Universidad Nacional del SantaFacultad de Ciencias

Departamento de Biología, Microbiología y Biotecnología

Genoma Eucariótico

Blga. Pesq. Eliana Zelada Mázmela

Blgo. Acuic. Carmen Yzásiga Barrera

Organismos Eucariotas

a) Tendencia a la especialización celular espacios genéticos

b) Distribución del material genético en múltiples cromosomas no homólogos

c) Aparición de CHON

d) Establecimiento de ciclos en el grado de condensación

e) Aparición del aparato mitótico distribución de copias idénticas a las células hijas

f) Diferenciación zonal en regiones con grado distintos de condensación: eucromatina y heterocromatina

Dodge: Mesocarionte:

• Zonas de E-H: clorofitas pluricelulares y rodofitas

• Sucesión condensación – descondensación: fitoflagelados

• Aparato mitótico rudimentario, sin centriolo: amebas

• Desarrollo de aparato mitótico: hongos y protozoos

El puente en algas, protozoos y hongos, teniendo mayor importancia los dinoflagelados:

• Con membrana nuclear pero que no desaparece durante la división

• No formación de huso

• CHON no histonas

Cromosoma Eucariota

Término propuesto por Waldeyer, haciendo énfasis en la continuidad entre la cromatina interfásica y el cromosoma metafásico. Material genético organizado estructura en forma de filamento, se encuentra en el núcleo, contiene a los genes. ADN + proteínas

Deriva del griego CROMO = Color SOMA = cuerpo

Cromatina: Sustancia que se tiñe

Forma

Forma del cromosoma obedece a su función:

a) Interfase: Presenta la forma de fibra nucleosómica o cromosómica. No está empaquetado (uncoiled). Se tiñe débilmente

ADNd + CHON histonas

b) División: Empaquetado: cromosomas

material genético organizado

ADN, histonas y CHON no histónicasInterfase

División

Partes:

En el caso de la especie humana, existen cinco pares de cromosomas que poseen regiones NOR, los pares  13, 14, 15, 21 y

22.

a) Telómero: Son los extremos de los brazos cromosómicos con estructura especial que protege al cromosoma de su degradación por los extremos y que se unan con otros. Poseen extremos 3' simples constituidos por una secuencia corta rica en G que está repetida en tándem cientos de veces. Durante la replicación se pierden de 50 a 200 nucleótidos en cada ciclo de división celular. Su desgaste impide su función protectora: problemas en la segregación se activan los mecanismos de apoptosis.

Modelo de estructura de los telómeros

LE 16-19

1 µm

Organismo Secuencia repetida

Tetrahymena 5' TTGGG 3'

Paramecium 5' TTGGGG 3'

Tripanosoma 5'TTAGGG 3'

Arabidopsis 5' TTTAGGG 3'

Homo 5' TTAGGG 3'

La telomerasa: En el caso de las células germinales y embrionarias, existe una enzima específica, la telomerasa, que es capaz de restaurar la secuencia del telómero.

Células sin telomerasa: < número de divisionesb) Centrómero: Zona por la que el cromosoma interacciona con las fibras del huso acromático en las anafases mitóticas y meióticas y que es responsable de los movimientos cromosómicos.

Las estructuras centroméricas que interaccionan con las fibras del huso se denominan cinetocoros. En la estructura del centrómero también intervienen proteínas centróméricas. 

Es la constricción primaria y aparece menos teñida que el resto del cromosoma. Hay tres regiones conservadas

Región I (8 pb)

Región II (76-86 pb)

Región III (25 pb)

PuTCACPuTG

rica en pares AT (87-95%)

TGTTT(T/A)TGNTTTCCGAAANNNAAAA

Palíndromo

11 pb

Altamente conservada

conservada

Su función dependería

de su longitud

En realidad el ADN centromérico evoluciona con gran rapidez, pero sigue siendo lo suficientemente estable para realizar su función paradoja centrómero.

Es un locus sobre el cual actúa el aparato de división celular

No han sido totalmente secuenciados grandes agujeros negros de ADN

Presenta dos CHON importantes: H3C y CEN-C

http://ca.wikipedia.org/wiki/Imatge:Cromosoma_detallat.png

Características mínimas para supervivencia

• Telómero supervivencia o integridad

• Centrómero segregación

• Origen replicación

Clasificación

a) Por la posición del centrómero

Metacéntrico

Submetacéntrico

Acrocéntrico

Telocéntrico

Presencia de secuencias centroméricas

b) Por el número de brazos: Unibraquiales, bibraquiales

c) Por su simetría transversal:

Simétricos: Metacéntricos

Asimétricos: Submetacéntricos, acrocéntricos

d) De acuerdo al momento de división:

- Con una cromátida - Con dos cromátidas

Anafase, telofase

Interfase: G1

Profase, metafase

Interfase: S, G2

La actividad génica sólo se da cuando la fibra nucleosómica se descondensa a 100 A . Conforme

se condensa, los genes se van silencionando

e) Por la función: - Autosomas - Sexuales

Tamaño: Variable

Grandes: 10 a 12

u

Pequeños

< 5 u

Número: Número constante en todas las células de un organismo y en todos los individuos de la misma especie.

Un juego cromosómico, haploide, n

Dos juegos cromosómicos, diploide, 2n

Especies con pocos cromosomas: 2n = 2 (hormigas)

Especies con muchos cromosomas: 2n = 436 (Lysandra atlantica)

El número no tiene valor evolutivo: Muntiacus

2n = 6

2n = 46

OrganismoNº Cromosomas

(2n)Organismo

Nº Cromosomas (2n)

Hombre, Homo sapiens 46 Roble blanco, Quercus alba 24

Chimpancé, Pan troglodytes 48 Pino amarillo, Pinus ponderosa 24

Mono rhesus, Macaca mulata 48 Cerezo ácido, Prunus cerasus 32

Caballo, Equus caballus 64 Col (repollo), Brassica oleracea 18

Asno, Equus asinus 62 Rábano, Raphanus sativus 18

Perro, Canis familiaris 78 Guisante de jardín, Pisum sativum 14

Gato, Felis domesticus 38 Guisante, Lathyrus odoratus 14

Ratón domestico, Mus musculus 40 Frijol, Phaseolus vulgaris 22

Rata, Ratus norvegicus 42 Pepino, Cucumis sativus 14

Zarigüeya, Didephys virginiana 22 Algodón, Gossypium hirsutum 52

Pollo, Gallus domesticus 78 Patata, Solanum tuberosum 48

Pavo, Meleagris gallopavo 82 Tomate, Solanum lycopersicum 24

Rana, Rana pipiens 26 Tabaco, Nicotiana tabacum 48

Platypoecilus maculatus 48 Trigo candeal, Triticum aestivum 42

Estrella de mar, Asterias forbesi 36 Trigo duro, Triticum durum 28

Gusano de seda, Bombix mori 56 Cebada, Hordeum vulgare 14

Mosca domestica, Musca domestica 12 Centeno, Secale cereale 14

Mosca fruta, Drosophila melanogaster 8 Arroz, Oryza sativa 24

Mosquito, Culex pipiens 6 Boca de dragón, Anthirrinum majus 16

Cucaracha, Blatta germanica 23, 24 Levadura, Saccharomyces cerevisiae 18

Cangrejo ermitaño, Eupagurus ochotensis 254 Alga verde, Acetabularia mediterranea 20

Nivel Interno

Cada cromátida está constituida por una fibra elemental: cromonema producto final del enrollamiento en hélice de una FN, tiene un diámetro de 200 – 300 A

En profase, muestra unos abultamientos: cromómeros que son enrollamientos localizados de cromatina con CHON no histonas. Con posición y tamaño constante.

Ultraestructura

Presenta una estructura repetitiva en forma de cuentas de collar, unidos por filamentos de ADN: subunidades que se repiten.

Al digerir con endonucleasa, se obtuvo de diferentes tamaños, el más pequeño de 200 pb, es decir c/200 pb queda sin histonas

100 A

Estructura del nucleosoma

Disposición del DNA:146 pares de bases se enrollan dando 1,8 vueltas en torno a un octámero de histonas

Cada vuelta requiere 80 pares de bases: dos secuencias situadas a esta distancia se encuentran muy próximas en torno a un nucleosoma

Los puntos de entrada y salida de la doble hélice en torno al octámero de histonas están muy próximos

54 pares de bases separan un octámero de histonas con su DNA enrollado de los octámeros contiguos

Total: 200 pares de bases

Organización del octámero de histonas

1 Tetrámero H3-H4

2 Dímeros H2A-H2B

Los genes para las histonas se encuentran agrupados en nichos, que se repiten decenas o centenas de veces (erizo de mar). Cada grupo contiene un orden de los genes para histonas: H1-H2A-H3-H2B-H4.

Genes ricos en pares G-C codifican para Lys y Arg, separados por secuencias ricas en A-T.

CHON básicas, ricas en Lys y Arg, con un elevado conservadorismo evolutivo y que interacción con el ADN formando el nucleosoma. La v del cambio evolutivo se mide como el Nº de cambios por cada 100 AA por cada 100 millones de años. También existen CHON que son específicas de tejido como es la histona H5 muy rica en Lys (25 moles%) específica de eritrocitos nucleados de vertebrados no mamíferos, y de las histonas del esperma. Reemplaza a H1

Genes para las histonas

Histona

Nº residuo

sPm

Contenido en moles % de Lys/

ArgModificación

V. cambio evoluti

voLys  Arg

H1 213 21.000

27,7 1,4 19,78 Fosforilación 4

H2A

129 13.900

10,9 9,3 1,17 Fosforilación, acetilación

1

H2B

125 13.774

15,2 6,1 2,49 Fosforilación, acetilación

1

H3 135 15.273

9,6 13,3 0,72 Acetilación, metilación

fosforilación

0,1

H4 102 11.236

10,8 13,7 0,79 Acetilación, metilación

fosforilación

0,06

ADN HISTONAS NO HISTONAS ARN

1 1 0,5 - 1,5 0,05

Composición química de la cromatina (en peso )

Varía en los diferentes

cromosomas

1/3 1/3 1/3

Estructura de cromatina

Varios niveles de enrollamiento:

• Nucleosoma: 100 A : 6

• Solenoide: 300 A: 40

• Lazos o dominios: 3000 A

Componente básico de

eucromatina y heterocromati

na

Formación del solenoide, papel de la H1

Regiones de fijación a la matriz (SAR)

http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Cromoeuc/COMPACT.BMP

Razón empaquetamie

nto: 40

Cada micra a lo largo de la fibra contiene 40 micras de ADN

Razón de empaquetamiento: Describe la compresión global del cromosoma. Se calcula dividiendo la longitud del ADN/longitud de la unidad en la que está contenido:

4,6 x 107 pb = 14000 u = 1,4 cm

Longitud del ADN

2 u

Longitud del cromosoma

14000/2 = 7000

Se estima que los cromosomas mitóticos están de 5 a 10 veces más empaquetados que la cromatina interfásica, lo que significa un empaquetamiento de 1000 y 2000

La estructura de la cromatina no se pierde durante la replicación

Tipos de cromatina

a) Eucromatina: Siguen un ciclo de condensación y descondensación. La fibra tiene 10 nm. Se considera hasta 100 nm de enrollamiento. Se encuentran los genes activos, los que transcriben una minoría: 10 nm su localización aquí es necesaria pero no suficiente.

Empaquetamiento global de 1000

b) Heterocromatina: Permanece condensado aún en interfase. Cerca de los centrómeros. >1000 a 10000 empaquetamiento

• En una misma fibra puede haber eucromatina y heterocromatina: diferentes grados de condensación.

• Las regiones de heterocromatina pasan por diferentes grados de condensación en la alternancia entre interfase y mitosis.• Facultativa: Sólo se condensa en ciertos tipos celulares o en ciertos momentos del desarrollo. Cromosoma X.

• Constitutiva: Aparece condensada en todos los tipos celulares: ADN altamente repetitivo. Protege eucromatina, se replica tardíamente.

Cromosoma organelo dinámico para el empaquetamiento, replicación, segregación y expresión de la información de una larga molécula de ADN Los componentes: Una molécula de ADN y muchos

tipos de CHON.

Estructura cromosómica: Interacción variable entre ADN y CHON que crea diferentes niveles de compactación.

Elementos especializados: segregación, replicación, etc.

El grado de empaquetamiento influencia La actividad génica.

El ADN en la escala evolutiva

Los análisis permiten afirmar que en general a medida que se incrementa la complejidad funcional y estructural de los seres vivos se incrementa su contenido de ADN, habiendo excepciones a la regla

Especie con menor contenido en ADN de cada grupo

taxonómico

Variación de la cantidad de ADN (pb) en diferentes grupos de

especies

Grupo Taxonómico

Especie Valor C (pb)

Algas Pyrenomas salina 6,6 x 105

Mycoplasma Mycoplasma pneumoniae 1,0 x 106

Bacterias Escherichia coli 4,2 x 106

Levaduras Saccharonyces cerevisiae 1,3 x 107

Hongos D. discoideum 5,4 x 107

Nematodos Caenorhabditis elegans 8,0 x 107

Insectos Drosophila melanogaster 1,4 x 108

Aves Gallus domesticus 1,2 x 109

Anfibios Xenopus laevis 3,1 x 109

Mamíferos Homo sapiens 3,3 x 109

El valor C se define como la cantidad de ADN por genoma haploide en estado de una cromátida (en fase G1).

Paradoja del valor C

Hombre = C = 23

el valor C sería la cantidad de ADN de las 23 cromátidas de un gameto humano

Falta de correspondencia entre el valor C y la complejidad filogenética, debido a que en eucariotas la mayor cantidad del ADN es no codificante, o sin función demostrable, ya sea entre genes o intragenes.¿ ?

Clasificación de ADN

a) Genes codificadores de proteínas

• Genes Solitarios: Comprende alrededor del 25 – 50%, genes solitarios o de secuencia única. Constituyen una unidad de transcripción simple.

• Genes Duplicados: A menudo son copias parecidas pero inexactas de un gene. Parece que se originaron a partir de un gene ancestral. Probablemente constituyan la mitad del ADN codificador.

Familia de genes: Conjunto de genes duplicados que codifican CHON con secuencias de AA similares pero no idénticas, pero con funciones similares: familia de CHON: proteincinasas, inmunoglobulinas, factores de transcripción, cadena pesada de miosina, etc.

Pseudogenes: transcripción inversa, desviaciones de secuencias.

b) Genes repetidos en tandemCodifican para ARNt, ARNr, histonas. Las regiones en tandem codifican para CHON idénticas o casi idénticas o RNA funcionales.

Son necesarios para cubrir la gran demanda de sus transcritos.

c) DNA repetidoDispersas por el genoma entre las secuencias de copia única.• DNA de secuencia simple: La mayoría está compuesta por repeticiones en tandem de secuencias de 5 – 10 pb; 20 a 200 pb, extendiéndose las repeticiones hasta 105. Se suele llamar ADN satélite. Aparece cerca de los centrómeros y telómeros. Suelen ubicarse en lugares específicos de un cromosoma permitiendo su identificación. Dentro de una sp. Están muy conservadas las secuencias de nucleótidos, pero son comunes las variaciones en el número de repeticiones huellas dactilares.

• DNA con repeticiones moderadas: Incluyen secuencias de 10 a 100 pb que se repiten varias veces en el genoma. Incluye los VNTR, que pueden estar repetidas un número determinado de veces en un punto determinado del cromosoma, indicando su variación diferencias

• Transposones: también es posible encontrar en los genomas de especies eucariontes secuencias o elementos que pueden cambiar de posición dentro del genoma, transposones. Algunos genomas muestran múltiples copias de estos elementos genéticos móviles, o versiones truncadas de ellos dispersas a lo largo del genoma

Son cromosomas desespiralizados que se asocian en pares homólogos. Reciben el nombre lumpbrush o escobillones, son muy activos en la síntesis de RNA y se produce mucha síntesis de ribosomas y proteínas necesarias para el crecimiento del ovocito.

Cromosomas Plumosos

Cromosomas Gigantes Son cromosomas gigantes que contienen múltiples copias no separadas de DNA. Replicado. Chromocentre is el punto donde polytene chromosomes appear to be attached. Along the length of the  polytene chromomes several features such as bands, puffs and Balbiani rings are present

Otorga una > precisión en la individualización de los cromosomas, facilitando su agrupamiento y clasificación morfológica: la determinación de aberraciones cromosómicas de importante incidencia en animales con problemas de reducción de la fertilidad: la localización de genes que confluyen al mapeo genético. Los bandeos cromosómicos hacen posible que se tenga un mayor conocimiento acerca de la estructura cromosómica y de los reordenamientos que se producen en las distintas alteraciones tales como: fusiones y fisiones céntricas, translocaciones recíprocas y en tandem; inversiones peri y paracéntricas; delecciones; duplicaciones; constricciones secundarias.; gaps, fracturas cromosómicas, etc.

Bandeo cromosómico

Los bandeos dinámicos: Son técnicas que implican la incorporación de una base análoga, bromo-desexiuridina (BrdU), en el ADN durante la fase S.. Se denomina también bandeo de replicación debido a la relación existente entre el tiempo de incorporación del BrdU y el patrón de replicación.

Los bandeos morfológicos: se obtienen basándose en técnicas inherentes a la heterogeneidad de la cromatina.

Estos bandeos pueden ser a su vez clasificados en: técnicas de tinción diferencial, métodos de tinción selectiva, coloraciones con fluorocromos específicos aislados o combinados con colorantes no fluorescentes, y tinciones con anticuerpos fluorescentes.

Tipos

Cuando se incorpora BrdU durante la fase de replicación temprana se obtiene un patrón de bandeo R destacándose las regiones ricas en G-C. Luego de realizada esta técnica, los cromosomas pueden visualizarce utilizando distintos métodos de tinción que emplean colorante tales como el Giemesa o el naranja de acridina o utilizando anticuerpos específicos.

Si se incorpora la base análoga durante la fase tardía de replicación se obtiene un patrón de bandas G, destacándose las zonas de predominio de secuencias A-T. Los cromosomas pueden ser visualizados utilizando diferentes métodos de tinción.

Nomenclatura de bandeos morfológicos.

QFQ: Bandas Q por fluorecencia usando quinacrina: Regiones ricas en A-T. Se traduce en diferencias de intensidad fluorescente que se emite bajo la luz UV.

GTG: Bandas G por tratamiento enzimático con tripsina utilizando Giemsa. Coincide con el Q

RFA: Bandas R por fluorecencia usando naranja de acridina. Coincide con zonas ricas en G-C y a zonas de replicación temprana

CBG: Bandas C por hidróxido de bario utilizando Giemsa. Sirve para detectar heterocromatina constitutiva, derivándose que ésta se encuentra cerca del centrómero y telómero y en mayor concentración en cromosomas sexuales.

RHG: Bandas R mediante desnaturalización térmica utilizando Giemesa.

THG: Bandas T por desnaturalización térmica empleando Giemesa.

Nomenclatura de bandeos dinámicos.

GBG: Bandas G por incorporación de BrdU utilizando Giemsa.

RBA: Bandas R por incorporación de BrdU empleando naranja de acridina.

RBG: Bandas R por incorporación de BrdU utilizando Giemsa.

GB-AAu: Bandas G por incorporación de BrdU empleando anticuerpos específicos unidos a partículas deoro coloidal.

RB-AAu: Bandas R por incorporación de BrdU usando anticuerpos específicos unidos a partículas de oro coloidal.

Bandeo G en paciente con Síndrome de Klineferter XXY

Translocaciones con bandas C

FISH de Aegilops speltoides

Metafase mitótica con bandeo C

La FISH es una nueva tecnología que utiliza sondas de DNA marcadas para detectar o confirmar anomalías génicas o cromosómicas que están más allá del poder de resolución de la citogenética de rutina. Primero, la muestra de DNA (cromosomas metafásicos o núcleos en interfase) se desnaturaliza. Luego se le añade la sonda de interés, marcada con fluorescencia, que se hibridará al DNA de la muestra en el sitio diana, en el proceso denominado templado, donde se vuelve a formar una doble hélice. La señal de la sonda se observa mediante un microscopio de fluorescencia y la muestra de DNA se clasifica según la presencia o ausencia de la señal. Puede detectar microdelecciones específicas, pero su éxito depende del síndrome en particular:La sonda es específica para el gen defectuoso, como en el Síndrome de Williams, donde se ha encontrado una deleción en el gen de la elastina en el 96% de los pacientes con diagnóstico confirmado

Fluorescence in situ hibridization FISH

Fluorescence in situ hibridization FISH

Aplicación del FISH

Éste es un ejemplo de la prueba de aneuploidía, donde se han combinado núcleos en interfase procedentes de células de

fluido amniótico con sondas de DNA para los cromosomas 13, 18, 21, X e Y. El núcleo de la izquierda se ha hibridado con

sondas para los cromosomas 13 (verde) y 21 (rojo). El núcleo de la derecha se ha hibridado con sondas para los cromosomas 18

(azul claro), X (verde) e Y (rojo). Puesto que hay dos señales correspondientes a las sondas de 13, 18 y 21, y una sola señal

de cromosomas X e Y, este feto es un varón, normal con respecto a la prueba de aneuploidía. 

Genes estructurales con secuencias interpuestas de los tipos

"entremezclado" y "Tándem". Tomado de Devlin, T.M (Ed). Bioquímica.

Antes pensábamos que nuestro futuro

estaba en las estrellas. Ahora

sabemos que está en nuestros genesJames Watson