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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

MODALIDAD INVESTIGACIÓN

TEMA:

ACCIÓN ANTIMICROBIANA DE SOLUCIONES FORMADORAS DE

RECUBRIMIENTOS COMESTIBLES A BASE DE QUITOSANO Y

EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO DE JENGIBRE (ZINGIBER

OFFICINALE) FRENTE ALGUNOS MICROORGANISMOS

DE INTERÉS SANITARIO.

TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO PREVIO

PARA OPTAR AL GRADO DE QUÍMICA Y FARMACÉUTICA.

AUTORA:

JESIKA IVONNE CEVALLOS WONG

TUTORA:

DRA. CELESTE JACQUELINE CARRILLO TOMALÁ

CO – TUTOR:

ING. RAÚL DÍAZ TORRES PHD.

GUAYAQUIL – ECUADOR

2015

II

III

IV

V

VI

AGRADECIMIENTO

Agradezco a Dios, por haberme permitido llegar hasta este punto y haberme

dado salud para lograr mis objetivos, además de su infinita bondad y amor.

A mi madre, que con su demostración de una madre ejemplar me ha

enseñado a no desfallecer ni rendirme ante nada y siempre perseverar a través

de sus sabios consejos.

A Stuard, por acompañarme durante todo este arduo camino y compartir

conmigo alegrías.

A mis tutores Dra. Celeste Carrillo y Dr. Raúl Díaz que por su apoyo

incondicional, así como también haberme tenido toda la paciencia del mundo

para guiarme durante todo el desarrollo del trabajo de titulación.

A los doctores Oswaldo Pesantes, Adonis Bello y demás docentes de la

Facultad de Ciencias Químicas por su colaboración y su interés en dirigir esta

investigación, además, agradezco su calidez y su valiosa amistad.

A las diferentes instituciones que han colaborado con la realización de esta

tesis, Instituto Nacional de Pesca, a la Q.F Mery Ramírez de la Universidad

Estatal Península de Santa Elena, a la Ing. Isabel de la Facultad de Ingeniería

Química de la Universidad de Guayaquil.

A mis amigos Cristhian y Yoly porque cada uno con sus valiosas aportaciones

hicieron posible este proyecto y por la calidad humana que me han demostrado

con su amistad.

Son muchas las personas que han formado parte de mi vida profesional a las

que me encantaría agradecerles su amistad, consejos, apoyo, ánimo y compañía

en los momentos más difíciles de mi vida. Algunas están aquí conmigo y otras en

mis recuerdos y en mi corazón, sin importar en donde estén quiero darles las

gracias por formar parte de mí, por todo lo que me han brindado y por todas sus

bendiciones.

VII

DEDICATORIA

A mi madre Narcisa y padre Walter, por haberme apoyado en todo momento,

por sus consejos, sus valores, comprensión y por la motivación constante que

me ha permitido ser una persona de bien, pero más que nada, por su amor.

A mi hermano Walther, que con su amor me ha enseñado a salir adelante.

Gracias por estar en otro momento importante en mi vida.

VIII

ÍNDICE GENERAL

CARTA DE AUTORÍA DEL TRABAJO DE TITULACIÓN .................................... IV

AGRADECIMIENTO ........................................................................................... VI

DEDICATORIA .................................................................................................. VII

ÍNDICE DE FIGURAS ......................................................................................... XI

ÍNDICE DE GRÁFICOS ...................................................................................... XI

ÍNDICE DE TABLAS .......................................................................................... XII

RESUMEN EJECUTIVO ................................................................................... XIII

ABSTRACT ..................................................................................................... XIV

INTRODUCCIÓN ................................................................................................. 1

ANTECEDENTES ................................................................................................ 3

ESTADO DEL ARTE ........................................................................................... 7

JUSTIFICACIÓN................................................................................................ 10

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ................................................................ 12

FORMULACIÓN DEL PROBLEMA .................................................................... 14

OBJETIVOS ...................................................................................................... 15

Objetivo General ............................................................................................ 15

Objetivos Específicos ..................................................................................... 15

HIPÓTESIS ....................................................................................................... 16

VARIABLES ....................................................................................................... 16

CAPITULO I ....................................................................................................... 18

MARCO TEÓRICO ..................................................................................... 18

1.1. Alimento .............................................................................................. 18

1.2. Enfermedades transmitidas por alimentos ........................................... 19

1.3. Microorganismos de interés sanitario .................................................. 20

1.3.1. Escherichia coli............................................................................. 20

1.3.2. Salmonella .................................................................................... 21

1.3.3. Staphyloccocus aureus ................................................................ 22

1.3.4. Listeria monocytogenes ................................................................ 23

1.4. Recubrimientos comestibles ................................................................ 23

1.5. Quitosano ............................................................................................ 24

1.6. Aceite esencial .................................................................................... 26

1.6.1. Composición química ................................................................... 26

IX

1.7. Fenoles ................................................................................................ 27

1.8. Jengibre ............................................................................................... 28

1.8.1. Clasificación taxonómica .............................................................. 28

1.8.2. Composición química del jengibre ................................................ 28

GLOSARIO DE TÉRMINOS .............................................................................. 30

CAPÍTULO II ...................................................................................................... 34

METODOLOGÍA ................................................................................................ 34

2.1. MÉTODOS CIENTÍFICOS EMPLEADOS EN LA INVESTIGACIÓN .... 34

MÉTODO CIENTÍFICO: ..................................................................................... 34

MÉTODOS EMPÍRICOS: ............................................................................... 34

MÉTODOS ESTADÍSTICOS .......................................................................... 35

2.2. METODOLOGÍA .................................................................................. 36

2.3. TIPO DE INVESTIGACIÓN ................................................................. 37

2.4. DISEÑO EXPERIMENTAL DE LA INVESTIGACIÓN ........................... 37

2.5. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS ........................................... 37

PROCEDIMIENTOS....................................................................................... 39

2.6. RECOLECCIÓN Y PREPARACIÓN DEL MATERIAL VEGETAL ......... 39

2.7. TÉCNICA DE EXTRACCIÓN POR PERCOLACIÓN, MACERACION Y SOXHLET CON ETANOL A TRES CONCENTRACIONES DIFERENTES (50%, 70%, 90%) ........................................................................................... 39

2.7.1. Extracción por Percolación ........................................................... 39

2.7.2. Extracción por Maceración ........................................................... 40

2.7.3. Extracción Soxhlet ........................................................................ 40

2.7.4. Concentración en Rotaevaporador ............................................... 41

2.8. Pruebas de Identificación de Fenoles Totales por método de Folin Ciocalteu ........................................................................................................ 41

Preparación de la curva de calibración. ...................................................... 42

2.9. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA ....................... 42

2.9.1. Técnica de difusión de disco en agar ............................................ 42

2.10. PREPARACIÓN DE LA SOLUCION FORMADORA DE RECUBRIMIENTOS COMESTIBLES. ............................................................ 43

CAPÍTULO III ..................................................................................................... 44

RECOLECCIÓN DE DATOS. ............................................................... 44

ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS ........................................ 45

CONCLUSIONES .......................................................................................... 55

RECOMENDACIONES .................................................................................. 56

X

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................... 57

ANEXOS ........................................................................................................... 65

XI

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura I. Estructura química del quitosano ............................................................. 25

Figura II. Estructura química de gingerol y shogaol ............................................. 29

Figura III. EXTRACCIÓN POR SOXHLET ................................................................. 65

Figura IV. EXTRACCIÓN POR MACERACIÓN ......................................................... 66

Figura V. EXTRACCIÓN POR PERCOLACIÓN ........................................................ 66

Figura VI. ROTAEVAPORACIÓN .............................................................................. 67

Figura VII. REACTVO DE FOLIN- CIOCALTEU ........................................................ 67

Figura VIII. PRUEBA DE FOLIN-CIOCALTEU .......................................................... 68

Figura IX. LECTURA ESPECTROFOTOMETRICA A 760NM ................................... 68

Figura X. E. Coli ........................................................................................................ 69

Figura XI. Salmonella typhimurium ......................................................................... 70

Figura XII. Staphylococcus aureus .......................................................................... 70

Figura XIII. Listeria monocytogenes ........................................................................ 71

Figura XIV. PREPARACIÓN DEL QUITOSANO ....................................................... 71

Figura XV. INOCULACIÓN DEL MICROORGANISMO ............................................. 72

Figura XVI. INCORPORACIÓN DE SOLUCIONES FORMADORAS ......................... 73

Figura XVII. E. coli .................................................................................................... 73

Figura XVIII. S. typhimurium .................................................................................... 74

Figura XIX. S. aureus ................................................................................................ 74

Figura XX. L. monocytogenes .................................................................................. 75

Figura XXI. SEGUNDA ETAPA DE CONCURSO “GALARDONES NACIONALES 2015” PROMOVIDO POR LA SENECYT. ......................................... 76

Figura XXII. TERCERA ETAPA DE CONCURSO FINALES DE “GALARDONES NACIONALES 2015” PROMOVIDO POR LA SENECYT. .............. 78

ÍNDICE DE GRÁFICOS

Gráfico I. Curva de calibración para fenoles totales .............................................. 45

Gráfico II. Compuestos fenólicos ............................................................................ 48

XII

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla I. Cepas de E. coli causantes de diarrea ...................................................... 20

Tabla II. Especies y Subespecies de Salmonella .................................................... 21

Tabla III. Composición química del jengibre ........................................................... 29

Tabla IV. Curva patrón de ácido gálico ................................................................... 45

Tabla V. Promedios y desviaciones estándares de los métodos de extracción con sus concentraciones hidroalcohólicas. ........................................ 46

Tabla VI Análisis de varianza para efecto de dos factores .................................... 46

Tabla VII. Comparación de medias por test de Duncan para distintos métodos de extracción ............................................................................................. 47

Tabla VIII. Pruebas de comparación por test de Duncan para las distintas concentraciones de extractos hidroalcohólicos .................................................... 47

Tabla IX Códigos de las concentraciones de extracto hidroalcohólico ................ 49

Tabla X. Tamaño de halo de inhibición (mm) del extracto de jengibre ................. 49

Tabla XI. Análisis de varianza para E. coli frente al extracto hidroalcohólico Maceración 90º .......................................................................................................... 50

Tabla XII Códigos de las concentraciones de extracto hidroalcohólico ............... 51

Tabla XIII. Tamaño del halo de inhibición (mm) de la solución formadora de recubrimiento. ........................................................................................................... 51

Tabla XIV. Análisis de varianza para E. coli ............................................................ 51

Tabla XVI. Análisis de varianza para Listeria Monocytogenes .............................. 52

Tabla XVII. Análisis de varianza para Salmonella typhimurium ............................ 53

Tabla XIX. Análisis de varianza para Staphylococcus aureus ............................... 53

XIII

RESUMEN EJECUTIVO

El presente trabajo se realizó en los laboratorios de la facultad de Ciencias

Químicas de la Universidad de Guayaquil, su objetivo primordial fue evaluar la

posible actividad antimicrobiana de una solución formadora de recubrimiento

comestible a base de extracto hidroalcohólico de jengibre mas quitosano, frente

a Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus y Listeria

monocytogenes. El jengibre obtenido de un supermercado de consumo masivo

al norte de la ciudad de Guayaquil, fue lavado para quitar de su superficie

partículas extrañas como polvo, tierra y restos de raíces, pelado y por ultimo

triturado para realizar la extracción hidroalcohólica utilizando tres métodos

diferentes: Soxhlet, Maceración y Percolación, siendo seleccionado el método de

Maceración. La actividad antimicrobiana se determinó utilizando la técnica de

difusión de disco en agar, inoculando los microorganismos en medio agar

Mueller Hinton, las placas fueron incubadas a 37°C durante 24 horas, después

de lo cual se realizaron las lecturas de los halos de inhibición de todas las placas

preparadas para los diferentes microorganismos y con las diferentes posibles

mezclas de formulación final de solución de recubrimiento comestible. Se

concluye que existió una inhibición del crecimiento de Escherichia coli ATCC

25922 al utilizar tanto el extracto hidroalcohólico como la solución formadora de

recubrimiento comestible preparada a base de extracto hidroalcohólico de

jengibre más quitosano.

Palabras Clave: Recubrimiento Comestible, Jengibre, Quitosano, Inhibición

Microbiana

XIV

ABSTRACT

This work was done in the laboratories of the Faculty of Chemistry of the

University of Guayaquil, its primary objective was to evaluate the possible

antimicrobial activity of an edible coating forming solution based hydroalcoholic

ginger extract more chitosan, against Escherichia coli , Salmonella typhimurium,

Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes. Ginger obtained from a

supermarket consumer north of the city of Guayaquil, was washed to remove

foreign particles from its surface as dust, dirt and debris root, peeled and crushed

to finally make the alcoholic extraction using three different methods: Soxhlet,

maceration and percolation, being selected the method of maceration. The

antimicrobial activity was determined using the technique disk diffusion agar,

inoculating microorganisms in Mueller Hinton Agar, the plates were incubated at

37 ° C for 24 hours after which readings inhibition halos were performed All the

plates prepared for different microorganisms and the various possible mixtures

final formulation of edible coating solution. It was concluded that growth inhibition

of Escherichia coli ATCC 25922 by using both the hydroalcoholic extract and

edible coating forming solution prepared from hydroalcoholic ginger extract plus

chitosan.

Keywords: Edible coating, Ginger, Chitosan, Microbial Inhibition

1

INTRODUCCIÓN

El consumo de alimentos como frutas y hortalizas representa en la actualidad

una tendencia mundial en favor de la salud de sus consumidores. Los productos

con estas características requieren la generación y evaluación de procesos

tecnológicos que garanticen la calidad e inocuidad de los mismos. Los productos

vegetales tienen un tiempo de vida útil o en percha corto debido a la degradación

por acción de factores físicos y por la acción de los microorganismos y otros

factores involucrados en el proceso que afectan la inocuidad del producto.

Según la OMS (Organización Mundial de la Salud), 2015, las enfermedades

transmitidas por los alimentos suponen una importante carga para la salud.

Millones de personas enferman y muchas mueren por consumir alimentos

insalubres.

Con el fin de incrementar la vida útil de los alimentos y especialmente de

aquellos de origen vegetal se han desarrollado los recubrimientos comestibles

que van a usarse para retardar la migración de humedad y lípidos o el transporte

de gases y solutos. Éstos, deben poseer propiedades mecánicas que garanticen

la adecuada adhesividad a los alimentos (Famá et al., 2004; Figueroa, Salcedo,

Aguas, Olivero, & Narváez, 2011).

Las coberturas comestibles fueron creadas como una estrategia para reducir

los efectos perjudiciales en los tejidos vegetales funcionando como una barrera

artificial semipermeable, contribuyen a la extensión de la vida útil del producto al

reducir la migración de humedad y de solutos, el intercambio de gases, la

respiración y otras reacciones oxidativas, disminuyendo así los desórdenes

fisiológicos. Estas coberturas comestibles pueden servir como soporte de

algunos aditivos alimentarios, tales como antioxidantes, antimicrobianos,

colorantes, saborizantes y nutrientes (Figueroa et al., 2011).

2

Viña et al. (2007), definieron a las películas y recubrimientos comestibles

como matrices o soportes que pueden ser formadas por lípidos, polisacáridos y

proteínas. Estos otorgan al alimento al que van adheridos la posibilidad de

aumentar su calidad mediante el control de migración de la humedad, grasas,

oxígeno y compuestos responsables del sabor, color y aroma. Logrando así

mantener en buenas condiciones al producto alimenticio por largos periodos de

almacenamiento.

En la elaboración de los recubrimientos comestibles se pueden incorporar

productos naturales con actividad antimicrobiana procedentes de plantas en

sustitución al uso de productos químicos.

El rizoma del jengibre tanto fresco como seco es una especie vegetal utilizada

en la preparación de alimentos y goza de una amplia reputación por sus

propiedades medicinales en la medicina tradicional en China por más de 2 500

años (Funk et al., 2009; Gómez et al., 2013).

En el jengibre, además de los compuestos volátiles que aportan el olor típico

de este rizoma, existe un grupo de compuestos no volátiles que aportan

propiedades farmacológicas importantes (Mahady, Pendland, Yun, Lu, & Stoia,

2003). Además contiene compuestos polifenólicos que le aportan una alta

actividad antioxidante (Stoilova, Krastanov, Stoyanova, Denev, & Gargova,

2007).

Este estudio va a comprobar el efecto de un recubrimiento comestible a base

de Jengibre (Zingiber officinale), junto a la acción del Quitosano que en conjunto

podría tener un efecto inhibitorio frente a varios microorganismos de interés

sanitario y podría ser una alternativa a los problemas de pérdidas de alimentos y

preservación de los mismos.

3

ANTECEDENTES

Jengibre

El jengibre cuyo nombre científico es “Zingiber officinale”, es originario de

zonas tropicales de Asia, la parte utilizada tradicionalmente es el rizoma,

empleado como especia hace más de 2.000 años (Stoilova, Krastanov,

Stoyanova, Denev, & Gargova, 2007).

El jengibre posee un grupo de compuestos no volátiles que aportan

propiedades farmacológicas importantes, presentando propiedades para

tratamiento de enfermedades gastrointestinales, es un antiemético (Mahady,

Pendland, Yun, Lu, & Stoia, 2003), estimulante circulatorio, utilizándose cuando

hay mala circulación y calambres, afecciones respiratorias, como expectorante,

y antiséptico (ABIES, s.f.).

Las oleorresinas del jengibre se obtienen mediante la extracción de los

compuestos aromáticos de las especias deshidratadas con solventes orgánicos.

Sus raíces y los extractos obtenidos contienen compuestos de polifenol (6-

gingerol y sus derivados), que tienen una alta actividad antioxidante (Stoilova,

Krastanov, Stoyanova, Denev, & Gargova, 2007) incluso mayor que la del alfa-

tocoferol (vitamina E) (Craig, 2006).

Alonso (2004), recopiló información importante, donde indicó que

las oleorresinas se producen mediante la extracción de los

compuestos aromáticos de las especias deshidratadas con

solventes orgánicos. El conjunto de sesquiterpenos de la

oleorresina, en especial el B-sesquifelandreno, demostró in vitro

actividad inhibitoria frente al rinovirus (Denyer C.et al., 1994). El

extracto dicloro-metano y metanólico de la raíz de jengibre ha

exhibido actividad bactericida (in vitro) frente a gérmenes Gram

4

positivos y negativos. En ese sentido el extracto alcohólico al 80%

del rizoma resulto ser activo en dosis de 500 ug/disco frente a

Bacillus antracis, Bacillus subtilis, Escherichia coli (cepas 7075 y

BB), Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella

typhi, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis

Staphylococcus hemolyticus. En la misma dosis, pero extraído en

alcohol de 90% resulto activo frente a B. subtilis, E. coli y

Streptococcus faecalis (Mascolo N. et al., 1989). Por su parte, el

extracto metanólico de la raíz demostró actividad inhibitoria in vitro

frente a Bacillus cereus (Alzoeky N. et al., 2003).

Quitosano

El quitosano es un polisacárido obtenido mediante la desacetilación parcial de

la quitina contenida en el exoesqueleto de crustáceos. (Feepons, 1991; Ramos

et al., 2010).

Las películas de quitosano han sido utilizadas en el control de Penicillium

Italicum en manzanas, asimismo ha sido probada en rodajas de mango y en

fresones, mejorando algunas propiedades físico-químicas del fruto, y

disminuyendo la deshidratación (Sánchez, Vargas, González, Cháfer, & Chiralt,

2008), e induciendo la resistencia de la fruta además de inhibir el crecimiento del

patógeno. (Cruañes & Locaso, 2011)

Dependiendo de la concentración usada, factores inherentes al quitosano, su

preparación, y del microorganismo a controlar, el quitosano generará una

inhibición o disminución de la carga microbiana.

Wang (1992) observó que una concentración alta de quitosano (1-

1.5% p/v) se requiere para la inactivación completa de

Staphylococcus aureus después de dos días de incubación a pH

5

5,5. Para un efecto bactericida de Bacillus cereus requiere una

concentración de quitosano del orden de 0,02% p/v. Escherichia

coli y Proteus vulgaris mostraron crecimiento mínimo en

soluciones de quitosano al 0,005%, y una inhibición completa a >

0,0075% de quitosano (Valenzuela & Arias, 2012).

Recubrimiento comestible

Los recubrimientos comestibles datan de los siglos XII y XIII en China donde

se efectuaban en cítricos la inmersión en cera, que usaban para retrasar la

pérdida de agua (Kaplan, 1986; Greener y Fennema, 1994; Bósquez-Molina,

2003).

Al recubrimiento comestible se lo detalla como una capa delgada constituida

por materiales poliméricos, como lípidos, proteínas o polisacáridos en solución,

que son comestibles y colocadas sobre la superficie del alimento con la intención

de extender su vida útil y proporcionar una efectiva barrera (Restrepo &

Aristizábal, 2010), disminuyendo los índices de respiración y transpiración a

través de la superficie de las frutas y así retrasando el crecimiento microbiológico

y los cambios de color, mejorando asimismo la textura y calidad de la fruta

(Cruañes & Locaso, 2011), igualmente mejora la integridad estructural y

propiedades de manipulación mecánica de los alimentos, (Cordeiro de Azeredo,

2012) dando un efecto sinérgico de los componentes sobre la vida de anaquel

de dichos alimentos.

Moncayo et al., (2013) realizaron un estudio utilizando como recubrimiento

comestible un biopolímero tipo dextrana, en fresas (Fragaria × ananassa L), las

que presentaron una disminución en la pérdida de peso, y deterioro

microbiológico, conservando las propiedades mecánicas del producto.

6

Figueroa et al., 2011 realizaron recubrimientos comestibles a base de

propóleo para la conservación de mango y aguacate, las que redujo la pérdida

de peso, la velocidad de respiración y la maduración, con la finalidad de

extender la vida comercial del producto, mejorando su apariencia.

El polisacárido más utilizado para la formulación de los recubrimientos

comestibles es el quitosano, reduciendo el crecimiento de hongos y bacterias

(Ramos-García, et al., 2010).

Durango et al. (2006) desarrollaron recubrimientos a base de

almidón de ñame (Dioscorea sp.) y quitosano, preparados por

termo-gelatinización usando suspensiones de 4% de almidón de

ñame (w/w) y 2% de glicerol (w/w). El quitosano fue agregado en

concentraciones de 0.5% y 1.5% (w/w). La máxima actividad

antimicrobiana se obtuvo en el RC que contenía 1.5% (w/w) de

quitosano y fue totalmente eficiente sobre el crecimiento de

mohos y levaduras. A esta concentración el conteo de este grupo

de microorganismos se redujo en 2.5 ciclos logarítmicos en los

trozos de zanahoria (Daucus carota L.) que se almacenaron

durante 15 días. El recubrimiento con una concentración de 0.5%

(w/w) de quitosano controló el desarrollo de mohos y levaduras

durante los primeros 5 días de almacenamiento. Después de este

tiempo las muestras evaluadas (Quintero, Falguera, & Muñoz,

2010).

7

ESTADO DEL ARTE

Los productos hortofrutícolas están expuestos a pérdidas, en cantidad y

calidad en el período de recolección, manipulación y traslado. Actualmente hay

un creciente interés por el desarrollo de materiales que puedan mejorar la vida

útil de los alimentos y también por la seguridad microbiológica que se les da

(Arce- Alfonso, 2011).

Se han implementado para prolongar la vida útil en los productos

hortofrutícolas diferentes tecnologías, entre ellas el almacenamiento a bajas

temperaturas, la aplicación de tratamientos hidrotérmicos, irradiación

(Quezada et al., 2003), recubrimientos y películas comestible (Ramos-García, et

al., 2010).

No obstante a que los términos películas comestibles y recubrimientos

comestibles se refieren a veces como sinónimos, hay una diferencia,

las películas están preformadas por separado y después se aplican a la

superficie de los alimentos o sellados en bolsas comestibles, mientras que los

recubrimientos se forman directamente sobre las superficies de los

alimentos. (Cordeiro de Azeredo, 2012)

Malu, Obochi, Tawo y Nyong (2009), comprobaron la actividad antibacteriana

de extractos del jengibre obtenidos por diferentes métodos. Ellos utilizaron

diferentes métodos de extracción empleando agua, n- hexano, acetato de etilo y

extracción por un aparato soxhlet usando como solvente el etanol. Los

resultados de los extractos mostraron que tienen actividad antibacteriana sobre

Bacillus colliform, Staphylococcus epidermidis y Streptococcus viridians, excepto

el extracto acuoso que no presenta inhibición de la actividad bacteriana. (Malu,

Obochi, Tawo, & Nyong, 2009)

8

Habsah et al., (2000), investigaron sobre los hongos causantes de

micosis humanas, y ningún extracto del jengibre ha presentado un

resultado activo. Al contrario frente a hongos fitopatógenos ellos

poseen efectividad para Drechslera oryzae, Rhizoctonia solani,

Sclerotium oryzae y Sclerotum rolfsii (Caceres A., 1997). El

extracto al 10% de la raíz de jengibre evidencio actividad fungicida

in vitro e in vivo frente a Fusarium udum, hongo causante del

deterioro de cultivos de gandul (Cajanus cajan) (Singh R. & Rai

B., 2000). El 6-gingerol combinado con piperonil-butóxido

demostró poseer actividad molusquicida sobre Lymnaea

acuminata (Singh K. & Singh D., 2000). Por último, el extracto etil-

acético del rizoma de jengibre ha demostrado ser eficaz frente al

desarrollo de Schistosoma mansoni (macho y hembra adultos)

tanto in vivo como in vitro (Sanderson et al., 2002).

Parzanese (2012), indica que el quitosano en los últimos años se ha

convertido en el aditivo de alimentos de origen biológico preferido, debido a su

abundancia en la naturaleza y a su capacidad para formar películas. El

quitosano posee propiedades tales como actividad antimicrobiana, no es tóxico

y tiene afinidad notable a las proteínas, presentando características

biofuncionales (Ramos-García, et al., 2010), por lo que podría ser una opción

factible para elaborar recubrimientos comestibles y así sustituir los métodos de

control de microorganismos tradicionales utilizándose sin problemas (González–

Aguilar, Monroy–García, Goycoolea–Valencia, Díaz–Cinco, & Ayala–Zavala.,

2005), siendo aplicadas en muchos productos, principalmente frutas y hortalizas

como fresas (Moncayo-Martinez, Buitrago-Hurtado, & Perilla, 2013), pimientos

(Bautista-Baños, Hernández-Lauzardo, Valle, Bosquez-Molina, & Sánchez,

2005), pepinos (Galletti, Berger, Drouilly, & Lizana, 2006), arándanos (Cruañes

& Locaso, 2011), peras (Chatterjee et al., 2004), mango y aguacate (Figueroa et

al, 2011) con el objetivo de preservar su calidad y actuar como agente

antimicrobiano.

9

Los recubrimientos con quitosano se distinguen de otros polisacáridos por ser

transparentes, formando una cubierta semipermeable (Bautista-Baños,

Hernández-Lauzardo, Valle, Bosquez-Molina, & Sánchez, 2005) en la superficie

de los frutos, que actúa como una barrera mecánica frente al O2 (Ramos et al.,

2010), ocasionando cambios físico-químicos favorables en el metabolismo de las

frutas u hortalizas alargando su vida de anaquel (Bautista et al., 2005) y

reduciendo el desarrollo de pudriciones durante el almacenamiento causadas

por hongos, como Rizophus stolonifer, Botrytis cinerea , y Alternaria alternata

entre otras (Ramos et al., 2010). Además presenta un amplio espectro

antimicrobiano, que ha sido expuesto a través de varios mecanismos de acción,

contra microorganismos patógenos tales como Escherichia coli, Listeria

monocytogenes, Pseudomonas spp, Salmonella, Staphylococcus aureus, (Mead,

1999; Huang et al., 2012; Valenzuela & Arias, 2012)

10

JUSTIFICACIÓN

Según la FAO (2000), los microorganismos son los causantes de la mayoría

de pérdidas de los alimentos producidos a nivel mundial. Esto le da vital

importancia el envasado y almacenamiento de los alimentos. Así en los últimos

años, la industria agroalimentaria ha priorizado la sustitución de los aditivos

químicos convencionales por compuestos naturales como respuesta a la

demanda creciente de los consumidores de una alimentación más sana y

segura.

El diseño de formulaciones formadoras de recubrimiento a base de

biopolímeros biodegradables como el quitosano combinados con antimicrobianos

naturales representan una técnica innovadora que puede garantizar la seguridad

y prolongar la vida útil de los alimentos. (Sánchez Gonzáles, 2010)

Rodríguez (2011), indicó que para la industria alimentaria se ha vuelto de

gran interés el estudio de los extractos y aceites esenciales derivados de las

plantas debido a su propiedad de controlar el crecimiento de microorganismos

patógenos de manera natural, evitando así las enfermedades producidas por los

alimentos y/o descomposición de los mismos.

En este sentido, numerosas investigaciones destacan el amplio espectro de

estos extractos y aceites esenciales frente a diferentes cepas de hongos,

levaduras, virus y bacterias. (Sánchez Gonzáles, 2010)

Investigaciones realizadas in vitro donde se demuestran

las propiedades antimicrobianas de Z. officinale, atribuidos a los

componentes 6-gingerol y zingerona. Se ha demostrado in vitro

que extractos de jengibre bloquean la unión entre la enterotoxina

11

termolábil de la Escherichia coli al receptor de la superficie celular

GM1 por medio de zingerona (vanillil acetona) (Chen et al., 2007).

Realizar un estudio utilizando el Jengibre (Zingiber officinale), junto a la

acción del quitosano podría resultar una solución a los problemas de pérdidas de

alimentos, así como una alternativa más eficaz para la preservación de los

mismos.

12

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Un alimento alterado es aquel que presenta cambios que limitan su

aprovechamiento. El alimento alterado tiene modificadas sus características

organolépticas y no es apto para el consumo, sin que ello suponga siempre que

sea peligroso para la salud.

Existen varios tipos de agentes causantes de la alteración de los alimentos:

los de origen biológico, entre los que se pueden diferenciar, los intrínsecos,

como las enzimas y los extrínsecos, como parásitos o microorganismos y

también los de origen físico como la temperatura, luz, entre otros. Pero sin duda

los que producen las transformaciones más indeseadas y abundantes son las

alteraciones causadas por agentes biológicos. En algunos casos pueden

suponer riesgos para la salud de las personas, siendo las infecciones

microbianas el problema más grave de la alimentación humana, después del

hambre y la sobrealimentación. (Juliarena y Gratton, 2012).

Según la FAO (2011), cada año se estima que 1,3 millones de toneladas,

aproximadamente un tercio de los alimentos producidos para el consumo

humano en todo el mundo, se pierden. De esta cantidad una gran parte de la

pérdida es producida por acción de los microorganismos.

Actualmente una de las alternativas con más futuro en este campo es la

tecnología de recubrimientos comestibles ya que cumple con las exigencias de

los consumidores actuales: productos saludables, mínimamente procesados, sin

agregado de agentes químicos, y de producción sustentable. Una funcionalidad

importante de los recubrimientos y películas comestibles es su habilidad para

13

incorporar ingredientes activos, ya que pueden servir como soporte de aditivos

capaces de conservar y mejorar la calidad del producto. (Parzanese, 2012)

La necesidad del mercado productor de alimentos de que sus productos sean

comercializados evitando el deterioro o putrefacción de los mismos por acción de

diversos microorganismos tales como hongos y bacterias que aceleran el

proceso enzimático y por ende la maduración del alimento hasta su

descomposición, ha llevado a los investigadores a observar y evaluar las

aplicaciones que se les atribuyen a extractos de plantas entre los cuales se

destacan los extractos hidroalcohólicos que a diferentes concentraciones tienen

actividad anti fúngica y antibacteriana.

Un biopolímero como el quitosano puede ejercer un efecto sinérgico a la

actividad antimicrobiana del extracto hidroalcohólico, dando como resultado una

acción inhibitoria más efectiva contra muchos microorganismos de interés

sanitario, lo cual permitiría evitar la pérdida de alimentos producidos, mayor vida

útil de estos y mayores ganancias para los productores y para el país.

14

FORMULACIÓN DEL PROBLEMA

¿Tendrán las soluciones formadoras de recubrimiento comestible a base de

quitosano y extracto hidroalcohólico de Jengibre (Zingiber officinale) un efecto

inhibitorio frente a ciertos microorganismos de interés sanitario?

15

OBJETIVOS

Objetivo General

1. Evaluar la actividad antimicrobiana de soluciones formadoras de

recubrimiento comestible a base de quitosano y extracto hidroalcohólico

de Jengibre (Zingiber officinale) frente a ciertos microorganismos de

interés sanitario.

Objetivos Específicos

1. Seleccionar el método de obtención del extracto hidroalcohólico.

2. Determinar la cantidad de compuestos fenólicos presentes en

todos los métodos de extracción empleados.

3. Analizar la actividad antimicrobiana de las soluciones formadoras

de recubrimientos comestibles elaboradas con quitosano y

Jengibre (Zingiber officinale) frente a microorganismos

seleccionados.

16

HIPÓTESIS

El recubrimiento comestible a base de quitosano y extracto hidroalcohólico de

Jengibre (Zingiber officinale) presenta actividad antimicrobiana.

VARIABLES

Variable Independiente

Concentración de alcohol en la solución extractora

Método de obtención del extracto hidroalcohólico

Concentración de extracto hidroalcohólico en la disolución formadora de

recubrimiento comestible.

Concentración de quitosano en la disolución formadora de recubrimiento

comestible.

Variable Dependiente

Concentración de compuestos fenólicos

Diámetro del halo de inhibición.

17

VARIABLE CONCEPTUALIZACION INDICADOR - MEDICIONES

Dependiente

Diámetro del halo de inhibición

Es la zona alrededor de un disco de antibiótico en un antibiograma en el

que no se produce crecimiento bacteriano en una placa de agar

inoculada.

mm

Independiente

Concentración de alcohol en la solución

extractora

Porcentaje de alcohol en la solución extractora

O

(Grado alcohólico)

Concentración de extracto

hidroalcohólico en la disolución formadora

de recubrimiento comestible.

Proporción de extracto hidroalcohólico en la solución final

del recubrimiento comestible

%

Concentración de compuestos fenólicos

Cantidad de compuestos con capacidad antioxidante capaz de

ejercer acción antimicrobiana.

ppm

Concentración de quitosano en la

disolución formadora de recubrimiento

comestible.

Proporción de extracto solución de quitosano en la solución final del

recubrimiento comestible

%

18

CAPITULO I

MARCO TEÓRICO

1.1. Alimento

La FAO (s.f.), define al alimento como un producto natural o procesado,

conformado por nutrientes como proteínas, vitaminas, minerales, carbohidratos,

grasas y agua, que poseen características organolépticas (sabor, color, aroma y

textura), fundamental para la sobrevivencia del hombre.

Un alimento sano se caracteriza por aportar energía y nutrientes que el

organismo necesita. El alimento seguro o inocuo es aquel que está libre de

contaminación (bacterias, virus, parásitos, etc.) (FAO , 2014).

Un alimento contaminado se presenta por la aparición de material extraño

reduciendo la calidad para el consumo humano. Existen dos tipos de alimento

contaminado: contaminación biológica y contaminación química. La

contaminación biológica son los que presentan microorganismos como las

bacterias, los parásitos y los hongos. En la contaminación química existe la

presencia de sustancias extrañas (tierra, pelos, etc.) o tóxicos tales como

detergentes, insecticidas, plaguicidas (ELIKA, 2014).

Los alimentos alterados son aquellos que por numerosas causas ha

presentado un deterioro, (FAO , 2014) es decir muestran cambios que limitan su

utilización, variando sus características organolépticas y no son idóneos para el

consumo humano. (ELIKA, 2014). Los agentes principales que ocasionan

alteración al alimento, son: agente físicos, agentes biológicos y agentes

químicos. Los agentes físicos son los que conllevan a variaciones en la

estructura, tales como humedad, actividad del agua, la temperatura y el tiempo,

los agentes químicos crean compuestos debido a reacciones químicas o

enzimáticas, como: el oxígeno del aire y la luz, que provocan fenómenos de

oxidación, el pH y la acidez, sin embargo los agentes biológicos son propios de

19

la composición del alimento, como puede ser el caso de las enzimas propias del

producto y las procedentes de las bacterias, levaduras y mohos.

Los alimentos intervienen como vehículos de transmisión de agentes

patógenos y sustancias tóxicas, (Barón, Chávez, & Sauceda, 2013)

habitualmente se produce la contaminación de los alimentos durante la

manipulación, ya que se pueden introducir microorganismos perjudiciales para la

salud del consumidor.

La OMS (2015) estima que 2 millones de personas al año, en su mayoría

niños mueren por alimentos insalubres, los alimentos que contienen bacterias,

virus, parásitos o sustancias químicas nocivas causan más de 200

enfermedades, que van desde la diarrea hasta el cáncer.

1.2. Enfermedades transmitidas por alimentos

Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETAS) son aquellas

enfermedades de carácter infeccioso o toxico que se originan por la ingestión de

microorganismos patógenos (bacterias, parásitos o virus) o sustancias que

penetran al organismo, tomando como vehículo al alimento, afectando sobre

todo a grupos sociales de bajo recursos (Kopper, Calderón, Schneider,

Domínguez, & Gutiérrez, 2009).

Una diversidad de microorganismos conduce el deterioro de los alimentos

que es una de las preocupaciones más importantes de la industria alimentaria.

(Norajit, Laohakunjit, & Kerdchoechuen, 2007). Los microorganismos causantes

de ETAs comprenden coliformes fecales, Escherichia coli, Clostridium botulinum,

C. perfringens, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus tipo emético, Vibrio

cholerae, V. parahaemolyticus, Yersinia enterocolitica, Shigella sp., Salmonella

sp., Listeria monocytogenes, entre otras. De la misma forma existen

enfermedades producidas por parásitos como la amibiasis, giardiasis, triquinosis,

cisticercosis, y con menor frecuencia enfermedades virales como la hepatitis y

20

otras que pueden ser causadas por rotavirus, asimismo las intoxicaciones

causadas por toxinas de origen fúngico (aflatoxinas). (Kopper, Calderón,

Schneider, Domínguez, & Gutiérrez, 2009).

1.3. Microorganismos de interés sanitario

1.3.1. Escherichia coli

Escherichia coli (E. coli) es un bacilo Gram negativo, anaerobio facultativo de

la familia Enterobacteriaceae, microorganismo indicador de la contaminación

fecal, se encuentra ampliamente distribuida en el intestino de los seres humanos

y animales de sangre caliente, predominante en el intestino y parte de la

microbiota intestinal esencial que mantiene la fisiología del huésped sano (Feng,

Weagant, Grant, & Burkhardt, 2002), pero existen cepas que pueden ser

patógenas como la E. coli enterotoxigénica (ETEC), enteroinvasiva (EIEC) y

enteropatógena (EPEC). enteroagregativa (EAEC) y de adherencia difusa

(DAEC), produciendo diferentes cuadros clínicos, entre ellos diarrea. (Rodríguez-

Angeles, 2002). [TABLA I]

Tabla I. Cepas de E. coli causantes de diarrea

Grupos Síntomas Epidemiologia

ETEC Diarrea aguda acuosa Niños menores de dos

años y diarrea del viajero

EHEC Síndrome Urémico

Hemolítico (SUH), Colitis

Hemorrágica (CH), diarrea

sin sangre, dolor

abdominal, fiebre, vómito

Niños y adultos que la

adquieren por comer carne

cruda o mal cocida

EIEC Diarrea con moco y sangre

o diarrea acuosa, también

se presenta cuadro

disentérico

Niños menores de seis

meses

21

EPEC Diarrea aguda, dolor

abdominal, vómito, fiebre

baja

Niños menores de seis

meses hasta dos años

EAEC Diarrea liquida, verde con

moco, sin sangre, diarrea

persistente hasta 20 días

Recién nacidos y niños

menores de dos años

DAEC Diarrea acuosa sin sangre Niños de 1 a 5 años

Fuente: (Rodríguez-Angeles, 2002)

El medio de contagio de la E. coli se debe al consumo de alimentos

contaminados, como carne molida cruda o mal cocida, leche cruda y productos

frescos, originada por la contaminación fecal de los alimentos y del agua,

también a través de la contaminación cruzada o por contacto humano directo

durante la preparación de los alimentos. La E. coli patógena transmitida por los

alimentos contradictoriamente ha aparecido en sociedades con un mejor

progreso sanitario e higiénico (FAO, 2004).

1.3.2. Salmonella

Es la principal bacteria relacionada con las infecciones transmitidas por

alimentos en los países industrializados. La Salmonella es un bacilo Gram

negativo, anaerobio facultativo perteneciente a la familia Enterobacteriaceae,

dividida en dos especies: Salmonella entérica responsables de infecciones en el

hombre y animales de sangre caliente; y Salmonella bongori de la cual se

encuentran más de 20 serotipos que producen casos espontáneos de enteritis

en humanos probablemente al ingresar en contacto con reptiles y aves

migratorias. (Rivera Calderón, et al., 2012). [Tabla II]

Tabla II. Especies y Subespecies de Salmonella

Especie Subespecie

Salmonella entérica I enterica II salamae

22

IIIa arizonae IIIb diarizonae IV houtenae

VI indica Salmonella bongori

Fuente: (Rivera Calderón, et al., 2012)

La bacteria Salmonella puede causar una infección gastrointestinal conocida

como salmonelosis, no forma parte de la microbiota del humano y se transmite

de manera menos frecuente de una fuente animal, excepto la S. typhi; su medio

de contagio es de persona a persona, debido a la manipulación de los alimentos

afectando el sistema digestivo y produciendo diarrea aguda, (Murray et al. 2006;

Rivera-Calderón, et al., 2012) es de importancia en la salud pública debido a

que no siempre se cuenta con las condiciones de saneamiento e higiene

adecuados (Gutiérrez-Cogco, Montiel-Vázquez, Aguilera-Pérez, & González-

Andrade, 2000).

1.3.3. Staphyloccocus aureus

Staphyloccocus aureus (S. Aureus) son cocos Gram positivos, catalasa y

coagulasa positivos, inmóviles, facultativamente anaerobios, no formadores de

esporas, presentes en la piel y mucosas (Chams, 2013).

S. Aureus puede causar una intoxicación alimentaria grave, siendo

reconocido como el agente causal en muchos brotes y es probablemente

responsable de más casos, incluso en individuos y grupos familiares que los

mostrados en los registros (Bennett & Lancette, 2001).

Los S. aureus son vulnerables a la destrucción por tratamiento térmico y otros

agentes, casi todos desinfectantes. Consecuentemente, la presencia de esta

bacteria o sus enterotoxinas en los alimentos procesados o en equipos de

procesamiento de alimentos es en general una indicación de la falta de

saneamiento o una inadecuada manipulación (Bennett & Lancette, 2001).

23

1.3.4. Listeria monocytogenes

Se trata de una bacteria Gram positiva, patógeno oportunista, causante de

varios brotes de enfermedades transmitidas por alimentos, está ampliamente

dispersa en el medio ambiente y alimentos, el patógeno puede crecer en un

número significativo a temperaturas de refrigeración cuando se le da el tiempo

suficiente (Nuvolosi, Pedonese, D'Ascenzi, & Rindi, 2006).

La listeriosis transmitida por los alimentos es una enfermedad grave, con

altas tasas de mortalidad (20-30%) en comparación con otros patógenos

microbianos transmitidos por los alimentos, como Salmonella (Nuvolosi,

Pedonese, D'Ascenzi, & Rindi, 2006). Con mayor frecuencia afecta a mujeres

embarazadas, fetos y personas inmunodeprimidas, provocando abortos, muertes

neonatal, septicemia y meningitis (OMS, 2014).

1.4. Recubrimientos comestibles

El recubrimiento comestible es una capa delgada formada por biopolímeros,

(lípidos, proteínas o polisacáridos), que se emplea sobre la superficie del

alimento constituyendo una barrera semipermeable a los gases y al vapor de

agua (Restrepo & Aristizábal, 2010) retrasando el crecimiento microbiológico y

los cambios de color, mejorando asimismo la textura y calidad de la fruta

(Cruañes & Locaso, 2011) con el propósito de extender su vida útil.

Los recubrimientos comestibles tienen la capacidad para incorporar agentes

antimicrobianos y ofrecer estabilidad microbiológica a los alimentos,

disminuyendo el riesgo de crecimiento de patógenos (Marsh & Bugusu, 2007).

Los recubrimientos comestibles deben presentar características como:

transparencia, estabilidad para distintas formas de almacenamiento,

homogeneidad, y estar exentos de sabores y olores extraños, asimismo como de

24

cualquier sustancia nociva (Campos, 2014). Dependiendo del tipo de compuesto

a incorporarse se dividen en tres grupos:

1.4.1. Hidrocoloides: Presentan una buena barrera mecánica contra gases con

excepción el vapor de agua, esto se debe a la naturaleza hidrófila, dentro

de ellos se encuentran los polisacáridos (Kester y Fennema, 1986;

Gennadios y Weller, 1990; Campos 2014).

1.4.2. Lípidos: Tienen la ventaja de ser una barrera contra la humedad

reduciendo la deshidratación y transpiración, pues están constituidos por

compuestos hidrofóbicos y no poliméricos; pero presentan dificultad para

formar películas (Figueroa, Salcedo, Aguas, Olivero, & Narváez, 2011).

1.4.3. Compuestos: Formados a partir de combinaciones de hidrocoloides y

lípidos, para aprovechar los beneficios de ambos tipos y reducir sus

inconvenientes (Greener y Fennema, 1994; Campos 2014).

1.5. Quitosano

El quitosano es un polímero natural, su fórmula química es poli[β-(1-4)-2-

amino-2-desoxi-D-gucopiranosa] (Pastor de Abram & Higuera, 2004)(ver Figura

1), se obtiene por la desacetilación alcalina de la quitina (Ying-chien, et al.,

2004). Estructuralmente se logran diferenciar dos tipos de quitosano (Q)

principalmente α-Q presente en la cutícula de los crustáceos y las paredes

celulares de ciertos hongos; y β-Q obtenida en la pluma cartilaginosa interna del

exoesqueleto de calamares (Valenzuela & Arias, 2012).

25

Figura I. Estructura química del quitosano Fuente: (Goy, Britto, & Assis, 2009)

El quitosano es una base débil e insoluble en agua, pero soluble en

soluciones ácidas acuosas diluidas por debajo de su pKa (~ 6,3), se diferencia

de otros polisacáridos por ser transparentes y formar cubiertas. (Goy, Britto, &

Assis, 2009). El quitosano es biodegradable in vivo debido a la capacidad de

recibir el efecto de la hidrólisis enzimática de los enlaces β (1→4) intervenida por

la enzima lisozima, presente en el organismo humano (Sashiwa et al., 1990;

Shigemasa et al., 1994; Valenzuela & Arias, 2012).

El quitosano es considerado un material biofuncional, posee propiedades

tales como la actividad antimicrobiana, presentando una baja toxicidad DL50= 16

ml/kg se encuentra ubicado en un nivel equivalente al azúcar y menos tóxico que

la sal (Romanazzi, et al, 2002; Valenzuela & Arias, 2012); teniendo afinidad

notable a las proteínas (Ramos-García, et al., 2010), por lo que podría ser una

opción factible para elaborar recubrimientos comestibles y así sustituir

parcialmente los métodos de control de microorganismos (González–Aguilar,

Monroy–García, Goycoolea–Valencia, Díaz–Cinco, & Ayala–Zavala., 2005),

prolongando la vida útil y preservando la calidad de los alimentos frescos.

Goy, Brito & Assis, (2009) destacan las propiedades del quitosano como son

su inocuidad, biodegradabilidad, actividad antimicrobiana, propiedades

emulgentes y acción antipardeante.

26

Los recubrimientos de quitosano presentan un amplio espectro contra

microorganismos patógenos asociados con enfermedades alimentarias que

frecuentemente contaminan alimentos como bacterias del tipo Escherichia coli,

Salmonella, Pseudomonas spp, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus,

entre la primordiales (Mead, 1999; Huang et al., 2012; Valenzuela & Arias,

2012).

1.6. Aceite esencial

Los aceites esenciales también llamados aceites volátiles, son líquidos

oleosos aromáticos obtenidos a partir de material vegetal (Bautista-Baños,

Hernández-Lauzardo, Valle, Bosquez-Molina, & Sánchez, 2005), los que suelen

presentar un aroma agradable, son ampliamente empleados en la industria

alimentaria como saborizantes y condimentos, y en la industrias farmacéutica y

cosmetológica como perfumes y esencias (Ramírez et al., 2009; Ochoa,

Paredes, Bejarano & Silva, 2012), además presentan actividad antimicrobiana y

pueden ser utilizados para controlar el deterioro de los alimentos y el crecimiento

de las bacterias patógenas (Wen-Xian, Avena-Bustillos, Sui Sheng T., &

McHugh, 2011).

Los aceites esenciales son líquidos a temperatura ambiente, insolubles en

agua, solubles en disolventes orgánicos apolares (hexano, éter, etc.), y en

alcoholes de alta graduación. Habitualmente son menos densos que el agua con

excepciones como la esencias de clavo de olor y canela (Kuklinski, 2003).

1.6.1. Composición química

La clasificación de los compuestos de los aceites esenciales son: (Kuklinski,

2003)

Terpenoides: Provienen de la condensación del isopreno

(C5), pueden o no tener oxígeno.

27

o Monoterpenos y sesquiterpenos son hidrocarburos

carentes de oxígeno, son aromáticos o alifáticos.

o Terpenos presentan oxigeno con función alcohol,

fenol, aldehídos, cetonas, éter, ester o peróxido.

No terpenoides:

o Sustancias volátiles alifáticas

o Sustancias volátiles aromáticas

o Sustancias nitrogenadas

o Sustancias con azufre

La actividad antimicrobiana de los aceites esenciales se deben a los

compuestos terpenoides y fenólicos (Wen-Xian, Avena-Bustillos, Sui Sheng T., &

McHugh, 2011) asimismo se le atribuye actividad antifúngica, antiparasitaria, e

incluso insecticida (Arce- Alfonso, 2011).

1.7. Fenoles

Los fenoles o compuestos fenólicos son metabolitos secundarios

ampliamente distribuidos en el reino vegetal, se encuentra unido a estructuras

aromáticas o alifáticas. Estos compuestos participan de diversas funciones, tales

como la asimilación de nutrientes, la síntesis proteica, la actividad enzimática, la

fotosíntesis, la formación de componentes estructurales, la alelopatía y la

defensa ante los factores adversos del ambiente (OFFARM, 2004).

Los compuestos fenólicos desnaturalizan las proteínas de las células

dañando las membranas celulares, dependiendo de la concentración ejecutan

actividad bactericida o bacteriostática, son altamente fungicidas y su actividad se

reduce a pH alcalino (Gonzalez-Carvajal, 2011).

28

1.8. Jengibre

El jengibre (Zingiber officinale) es una planta de la familia zingiberáceas, la

parte aprovechada es el rizoma, conteniendo compuestos volátiles que concede

el olor típico, y no volátiles que aportan propiedades farmacológicas. (Batista

Carmona, Pino Alea, Rodríguez León, Rodríguez Alfonso, & Padrón Palomar,

2003).

1.8.1. Clasificación taxonómica

Reino: Plantae

Orden: Escitamíneas

Familia: Zingiberaceae

Género: Zingiber

Especie: Officinale

1.8.2. Composición química del jengibre

El jengibre presenta oleorresina, que contiene aceite esencial y resina. El

aceite esencial está compuesto por sesquiterpenos en los que destacan α-

zingibereno, arcurcumeno, β-bisaboleno otorgando el aroma. La resina contiene

[6]-gingerol, [6]- shogaol, [Figura II], zingerona, proporcionando el sabor picante

(Acuña & Torres, 2014), y tienen una actividad antioxidante (Chen, Kuo Wu, y

Ho, 1986; Herrmann, 1994, Çoban, 2013). [Tabla III]

29

Figura II. Estructura química de gingerol y shogaol

Fuente: (Cañigueral, 2003)

Tabla III. Composición química del jengibre Componentes Propiedades Referencias

Ole

orr

esin

as

4-7

.5%

Aceite esencial 1.5-3%

Sesquiterpenos

α-zingibereno,

arcurcumeno,

β-bisaboleno

Proporcionan el aroma

(Acuña & Torres, 2014)

(Gómez-Rodríguez,

Cortés Suárez, & Izquierdo-Sánchez,

2013)

Resina

Gingeroles y los sogaoles

6 gingerol

6shogalol

Zingerona

Otorgan la pungencia Actividad

antioxidante

(Acuña & Torres, 2014) (Cañigueral,

2003)

Vitaminas Tiamina, Riboflavina, Niacina, Priridoxina, Vitamina A,

Vitamina C y Vitamina E

(Al-Nahain, Jahan, &

Rahmatullah, 2014)

Otros componentes

almidón, diterpenos,

ácido 6-gingesulfónico

monoacil digalactosil gliceroles.

diarilheptanoides: difenilheptenonas, difenilheptanonoles, difenilheptanodioles y sus acetatos.

(Cañigueral, 2003)

Fuente: Elaboración propia

30

GLOSARIO DE TÉRMINOS

Alelopatía: Es la influencia directa de un compuesto químico liberado por una

planta sobre el desarrollo y crecimiento de otra planta.

Anaerobio facultativo: Bacteria que puede crecer tanto en presencia de

oxigeno como en ausencia.

Antipardeamiento: Inhibición del ennegrecimiento en la superficie de los

alimentos.

Bactericida: Sustancia que causa muerte a la bacteria.

Bacteriostático: Sustancia que inhibe el crecimiento bacteriano.

Biodegradable: Producto o sustancias que puede descomponerse de manera

natural como sol, agua, bacterias, plantas, animales, preservando el medio

ambiente.

Biopolímeros: Macromoléculas presente en los seres vivos.

Desacetilación: Pérdida del radical acetil de la cadena madre.

31

Descomposición: Alteración de la composición inicial de la materia orgánica por

diversos factores.

DL50: Dosis letal 50 es la cantidad de un material determinado completo de una

sola vez, que provoca la muerte del 50% (una mitad) de un grupo de animales de

prueba. El DL50 es una forma de medir el envenenamiento potencial a corto

plazo (toxicidad aguda) de un material.

Enterotoxina: Toxina producida por algunas bacterias.

Estructura alifático: Estructura molecular orgánica de cadena abierta.

Estructura aromática: Derivado del benceno, cíclico insaturado.

Exoesqueleto: Piel dura que protege y cubre el cuerpo de los invertebrados.

Hidrófobo: Molécula que ejerce repulsión ante el agua.

Hidrófilo: Molécula con afinidad al agua.

Hidrólisis enzimática: Rompimiento de moléculas de agua originado por la

acción de una enzima.

32

Infección: Causado por un agente patógeno, que invade y se multiplica dentro

del organismo.

Intoxicación alimentaria: Es un síndrome que resulta de la ingestión de

alimentos contaminados con micro-organismos, toxinas microbianas o

sustancias químicas.

Micotoxinas: son sustancias producidas por ciertos hongos pertenecientes

principalmente a los géneros Aspergillus, Fusarium y Penicillium. Son altamente

tóxicos, producen mutaciones (mutágenos), producen cáncer (cancerígenos),

malformaciones en los fetos (teratógenos) y disminuyen la inmunidad

(inmunosupresores). Debido a su gran variedad de efectos tóxicos, y sobre todo

a su extrema resistencia al calor (termorresistencia), la presencia de las

micotoxinas en los alimentos es considerada de alto riesgo para la salud humana

y de los animales.

pka: Constante de disociación ácida, es la fuerza que tienen las moléculas de

disociarse.

Polímero: Son macromoléculas orgánicas formadas por la unión de monómeros.

Polisacárido: Son moléculas, formados por la unión de muchas moléculas de

monosacáridos entre sí.

33

Propiedades emulgentes: Es una sustancia que ayuda en la mezcla de dos

sustancias poco miscibles o difíciles de mezclar, originando así una emulsión.

Septicemia: Es una infección sistémica, causa muertes en pacientes

inmunodeprimidos y con enfermedades críticas.

Sinergismo: Aquella interacción que da con resultado efectos combinados con

la administración de dos o más fármacos que resulta ser mayores que aquellos

que podrían haberse alcanzado con la administración de uno solo.

34

CAPÍTULO II

METODOLOGÍA

2.1. MÉTODOS CIENTÍFICOS EMPLEADOS EN LA INVESTIGACIÓN

MÉTODO CIENTÍFICO:

Análisis - Síntesis: El estudio de las bases científicas y técnicas de cada uno

de los materiales y los resultados de los experimentos propuestas en esta

investigación, permitirán escoger las mezclas con mejor actividad antimicrobiana

frente a los microorganismos objeto de este estudio.

Inducción - Deducción: La revisión de los referentes teóricos permitirá al

investigador escoger las concentraciones utilizadas en los experimentos

propuestos en esta investigación. Los datos obtenidos durante la investigación

permitirán deducir cuál o cuáles serán las mejores mezclas de disoluciones

formadoras de coberturas comestibles de quitosano y extractos hidroalcohólico

de jengibre y su aplicación en posteriores procesos productivos.

MÉTODOS EMPÍRICOS:

Observación: para comprobar la presencia visible de crecimiento microbiano

sobre los productos sometidos a la prueba de reto, la presencia de halo de

inhibición y los indicadores sensoriales de deterioro.

35

MÉTODOS ESTADÍSTICOS

A todos los resultados obtenidos se les aplicará la estadística descriptiva para

evaluar media y desviación estándar y cuando sea pertinente se utilizarán

técnicas de correlación, regresión y análisis de varianza (ANOVA).

36

2.2. METODOLOGÍA

Tema de investigación

Planteamiento del tema

Hipótesis

Desarrollo de la metodologia

Recolección y preparación de

muestras

Extracción por percolación,

maceración, soxleth en concentraciones

diferentes

Concentración en rotavapor

Prueba de identificación de

fenoles

Determinación antimicrobiana del

extracto hidroalcohólico

Preparación de Soluciones

formadoras de recubrimientos

comestibles

Demostración de actividad

antimicrobiana de soluciones

formadoras de recubrimientos

comestibles

Tabulación de datos

Revisión de informe final

Entrega de informe final

37

2.3. TIPO DE INVESTIGACIÓN

La investigación es de carácter Exploratoria, Correlacional

2.4. DISEÑO EXPERIMENTAL DE LA INVESTIGACIÓN

Diseños factoriales:

Para la selección del método de extracción se trabajó con un diseño factorial

32 en el cual se utilizaron como variables independientes la concentración de

disolvente, y el método de extracción. Estos aspectos se detallan en el numeral

2.7.

2.5. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS

Materiales

o Fundas estériles.

o Cuchillos estériles.

o Rallador estéril.

o Percoladores

o Aparato de extracción Soxhlet

o Vasos de precipitación

o Soporte universal

o Balones de 500 ml – 250 ml

o Probetas

o Pipetas volumétricas

o Papel filtro Whatman

o Pipetas automáticas

38

o Puntas de 100 ul, 500 ul

o Tubos de ensayo

o Matraz aforado de 100 ml

o Tubos Eppendorf de 50 ml

o Cubeta de cuarzo 10mm

o Cajas Petri desechables

o Asa calibrada

o Mechero Bunsen

o Algodón

o Probetas

Equipos

o Balanza analítica

o Rotaevaporador

o Espectrofotómetro UV-VIS

o Incubadora

o Vortex

Reactivos:

o Agua destilada

o Alcohol 98°

o Carbonato de Sodio [Solución 20%]

o Acido Gálico (QP)

o Reactivo Folin Ciocalteu

o Agua Tipo I

o Agar Muller Hinton

o SO4H2 [Solución al 1%]

o Cl2Ba 1%

39

PROCEDIMIENTOS

2.6. RECOLECCIÓN Y PREPARACIÓN DEL MATERIAL VEGETAL

Se empleó como materia prima el rizoma del jengibre, obtenido en un

supermercado de la ciudad de Guayaquil. Se ejecutaron los siguientes

procedimientos previos, con el propósito de acondicionar la materia prima para el

proceso de extracción.

Limpieza. Se eliminó la tierra adherida o cualquier material extraño, con

abundante agua potable y se utilizaron cuchillos de acero inoxidables con el

objetivo de apartar las escamas que cubren el rizoma.

Cortado. Se desmenuzó el jengibre de manera manual con un rallador, para

facilitar que la solución hidroalcohólica penetrara el tejido del jengibre y extraer

los metabolitos que en él se encuentran.

2.7. TÉCNICA DE EXTRACCIÓN POR PERCOLACIÓN,

MACERACION Y SOXHLET CON ETANOL A TRES

CONCENTRACIONES DIFERENTES (50%, 70%, 90%)

2.7.1. Extracción por Percolación

Se utilizó un percolador con capacidad de 500 ml, en la punta del cual se

colocó un pedazo de algodón, de manera que sirva de filtro, cubierto con un

40

papel de filtro de forma circular, En el interior del percolador se colocaron

aproximadamente 250 g de jengibre los que fueron cubiertos con la

correspondiente solución hidroalcohólica hasta llenar el percolador cuya punta

se tapó con un tapón plástico para evitar la salida del disolvente

Cada percolador fue identificado y se lo dejó en reposo por 24 horas,

después de lo cual se retiraba el tapón de plástico dejando gotear hasta que

saliera todo el disolvente. El disolvente fue reincorporado en el percolador y se

repitió esta operación cuatro veces.

2.7.2. Extracción por Maceración

Se colocaron 250 g del material vegetal en balones de 500 ml a los que se

cubrió con solución hidroalcohólica (50%, 70%, 90%) respectivamente y se selló

con tapón plástico para evitar la evaporación del alcohol, al cabo de cuatro días

se retiró el disolvente con los metabolitos extraídos, para continuar con el

proceso de rotaevaporación.

2.7.3. Extracción Soxhlet

Tres muestras vegetales (20 g), puestas en dedales de papel, fueron

sometidos a extracción por soxhlet durante 2 horas, empleando concentraciones

diferentes de alcohol (50%, 70%, 90%) respectivamente.

41

2.7.4. Concentración en Rotaevaporador

Este aparato proporciona las condiciones adecuadas para eliminar el

disolvente en el proceso de concentración. Se colocaron en el balón del

rotaevaporador los diferentes extractos obtenidos y se procedió a concentrarlos

a la temperatura de 45°C ± 1ºC en baño termostático, empleando presión

reducida de 100 mBar.

2.8. Pruebas de Identificación de Fenoles Totales por método de Folin

Ciocalteu

Se ejecutó la prueba de fenoles totales a los 9 extractos obtenidos, para ellos

se realizó una dilución 1:10 de los extractos alcohólicos para tener una

concentración cuantificable, la dilución se la realizó con agua Tipo I, debido a

que el etanol presentaba interferencia con los reactivos del método de Folin

Ciocalteu creando un precipitado abundante de color blanco que no posibilitaba

la lectura de las muestras a espectrofotómetro.

Se utilizaron 100 μl de cada muestra y de la solución patrón respectivamente,

y se agregan a cada tubo 200 μl de reactivo de Folin Ciocalteu, se agitó y se

dejó reposar por 5 min, adicionando 1000 μl de solución de carbonato de sodio

al 20%. Después de 90 minutos se leyó la absorbancia de cada solución a una

longitud de onda 760 nm y se comparó contra una curva de calibración.

42

Preparación de la curva de calibración.

De una disolución de 1010 ppm de estándar de ácido gálico, se tomaron

alícuotas de 100, 200, 400 y 800 uL llevándolo a volumen final de 10 ml,

obteniendo así concentraciones teóricas de 10,1; 20,2; 40,4 y 80,8 ppm.

2.9. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA

Para la determinación antimicrobiana se usaron las bacterias Salmonella

typhimurium ATCC 14028, Escherichia coli ATCC 25922, Estafilococo aureus

ATCC 15923, y Listeria monocytogenes ATCC 19118.

2.9.1. Técnica de difusión de disco en agar

Para la evaluación de la actividad antimicrobiana de los distintos extractos

obtenidos, se empleó la técnica de difusión en agar, se inocularon los

microorganismos en tubos con medio agar Mueller Hinton previamente fundido y

mantenido a 45 oC, ajustando las concentraciones a la turbidez 0,5 en la escala

Mc Farland (1.5x106 UFC/m), y se vertió el contenido del tubo en una placa Petri

con Agar Müeller-Hinton.

Posteriormente, los medios de cultivos inoculados se incubaron a 37°C

durante 24 horas, y transcurrido este tiempo se realizaron las lecturas de los

halos de inhibición. Todos los ensayos se realizaron por duplicado.

43

2.10. PREPARACIÓN DE LA SOLUCION FORMADORA DE

RECUBRIMIENTOS COMESTIBLES.

Se preparó la solución de quitosano al 5% (p/v) con agua, homogenizando

por 30 min a 1000 rpm en un homogeneizador. Posteriormente, se adicionó

glicerol (0,75 % v/v) y se homogenizó por 10 min. Con un potenciómetro

calibrado se ajustó a pH 5 con NaOH 0.1N.

Una vez obtenida la solución de quitosano se le incorporó extracto

hidroalcohólico de jengibre para obtener concentraciones del 10%, 15% y 25%

Todos los ensayos se realizaron por duplicado.

44

CAPÍTULO III

RECOLECCIÓN DE DATOS.

La obtención de datos se basó en:

Pruebas de Identificación de Fenoles Totales por método de Folin-

Ciocalteu, utilizada para medir capacidad la antioxidante y en relación a

ella la capacidad antimicrobiana, con el fin de tomar el extracto con

mayor cantidad de recuperación de fenoles.

Análisis Estadísticos a todos los resultados obtenidos para evaluar

media, desviación estándar y análisis de varianza (ANOVA), para

determinar el mejor método de extracción para continuar con el proceso

de determinación de la inhibición microbiana.

Demostración de la actividad antimicrobiana por medio de la técnica de

difusión de disco en agar con cepas ATCC sembrando masivamente en

agar Mueller Hinton para cada microorganismo, logrando así obtener un

dato de la existencia o no de inhibición otorgada por el recubrimiento

comestible frente a las diferentes cepas ATCC utilizadas.

45

ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

Compuestos fenólicos

Tabla IV. Curva patrón de ácido gálico

Nivel de Calibración

Conc. de ácido gálico (ppm)

Absorbancia

(nm)

1 10,1 0,058

2 20,2 0,126

3 40,4 0,219

4 80,8 0,398

Gráfico I. Curva de calibración para fenoles totales


En el Gráfico I se observan las concentraciones de ácido gálico en la curva

estándar. Como puede apreciarse el coeficiente de determinación es muy

elevado, indicando que la ecuación obtenida explica más del 99% de los valores

observados.

y = 211,63x - 4,5034 R² = 0,9957

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45

Co

nce

ntr

ació

n (

pp

m)

Absorbancia (nm)

46

Tabla V. Promedios y desviaciones estándares de los métodos de extracción con sus concentraciones hidroalcohólicas.

Nota: Sox: Soxhlet, Mac: Maceración, Per: Percolación. Fuente: Elaboración

propia

Tabla VI Análisis de varianza para efecto de dos factores

Origen Suma de cuadrados

tipo III

gl Media cuadrática

F Sig.

MÉTODO 18308452,139 2 9154226,070 65,982 ,000 CONCENTRACIÓN 9364414,786 2 4682207,393 33,749 ,000 METODO * CONC 6443063,452 4 1610765,863 11,610 ,001

Error 1248641,888 9 138737,988

Total 61007922,417 18

Total corregida 35364572,265 17

Nota: R cuadrado = ,965 (R cuadrado corregida = ,933). Fuente: Elaboración propia

MÉTODO CONC Media Desviación típica N

Sox 90 4448,8350 1032,53854 2

70 2300,8200 ,00000 2

50 935,8150 284,32057 2

Total 2561,8233 1654,85055 6

Mac 90 1888,1400 14,96238 2

70 406,7450 164,60739 2

50 279,7700 194,53922 2

Total 858,2183 807,89895 6

Per 90 216,2850 134,68263 2

70 16,5050 14,96945 2

50 249,2950 134,68263 2

Total 160,6950 141,39649 6

Total 90 2184,4200 1962,76968 6

70 908,0233 1095,37707 6

50 488,2933 384,33807 6

Total 1193,5789 1442,31375 18

47

En la tabla VI se observa que el nivel de significación para los factores

(Método -Concentración hidroalcohólica) y de la interacción es menor a 0.05, es

decir, existen diferencias significativas de las concentraciones de compuestos

fenólicos dependiendo del tipo de método y del grado de concentración

alcohólica.

Tabla VII. Comparación de medias por test de Duncan para distintos métodos de extracción

MÉTODO N Subconjunto

1 2 3 Percolación 6 160,6950

Maceración 6 858,2183

Soxhlet 6 2561,8233

Sig. 1,000 1,000 1,000


En la tabla VII se muestran las comparaciones de los métodos de extracción

por el test de Duncan, la cual indica que el promedio del método de Soxhlet es

significativamente superior al observado frente a la maceración y percolación, sin

embargo, el método de extracción por maceración presenta un mayor

rendimiento de compuestos fenólicos en comparación con el método por

percolación.

Tabla VIII. Pruebas de comparación por test de Duncan para las distintas

concentraciones de extractos hidroalcohólicos

CONC N Subconjunto 1 2

50º 6 488,2933

70º 6 908,0233

90º 6 2184,4200

Sig. ,083 1,000


48

La prueba de comparación de medias por el test de Duncan para las

diferentes concentraciones de extracción, demuestra que las

concentraciones de 50 y 60º presentar menor contenido de compuestos

fenólicos, sin embargo las concentraciones al 90º muestran mejor

recuperación de compuestos.

Gráfico II. Compuestos fenólicos


El Gráfico II nos indica que el mejor método de extracción es Soxhlet, sin

embargo este no fue seleccionado debido a que la temperatura empleada puede

inducir transformaciones de alguno de los componentes extraídos (degradación

térmica y oxidativa) (Reyes et al, 2011); por lo cual se decidió utilizar el siguiente

mejor método que fue maceración al 90º.

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

Soxhlet Maceración Percolación

Co

nce

ntr

ació

n

de

co

mp

ue

sto

s fe

no

lico

s

Concentración hidroalcoholica

Métodos

90

70

50

49

ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS EXTRACTOS

Tabla IX Códigos de las concentraciones de extracto hidroalcohólico

Réplica Concentraciones (% p/v)

0,0 25% 15% 10%

1 J01 J11 J21 J31

2 J02 J12 J22 J32


Tabla X. Tamaño de halo de inhibición (mm) del extracto de jengibre

Extractos S. aureus E. coli S. typhimurium L. monocytogenes

J01 - 13 11 -

J02 - 12 9 -

J11 - 10 - -

J12 - 10 - -

J21 - 9 - -

J22 - 9 - -

J31 - 6 - -

J32 - 6 - -


Como se observa en la Tabla X mediante el diámetro de inhibición, el extracto

hidroalcohólico de jengibre presenta mayor efectividad frente a E. coli.

50

Tabla XI. Análisis de varianza para E. coli frente al extracto hidroalcohólico Maceración 90º

Origen Tipo III de suma de

cuadrados

gl Cuadrático promedio

F Sig.

Concentraciones 43,375 3 14,458 115,667 ,000

Error ,500 4 ,125

Total 747,000 8

Total corregido 43,875 7

Nota: R al cuadrado = ,989 (R al cuadrado ajustada = ,980. Fuente: Elaboración propia

La tabla XI muestra que el nivel de significación es menor a 0.05, es decir,

existe diferencia significativa de los halos de inhibición entre la E.coli y el

extracto hidroalcohólico de jengibre por maceración al 90º.

51

ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LAS SOLUCIONES FORMADORAS

DE RECUBRIMIENTO

Tabla XII Códigos de las concentraciones de extracto hidroalcohólico

Concentraciones (% p/v)

Extractos de Jengibre

Material Replica 0,0% 25% 15% 10%

Quitosano 5%

1 QJ01 QJ11 QJ21 QJ31

2 QJ02 QJ12 QJ22 QJ32


Tabla XIII. Tamaño del halo de inhibición (mm) de la solución formadora de recubrimiento.

Extracto+ Quitosano

S. aureus E.coli S. typhimurium L. monocytogenes

QJ01 13 11 14 13 QJ02 13 11 14 14 QJ11 7 6 8 13 QJ12 7 6 6 9 QJ21 7 8 9 12 QJ22 9 8 10 8 QJ31 10 10 12 14 QJ32 10 10 10 10


Tabla XIV. Análisis de varianza para E. coli

Origen Tipo III de

suma de

cuadrados

gl Cuadrático

promedio

F Sig.


Error ,500 4 ,125

Total 593,000 8


Nota: R al cuadrado = ,997 (R al cuadrado ajustada = ,994). Fuente: Elaboración propia.

52

La tabla XIV muestra que el nivel de significación es menor a 0.05, es decir,

existe diferencia significativa de los halos de inhibición de crecimiento de la E.coli

para las diferentes soluciones de recubrimiento.

Al realizar la prueba de Rangos Múltiples de Duncan se obtuvieron los

resultados mostrados en la Tabla XV.

Concentraciones N Subconjunto 1 2 3 4

25% 2 6,0000

15% 2 8,0000

10% 2 10,0000 0% 2 11,5000 Sig. 1,000 1,000 1,000 1,000


Como se puede apreciar el halo de inhibición del crecimiento es mayor a

medida que disminuye la concentración del extracto hidroalcohólico, indicando

que este ejerce una acción contraria al efecto inhibidor el quitosano.

Tabla XVI. Análisis de varianza para Listeria Monocytogenes

Origen Tipo III de suma de

cuadrados


F Sig.

Concentraciones 17,500 3 5,833 ,729 ,586

Error 32,000 4 8,000

Total 1154,000 8


Nota: R al cuadrado = ,354 (R al cuadrado ajustada = -,131). Fuente: Elaboración propia.

La tabla XVI muestra que el nivel de significación es mayor a 0.05, es decir,

no existe diferencia significativa de los halos de inhibición de crecimiento de la

Listeria monocytogenes para las diferentes soluciones de recubrimiento. Es decir

los valores observados no dependen de la adición o no del extracto

hidroalcohólico de jengibre.

53

Tabla XVII. Análisis de varianza para Salmonella typhimurium

Origen Tipo III de suma de cuadrados


F Sig.


Error 5,000 4 1,250

Total 890,000 8


Nota: R al cuadrado = ,899 (R al cuadrado ajustada = ,823). Fuente:

Elaboración propia

La tabla XVII muestra un efecto significativo de la solución formadora de

recubrimiento sobre el halo de inhibición del crecimiento de Salmonella

typhimurium.

Al realizar la prueba de rangos múltiples de Duncan se encontraron los

resultados que se muestran en la Tabla XVIII.

Concentraciones N Subconjunto

1 2 3

25% 2 7,0000

15% 2 9,5000 9,5000

10% 2 11,0000 11,0000 0% 2 13,5000 Sig. ,089 ,251 ,089


Estos resultados muestran que a medida que se incrementa la concentración

del extracto hidroalcohólico, disminuye el halo de inhibición del crecimiento.

Tabla XIX. Análisis de varianza para Staphylococcus aureus

Origen Tipo III de

suma de

cuadrados

gl Cuadrático

promedio

F Sig.


Error 2,500 4 ,625

Total 741,000 8

54


Nota: R al cuadrado = ,934 (R al cuadrado ajustada = ,884).Fuente: Elaboración propia

La tabla XIX muestra un efecto significativo de la concentración de la solución

formadora de recubrimiento sobre el halo de inhibición del crecimiento de S.

aureus.

Al realizar la prueba de rangos múltiples de Duncan se encontraron los

resultados que se muestran en la Tabla XX los que indican que a medida que se

incrementa la concentración del extracto hidroalcohólico, disminuye el halo de

inhibición del crecimiento.

Concentraciones N Subconjunto

1 2 3

25% 2 7,0000

15% 2 8,0000 8,0000

10% 2 10,0000 0% 2 12,5000 Sig. ,275 ,065 1,000


Los resultados encontrados para Salmonella typhimurium y Staphylococcus

aureus muestran que para estos microorganismos, la incorporación del extracto

hidroalcohólico, equivale a una dilución del quitosano, el cual es el único

responsable de la inhibición del crecimiento observada.

55

CONCLUSIONES

Se eligió el método de Maceración como método de extracción para

obtener el extracto hidroalcohólico a ser usado en la formulación final de

la solución formadora de recubrimiento.

Dentro de las cepas bacterianas estudiadas, el extracto hidroalcohólico

solo fue efectivo para inhibir el crecimiento de la cepa de Escherichia coli

ATCC 25922.

56

RECOMENDACIONES

Para futuros estudios, podrían emplearse otros tipos de solventes como

medio de extracción, para mejorar la recuperación de compuestos

fenólicos del jengibre.

En este estudio se realizaron pruebas con Staphylococcus aureus,

Listeria monocytogenes, E. coli y Salmonella typhimurium; se recomienda

para futuros estudios utilizar otros tipos de bacterias y hongos.

Se debería estudiar el uso de concentraciones diferentes a las utilizadas

en esta investigación, tanto de extracto hidroalcohólico de jengibre como

de quitosano para la formulación final de solución formadora de

recubrimiento comestible.

57

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65

ANEXOS

ANEXO 1

MÉTODOS DE EXTRACCIÓN

Figura III. EXTRACCIÓN POR SOXHLET

66

Figura IV. EXTRACCIÓN POR MACERACIÓN

Figura V. EXTRACCIÓN POR PERCOLACIÓN

67

ANEXO 2

CONCENTRACIÓN DEL EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO

Figura VI. ROTAEVAPORACIÓN

ANEXO 3

IDENTIFICACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS

Figura VII. REACTVO DE FOLIN- CIOCALTEU

68

Figura VIII. PRUEBA DE FOLIN-CIOCALTEU

Figura IX. LECTURA ESPECTROFOTOMETRICA A 760NM

69

ANEXO 4

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS EXTRACTOS

Figura X. E. Coli

70

Figura XI. Salmonella typhimurium

Figura XII. Staphylococcus aureus

71

Figura XIII. Listeria monocytogenes

ANEXO 5

PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN FORMADORA DE

RECUBRIMIENTO

Figura XIV. PREPARACIÓN DEL QUITOSANO

72

ANEXO 6

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LAS SOLUCIONES FORMADORAS

Figura XV. INOCULACIÓN DEL MICROORGANISMO

73

Figura XVI. INCORPORACIÓN DE SOLUCIONES FORMADORAS

ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA

Figura XVII. E. coli

74

Figura XVIII. S. typhimurium

Figura XIX. S. aureus

75

Figura XX. L. monocytogenes

76

ANEXO 7

Figura XXI. SEGUNDA ETAPA DE CONCURSO “GALARDONES NACIONALES 2015” PROMOVIDO POR LA SENECYT.

77

78

Figura XXII. TERCERA ETAPA DE CONCURSO FINALES DE “GALARDONES NACIONALES 2015” PROMOVIDO POR LA SENECYT.

79

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