UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS · querida como nunca antes y a Luchito Alanya con todo mi cariño. A Mary Gálvez y Judith Toledo, mis maestras y amigas a las que siempre

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS Fundada en 1551

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

E.A.P. DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

BIOTECNOLOGÍA Y METABOLITOS SECUNDARIOS EN Lepidium peruvianum Chacón. “ MACA”

TESIS :

Para optar el Título Profesional de :

BIÓLOGO

Con mención en :

GENÉTICA

AUTOR

Ángela Renee Arias Ramírez

LIMA – PERÚ

2002

Este trabajo se realizó en el Laboratorio de Recursos Genéticos y

Biotecnología de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad

Nacional Mayor de San Marcos y en el Laboratorio del Dr. César

Fuertes Ruitón en el Instituto de Química Orgánica Aplicada a la

Farmacia de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad

Nacional Mayor de San Marcos.

AGRADECIMIENTOS

Al profesor Rolando Estrada, por todo el apoyo y cariño que me brindó

mientras estuve en el LRGB.

Al Dr. César Fuertes, investigador del Instituto de Química Orgánica

Aplicada a la Farmacia, de la Facultad de Farmacia y Bioquímica sin

cuya asesoría, apoyo y enseñanzas este trabajo no hubiera podido

llevarse a cabo.

A mis padres, Juan y Hortensia por su amor, apoyo y paciencia.

A mis hermanos Marina, Nina, Juana. Lena, Paul y Eva por su amor

y apoyo incondicional.

A Juan Diego y Alessia que vinieron a iluminar nuestras vidas y

llenarlas de esperanza y alegría.

A mi mamá Eloy, a mi mamá Jessi y a mi papá Cesar, y a mis primos

aunque sería más adecuado decir hermanos.

A Verónica, Delcy y Enrique, por enseñarme a querer y a sentirme

querida como nunca antes y a Luchito Alanya con todo mi cariño.

A Mary Gálvez y Judith Toledo, mis maestras y amigas a las que

siempre llevo en el corazón y a Miles por su amistad sincera y su

entusiasmo contagiante.

A mis amigos de la Facultad de Ciencias Biológicas, en especial a

Nancy, Maggi, Miriam, María Esther, Ingrid, al profesor Mariano, a

la profesora Caleen Távara, y a todos los amigos que conocí en esta

casa de estudios y que no puedo enumerar por razones de espacio.

A mis amigos del LRGB, los “dinosaurios” César, Fredy, Rafo, Pepe,

Flor, Margarita, y Augusto que me hicieron sentir bienvenida y en mi

segundo hogar, a los que siguieron llegando: Héctor, Indira, Mariellix,

Alberto, Elisa, Gilmar, Roberto, Gerardo, Nancy, las profesoras

Vidalina y Yolanda para compartir preocupaciones y alegrías, los

chicos que hoy están empezando su camino en especial a Arturo, Alex,

Ivett y Joel .

INDICE

I.- RESÚMEN I.1.- ABSTRACT II.- INTRODUCCIÓN II.1.- OBJETIVOS

II.1.1.- GENERALES

II.1.2.- ESPECÍFICOS

III.- ANTECEDENTES

III.1.- DESCRIPCIÓN DE LA PLANTA

III.1.1.- CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA

III.1. 2.- DESCRIPCIÓN BOTÁNICA

III.1.3.- NÚMERO DE CROMOSOMAS

III.1.4.- DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA

III.1.5.- IMPORTANCIA NUTRICIONAL

III.2.- METABOLITOS SECUNDARIOS

III.2.1.- GLUCOSINOLATOS

III.2.1.1.- EL SISTEMA MIROSINASA – GLUCOSINOLATO

III.2.2.- ALCALOIDES

III.3.- CULTIVO DE TEJIDOS

III.3.1.- CULTIVO DE CALLOS

III.3.2.- HORMONAS Y REGULADORES DE CRECIMIENTO

III.3.2.1- AUXINAS

III.3.2.2.- CITOCININAS

III.3.3.- EL EXPLANTE

III.3.4.- CULTIVO DE TEJIDOS Y METABOLITOS

SECUNDARIOS

III.4.- CROMATOGRAFÍA

III.5.- ELECTROFORESIS EN GEL

IV.- MATERIAL Y MÉTODOS

IV.1.- INDUCCIÓN DE CALLOS

IV.1.1.- MATERIAL VEGETAL

IV.1.1.1.- DESINFECCIÓN

IV.1.1.2.- CONDICIONES DE CULTIVO

IV.1.2.- EXPLANTES

IV.1.3.- MEDIO DE CULTIVO PARA

LA INDUCCIÓN DE CALLOS

IV.1.4.- INDUCCIÓN DE CALLOS

IV.2.- DETECCIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS

IV.2.1.- EXTRACCIÓN Y DETECCIÓN DE GLUCOSINOLATOS

IV.2.2.- EXTRACCIÓN Y DETECCIÓN DE ALCALOIDES

IV.3.- DETECCIÓN DE MIROSINASAS

IV.3.1.- ELECTROFORESIS

IV.3.2.- EXTRACCIÓN DE LAS MUESTRAS

IV.3.3.- DETECCIÓN DE ACTIVIDAD

V.- RESULTADOS

V.1.- INDUCCIÓN DE CALLOS

V.2.- DETECCIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS

V.2.1.- GLUCOSINOLATOS

V.2.2.- ALCALOIDES

V.3.- DETECCIÓN DE MIROSINASAS

VI.- DISCUSIÓN

VI.1.- INDUCCIÓN DE CALLOS

VI.2.- DETECCIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS

VI.3.- DETECCIÓN DE MIROSINASAS

VII.- CONCLUSIONES VIII.- RECOMENDACIONES IX.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS X.- APÉNDICE

ABREVIATURAS IAA Ácido indol acético

IBA Ácido indolbutírico

NAA Ácido Naftalenacético

2,4D Ácido 2,4-diclorofenoacético

BAP Bencil amino purina

KIN Kinetina

ZEA Zeatina

2ip 2-isopentenidenina

BIOTECNOLOGÍA Y METABOLITOS SECUNDARIOS EN Lepidium peruvianum Chacón. “ MACA” Angela Renee Arias Ramírez. Derechos reservados conforme a Ley

Elaboración y diseño en formato PDF, por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM

CAPITULO I

RESÚMEN

Lepidium peruvianum Chacón (maca), es una crucífera altoandina, que crece a

entre los 3,500 y 4500 m.s.n.m. Originaria de la meseta del Bombón, en los

departamentos de Junín y Pasco; por sus cualidades medicinales y su alto valor

nutritivo, es una planta de alto interés económico, cuyo cultivo se ha extendido a

otras regiones de nuestro país. En el presente trabajo se estudió la susceptibilidad

de la especie a las técnicas del cultivo de tejidos como herramienta de producción

de metabolitos secundarios. Se realizó la inducción de callos en diferentes

explantes de L. peruvianum utilizando la auxina 2,4-D y la citoquinina Kinetina, en

un factorial de medios con diferentes concentraciones auxina/citoquinina. Se

obtuvieron callos en la mayoría de los medios usados, la relación de hormonas más

eficiente fue 1 µM auxina/citoquinina. Se evaluó la presencia de glucosinolatos y

alcaloides en los callos obtenidos y se compararon con muestras control de

hipocótilos de maca. Se observó la presencia variable de dos fracciones de

glucosinolatos en los callos, en la mayoría de los casos las manchas tuvieron una

coloración más intensa en los callos que en los controles. De otro lado se observó

una alta variabilidad en la presencia de alcaloides y otros metabolitos no

identificados en los callos obtenidos en este trabajo. También se evaluó

cualitativamente la presencia de mirosinasas en los callos obtenidos, observándose

bandas positivas en los callos y las muestras de plantas de maca.



ABSTRACT

Lepidium peruvianum Chacón, is a Cruciferae native from the Andes. It grows

between 3,500 and 4500 m. Original from the Bombón plateau, located at the

Peruvian localities Junín and Pasco. It became in a crop with a high economical

value, due its medicinal and nutritional properties. Actually, it is extended to other

regions of the country. The main objective of this research is to study the tissue

culture ability of the crop to use in vitro tissues as a tool for secondary metabolite

production.

Leaves, petioles, roots and hypocotils of L. peruvianum were tested as explants to

induce calli. Different concentrations of 2,4-D and Kinetin, in MS basic medium were

tested. Calli were induced in most of the media tested, the most efficient hormone

ratio auxin/citokinin was 1. It was evaluated the presence of glucosionlatos and

alkaloids in the callus induced and compared to maca hypocotils as control sample.

Two glucosinolatos fractions were obtained from calli analyzed. It was found one or

two fractions according to the callus and in most of the cases the concentration was

higher in callus than in control. In the other hand, it was observed a high variability in

the alkaloid fractions and other unidentified metabolites extracted from the calli

evaluated in this work.

It was also evaluated the presence of myrosinases in the calli studied, and it was

found positive bands either in callus as in maca hypocotils.



CAPITULO II

INTRODUCCIÓN

Lepidium peruvianum Chacón, "maca", es una crucífera calificada como una

de las raíces y tubérculos andinos (RTA) de más alto contenido proteico. Crece

entre los 3,500 y 4500 m.s.n.m (King, 1988). Originaria de la meseta del Bombón,

entre los departamentos de Junín y Pasco, es la única Brassicacea domesticada de

los andes y el único cultivo que reemplaza el cultivo de las papas amargas en esas

altitudes (regiones suni y puna de los departamentos de Junín y Pasco), soportando

condiciones ambientales extremas, como cambios de temperatura de 18° C a - 10°

C en un solo día, fuertes vientos, y poca disponibilidad de agua. La maca es una

pequeña planta arrosetada de hojas postradas, cuya raíz tuberosa es rica en

azúcares, otros carbohidratos, proteínas y minerales esenciales, lo que la convierte

en una excelente fuente alimenticia, siendo utilizada principalmente por las

poblaciones rurales de la sierra central, mientras que fuera de su área de cultivo

tradicional aún no es conocida completamente (Aliaga 1999, National Research

Council. 1989)

En la última década del siglo XX, la maca que se consideraba como un cultivo

en proceso de extinción (Castro de León 1990) ha empezado a cobrar importancia

gracias al redescubrimiento de su alto valor nutritivo, energético y medicinal. Una de

las principales propiedades medicinales atribuidas a la maca es la de potenciador de

la fertilidad, y su acción sobre la conducta sexual, propiedad por la que ya era usada

en el incanato (Johns, 1980).

Se han realizado muchos estudios sobre la actividad fertilizante de la maca,

hallándosele propiedades como potenciador de la fertilidad en ratas (Chacón, 1961 y

Ninanya 1995), propiedades estrogénicas marcadas, (Lamas y Upumayta, 1993),



como potenciador de la actividad espermática (Yauri y Valerio, 1991). Estos efectos

están relacionados a la presencia de glucosionlatos aromáticos (Johns, 1980), y de

alcaloides en la planta (Chacón, 1992). Sin embargo los metabolitos de “maca” no

han sido estudiados a profundidad, desconociéndose las propiedades de muchos

de ellos.

Los glucosionlatos han sido descritos desde hace mucho tiempo, junto con las

mirosinasas (las enzimas que los degradan) como un sistema característico del

orden de las Capparales. Este sistema está involucrado en la defensa de la planta

contra insectos y patógenos. Además, los productos de la degradación de los

glucosionlatos están relacionados con efectos negativos en el ser humano, como la

probable inhibición del yodo en la tiroides producida por los tiocianatos, derivados de

la hidrólisis de los glucosionlatos por acción de la mirosinasa (Daxenbichler y colb.,

1964). Pero otro lado, recientemente estos metabolitos han adquirido interés debido

a sus propiedades anticarcinogénicas (Quiros, 1999).

Anteriores estudios realizados en los alcaloides de Lepidium peruvianum Ch.

muestran que estos compuestos tienen efectos estimulantes sobre la fertilidad

femenina (Chacón, 1990). Por lo descrito anteriormente se eligieron pues los

alcaloides y glucosionlatos para evaluar la posibilidad de utilizar el cultivo de tejidos

vegetales para la producción y estudio de los metabolitos secundarios de maca,

debido a que los cultivos de tejidos y suspensiones celulares pueden ser

manipulados para obtener una gran variedad de productos naturales usados en las

industrias de alimentos y farmacéutica. De hecho esta técnica ya ha sido utilizada a

escala industrial en la producción de metabolitos secundarios (Nuñez y Ochoa,

2000).



II.1.- OBJETIVOS

II.1.1.- GENERALES

• Evaluar la producción de metabolitos secundarios de Lepidium peruvianum

Ch. bajo condiciones de cultivo in vitro.

II.1.2.- ESPECÍFICOS

• Determinar la composición de un medio de cultivo óptimo para la inducción de

callos en diferentes explantes de L. peruvianum Ch.

• Determinar la presencia de glucosinolatos y alcaloides en callos de L.

peruvianum Ch.

• Comparar la presencia de glucosinolatos y alcaloides en callos de L.

peruvianum Ch. con la que se presenta in vivo.

• Determinar la presencia de mirosinasas en callos de L. peruvianum Ch. y

compararla con la que se presenta in vivo.



CAPITULO III

ANTECEDENTES

III.1.- DESCRIPCIÓN DE LA PLANTA.-

El género Lepidium incluye aproximadamente 175 especies, distribuidas en

prácticamente todos los continentes, excepto la Antártida, siendo uno de los más

grandes dentro de las crucíferas. Las especies de América del Norte, Australia y

Europa han sido estudiadas extensamente, pero se sabe muy poco de las

especies endémicas Andinas (Quiros 1999).

Gloria Chacón (1990) menciona que en el Perú, de acuerdo a Ferreira

(1986), existían 11 especies clasificadas del género Lepidium a la que agrega

Lepidium peruvianum Chacón como una nueva especie.

De acuerdo a Rea (1992, citado por Quiros y colb. 1996) la maca fue

domesticada hace cerca de 2000 años en San Blas, Junín. Siendo, según Bonnier

(1986, citado por Chacón 1990), una de las primeras plantas domesticadas en el

Perú.

La maca parece haber jugado un papel importante en la economía

prehispánica, y durante los primeros cien años de la colonia formó parte de los

tributos exigidos por el Encomendador (Chacón, 1990).

III.1.1.- CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA.

DIVISION : ANGIOSPERMAE

CLASE : DICOTYLEDONEAE

SUBCLASE : ARCHICHLAMYDEAE



ORDEN : PAPAVERALES

FAMILIA : BRASSICACEAE

GENERO : Lepidium

ESPECIE : Lepidium peruvianum Chacón. Sp. Nov. Antes L.

meyenii Walp.

NOMBRE COMUN : MACA, MACA-MACA, MAINO, AYAK CHICHIRA,

AYAC WILLKU, GINSENG PERUANO.

III.1. 2.- DESCRIPCIÓN BOTÁNICA

La maca, según Aliaga (1988), es una planta de comportamiento bienal

en la sierra alta, (no se tienen referencias respecto a su comportamiento en

menores altitudes) siendo autógama, cleistógama, con una fase reproductiva de

5 meses con una floración que dura dos meses. Las flores se abren en series

sucesivas, presentando cuatro etapas: flor cerrada con anteras sin dehiscencia,

flores cerradas con anteras con dehiscencia, flor abierta con estructuras florales

en pleno desarrollo, flor abierta con estructuras florales entrando en

senescencia. Esta fase reproductiva es precedida por una fase vegetativa de 8

meses, que se inicia con la siembra de la semilla, en la que se produce el

ensanchamiento de los hipocótilos. El cultivo de estas dos fases se da

generalmente entre los meses de setiembre y junio en dos años consecutivos

(Aliaga, 1999).

La raíz es napiforme (Beltrán y colb. Citado por Obregón, 1998), descrita

como tubérculo hipocotíleo por Piñas (1994) recibiendo también el nombre de

hipocótilo (Aliaga 1995, 1997; Tello y colb. 1992; Quiros, 1996), según León

(1964), éste es un eje carnoso derivado del hipocótilo cuya parte superior



termina en una superficie plana de la que brotan de 6 a 15 hojas; mientras la

inferior es cónica y se alarga en una raíz ancha y fuerte con dos áreas

irregulares en la mitad inferior, de donde nacen las raicillas.

Los colores de maca más frecuentes son: amarillo, morado, medio

morado (la parte superior morada y la inferior blanca) y negro (León, 1964) pero

se pueden encontrar también maca de color rosado, crema-morado, amarillo-

negro, plomo, y raras veces morado-negro (Aliaga, 1999), el color preferido por

los campesinos y el mercado es el color amarillo (León, 1964 y Aliaga, 1999).

El tallo es acaule, mientras las hojas son arrosetadas, pecioladas,

compuestas bipinnatisectas, con foliolos opuestos y dimórficas: En la fase

vegetativa son grandes (10 – 15 cm de largo) y muy reducidas (menos de 5 cm)

en la fase reproductiva (Tello y colb. 1992 y Aliaga, 1999).

La inflorescencia es un racimo compuesto, raramente simple (Piñas

1994), con el eje floral corto. Las flores, pequeñas y blancas, son perfectas, con

cuatro sépalos, cuatro pétalos, 2 estambres fértiles y cuatro estaminodios y un

ovario súpero bicarpelar y bilocular, con un óvulo en cada lóculo de

placentación axilar. Su fórmula floral es: K4C4A2-4G2 (León, 1964 y Aliaga,

1995).

El fruto es una silícula de dehiscencia longitudinal con 2 semillas ovoides

de 2-3 mm de ancho y 4 – 5 mm de largo (Beltrán y colb. Citado por Obregón,

1998) el color de las semillas varía del amarillo-naranja al marrón oscuro (Aliaga,

1999).



III.1.3.- NÚMERO DE CROMOSOMAS

Tello y colb. (1992) sugirieron que la maca era un hexaploide de n = 8

con 54 – 56 cromosomas, pero en 1996, Quiros y colb. observaron, en células

madres de plantas en floración, 32 pares de cromosomas; concluyendo que la

maca es un poliploide disómico del número cromosómico básico del género: n

= 8, siendo así un octoploide: 2n x 8 = 64 cromosomas.

III.1.4.- DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA

A pesar que la maca crece a altitudes mayores de los 3500 m.s.n.m e

inclusive en regiones en las que ni siquiera las papas amargas pueden

sobrevivir, altitudes que se encuentran a lo largo de la Cordillera de los Andes

(National Research Council. 1989); el cultivo de la maca (luego de la colonia),

estuvo restringido a los departamentos de Junín y Pasco, en las regiones suni y

puna, principalmente en las laderas circundantes al lago de Junín; a altitudes

de 4100 – 4450 m.s.n.m. (Tello 1992); y en menor grado en otras localidades de

estos departamentos desde los 3400 m.s.n.m.

Los datos de los cronistas y las memorias de tributos, sugieren que la

distribución del cultivo era amplia en los territorios altoandinos, pero el área de

cultivo de la planta disminuyó progresivamente hasta que entre 1777 y 1778,

Hipólito Ruiz lo circunscribe la región de Chinchaycocha (Castro, 1990). Esta

tendencia se mantuvo hasta la década de los ochenta, en la que el área de

cultivo de la planta era de apenas 25 Has (Aliaga, 1999). En la década de los 90

esta tendencia se revirtió al crecer la demanda de la planta, y su cultivo se

extendió a otros departamentos del Perú, de tal manera que actualmente la

maca se está cultivando en Puno, Ayacucho, Huancavelica, Huánuco y

Apurímac (Aliaga, 1999).



III.1.5.- IMPORTANCIA NUTRICIONAL

La maca es la única especie del género Lepidium cuya raíz es utilizada

como alimento, aunque las hojas de otras especies son usadas como verduras

(National Research Council. 1989), además, dentro de los tubérculos y raíces

andinos, es una de las especies con mayor valor alimenticio; con un alto

contenido de aminoácidos esenciales, comparables con los recomendados por

la FAO – OMS, siendo altos sus valores de lisina, tirosina y fenilalanina. La

fracción grasa es rica en ácido linoleico utilizado por el organismo para la

biosíntesis de ácidos grasos esenciales. Por otro lado, los niveles de minerales

de la planta son altos comparados con otras especies (Pizza y colb. 1998). (Ver

apéndice)

III.2.- METABOLITOS SECUNDARIOS.

Se definen como metabolitos secundarios a aquellos compuestos que no

tienen una función reconocida en el mantenimiento de los procesos fisiológicos

fundamentales de los organismos que los sintetizan (Robert y colb. 1991).

Entre las funciones que cumplen estos metabolitos están: proteger la planta

de los depredadores, competir ventajosamente con otras plantas, atraer

polinizadores y simbiontes y brindarles protección contra diferentes tipos de estrés a

los que se vean sometidas (Loyola y Vargas, 1985, citados por Robert y colb. 1991).

Las evidencias de una estricta regulación metabólica de estos productos nos

indicaría que cumplen un rol importante en la sobrevivencia de las plantas



III.2.1.- GLUCOSINOLATOS.

Los glucosinolatos son una clase tioglucósidos restringidos a las

dicotiledóneas limitados a pocas familias y en algunos casos a ciertos géneros y

especies (Kjaer, 1973), los que son almacenados en diferentes tejidos de la

planta, siendo una fuente significativa del contenido de azufre y minerales de la

planta (Josefsson, 1970; citado por Rodman, 1981), se encuentran en muchos

cultivos comerciales y junto con la enzima que los degrada, la mirosinasa,

conforman un sistema que define fitoquímicamente al orden de las Capparales

(Hegnauer, 1986; citado por Bones y Rossiter, 1996); estando presente en

muchas brassicaceas económicamente importantes, como la mostaza,

calabazas, brócoli, nabo, etc. El daño mecánico, infecciones o ataque de pestes

produce, como una respuesta de defensa de la planta, el rompimiento celular

que exponen los glucosinolatos almacenados a la acción de las enzimas que los

degradan, las mirosinasas, produciendo isotiocianatos, nitrilos,

cianoepitioalcanos y tiocinatos dependiendo del pH y/u otros factores (Fig 1)

(Bones y Rossiter, 1996). Estos compuestos disminuyen la palatibilidad de las

hojas para herbívoros no específicos como aves y babosas, pero aumenta la

susceptibilidad del tejido a insectos específicos como los escarabajos alados,

(Mithen y col. 1995)

La primera revisión de la presencia de glucosinolatos en varias especies

fue hecha por Kjaer en 1960, con actualizaciones periódicas (Xenophon y colb.,

1981), en 1973, Kjaer puntualizó: “entre el vasto número de productos

secundarios vegetales, aquellos que presentan una distribución discontinua junto

con un llamado inmediato a los sentidos humanos (olor, sabor, color) han

adquirido, por razones obvias, una posición prominente en discusiones acerca

de los méritos de tales productos para propósitos de clasificación y, más

fundamentalmente, consideraciones filogenéticas. Los glucosinolatos ........



constituyen un grupo con algunas de las características anteriores.”....... “La

complejidad sistemática de numerosos taxa productores de glucosinolatos, por

ejemplo dentro de Cruciferae, es un reto para nuestro entendimiento de la

posición biológica e importancia de este grupo de constituyentes vegetales

químicamente bien definido y en constante crecimiento”.

Hace ya varias décadas, se ha deseado reducir el contenido de

tioglucósidos en Brassicáceas mediante métodos de cultivo, pues la presencia

de algunos de ellos son indeseables por algunos efectos tóxicos de los

productos de su degradación (Josefsson, 1967), tales como nitrilos,

isotiocianatos, tiocianatos, epitionitrilos y vinil oxazolidinetionas (Bones y

Rossiter, 1996), así como por su sabor; mientras que otros vienen siendo

estudiados por sus propiedades terapéuticas. Actualmente, la concentración de

glucosinolatos puede ser manipulada genéticamente, disminuyéndola para

mejorar la palatabilidad del cultivo, como en el caso de la colza, o,

aumentándola como se trata de hacer en brócoli con el glucosinolato

glucorafanina, que al hidrolizarse forma sulfurofano con actividad

anticancerígena (Quiros, 1999).

Las especies del género Lepidium son usualmente ricas en bencil

isotiocianatos (Daxenbichler y colb., 1964) y en el caso de la maca, Jonhs

(1981), sugiere que las propiedades potenciadoras de la fertilidad se deben a los

productos de los glucosinolatos de maca, los isotiocianatos aromáticos,

bencilisotiocianato y el p-metoxibencil isotiocianato, el último de los cuales

también se encuentra en mashua.

Químicamente, los glucosinolatos son compuestos hidrosolubles, tienen

el mismo núcleo el cual consiste en un tioglucósido unido al carbón de una

oxima sulfonada y un grupo funcional R que deriva de aminoácidos siendo éste



el carácter variable (Bones y Rossiter, 1996) y de cuya estructura depende la

actividad biológica del glucosinolato al determinar la naturaleza de los productos

resultantes del daño de los tejidos de la planta, (Mithen y colb., 1995). La

naturaleza de este grupo R los divide en dos grupos: los glucosinolatos

aromáticos (alquil, alquenil, hidroxialquenil, w- metiltioalkenil) y los alifáticos

(bencil, bencil sustituido), el grupo sulfato le imparte fuertes propiedades ácidas,

por lo que los glucosinolatos se presentan como aniones contrabalanceados por

un catión, la glucosa y sus formas aniónicas, los hacen compuestos no volátiles

e hidrofílicos, se han identificado más de 100 glucosinolatos; todos ellos se

diferencian sólo en la cadena lateral R. (Bones y Rossiter, 1996). Por el gran

número de glucosinolatos, se usan nombres semisistemáticos, en los que el

nombre de la cadena R es seguido por el sufijo “glucosinolato”,

Los glucosinolatos provienen del metabolismo de los α- aminoácidos,

Valina, Alanina, Leucina, Isoleucina, Fenilalanina, Tirosina y Triptofano (Kjaer,

1973), en una serie de reacciones en las que el grupo carboxilo se pierde y el

carbón α se transforma en el carbón central del glucosinolato (Larsen, 1981),

aunque solo siete corresponden a aminoácidos proteicos (antes mencionados),

los restantes derivan de modificaciones de la cadena lateral, que probablemente

a nivel de glucosinolato o derivan de aminoácidos no proteicos (Chapple, y colb.,

1994 y Larsen, 1981).

Para el aislamiento y análisis de los glucosinolatos se han desarrollado

muchas técnicas, como la cromatografía en papel Kjaer 1970, cromatografía de

capa fina, cromatografía de gases, además de procesos que involucra el estudio

de los productos de la degradación enzimática, aunque la gran variabilidad de

los productos de la degradación enzimática pueden causar resultados erróneos,

(Larsen, 1981).



El tratamiento de los glucosinolatos con AgNO3 o Hg(Oac)2 resulta en la

producción de α-D-glucosa y derivados de la plata o el mercurio los que

nuevamente pueden ser descompuestos en nitrilos, (Larsen, 1981)

Los glucosinolatos se encuentran usualmente en toda la planta en

vacuolas celulares, pero presumiblemente en las semillas maduras y dormantes

ricas en glucosinolatos y que presumiblemente no presentan vacuolas acuosas

aún no se ha definido su localización celular (Rodman, 1981).

Lockwood y Belkhiri, (1991), revisaron la clasificación de crucíferas de

Argelia, de acuerdo a sus glucosinolatos, reclasificando el género Isatis y

reubicando el género Sinapsis fuera de Brassicaria, esto demuestra pues, el

valor taxonómico de estos compuestos.

III.2.1.1.- EL SISTEMA MIROSINASA – GLUCOSINOLATO

Las enzimas que hidrolizan los glucosinolatos son las mirosinasas y estas

están invariablemente depositadas en toda la naturaleza con el sustrato. (Kjaer,

1973), así, sin excepción conocida, los glucosinolatos están acompañados en la

planta por esta enzima. Las mirosinasas se encuentran en idioblastos

especializados ricos en proteínas llamados células de mirosina (Rodman, 1981)

que se encuentran en el tejido parenquimático (Bonnes y Rossiter, 1996), éstos

se tiñen de rojo intenso con el reactivo de Millon. (Fahn, 1979; citado por

Rodman, 1981) de tal manera que los dos componentes se encuentran

separados hasta que se produce daño tisular o autolisis, generando durante la

masticación los productos de defensa de la planta (Purrington, 2000).

Este sistema fue observado por primera vez en semillas de mostaza,

(Kjaer, 1968) posteriormente fue encontrado en todas las Brassicáceas, y en la



familias Caparaceae, Tropaeolaceae, Caricaceae, entre otras. Por otro lado se

ha encontrado en los hongos Aspergillus sydowi y Aspergillus niger , en la

bacteria Enterobacter cloacae, en tejidos de mamíferos y en los áfidos que

atacan crucíferas Lipaphis erisimi y Brevicoryne brassicae. Pero estas enzimas

parecen no estar relacionadas con las enzimas de las plantas (Bones y Rossiter,

1996).

S – Glu

R – C

NOSO3

H2O mirosinasa

S

R –C + D - Glu

NOSO3

Isotiocianatos nitrilos cianoepitioalcanos tiocianato

FIG. 1.- Hidrólisis de los glucosinolatos por la mirosinasa. (Fuente: Bonnes y

Rossiter. 1996. The Myrosinase – Glucosinolate System, its Organization and

Biochemistry. Physiologia Plantarum. 97:194 -208 )

La degradación de los glucosinolatos mediada por la mirosinasa puede

producir: a) isocianatos, cuando la hidrólisis se produce en un pH normal; b)

nitrilos, cuando la hidrólisis ocurre a pH ácido; c) cianoepitioalcanos, cuando la

mirosinasa se presenta con una pequeña proteína conocida como proteína

epitioespecificadora; d) tiocianatos, que son producidos solo por tres de los

glucosionatos que se dan en la naturaleza, los allyl, bencil, y 4-

(metiltio)butilglucosinolatos.



MacGibbon y Allison en 1970 detectaron por electroforesis en gel

separando varias isoenzimas de mirosinasas, ellos trabajaron con 7 especies de

Rhoeadales, cada especie tenia un patrón diferente con 1 a 4 bandas. También

encontraron que este patrón variaba de acuerdo a la parte de la planta de la cual

se hicieran los extractos.

Diferentes estudios de las mirosinasas demuestran que el patrón de estas

enzimas puede variar no solo de acuerdo a la especie, sino también de acuerdo

al órgano y edad de la planta, pero se sabe poco de la razón fisiológica de esta

diferencia.(Bonnes y Rossiter, 1996). Se ha postulado que las isoenzimas

particulares corresponden a condiciones endógenas encontradas en las plantas,

o al organismo blanco o a los glucosinolatos que predominan en el

tejido.(Bonnes y Rossiter, 1996).

III.2.2.- ALCALOIDES

Los alcaloides forman una amplia y variada familia de metabolitos

secundarios de moléculas no relacionadas entre sí, siendo de gran importancia

económica debido a sus propiedades farmacológicas, las mismas que han sido

usadas desde la prehistoria hasta la actualidad. Son los metabolitos mas

frecuentes en el reino vegetal, habiéndose encontrado cerca de 10,000

alcaloides en aproximadamente 20 por ciento de plantas con flores,

principalmente dicotiledóneas herbáceas (Hopkins, 1999).

Se clasifican como alcaloides a aquellas sustancias básicas con uno o

más átomos de nitrógeno en su sistema cíclico, que manifiestan actividad

farmacológica (Lock, 1994)

La mayoría de los alcaloides provienen del metabolismo de los

aminoácidos, principalmente tirosina, triptofano, arginina y lisina, y aunque



algunos alcaloides se encuentran en varios géneros o aún en una familia, la

mayoría de las especies presentan un patrón único, genéticamente

determinado. Por otro lado su distribución está restringida a determinados

órganos de la planta, como raíces, hojas o frutos jóvenes (Hopkins, 1999).

No se ha determinado aún cual es la función de los alcaloides en la

planta, aunque se le asignan rol defensivo, debido a que la mayoría son

amargos, lo cual es considerado universalmente como un carácter repelente.

Todos son biológicamente activos, muchos significativamente tóxicos y otros con

propiedades antibióticas. Frecuentemente los tejidos que acumulan alcaloides

son los más vulnerables, o son tejidos periféricos que pueden ser atacados por

herbívoros (Hopkins, 1999), pero el hecho que cerca de 80% de las plantas no

contienen alcaloides hace suponer que estos no son vitales para todos los

organismos vivientes (Lock, 1994).

Para la extracción de alcaloides se aprovecha su carácter básico,

utilizando soluciones acuosas o alcohólicas ligeramente ácidas, para obtener el

extracto crudo de alcaloides; pudiendo previamente liberarlos con soluciones de

amoniaco y carbonato de sodio, para extraerlos luego con solventes

orgánicos.(Lock, 1994)

Las técnicas de separación de alcaloides más comunes son la

cromatografía de capa fina o delgada aunque en los noventa se generalizó el

uso de Sephadex LH-20 por elución y la cromatografía líquida de alta

perfomance (HPLC). Los sistemas solventes son muy variados y el agente

revelador de uso general es el reactivo de Dragendorff, cuya aplicación produce

manchas generalmente de color naranja (Lock 1994).

La Dra. Gloria Chacón, (1961, 1990) demostró la presencia de alcaloides



en Lepidium peruvianum, para demostrar la acción fecundadora del extracto

alcaloideo de maca, lo inoculó en ratas obteniendo una marcada estimulación

de la maduración los folículos de Graaf y engrosamiento del endometrio.

Posteriormente Yllesca, (1994), en un estudio fitoquímico de la planta encontró

3 alcaloides en los extractos metanólico y butanólico de maca de los ecotipos

amarillo, rojo y negro. En 1993, Garró y col. obtuvieron cuatro fracciones de

alcaloides por cromatografía de capa fina. Por otro lado Dini y colb., (1994),

detectaron por cromatografía de capa fina de un extracto alcalino de polvo de

maca realizado en cloroformo 3 fracciones positivas al reactivo de Dragendorff.

Sin embargo la presencia de alcaloides en maca aún es discutida y no se ha

determinado su estructura.

III.3.- CULTIVO DE TEJIDOS

El cultivo de tejidos como técnica consiste en aislar una porción de planta

y proporcionarle las condiciones apropiadas para que las células expresen su

potencial intrínseco o inducido. Es en realidad un conjunto de diversas técnicas

mediante las cuales un explante, es decir una parte separada de la planta, se

cultiva asépticamente en un medio de composición definida y se incuba en

condiciones ambientales controladas. (Roca y Mroginski, 1991).

Los principios de esta técnica están contenidos en la teoría celular de

Schleiden y Schwann (1839, citados por Gautheret, 1982) que postula que la

célula es capaz de tener autonomía y totipotencia, lo que fue demostrado en

células somáticas con la observación de la formación y cicatrización de callos en

áreas donde la planta sufre cortes (Gautheret, 1982).

Los primeros intentos de establecer cultivos de tejidos vegetales fueron

realizados por el botánico alemán G. Haberlandt (1902, citado por Gautheret



1982), quien trabajó con células de palizada, pelos glandulares y pelos de

estambres de Tradescantia; pero aunque logró que las células sobrevivieran

entre 20 a 27 días, no tuvo crecimiento celular, probablemente debido a que

eligió nutrientes relativamente simples y a que eligió células altamente

diferenciadas (Dodds y Roberts, 1982). Recién en 1934, mucho después que en

1912 Carrel diseñara el método para cultivar células animales; que Gautheret

logra los primeros resultados exitosos en el cultivo de tejidos del cambium en

Acer pseudoplatanus, Salix capraea y Sambucus nigra (Gautheret 1982) y White

demuestra el crecimiento ilimitado de las puntas cortadas de raíces de tomate

(Dodds y Roberts 1982).

Los primeros logros del cultivo de tejidos fueron los de formación de

callos indiferenciados, que podían crecer ilimitadamente a través de subcultivos,

por lo que se puso mucho énfasis en la determinación de los requerimientos

nutricionales para el crecimiento sostenido (Dodds y Roberts 1982). Para

entonces ya se había descubierto la auxina IAA (Went, 1926, citado por

Gautheret, 1982) y en las décadas siguientes se estudiaron diversas sustancias

que favorecían el crecimiento celular de los tejidos cultivados in vitro (Gautheret

1982) se descubrió la kinetina y otras hormonas que recibieron el nombre de

citoquininas (Dodds y Roberts 1982) , hasta que en 1962, Murashigue y Skoog

propusieron una solución de minerales asociada a auxinas y citoquininas que

permite el crecimiento de la mayoría de tejidos (Gautheret 1982).

También se inició una serie de estudios en organogénesis e histogénesis,

que sentaron las bases de la micropropagación cuando Ball en 1946 descubrió el

principio de la propagación vegetativa determinando cuales eran los tipos de

meristemos que eran capaces de generar plantas completas. En 1964, Morel

aplicó estos principios en la propagación clonal de orquídeas. (Gautheret 1982).



Muir (1953 – 1954, citado por Dodds y Roberts 1982) encontró que los

callos que eran trasladados a un medio líquido se convertían en suspensiones

celulares, desarrollándose luego muchas técnicas de cultivo de células aisladas y

de otro tipo de cultivos, como el de anteras, de microsporas, el aislamiento y

cultivo de protoplastos y otros. (Dodds y Roberts 1982).

Actualmente el cultivo de tejidos se aplica entre otros:

a) Estudios básicos de fisiología, genética, bioquímica y ciencias afines.

b) Bioconversión y producción de compuestos útiles.

c) Incremento de la variabilidad genética.

d) Obtención de plantas libres de patógenos.

e) Propagación de plantas.

f) Conservación e intercambio de germoplasma.

III.3.1.- CULTIVO DE CALLOS

El establecimiento del cultivo de tejidos depende del tipo de explante

usado, y la elección de éste dependerá del objetivo perseguido y la especie

vegetal utilizada. Para la obtención de callos se puede utilizar cualquier tipo de

explante que contenga células nucleadas, y éste se seleccionará en función a

razones prácticas como disponibilidad, facilidad de manipulación,

homogeneidad, baja contaminación, respuesta in vitro; esta respuesta puede

variar con el genotipo de las plantas, su estado de desarrollo, edad ontogénica y

tamaño del explante (Roca y Mroginski, 1991). A las dos o tres semanas de

incubación empieza a formarse, en las regiones de corte, el callo, una masa

amorfa desdiferenciada de células parenquimáticas de pared delgada (Dodds y

Roberts 1982), y sigue creciendo cubriendo el explante en unos casos, y en

otros desintegrándose a medida que el callo crece (Nuñez y Ochoa, 2000). Este

crecimiento depende de la relación entre la planta de origen, el medio de cultivo,



las condiciones ambientales y el tiempo de incubación; algunos callos crecen

fuertemente lignificados y de textura dura, mientras otros se rompen fácilmente

en pequeños fragmentos, estos callos son llamados friables (Dodds y Roberts,

1995), estos callos son los mejores para la iniciación de cultivos celulares.

El establecimiento de un callo a partir de un explante, puede dividirse en

tres fases de desarrollo: Inducción, en la que el metabolismo es estimulado

antes de la mitosis; división celular en el que las células del explante revierten a

un estado meristemático; y por ultimo diferenciación celular y expresión de

algunas vías metabólicas que llevan a la formación de metabolitos secundarios

(Dodds y Roberts, 1995).

La formación de callos en plantas intactas, normalmente está controlada

por hormonas endógenas, las auxinas y citoquininas, por lo que para su

inducción in vitro en explantes vegetales sin causar estrés, depende de la

introducción de reguladores de crecimientos en el medio de cultivo (Nuñez y

Ochoa, 2000).

Los otros factores más importantes para el éxito de esta tecnología son:

el explante y el medio de cultivo, es decir, los componentes esenciales y

opcionales que contenga. Los nutrientes esenciales consisten en las sales

inorgánicas, fuentes de carbono y energía, vitaminas y fitohormonas (Gamborg y

Shyluk, 1981). Otros componentes como compuestos nitrogenados, ácidos

orgánicos y sustancias complejas pueden ser importantes pero son opcionales.

Después de que el callo ha crecido por un tiempo en asociación con el

tejido original, es necesario subcultivar el callo a medio fresco. El crecimiento en

el mismo medio por un tiempo prolongado lleva al agotamiento de los



nutrientes, la gradual desecación del agente gelificante y a la acumulación de

metabolito que pueden resultar tóxicos para el callo (Dodds y Roberts, 1995).

Los subcultivos sucesivos usualmente son llevados a cabo cada seis

semanas, con cultivos mantenidos en medio agar a 25°C o más, pero en

realidad este tiempo varía con la tasa de crecimiento del callo (Dodds y Roberts,

1995).

Carhuaz en 1997 (comunicación personal), indujo callos en maca,

utilizando un factorial de cuatro citoquininas (BAP, KIN, ZEA y 2ip) y cuatro

auxinas (IIA, IBA, NAA y 2,4-D) a concentraciones de 0.1, 1.0, 10.0, 100 ìM,

concluyendo que el 2,4-D en el rango de 0.1 – 10.0 ìM el regulador m ás

efectivo para promover la formación de callos, coincidiendo con Gamborg y colb.

(1981), quienes indican un rango óptimo de 1- 5 ìM para la acción del 2,4-D y

con Flick y colb. (1983), que también señalan al 2,4-D y a la kinetina como los

reguladores más efectivos para la inducción de callos en Brassicáceas.

III.3.2.- HORMONAS Y REGULADORES DE CRECIMIENTO

Se llama hormona o fitohormona a aquellas sustancias orgánicas

naturales que a bajas concentraciones ejercen una profunda influencia en los

procesos fisiológicos de la planta (Hopkins, 1999), mientras que las sustancias

sintéticas con las mismas propiedades son llamadas reguladores de crecimiento,

y no son consideradas como hormonas vegetales (Dodds y Roberts, 1995).

Se conocen cinco grupos de hormonas: auxinas, giberelinas, citoquininas,

ácido absícico y etileno (Hopkins, 1999). De estas las auxinas y citoquininas son

las mas usadas en el cultivo de callos, mientras las giberelinas son usadas con

poca frecuencia y generalmente en cultivos de meristemos apicales. De igual



modo el ácido absícico y el etileno se usan con poca frecuencia (Dodds y

Roberts, 1995).

En la familia Brassicaceae se encuentran muchas especies

económicamente importantes, en muchas de ellas se han inducido callos,

incluyendo a Brassica oleracea, B. napus y Arabidopsis thaliana, los

requerimientos para inducir callos en esta familia pueden ser cubiertos con

muchas hormonas, con un amplio rango de concentraciones, estas

concentraciones y la hormona a ser elegida, así como la respuesta de

crecimiento varía con la especie y el genotipo. Sin embargo, usualmente se

utiliza una auxina y una citoquinina, (Flick y colb., 1983), dentro de las

citoquininas la más usada es la Kinetina, mientras que la auxina utilizada con

más frecuencia es 2,4-D, de igual modo, la relación auxina:citoquinina más

eficiente para la inducción de callos es de 1 (Flick y colb. (1983).

III.3.2.1- AUXINAS

Las auxinas (del griego auxein = incrementar) fueron identificadas por

primera vez por Went en 1926, quien describió la acción elongadora del IAA en

coleóptidos de avena. Posteriormente se hallaron mas auxinas naturales, de las

cuales la más usada en cultivo de tejidos es el IAA, y otras sintéticas o

reguladores de crecimiento de las cuales las más usadas son el 2,4-D, el NAA y

el IBA (Krikorian, 1991).

Los efectos de las auxinas más importantes para el cultivo de tejidos son

el crecimiento celular y la elongación celular. Algunos tejidos sólo forman callos

en respuesta a una auxina en particular, siendo a veces necesario utilizar altas

concentraciones de auxina para la iniciación del callo, aunque en el caso del 2,4-

D, se ha observado efectos inhibitorios a concentraciones mayores a 1 mg/litro.



Este regulador es la auxina más efectiva para la proliferación de callos

usándose a concentraciones de 10-7 – 10-5 M y aún en ausencia de una

citoquinina exógena (Yeoman y Forche, 1980).

Además de inducir la proliferación celular, el 2,4-D tiende a suprimir la

morfogénesis del callo, por lo que su uso no es recomendado para estudios de

diferenciación (Yeoman y Forche, 1980). En Arabidopsis thaliana, la brassicacea

mas estudiada, la auxina mas usada en la obtención de callos en diferentes

explantes es el 2,4-D, sea junto a una citoquinina o a leche de coco (Morris y

Altmann, 1994).

III.3.2.2.- CITOCININAS

En 1954 Skoog y Miller descubrieron un compuesto muy activo en la

promoción de la citocinesis, el que se formaba por la descomposición parcial de

ADN, llamándolo cinetina (Kinetina, KIN) y propusieron el término cinina para

denominar las sustancias naturales y sintéticas que presentaban el mismo tipo

de actividad biológica. Posteriormente para evitar confusiones con la sustancia

usada en cultivo de tejidos animales, se optó por el nombre citocinina para

estas sustancias (Krikorian, 1991).

Las citoquininas se caracterizan por su habilidad para estimular la división

celular en el cultivo de tejidos cultivo, induciendo la división celular sincrónica a

las 18 h (Szweykowska, 1974), y, en presencia de una auxina, estimular la

formación de brotes e inhibir el enraizamiento (Dodds y Roberts, 1995).

Las citoquininas mas usadas son la kinetina y la zeatina, siendo

compuestos sintéticos, mientras la zeatina es una citoquinina natural (Dodds y

Roberts, 1995).



Hay excepciones en el requerimiento de auxinas y citoquininas, así

algunos cultivos no requieren de una auxina exógena y otros requieren de una

auxina y no de una citoquinina (Dodds y Roberts, 1995). Se ha observado

además que en todos los casos las citoquininas a altas concentraciones (10 –25

mg/l) inhiben la formación de callos (Yeoman y Forche, 1980).

En Lepidium peruvianum, Carhuaz (1997, comunicación personal) utilizó

un factorial de medios con cuatro auxinas (IAA, IBA, NAA, y 2,4-D) y cuatro

citoquininas ( BAP, KIN, ZEA, Y 2ip) a concentraciones de 0.1, 1.0, 10.0 y 100

µM, utilizando como explantes, la raíz, hoja, peciolo e hipocótilo.

III.3.3.- EL EXPLANTE

Los requerimientos hormonales para la iniciación del callo dependen del

origen del tejido aislado (explante), los explantes que contienen células del

cambium pueden formar callos sin adición de reguladores de crecimiento; pero

la mayoría de los explantes requiere de uno o más reguladores de crecimiento

para iniciar la formación de callos (Dodds y Roberts, 1995). Esta respuesta

también depende del estado fisiológico del tejido y del tiempo de escisión,

(Yeoman y Forche, 1980).

Los explantes pueden ser clasificados de acuerdo a sus requerimientos

exógenos de la siguiente manera: 1) auxinas 2) citoquininas 3) auxinas y

citoquininas 4) extractos naturales complejos (Dodds y Roberts, 1995).

III.3.4.- CULTIVO DE TEJIDOS Y METABOLITOS SECUNDARIOS

Las plantas siguen siendo una importante fuente comercial de metabolitos

secundarios, pero en algunos casos estas plantas no han sido sujetas a



programas intensivos de mejoramiento genético y se presentan además

problemas técnicos y económicos para su cultivo (Dodds y Roberts, 1995).

El cultivo de tejidos puede ser una alternativa para producir metabolitos

secundarios cuya extracción a partir de las plantas que los producen puede

resultar difícil o económicamente inviable, sea por el largo tiempo de espera

necesario, por el riesgo de sobreexplotación al que se expone el cultivo; por las

pequeñas cantidades de compuesto presente en la planta o por los controles a

los que se someten a las plantas productoras (Robert y colb., 1991). Por otro

lado el cultivo de tejidos puede ser utilizado para mejorar el cultivo de estas

plantas (Dodds y Roberts, 1995).

La noción de que una línea celular altamente productiva podía ser

seleccionada para generar compuestos útiles fue introducida en la década de

1970, en la década de los ochenta, las Universidades de Kyoto y Kitasato en

cooperación con la industria privada, produjeron shikonina de Lithospermum

erythrorhyzon y saponinas de ginseng respectivamente (Hara, 1996).

La producción de shikonina, un pigmento que se extrae de las raíces de la

planta asiática Lithospermum erythrorhyzon es un ejemplo de la efectividad del

uso del cultivo de tejidos vegetales en la producción de metabolitos secundarios.

En la planta el rendimiento de shikonina, además de ser muy bajo, depende de

la distribución geográfica y el clima, habiendo sufrido una rápida disminución en

su población. Luego de establecer una estrategia de producción in vitro, la

empresa petroquímica Mitsui del Japón logró la primera producción industrial del

compuesto, vendiendo a 4000 dólares el kilo de shikonina producida in vitro

(Robert y colb., 1991).



En la década de los noventa el número de compuestos producidos por

cultivo de tejidos aumentó y la mejora de la tecnología Hara permitió obtener

compuestos raros en los recursos vegetales naturales. Un ejemplo de esta

tecnología es la producción comercial, por Kao, de un polisacárido tuberoso

usado en cosméticos (Hara, 1996).

Actualmente existen al menos tres programas de búsqueda de

compuestos con actividad biológica, llevados a cabo por las industrias

farmacéuticas, cada año varios cientos de plantas son colectados y se intenta en

ellas la inducción de callos, con un éxito de cerca al 50%. Cerca del 10% de los

callos muestra alguna forma de actividad ( Schripsema, y colb., 1996).

Todo el proceso desde la colección hasta la obtención de un compuesto

puro es estimado entre los 2 y 4 años. Algunos resultados de estas búsquedas

han sido publicados y patentados, como el alcaloide jatrorrhizina y los

dehidrodiconiferil alcohol glucósidos aislados de cultivos celulares de

Plagiorhegma dubium Maxim (Schripsema y colb., 1996).

La búsqueda de nuevos compuestos a nivel de callos tiene la ventaja de

reducir el número de cultivos de interés, muchas veces el paso de callos a

suspensiones celulares representa una reducción considerable de los niveles de

ciertos metabolitos secundarios, ocurriendo algunas veces la pérdida completa

de productividad para ciertos productos, lo que no significa que los cultivos

celulares no sean capaces de producir compuestos de interés, por el contrario,

Ruyter y Stöckingt (1989 citados por Schripsema y colb., 1996) demostraron que

los cultivos celulares son una excelente fuente de nuevos compuestos.

Las ventajas esperadas del cultivo de tejidos en la producción de

metabolitos secundarios son las siguientes:



• Producción a escala industrial

• Producción de sustancias difíciles de obtener por extracción o por síntesis

química

• Reducción de los costos de producción a largo plazo

• Eliminación de la dependencia en materia de importación

• Producción continua y controlada de sustancias independiente- mente de los

factores del medio ambiente.

• Precios estables

• Posibilidad de realizar la producción cerca de las fábricas de procesamiento

final y de los mercados.

Se ha estudiado también la posibilidad de aumentar significativamente la

productividad del cultivo usando un medio de inducción (para la producción de

los metabolitos secundarios) (Becker, 1987).

III.4.- CROMATOGRAFÍA

La cromatografía es la técnica analítica usada para la separación de

mezclas y sustancias, por adsorción selectiva (Microsoft® Encarta® Online

Encyclopedia 2001) y fue descubierta por el botánico ruso Michael Tswett en

1903, quien descubrió que los pigmentos de las plantas podían separarse al

filtrarlos con éter de petróleo a través de una columna de carbonato de calcio.

Pero el desarrollo de esta técnica empieza realmente en 1931, cuando,

posteriormente otros investigadores introducen otros materiales como las

columnas de silicagel, papel (Randerath, 1968).

Actualmente se usa un amplio rango de técnicas cromatográficas de

acuerdo a los adsorbentes usados, la cromatografía de columna utiliza sílica,

alúmina y sílica gel; en la cromatografía de capa fina el adsorbente se encuentra



sobre un vidrio o una película plástica, mientras que en la cromatografía de

papel, una muestra líquida fluye sobre el papel adsorbente. Otras técnicas

cromatográficas son: la cromatografía gas-líquida, que permite la separación de

sustancias que pueden ser volatizadas; la cromatografía iónica donde un gas

puede ser descompuesto en iones que interactúan con el adsorbente; la

cromatografía de permeación de gel usa un adsorbente con poros de tamaño

uniforme, y finalmente, la cromatografía líquida de alto perfomance (HPLC)

donde el adsorbente es líquido, esta técnica es ampliamente usada

actualmente (Microsoft® Encarta® Online Encyclopedia 2001).

III.5.- ELECTROFORESIS EN GEL

La electroforesis en gel es un método de separación, en el que las

partículas cargadas migran hacia un electrodo de carga opuesta bajo la influencia

de un campo eléctrico aplicado externamente. Este movimiento se realiza en

interacción con la matriz circundante, la cual actúa como un filtro molecular,

generándose como consecuencia, tasas diferenciales de migración para las

proteínas contenidas en una muestra (Garfin, 1990).

Los primeros trabajos de electroforesis fueron realizados en soportes de

papel y acetato de celulosa, y se utilizaron principalmente para separar

aminoácidos, péptidos y mezclas proteicas mal separadas por cromatografía

(Freifelder, 1979), los soportes pueden ser relativamente inertes, como papel,

acetato de celulosa, silicagel, alúmina y celulosa y actuar como tamices

moleculares como son los geles de almidón, agarosa y poliacrilamida (Hames,

1981, citado por Gálvez, 1990).

El método más utilizado es la electroforesis en geles de poliacrilamida

(PAGE), por proporcionar un tamaño de poro controlable, ser repetible y de alta

resolución (Garfin, 1990).



Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerización del monómero

de acrilamida y un co-monómero de ligamiento cruzado, la N,N’-metilen-

bisacrilamida. Esta polimerización es catalizada por un sistema generador de

radicales libres, compuesto por persulfato de amonio, que actúa como iniciador,

y un acelerador, el tetrametiletilendiamida TEMED, que causa la formación de

radicales libres a partir del persulfato de amonio, los que a su vez catalizan la

polimerización del gel (Garfin, 1990). Otro agente donante de radicales libres es

la riboflavina, pero a diferencia del persulfato de amonio requiere de luz y

oxígeno, agentes que convierten la convierten a su forma leuco, la cual inicia la

polimerización (Gálvez, 1990).

Los poros se forman por la naturaleza del enlace cruzado entre la

acrilamida y la bisacrilamida, y su tamaño disminuye a medida que la

concentración de acrilamida aumenta, determinando sus propiedades como

tamiz.

La separación por electroforesis en gel esta basada en los tamaños,

formas y cargas netas de las macromoléculas, los sistemas diseñados para

proteínas nativas se utilizan principalmente para separar y categorizar mezclas

de proteínas; pero no para medir la pureza de una preparación o el peso

molecular de una muestra desconocida, pues estos sistemas no diferencian entre

los efectos del tamaño, forma y carga en la movilidad electroforética, debido a

que proteínas con diferentes pesos moleculares pueden tener la misma

movilidad; para diferenciar estos efectos se utiliza la electroforesis denaturante

(SDS – PAGE)(Garfin, 1990).

La separación por electroforesis en gel esta basada en los tamaños,

formas y cargas netas de las macromoléculas, los sistemas diseñados para

proteínas nativas se utilizan principalmente para separar y categorizar mezclas



de proteínas; pero no para medir la pureza de una preparación o el peso

molecular de una muestra desconocida, pues estos sistemas no diferencian entre

los efectos del tamaño, forma y carga en la movilidad electroforética, debido a

que proteínas con diferentes pesos moleculares pueden tener la misma

movilidad; para diferenciar estos efectos se utiliza la electroforesis denaturante

(Garfin, 1990), en la cual se utilizan detergentes iónicos como el SDS (sodium

dodecyl sulfato) el mismo que neutraliza la cargas de la proteína de tal forma

que las proteínas migran por efecto de su peso molecular, las muestras en este

caso deben ser tratadas con SDS y un tiol, como el mercaptoetanol. (Gálvez,

1990).

El método más popular es el SDS-PAGE desarrollado por Laemmli en

1970 (Garfin, 1990), el cual consiste en un método discontinuo con dos tipos de

geles: un gel de separación y uno de concentración, ambos geles tienen

diferentes porosidades y pH, sirviendo el segundo como un medio anticonvectivo,

donde la muestra se apila antes de pasar al gel de separación que se halla

inmediatamente debajo y que posee un tamaño de poro más pequeño. Además,

se utilizan diferentes buffers para el gel y los electrodos, esta discontinuidad

permite concentrar grandes volúmenes de muestra en el gel de concentración,

resultando en una mejor resolución (Laemmli, 1970).



CAPITULO IV

MATERIAL Y MÉTODOS

IV.1.- INDUCCIÓN DE CALLOS Para la inducción de callos se siguió un protocolo en base al trabajo

realizado por Carhuaz en 1997 (comunicación personal) según se describe a

continuación.

IV.1.1.- MATERIAL VEGETAL

Se utilizaron plántulas de maca amarilla, morada y negra, germinadas in vitro

en medio Murashigue y Skoog (1962), sin hormonas, suplementado con

vitaminas, mioinositol, pantetonato de calcio, 20% de sucrosa, y 2% de gelrite.

Las semillas fueron gentilmente proporcionadas por el Ing. Rolando Aliaga

(CIMA – UNA) y provinieron de la comunidad de Huayre – Junín.

IV.1.1.1.- DESINFECCIÓN

La desinfección de las semillas se realizó adecuando el protocolo de

desinfección de rutina usado en el LRGB, de la manera siguiente:

Inmersión en alcohol al 70% : 1 minuto

Inmersión en hipoclorito de Na al 2% : 10 minutos

Enjuague con agua destilada estéril : 1 minuto, cuatro veces

IV.1.1.2.- CONDICIONES DE CULTIVO

Las condiciones del cuarto de cultivo fueron: 18°C, 1,500 Lux, fotoperíodo

de 16 h de luz. A los 40 días, las plántulas tuvieron el tamaño de hoja necesario

para obtener dos explantes: apical y proximal.



Los colores del ecotipo de maca correspondiente a cada plántula de

origen fueron denominados utilizando la siguiente nomenclatura:

M1 = Ecotipo amarillo, M2 = Ecotipo morado, M3 = Ecotipo negro.

IV.1.2.- EXPLANTES

Los explantes obtenidos fueron los siguientes:

E1: Región apical de la hoja (Aprox. 0.5 cm de longitud x 0.5 en la base.)

E2: Región proximal de la hoja del mismo tamaño que el explante anterior.

Los bordes de las hojas fueron cortados para obtener una mayor área de

inducción de callos.

E3: Porción de peciolo aprox. 1 cm de longitud.

E4: Hipocótilo completo, incluyendo la roseta meristemática, la mayoría de

ellos medía tuvieron aproximadamente 0.4 cm.

E5: raíces segmentos sin puntas de aprox.1 cm se escindieron de la región

proximal.

IV.1.3.- MEDIO DE CULTIVO PARA LA INDUCCIÓN DE CALLOS:

Se utilizaron dos hormonas vegetales para la inducción de callos, una

auxina (2,4-D) en concentraciones de 0, 0.1, 0.5, 1 y 10 µM y una citoquinina

(kinetina) en concentraciones de 0, 0.1, 0.5, 1 y 10 µM; como medio básico se

utilizó el medio descrito por Murashige y Skoog (1962) al que se le agregaron

mioinositol 100 ppm, pantotenato de calcio 2 ppm, vitaminas: tiamina 2 ppm,

piridoxina 0.5 ppm, ácido nicotínico 0.1 ppm y glicina 0.5 ppm; 2% de sucrosa y

0.2% de gelrite, tal como se utiliza en rutina en el LRGB, obteniéndose un

factorial de 17 medios de inducción semisólidos con diferentes concentraciones

de hormona incluyendo el control negativo.



V.1.4.- INDUCCIÓN DE CALLOS:

Se sembraron los explantes en placas petri descartables con 25 ml de

medio de inducción, haciendo cinco repeticiones por cada medio de inducción.

Las placas se mantuvieron en oscuridad a 25°C. realizándose evaluaciones a

partir de los 25 días de siembra con un intervalo de 10 días por evaluación

durante dos meses, estas evaluaciones fueron cualitativas para confirmar el

crecimiento de los callos.

A los dos meses de crecimiento se hizo el primer subcultivo en placas

petri descartables con medios de inducción frescos, a los cuatro meses se

evaluó el material midiendo el área ocupada por cada callo sobre una cuadrícula

milimetrada, para determinar así la masa relativa de los mismos y por

consiguiente el medio con mayor rendimiento en masa. Seguidamente, se

realizó el subcultivo de todos los callos en el medio K (ver apéndice), a partir de

entonces se realizaron subcultivos cada dos meses hasta los ocho meses

cuando se cosecharon los callos para la extracción de metabolitos secundarios.

IV.2.- DETECCIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS

Se realizaron cromatografías de papel para la detección de glucosinolatos

y cromatografías de capa fina ascendente para la detección de alcaloides tanto

en los callos obtenidos como en los controles, no se utilizó una sola línea celular

debido a la pequeña cantidad de materia seca obtenida de los callos como

consecuencia de su alto porcentaje de humedad. Para la extracción de los

metabolitos se utilizaron 30 mg muestra estabilizada.

La estabilización se realizó secando los callos en una estufa a 37° C por

36 horas para luego molerlos y guardar los frascos en un lugar seco y sin luz.

Como control, se usaron muestras de hipocótilos amarillos morados y negros



provenientes de la localidad de Huayre y estabilizadas en las mismas

condiciones que los callos. Los callos se clasificaron de acuerdo al color y

naturaleza del explante del que provenían, así un callo proveniente de la zona

apical de la hoja de ecotipo amarillo se denominó M1E1 y así sucesivamente (ver

apéndice). Esta clasificación nos facilitó el manejo de las muestra en las

cromatografías.

Antes de la pulverización de las muestras se determinó el % de humedad.

IV.2.1.- EXTRACCIÓN Y DETECCIÓN DE GLUCOSINOLATOS

Para la extracción y cromatografía de glucosinolatos se adecuó el

protocolo de rutina utilizado por el Dr. César Fuertes en el Instituto de Química

Orgánica Aplicada a la Farmacia, en la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la

Universidad Nacional Mayor de San Marcos (ver apéndice), como se describe a

continuación:

Para la extracción etanólica se tomaron 30 mg de cada tipo de callo y se

pusieron a macerar en 2 ml de etanol al 96% durante dos semanas. Se sembraron,

100 alicuotas de cada uno de estos extractos en hojas de papel Wathman N° 1 de

11 x 29 cm y se colocaron en un tanque de cromatografía de papel descendente,

dejándose desarrollar por 22 horas.

Como sistema solvente se usó una solución de n-butanol:etanol:agua (4:1:4)

descrito por Kjaer en 1968.

Después de retirar los papeles del tanque de cromatografía se secaron a

temperatura ambiente e inmediatamente se revelaron para lo cual se pulverizaron

primero con una solución de nitrato de plata:acetona 15 mg/ml, y luego de dejar

secar por unos minutos, con una solución de KOH:Etanol 20 mg/ml. Se dejaron

secar las hojas de papel unos minutos y se colocaron en una estufa caliente. Una



vez obtenidas las manchas indicadoras, se colocaron los cromatogramas en una

solución decolorante de hiposulfito de potasio al 5%, durante 20 hrs.

IV.2.2.- EXTRACCIÓN Y DETECCIÓN DE ALCALOIDES

Se utilizaron 30 mg de cada muestra, las que se pusieron a macerar en éter

etílico, realizándose tres extracciones sucesivas.

La cromatografía de capa fina se realizó de acuerdo a la técnica descrita por

Stahl (1958 y 1965), en cromatofolios de silicagel GF254 ( para las

cromatografías preliminares se usaron cromatofolios de 2 x 10 cm) y

cromatoplacas Kieselgel 60 G F254 (Merck) de 20 x 20 cm.

En las cromatografías preliminares se realizaron con las muestras de

hipocótilos de maca (controles) y se probaron las siguientes soluciones para el

sistema solvente:

Benzol : éter dietílico : metanol : amoniaco (75 : 75 : 6 : 0.7);

Cloroformo : metanol : amoniaco (2 : 0.12 : 0.02);

Cloroformo : metanol (2 : 1), (2 : 0.25), (2 : 0.15) y (2 : 0.12), siendo esta

última la que se utilizó en la estandarización de la cromatografía.

Se desarrollaron cromatografías de muestras acidificadas y sin acidificar.

Para el revelado de las placas se utilizó el reactivo de Dragendorff y

posteriormente el reactivo yodoplatinato de potasio.

Antes de revelar las placas se observaron en el espectro de luz UV.

En vista de la ausencia de resultados congruentes en la primera

cromatografía, se procedió a estandarizar la extracción en una muestra de



hipocótilos de varios colores, la cantidad de metabolitos no deseables para la

cromatografía fue bastante alta por lo que se procedió a lavar el extracto

acidificando el extracto etéreo con HCl acuoso, recuperándose la fase acuosa a

la cual, luego de ser alcalinizada con NaOH concentrado, se le agregó dos

volúmenes de éter etílico para recuperar la fase orgánica. Se cromatografió este

extracto en una cromatoplaca Kieselgel 60 F F254 (Merck) de 20 x 20 cm. Se

revelaron los bordes de la placa con el reactivo de Dragendorff modificado por

Munnier (1955) y el reactivo yodoplatinato de potasio, aislando luego las

regiones correspondientes a las manchas positivas.

Una vez obtenidas las fracciones positivas para alcaloides, se

cromatografiaron los extractos de callos y los controles, junto con el extracto

etéreo y sus cuatro fracciones, las que se usaron como un control extra.

IV.3.- DETECCIÓN DE MIROSINASAS IV.3.1.- ELECTROFORESIS.-

Se utilizó la electroforesis en geles de policrilamida (PAGE) para separar

las mirosinasas, los geles y buffers fueron preparados de acuerdo al sistema de

Laemmli (1970), pero eliminando el uso de SDS y mercaptoetanol tanto de las

soluciones de los geles como de las de los buffers para obtener una PAGE en

condiciones no denaturantes. La concentración de los geles fue de 8.6 y 7.5%.

Las corridas en los geles se llevaron a cabo con una corriente constante de 30

mA, el voltaje inicial fue de 80 V y el final de 250V. La duración de las corridas

fue de 5 horas.

IV.3.2.- EXTRACCIÓN DE LAS MUESTRAS.

Se llevó a cabo adaptando el protocolo de MacGibbon y Allison (1964): 0.5g

de muestra fueron molidos en un mortero frío con 2 ml de buffer Tris-Cl pH 6.8,



se centrifugó a 10,000 rpm por 4 min, se tomaron 80 µl del sobrenadante a los

que se añadieron mercaptoetanol 5 µl, glicerol 10 µl y 5µl de un stock de azul de

bromofenol preparado para los procedimientos de rutina del LRGB. Se

colocaron 50 µl de muestra en cada pocillo del gel.

Se utilizaron hipocótilos y hojas de campo.

IV.3.3.- DETECCIÓN DE ACTIVIDAD.-

Se adaptó la modificación del método de detección de actividad basado

en la formación de bandas de BaSO4, descrito por MacGibbon y Allison (1970),

esta modificación fue gentilmente proporcionada por el Dr. Atle Bones en una

comunicación personal (1999). Para adaptar este protocolo se utilizó un extracto

etanólico de semillas de mostaza, preparado moliendo 100 g de semillas y

macerándolas en 250 ml de alcohol etílico al 96%.

Cuando los geles fueron removidos, fueron colocados entre dos placas de vidrio

e incubados a 50°C en una solución acuosa de ácido ascórbico 1mM; Acetato de

Bario 10mM; Buffer Tris-Cl 0.5 M; pH 6.8 200 ml/L; extracto etanólico de semillas

de mostaza 300 ml/L.

Cuando se hicieron evidentes las bandas, los geles fueron fotografiados con una

cámara digital DAGEMIT CCD100 en blanco y negro.



CAPITULO V

RESULTADOS

V.1.- INDUCCIÓN DE CALLOS:

• En la primera evaluación, realizada a los 25 días de la incubación (Foto nro.

1), se observó la turgencia de las zonas del explante en donde se formarán

los callos y la formación de pequeños callos en varias zonas de los cortes. La

tabla Nro. 1 muestra la presencia de callos en los explantes (+).

TABLA Nro.1.- PRESENCIA DE CALLOS EN LOS EXPLANTES A LOS 25 DÍAS DE

INCUBACIÓN

COLOR

AMARILLO MORADO NEGRO

EXPLANTE

MEDIO DE

CULTIVO

E1 E2 E3 E4 E5 E1 E2 E3 E4 E5 E1 E2 E3 E4 E5

A - - - - - - - - - - - - - - -

B + - - + + + + + + + - + - + +

C + - + + + - - + + + + + + + +

D + + + + + + + + + + + + + + +

E - - - - - - - - - - - - - - -

F + - - + + - - + + + + + + + +

G - - - + + - + + + + - - + + +

H + + + + + - - - + + - - + + +

I - - - - - - - - - - - - - - -

J + - + + + + - + + + + + + + +

K + + + + + + + + + + + + + + +

L + + + + + + + + + + + + + + +

M - - - - - - - - - - - - - - -

N - - + + + - + - + + - - + + +

O + + + + + + + + + + + + + + +

P - - + + + + + + + + - - + + +

Q + + + + + + + + + + + + + + +

t t t

t t t



• La Tabla Nro. 2 muestra los resultados obtenidos en cada medio en los tres

colores de maca. Como muestra el gráfico Nro. 1 (apéndice) el medio K es

el que produjo una mayor área de callos callos y los medios I y M los que no

produjeron callos. Las variaciones de respuesta de cada ecotipo, pueden

verse en el gráfico Nro. 2 (apéndice)

TABLA Nro. 2.- ÁREA OCUPADA POR LOS CALLOS (mm2) EN UNA CUADRÍCULA MILIMETRADA

COLOR MEDIO DE

CULTIVO AMARILL

O

MORAD

O

NEGR

O

TOTAL

(mm)

A 15 37 46 98

B 701 640 1416 2757

C 2610 2438 1977 7025

D 1894 2445 2984 7323

E 13 45 68 126

F 1079 1445 719 3243

G 1338 1461 1468 4267

H 1295 1622 1512 4429

I 0 0 0 0

J 1286 725 779 2790

K 3831 3608 2913 10352

L 2090 2225 2458 6773

M 0 0 0 0

N 816 962 492 2270

O 1428 1807 1474 4709

P 1550 1631 1878 5059

Q 2357 2249 2489 7095

t t t

t t t



• El mayor número de callos en total, se obtuvo con el medio D, como se puede

ver en la Tabla Nro 3. El ecotipo negro como se puede ver en esta tabla rindió

el mayor número de callos. El gráfico Nro. 3 (apéndice) muestra las

variaciones de respuesta de cada ecotipo.

TABLA Nro. 3.- NÚMERO DE CALLOS OBTENIDOS 2 MESES DESPUÉS DEL

PRIMER SUBCULTIVO

COLOR MEDIO

DE

CULT.

AMARILL

O

MORAD

O

NEGR

O

TOTAL

A 2 3 5 10 B 13 22 22 57 C 19 12 22 53 D 23 28 25 76 E 2 6 5 13 F 18 19 17 54 G 19 19 24 62 H 24 24 19 67 I 0 0 0 0 J 14 14 14 42 K 25 23 22 70 L 19 29 22 70 M 0 0 0 0 N 11 13 9 33 O 22 24 25 71 P 14 15 18 47 Q 21 23 27 71

TOTAL 246 274 276 796

t t t

t t t

t t t



• La Tabla Nro. 4 muestra el número de callos por explante en el ecotipo

amarillo. El mayor número de callos se logró en el medio K, mientras que en

los medios I y M no se obtuvieron callos (gráfico Nro. 4, apéndice).

TABLA Nro. 4.- NUMERO DE CALLOS OBTENIDOS 2 MESES DESPUÉS DEL

PRIMER SUBCULTIVO

ECOTIPO AMARILLO

EXPLANTE MEDIO DE

CULTIVO E1 E2 E3 E4 E5 TOTAL

A 0 0 0 0 2 2

B 2 1 1 4 5 13

C 2 2 6 4 5 19

D 7 3 4 4 5 23

E 0 0 0 0 2 2

F 2 3 4 4 5 18

G 5 1 3 5 5 19

H 9 3 2 4 6 24

I 0 0 0 0 0 0

J 1 0 3 5 5 14

K 5 5 5 5 5 25

L 1 2 6 5 5 19

M 0 0 0 0 0 0

N 0 0 4 3 4 11

O 5 3 6 3 5 22

P 1 0 3 4 6 14

Q 4 3 6 3 5 21

t t t



• La Tabla Nro. 5 muestra el área total obtenida en cada medio por cada

explante en el ecotipo amarillo. Siendo el medio K el que produjo una mayor

área (gráfico Nro. 5).

TABLA Nro. 5.- ÁREA TOTAL OCUPADA POR LOS CALLOS (mm2 ) SOBRE

UNA CUADRÍCULA MILIMETRADA 2 MESES DESPUÉS DEL SUBCULTIVO

ECOTIPO AMARILLO

EXPLANTE MEDIO DE

CULT. E1 E2 E3 E4 E5 TOTAL

A 0 0 0 0 15 15

B 123 4 1 160 413 701

C 82 82 720 894 832 2610

D 298 192 309 240 855 1894

E 0 0 0 0 13 13

F 220 37 219 273 330 1079

G 12 10 69 624 623 1338

H 105 35 35 602 518 1295

I 0 0 0 0 0 0

J 25 0 259 388 614 1286

K 526 567 535 1231 972 3831

L 80 97 205 970 738 2090

M 0 0 0 0 0 0

N 0 0 80 231 505 816

O 70 76 277 295 710 1428

P 30 0 343 504 673 1550

Q 226 217 618 540 756 2357

t t t




morado. El mayor número de callos se logró en el medio L, mientras que en

los medios I y M no se obtuvieron callos (gráfico Nro. 6).

TABLA Nro. 6.- NUMERO DE CALLOS OBTENIDOS 2 MESES DESPUÉS DEL

PRIMER SUBCULTIVO

ECOTIPO MORADO

EXPLANTE

MEDIO DE


A 0 0 0 0 3 3

B 2 6 5 4 5 22

C 0 1 1 5 5 12

D 5 5 6 6 6 28

E 0 0 0 0 6 6

F 2 3 4 5 5 19

G 2 2 5 5 5 19

H 2 4 7 6 5 24

I 0 0 0 0 0 0

J 2 0 2 5 5 14

K 3 5 5 5 5 23

L 5 5 7 7 5 29

M 0 0 0 0 0 0

N 1 1 4 3 4 13

O 5 5 4 5 5 24

P 2 1 4 3 5 15

Q 5 6 2 5 5 23

t t t

t t t

t t t



• La Tabla Nro. 7 muestra el área total obtenida en cada medio en cada

explante en el ecotipo morado. Siendo el medio K el que produjo una mayor

área (gráfico Nro. 7).

TABLA Nro. 7.- ÁREA TOTAL OCUPADA POR LOS CALLOS (mm2) SOBRE

UNA CUADRÍCULA MILIMETRADA 2 MESES DESPUÉS DELPRIMER

SUBCULTIVO

ECOTIPO MORADO

EXPLANTE MEDIO DE

CULT. E1 E2 E3 E4 E5 TOTAL

A 0 0 0 0 37 37

B 0 30 1 274 335 640

C 206 247 591 605 789 2438

D 417 200 524 594 710 2445

E 0 0 0 0 45 45

F 202 116 191 524 412 1445

G 22 74 282 550 533 1461

H 3 44 361 353 861 1622

I 0 0 0 0 0 0

J 37 0 126 186 376 725

K 285 293 725 1058 1247 3608

L 144 155 438 802 686 2225

M 0 0 0 0 0 0

N 9 15 80 205 653 962

O 109 34 294 586 784 1807

P 86 6 215 563 761 1631

Q 465 216 310 657 601 2249

t t t

t t t

t t t




negro. El mayor número de callos se logró en el medio Q, mientras que en

los medios I y M no se obtuvieron callos (gráfico Nro. 8).

TABLA Nro. 8.- NÚMERO DE CALLOS OBTENIDOS. 2 MESES DESPUÉS DEL

PRIMER SUBCULTIVO

ECOTIPO NEGRO

EXPLANTE MEDIO DE


A 0 0 0 0 5 5

B 2 5 5 5 5 22

C 5 3 4 5 5 22

D 3 5 6 6 5 25

E 0 0 0 0 5 5

F 1 6 2 3 5 17

G 7 3 4 5 5 24

H 2 2 5 5 5 19

I 0 0 0 0 0 0

J 2 1 1 5 5 14

K 3 3 5 5 6 22

L 4 4 5 5 4 22

M 0 0 0 0 0 0

N 0 1 2 1 5 9

O 7 4 6 3 5 25

P 0 2 6 5 5 18

Q 6 8 3 5 5 27

t t t

t t t

t t t



• La Tabla Nro. 9 muestra el área total obtenida en cada medio en cada

explante en el ecotipo negro. Siendo los medio D y K los que produjeron

una mayor área (gráfico Nro. 9).

TABLA Nro. 9.- ÁREA TOTAL OCUPADA POR LOS CALLOS (mm2) SOBRE UNA

CUADRICULA MILIMETRADA 2 MESES DESPUÉS DEL SUBCULTIVO

ECOTIPO NEGRO

EXPLANTE MEDIO DE


A 0 0 0 0 46 46

B 84 242 294 257 539 1416

C 202 77 230 858 610 1977

D 728 515 629 379 733 2984

E 0 0 0 0 68 68

F 35 196 54 109 325 719

G 58 52 247 565 546 1468

H 3 39 288 442 740 1512

I 0 0 0 0 0 0

J 76 56 108 229 310 779

K 440 313 399 758 1003 2913

L 397 127 352 523 1059 2458

M 0 0 0 0 0 0

N 0 24 52 50 366 492

O 164 62 309 552 387 1474

P 0 102 271 620 885 1878

Q 189 378 497 661 764 2489

t t t

t t t



• En 10 de los medios se obtuvieron callos friables, como puede verse en la

Tabla Nro. 10, el medio en el que se logró mayor cantidad de callos

friables fue el medio K y el explante en el que se obtuvo mayor cantidad de

callos friables fue la raíz (E5), tanto en el ecotipo amarillo y morado como

en el negro. (Gráfico Nro. 10)

TABLA N° 10.- NÚMERO DE CALLOS FRIABLES OBTENIDOS POR MEDIO DE

CULTIVO Y EXPLANTE

COLOR


EXPLANTE EXPLANTE EXPLANTE

MEDIO DE

CULTIVO


TOTAL

A 0

B 4 4

C 1 2 1 1 5

D 5 1 5 1 12

G 0

F 0

G 2 1 1 4

H 1 3 1 2 7

I 0

J 0

K 1 2 4 1 2 4 2 3 3 1 23

L 2 1 2 5

M 0

N 1 2 3

O 1 1 1 1 4

P 2 2 4 8

Q 0

TOTAL 6 1 9 4 14 1 2 7 3 8 4 2 4 4 6 75

t t t



• Se observó que algunos callos presentaban zonas pigmentadas de negro. El

mayor número se presentó en los explantes E5 (raíces) tanto en el ecotipo

amarillo y morado como en el negro; y en el medio L, como se puede

apreciar en la Tabla Nro. 11.

TABLA Nro. 11.- NÚMERO DE CALLOS CON ZONAS PIGMENTADAS

OBTENIDOS EN LOS TRES ECOTIPOS

COLOR


EXPLANTE EXPLANTE EXPLANTE

ME-

DIO

E1 E2 E3 E4 E5 TOT E1 E2 E3 E4 E5 TOT E1 E2 E3 E4 E5 TOT

TOTAL

EN LOS

TRES

ECOTIP.

A 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

B 2 0 1 4 1 8 0 0 0 0 0 0 2 2 0 0 1 5 13

C 0 2 0 4 0 6 2 3 3 4 1 13 2 2 2 3 5 14 33

D 0 1 1 1 1 4 0 0 0 1 5 6 2 1 2 3 3 11 21

E 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

F 0 1 1 0 0 2 0 0 3 1 2 6 0 2 2 0 0 4 12

G 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

H 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

I 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

J 1 0 2 0 0 3 0 0 0 1 0 1 1 1 0 1 0 3 7

K 0 0 2 3 5 10 0 0 0 0 3 3 2 3 0 1 1 7 20

L 1 2 0 0 5 8 1 0 3 3 4 11 2 4 4 4 4 18 37

M 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

N 0 1 1 1 3 6 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 3 9

O 0 0 3 0 4 7 2 1 3 2 8 0 0 3 0 0 3 18

P 0 0 2 0 3 5 1 0 2 3 1 7 0 0 0 0 3 3 15

Q 0 1 4 1 5 11 2 0 2 0 0 4 1 0 3 0 0 4 19

TOTAL 4 8 17 14 27 70 6 5 14 16 18 59 12 16 17 12 18 75 204

t t t



• En los medios C, D, K, L y O se observaron algunos callos completamente

negros tabla Nro. 12 y 12A, gráfico Nro. 11 (apéndice)

TABLA NRO. 12.- NÚMERO DE CALLOS TOTALMENTE NEGROS

OBTENIDOS EN LOS TRES ECOTIPOS DE ACUERDO AL MEDIO DE

CULTIVO

COLOR


EXPLANTE EXPLANTE EXPLANTE MEDIO


TOTAL

C 1 O O O O O O O O 2 O O 1 O O 4

D O O 1 O O O O O O O O O O O O 1

K O O O O O O O O O 2 2 O O O O 4

L O O O O O 1 O O 1 O O O O O O 2

O O O 2 O O O 2 O O 1 O O O O O 5

TOTAL 1 0 3 0 0 1 2 0 1 5 2 0 1 0 0 16

t t t

t t t



CUADRO NRO. 12A.- NÚMERO DE CALLOS NEGROS OBTENIDOS POR

ECOTIPO Y EXPLANTE

EXPLANTE ECOTIP

O E1 E2 E3 E4 E5 TOTAL

AMARILL

O 1 0 3 0 0 4

MORAD

O 1 2 0 1 5 9

NEGRO 2 0 1 0 0 3

TOTAL 4 2 4 1 5 16

V.2.- DETECCION DE METABOLITOS SECUNDARIOS.

• Los callos mostraron un porcentaje de humedad de 94%.

V.2.1.- GLUCOSINOLATOS.

• La presencia de las fracciones se observó como una mancha negra como puede

apreciarse en las fotografías. Se observaron dos fracciones que se nominaron

como fracción 1 y fracción 2 (Fotografías 2 –6).

• En 13 de las muestras se observaron dos fracciones de glucosinolatos. En las

siete muestras restantes (M1E2, M1E3, M2E2, M2E3, M2E5, M3E3, y callo

negro), se observó la presencia de la fracción 1, como puede apreciarse en la

Tabla Nro. 19.

t t t

t t t



TABLA N° 2.- PRESENCIA DE GLUCOSINOLATOS EN HIPOCOTILOS Y

CALLOS DE MACA.

MUESTRA FRACCION 1 FRACCION 2

Hipocótilo amarillo + +

Hipocótilo morado + +

Hipocótilo negro + +

M1E1 + +

M1E2 + -

M1E3 + -

M1E4 + +

M1E5 + +

M2E1 + +

M2E2 + -

M2E3 + -

M2E4 + +

M2E5 + -

M3E1 + +

M3E2 + +

M3E3 + -

M3E4 + +

M3E5 + +

CALLO NEGRO + -

CALLO BLANCO + +



V.2.2.- ALCALOIDES.

En las cromatografías preliminares se observó la separación de cuatro

fracciones al usar como solvente la solución Cloroformo:metanol 2:0.12. Las

muestras acidificadas desarrollaron una sola fracción, mientras que las sin

acidificar mostraron cuatro fracciones.

Los resultados de la primera cromatografía (de todas las muestras) se

observan en la fotografía Nro. 7.

En el extracto lavado de hipocótilos de maca se obtuvieron cuatro

fracciones que fueron positivas tanto para el reactivo de Dragendorff.

Estas fracciones también fueron positivas para el reactivo yodoplatinato de

potasio, la fracción N°1 de color amarillo fue la de mayor Rf, y se presentó en la

mancha más grande, la fracción N° 2 de color plomizo debajo de ésta se halla

en cantidades pequeñas. La fracción N° 3 presentó un color marrón oscuro. La

fracción N° 4 que se encontró en el punto de siembra presentó un color azul

cemento (Fotografía Nro 8).

En la segunda cromatografía de todas las muestras, se observó la

presencia de las fracciones 1, 3 y 4, la segunda fracción no se observó en

ninguna de las muestras, incluyendo el extracto patrón, (fotografía Nro.9).

Al observar la cromatoplaca en la lámpara de luz ultravioleta, los patrones

de extractos de callos presentaron una gran cantidad de fracciones de

metabolitos mostrando patrones diferentes para cada muestra (Fotografía Nro

10). Las fracciones correspondientes a los alcaloides no mostraron fluorescencia.



V.3.- DETECCION DE MIROSINASAS

Se observó un patrón de una sola banda por muestra (foto), las bandas

se observaron demasiado cerca del borde superior del gel por lo que no se

midieron los Rf.



CAPITULO VI

DISCUSIÓN

VI.1.- INDUCCIÓN DE CALLOS.-

1. La respuesta a las diferentes concentraciones de hormonas fue variable. La

mayor producción de callos se obtuvo con los medios K,( 0.5/0.5 ìM 2,4-D/ìM

KIN), D ( 1/0 ìM 2,4-D/ìM KIN) y Q (10/10 ìM 2,4-D/ìM KIN) los medios C (

0.5/0 ìM 2,4-D/ìM KIN), L ( 1/0.5 ìM 2,4-D/ìM KIN) y P ( 1/1 ìM 2,4-D/ìM KIN)

tuvieron una respuesta menor a los anteriores pero superior a los demás. Del

mismo modo los medios M ( 0/1 ìM 2,4-D/ìM KIN) e I ( 0/0.5 ìM 2,4-D/ìM KIN)

no produjeron ninguna respuesta callogénica, mientras que el medio E ( 0/0.1 ìM

2,4-D/ìM KIN) produjo una bajísima respuesta. De todo esto y de la observación

del comportamiento de los explantes en los demás medios, podemos inferir que

la presencia del 2,4-D es de mayor importancia para la inducción de callos que la

KIN, siendo inclusive suficiente para la callogénesis. Esta observación es

congruente con el análisis estadístico realizado para esta prueba, el cual nos

muestra que el 2,4-D tiene un efecto estadísticamente significativo en la

inducción de callos. Siendo su significancia mayor que la de la auxina y la

interacción de ambas hormonas. Este dominancia ya fue señala da en otras

ocasiones, Dodds ( 1982) hace referencia a su uso junto con el agua de coco

para inducir la proliferación celular, al parecer esta alta eficiencia del 2,4-D en la

inducción de callos se debe a la alta disponibilidad de auxinas en los tejidos de la

mayoría de las dicotiledóneas ( Jacobsen, 1983)

2. En crucíferas, los callos son generalmente iniciados y mantenidos en medios que

presentasn una relacion auxina, citoquinina mayor que 1. en nuestro caso en

presencia de la KIN, la concentración de 2,4-D que dio mejores resultados fue la

de 0.5 ìM, ya que en concentraciones mayores el rendimiento del medio



disminuye, aun cuando la relación con la citoquinina es 1/1. Por otro lado,

podemos ver que la presencia de la KIN potencia la efectividad del 2,4-D siempre

y cuando su concentración no exceda la del 2,4-D, pues en estos casos el

rendimiento del medio disminuye. Esta disminución de la actividad podría estar

relacionada a la toxicidad del 2,4- D, pues como reportan Carew y Krueger (1977,

citados por Yerman. 1980 ) tiene efectos inhibitorios a concentraciones de 1 mgr.

por litro. De la misma la disminución en la producción de callos cuando la

relación auxina/citoquinina disminuye pueden explicarse por la actividad

inhibitoria que tienen las citoquininas cuando se presentan en altas

concentraciones (Yeoman y Forsche, 1980).

3. El medio que produjo mayor número de callos fue el medio D, seguido por los

medios O, Q, K y L, el rendimiento de masa en los medios D y Q está relacionado

al número de callos generado más que al tamaño de los mismos. La significancia

de cada una de las hormonas en el número de callos producidos es mayor para

el 2,4-D que para la KIN, sin embargo la combinación de ambas hormonas no

tiene un efecto significativo en el número de callos obtenidos. (ver apéndice:

análisis estadístico) lo cual nos indicaría que cuando el objetivo es lograr un

mayor número de líneas celulares quizá sería conveniente experimentar con una

sola hormona, especialmente el 2,4 –D.

4. La mayor efectividad del 2,4 –D corresponde a la esperada, pues es congruentes

con los resultados obtenidos por Carhuaz en Lepidium peruvianum (1997, sin

publicar) y por los resultados obtenidos en el cultivo de tejidos de diferentes

especies de la familia Cruciferae. (Flick y colb. 1983)

5. La respuesta de los ecotipos a cada uno de los medios de cultivo no fue

uniforme, como puede observarse en los gráficos 2C, 2D y 2E, siendo el ecotipo

negro el que presento mayor diferencia, sin embargo estas diferencias no son



demasiado grandes.

6. La masa de callos obtenidas en cada uno de los ecotipos fue mayor en el medio

K en todos los casos, mientras que los medios con los que se obtuvo un mayor

número de callos fue diferente para cada ecotipo (K, L y Q para amarillo, morado

y negro respectivamente) lo que nos muestra que la respuesta de los explantes

respecto al número de callos por explante no es uniforme. Al analizar la

respuesta de los explantes por ecotipo, se ha observado que las raíces tienen

una respuesta significativamente diferente a los otros explantes. Mientras que

para la respuesta de los explantes en relación del área ocupada por los callos se

observa una respuesta descendente de raíz a hoja. Es así que en ambos casos

las raíces son los tejidos de mayor potencial callogenético.

7. El medio A no contiene hormonas, sin embargo en este medio se produjo una

pequeña cantidad de callos, estos podrían deberse a la presencia de hormonas

endógenas en este explante que permiten la callogénesis como respuesta al

corte, esto sería coherente con la observación de que este es el explante que

produce mayor número y masa de callos en todos los ecotipos y medios y al

hecho de que en las raíces se producen auxinas endógenas (Hopkins 1999).

8. No se observaron diferencias significativas entre los dos tipos de explantes de

hoja, lo cual es coherente con los resultados obtenidos en otros trabajos, de otro

lado el medio Q fue el que produjo el mayor número de callos en estos

explantes.

9. Los peciolos e hipocótilos tuvieron una respuesta mucho mayor a los

tratamientos siendo el hipocótilo el más susceptible de los dos, esto tendría

relación con la presencia de tejido meristemático en este explante.



10. El medio que produjo mayor cantidad de explantes friables fue el medio K,

aunque la cantidad obtenida de este tipo de callos fue bastante pequeña, lo cual

se podría deber a una predisposición de la especie o al tipo de actividad de las

hormonas usadas, de todos modos a diferencia del número de callos obtenido y

el área ocupada por los callos, en este caso puede observarse que la interacción

de las hormonas tiene un efecto más significativo que el de las hormonas solas.

11. Los explantes que produjeron la mayor cantidad de callos friables fueron los

provenientes de las raíces, mientras que los provenientes de los hipocótilos

produjeron menor cantidad de callos friables que los pecíolos, siendo igual que

en los explantes de la región terminal de la hoja. En este caso no se observaron

diferencias significativas entre los explantes de hoja terminal y proximal, aunque

el menos susceptible fue el explante proximal. Si bien la raíz y el hipocótilo

produjeron mayor número de callos friables, la diferencia entre ambos explantes

no fue significativa.

12. El efecto del color del ecotipo en la obtención de callos friables fue

significativamente diferente para el color amarillo, mientras que entre el el ecotipo

morado y negro, las diferencias no fueron significativas.

13. La presencia de callos con pigmentación negra puede explicarse por la presencia

de metabolitos secundarios en los callos, el número obtenido en los explantes

provenientes del ecotipo amarillo fue similar al obtenido del ecotipo negro, y

ambos fueron superiores a la cantidad obtenida en el ecotipo morado, por otro

lado la cantidad de callos totalmente negros obtenido en el ecotipo morado fue

mucho mayor que en los ecotipos negro y amarillo. Esto nos indicaría que esta

pigmentación no está relacionada con el color del ecotipo del que proviene el

explante.



VI.2.- DETECCION DE METABOLITOS SECUNDARIOS

13. Los callos de Lepidium peruvianum Ch. sí producen glucosinolatos. Pero la

producción de estos metabolitos varía de acuerdo al callo, pudiendo ser mayor o

menor. Se encontraron callos en los que se formaron solo una de las fracciones.

Esto demuestra que el cultivo de callos de maca, puede ser utilizado para hallar

líneas que produzcan un solo tipo de glucosinolato, o los produzcan en

cantidades mayores a las obtenidas en campo.

14. Los explantes provenientes de peciolo(E3) y de la parte proximal de la hoja (E2)

mostraron una sola fracción de glucosinolatos en casi todos los casos, esto

sugeriría que el origen de los explantes estaría involucrado en la cantidad y tipo

de glucosinolatos producidos. Para poder comprobar esta posibilidad se tendría

que realizar pruebas con un tamaño de muestra estadísticamente significativa.

15. El origen de los explantes no parece ser la causa de la variabilidad de la

producción de callos. Pues los callos con diferentes patrones cromatográficos

provienen de diferentes tipos de explante y de plántulas de diferentes ecotipos.

Sin embargo en este caso también se observa una variabilidad alta en el

explante E5.

16. Los Rf de cada una de las fracciones es muy similar pero no igual para cada

extracto, esto puede deberse a que, por el tamaño de la cámara, las muestras no

se pudieron desarrollar en una sola cromatografía por lo que no estuvieron

sujetas a condiciones idénticas.

17. El mayor tamaño de las manchas de glucosinolatos en los extractos de callo,

indican una mayor concentración del metabolito en éstos. Esto nos brinda muy

buenas expectativas para su producción in vitro.



18. En los cromatogramas de glucosinolatos se observan manchas débiles a lo largo

del cromatograma, estas manchas fueron asumidas como porciones de

glucosionatos la por la mirosinasa, (Kjaer, 1970). Sin embargo, Genyi y col.

reportaron en el año 2001, la presencia de otros glucosinolatos en maca, si bien

en pequeñas cantidades. Debido a esto estas no podemos asegurar que

manchas correspondan a artefactos o a esos glucosinolatos.

19. Los patrones cromatográficos de alcaloides muestran una gran variabilidad, así

como los patrones de los metabolitos con fluorescencia a la luz UV, esto nos

indicaría que los callos tienen una gran variabilidad respecto a su producción de

metabolitos, lo que sería de gran utilidad en el caso de necesitarse la explotación

de alguno de estos. Los extractos que mostraron una presencia notablemente

mayor de una de las fracciones de alcaloides fueron los de los callos M3E3 y

M3E4.

20. La fracción N° 2 del extracto de alcaloides, no es detectable cuando se

cromatografiaron cantidades pequeñas de extracto, por lo que su ausencia en la

cromatografía de los extractos de callos y controles no indican ausencia

necesaria del metabolito.

21. El hecho de que algunos extractos de callos muestren mayor presencia de

algunas fracciones de callos y dada la pequeña cantidad en la que parecen

encontrarse en los hipocótilos, el cultivo de callos o suspensiones celulares

puede ser utilizada para lograr mayores cantidades que permitan el estudio de

las propiedades y actividad biológica de estos compuestos.

22. La poca cantidad de alcaloides que presenta la planta, puede ser aumenta en el

cultivo de tejidos utilizando callos con mayor tiempo de incubación, pues, la

producción de metabolitos secundarios aumenta al iniciarse la fase estacionaria



(Yeoman y colb. 1980), y la de los alcaloides es inversamente proporcional a la

tasa de crecimiento (Carew y Krueger, 1977). Esta propiedad debe ser tomada

en cuenta tanto en el caso de desear producir alcaloides como otros metabolitos.

23. El hecho de que en algunos callos se observe manchas mas intensas que en el

hipocótilo y que en otros casos se observen fracciones que no se presentan en

las muestras de hipocótilos, nos indicaría el gran potencial de la planta, pues

usualmente los cultivos de tejidos vegetales producen metabolitos en pequeñas

cantidades ( Yanadi y Fujita, 1983), por otro lado la alta variabilidad de la

producción de metabolitos merece que se realicen investigaciones posteriores

para determinar si estas variaciones son fisiológics o genéticas, dado del

potencial mitogénico del 2,4-D y el aumento de la variabilidad producido por la

tecnica de cultivo de tejidos (Reisch, 1983).

VI.3.- DETECCION DE MIROSINASAS

24. La detección de mirosinasas fue cualitativa, con la finalidad de determinar

únicamente la presencia de mirosinasas en los callos e hipocótilos, pues para

una evaluación cuantitativa, se requeriría de mayores estudios de la presencia de

esta enzima en esta especie.

25. El que las bandas de mirosinasas no migraran mucho más allá de la parte

superior del gel, a pesar de dejarlas correr por encima del tiempo requerido de

acuerdo a la migración del frente de corrida, nos indicaría que estas proteínas

tienen un gran peso molecular, esto estaría en concordancia con los resultados

obtenidos por MacGibbon y Allison (1970) en otras especies y a la vez nos

indicaría que la mirosinasas de maca son mas grandes que las de otras especies

estudiadas.



CAPITULO VII

CONCLUSIONES

1. Lepidium peruvianum es susceptible a la inducción de callos con auxinas y

citoquininas.

2. La auxina 2,4-D es eficiente en la inducción de callos, siendo su concentración

óptima la de 0.5 ìM.

3. La relación óptima 2,4-D/KIN es de 1

4. El comportamiento de los callos de L. peruvianum es altamente variable respecto

a la presencia de metabolitos secundarios.

5. Lepidium peruvianum es una especie que presenta condiciones óptimas para

realizar estudios de producción de metabolitos secundarios in vitro.

6. La enzima mirosinasa sí está presente en los callos y plantas de campo de L.

peruvianum. Estas enzimas son de gran tamaño molecular.



CAPITULO VIII

RECOMENDACIONES

1. Recomendamos iniciar un estudio del metabolismo secundario de callos de L.

peruvianum, “maca” que nos permita determinar los factores que induzcan la

producción de metabolitos in vitro.

2. También es necesario profundizar el estudio de alcaloides de maca, para

determinar la estructura y actividad biológica de los mismos.

3. Realizar estudios histoquímicos que determinen la distribución de los

glucosinolatos y mirosinasas en la planta.

4. Sería recomendable realizar la caracterización de las mirosinasas de L.

peruvianum y compararlas con las descritas en otras especies.



CAPITULO IX

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Cruciferae and Two Capparaceae Species. Phytochemistry . Vol 20. Nro. 10. Pp

2355 – 2358.

YEOMAN, M & FORCHE,E. 1980. Cell Proliferation and Growth in Callus Cultures.

International review of Cytology, Supplement 11A. 1-24.

YLLESCA, M. 1994. Estudio químico y fitoquímico comparativo de 3 ecotipos de

Lepidium meyenii Walp. "Maca", procedente de Carhuamayo (Junín). Cátedra en

Bromatología. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Universidad Nacional Mayor de

San Marcos. Lima.



APÉNDICE























FACTORIAL DE MEDIOS DE CULTIVO

FACTORIAL DE MEDIOS DE CULTIVO

KIN REGULADORES DE

CRECIMIENTO 0 ìM 0.1 ìM 0.5 ìM 1 ìM 10 ìM

0 ìM A E I M -

0.1 ìM B F J N -

0.5 ìM C G K O -

1 ìM D H L P -

2.4-D

10 ìM - - - - Q

2,4-D KIN (uM) (uM) A 0.0 0.0 B 0.1 0.0 C 0.5 0.0

D 1.0 0.0 E 0.0 0.1

F 0.1 0.1 G 0.5 0.1 H 1.0 0.1

I 0.0 0.5 J 0.1 0.5 K 0.5 0.5

L 1.0 0.5 M 0.0 1.0 N 0.1 1.0

O 0.5 1.0 P 1.0 1.0 Q 10.0 10.0

t t t

t t t

t t t

t t t



COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO MURASHIGE Y SKOOG (1962)

CONSTITUYENTES mM Mg/lt

MACRONUTRIENTES

KNO3 18.8000 1900.00

NH4NO3 20.6000 1650.00

CaCl2.2H2O 3.0000 440.00

MgSO4.7H2O 1.5000 370.00

KH2PO4 1.2500 170.00

MICRONUTRIENTES

MnSO4.4H2O 0.1000 22.30

ZnSO4.7H2O 0.0300 8.60

H3BO3 0.1000 6.30

KI 0.0050 0.8300

NA2MoO2.2H2O 0.0010 0.2500

CoSO4.6H2O 0.0001 0.0250

CuSO4.5H2O 0.0001 0.0250

FeSO4.7H2O 0.1000 27.80

Na2EDTA 0.1000 37.30

FUENTE: Laboratorio de Recursos Genéticos y Biotecnología - UNMSM.



COMPOSICION ANALITICA DE MACA

%

Agua 10.4

Proteínas 10.2

Lípidos 2.2

Carbohidratos 59

Fibra 8.5

Ceniza 4.9

FUENTE: DE SIMONE, F. y RASTRELLI, L.1998.ITA'NUTRICIONALI DEI TUBERI ANDINI. En La

maca "Il Ginseng delle Ande" e Altre Radici e Tuberi Andini. Cuaderni IILa . Serie Scienza 10. Roma

COMPOSICION MINERAL DE MACA ( mg/ 100 g de materia seca)

Mg/100 g

Fe 16.6

Mn 0.8

Cu 5.9

Zn 3.8

Na 18.7

K 2050

Ca 150

FUENTE: DE SIMONE, F. y RASTRELLI, L.1998.ITA'NUTRICIONALI DEI TUBERI ANDINI. En La

maca "Il Ginseng delle Ande" e Altre Radici e Tuberi Andini. Cuaderni IILa . Serie Scienza 10. Roma



COMPOSICIÓN AMINOACIDICA Y CALIDAD PROTEICA DE “MACA”

Aminoácido (Rt,

min) mg/g proteína

Aminoácidos

esenciales patrón de la

FAO-OMS 1973

Indice

químico mg/g

proteína

Acido Aspártico

(2.7) 91.7 - -

Acido Glutámico

(4.0) 156.5 - -

Serina (10.1) 50.4 - -

Histidina (14.2) 21.9 - -

Glicina (15.1) 68.3 - -

Treonina (15.7) 33.1 40 83

Arginina (22.5) 99.4 - -

Alanina (24.5) 63.1 - -

Tirosina (25.2) 30.6

} 60 143

Fenialanina (37.8) 55.3

Metionina (30.8) 28 35 80

Valían (31.3) 79.3 50 158

Isoleucina (35.7) 47.4 40 118

Leucina (38.1) 91 70 130

Lisina (47.0) 54.5 55 99

Triptofano n.d. 10 n.d.

OH-prolina (33.8) 26.6 - -

Prolina (43.1) 0.5 - -

FUENTE: DE SIMONE, F. y RASTRELLI, L.1998.ITA'NUTRICIONALI DEI TUBERI ANDINI. En La maca "Il Ginseng delle Ande" e Altre Radici e Tuberi Andini. Cuaderni IILa . Serie Scienza 10. Roma



PROTOCOLO DE EXTRACCION Y CROMATOGRAFIA EN PAPEL DE

GLUCOSINOLATOS

Extracción

Macerar las muestras en etanol al 96% por 3 días como mínimo.

Filtrar

Guardar la solución y con el residuo hacer una nueva extracción con etanol.

Filtrar y guardar con la solución anterior.

Cromatografía en papel

Cortar las hojas de papel de 11 x 29 cm. Hacer tres dobleces a 2, 4 y cm del borde

del papel para que sirvan de soporte de la hoja en el tanque de cromatografía.

A 5 cm del borde hacer una marca con lápiz y hacer pequeñas equis en ella donde

se va a sembrar la muestra.

Colocar una alicuota de cada muestra en cada marca, dejar secar, repetir 40 veces.

Colocar los papeles en las bandejas de soporte del tanque de cromatografía, y

sujetar con las varillas respectivas. Agregar el solvente a las bandejas y tapar

herméticamente el tanque.

Dejar desarrollar durante la noche.

Retirar del tanque de cromatografía y secar.

Pulverizar con una solución de nitrato de plata : acetona 15 mg/ml, dejar secar unos

minutos

Pulverizar con una solución de KOH : Etanol 20 mg/ml, dejar secar unos minutos.

Colocar los cromatogramas en una estufa caliente.



Retirar de la estufa cuando se forman las manchas negras, (indicadoras de la

presencia de glucosinolatos).

Sumergir en una solución de hiposulfito de potasio al 5% por 20 - 24 para

decolorar.

Secar Fotocopiar inmediatamente.

Preparación del solvente Hacer una solución de n-butanol:etanol:agua 4:1:4 en una pera de decantación.

La mezcla se realiza en orden: mezclar primero el n-butanol y el etanol, agitar y

agregar el agua, agitar bien y dejar reposar sin mover 24 hr.

Se obtienen dos fases: una acuosa y una orgánica (superior), desechar la fase

acuosa.

Preparación del revelador Solución de nitrato de plata : acetona (para 100 ml.) Preparar una solución saturada de nitrato de plata y agua: diluir 1.5 gr. de nitrato de

plata en 0.5 ml. de agua destilada, si no se disuelve calentar ligeramente a baño

María

Disolver en 80 ml. de acetona y agregar agua destilada hasta disolver el precipitado

que se haya formado.

Usar inmediatamente.

Solución de hidróxido de potasio : etanol. Solución al 2% (para 100 ml)

Disolver 2 gr de KOH en 0.5 ml de agua destilada y completar a 100 ml con etanol.

Preparación de la solución de hiposulfito de sodio al 5% (decolorante)

Disolver 2 gr de hiposulfito de sodio en 400 ml de agua destilada.



PROTOCOLO DE EXTRACCION Y CROMATOGRAFIA DE ALCALOIDES

Extracción

A.- extracto crudo:

Colocar las muestra estabilizada en un frasco y humedecer con amoniacoy dejar en

oscuridad por 48 hr.

Agregar éter etílico agitar y reposar varios días.

Filtrar o centrifugar.

B.- extracto lavado:

Macerar la muestra con una solución de agua : etanol (4:1).

Acidificar hasta pH 3 ó 4 con HCl.

Centrifugar o filtra para recuperar la fase acuosa.

Alcalinizar la fase acuosa con NaOH u otro álcali, hasta pH 8 ó 9.

Poner en una pera de decantación y agregar una cantidad similar de eter etilico,

agitar y recuperar la fase orgánica.

Repetir esta extracción.

Cromatografía de capa fina ascendente.

Sembrar las muestras en un cromatograma de silicagel

Colocar el solvente en el tanque de cromatografía de capa fina ascendente, cerrar

herméticamente y dejar saturar.

Colocar la cromatoplaca en el tanque, cerrar herméticamente y dejar desarrollar.

Cuando el solvente llega al tope de la placa, sacar la cromatoplaca del tanque, dejar

secar y pulverizar con el revelador.



Preparación del solvente

Mezclar en el tanque de cromatografía cloroformo:metanol u otra sol en las

proporciones adecuadas en nuestro caso la proporción fue 2 : 0.12.

Preparación del revelador

Reactivo de Dragendorff (modificado por Munnier)

SOLUCION I.- Disolver 17 gr de subnitrato de bismuto y 200 gr. de ácido tartárico en

800 ml de agua destilada.

SOLUCION II.- Disolver 160 gr de yoduro de potasio en 400 ml de agua destilada.

Mezclar las soluciones I y II en una proporción 1 : 1

PARA USAR: disolver 100 gr. De ácido tartárico en 50 ml de esta mezcla y 500 ml

de agua destilada.

El stock puede almacenarse durante meses. La solución diluida puede almacenarse

por unas semanas.

Reactivo Yodoplatinado

Diluir 3ml de ácido cloroplatínico al 10% en 97 ml de agua destilada.

Agregar 100 ml de solución de yoduro de potasio al 6%.

Este reactivo puede almacenarse por largo tiempo.



ANÁLISIS ESTADÍSTICO

ANÁLISIS DE VARIANZA PARA EFECTOS FIJO CON MEDIDAS

REPETIDAS

DISEÑO DE DOS FACTORES

PARA EL EFECTO DE LOS MEDIOS EN LA MASA TOTAL DE CALLOS OBTENIDOS τ i Para el factor 2,4-D

Ho :τ 1=:τ 2=:τ 3=:τ 4=0 H1:Al menos un τ i diferente de cero i = 1, 2, 3, 4

β i Para el factor KIN

Ho β 1 = β 2 = β 3 = β 4=0 H1 Al menos una βi diferente a cero i = 1, 2,3,4

Para el factor 2,4-D * KIN

Ho : (τ β )ij = 0 H1 Al menos una (τ β )ij diferente a cero

Nivel de significancia α =0.05 F crítico =9.36

Región crítica Fcal >F crítico el tratamiento estadísticamente significativo existe efecto *estadísticamente significativo existe efecto

scua gl mcua F ss2,4-D 36338061 3 12112687 156* ssKIN 3835449 31278483.13 16* ssinter 5971750 91990583.17 26* sserrores 2491388 32 77855.875 sst 48636647.81 47



EFECTO DE LOS MEDIOS SOBRE EL NUMERO DE CALLOS OBTENIDO Hipótesis τ i Para el factor 2,4-D

Ho :τ 1=:τ 2=:τ 3=:τ 4=0 H1:Al menos un τ i diferente de cero i =1, 2, 3, 4


Ho β 1= = β 2 = β 3 = β 4=0 H1 Al menos una βi diferente a cero i =1, 2, 3,4


Ho : (τ β )ij= 0 H1 Al menos una (τ β )ij diferente a cero



Scua gl mcua f

ss2,4-D 3071 3 1024 29.3*

ssKIN 112.5625 3 37.52083333 17*

ssinter 284 9 94.673611112.705639747

sserrores 11197 32 349.9121094

sst 14665 47

t t t



EFECTO DE LOS MEDIOS SOBRE EL NUMERO DE CALLOS OBTENIDOS EN EL ECOTIPO AMARILLO Hipótesis

τ i Para el factor 2,4-D



Ho β 1= = β 2 = β 3 = β 4=0 H1 Al menos una βi diferente a cero i =1, 2, 3, 4




Región crítica Fcal >Critico el tratamiento estadísticamente significativo existe efecto *estadísticamente significativo existe efecto

scua gl mcua F

ss2,4-D 206 3 69 10*

ssKIN 6.7375 3 2 0

ssinter 17 9 6 1

sserrores 211 32 7

sst 440 47



EFECTO DE LOS MEDIOS SOBRE EL ÁREA OCUPADA POR LOS CALLOS EN EL ECOTIPO AMARILLO Hipótesis τ i Para el factor 2,4-D


β i Para el factor KIN Ho β 1= = β 2 = β 3 = β 4=0 H1 Al menos una βi diferente a cero i =1, 2, 3, 4 Para el factor 2,4-D * KIN

Ho : (τ β )ij= 0 H1 Al menos una (τ β )ij diferente a cero Nivel de significancia α =0.05 F crítico =9.36

Regios crítica Fcal >F crítico el tratamiento estadísticamente significativo existe efecto *estadísticamente significativo existe efecto

scua gl mcua f ss2,4-D 2350703 3 783568 13*

SsKIN 399929 3 133310 2

ssinter 542059 9 180686 3

sserrores 3988904.4 64 62326.6313 Sst 7281595.55 47



EFECTO DE LOS MEDIOS SOBRE EL NUMERO DE CALLOS OBTENIDOS EN EL ECOTIPO MORADO Hipótesis τ i Para el factor 2,4-D



Ho β 1= = β 2 = β 3 = β 4=0 H1 Al menos una βi diferente a cero i =1, 2, 3, 4 Para el factor 2,4-D * KIN

Ho : (τ β )ij= 0 H1 Al menos una (τ β )ij diferente a cero Nivel de significancia α =0.05 F crítico =9.36


scua gl mcua f ss2,4-D 213 3 71 31*

ssKIN 8 3 3 1

ssinter 50 9 17 7

sserrores 148 32 2 sst 419 47

t t t



EFECTO DE LOS MEDIOS SOBRE EL ÁREA OCUPADA POR LOS CALLOS EN EL ECOTIPO MORADO Hipótesis

τ i Para el factor 2,4-D


β i Para el factor KIN Ho β 1= = β 2 = β 3 = β 4=0 H1 Al menos una βi diferente a cero i =1, 2, 3, 4




Región crítica Fcal >F crítico el tratamiemto estadísticamente significativo exlste efecto *estadísticamente significativo exlste efecto

scua gl mcua f ss2,4-D 3E+06 3 875861 14*

ssKIN 1E+05 3 49762 1

ssinter 6E+05 9 189788 3

sserrores4E+06 64 64090 sst 7E+06 47

t t t



EFECTO DE LOS MEDIOS SOBRE EL NUMERO DE CALLOS OBTENIDOS EN EL ECOTIPO NEGRO Hipótesis τ i Para el factor 2,4-D



Ho β 1= = β 2 = β 3 = β 4=0 H1 Al menos una βi diferente a cero i =1, 2, 3, 4




Region crítica Fcal >F crítico el tratamiemto estadísticamente significativo exlste efecto *estadísticamente significativo exlste efecto

scua gl mcua f ss2,4-D 207 3 69 38*

ssKIN 13 3 4 15*

ssinter 17 9 6 4

sserrores 927 64 14 sst 1165 47

t t t



EFECTO DE LOS MEDIOS SOBRE EL ÁREA OCUPADA POR LOS CALLOS EN EL ECOTIPO NEGRO Hipótesis τ i Para el factor 2,4-D






Region crítica Fcal >F crítico el tratamiemto estadísticamente significativo exlste efecto *estadísticamente significativo exlste efecto.

scua gl mcua f ss2,4-D 2E+06 3E+00 8E+05 60*

ssKIN 3E+05 3E+00 1E+05 70*

ssinter 2E+06 9E+00 8E+05 50*

sserrores 9E+05 6E+01 1E+04 sst 6E+06 5E+01

t t t



EFECTO DEL TIPO DE EXPLANTE SOBRE EL NÚMERO DE CALLOS OBTENIDOS EN EL ECOTIPO AMARILLO Multiple Comparisons Dependent Variable: TABLA4 Tukey HSD

* Estadísticamente significativo existe diferencias si p<0.05

Mean Differenc

e (I-J)

Std. Error

(I) N (J) NE1 E2 1.0625 .7611 .632

E3 -.4375 .7611 .978E4 -.6250 .7611 .923E5 -1.5625 .7611 .005

E2 E1 -1.0625 .7611 .632E3. -1.5000 .7611 .290E4. -1.6875 .7611 .185E5. -2.6250 .7611 .008

E3 E1. .4375 .7611 .978E2. 1.5000 .7611 .290E4. -.1875 .7611 .999E5. -1.1250 .7611 .000

E4 E1. .6250 .7611 .923E2. 1.6875 .7611 .185E3. .1875 .7611 .999E5. -.9375 .7611 .000

E5 E1. 1.5625 .7611 .005E2. 2.6250 .7611 .008E3. 1.1250 .7611 .000E4 .9375 .7611 .000

t t t



EFECTO DEL TIPO DE EXPLANTE SOBRE EL ÁREA DE CALLOS OBTENIDOS EN EL ECOTIPO AMARILLO Multiple Comparisons Dependent Variable: TABLA5 Tukey HSD si p

Estadísticamente significativo existe diferencias si p<0.05

Mean Difference

(I-J)

Std. Error p.

(I) N (J) NE1 E2 29.4375 91.8309 .998

E3 -92.5625 91.8309 .851E4 -302.5625 91.8309 .013E5 -390.0000 91.8309 .001

E2 E1 -29.4375 91.8309 .998E3. -122.0000 91.8309 .674E4. -332.0000 91.8309 .005E5. -419.4375 91.8309 .000

E3 E1. 92.5625 91.8309 .851E2. 122.0000 91.8309 .674E4. -210.0000 91.8309 .161E5. -297.4375 91.8309 .015

E4 E1. 302.5625 91.8309 .013E2. 332.0000 91.8309 .005E3. 210.0000 91.8309 .161E5. -87.4375 91.8309 .875

E5 E1. 390.0000 91.8309 .001E2. 419.4375 91.8309 .000E3. 297.4375 91.8309 .015E4 87.4375 91.8309 .875

t t t



EFECTO DEL TIPO DE EXPLANTE SOBRE EL NÚMERO DE CALLOS OBTENIDOS EN EL ECOTIPO MORADO Multiple Comparisons Dependent Variable: TABLA6 Tukey HSD

Mean Differenc

e (I-J)

Std. Error

p

(I) N (J) NE1 E2 -.4375 .7739 .980

E3 -1.4375 .7739 .349E4 -1.7500 .7739 .169E5 -2.3750 .7739 .024

E2 E1 .4375 .7739 .980E3. -1.0000 .7739 .697E4. -1.3125 .7739 .443E5. -1.9375 .7739 .000

E3 E1. 1.4375 .7739 .349E2. 1.0000 .7739 .697E4. -.3125 .7739 .994E5. -.9375 .7739 .002

E4 E1. 1.7500 .7739 .169E2. 1.3125 .7739 .443E3. .3125 .7739 .994E5. -.6250 .7739 .003

E5 E1. 2.3750 .7739 .024E2. 1.9375 .7739 .000E3. .9375 .7739 .002E4 .6250 .7739 .003

Estadísticamente significativo existe diferencias <0.05



EFECTO DEL TIPO DE EXPLANTE SOBRE EL ÁREA DE CALLOS OBTENIDOS EN EL ECOTIPO MORADO Multiple Comparisons Dependent Variable: TABLA7 Tukey HSD

Mean Difference

(I-J)

Std. Error p

(I) N (J) NE1 E2 19.1250 88.6138 1.000

E3 -144.2500 88.6138 .485E4 -298.7500 88.6138 .010E5 -419.3125 88.6138 .000

E2 E1 -19.1250 88.6138 1.000E3. -163.3750 88.6138 .357E4. -317.8750 88.6138 .005E5. -438.4375 88.6138 .000

E3 E1. 144.2500 88.6138 .485E2. 163.3750 88.6138 .357E4. -154.5000 88.6138 .414E5. -275.0625 88.6138 .022

E4 E1. 298.7500 88.6138 .010E2. 317.8750 88.6138 .005E3. 154.5000 88.6138 .414E5. -120.5625 88.6138 .654

E5 E1. 419.3125 88.6138 .000E2. 438.4375 88.6138 .000E3. 275.0625 88.6138 .022E4 120.5625 88.6138 .654




EFECTO DEL TIPO DE EXPLANTE SOBRE EL NÚMERO DE CALLOS OBTENIDOS EN EL ECOTIPO NEGRO Multiple Comparisons Dependent Variable: TABLA8 Tukey HSD

Mean Differenc

e (I-J)

Std. Error

Sig.

(I) N (J) NE1 E2 -.1875 .7752 .999

E3 -.9375 .7752 .746E4 -1.0625 .7752 .648E5 -2.1250 .7752 .000

E2 E1 .1875 .7752 .999E3. -.7500 .7752 .869E4. -.8750 .7752 .791E5. -1.9375 .7752 .006

E3 E1. .9375 .7752 .746E2. .7500 .7752 .869E4. -.1250 .7752 1.000E5. -1.1875 .7752 .050

E4 E1. 1.0625 .7752 .648E2. .8750 .7752 .791E3. .1250 .7752 1.000E5. -1.0625 .7752 .030

E5 E1. 2.1250 .7752 .000E2. 1.9375 .7752 .050E3. 1.1875 .7752 .030E4 1.0625 .7752 .002




EFECTO DEL TIPO DE EXPLANTE SOBRE EL ÁREA DE CALLOS OBTENIDOS EN EL ECOTIPO NEGRO Multiple Comparisons Dependent Variable: TABLA9 Tukey HSD

Mean Difference

(I-J)

Std. Error Sig.

(I) N (J) NE1 E2 23.8750 87.2393 .999

E3 -65.3750 87.2393 .944E4 -197.1875 87.2393 .170E5 -339.3750 87.2393 .002

E2 E1 -23.8750 87.2393 .999E3. -89.2500 87.2393 .844E4. -221.0625 87.2393 .094E5. -363.2500 87.2393 .001

E3 E1. 65.3750 87.2393 .944E2. 89.2500 87.2393 .844E4. -131.8125 87.2393 .559E5. -274.0000 87.2393 .020

E4 E1. 197.1875 87.2393 .170E2. 221.0625 87.2393 .094E3. 131.8125 87.2393 .559E5. -142.1875 87.2393 .483

E5 E1. 339.3750 87.2393 .002E2. 363.2500 87.2393 .001E3. 274.0000 87.2393 .020E4 142.1875 87.2393 .483




ANALISIS EDE VARIANZA PARA DOS EFECTOS FIJOS EFECTO DEL MEDIO DE CULTIVO EN LA PRODUCCIÓN DE CALLOS FRIALES Hipótesis τ i Para el factor 2,4-D






Region crítica Fcal >F crítico el tratamiemto estadísticamente significativo exlste efecto *estadísticamente significativo exlste efecto

scua gl mcua f ss2,4-D 80 3 48.7430556 12*

ssKIN 14 3 34.57638889 11*

ssinter 87 9 45.8402778 15*

sserrores 119. 32 3.72916667 sst 299.8125 47

t t t



EFECTO DEL COLOR EN LA PRODUCCIÓN DE CALLOS FRIABLES

Multiple Comparisons Dependent Variable: tabla 10 Tukey HSD


Mean

Difference

(I-J)

Std.

Error

.

(I) (J)

Amarillo Morado .8125 .9009 .002

Negro .8750 .9009 .006

Morado Amarillo -.8125 .9009 .002

Negro 6.250E-02 .9009 .997

t t t



EFECTO DEL TIPO DE EXPLANTE EN LA PRODUCCIÓN DE CALLOS FIABLES Multiple Comparisons Dependent Variable: TABLA9 Tukey HSD


Mean Difference

(I-J)

Sig.

(I) N (J) NE1 E2 23.8750 .999

E3 -65.3750 .944E4 -197.1875 .170E5 -339.3750 .002

E2 E1 -23.8750 .999E3. -89.2500 .44E4. -221.0625 .094E5. -363.2500 .003

E3 E1. 65.3750 .944E2. 89.2500 .044E4. -131.8125 .049E5. -274.0000 .024

E4 E1. 197.1875 .170E2. 221.0625 .094E3. 131.8125 .049E5. -142.1875 .483

E5 E1. 339.3750 .002E2. 363.2500 .003E3. 274.0000 .024E4 142.1875 .483

t t t



COEFICIENTE DE VARIABILIDAD DE LA PRESENCIA DE GLUCOSINELATOS

EN HIPOCOTILOS Y CALLOS DE MACA

Ho Exite variabilidad

H1 No existe variabilidad

Si p<0.05 se rechaza la hipótesis nula En el presente problema p=0.6>0.05 entonces se concluye que exite variabilidad

Fraccion 1 Fraccion2

Fraccion 1 Correlation

Coefficient

1.000 .650

Sig. (2-

tailed)

. .600

N 80 80

Fraccion 2 Correlation

Coefficient

.650 1.000

Sig. (2-

tailed)

.600 .

N 16 16

t t t

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UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS · querida como nunca antes y a Luchito Alanya con todo mi cariño. A Mary Gálvez y Judith Toledo, mis maestras y amigas a las que siempre