cuentas por minuto emitidas por los cultivos celulares, evaluada por triplicado más la desviación

estándar (barras de error). *, P < 0,05 comparado con ambos controles del grupo A (vector vacío y

PBS); ** P < 0,05 comparado con ambos controles del grupo B (vector vacío y PBS).

44

Resultados

Figura 18. Cuantificación de citoquinas. Análisis mediante ELISA de las citoquinas IFN-γ e IL-4

secretadas in vitro por linfocitos estimulados con las proteínas recombinantes SEN1002-Flag (A) o

SEN1395-Flag (B) durante 24 horas. Las barras representan la concentración en pg/ml de las

citoquinas analizadas, obtenidas de un experimento por cada grupo experimental.

45

Resultados

3.4.3 Desafío con LK5 de ratones BALB/c inmunizados Los ensayos de desafío se realizaron inoculando vía intraperitoneal a cinco

ratones de cada grupo experimental con 104 UFC de la cepa virulenta S. Enteritidis

LK5 y luego de dos semanas se determinó la cantidad de UFC de Salmonella por

bazo. Los resultados son expresados como Log10 de UFC contabilizadas. En la Tabla 10 se observa que no hay diferencias significativas entre la

cantidad de UFC cuantificadas en los grupos experimentales y sus controles. Por

otra parte, en las placas sembradas con el grupo experimental pVAXFlag/SEN1395

no hubo crecimiento de bacterias.

Tabla 10. Recuento de Salmonella enterica LK5 a partir del bazo de ratones vacunados. Para todos los grupos se realizó estadística con n=5.

Vacuna Log10 UFC de S. enterica LK5 en

bazo (promedio ± SD)

Control salino, PBS 3,37 ± 0,18

Control pVAXFlag 3,36 ± 0,85

pVAXFlag/SEN1002 3,81 ± 0,42

pVAXFlag/SEN1395 Sin crecimiento

46

Discusión

4. DISCUSION En esta tesis se propuso desarrollar nuevas vacunas contra S. Enteritidis que

otorguen una protección efectiva y de larga duración para prevenir la infección aviar y

la transmisión de la bacteria al hombre.

Desde esta perspectiva, se diseñó un nuevo vector de expresión a partir del

vector comercial pVAX1, al que denominamos pVAXFlag. Para obtener este

plasmidio, se clonó dentro de pVAX1 la secuencia 3xFlag asociada al gen de

resistencia a Amp (para su seguimiento por selección) desde el plasmidio pLTS, un

derivado de pSUB11 (Figura 6). En esta construcción, el gen de resistencia a Amp

genera un distanciamiento considerable entre el codón de stop de término de la

traducción y la zona de poliadenilación cercano a 1 kb de secuencia “inutilizable”, por

lo que se eliminó para descartar cualquier tipo de interferencia con la eficiencia del

proceso de transcripción (Figuras 7 y 8). De este modo, se sintetizó el vector

pVAXFlag de 3.030 pb, que posee:

• Promotor de citomegalovirus (CMV) para un alto nivel de expresión de

proteínas en células eucariontes

• Promotor del fago T7, secuencia que se emplea para amplificar y secuenciar

insertos en los vectores así como expresar genes en cepas bacterianas

adecuadas

• Gen de resistencia a Kan para su selección en E. coli.

• Señal de poliadenilación para un término eficiente de transcripción y

poliadenilación del ARN mensajero

• Origen de replicación bacteriano pUC que permite la replicación en alto

número de copias en E. coli

• Secuencia del epítopo 3xFlag, que posibilita la generación de una proteína

recombinante fusionada al epítopo, permitiendo la detección por Western blot

con el anticuerpo comercial anti-Flag M2.

Por otra parte, en el sitio de múltiple clonamiento de pVAXFlag se mantienen

algunos sitios de corte del plasmidio precursor que permiten fusionar el inserto a la

47

Discusión

secuencia 3xFlag (NheI, AflII, HindIII, Asp718I, KpnI y BamHI), así como sitios que

posibilitan la inserción de un fragmento aislado (XhoI, XbaI, DraII, ApaI) como se

muestra en la Figura 19.

Esta nueva construcción permite clonar una gran variedad de secuencias

inmunogénicas y facilita la detección de las proteínas recombinantes, simplificando el

desarrollo de nuevas vacunas de ADN.

Figura 19. Secuencia de pVAXFlag, nucleótidos 661 al 960. La secuencia 3xFlag

está inserta dentro del sitio de múltiple clonamiento de pVAXFlag.

Hemos identificado dos secuencias en Salmonella Enteritidis que, de acuerdo

a los antecedentes mencionados previamente, representan un blanco favorable en la

construcción de nuevas vacunas. Estos genes, SEN1002 y SEN1395, se

amplificaron desde la cepa NCTC13349 de S. Enterididis excluyendo en ambos

casos el codón de término de traducción para permitir la fusión al segmento 3xFlag.

Por otra parte, las secuencias SD y KZ se anexaron al extremo 5’ para mejorar la

eficiencia de traducción en procariontes y eucariontes, respectivamente. Estas

secuencias (SD y KZ) no interfieren en la estructura de la proteína, pues como se

observa en la Figura 10 no se expresan en la proteína recombinante, permitiendo en

tal condición que dicha proteína se pueda producir eficientemente y en altas

cantidades.

Estos productos de PCR se clonaron independientemente en pVAXFlag entre

los sitios HindIII y BamHI del sitio de múltiple clonamiento, permitiendo la fusión con

48

Discusión

la secuencia 3xFlag manteniendo el marco de lectura en fase, como se muestra en la

Figura 10.

Las construcciones se confirmaron por PCR y por el tamaño plasmidial, como

se observa en las Figuras 11 y 12, donde en ambas ocasiones se lograron patrones

de migración de acuerdo a los tamaños esperados (pVAXFlag 3.030 pb;

pVAXFlag/SEN1002 3.506 pb; pVAXFlag/SEN1395 3.569 pb). No obstante, la

confirmación final se realizó mediante la secuenciación de todas las construcciones,

de modo de descartar modificaciones que, pese a mantener el tamaño y la estructura

de los plasmidios, pudieran afectar su funcionalidad.

Como se observa en la Tabla 6, la secuencia del vector de clonamiento

pVAXFlag posee dos mutaciones puntuales marcadas con “*”. Una de ellas se

encuentra incluida en la secuencia del epítopo 3xFlag, produciendo un cambio de

aminoácido de histidina (CAU) a arginina (CGU) que se repite en todas las

construcciones (Tablas 8 y 9). La segunda mutación se encuentra alejada de las

secuencias de interés, siendo de menor importancia.

En la secuencia de pVAXFlag/SEN1002 no hay modificaciones a excepción de

la mutación correspondiente al vector original pVAXFlag (Tabla 7) como se mencionó

anteriormente, mientras que en pVAXFlag/SEN1395 sí se generó una mutación extra

(Tabla 8). Esta modificación produce un cambio del aminoácido 169 de serina a

leucina en la región carboxilo terminal de la proteína. Sin embargo, esta alteración no

debiera generar un debilitamiento en la capacidad inmunogénica de la proteína, pues

de acuerdo al diagrama de residuos antigénicos de la proteína SEN1395 (Figura 5)

este aminoácido se encuentra en una región de bajo índice, manteniendo intactas las

zonas de mayor índice de antigenicidad. Por otra parte, el largo de la proteína

permite generar distintas zonas de reconocimiento por anticuerpos, por lo que, si sólo

una se ve afectada, es posible que otras regiones generen igualmente la respuesta

inmune esperada.

Con lo anterior, se confirmó la construcción de todos los vectores, mas no la

funcionalidad. Para este propósito, y frente a la presencia del promotor del fago T7,

los plasmidios se transformaron en E. coli BL21(DE3), cepa bacteriana cuya RNA

polimerasa T7 es inducible por IPTG. Este sistema permite detectar rápida y

49

Discusión

fácilmente la producción de proteínas debido a las ventajas del trabajo con bacterias

(alta replicación del plasmidio, expresión inducible, bajo costo, fácil manipulación,

entre otras).

Las proteínas recombinantes producidas por estas bacterias correspondieron

al tamaño esperado de la fusión entre los genes de Salmonella y el epítopo 3xFlag

(21 kDa SEN1002/Flag y 23,7 kDa SEN1395/Flag), como se muestra en la Figura 13

(izquierda). Cabe hacer notar que el nivel de proteínas totales producido por la

bacteria disminuye en aquellos casos en que la producción de proteína recombinante

está inducida (IPTG). Esto es debido a que los vectores construidos son de alto

número de copias, por lo que en el proceso de inducción toda la maquinaria

transcripcional y traduccional es secuestrada para trabajar en nuestro sistema, dando

paso a la reducción en la producción de proteínas esenciales y por tanto muerte

celular.

Al detectar las proteínas mediante Western blot (Figura 13, derecha), además

de la producción de las proteínas, se comprobó la funcionalidad del epítopo, lo que

demostró que la mutación encontrada en dicha secuencia no afectó tal propiedad.

Por otra parte, las proteínas se detectaron aún en condiciones represoras,

demostrando que el sistema de expresión es altamente eficiente. En condiciones

inducidas se observó un bandeo de proteína detectado por Western blot, marcas que

se atribuyen posiblemente a la degradación de la proteína recombinante, detectables

debido a los altos niveles de producción.

Para los estudios en células eucariontes, y debido a la complejidad del ensayo

de transfección, se construyó el plasmidio pVAXFlag/GFP. Estructuralmente, esta

construcción es similar a las vacunas de Salmonella, debido a que se clonó con las

mismas características genéticas (SD, KZ, sin codón de stop) entre los mismos sitos

de corte (HindIII y BamHI) y posee un tamaño similar (GFP/Flag 30 kDa

aproximadamente). De esta manera, se pudo determinar cualitativamente que, bajo

determinadas condiciones (Figura 14F; 24 horas de reacción, 800 ng de plasmidio,

2 μg de lipofectamina y aproximadamente 100% de confluencia celular en una

superficie de 9,4 cm2) se obtiene una mayor producción de las proteínas codificadas

en pVAXFlag en células HEK 293.

50

Discusión

Con estos parámetros, se determinó la producción de las proteínas

SEN1002/Flag y SEN1395/Flag en dicho modelo celular (Figura 15) confirmando la

funcionalidad de las construcciones tanto para un sistema procarionte como

eucarionte. Adicionalmente, y debido a la correcta emisión de fluorescencia por parte

de la proteína GFP/Flag, es posible inferir que la fusión de la proteína silvestre al

marcador no interfiere en la función (estructura) de la proteína de interés.

Habiendo caracterizado las construcciones en modelos in vitro, se procedió a

estudiar la funcionalidad de las vacunas en ratones BALB/c.

El ensayo de linfoproliferación permite evaluar la respuesta inmune de

linfocitos T luego de las inmunizaciones. En este sentido, los ratones inmunizados

con pVAXFlag/SEN1002 fueron capaces de responder frente a la inducción tanto por

la proteína recombinante como por el lisado de bacteria (Figura 17 A-B), no así los

ratones vacunados con pVAXFlag/SEN1395 que no proliferaron de manera

significativa respecto de los controles. Pese a esto, en ambos casos se detectaron

altos niveles de IFNγ secretados y bajas cantidades de IL-4 (Figura 18), datos que

indican que la inmunización con las vacunas construidas induce una respuesta

inmune celular Th1, esencial para la defensa frente a patógenos intracelulares como

S. Enteritidis.

Sin embargo, esta respuesta no fue suficiente para generar protección inmune

en los ratones desafiados con la cepa virulenta LK5 manteniendo inalterable la

magnitud de bacterias recuperadas (Tabla 10). No obstante, estos resultados son de

gran relevancia ya que al obtener la respuesta inmune de tipo celular Th1 como

esperábamos, es posible considerar que la estrategia utilizada en los desafíos no fue

la más adecuada, pudiendo modificar ciertos parámetros experimentales como

cantidad de inóculo y/o vía de inoculación, o bien replantear las tácticas de

inmunización en los mismos parámetros (concentración de plasmidio y/o vías de

inmunización).

Lejos de ser un resultado adverso, la estrategia desarrollada nos permitió

establecer una aproximación importante en la producción de vacunas de ADN para

Salmonella Enteritidis, hasta la fecha inexistentes en la literatura. En este sentido, la

única publicación relacionada refiere a una vacuna de ADN diseñada con el gen

51

Discusión

sopB contra S. enterica serovar Typhimurium en un modelo de ratones BALB/c

(Arvindhan y cols., 2009). Sin embargo, sólo ha sido estudiada de manera conjugada

con la bacteria atenuada y los resultados podrían atribuirse tanto a la vacuna de ADN

como a la bacteria, siendo este trabajo, en contraste, el primero en evaluar de

manera independiente la eficacia de vacunas de ADN contra Salmonella enterica.

Por otra parte, el vector que hemos desarrollado es una poderosa herramienta

para el campo de la inmunología, de fácil manipulación, detección y producción,

proporcionando un adelanto considerable ya que no sólo es útil para nuestro

patógeno, sino que puede ser ampliado a otros organismos en distintas áreas de

investigación.

52

Conclusiones

5. CONCLUSIONES

• pVAXFlag es un nuevo vector de alto número de copias y fácil manipulación

que permite generar proteínas recombinantes potencialmente antigénicas para

su uso como vacunas de última generación. El clonamiento en este vector

genera proteínas fusionadas al epítopo 3xFlag lo que posibilita la detección de

cualquier fragmento producido con el anticuerpo comercial anti-Flag M2.

• Los plasmidios construidos expresan correctamente las proteínas

recombinantes en células eucariontes in vitro. Además, dado que la proteína

GFP/FLAG codificada en el vector pVAXFlag/GFP mantiene la emisión de

fluorescencia, demuestra que el epítopo Flag no perjudica la funcionalidad de

los productos.

• Las vacunas construidas (y el vector vacío) son inocuas para ratones BALB/c.

• pVAXFlag/SEN1002 es capaz de inducir respuesta inmune en ratones BALB/c

pues produce un aumento en la linfoproliferación de esplenocitos, así como un

aumento en la secreción de INFγ y disminución de la citoquina

inmunosupresora IL-4. De manera similar, pVAXFlag/SEN1395 genera el

mismo patrón de secreción de citoquinas a pesar de no tener un efecto

evidente en linfoproliferación.

• Si bien hubo respuesta inmune generada por ambas vacunas, en las

condiciones evaluadas en esta tesis, no fue posible generar algún efecto de

protección frente al desafío con LK5 de ratones inmunizados.

• Las vacunas construidas proporcionan un adelanto considerable en el área

inmunológica, siendo éstas las primeras vacunas desarrolladas contra S.

enterica serovar Enteridis

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UNIVERSIDAD DE CHILE€¦ · Daniela Seelenfreund _____ Dr. Roberto Vidal _____ "Los animales no se comunican con el fin de exhibirse, sino con el fin de la gestión de un entorno

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