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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
Maestría y Doctorado en Ciencias Bioquímicas
Procesamiento de información y toma de decisiones en el sistema de esporulación de Bacillus subtilis.
TESIS
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: Maestro en Ciencias
PRESENTA: Alejandro Granados Castro
TUTOR PRINCIPAL
Dr. Rosa María Gutiérrez Ríos. Instituto de Biotecnología, UNAM.
INTEGRANTES DEL COMITÉ TUTOR
Dr. Maximino Aldana. Centro de Ciencias Físicas, UNAM.
Dr. Guillermo Gosset Lagarda. Instituto de Biotecnología, UNAM.
MÉXICO, D. F. Marzo, 2013
UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
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PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL
Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México).
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Agradecimientos A mis padres por su apoyo incondicional y completo a lo largo de mi vida. A la Universidad Nacional Autónoma de México por proveerme de los conocimientos y recursos necesarios para realizar este trabajo de investigación. Al Dr. Enrique Merino por brindarme la oportunidad de unirme a su grupo de investigación y a la Dra. Rosa María Gutiérrez Ríos por fungir como mi tutora durante los 3 años que formé parte de este gran equipo de investigación en el Instituto de Biotecnología. Este fue mi primer acercamiento a la investigación científica, donde aprendí valiosas lecciones, en especial de la Dra. Rosa María que siempre me apoyó para desarrollar este y otros proyectos. Por otra parte, expreso mi agradecimiento al Dr. Walter Fontana del Departamento de Biología en Sistemas de la Universidad de Harvard, por invitarme a formar parte de su grupo de investigación durante una estancia durante mi último semestre del programa de maestría. Este proyecto fue posible gracias al trabajo en colaboración con el Dr. Fontana con quién tuve valiosas discusiones e intercambio de ideas. Al Dr. Martin Rosvall, Universidad Umeå, Suecia; por valiosas discusiones sobre procesamiento de información, toma de decisiones y evolución en redes. A mi comité tutor formado por el Dr. Maximino Aldana del Centro de Ciencias Físicas, UNAM, y el Dr. Guillermo Gosset, del Instituto de Biotecnología, UNAM; por sus valiosos comentarios y consejos a lo largo de estos dos años. A mis amigos y compañeros por su amistad y apoyo, por creer en este proyecto y en mí. A mi jurado de examen: Dr. Lorenzo Segovia, Dr. Guillermo Morett, Dr. Agustino Martínez, Dr. Julio Freyre y Dr. Osbaldo Resendis; por su tiempo y ayuda durante la revisión de esta tesis. Finalmente, al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por el soporte económico para la realización de mis estudios de Maestría en el posgrado en Ciencias Bioquímicas.
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Resumen
Una característica fundamental de los sistemas biológicos es su capacidad de procesar información y tomar decisiones en respuesta a un ambiente siempre cambiante. Este comportamiento es el resultado del procesamiento controlado de energía, materia e información para generar organización en diferentes escalas espaciales y temporales. A nivel celular, esta organización depende de complejos programas codificados en la arquitectura del sistema, i.e., los patrones de interacción entre los múltiples componentes moleculares; y de los parámetros cinéticos asociados a estas interacciones. Más aún, existe un componente estocástico inherente en las interacciones moleculares el cual se ha propuesto como una fuente considerable de variabilidad en la dinámica entre diferentes células de una población. Es decir, aún individuos con el mismo conjunto de interacciones y parámetros, i.e., mismo genotipo, presentan variabilidad en la respuesta al ambiente, es decir, en su fenotipo. Sin embargo, cómo se combinan la dinámica del sistema y la variabilidad en el contexto de procesamiento de información no ha sido completamente entendido. Más aún, tampoco se tiene claro cuál es el nivel de control que el sistema podría tener sobre la variabilidad en el fenotipo y las implicaciones que esto podría tener en la capacidad del sistema para adaptarse y evolucionar.
El módulo de la señalización en esporulación de Bacillus subtilis es un buen candidato para abordar estas preguntas por dos razones principales, es un excelente ejemplo de un sistema molecular de toma de decisiones y existe una cantidad importante de información experimental y modelos teóricos. En B. subtilis, la esporulación es el resultado final de un complejo programa de respuesta al estrés ambiental regulado por un sistema de señalización conocido como phosphorelay. Más aún, existe un componente estocástico en este proceso: aún bajo condiciones ambientales idénticas, sólo una proporción de la población se compromete a esporulación mientras que las demás células adoptan otros destinos celulares. En este proyecto se plantea la hipótesis de que la estructura y la dinámica del phosphorelay están relacionadas con sus capacidades para procesar información y controlar así la proporción de esporas en la población. Consecuentemente, el objetivo de este trabajo es entender la esporulación como un proceso de toma de decisión desde un punto de vista cuantitativo, considerando las escalas molecular y poblacional. Para esto se construyó un modelo estocástico del phosphorelay y se investigaron las propiedades que podrían controlar la proporción de esporas en la población, es decir la probabilidad de que una célula individual se comprometa a esporular o no, representando esto la decisión del sistema. Utilizando simulaciones estocásticas del modelo del phosphorelay, se analizaron los efectos de las interacciones moleculares en la dinámica de Spo0A, el factor transcripcional maestro de respuesta a estrés y de esporulación. Se investigaron los efectos de diferentes parámetros en la dinámica poblacional y en la proporción de esporas, definido aquí como la respuesta del sistema. Se encontró que el control por retroalimentación mediado por transcripción en KinA, una proteína cinasa que activa el sistema, representa un mecanismo adaptable con el potencial de regular la estrategia de la población. Basado en las simulaciones y en previas observaciones experimentales, se formula un modelo probabilístico de toma de decisiones controlado a nivel de la red de señalización y se discute su capacidad para adaptarse a nuevos ambientes y evolucionar. También se realiza una extensa discusión sobre cómo los resultados aquí presentados pueden ser extrapolados a otros sistemas de señalización, por ejemplo a la familia de Sistemas de Dos Componentes. En conclusión, con los resultados de este trabajo se propone que la señalización mediada por el phosphorelay en B. subtilis, representa un mecanismo para controlar estrategias de decisión, generar variabilidad controlada y fenotipos con potencial evolutivo.
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Abstract
A fundamental property of biological systems is their ability to process information and make decision
in response to an ever changing environment. This behavior results from the controlled processing of
matter, energy and information which generates organization in different temporal and spatial scales.
At the cellular level, this organization depends upon multiple programs encoded in the system’s
architecture, i.e., the interaction patterns among molecular components; and the kinetic parameters
associated to such interactions. Moreover, there exists an intrinsic stochastic component in molecular
interactions which has been proposed as a significant source of variability among cells in a population.
That is, even individuals with the same set of interactions and parameters, i.e., same genotype, will
present variability in their response to environment, that is, variability in its phenotype. However, how
system’s dynamics and stochastic fluctuations combine within the information processing context is not
completely understood. Moreover, it is not clear to what extent the system has control over phenotypic
variability and the implications that this might have in the capacity of the system for adapting and
evolving.
The signaling module for sporulation in Bacillus subtilis is a good candidate to address these questions
for two main reasons, it is an excellent example of a decision making molecular system and there exists
a substantial amount of experimental data and theoretical models. In B. subtilis, sporulation is the final
result of a complex program involved in response to environmental stress which is regulated by a
signaling system known as phosphorelay. Moreover, there exists a stochastic component in this process
which means that even under identical environmental conditions only a proportion of the population
commits to sporulation while other cells adopt different fates. In this project, we present the hypothesis
that the structure and dynamics of the phosphorelay are related to its capacities for information
processing and thus for controlling the proportion of spores in the population. Consequently, the aim of
this project was to understand sporulation in B. subtilis as a decision making process within a
quantitative framework, considering both molecular and population scales. In order to achieve this, we
constructed a stochastic model for the phosphorelay and we used it to investigate which properties
might affect the proportion of spores, i.e., the probability that a single cell commits to sporulation or
not, being this the decision of the system.
Using stochastic simulations from the phosphorelay model, we analyzed the effects of different
molecular interactions in the dynamic of Spo0A, the master transcription factor of stress response and
sporulation. We investigated the effects of kinetic parameters in the population scale dynamics and the
proportion of spores, defined here as the output of the system. We found that transcriptional feedback
control in KinA, the kinase protein that activates the phosphorelay, represents an adaptable mechanism
for controlling the population scale strategy. Based on these simulations and previous experimental
evidence, we formulate a probabilistic model in which decision making is controlled by the signaling
network. We discuss its capabilities for adapting to new environments and evolve. We also make an
extensive discussion on how the results presented in this work might be extrapolated to more signaling
systems, such as Two Component Systems family of signaling pathways. In conclusion, based on the
results presented in this project we propose that signaling dynamics controlled by the phosphorelay in
B. subtilis, represent a mechanisms for controlling decision-making strategies, generate controlled
variability and phenotypes with evolutionary potential.
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Introducción
1. Procesamiento de información en sistemas biológicos. 2. Regulación transcripcional en bacterias. 3. Redes de señalización y de regulación genética: propiedades y toma de decisiones. 4. Esporulación en Bacillus subtilis. 5. El módulo de esporulación y activación de Spo0A. 6. Desarrollo de la espora.
Métodos
1. Reconstrucción de la red 2. Modelo dinámico 3. El lenguaje Kappa 4. Reglas en Kappa 5. Las reglas del módulo de esporulación 6. Parámetros utilizados
Resultados y discusión
1. Esporulación: El phosphorelay y la proteína Spo0A. 2. Dinámica del phosphorelay: El Modelo wild type 3. Interfaces de comunicación: la proteína Spo0B. 4. La dinámica del phosphorelay podría amplificar fluctuaciones estocásticas 5. Dinámica poblacional: Los niveles de activación de Spo0A son heterogéneos 6. La distribución de activación de Spo0A, , como mecanismo de toma de decisiones 7. Esporular o no esporular: La probabilidad de esporular y bet-hedging 8. Caracterizando el fenotipo: Las propiedades de 9. Decodificación de información en promotores de genes regulados por Spo0A 10. Las funciones lógicas del promotor particionan 11. Regulación transcripcional por retroalimentación en kinA controla la dinámica de 12. Señalización como sistema de aprendizaje: plasticidad en el fenotipo y potencial evolutivo. 13. Probabilidad e Información
Conclusiones
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1. Procesamiento de información en sistemas biológicos
La habilidad de los sistemas vivos para interactuar con el ambiente y sobrevivir, depende de la
detección de señales ambientales y la organización de respuestas fisiológicas adecuadas. Estas señales del
ambiente no son sólo transmitidas sino también procesadas para decidir un curso de acción en el sistema.
Sin embargo, desarrollar modelos cuantitativos para estudiar el procesamiento de información no es algo
trivial, principalmente porque la definición misma de información tampoco lo es. Intuitivamente, sin
embargo, es claro que la “información” es ubicua en los sistemas vivos. Más aún, algunos sistemas han
evolucionado específicamente para procesar información, por ejemplo, las redes de señalización y
regulación genética, por lo cual es de esperarse que su estructura y dinámica estén relacionadas con sus
capacidades de procesamiento. Entonces, proponer un modelo para cuantificar y analizar la información
procesada en los sistemas moleculares es un paso importante para entender sus características
estructurales, dinámicas y evolutivas.
En las últimas décadas se han propuesto diferentes formas de cuantificar la información [Bergstrom,
2004]. Sin embargo, estas medidas se pensaron aplicadas a circuitos eléctricos y a la transmisión digital de
información. Shannon propuso en 1946 una medida para cuantificar la incertidumbre asociada a una
variable aleatoria, la entropía de Shannon [Shannon, 1946]. Esta medida resultó ser fundamental en el inicio
de la era digital de la información como hoy la conocemos. Su aplicación a la biología cada vez es más
evidente sobre todo en el área de la Bioinformática [Schneider, 2007]. La entropía de Shannon se relaciona
con la información potencial de una estructura, y no tiene que ver con el significado de la información, es
por eso que algunos autores argumentan que no se puede aplicar directamente a la información biológica.
Sin embargo cuantificar la información potencial que puede manejar un sistema podría ser un primer paso
hacia una teoría de la información biológica [Bergstrom, 2004].
La teoría de la información, como se menciona anteriormente, propone una medida para cuantificar
la información potencial. En un sistema de comunicación digital, la información se define como una
secuencia de símbolos que son interpretados como un mensaje. Este proceso es llevado a cabo por un
conjunto de subsistemas especializados. La señal, sensor, el receptor, el canal de comunicación, etc., están
definidos perfectamente. En contraste, en los sistemas vivos, estos subsistemas no siempre están
claramente definidos. Por ejemplo, una red de señalización podría interactuar en todo momento con los
sistemas de regulación genética de los cuales recibe retroalimentación. Más aún, haciendo una analogía con
las computadoras modernas, en los sistemas vivos la diferencia entre software y hardware es difusa. Es
decir, los programas que son ejecutados en respuesta al ambiente están codificados en la misma estructura
que se encarga de ejecutarlos: las redes de interacciones moleculares.
2. Regulación transcripcional en bacterias
La regulación de la expresión genética es probablemente el mecanismo que ha desarrollado más complejidad en los sistemas vivos. Los estímulos ambientales son procesados en sistemas de señalización que, a su vez, controlan la activación de moléculas reguladoras. En bacterias, se han caracterizado múltiples mecanismos de regulación, por ejemplo, sistemas dependientes de RNA, DNA y proteínas. Cada una de estas
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estrategias tiene sus propiedades estructurales y dinámicas, que le permiten a la bacteria disponer de un amplio rango de comportamientos y respuestas al ambiente.
Un mecanismo ampliamente distribuido en procariontes para regular la expresión genética es el acoplamiento de una proteína sensor y una proteína de unión a DNA. Generalmente, la señal externa es procesada por una proteína cinasa anclada a la membrada, la señal provoca un cambio estructural que induce una señal en el citoplasma, activado a una proteína de unión a DNA. Esta proteína de unión a DNA, posee un dominio de activación, en el cuál recibe la señal como una reacción de fosforilación. Este sistema sensor/respuesta se conoce como sistema de dos componentes y es el paradigma de regulación transcripcional en procariontes. Una vez activada la proteína reguladora, conocida como regulador de respuesta, su dominio de unión a DNA queda expuesto permitiéndole unirse a la región reguladora de los genes asociados a la respuesta respectiva.
Esta proteína de unión a DNA, conocida como Factor Transcripcional (FT) promueve la unión de la
polimerasa de RNA al promotor del gen, facilitando el inicio de la transcripción. Los mecanismos que usan
diferentes FT varían significativamente.
Figura 1 | Esquema del paradigma de señalización en bacteria: sistema de dos componentes. Al
recibir una señal se estimula la autofosforilación de una quinasa de histidina (HK). El grupo fosforilo es
subsecuentemente pasado a un regulador de respuesta afín, el cuál puede disparar cambios en la
expresión genética o en otros procesos fisiológicos [Laub, 2008].
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Figura 2 | Activación en promotores simples. La figura ilustra la organización de la RNA polimerasa y las subunidades
activadoras durante la activación en promotores sencillos. Muchos activadores funcionan como dímeros, como el mostrado en la figura. Las proteínas que interaccionan se muestran una junto a otra. a) Clase 1, El activador se une a la región río arriba y contacta la subunidad α-CTD de la polimerasa de RNA, de esta forma la recluta en el promotor. b) Clase II, El activador se une al blanco que está adyacente al sitio -35 y el activador interactúa con el factor sigma. c) Activación por cambio de conformación, El activador (en azul) se une en, o cerca de, los elementos del promotor y alinea los elementos -10 y -35 de manera que la polimerasa de RNA pueda unirse al promotor [Browning, 2004].
Los factores transcripcionales son proteínas que actúan sobre las regiones río arriba de los genes. Estas
proteínas reguladoras pueden tener efectos positivos y/o negativos en la actividad del promotor. Un
mismo factor transcripcional podría actuar negativa o positivamente en el mismo gen, dependiendo de
la posición en dónde se une al DNA. Muchos reguladores transcripcionales bloquean la unión de la
polimerasa de RNA para evitar la transcripción.
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Figura 3 | Mecanismos de represión. a) Represión por impedimento estérico. El sitio de unión al represor superpone a
elementos del promotor y bloquea el reconocimiento del mismo por la polimerasa de RNA. b) Represión por doblamiento de DNA. El represor se une a sitios distantes e interacciona doblando el DNA, reprimiendo al promotor. c) Represión por modulación de un activador. El represor se une a un activador y previene su funcionalidad [Browning, 2004].
3. Redes de señalización y de regulación genética: propiedades y toma de decisiones.
El procesamiento de información en la célula se lleva a cabo en complejos sistemas de interacciones
moleculares. Estos sistemas son encargados de censar estímulos, transmitir esa información y ejecutar
respuestas que permitan al sistema interactuar con el ambiente y sobrevivir. Estos sistemas de
interacciones moleculares se pueden representar a través de modelos de redes, es decir,
representando los componentes e interacciones del sistema como nodos y conexiones de un grafo,
respectivamente. Esta representación en redes permite analizar la estructura del sistema, es decir, los
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patrones entre las interacciones. Más aún, permite también analizar la dinámica del sistema al
implementar parámetros cinéticos y modelos matemáticos o computacionales.
Una red de señalización representa las interacciones entre proteínas que ocurren en respuesta a un
estímulo específico. Por otro lado, una red de regulación genética (RRG) representa interacciones
entre genes (a través de sus productos), donde unos afectan la expresión de otros. A grandes rasgos
podríamos decir que las redes de señalización son las encargadas de tomar decisiones integrando
información ambiental, información del estado interno de la célula e incluso de otras células. Por otro
lado las redes de regulación transcripcional ejecutan programas moleculares dinámicos en función de
los estímulos provenientes de las redes de señalización, regulando así la dinámica de la célula.
Si bien las redes de señalización y genéticas generalmente se estudian por separado, en la célula,
estos dos sistemas están altamente interconectados y operan como un todo. Una de las interfaces
fundamentales entre la señalización y la regulación genética, ocurre durante el control de la
trascripción. En sistema eucariontes, la regulación transcripcional ha evolucionado en sistemas
bastante complejos, por ejemplo el núcleo celular, la regulación dependiente de la estructura de la
cromatina, RNAs no codificantes de proteína, edición alternativa de transcritos etc. En bacteria, la
regulación transcripcional es mucho menos compleja y por lo tanto más fácil de estudiar. Más aún, la
interacción entre la red de señalización y la red de regulación genética es directa, ya que los factores
transcripcionales son activados en la primera y actúan sobre la segunda al unirse al promotor del gen
regulado.
Al analizar la dinámica de las redes de señalización, se han encontrado varias propiedades
interesantes, por ejemplo, arquitectura modular, bi-estabilidad [Markevich et al., 2004] y oscilaciones
[Bhalla,1999]. Este repertorio de propiedades dinámicas permite que el sistema genere respuestas
fisiológicas adecuadas, por ejemplo, un interruptor que funcione como prendido/apagado o un
oscilador que controle la amplitud del ciclo circadiano. Sin embargo, poco se ha hecho para estudiar la
dinámica de la señalización desde un punto de vista de toma de decisiones, probablemente porque no
es claro qué representa una decisión en el contexto celular. Por otro lado, también es complicado
determinar qué sistemas podrían clasificarse como tomadores de decisiones y cuáles no.
Un excelente modelo para implementar estas preguntas es la red de señalización de Bacillus subtilis,
una bacteria Gram-positiva de vida libre que se encuentra en el suelo. La Figura 4 muestra las
interacciones conocidas para la red de señalización de B. subtilis; con un código de colores se han
separado los módulos funcionales de la red. B. subtilis presenta un complejo comportamiento social
relacionado con su capacidad para adoptar diferentes tipos celulares en respuesta a las condiciones
ambientales [López, 2009]. Cuando B. subtilis se encuentra en condiciones de estrés comienza un
complejo programa molecular, donde una variedad de tácticas para sobrevivir son empleadas. La
última opción es la formación de una espora rígida que mantendrá el genoma a salvo hasta que las
condiciones del ambiente sean más favorables. Esta capacidad para elegir destino celular en función
del ambiente ha sido ampliamente estudiada experimentalmente. Sin embargo, poco se ha hecho para
estudiar al sistema de manera integral analizando este comportamiento utilizando el concepto de
decisión.
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Figura 4 | La red de señalización de esporulación-competencia en Bacillus subtilis. La red de esporulación se muestra a la
izquierda (azul), y la de competencia en la derecha (rojo). Cada módulo se compone de una unidad sensor y una unidad regulatoria. La unidad sensor de estrés KinA-E , la cascada de transferencias de fosfatos y Spo0A componen el módulo de esporulación. La unidad de quorum sensing ComP-ComA y el switch ComK componen el módulo de competencia. Los dos módulos principales interaccionan mediante el sistema de comunicación Rap (verde), el módulo AbrB-Rok (café), y el módulo SinR-SinI (morado). Las señales de entrada y salida están representadas mediante las líneas negras que cruzan la línea punteada. A la derecha, los promotores regulando la producción de feromonas usadas para transmitir señales hacia el ambiente [Schultz, 2009].
Sin embargo, en 2009, Schultz ya propone a la red de señalización de Bacillus subtilis como un ejemplo de una red de procesamiento de información (figura 4). Como se mencionó antes, cuando B. subtilis se encuentra en situaciones de estrés, puede tomar diferentes alternativas para sobrevivir. Dos alternativas importantes son la esporulación y la competencia. Una célula se vuelve competente mediante la activación de la proteína ComK. Sin embargo esta decisión es excluyente con la esporulación, de manera que los dos módulos deben estar interactuando en todo momento para decidir el destino celular. En la figura 4 se observa cómo esta interacción entre el módulo de esporulación (recuadro azul) y el módulo de competencia (recuadro rojo) se da mediante las proteínas fosfatasas Rap (recuadro verde) y mediante el represor AbrB (recuadro café).
4. Esporulación en Bacillus subtilis
Bacillus subtilis se encuentra frecuentemente enfrentando condiciones de escasos nutrientes y tiene varias estrategias disponibles para sobrevivir, incluyendo movimiento mediado por quimiotaxis, producción de enzymas de recuperación, incorporación de material genético del ambiente (competencia) y producción de antibióticos [Errington, 2003]. Estas estrategias siempre son utilizadas antes de comprometerse a esporular ya que la esporulación es un proceso energéticamente costoso que se vuelve irreversible después de que el regulador maestro Spo0A ha alcanzado altos niveles de activación. Esta decisión está altamente regulada y coordinada con otros procesos fisiológicos [Mitrophanov,2008].
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El inicio de la esporulación en Bacillus subtilis y en general en la mayoría de las especies Bacillus aeróbicas es controlado por un sistema de trasducción de señales basado en cascadas de transferencia de fosfato, a este sistema se le conoce como phosphorelay (figura 4, recuadro azul). El procesamiento de información que lleva a cabo esta red de señalización tiene como fin último la activación por fosforilación de Spo0A, factor transcripcional y regulador maestro de los genes involucrados en esporulación (figura 4). Un umbral de activación en Spo0A activa genes clave para el desarrollo de la espora, cuando este umbral se alcanza, la decisión de esporular es irreversible, a esto se le ha llamado compromiso.
5. El módulo de esporulación y activación de Spo0A
Al presentarse el estrés ambiental el conjunto de proteínas cinasas de histidina Kin(A-E) transfiere señales a través de la membrana hacia el citoplasma; estas proteínas son parte fundamental de una familia de sistemas de señalización conocida como “Sistema de dos Componentes”. Las proteínas “cinasas de histidina” realizan la transferencia de la señal utilizando una reacción de auto-fosforilación que cambia la proteína a su forma activa, de esta forma transfiere la información al citoplasma de que cierta señal particular se encuentra en el exterior. No se sabe aún exactamente cuáles son las señales que son reconocidas por KinA-E [López & Kolter, 2009]. Sin embargo, se ha demostrado que las cinasas KinA y KinB son las principales para inducir esporulación [Hoch, 2000].
Figura 5 | Representación esquemática de los distintos tipos celulares en las comunidad de Bacillus subtilis.
Cada tipo celular ha sido caricaturizado, considerando su atributo más representativo. Todos los tipos celulares
fueron clasificados en sub-grupos, acorde al regulador maestro que dispara la diferenciación. Las flechas indican
el proceso de diferenciación. El regulador maestro involucrado se presenta en azul. Cabe nota que las células
móviles no necesitan la activación de ningún regulador maestro. La sub-población expuesta a la acción de las
toxinas de canibalismo, mostradas como células muertas, también se muestran, aunque no pueden ser
consideradas como un tipo celular.
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La información ambiental sensada por las proteínas Kin y ahora codificada como un flujo de fostafatos, pasa rápidamente a la proteína Spo0F (0F), el segundo componente de la cascada [Piggot-Hilbert, 2004]. 0F pasa a su forma activa 0F~p y posteriormente transfiere el fosfato al tercer componente de la cascada Spo0B (0B) activándolo, 0B~p pasa el fosfato al regulador de la respuesta Spo0A (0A). La forma activa de este regulador transcripcional, 0A~p, regula varios cientos de genes. Aproximadamente el 10% del genoma de B. subtilis es regulado directa o indirectamente por este factor transcripcional [Errington, 2003]. Como se ha explicado antes, Spo0A coordina un complejo programa genético como respuesta al estrés ambiental, la última alternativa de esta respuesta es la esporulación.
Al dividir la vía de señalización en diferentes pasos de fosfotransferencia antes de llegar a 0A, el sistema tiene varios puntos potenciales para regular el flujo de fosfato, es decir, el flujo de la señal. Regulando el flujo de fosfatos se regula la dinámica de 0A~p y por lo tanto la expresión genética. El primer receptor de fosfatos, Spo0F, es también el primer punto de control importante. 0F es fosforilado por las 5 cinasas Kin y regulado negativamente (defosforilado) por la familia de fosfatasas Rap. Las proteínas Rap son reprimidas por señales de quorum sensing, específicamente por los péptidos phr, conocidos como feromonas rap. Estos péptidos son importados del ambiente y se unen directamente a su proteína Rap asociada, inhibiéndola [Perego, 1997]. Veening y colaboradores proponen que, dado que los péptidos phr contienen información acerca del tamaño de la población, probablemente B. subtilis realiza un proceso de ponderación entre el tamaño de la población y la cantidad de recursos [Bischofs, 2008]. Para el siguiente paso de la cascada, 0B, no se conoce ningún tipo de regulación negativa mediada por fosfotransferencia. Más aún, no se conoce ningún tipo de regulación transcripcional dependiente de Spo0A. Parece actuar sólo como canal de comunicación, regulando el flujo de fosfatos únicamente con su constante de reacción y su concentración. Es decir, la concentración de Spo0B actuaría como un moderador de flujo, una especie de ancho de banda. El siguiente paso, 0A, es el que presenta regulación más compleja. Como factor transcripcional se une directamente a 40 genes [Molle, 2003] ocasionando cambios (indirectamente) en la regulación de alrededor de 500 genes [Schultz, 2009], no es de sorprender la complejidad en la regulación de esta molécula. Cuando este regulador maestro pasa a su forma activa, 0A~p, comienza un complejo programa molecular codificado en la estructura de la red genética. Una de las principales funciones de este regulador es la represión de la expresión de abrB, un gene que codifica para un factor transcripcional que inhibe varios procesos de la fase estacionaria [Robertson, 1989]. Durante crecimiento exponencial AbrB reprime la expresión de sigH, kinA , spo0E y al mismo abrB [Veening, 2005]. Es decir, reprimiendo a abrB, Spo0A activa de forma indirecta a los genes del phosphorelay y otros involucrados en esporulación.
El factor Sigma-H, codificado por el gen sigH, actúa como regulador positivo de la esporulación, interactuando con la RNA polimerasa y dirigiendo la expresión de al menos 49 promotores controlando al menos 87 genes [Britton, 2002]. Esta regulación crea al menos 3 ciclos importantes de control por retroalimentación a nivel transcripcional. El primero es regulación positiva de kinA, el segundo corresponde a la regulación positiva de spo0F y el tercero a la regulación negativa de spo0E, que codifica para una fosfatasa que desactiva a A0~p. Esto ciclos actúan en una escala de tiempo limitada por los procesos involucrados en la expresión genética. Cabe mencionar que al inhibir a spo0E, se crea un ciclo de retroalimentación positivo sobre Spo0A.
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6. Desarrollo de la espora
La complejidad con la que se regula el inicio de la esporulación refleja, en parte, el hecho de que en su ambiente natural, B. subtilis se encuentra frecuentemente con escasos nutrientes. Esta bacteria tiene varias estrategias disponibles, incluyendo motilidad por quimiotaxis, producción de enzimas degradadoras, incorporación de DNA externo y la producción de antibióticos para suprimir la competencia por nutrientes. La esporulación parece ser la última respuesta usada para contender el estrés, probablemente porque es un proceso largo y costoso.
División asimétrica Después de tomar la decisión de esporular, el primer evento morfológico es la división celular asimétrica. Esta es una versión modificada del proceso de división celular usado normalmente. Durante la esporulación, la maquinaria de división es re-direccionada cerca de los polos y el septo es re-posicionado. Mutaciones en el gen spoIIE retrasan el posicionamiento del septo, ahora también se sabe que las concentraciones de FtsZ (encargada de reclutar proteínas en el futuro lugar del septo) deben crecer para el correcto posicionamiento del septo. Sin embargo, el mecanismo exacto por el cual estas proteínas afectan la formación y re-posicionamiento del septo no se entiende completamente.
Segregación cromosómica
El cambio en el posicionamiento del septo tiene una interesante consecuencia para la segregación cromosómica, ya que los cromosomas no están normalmente posicionados cerca de los polos para ser acomodados en el pequeño espacio de la pre-espora.
Figura 6 | El ciclo de esporulación de
Bacillus subtilis. Este simplificado esquema
muestra solamente los eventos clave.
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Transcripción célula-específica
Lo mecanismos antes descritos permiten a la célula que está esporulando, dividirse en dos compartimentos de diferentes tamaños- la pre-espora pequeña y la mucho más grande célula madre- y segregar de manera correcta un cromosoma en cada compartimento. La regulación transcripcional en la célula madre y en la espora varía significativamente. Factores sigma específicos de cada compartimento regulan la actividad del desarrollo después de que la decisión de esporular se ha hecho. La formación del septo asimétrico en un evento clave en el desarrollo. Dispara la cascada de cambios en la expresión genética, incluyendo diferentes programas de expresión genética en cada una de las dos células. Los dos factores SigmaF y SigmaE, son instrumentales en fijar los programas célula-específicos. Los dos son sintetizados antes de que el septo se forme, pero se mantienen inactivos hasta que el septo se forma. Por estas razones se decidió definir el compromiso de esporulación en función de la activación de los genes que codifican para estos factores sigma.
Después de la revisión literaria para la reconstrucción de la red molecular y después de considerar
los objetivos y alcances del presente trabajo junto con resultados de algunas simplificaciones matemáticas de la dinámica [Alon,2007], se decidió trabajar con el modelo molecular hasta ahora descrito como representación del módulo de esporulación.
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En base en los antecedentes planteados en la Introducción se plantea lo siguiente:
Hipótesis
La estructura y la dinámica del phosphorelay de Bacillus subtilis están relacionadas con sus capacidades para procesar información y controlar la proporción de esporas en la población.
Objetivos del Proyecto General Entender la dinámica del procesamiento de información en el sistema de esporulación en Bacillus
subtilis y proponer un modelo cuantitativo para explicar la esporulación como un proceso de toma de decisiones.
Específicos
—Revisión de la literatura con el fin de identificar cuáles componentes e interacciones de la red son necesarios para entender la dinámica de la esporulación, en específico del sistema phosphorelay.
—Basado en estas interacciones, crear un modelo dinámico que incluya el componente estocástico del sistema y permita realizar simulaciones a nivel poblacional. —Utilizar el modelo para explorar la dinámica molecular y poblacional. —Encontrar las propiedades del sistema que afectan la proporción de esporas en la población. —Integrar las escalas moleculares y poblacionales
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Métodos
1. Reconstrucción de la red
Se realizó una exhaustiva revisión de la literatura para establecer las interacciones relevantes en el proceso de esporulación. El módulo de señalización que regula la actividad de Spo0A interacciona con módulos para otros destinos celulares, como competencia. Para definir el módulo de esporulación que se usará en este trabajo, se revisó información experimental relacionada con la expresión en cepas mutantes. Aquellos componentes que demostraron no tener un impacto significativo en la dinámica de esporulación no fueron considerados en este trabajo. El modelo completo se describe en la Figura 8, incluye las interacciones relacionadas con el flujo de fosfatos (phosphorelay) y los ciclos de retroalimentación. Para las interacciones genéticas y los sitios de unión de Spo0A se utilizó información de la base de datos DBTBS (Sierro N. et al., 2008). En esta base de datos pública se encuentra información experimental para los sitios de unión de los factores transcripcionales de Bacillus subtilis. A partir de los datos encontrados en DBTS se generaron reglas para el modelo en Kappa. Para incluir la regulación transcripcional, se diseñaron agentes con sitios de unión que representan a los motivos encontrados en los promotores. Es importante remarcar que bajo la estructura de Kappa y de este modelo en particular, sólo se está tomando en cuenta el número de sitios de unión en un promotor (cada uno con diferente constante de afinidad) más no la posición. Como se explica en la sección de resultados, tomar en cuenta la estructura del promotor fue determinante para entender el procesamiento de información.
Se realizó también una revisión detallada de los mecanismos cinéticos de los componentes del sistema. Los parámetros utilizados en el modelo se muestran en la tabla 2, todos ellos fueron tomados de publicaciones científicas cuyas referencias también se presentan en la tabla. Los parámetros calculados por métodos propios se indican en la tabla. Al ser un modelo estudiado durante mucho tiempo, el phosphorelay cuenta con datos cuantitativos sustanciales, esto facilitó el trabajo de la construcción del modelo. Sin embargo, algunos parámetros provenientes de diferentes publicaciones son medidos en circunstancias no necesariamente equivalentes, esto podría introducir variaciones no deseadas en el modelo. Para evitar esto, se probaron diferentes parámetros publicados en diferentes trabajos y se eligieron aquellos bajo los cuales el modelo se ajustaba mejor a los datos experimentales publicados en Eswaramoorty (2010), siendo ésta la única publicación que tiene mediciones de mRNA y proteína para los diferentes componentes del phosphorelay.
2. Modelo dinámico
La complejidad de los sistemas biológicos representa un reto para la creación de modelos cuantitativos. La disponibilidad de parámetros cinéticos y la poca información que tenemos acerca del sistema son los dos principales obstáculos. Bacillus subtilis es un excelente modelo para la biología de sistemas por la disponibilidad de información experimental. El proceso de diferenciación en B. subtilis ha sido extensivamente estudiado, lo cual provee gran cantidad de datos. El modelo molecular que se decidió utilizar en este trabajo se muestra en la figura 8. Existen diferentes formas para pasar de este modelo conceptual a un modelo dinámico cuantitativo. Los sistemas de Ecuaciones Diferenciales Ordinarias (ODE) es la opción más utilizada (Schultz et al, 2009; Igoshin et al, 2008). Sin embargo, los sistemas de señalización celular presentan un alto grado de
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complejidad combinatoria, es decir, existen múltiples interacciones y los componentes existen en múltiples estados funcionales. Esto complica el uso de las ecuaciones diferenciales, ya que el tamaño del modelo aumenta exponencialmente con esta complejidad combinatoria. Más aún, algunas interacciones de causalidad están implícitas en las reglas bioquímicas y podríamos no tomarlas en cuenta al plantear una ecuación diferencial. Por último, la esporulación en Bacillus subtilis es un proceso con un importante componente estocástico. Bajo condiciones idénticas, los individuos de una población isogénica responden de manera diferente, de forma que sólo una proporción de población decide esporular. Por estas razones se adoptó otro enfoque para modelar el sistema. Para incorporar la información obtenida en la revisión literaria decidimos utilizar un modelo basado en reglas. En este tipo de enfoque las reacciones químicas se representan directamente en un lenguaje formal en el cuál se pueden incluir los mecanismos cinéticos claramente. Las reglas representan las posibles interacciones en el sistema y serán ejecutadas bajo restricciones termodinámicas, es decir, cada regla tiene asociada una constante de reacción.
3. El lenguaje Kappa
Los lenguajes basados en reglas, también conocidos como basados en agentes, tienen aplicaciones en una gran variedad de áreas de la ciencia. La idea central es la creación de objetos abstractos con interfaces que les permiten interactuar con otros objetos siguiendo reglas definidas. En el caso específico de las redes de señalización, los objetos representan a las proteínas y las interfaces son los sitios de unión por los cuáles interactúan. El lenguaje Kappa desarrollado por Walter Fontana y Vincent Danos, es una primera aproximación para abordar la complejidad combinatoria de los sistemas de señalización dentro un marco cuantitativo (Danos et al, 2007). Este lenguaje permite la creación de modelos dinámicos, utilizando el algoritmo estocástico molecular propuesto por Gillespie en 1977, para ejecutar las reglas.
4. Reglas en Kappa
Las interacciones entre componentes moleculares en los sistemas biológicos las conocemos por la información disponible en la literatura, desde luego, esto es sólo un modelo. Estas interacciones las podríamos representar con otros lenguajes, por ejemplo, con ecuaciones matemáticas. El problema de estructurar un lenguaje formal para representar los sistemas moleculares ha sido abordado desde diferentes puntos de vista. Kappa es una propuesta bastante prometedora.
En Kappa los componentes son representados como objetos computacionales que pueden interactuar entre sí. La forma en la cual se relacionan estos objetos, también conocidos como agentes, está definida para representar las interacciones entre proteínas, es decir, mediante formación de complejos y modificación de sitios.
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Para cada interacción del sistema de B. subtilis se construyeron reglas, tomando en cuenta información experimental y el mecanismo cinético subyacente. La Tabla 1 muestra las reacciones bioquímicas y sus respectivas reglas en Kappa. Es obvia la similitud entre los dos lenguajes, los dos nos dicen exactamente la misma información acerca del sistema. Es ésta una de las principales ventajas de Kappa: incorporar de forma eficiente el conocimiento en modelos ejecutables.
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5. Las reglas del modelo de esporulación
Reacción Literatura Kappa
KinA +KinA <-> KinA Dimerización de la Quinasa La proteína se dimeriza por la asociación del dominio horquilla-hélice (hairpin-helix). La dimerización ocurre en el dominio de Dimerización y Fosfotransferencia a Histidina (Dhp). (Eswaramoorthy, 2009)
KinA(Dhp),KinA(Dhp) -> KinA(Dhp!1),KinA(Dhp!1) KinA(Dhp!1,H405),KinA(Dhp!1,H405) -> KinA(Dhp,H405),KinA(Dhp,H405)
KinA <-> KinA~p Autofosforilación de KinA El primer paso en la transmisión de la señal es la autofosforilación, dónde el residuo de histidina en un protómero recibe el grupo fosforilo del ATP unido al otro protómero. (Varaguese, 2006)
KinA(Dhp!1,H405~u),KinA(Dhp!1) -> KinA(Dhp!1,H405~p),KinA(Dhp!1)
KinA~p + Spo0F -> (KinA~p)Spo0F
Unión de Spo0F a KinA Después de la fosforilación en el residuo de His, el dominio de ATP es desplazado, lo que permite la unión de Spo0F. (Varaguese, 2006)
KinA(Dhp!1,H405),KinA(Dhp!1),Spo0F(D54) -> KinA(Dhp!1,H405!2),KinA(Dhp!1),Spo0F(D54!2)
(Kina~p)Spo0F -> (KinA)Spo0F~p
Transferencia de fosfato KinA a Spo0F
KinA(Dhp!1,H405~p!2),KinA(Dhp!1),Spo0F(D54~u!2) ->
KinA(Dhp!1,H405~u!2),KinA(Dhp!1),Spo0F(D54~p!2)
Spo0B + Spo0B -> Spo0B
Dimerización de Spo0B Spo0B dimeriza en una forma muy similar a las quinasas. (Varaguese, 2002)
Spo0B(dim),Spo0B(dim) -> Spo0B(dim!1),Spo0B(dim!1) Spo0B(dim!1),Spo0B(dim!1) -> Spo0B(dim),Spo0B(dim)
Spo0B + Spo0F <-> Spo0B-Spo0F
Unión de Spo0F a Spo0B Spo0B(dim!1,H30),Spo0B(dim!1),Spo0F(D54) ->
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Tabla 1 | Reglas para el sistema de señalización del módulo de esporulación. Para cada reacción se muestra su representación como ecuación química, su referencia en la literatura y su representación en Kappa
Spo0B(dim!1,H30!2),Spo0B(dim!1),Spo0F(D54!2)
Spo0B(dim!1,H30!2),Spo0B(dim!1),Spo0F(D54!2) ->
Spo0B(dim!1,H30),Spo0B(dim!1),Spo0F(D54)
Spo0F~p + Spo0B <-> (Spo0F~p)Spo0B
Transferencia de fosfato Spo0F a Spo0B El grupo fosforilo es transferido de Spo0F~p (D54) a Spo0B (H30) en una reacción reversible. (Hoch, 1998)
Spo0B(dim!1,H30~u!2),Spo0B(dim!1),Spo0F(D54~p!2) ->
Spo0B(dim!1,H30~p!2),Spo0B(dim!1),Spo0F(D54~u!2)
Spo0B(dim!1,H30~p!2),Spo0B(dim!1),Spo0F(D54~u!2) ->
Spo0B(dim!1,H30~u!2),Spo0B(dim!1),Spo0F(D54~p!2)
Spo0B~p + Spo0A <-> ( Spo0B~p)Spo0A
Spo0B~p se une a Spo0A Spo0B(dim!1,H30),Spo0B(dim!1),Spo0A(RR) ->
Spo0B(dim!1,H30!2),Spo0B(dim!1),Spo0A(RR!2)
Spo0B(dim!1,H30!2),Spo0B(dim!1),Spo0A(RR!2) ->
Spo0B(dim!1,H30),Spo0B(dim!1),Spo0A(RR)
( Spo0B~p)Spo0A <-> Spo0B(Spo0A~p)
Transferencia de Fosfato Spo0B a Spo0A El grupo fosforilo es transferido de Spo0B~B a Spo0A. Dado que el dominio receptor de Spo0A es muy parecido al de Spo0F, el modo de asociación entre Spo0A y Spo0B será parecido al modo de asociciación entre Spo0F y Spo0B. (Varaguese, 2006)
Spo0B(dim!1,H30~p!2),Spo0B(dim!1),Spo0A(RR~u!2) ->
Spo0B(dim!1,H30~u!2),Spo0B(dim!1),Spo0A(RR~p!2)
Spo0B(dim!1,H30~u!2),Spo0B(dim!1),Spo0A(RR~p!2) ->
Spo0B(dim!1,H30~u!2),Spo0B(dim!1),Spo0A(RR~u!2)
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6. Parámetros utilizados
Gracias al extenso estudio que se le ha dado a los procesos de diferenciación en B. subtilis, existe una gran cantidad de información experimental disponible. La siguiente tabla muestra todos los parámetros utilizados en la construcción del modelo dinámico.
Evento Parámetro Referencia
Parámetro general de unión 0,005 1/(m*s) Igoshin, 2008
Parámetro general de desunión 0,5 1/s "
Tasa de autofosforilación de HK (general) 0,1 1/s "
Tasa de autodefosforilación de HK (general) 0,001 1/s "
"
Fosforilación HK-RR 1,5 1/s "
Defosforilación del RR por HK 0,05 1/s "
Fosfotransferencia KinA a Spo0F 0,08 1/s Grimshaw, 1998
Tasa de autodefosforilación de KinA (general) 0,002 1/s "
Fosfotransferencia spo0B a spo0A 0,2 1/s "
KinA autofosforilación de KinA (sin Spo0F) 0,0019 1/s "
KinA autofosforilación de KinA (con Spo0F) 0,01 1/s "
Dimerización de HK (general) 0,1 1/(m*s) Bray, 1993
Disociación dímero HK (general) 0,5 1/s "
Tasa de degradación de proteína (general) 4E-4 1/s Losick, 2010
Tasa de degradación de mRNA (general) 1E-2 1/2 "
Tasa de traducción por molécula de mRNA(general) 4E-2 1/2 "
"
Tasa de transcripción de spo0E inactivo 1E-3 m/s "
Tasa de transcripción de spo0E activo 3E-3 m/s "
Kd Spo0A al promotor de skf 26 nM Fujita, 2005
Kd Spo0A al promotor de spoIIA 140 nM "
Kd Spo0A al promotor spoIIE 230 nM "
Kd Spo0A al promotor de sdp 1300 nM "
Kd Spo0A al promotor de spoIIG 1700 nM "
Kd Spo0A al promotro de abrB 64 nM " Tabla 2 | Parámetros del modelo. M molar, m molécula, HK cinasa de histidina, RR regulador de la respuesta. Los parámetros generales son de modelos moleculares similares al de Bacillus subtilis. (1/s: frecuencia [1/segundo]; nM: concentración [10^-9 Moles por litro]; m/s: tasa de reacción, [moléculas por segundo]; Kd: Constante de disociación)
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Resultados y discusión
1. El módulo de señalización y la dinámica temporal de 0A
En términos bioquímicios el módulo de esporulación controla dos aspectos del sistema: el estado estacionario de la concentración de Spo0A activado, [0A~p], y el tiempo antes de llegar a ese estado estacionario, dicho de otra forma, actúa controlando el cambio en la concentración de Spo0A en el tiempo, expresado como la derivada, i.e. d[0A~p]/dt.
Fujita y Losick demostraron experimentalmente en 2005 que los genes regulados por Spo0A~p se pueden clasificar en dos grupos: los que responden a bajas y a altas concentraciones del factor transcripcional respectivamente. Basado en estos y otros resultados previos, Schultz en 2009 propone un modelo basado en ecuaciones diferenciales que sugiere que la dinámica de [0A~p] define tres etapas en este el proceso de toma de decisión (Schultz, 2009). A grandes rasgos estas etapas corresponden a un umbral bajo, un lapso de espera donde d[0A]/dt = 0, y un umbral alto donde se toma la decisión de esporular, respectivamente.
El lapso donde la actividad de 0A no cambia en el tiempo (d[0A]/dt = 0) es usando como táctica de espera, en caso de que las condiciones ambientales mejoren, en esta etapa se puede elegir el destino celular alterno, célula competente (Errington, 2003; Schultz,2009). Las simulaciones por computadora del modelo de esporulación sugieren que la actividad de Spo0E, fosfatasa de Spo0A, podría ser determinante en la duración de este lapso. Esto es congruente con los resultados de mutantes de 0E publicados en [Losick,2010].
La actividad de 0E es un ejemplo de control negativo por retroalimentación, el mecanismo de control más fundamental que existe tanto en sistemas diseñados por el hombre y en seres vivos [Ingalls, 2006]. Los sistemas de dos componentes y de señalización en general, presentan uno o varios ciclos de retroalimentación que operan en diferentes escalas temporales. La tabla 3 y la figura 8 muestran los ciclos conocidos para el módulo de esporulación, indicando el tipo de regulación (negativo o positivo). Con esta información se decidió utilizar el siguiente modelo para el módulo de señalización:
-Entrada de señales por diferentes quinasas de histidina -Autofosforilación de las Quinasas -Flujo de fosfato reversible a través del phosphorelay Spo0F-Spo0B-Spo0A -Control negativo en Spo0F a través de la actividad de la fosfatasa Rap -Activación de por fosfato de Spo0A -Control negativo en Spo0A a través de la actividad de la fosfatasa Spo0E
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Figura 8 | Modelo del módulo de señalización de esporulación.
___: flujo de fosfato, ___: retroalimentación transcripcional. El tamaño del círculo para Spo0B remarca el número inusualmente bajo de moléculas en el citoplasma. Sda es una proteína relacionada con ciclo celular, que regula la actividad de KinA.
El sistema de decisiones implementado por B. subtilis utiliza control por retroalimentación mediado por transcripción. Spo0A se une a la región promotora de abrB, spo0F, kinA y spo0A. En la tabla 3 se presentan las interacciones de regulación genética conocidas para los componentes involucrados en la dinámica del phosphorelay.
kinA spo0F spo0B rap spo0E spo0A sigH abrB Regulador
+ - ++ ++- --- Spo0A
+ + + + SigH
- - - AbrB
+ + + + ++ + SigA
Tabla 3| Regulación transcripcional en el módulo de señalización. Se muestran las interacciones negativas (-) y positivas (+). Solo
para Spo0A y sigA, el número de signos señala la fuerza relativa estimada a partir de los resultados de Fujita, 2005, DBTBS y métodos de matrices. En azul se resaltan las interacciones entre reguladores transcripcionales. Es evidente que el sistema de decisiones no se compone sólo de la red de señalización; los mecanismos de control por retroalimentación mediado por transcripción mostrados en la figura 8 y en la tabla 3 sugieren que la determinación del destino celular en B. subtilis depende de una compleja interacción entre el sistema
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de señalización y la red de regulación genética. Más aún, la separación entre escalas temporales generada por esos mecanismos de control resultó ser determinante en la dinámica poblacional (ver más adelante).
2. Dinámica del Phosphorelay: Modelo silvestre (wild type) Con la información obtenida de la literatura y diversas bases de datos se construyó un detallado modelo de las interacciones esquematizadas en la figura 8 y tabla 2. Las reglas de este modelo (tabla 1) pueden ejecutarse en una simulación estocástica que utiliza resultados de la mecánica estadística para representar de manera “exacta” la cinética molecular [Gillespie, 1977]. Más aún, al ser estocástica permite explorar el espacio de todas las posibles trayectorias del sistema, lo cual es indispensable para entender la dinámica a nivel poblacional.
Figura 9. Dinámica de los componentes del phopshorelay. El modelo wild type corresponde a las interacciones de la figura 8, utilizando los parámetros y las reglas descritos en las tablas 1 y 2. A) Simulación estocástica única (representa la dinámica de una célula) por 10000 segundos. Se muestran los niveles de expresión para cada componente del phosphorelay y también los niveles de activación de Spo0A (rojo). B) Resultados experimentales de niveles de expresión utilizando técnicas de fluorescencia obtenidos por Eswaramoorthy en 2010. Los niveles de expresión en Spo0F, Spo0B y KinA durante 9000 segundos después de inducir a Bacillus subitlis en medio sin nutrientes. Mediciones cada media hora.
A partir de las reglas presentadas en la tabla 1 y los parámetros de la tabla 2 se obtuvo un modelo base, que representa el sistema de señalización tal como se le ha observado en el laboratorio en condiciones estándar de esporulación. Lo hemos definido como modelo silvestre (wild type) porque lo utilizaremos para comparar los efectos de las modificaciones in silico. A partir de este modelo se puede hacer una exploración exhaustiva de la dinámica del sistema. Sin embargo, es importante mencionar que las simulaciones estocásticas siguen siendo computacionalmente costosas para modelos grandes, aún con las nuevas tecnologías de cómputo. Para ejecutar una simulación, es decir, una realización de las reglas del sistema bajo un conjunto de parámetros cinéticos y condiciones iniciales, durante 9000 segundos de tiempo biológico, un procesador Intel Centrino 2.4Ghz tarda aproximadamente 720 segundos de tiempo computacional. Más aún, al estar analizando la dinámica poblacional debemos ejecutar la simulación un gran número de veces para tener significancia estadística. Sin embargo, el acceso al centro de cómputo avanzado de la Universidad de Harvard facilitó el trabajo.
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La figura 9 muestra los cambios en la concentración de los diferentes componentes del phosphorelay. La dinámica del modelo wild type fue comparada con resultados experimentales obtenidos por Eswaramoorthy. Los niveles de activación de Spo0A, en rojo en la figura 9-A, no pueden ser medidos experimentalmente debido a la inestabilidad de la molécula activada. Sin embargo, los niveles de Spo0F y KinA correlacionan bien entre el modelo y el experimento. Por otra parte, el modelo wild type se construyó utilizando datos experimentales de distintas fuentes y se calibró (ajuste de parámetros y variables del sistema) utilizando diversas fuentes de datos experimentales de la cinética del sistema [Schultz, 2009; Chastanet, 2010; Eswaramoorthy, 2010; Veening, 2010]. Para KinA, Spo0F y Spo0A se encontraron resultados que ya han sido observados tanto experimentalmente como en modelos teóricos, esto nos sirvió para calibrar nuestro modelo. Sin embargo, para Spo0B se encontró un comportamiento antes no observado el cual se discute a continuación.
3. Interfaces de comunicación: la proteína Spo0B. El sistema biológico funciona como un todo, sin embargo, la división de labores es una propiedad clave del procesamiento de información en la célula, por lo que es posible identificar módulos estructurales, dinámicos y funcionales. En el sistema phosphorelay existen dos módulos principales: la integración de señales llevaba a cabo por las proteínas Kin y Spo0F, y la activación de Spo0A y activación transcripcional de los genes de esporulación. Como se aprecia en la Figura 8, la proteína proteína fosfotransferasa Spo0B funciona como un puente efectivo entre la integración de señales (en Spo0F) y la activación de Spo0A, es decir, funciona comunicando dos módulos del sistema. Más aún, presenta varias particularidades con respecto a los otros componentes del phosphorelay (figura 8). La proteína Spo0B presenta varias particularidades con respecto a los otros componentes del phosphorelay.
1. No tiene (no se conoce) ningún ciclo de regulación transcripcional dependiente del phosphorelay [Chastanet, 2010].
2. Se encuentra en niveles muy bajos en relación a los demás componentes [Eswaramoorthy, 2010]. 3. Su estado de fosforilación no es regulado por fosfatasas [Varughese, 2006]. 4. Las fluctuaciones estocásticas en la expresión de Spo0B son más altas que en los demás
componentes [Jong, 2010]. 5. Es el puente entre el módulo sensor y la regulación transcripcional.
Desde un punto de vista topológico, Spo0B, podría no parecer un elemento particularmente importante en el sistema, ésta podría ser la razón por la cual sea el elemento menos estudiado. Sin embargo, a partir de la estructura del phosphorelay y las propiedades listadas previamente, se planteó la hipótesis de que Spo0B no sólo une los dos módulos del sistema sino que también actúa como un paso limitante en el flujo de fosfatos, es decir, como un canal de comunicación con un ancho de banda. De ser así, el flujo de fosfato a través de Spo0B dependería únicamente de su concentración y los parámetros cinéticos asociados a las reacciones de fosfotransferencia, ya que no tiene regulación transcripcional por retroalimentación. El modelo nos da la oportunidad de abordar esta pregunta y así entender la importancia que Spo0B podría tener en la dinámica de esporulación.
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La figura 10 muestra la relación entre el tiempo de respuesta del sistema y la concentración inicial de Spo0B. El tiempo de respuesta para este análisis está definido como el tiempo necesario para alcanzar 50% del valor de la concentración en el estado estacionario del factor transcripcional de interés, Spo0A en este caso [Alon, 2007]. Se observa que incluso pequeñas variaciones en el número de moléculas podrían tener efectos drásticos en el tiempo de respuesta. De hecho, la dependencia del tiempo de respuesta a la concentración de Spo0B sigue una ley de potencias (figura 10-B). La estructura de la red y las propiedades inusuales de Spo0B se combinan para generar un comportamiento bastante definido.
Figura 10 | A) Tiempo (número de eventos en la simulación) para que la concentración de Spo0A~p alcance 50% de su estado
estacionario como función del número de moléculas presentes de Spo0B. Cada punto representa un promedio obtenido a partir de 100 simulaciones. B) Regresión lineal para ajustar los datos a una ley de potencias.
Los resultados presentados en la figura 10 sugieren que Spo0B actúa modulando el flujo de fosfatos y por tanto, el tiempo de respuesta del sistema. Cambios en la concentración de Spo0B afectan directamente el tiempo de respuesta, en la célula sin embargo, la expresión de Spo0B no depende de la actividad del phosphorelay. En la siguiente sección se discutirán los mecanismos que podrían afectar la concentración de Spo0B en la célula y las implicaciones que tendrían en la dinámica de esporulación.
4. La dinámica del phosphorelay podría amplificar las fluctuaciones estocásticas.
En las mediciones de Eswaramoorthy en 2010 se encontró que la concentración inicial de Spo0B es aproximadamente 40~60 moléculas, un orden de magnitud menor que la de Spo0F o KinA. Dado el gen spo0B no tiene regulación transcripcional dependiente del phosphorelay y sólo es regulado por el factor housekeeping sigma-A, su concentración aumenta de manera lineal a lo largo de todo el proceso. La figura 11 presenta resultados experimentales de los niveles de expresión en una célula para diferentes componentes del sistema. Para cada gen, se hace una comparación entre una célula que esporula (rojo) y una que no (negro). Como se observa en la figura 11-D, los niveles de expresión de Spo0B no presentan incremento o decremento significativo comparado con los otros componentes del sistema. Sin embargo, sí presentan fluctuaciones significativas.
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Como se muestra en la figura 10, variaciones en la concentración de Spo0B podrían tener un efecto significativo en la dinámica de esporulación. Dado que Spo0B no cuenta con mecanismos de regulación transcripcional adicionales a los de expresión basal (tabla 3), su concentración no cambia significativamente en el tiempo [Eswaramoorthy, 2010]. Sin embargo, una fuente importante de variación en la concentración de spo0B entre individuos serían las fluctuaciones generadas a nivel del promotor (figura 11). Es decir, variaciones en la concentración de Spo0B se generarían principalmente por fluctuaciones estocásticas durante la expresión del gen y éstas podrían ser amplificadas creando variación entre los tiempos a los que diferentes células deciden esporular. En general, las fluctuaciones estocásticas a nivel del promotor han sido caracterizadas y clasificadas en dos tipos, ruido intrínseco y ruido extrínseco [Swain, 2002]. El ruido extrínseco, es el efecto que tienen las fluctuaciones estocásticas del citoplasma en la expresión genética, es el mismo para todos los genes. El ruido intrínseco, por otro lado, es específico para cada gen y se entiende como el efecto que tiene la estructura del promotor en las fluctuaciones estocásticas de la expresión genética. Los resultados presentados en la figura 10 sugieren que, fluctuaciones en la concentración de Spo0B podrían tener efectos significativos en el tiempo de respuesta del sistema. Para probar esta hipótesis sería suficiente expresar Spo0B utilizando un promotor sintético para el cual se conocen los niveles de ruido. Si en efecto el phosphorelay amplifica las fluctuaciones estocásticas del promotor de Spo0B, esto podría significar que el ruido del promotor pudo haber sido ajustado durante la evolución de Bacillus subtilis y su adaptación al medio ambiente.
Figura 11 | Fluctuaciones en los niveles de expresión de los componentes del phosphorelay. En este trabajo de Veening en 2010,
se midieron los niveles de expresión utilizando tecnologías de célula-unica. Se midieron los niveles de expresión utilizando una fusión transcripcionales con gfp. Los puntos más gruesos representan eventos de división celular. Después de cada división, se tomó una de las dos células hijas aleatoriamente para continuar las mediciones. Se observa en D los altos niveles de fluctuaciones estocásticas en Spo0B.
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Los resultados encontrados para Spo0B sugieren que la dinámica de la señalización en esporulación está estrechamente relacionada no sólo con la topología de la red sino con los parámetros cinéticos y las fluctuaciones estocásticas. Más aún, como sugieren los resultados presentados en la figura 10, la topología de la red de señalización le confiere a Spo0B la capacidad de modular el tiempo de respuesta del sistema. Adicionalmente, Spo0B podría presentar fluctuaciones en niveles de expresión no sólo provenientes del ruido en la transcripción, sino también a la repartición no igual al momento de la división celular. De hecho, Veening propone en 2011 que existe un tipo de herencia epigenética en el phosphorelay, es decir, que el número de moléculas que recibe cada célula al momento de la división celular lleva información que podría afectar el destino celular, en este caso, la decisión de esporular o no.
5. Los niveles de activación de 0A son heterogéneos en la población. Se ha demostrado en diferentes trabajos que, a nivel poblacional, la activación de 0A es heterogénea [Losick,2010; Veening, 2005] es decir, no un hay valor único para la concentración de 0A~p en el estado estacionario, sino una distribución de probabilidad. Tomando en cuenta los umbrales definidos por Fujita y Losick para los genes regulados por Spo0A, esta distribución de probabilidad definiría qué proporción de células tienen niveles suficientemente altos de Spo0A activo. La figura 12 muestra diferentes representaciones de la heterogeneidad en los niveles de activación de Spo0A. En una población aparentemente isogénica de células creciendo bajo condiciones ambientales iguales, distintos individuos alcanzarían niveles diferentes de activación en Spo0A, que es justamente lo que se ha observado experimentalmente (figura 11 C-D). Como ya se ha discutido ampliamente, la concentración de Spo0A activado es la variable que determinará si la célula va a esporulación o no. Además, en las células que no van a esporulación, Spo0A también regula genes clave involucrados en la adopción de otros destinos celulares. De esta manera, el nivel de activación de Spo0A, controlado por la dinámica del phosphorelay, establece un mapa entre la información ambiental y la especificación del fenotipo. Por las discusiones y resultados presentados en las secciones anteriores y la dinámica de Spo0A a nivel poblacional presentada en la figura 12, se puede intuir que la pregunta para entender la toma de decisiones en esporulación es: ¿Cuál es la probabilidad de que una célula alcance niveles suficientemente altos de Spo0A y consecuentemente decida esporular? En la escala poblacional, el fenotipo está determinado por la distribución de los niveles de activación de Spo0A, . En términos matemáticos, representa la probabilidad de que una célula elegida al azar en la población tenga un nivel específico de Spo0A activo. Más aún, a partir de esta distribución también se puede calcular la proporción de células con niveles más altos que un valor X (ver más adelante). Estas dos ideas anteriores representan la parte medular del modelo de toma de decisiones propuesto en este proyecto y serán analizadas con más detalle en las siguientes secciones. Para entender la dinámica de se utilizaron simulaciones estocásticas de las reacciones involucradas en el phopshorelay utilizando el algoritmo de Gillespie [Gillespie, 1973]. Cada simulación del modelo del phosphorelay (una realización del proceso estocástico asociado al modelo), representa la dinámica de una célula de la población. Es importante remarcar que al ser un modelo estocástico, cada simulación seguirá una trayectoria diferente, esto es análogo a los que se observa experimentalmente (figura 12). En nuestra simulación, las células tienen el mismo genotipo (mismo conjunto de interacciones y parámetros) y el mismo ambiente (input en la simulación y condiciones de inicio). Esto quiere decir, que la variación que se observa en no proviene de
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variación genotípica o variación ambiental. Es decir, la dinámica de está controlada por la dinámica a nivel molecular del phosphorelay y Spo0A.
Figura 12 | Distribución poblacional de los niveles de activación de Spo0A. A) Se muestran los niveles alcanzados por 100
simulaciones independientes del modelo wild type a las dos horas. En rojo se muestra el ajuste de densidad utilizando un kernel gaussiano. B) y C) Distribución para niveles de activación de Spo0A encontrada experimentalmente por Veening et al., en 2010. D) Distribución para niveles de activación de Spo0A a la 1er hora, encontrada por Losick et al., en 2010. Para investigar más profundamente qué factores del sistema afectan más significativamente la dinámica de
y, por lo tanto el fenotipo poblacional del sistema, se llevó a cabo la variación de parámetros cinéticos. Para cada conjunto de parámetros se cuantificaron las propiedades estadísticas de , esto se explica a detalle en las siguientes secciones. La figura 12-A muestra la distribución de niveles de activación de Spo0A después de 2 horas de haber iniciado el proceso ejecutando el modelo wild type. Dado que cada simulación representa a una célula individual, al realizar un gran número de simulaciones se obtiene un estimado de la dinámica poblacional. Este experimento in silico es análogo a una medición de niveles de expresión utilizando por ejemplo una etiqueta fluorescente y citometría de flujo. La distribución de la figura 11-A, obtenida con 1000 simulaciones del modelo wild type, muestra un claro comportamiento bimodal. Existen al mismo tiempo dos sub-poblaciones, una con niveles altos de activación y con niveles bajos. Esto lo encontró Veening experimentalmente en 2010, utilizando citometría y un marcador para el gen spo0IIA (figura 11-B). Sin embargo, Losick en 2010 propone que la distribución de Spo0A no es bimodal, más aún, demuestra con citometría y marcadores para spo0IIA (igual que Veening) que la distribución no tiene un comportamiento bimodal, sino que muestra alto grado de dispersión (figura 11-C). Dado que los genes regulados por Spo0A se pueden clasificar de acuerdo al nivel de Spo0A activado al cual responden (alto o bajo), definiría la proporción de cada uno de estos dos grupos. Más aún, el umbral de activación para compromiso a esporular, en conjunto con la forma y posición de la distribución, definiría la proporción de esporas, como se explicará en las siguientes secciones.
A)
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En su publicación de 2010, Losick propone que el phosphorelay actúa como un generador de ruido y que es esta la razón por la cual se observa una activación heterogénea de Spo0A. Esta hipótesis está en completa congruencia con los resultados presentados en la sección anterior. Más aún, se logró identificar el componente del phosphorelay encargado de amplificar el ruido: Spo0B. Sin embargo, es necesario profundizar en el análisis de la distribución de Spo0A, para determinar las posibles razones de esta aparente incongruencia entre los resultados de Veening y Losick.
6. La distribución de activación de Spo0A como mecanismo de toma de decisiones Como se explicó en la sección anterior representa la probabilidad de que una célula tomada al azar en la población presente cierto nivel de Spo0A activado. Esta distribución representa el comportamiento estadístico del sistema, es decir, las propiedades que se observan sólo a nivel poblacional. Es importante enfatizar que en varias especies de bacterias se han observado complejos mecanismos de organización poblacional, por ejemplo, los biofilms donde la población se divide en diferentes tipos celulares con tareas específicas [Dunny, 2008]. Una pregunta clave para entender la organización este comportamiento en Bacterias y en sistemas multicelulares en general, es ¿Cómo se especifican las proporciones de fenotipos diferentes en una población? A continuación se presenta un modelo que responde esta pregunta para el sistema de esporulación, es decir, cómo se determina la proporción de esporas en una población. En este momento es importante recapitular dos aspectos fundamentales del sistema de esporulación: los niveles de activación en Spo0A son heterogéneos en la población y se ha observado que las células se comprometen a esporular cuando se ha alcanzado un umbral de activación en Spo0A [Chastanet, 2010]. Basado en estas dos observaciones y en los resultados presentados en las secciones anteriores, se propone que el sistema de señalización podría determina la proporción de esporas controlando la dinámica de . Esto quiere decir, no sólo controlando los niveles de activación de Spo0A, sino la forma de la distribución. En la figura 13 se muestra la dinámica de obtenida ejecutando 1000 simulaciones del modelo wild type y midiendo niveles de activación de Spo0A cada 40 min (como se ha hecho en estudios experimentales). En rojo se presenta la proporción de individuos que han alcanzado niveles suficientemente altos de Spo0A, es decir, que han pasado el umbral de activación K. Este umbral de activación se ha documentado ampliamente, sin embargo no se sabe exactamente qué mecanismos moleculares lo determinan. En nuestra simulación se incluyó como un parámetro constante, sin embargo, está suposición es aceptable dado que en la célula el umbral probablemente está codificado a nivel de estructura del promotor y podría ser constante también. Sin embargo, es interesante pensar que este umbral podría cambiar dinámicamente, lo cual proveería aún mayor control sobre la proporción de esporas. Es decir, el mecanismo de toma de decisión de Bacillus subtilis consta de dos componentes fundamentales, el control sobre la forma de y el valor del umbral de activación.
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Figura 13. Probabilidad de esporular como función de la dinámica de . Se muestra el cambio en el tiempo para los niveles de activación de Spo0A en una población de 1000 simulaciones con condiciones iniciales y parámetros idénticos
utilizando el modelo wild type. La función umbral , representada por el plano vertical, es específica de cada gen y probablemente está codificada en la estructura del promotor (número y posición de los sitios de unión) y las constantes de disociación entre Spo0A y el(los) sitios de unión de unión.
A partir del modelo presentado en la figura 13 surgen dos preguntas fundamentales: ¿Cuál es el potencial del sistema de señalización para controlar la dinámica de ? Y ¿Cuáles son los mecanismos que podrían
controlar la función de umbral ? Como ya se discutió previamente, la segunda pregunta va más allá de los alcances de este proyecto, sin embargo es bastante interesante proponer que este umbral se genera a nivel de estructura del promotor y funciona como un mecanismo que podría adaptarse en escala evolutiva mediante mutaciones puntuales (ver sección 9). La primera pregunta, se discutirá ampliamente en las siguientes secciones. El modelo presentado en la figura 13 muestra la forma en la que el sistema de señalización acoplado con la función umbral controla el área bajo la curva marcada en rojo. En términos matemáticos, realizan un proceso de integración. Al controlar la forma de , automáticamente se está controlando también el área en rojo, es decir la proporción de esporas . Dicho de otra forma, se está controlando la probabilidad de
que una célula individual decida esporular. Es importante recordar que al inicio de la simulación, los individuos poseen la misma información genética (interacciones y parámetros cinéticos) y la misma información ambiental (input de la simulación). Es decir, partiendo de la misma información diferentes individuos elegirán su destino celular con cierta probabilidad. Sin embargo, esto no debe confundirse con lanzar una moneda al aire; la toma de decisiones con componente aleatorio (en inglés bet-hedging) es un mecanismo cada vez más estudiado en sistemas biológicos y será discutido en la siguiente sección.
Dinámica poblacional de activación de Spo0A
Dinámica poblacional de activación de Spo0A
Proporción de esporas.
Función umbral
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Para estudiar cuáles atributos del sistema contribuyen a la dinámica de se realizó un análisis sistemático variando parámetros cinéticos y buscando cambios significativos en la forma de . Los resultados mostraron que diversos parámetros afectaron el promedio de la distribución, lo cual ya ha sido documentado experimentalmente y con modelos de Ecuaciones Diferenciales Ordinarias. Sin embargo, el presente análisis mostró también que la retroalimentación a nivel transcripcional tiene el potencial para darle forma a , no sólo a nivel del promedio y la deviación estándar, sino también controlando el sesgo y la kurtosis. Estas dos últimas estadísticas asociadas al tercer y cuarto momentos, respectivamente, son particularmente importantes para entender cómo son determinadas las proporciones de fenotipos en la población y cómo estas proporciones cambian en el tiempo y se adaptan en escala evolutiva.
7. Esporular o no esporular: como estrategia de bet-hedging En este trabajo se presenta un modelo en el cual la distribución de Spo0A activado, , representa la decisión del sistema, es decir, la estrategia de Bacillus subtilis para interactuar con el ambiente. Esta interacción se da al procesar información ambiental en el sistema de señalización y responder con la dinámica adecuada a nivel de expresión genética. A su vez, la interacción entre la señalización y la expresión genética reside en la dinámica de activación de los reguladores transcripcionales. En el caso de los genes regulados por Spo0A, existe un mecanismo de regulación por umbral [Fujita, 2010] (figura 13), es decir, existen genes que son activados/reprimidos sólo cuando la concentración de Spo0A activado ha pasado un cierto valor, el cual es específico para cada gen (ver más adelante). Este comportamiento lleva a la idea de que la forma de , determinará las proporciones en la población de genes expresados o reprimidos, como se discutió detalladamente en la sección anterior.
Figura 14 Dinámica de la proporción de esporas en la población. A a partir de los resultados presentados en la Figura 13, se calculó la proporción de células que sobrepasan el umbral de activación en función del tiempo. A) Dinámica de la
proporción de células con niveles de activación en Spo0A mayores al umbral (es igual al valor del área en rojo de la figura 13) B) Proporción de esporas observada experimentalmente a través del tiempo [Chastanet, 2010].
Proporción de esporas
tiempo
Proporción de esporas (experimental)
Modificado de
[Chastanet, 2010]
(modelo)
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Más aún, al ser un regulador maestro, varios de los genes regulados por Spo0A son, a su vez, factores transcripcionales. Es decir, la forma de , tendría el potencial para determinar las proporciones de individuos en los que reguladores transcripcionales adicionales podrían ejecutar, a su vez, programas genéticos que codifiquen para fenotipos complejos. En el caso de esporulación, Spo0A regula a los factores sigma E y F, cuya función es iniciar el proceso de desarrollo de la espora. Una vez que estos genes se activan el proceso de esporulación se vuelve irreversible. En la figura 14-A, se muestra la dinámica de la proporción de esporas con respecto al tiempo, es decir, la proporción de individuos en la población que han alcanzado niveles suficientemente altos para comprometerse a esporulación. La dinámica de la figura 14-A es una representación del área marcada en rojo en la figura 13, esto muestra la estrecha relación entre la forma de
y la proporción de esporas. A partir de esto se plante la pregunta: ¿Cuál es el potencial del sistema de señalización para generar estrategias diferentes? Al controlar la forma de , en principio se podrían obtener diferentes valores para la proporción de esporas. Esta proporción representa la decisión del sistema, es decir, la probabilidad de que un individuo elegido al azar en la población se comprometa a esporular. Este tipo de mecanismo de toma de decisión con componente aleatorio se conoce como bet-hedging, haciendo referencia a un tipo de apuesta. En el caso de esporulación, Bacillus subtilis estaría apostando a la proporción de esporas necesaria para contender con la situación del ambiente. Por sí mismo, esto representa un problema bastante complejo y podría incluso ser el caso que B. subtilis esté realizando una estimación sobre las propiedades estadísticas del ambiente a través del tiempo. ¿Es la probabilidad de esporular óptima? ¿Es posible adaptar la probabilidad de esporular en escala evolutiva? ¿Qué nos dice la probabilidad de esporular acerca del ambiente en el que vive Bacillus subtilis? Estudiar exhaustivamente estas preguntas va más allá de los alcances de este proyecto, sin embargo se discutirán superficialmente en las secciones siguientes. Por último, el hecho de que la decisión esté representada por una probabilidad no quiere decir que sea tomada completamente al azar, al contrario, significa que la información procesada por el phopshorelay se colapsa en una probabilidad con la que se adopta un cierto destino celular. En escala poblacional, significa un patrón de organización multicelular mediante el cual se asignan las proporciones de diferentes tipos celulares a partir de un conjunto de células pluripotenciales. Esta analogía con los organismos multicelulares es cada vez más aceptada para algunas especies de bacterias y podría ser la base de modelos para entender la diferenciación celular [Kuchina, 2011; Dunny, 2008; Veening, 2008]. Los resultados presentados en las secciones anteriores proponen un modelo que integra varios conceptos fundamentales de la regulación genética y de señalización en esporulación: genes activados por mecanismos de umbral [Fujita, 2005], la dinámica poblacional del factor transcripcional [Chastanet, 2010] y las proporciones de fenotipos y estrategias de bet-hedging [Veening, 2008]. En esta sección se discutió la importancia de como el fenotipo de interés a nivel poblacional, sin embargo, ¿Qué mecanismos moleculares podrían controlan la dinámica de ?
8. Caracterizando el fenotipo: Las propiedades de Como se explicó en la sección anterior, el modelo propuesto en este proyecto se basa en la premisa de que la distribución de captura la información del ambiente una vez que ésta es procesada por el sistema de señalización y de esta forma determina la proporción de esporas (Figuras 13 y 14). De esta forma, representa un punto clave de la interacción del sistema con el ambiente, ya que contiene la información necesaria para especificar el fenotipo a nivel poblacional. Como se ha señalado anteriormente, algunas especies de bacterias actúan como un organismo multicelular que distribuye labores mediante el desarrollo de diferentes tipos celulares. Sobre este argumento, podemos añadir que en términos evolutivos representa el sustrato para la selección a través de generaciones, ya que dependiendo de cambios en el
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ambiente, individuos con ciertos niveles de Spo0A (bajos, altos, medios) podrían estar mejor adaptados y ser seleccionados. Es decir, la forma de podría tener efectos en la adaptación del fenotipo, en este caso, la proporción de esporas. En la figura 15 se representan diferentes estrategias para controlar la proporción de esporas en la población, no sólo el valor numérico, sino también cómo cambia este valor en el tiempo. Bajo ciertos ambientes, por ejemplo, podría ser necesario generar un alto número de esporas de manera rápida o tal vez generar el mismo número de esporas pero de manera gradual. En esta sección se discute cómo se podrían generar éstas y otras dinámicas poblacionales, y el papel que juega la forma de . La dinámica de Spo0A representada en las Figuras 13-15 plantea varias interesantes ideas. No sólo los niveles de activación son heterogéneos (representado por la varianza de la distribución) sino que esta variabilidad presenta direccionalidad (representada por el tercer momento o sesgo, s). Más aún, se observa bimodalidad transitoria y largas colas en la distribución (representado por la kurtosis, ζ). Generalmente, las mediciones experimentales utilizan valores promediados que tratan de capturar el comportamiento del sistema. Sin embargo, la variabilidad en la dinámica de los sistemas biológicos es un componente fundamental, ya que no sólo se observa de manera universal sino que es necesaria para la adaptación y evolución del sistema (ver más adelante). A partir de estas ideas también surgen preguntas como ¿Cuál es el rango de valores de activación de Spo0A? ¿Cuál es la variación alrededor de la media? ¿Cuál es el comportamiento de las colas de la distribución y cómo afectaría esto los procesos de selección y evolución? Estas preguntas se pueden entender mejor al analizar las propiedades cualitativas de , por ejemplo, usando los momentos estadísticos: = (Media, Desviación Estándar, Sesgo, Kurtosis). Este vector de momentos depende del tiempo y representa el estado del sistema.
Figura 15. La forma de determina
diferentes estrategias poblacionales. La
propiedad de activación por umbral de los
genes regulados por Spo0A combinado con
la forma de es suficiente para definir una
distribución binomial de fenotipos: aquellos
que deciden entrar a esporulación con
probabibilidad ; y aquellos que no con
probabilidad .
En este contexto los momentos 3ro (sesgo, s)
y 4to (kurtosis, ζ) definen los aspectos
relevantes (ver discusión). Alto/bajo valor de
S/ ζ está representado por
mayúscula/minúscula, respectivamente.
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En el contexto de señalización y regulación genética, los momentos de la distribución de niveles de activación de un factor transcripcional adquieren significados específicos. La media, , define el posicionamiento de la distribución, es decir, lo niveles promedio de activación del TF. La media es específica de cada TF y es importante para hacer comparaciones o predicciones congruentes con resultados experimentales. Sin embargo, de manera más general, la media no es relevante para estudiar la dinámica de bet-hedging, es decir, mediante procesos de normalización se puede crear un modelo general e independiente de la media, sin afectar la magnitud de los demás momentos. Es importante recordar que la forma de la distribución es lo que afecta la dinámica de la decisión. Por otro lado la varianza, σ2, o dispersión alrededor de la media, también ha sido estudiada ampliamente (como error estándar, coeficiente de variación, etc.), sin embargo generalmente ha sido reconocida como una propiedad no deseable en las mediciones, incluso se ha referido a ésta como error. No obstante, la variación entre individuos es universalmente observada en los sistemas vivos, tanto así, que podría ser una propiedad esencial de la vida. Más aún, la variación entre individuos es uno de los fundamentos de la teoría de la selección natural, ya que es esta variación el sustrato para que la selección pueda actuar a través de generaciones. En el contexto específico de Bacillus subtilis, la dispersión de , representa variación generada por la dinámica del phosphorelay ya que en las simulaciones los individuos tienen la misma información tanto ambiental como genética. Esto es congruente con observaciones experimentales [Chastanet, 2010; Veening, 2008] y con el modelo de toma de decisión mediante apuesta i.e., bet-hedging. Más aún, dentro del contexto planteado en las Figuras 13-15, asoma el hecho de que no solamente la magnitud de la variación es relevante sino también su direccionalidad (representada por el sesgo, s). Dos distribuciones podrían tener la misma media, pero diferente varianza; así mismo podrían tener la misma varianza, pero distribuida de manera diferente (Figura 15 paneles inferiores). Hacia dónde se desplaza la masa de la distribución es un problema fundamental cuando se utiliza el mecanismo de decisión por umbral propuesto en este proyecto. Más aún, en un contexto evolutivo, la direccionalidad de la variación afectaría la forma en la que los individuos son seleccionados por el ambiente. Por ejemplo, si el ambiente cambia y los individuos con más altos niveles de Spo0A tienen adecuación (en inglés fitness) mayor, el sesgo de la distribución determinaría qué proporción de individuos podrían ser seleccionados. Finalmente, mientras el sesgo indica hacia dónde se desplaza la variación (izquierda o derecha) la Kurtosis (representada aquí por la letra griega Zeta ζ) se relaciona con la pregunta ¿Qué proporción de la variación proviene de las colas de la distribución? La Figura 15, muestra diferentes estrategias agrupadas por sus valores de Sesgo y Kurtosis. Altos valores de Kurtosis (ζ >3) indican distribuciones “picudas” cuya varianza proviene de las colas. Una distribución Normal se caracteriza por valores de Kurtosis = 3 y Sesgo = 0. Una distribución con Kurtosis alta (ζ >4 o 5) y gran varianza, se caracteriza por tener un pico y a la vez una delgada y larga cola (a la izquierda o derecha, dependiendo del sesgo) (Figura 15 paneles superiores). Esta estrategia poblacional es robusta ya que una gran proporción de individuos tienen una respuesta bien definida (aquellos en el pico) y al mismo tiempo otra proporción de la población se distribuye en una larga cola, generando así variación. Esta dinámica combinada con presión de selección podría representar un fenotipo con potencial evolutivo (ver más adelante). En general, los genotipos han sido caracterizados cualitativamente desde el inicio de la biología, posteriormente, tecnologías experimentales avanzadas y la aplicación de métodos matemáticos/computacionales permitió cuantificar el fenotipo. Sin embargo, la variabilidad del fenotipo ha sido siempre observada, pero en gran medida, ignorada. Ahora es evidente que esta variación juega un papel fundamental en la dinámica molecular y que podría ser incluso parte esencial de la definición del fenotipo. En este trabajo se propone un mecanismo que toma en cuenta no sólo la magnitud de la variación en la población sino cómo ésta se distribuye y cuáles son sus implicaciones biológicas. Más aún, las observaciones anteriores acerca de los momentos de podrían ser generales para otros fenotipos.
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9. Actividad transcripcional con estructuras combinatorias de promotores regulados por Spo0A Hasta ahora se ha discutido la dinámica de Spo0A y se ha definido distribución poblacional de activación de Spo0A es el fenotipo de interés. Sin embargo, la dinámica de Spo0A es sólo uno de los múltiples pasos involucrados en la regulación genética. A grandes rasgos, los sistemas de señalización son encargados de procesar señales ambientales y posteriormente regular el comportamiento dinámico de los factores transcripcionales. Una vez activado, el TF interactúa con la región promotora del gen regulado. Esta interacción depende de múltiples factores, por ejemplo la estructura tridimensional del factor transcripcional, la distribución de los sitios de unión en el promotor, la curvatura del DNA, proteínas adicionales de unión al promotor, etc. De estos mecanismos, la estructura del promotor, i.e., la distribución de los sitios de unión y sus propiedades cinéticas, ha sido ampliamente caracterizada como sistema de regulación transcripcional [Buchler, 2003]. En esta sección se analizará particularmente el efecto de la estructura del promotor en la dinámica de activación por Spo0A y se discutirá también la relevancia que la estructura del promotor podría tener al momento de interactuar con . En términos generales, la estructura del promotor codifica para una función transcripcional (cis-function) [Guet, 2002], de esta forma, la actividad del factor transcripcional se decodifica en información de expresión genética [Buchler, 2003]. Spo0A presenta un caso interesante ya que funciona como activador y represor dependiendo de la ubicación del sitio de unión. Más aún, los genes regulados por Spo0A presentan entre 1 y 4 sitios de unión en su región promotora [Fujita, 2005], lo cual podría representar un gran potencial de comportamientos dinámicos. En términos cinéticos, el TF en su forma activa se une y desune al promotor con cierta probabilidad que depende de su constante de afinidad y de la concentración del TF. Más aún, al aumentar el número de sitios de unión, también aumentan las posibles configuraciones en las que se puede encontrar el promotor en un instante dado (Figura 16, columna central). Utilizando principios de la termodinámica se puede modelar la dinámica del promotor y cuantificar la probabilidad de que éste adopte alguna de sus posibles configuraciones en función de la concentración del TF. La figura 16 muestra la dinámica esperada para promotores con 1, 2 y 3 sitios de unión a Spo0A (X, Y & Z, respectivamente). De manera general, para cada estructura de promotor se muestran los posibles estados en que se puede encontrar y la probabilidad asociada a cada uno de estos estados como una función de la concentración de Spo0A. Es decir, si sabemos el valor de la concentración de Spo0A podemos saber cuál es la probabilidad de encontrar al promotor en alguna configuración determinada. Esta probabilidad se conoce generalmente como occupancy en inglés y por tanto nos referimos a ella como . Dependiendo el contexto, algunas de estas configuraciones son transcripcionalmente activas y otras no, eso es específico para cada gen. En la tercera columna de la figura, se muestran las funciones lógicas cis asociadas a cada estado posible de los diferentes promotores. En las curvas de probabilidad de la Figura 16 se observan umbrales que definen cambios en la dinámica. Estos umbrales están definidos por las constantes de disociación del factor transcripcional por los diferentes sitios de unión al promotor (KD-X, KD-Y & KD-Z). Por ejemplo, en el caso de un solo sitio, se observa el comportamiento esperado para la reacción . De esta forma, la curva indica qué proporción de moléculas se encuentran unidas en el equilibrio. O bien, cuál es la probabilidad de encontrar al TF unido al DNA. Sin embargo cuando se añaden más sitios, el espacio de posibles estados crece exponencialmente lo que genera interesantes dinámicas en el promotor (Figura 16 B y C). Este espacio de funciones (curvas con diferentes colores) representa los posibles comportamientos de un promotor, sin embargo el significado dependerá del tipo de regulación de cada sitio positivo/negativo, esto se puede ver más claramente con la tabla de funciones lógicas en la tercera columna de la Figura 16.
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Figura 16. Actividad transcripcional para diferentes estructuras y funciones lógicas-cis. Se muestra la función de
ocupación del promotor para promotores con diferente número de sitios de unión. Las curvas en la columna a la izquierda representan la probabilidad de encontrar al promotor en una configuración específica como función de la concentración de Spo0A. El código de colores asocia las curvas de probabilidad con la estructura que representan. El modelo asume equilibrio termodinámico entre Spo0A y los sitios de unión. La concentración de Spo0A y las constantes
KD-Y & KD-Z están normalizadas en unidades de KD-X. Columna a la derecha, cada uno de estos posibles estados se puede traducir a una forma lógica. A, B y C, promotor con 1, 2 y 3 sitios de unión para Spo0A respectivamente.
B)
X
NOT X
X AND Y
X AND NOT Y
NOT X AND Y
NOT X AND NOT Y
X AND Y AND Z
NOT X AND Y AND Z
X AND NOT Y AND Z
X AND Y AND NOT Z
X AND NOT Y AND NOT Z
NOT X AND Y AND NOT Z
NOT X AND NOT Y AND Z
NOT X AND NOT Y AND NOT Z
Actividad Transcripcional Estados posibles Función Lógica.
A)
C)
KD-Y
40
Es importante remarcar que las estructuras de promotor presentadas en la figura 16, sólo contienen información sobre el número de sitios de unión. Múltiples factores están asociados a la estructura del promotor, como la posición relativa de los sitios, factores adicionales que podrían doblar la estructura del DNA, elementos cis asociados a factores sigma, etc. Al contener más variables, la estructura del promotor codificaría para funciones cis más complejas, lo que daría mayor control sobre la expresión genética. Sin embargo, la aproximación hecha para el número de sitios presenta una idea general de las funciones lógicas cis y de la forma en las que se pueden crear umbrales de activación. A continuación se discutirá la interacción entre la distribución y las funciones cis y cómo esta interacción representa un potencial para generar proporciones de fenotipos.
10. Las funciones cis en los promotores particionan a La figura 16 muestra cómo un factor transcripcional puede generar diferentes respuestas dependiendo de la estructura del promotor del gen regulado. Al controlar la concentración del factor transcripcional activo, la red de señalización puede ejecutar el programa genético (i.e., función cis) codificada en la región promotora del gen. Sin embargo, como ya se ha descrito ampliamente en las secciones anteriores la respuesta del factor transcripcional, Spo0A en este caso, es una distribución de valores. De esta manera, los umbrales definidos por las constantes de disociación funcionarían como una partición de la distribución . Es decir, diferentes proporciones de la población se encontrarían en los diferentes regímenes dinámicos mostrados en la figura 16. Por ejemplo, tomemos la función cis X AND NOT Y (Figura 16-B curva color cian) y asumamos que para un cierto gen, ésta es la función que representa actividad transcripcional. Entonces, en aquellos individuos con niveles KD-X < Spo0A < KD-Y el gen estaría siendo expresado ya que la probabilidad de encontrar al promotor en la configuración activa (Curva color cian) es mayor que para las configuraciones no activas (Curvas color rojo, verde y morado). Sin embargo, aquellos individuos con niveles de activación en Spo0A mayores a KD-Y
presentan actividad transcripcional muy baja, debido al cambio en la curva cian. Es decir, la función X AND NOT Y podría particionar la distribución en dos sub-poblaciones con patrones de expresión opuestos. Como ya se ha discutido anteriormente, al controlar la dinámica de , se podrían controlar también estas proporciones. Matemáticamente, la Figura 16 muestra la probabilidad condicional de encontrar al promotor en una conformación específica dado que los niveles de Spo0A se encuentran en un cierto nivel, esta probabilidad es representada por la función . Por otro lado representa la probabilidad de que un individuo elegido aleatoriamente en la población tenga un nivel específico de Spo0A activado (cabe recordar que es dependiente del tiempo). Entonces, la probabilidad de que un individuo elegido al azar en la población presente el promotor en una conformación específica al tiempo t, será igual al producto de y . Este producto representa la dinámica del sistema “Phosphorelay + Promotor regulado”. Más aún, los factores transcripcionales generalmente controlan un conjunto de genes funcionalmente relacionados (regulón), en el caso de Spo0A, 120 genes son regulados directamente (y hasta 500 indirectamente) [Schultz, 2009]. Es decir, al controlar la dinámica de , el sistema de señalización puede ejecutar en paralelo múltiples funciones cis. Este proceso de decodificación de la información contenida en representa el enlace entre la actividad de señalización y la expresión genética. Es importante recordar que la regulación transcripcional es sólo el comienzo de la expresión genética y que múltiples puntos adicionales de control están involucrados. Adicionalmente, la Figura 16 muestra la dinámica que un solo TF puede generar, sin embargo, lo que se
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observa generalmente es que varios TF regulan a un mismo gen. De esta forma se puede llevar a cabo un proceso más complejo de integración de señales y respuesta. Al mismo tiempo, es interesante plantear la pregunta sobre el poder computacional de un solo TF, es decir, cuál es espacio de posibles funciones cis que un TF puede ejecutar y cuándo es necesario añadir un TF adicional. Estas preguntas podrían estar relacionadas con la evolución de las redes genéticas y el número promedio de interacciones observado en estas redes (la distribución del grado de entrada y salida [Barabási, 2004]).
11. Control por retroalimentación en kinA regula la dinámica de La respuesta a positiva SigH es rápida mientras que la negativa a Spo0A es lenta, de esta forma hay un
retraso efectivo entre la activación y la represión de kinA, aunque ambos son mediados por la actividad de
Spo0A. Para modelar esto se simularon dos sitios de unión a Spo0A con diferentes constantes de afinidad
creando el efecto neto de un retraso (Figura 16-B magenta). Mientras la concentración de Spo0A activo
crece se pueden observar dos regímenes en la actividad transcripcional de kinA: Incremento rápido cuando
; máximo en ; seguido de un decremento cuando Spo0A > . El
cociente de las constantes de disociación para los dos sitios, r, determinará los umbrales temporales de
Figura 17. Modelo del promotor de kinA. El gen kinA
presenta regulación positiva y negativa por parte de Spo0A.
Se muestra la estructura del promotor de kinA con dos sitios
de unión para Spo0A con diferentes afinidades y efecto
(positivo y negativo). El gen es activo cuando Spo0A está
unido al sitio X y no al sitio Y (función lógica: X AND NOT Y).
El cociente de las constantes de afinidad, r, representa un
retraso efectivo entre el efecto positivo y negativo.
La figura 8 muestra los ciclos de control por retroalimentación a nivel transcripcional en el módulo de esporulación. Los resultados de Losick en 2010 sugieren que estos mecanismos de control funcionan para lograr una fina regulación temporal de Spo0A (just in time regulation). Por otro lado, Fujita y colaboradores demuestraron que la regulación de la expresión de KinA gobierna la entrada a esporulación [Eswaramoorthy, 2010]. Sin embargo, en estos experimentos, la inducción de KinA es dependiente de IPTG mientras que en vivo, depende de activación transcripcional inducida por Spo0A (a través de sigH) (figura 8). En base a estos antecedentes, se utilizó el modelo para probar los efectos del control por retroalimentación en kinA en la dinámica de . El promotor de kinA (la principal cinasa que
activa el phopshorelay) contiene un sitio de
unión para SigH (control positivo mediado por
Spo0A) y un sitio de unión directo a Spo0A
(negativo) [Fujita, 1998].
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estos 3 regímenes. Más aún, es importante observar que la configuración del promotor crea una función cis
del tipo X AND NOT Y (Figura 16-B). La figura 18 muestra el efecto en la dinámica de para diferentes
valores de r. Al ser r el cociente entre las dos constantes de disociación (figura 17), un valor de r=102, por
ejemplo, significa que Spo0A se une al sitio negativo con 100 veces menos fuerza que al sitio positivo.
Figura 18. Dinámica de dependiente del control por retroalimentación en kinA. Dinámica de una población de 1000 simulaciones para diferentes configuraciones del promotor de kinA mostrado en la figura 17. Se realizaron mediciones de la distribución cada 0.5 horas y se estimó la densidad utilizando un kernel gaussiano. La distribución en estado estacionario se muestra en rojo. Todas las simulaciones se iniciaron con las mismas condiciones iniciales y parámetros de la tabla 2. A) Promotor sin sitio de unión Y (sin regulación negativa) se utilizó como control. Se observa
bimodalidad no estable y una respuesta robusta (distribución con pico) B) Sitio de unión negativo débil (KD-Y =11.5) estabiliza la bimodalidad C) Distribución ancha sin un sesgo definido se observa con un sitio de unión medianamente
fuerte (KD-Y =1.5) D) Sitio de unión negativo fuerte (KD-Y =0.4) genera una distribución posicionada en niveles bajos con
una cola larga a la derecha. Sólo se cambiaron los valores de KD-Y y se mantuvo el mismo valor para KD-X. Los valores
KD-Y = 11.5 y 0.4; se obtuvieron experimentalmente para genes que se sabe responden a concentraciones bajas y altas de Spo0A, respectivamente [Fujita, 2005]. El valor de 1.5 se eligió como punto intermedio. El la figura se muestra el
cociente r =KD-Y / KD-X. La escala es la misma para todas las distribuciones después de haber sido normalizadas por su valor máximo en el estado estacionario.
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La Figura 18 muestra los resultados al variar la constante de afinidad del sitio de unión negativo (KD-Y). Es interesante que cambios en este parámetro afectan drásticamente la dinámica poblacional. Es también evidente, que el cambio no sólo es en la media de la distribución, sino en la varianza, el sesgo y kurtosis. Es decir, el control por retroalimentación a través de KinA representa un mecanismo potencial para dar forma a la distribución . El hecho de que estos cambios radicales en la dinámica poblacional dependan de un solo parámetro del sistema sugiere mecanismos evolutivos potenciales mediante los cuales la estrategia de esporulación de Bacillus subtilis podría adaptarse a cambios ambientales. Esto se discutirá en la siguiente sección.
12. Plasticidad en el fenotipo y potencial para evolucionar. Dos conclusiones importantes emergen de los resultados presentados en la Figura 18. Primero, la dinámica de la distribución puede ser controlada por la retroalimentación transcripcional en la Cinasa de Histidina KinA. Segundo, este efecto en reside en cambios en un solo parámetro cinético (KD-Y), en la célula, estos cambios podrían generarse simplemente por mutaciones puntuales en el sitio de unión. Es decir, el sistema de toma de decisiones de B. subtilis podría fácilmente adaptar la dinámica poblacional para modular la proporción de esporas en caso de que el ambiente cambie. Desde un punto de vista evolutivo, este podría ser un mecanismo de aprendizaje por el cual el sistema de señalización estima la estrategia óptima en base al registro estadístico del ambiente. Es importante mencionar que la estrategia de Bacillus subtilis responde a una dinámica ambiental que opera en escalas temporales mucho mayores a la división celular ya que las esporas pueden permanecer inactivas durante incluso miles de años. Esta capacidad de adaptación mediante mínimos cambios genéticos es una forma de potencial evolutivo. Aunque la definición de potencial evolutivo (o evolvabilidad) no está claramente estructurada, sí podemos enlistar algunas características necesarias. A grandes rasgos, un sistema de procesamiento de información en la célula funciona como un objeto que mapea el ambiente con un fenotipo. Sin embargo, el ambiente es en realidad un conjunto de posibles estados ambientales y el fenotipo en realidad es un espacio de posibles fenotipos. La plasticidad del fenotipo se refiere a la capacidad del sistema para adaptarse al ambiente sin necesidad de cambios a nivel genético, y ocurre en escala de división celular. La evolvabilidad, por otra parte, se refiere a la capacidad que tiene el sistema para explorar el espacio de fenotipos mediante mutaciones y así, alcanzar respuestas óptimas a nuevas circunstancia ambientales, y ocurre en escala evolutiva [Voigt, 2006]. En resumen, el sistema de señalización de Bacillus subtilis tienen la capacidad de modular la variabilidad de su respuesta al estrés ambiental. Incluso bajo condiciones ambientales idénticas, una población genotípicamente homogénea responde de manera heterogénea, como se ha discutido a lo largo de esta tesis (Figura 19). Es decir, la variabilidad observada en el fenotipo tiene un componente que no es producto del ruido molecular o de la variabilidad genética, sino de la dinámica del sistema. En la Figura 19-A se muestran 1000 trayectorias independientes de la activación de Spo0A, esto representa una población de 1000 individuos sujetos a las mismas condiciones ambientales. En la figura 19-B se muestra la distribución de los valores alcanzados por los individuos al tiempo de 9000 segundos.
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Figura 19. Variabilidad en el fenotipo en señalización. Se muestra la trayectoria de 1000 simulaciones para la dinámica de Spo0A durante 9000 segundos. Todas las simulaciones se realizaron con condiciones iniciales idénticas y mismo conjunto de parámetros (tabla 2). El estrés (señal) se activa a los 2000 segundos del inicio de la simulación (en rojo). En negro se muestra el promedio de las simulaciones. B) Estimación de densidad utilizando kernel gaussiano y mediciones de la distribución a los 9000 segundos.
Aún cuando una gran proporción de los individuos en la Figura 19-A sigue una trayectoria definida (alrededor del promedio) una proporción significativa abarca un amplio rango de trayectorias. A partir de esta figura, es claro que el promedio (en negro) es insuficiente para entender la dinámica de la señalización. Mientras que los comportamientos cercanos al promedio refieren a una respuesta poblacional robusta, los comportamientos alejados del promedio (las colas de la distribución) son sustrato para la selección natural, lo cual facilita la adaptación a nuevos ambientes. Como sugieren los resultados de la Figura 18, el sistema de señalización podría modular la plasticidad del fenotipo y por lo tanto ejercer control sobre su propio potencial evolutivo. Aquí entra una pregunta fundamental en biología ¿Es el potencial evolutivo un fenotipo? De ser así, ¿está también expuesto a fuerzas evolutivas? Es decir, ¿Cómo evoluciona la evolvabilidad? Estas preguntas, por demás interesantes, van más allá de los objetivos de este proyecto. Sin embargo, el sistema de señalización de Bacillus subtilis es un buen modelo para abordarlas experimentalmente en el laboratorio y teóricamente con modelos como el propuesto en este trabajo.
A B
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13. Probabilidad e Información Las tecnologías de información actuales funcionan gracias a los principios propuestos por Shannon como parte de lo que ahora se conoce como Teoría de la Información. Si bien, esta ha sido ampliamente utilizada para el diseño de sistemas digitales de comunicación, no se ha aplicado directamente para cuantificar la información biológica. A grandes rasgos, Shannon propone que la información es una función de la probabilidad de observar un evento (un símbolo de un alfabeto, por ejemplo) dado un modelo (la distribución de probabilidad para todos los posibles símbolos). Sin embargo, tanto probabilidad como información son dos conceptos abstractos de los cuales se pueden encontrar múltiples definiciones, dependiendo del campo de estudio del que se esté hablando. En el contexto biológico, las interacciones moleculares tienen un componente estocástico, y por lo tanto el procesamiento de información ocurre en un ambiente estocástico. Es decir, en sistemas moleculares también debe existir una estrecha relación entre probabilidad e información. El modelo de toma de decisión propuesto en este proyecto, define la decisión como una función de probabilidad. El sistema de señalización controla la proporción de esporas en la población, i.e., la probabilidad de que una célula individual se comprometa a esporular. En resumen, dos aspectos fundamentales del proyecto son: 1) La información del ambiente es integrada a través del flujo de fosfatos en el phopshorelay y se colapsa en una distribución de probabilidad, . 2) La información contenida en es decodificada por las funciones cis (e.g., umbrales de activación) para generar la actividad transcripcional del gen regulado y definir la proporción de esporas. Como corolario, si bien determina la organización a nivel poblacional, su dinámica es controlada a nivel molecular. De esta manera, la distribución de probabilidad representa una interface entre dos escalas de organización. Es entonces claro que la información, de alguna manera, se puede representar como probabilidades. Otra forma de decirlo sería que la información de un sistema puede ser entendida por las propiedades estadísticas del mismo. Intuitivamente podemos pensar, ¿Qué tanto conozco acerca del comportamiento del sistema?, y en base a esto, ¿qué tanto puedo predecir su futuro comportamiento? Desde la perspectiva de un sistema vivo, ¿Qué tanta información tiene el sistema sobre el ambiente? En relación con estas preguntas, Shannon define la información en términos de una reducción de la incertidumbre asociada a un sistema, es decir, entre menos incertidumbre exista sobre el comportamiento de un sistema, más información se tiene de éste. Es entonces intuitivo pensar que los sistemas biológicos intentarán reducir la incertidumbre asociada al ambiente para determinar el curso de acción que les permitirá sobrevivir en el futuro. Estas ideas se pueden condensar en la propuesta de que los sistemas vivos realizan algún tipo inferencia sobre las propiedades estadísticas del ambiente. Si bien no hay una clara forma de cuantificar la información, la teoría de probabilidades y las propiedades estocásticas, tanto del ambiente como de los sistemas moleculares, sugieren que las ideas de Shannon podrían extrapolarse a los sistemas vivos. Sin embargo, esta teoría podría no ser suficiente para describir la complejidad observada en la dinámica de la información biológica. Es importante remarcar que al entrar en un espacio de probabilidades se pierde la noción de “escala”, es decir, diferentes sistemas podrían presentar el mismo comportamiento estadístico. Sin embargo, es esta propiedad de las probabilidades lo que tal vez les confiere su potencial para codificar información. Los resultados de este proyecto sugieren una forma de procesar información que depende sólo de la función de probabilidad , más aún, esta distribución comunica dos escalas de organización: molecular y poblacional. La distribución se genera por la dinámica del sistema molecular, pero sólo adquiere significado en la escala poblacional. Es decir, la función de probabilidad contiene información potencial, este mismo concepto de información potencial es al que se refiere Shannon en su teoría.
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Por último, no sólo conecta la escala molecular y poblacional, sino que interacciona directamente con el ambiente de diferentes formas. Primero, los individuos que No decidan esporular seguirán diferentes programas de respuesta a estrés para seguir enfrentando al ambiente. Si la proporción de esporas no es adecuada, la población podría desaparecer. Segundo, aquellos individuos con altos o bajos niveles de activación en Spo0A, podrían presentar adecuación diferencial en ciertas circunstancias y por lo tanto ser favorecidos por medios de selección natural. Tercero, la variabilidad de afecta directamente los procesos de deriva génica, i.e., las fluctuaciones en los alelos de la poblaciones debidas puramente a fluctuaciones aleatorias. Como ya se discutió antes, el ambiente y Bacillus subtilis son dos sistemas que están interactuando por medio del intercambiando de materia, energía e información. Los resultados presentados en este proyecto sugieren que la dinámica de la información ocurre a través de . Es interesante proponer un modelo en el que los módulos del sistema sean representados por distribuciones de probabilidad que interaccionan entre sí. Este podría ser el primer paso hacia una teoría cuantitativa de la información en sistemas moleculares.
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Conclusiones y Perspectivas
La toma de decisiones en sistemas biológicos es la característica esencial que les permite interactuar con el ambiente. En bacterias, esta interacción es mediada en su mayoría por los Sistemas de Dos Componentes (TCS, por su nombre en inglés) y las redes de regulación genética. En este trabajo se creó un modelo para el sistema de esporulación de Bacillus subtilis con el objetivo integrar la señalización y la regulación genética y entender la esporulación como un proceso de toma de decisión. El proceso de esporulación es altamente regulado por un sistema de señalización conocido como phosphorelay, derivado de la familia de TCS pero con componentes adicionales y múltiples ciclos de retroalimentación. El problema que Bacillus subtilis enfrenta se resume como el siguiente: Dadas las condiciones ambientales ¿Cuál es la proporción de esporas necesaria para contender con el ambiente y sobrevivir como población? Es decir, esta bacteria presenta un nivel de organización poblacional que, como se discutió ampliamente en este proyecto, es controlado a nivel molecular. Esta reconciliación entre diferentes escalas de organización es actualmente uno de los grandes retos en biologías de sistemas
El modelo desarrollado en este proyecto propone que el sistema de esporulación funciona modulando la proporción de esporas al controlar la dinámica de la distribución poblacional de los niveles de activación de Spo0A, . En base a previas observaciones experimentales y los resultados del presente modelo, se propone que el sistema no sólo tiene potencial de controlar los niveles promedio de activación sino la dinámica de toda la distribución . Se definieron las propiedades estadísticas de y se discutió ampliamente su relevancia biológica. En conjunto, los resultados de este proyecto sugieren una definición de fenotipo que involucra no sólo el valor promedio de los niveles de expresión y la desviación estándar, sino también el sesgo y la kurtosis, dos momentos estadísticos que resultaron ser esenciales para caracterizar la dinámica poblacional. En el contexto de toma de decisiones, la probabilidad de esporular es la decisión del sistema. Si bien este modelo es específico para el sistema de Bacillus subtilis, estudios en humanos [Teglás, 2011], y en sistemas de señalización tanto eucariontes como procariontes [Losick, 2008], sugieren que el componente probabilístico en la toma de decisiones en sistemas vivos podría ser una estrategia general para contender con la incertidumbre asociada al ambiente. En sistemas de procesamiento de información, la decisión tomada representa el fenotipo del sistema y como tal estará sujeto a selección por adecuación diferencial (selección natural). En biología es común pensar que a través de la evolución, algunos fenotipos han logrado alcanzar un óptimo funcional. Sin embargo, para un sistema de procesamiento de información no es trivial definir cuál es el problema que se está resolviendo y por lo tanto es difícil definir criterios para caracterizar óptimos funcionales. Más aún, la incertidumbre asociada al ambiente impone una condición en dónde el sistema posiblemente no puede alcanzar un óptimo ya que el ambiente probablemente cambiará pronto. Esta es la razón por la que el mecanismo de bet-hedging es tan recurrente en sistemas biológicos. En este trabajo se expusieron mecanismos por los cuales el phosphorelay y, en general, los sistemas de dos componentes pueden controlar la expresión genética utilizando estrategas bet-hedging. Bajo este concepto, el sistema utiliza estrategias que incluyen un componente estocástico donde los fenotipos son asignados en proporciones definidas para aumentar la adecuación de la población si el ambiente cambiara repentinamente. En este trabajo se reconciliaron estos conceptos utilizando el sistema de Bacillus subtilis como modelo y se proponen varias ideas que podrían ser generalizadas a otros sistemas moleculares de procesamiento de información.
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Finalmente, los resultados de este proyecto dejan muchas preguntas abiertas, será necesario definir un marco cuantitativo que permita integrar los conceptos de Ambiente, Genotipo, Fenotipo, Fitness y Potencial Evolutivo; dentro de un contexto de procesamiento de información. Esto definitivamente será el siguiente gran reto de la biología para los próximos años y requerirá de una reforma multidisciplinaria, la re-definición de muchos actuales conceptos y la definición de otros nuevos.
Perspectivas La actividad de KinA controla la dinámica del phosphorelay. Con respecto a los resultados del modelo presentado aquí, es necesario llevar a cabo estudios experimentales para determinar hasta qué punto lo observado en el modelo corresponde con el sistema real. Primero, es necesario manipular el control por retroalimentación en kinA. El modelo sugiere que este mecanismo puede afectar la dinámica poblacional al cambiar la constante de afinidad del sitio de unión por Spo0A. Experimentalmente, esto se puede lograr haciendo mutaciones en el sitio de unión y midiendo los niveles poblacionales de expresión. Es importante considerar que mecanismos adicionales podrían también afectar la dinámica de KinA, por ejemplo a nivel de regulación post-traduccional se sabe que las proteínas Kip interaccionan con KinA inhibiendo su actividad (Hoch, 1997). Por lo tanto, es necesario probar si es la actividad de KinA y no sólo los niveles de expresión lo que controla la dinámica del phosphorelay. Los ciclos de retroalimentación transcripcional Losick en 2010, modificó los ciclos de retroalimentación del phosphorelay y encontró que no afectan significativamente la dinámica de Spo0A, sin embargo, propone que podrían trabajar como mecanismos de regulación temporal (Chastanet, 2010). Los resultados de este proyecto proponen que las interacciones en la red, podrían no tener efectos en los niveles promedio de Spo0A pero sí en otras características de la distribución (sesgo, kurtosis, varianza) por lo tanto es necesario revisar experimentalmente los efectos de los ciclos de retroalimentación a nivel poblacional. Algunos de estos ciclos ocurren no directamente a través de Spo0A sino como resultado de la activación del factor sigma H, esto no se incluyo en el presente modelo y podría ser uno de los pasos a seguir a manera de extensión. Un modelo completo de la señalización en Bacillus subtilis Si bien el presente trabajo describe la dinámica de esporulación, otros destinos celulares son posibles, por ejemplo: competencia o células formadoras de matriz extracelular. El proceso de toma de decisión involucra considerar las alternativas antes de comprometerse a esporular. Es necesario entonces, integrar el phosphorelay con los módulos de señalización involucrados en otros destinos celulares para así poder entender la red de señalización como una red tomadora de decisiones capaz de especificar múltiples destinos celulares en proporciones definidas. La modularidad en la que se diseñó el actual modelo (en analogía con la modularidad natural en las redes biológicas) permite integrarlo con otros sub-sistemas, por ejemplo para el destino celular de competencia. De esta forma se podría abordar la pregunta de cómo se comunican los módulos en un sistema de información molecular. ¿Cómo se transfiere información de un módulo a otro? Y ¿Y hasta qué punto la funcionalidad de un módulo depende de la información proveniente de otro? Re-definiendo el fenotipo y el potencial evolutivo Por último, la definición de fenotipo presentada en este trabajo se basa completamente en las propiedades estadísticas del sistema. Dado que las fluctuaciones estocásticas están presentes no sólo a nivel molecular,
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sino en cualquier interacción de un sistema vivo con el ambiente, es de esperarse que la definición del fenotipo como una distribución de probabilidad pueda ser más general. Más aún, para cuantificar el potencial evolutivo de un sistema, es necesario entender cuál es el comportamiento a nivel poblacional, ya que si bien los cambios evolutivos ocurren a nivel de individuo, sus efectos y la probabilidad de que se fijen a través del tiempo, dependen de la dinámica poblacional. En este trabajo se utilizó la distribución de probabilidad no sólo como fenotipo sino como un objeto abstracto capaz de describir el procesamiento de información en el phosphorelay. Sin embargo, un procedimiento analítico del sistema es necesario para entender completamente la dinámica de la distribución. Es decir, es necesario resolver las ecuaciones estocásticas que describen el sistema para así entender qué parámetros afectan la distribución y cómo esto podría afectar la dinámica de la población en un contexto evolutivo. Hacia una teoría de la información biológica A lo largo de los resultados se discutieron varias preguntas que no fue posible abordar en este proyecto. El modelo presentado en este trabajo nos permitió no sólo entender la dinámica de toma decisiones sino que abrió un panorama sobre las siguientes preguntas necesarias para entender el procesamiento de información en los sistemas moleculares. Si bien estas preguntas se presentaron a lo largo de la sección de resultados y discusión, aquí se intentará sintetizar los puntos más importantes. Primero, sentar las bases para definir la información a nivel molecular. Un estudio reciente llevado a cabo por Swain y colaboradores (Bownsher y Swain, 2012), cuantifica las fuentes de variabilidad en la dinámica de las interacciones bioquímicas utilizando teoría de probabilidad y propiedades del Valor Esperado. De esta forma es posible entender qué proporción de la variabilidad surge de qué proceso molecular. Más aún, en este trabajo también se propone la primera medida para cuantificar la varianza informacional. Este trabajo podría sentar los fundamentos para generar una unidad universal para cuantificar la información en sistemas moleculares. Cuantificando el poder computacional de los sistemas de procesamiento de información. Más aún, una vez que se desarrolle un marco cuantitativo para el procesamiento de información, se podrá también cuantificar el potencial de un sistema, es decir, el poder computacional. ¿Qué estructuras en la red optimizan el flujo de información? ¿Cuál es la complejidad del problema que una red está resolviendo? ¿Se puede describir una red como un algoritmo, que contiene instrucciones y estructuras de control? ¿Podemos programar estas “computadoras”? Estas preguntas, si bien por el momento están fuera de lugar, es muy probable que esta analogía computadora-red, sea cada vez más aceptada e incluso podría ser necesaria para entender la naturaleza y evolución del procesamiento de información.
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