UNIVERSIDAD PRIVADA AUTÓNOMA DEL SURrepositorio.upads.edu.pe/bitstream/UPADS/57/1/TESIS JOSE...4.3.- Identificación de taninos 33 4.4.- Identificación de flavonoides por la prueba

UNIVERSIDAD PRIVADA AUTÓNOMA DEL SUR

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

CARRERA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

TESIS:

“EVALUACIÓN DEL EFECTO ANTIMICROBIANO DEL

EXTRACTO DE HOJAS DE Prosopis pallida forma

armata (ALGARROBO) SOBRE Staphylococcus aureus

ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 y Cándida

albicans ATCC 10231, AREQUIPA - 2018”.

PRESENTADO POR:

BACH. JOSÉ ANTONIO ARCE TINTAYA

BACH. JUAN JOSÉ CUTIPA HUAMANTUMA

PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE

QUÍMICO - FARMACÉUTICO

ASESORA:

Mg. GISELE MARÍA DELGADO MONTOYA

CO-ASESORA:

Mg. DIANA LUCÍA DÍAZ MONTOYA

AREQUIPA – PERÚ

2019

UNIVERSIDAD PRIVADA AUTÓNOMA DEL SUR

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

CARRERA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

TESIS

“EVALUACIÓN DEL EFECTO ANTIMICROBIANO DEL

EXTRACTO DE HOJAS DE Prosopis pallida forma

armata (ALGARROBO) SOBRE Staphylococcus aureus

ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 y Cándida

albicans ATCC 10231, AREQUIPA - 2018”.

PRESENTADO POR:

BACH. JOSÉ ANTONIO ARCE TINTAYA BACH. JUAN JOSÉ CUTIPA HUAMANTUMA

PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE

QUÍMICO - FARMACÉUTICO

APROBADO POR:

PRESIDENTE DEL JURADO : Dra. Romina L. RONDON CHAMBI

PRIMER MIEMBRO DEL JURADO : Mg. Celia CHOQUENAIRA QUISPE

SEGUNDO MIEMBRO DEL JURADO : Mg. Ruth E. GARATE MANRIQUE

I

DEDICATORIA

“La realización de esta tesis está dedicada a Dios y a mis padres. A

Dios porque estuvo conmigo a cada paso que iba dando, cuidándome

y brindándome fortaleza para continuar, a mis padres, quienes a lo

largo de mi vida han velado por mi bienestar y educación, siendo mi

apoyo en todo momento. Su perseverancia y lucha insaciable han

hecho de ellos el gran ejemplo a seguir y destacar, no solo para mí,

sino para mi hermano y familia en general”.

José Antonio Arce Tintaya

II

“A Dios, por haberme permitido llegar hasta este punto y haberme dado

salud para conseguir mi propósito, por fortalecer mi corazón e iluminar

mi mente y por haberme puesto en mi sendero a esas personas que

fueron sustento y compañía a lo largo de todo el tiempo de estudio”.

“A mis padres, por la buena crianza, el amor, la dedicación y el

apoyo incondicional para cumplir mi objetivo y la meta de ser

profesional”.

“A mis familiares, amigos y profesores por la ayuda en la realización del

presente trabajo”.

Juan José Cutipa Huamantuma

III

AGRADECIMIENTO

“A Dios Todopoderoso, por darnos la vida, ser nuestro amigo

incondicional, al estar siempre con nosotros, aun en los momentos

difíciles, y recordarnos siempre, que somos seres humanos con virtudes

y defectos”.

“Por brindarnos esa mano de amigo que conforta, da alivio y esperanza,

a quien debemos la vida, la inteligencia y la sabiduría, porque sin el

nada seriamos”.

“A la razón de mi vida, mis padres y a todas aquellas personas que

confiaron en mí y me apoyaron de una u otra forma, permitiendo lograr

este primer gran paso para obtener mi Título Profesional”.

“Con mucho cariño y afecto para ustedes mi familia, profesores y

amigos”

José Antonio Arce Tintaya

IV

“Agradezco ante todo a Dios por haberme guiado a lo largo de mi

carrera, por ser mi fortaleza en las situaciones difíciles y las bendiciones

brindadas en el trajinar amplio de mi vida”.

“A mis padres Margarita y Luis, por el apoyo incondicional, por los

valores que me han enseñado para hacerme una mejor persona a

través de sus consejos, porque gracias a ellos veo alcanzado mi

propósito”.

“A nuestra asesora Magister Bióloga Diana Díaz Montoya por su apoyo,

comprensión y paciencia que nos ha tenido”.

“A nuestros docentes, personas de gran sabiduría quienes se han

esforzado y nos han brindado sabios conocimientos para lograr mi

propósito. Mg. QF. Elvis Gonzales Condori por su tiempo, consejos y

enseñanzas para la realización de este trabajo de investigación”.

Juan José Cutipa Huamantuma

V

RESUMEN

Desde la antigüedad se sabe que existen especies vegetales con actividad

terapéutica, usado ampliamente en la medicina tradicional actual por los

múltiples beneficios que se les atribuyen. La presente investigación tuvo por

finalidad estudiar el efecto antimicrobiano del extracto etanólico de hojas de

Prosopis pallida forma armata (Algarrobo); para lo cual, se obtuvieron extractos

usando como solvente al etanol por el método de extracción Soxhlet, logrando

un rendimiento del 20.71 %, en dichos extractos, identificándose la presencia

de taninos condensados y flavonoides.

El extracto de algarrobo presenta efecto antibacteriano frente a Escherichia coli

ATCC 25922 con una Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración

Mínima Bactericida (CMB) de 6.25 mg/mL; del mismo modo, efecto

antibacteriano frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923 con una CMI y

CMB de 0.39 mg/mL; asimismo, presenta efecto antimicótico frente a Cándida

albicans ATCC 10231 con una CMI y Concentración Mínima Antimicótica

(CMA) de 0.39 mg/mL.

En cuanto al estudio de sensibilidad, Escherichia coli ATCC 25922 presentó

susceptibilidad al extracto etanólico de Prosopis pallida forma armata

(Algarrobo) a concentraciones de 10.00, 20.00, 40.00, 60.00, 80.00 y alta

sensibilidad a concentraciones de 80.00 y %100.00 %, cuyo diámetro de

inhibición llego a más de 30 mm, siendo indicativo de que esta cepa es

altamente sensible a este extracto. Así también, Staphylococcus aureus ATCC

25923 presentó sensibilidad al extracto de algarrobo a concentraciones de

5.00, 10.00, 20.00, 40.00, 60.00 y 80.00 % y alta sensibilidad a

concentraciones de 100.00 %, inclusive a un diámetro superior al halo que

forma la ampicilina. Finalmente, Cándida albicans ATCC 10231 presentó

sensibilidad al extracto etanólico de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo)

a una concentración de 100%, donde la sensibilidad del Clotrimazol es superior

a las concentraciones estudiadas.

Palabras Clave. Efecto antibacteriano, efecto antimicótico, Prosopis pallida

VI

ABSTRACT

Since ancient times it is known that there are plant species with therapeutic

activity, widely used in current traditional medicine for the multiple benefits

attributed to them. The purpose of the present investigation was to study the

antimicrobial effect of leaf extract of Prosopis pallida forma armata (algarrobo);

for which, extracts were obtained using ethanol as solvent by the Soxhlet

Extraction method, obtaining a yield of 20.71%, in said extracts, identifying the

presence of condensed tannins and flavonoids.

The extract of algarrobo tree presents antibacterial effect against Escherichia

coli ATCC 25922 with a Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum

Bactericidal Concentration (CMB) of 6.25 mg/mL; similarly, antibacterial effect

against Staphylococcus aureus ATCC 25923 with a MIC and CMB of 0.39 mg /

mL; It also has an antimicotic effect against Cándida albicans ATCC 10231 with

a MIC and Minimum antimicotic Concentration (AMC) of 0.39 mg/ L.

Regarding the sensitivity study, Escherichia coli ATCC 25922 presented

susceptibility to the ethanolic extract of Prosopis pallida forma armata

(Algarrobo) at concentrations of 10.00, 20.00, 40.00, 60.00, 80.00 and high

sensitivity at concentrations of 80.00 and% 100.00%, whose diameter of

inhibition reached more than 30 mm, being indicative that this strain is highly

sensitive to this extract. Also, Staphylococcus aureus ATCC 25923 presented

sensitivity to carob extract at concentrations of 5.00, 10.00, 20.00, 40.00, 60.00

and 80.00% and high sensitivity at concentrations of 100.00%, even to a

diameter greater than the halo that forms ampicillin. Finally, Cándida albicans

ATCC 10231 showed sensitivity to the ethanolic extract of Prosopis pallida

forma armata (Algarrobo) at a concentration of 100%, where the sensitivity of

Clotrimazole is higher than the concentrations studied.

Keywords: Antibacterial effect, antimicotic effect, Prosopis pallida.

VII

ÍNDICE DE CONTENIDOS

DEDICATORIA I

AGRADECIMIENTO III

RESUMEN V

ABSTRACT VI

ÍNDICE DE CONTENIDOS VII

ÍNDICE DE TABLAS XI

ÍNDICE DE FIGURAS XIII

ÍNDICE DE ANEXOS XV

ÍNDICE DE ABREVIATURAS XVI

INTRODUCCIÓN XVII

CAPÍTULO I

EL PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN

1.1.- Descripción de la realidad problemática 1

1.2.- Formulación del problema 2

1.2.1.- Problema principal 2

1.2.2.- Problemas especificos 2

1.3.- Objetivos 2

1.3.1.- Objetivo general 2

1.3.2.- Objetivos específicos 2

1.4.- Justificación 3

CAPÍTULO II

MARCO TEÓRICO

2.1.- Antecedentes de investigación 5

2.1.1.- A nivel internacional 5

2.1.2.- A nivel nacional 5

2.1.3.- A nivel local 7

2.2.- Base Teórica 7

2.2.1.- Prosopis pallida (Algarrobo) 7

VIII

2.2.2.- Polifenoles 11

2.2.3.- Flavonoides 11

2.2.4.- Taninos 12

2.2.5.- Propiedades antimicrobianas de metabolitos secundarios 13

2.2.6.- Extractos vegetales 14

2.2.7.- Equipo Soxlet 16

2.2.8.- Escherichia coli 16

2.2.9.- Staphylococcus aureus 17

2.2.10.- Cándida albicans 17

2.2.11.- Método de macrodilución en tubos 18

2.2.12.- Método de difusion 19

2.2.13.- Antibiograma 19

2.3.- Hipótesis 20

2.3.1.- Hipótesis principal 20

2.3.2.- Hipótesis secundarias 20

2.4.- Variables 21

2.4.1.- Identificación de variables 21

2.4.2.- Definición conceptual de variables 21

2.4.3.- Definición operacional de variables 21

2.4.4.- Operacionalización de variables 22

CAPÍTULO III

METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN

3.1.- Tipo y nivel de investigación 23

3.1.1.- Nivel de la investigación 23

3.1.2.- Tipo de investigación 23

3.1.3.- Diseño de la investigación 23

3.2.- Descripción del ámbito de la investigación 23

3.2.1.- Ubicación espacial 23

3.2.2.- Ubicación temporal 23

3.3.- Población, muestra y muestreo 23

3.4.- Técnicas e instrumentos para la recolección de datos 23

3.4.1.- Material biológico 24

IX

3.4.2.- Materiales 24

3.4.3.- Recolección, identificación y almacenamiento de hojas de

Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) 25

3.4.4.- Obtención extracto seco de hojas Prosopis pallida forma

armata (Algarrobo) 26

3.4.5.- Identificación de Taninos 27

3.4.6.- Identificación de Flavonoides 27

3.4.7.- Escala de Mc Farland 28

3.4.8.- Evaluación de la Actividad Antimicrobiana 28

3.4.9.- Estrategia de recoleccion de datos 31

CAPÍTULO IV

RESULTADOS

4.1.- Recolección e identificación 32

4.2.- Extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata

(Algarrobo) 32

4.3.- Identificación de taninos 33

4.4.- Identificación de flavonoides por la prueba de Shinoda 34

4.5.- Evaluación de la actividad antibacteriana del extracto

etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata

(Algarrobo) frente a Escherichia coli ATCC 25922 35

4.5.1.- Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) extracto etanólico de

hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente a

Escherichia coli ATCC 25922 35

4.5.2.- Concentración Mínima Bactericida (CMB) de extracto



4.5.3.- Determinación de la sensibilidad bacteriana de extracto


(Algarrobo), comparada con Ciprofloxacino frente a

Escherichia coli ATCC 25922. 38

4.6.- Evaluación de la actividad antimicrobiana de extracto


(Algarrobo) frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923 42

4.6.1.- Concentración Minima Inhibitoria (CIM) de extracto etanólico

de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente

a Staphylococcus aureus ATCC 25923 42

X

4.6.2.- Concentración Mínima Bactericida (CMB) de extracto


(Algarrobo) frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923 45

4.6.3.- Determinación de la sensibilidad bacteriana de extracto


(Algarrobo) comparada con Ampicilina frente a

Staphylococcus aureus ATCC 25923. 46

4.7.- Evaluación de la actividad antimicótica de extracto etanólico


a Cepas de Cándida albicans ATCC 10231 50

4.7.1.- Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de extracto etanólico


a Cepas de Cándida albicans ATCC 10231 50

4.7.2.- Concentración Mínima Antimicótica (CMA) de extracto


(Algarrobo) frente a Cepas de Cándida albicans ATCC

10231 53

4.7.3.- Determinación de la sensibilidad antimicótica de extracto


(Algarrobo) comparada con Clotrimazol 1% frente a Cándida

albicans ATCC 10231 54

CAPÍTULO V

DISCUSIÓN 59

CONCLUSIONES 63

RECOMENDACIONES 65

BIBLIOGRAFÍA 66

ANEXOS 72

XI

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Clasificación Taxonómica 10

Tabla 2. Mecanismo de acción de compuestos antimicrobianos 14

Tabla 3. Indicadores y subindicadores de las Variables en estudio 22

Tabla 4. Determinación de CMI por microdilución en caldo 30

Tabla 5. Identificación, tipificación de hojas de Prosopis pallida

forma armata (Algarrobo) recolectadas 32

Tabla 6. Porcentajes de rendimiento correspondientes a las

extracciones del extracto etanólico de hojas de Prosopis

pallida forma armata (Algarrobo). 33

Tabla 7. Resultados de la determinación de concentración

inhibitoria mínima (CIM) de extracto etanólico de hojas

de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente a


Tabla 8. Resultados de la determinación de la Concentración

Mínima Bactericida (CMB) de extracto etanólico de hojas



Tabla 9. Sensibilidad de Escherichia coli ATCC 25922 a

concentraciones del extracto de hojas de Prosopis

pallida forma armata (Algarrobo). 39

Tabla 10. Análisis de varianza de la determinación de prueba de

sensibilidad de Escherichia coli ATCC 25922 a

concentraciones del extracto etanólico de hojas de

Prosopis pallida forma armata (Algarrobo). 40

Tabla 11. Test de Tukey de comparacion de la sensibilidad de

Escherichia coli ATCC 25922 a concentraciones del

extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma

armata (Algarrobo). 41


Mínima Inhibitoria (CMI) de extracto etanólico de hojas


Staphylococcus aureus ATCC 25923. 45


Mínima Bactericida (CMB) de extracto etanólico de hojas

XII


Staphylococcus aureus ATCC 25923 46

Tabla 14. Resultados de la determinación de la sensibilidad de

Staphylococcus aureus ATCC 25923 a concentraciones

de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma



sensibilidad de Staphylococcus aureus ATCC 25923 a



Tabla 16. Test de Tukey de la determinación de la sensibilidad de

Staphylococcus aureus ATCC 25923 a concentraciones

de Prosopis pallida (Algarrobo) 49


Mínima Inhibitoria (CMI) de extracto etanólico de hojas


Cándida albicans ATCC 10231 53


Mínima Antimicótica (CMA) de extracto etanólico de

hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente

a Cándida albicans ATCC 10231. 54

Tabla 19. Resultados de determinación de la sensibilidad de

Cándida albicans ATCC 10231 a concentraciones de

extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma

armata (Algarrobo). 55


sensibilidad de Cándida albicans ATCC 10231 a



Tabla 21. Test de Tukey de la determinación de la sensibilidad de

Cándida albicans ATCC 10231 a concentraciones

extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida

(Algarrobo). 57

XIII

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) 9

Figura 2 Estructura general de flavonoides 12

Figura 3 Clasificación de taninos 13

Figura 4 Hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) 26

Figura 5 Proceso de obtención del extracto etanólico de hojas de


Figura 6 Reacción química en la prueba de Shinoda 28

Figura 7 Peso de extracto seco obtenido luego de la evaporación del

solvente (etanol) a Baño María 33

Figura 8 Identificación de taninos condensados en Prosopis pallida

forma armata (Algarrobo) 34

Figura 9 Identificación de flavonoides. Presencia de flavononas en


Figura 10 Tubos de ensayo de determinación de CMI de extracto



Figura 11 Siembra en placa (CMB) de extracto etanólico de hojas de

P. Pallida forma armata (Algarrobo) frente a E. coli ATCC

25922 38

Figura 12 Sensibilidad bacteriana de extracto etanólico de hojas de P.

Pallida forma armata (Algarrobo) frente a E. coli ATCC

25922 39

Figura 13 Boxplot Data de la evaluación de la sensibilidad de

Escherichia coli ATCC 25922 a concentraciones del

extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata

(Algarrobo) 42

Figura 14 Tubos de ensayo de determinación de la CMI del extracto


a Staphylococcus aureus ATCC 25923 44

Figura 15 Siembra en placa CMB de extracto etanólico de hojas

Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente a S. aureus

ATCC 25923 46

Figura 16 Sensibilidad bacteriana de Staphylococcus aureus ATCC

25923 frente al extracto de hojas de Prosopis pallida forma


XIV

Figura 17 Boxplot Data de la evaluación de la sensibilidad de S.

aureus ATCC 25923 a concentraciones de extracto


(Algarrobo) 50

Figura 18 Método de microdilución en tubos para la determinación de

CMI de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente a

Cepas de Cándida albicans ATCC 10231 52

Figura 19 Siembra en placa (CBM) de Prosopis pallida forma armata

(Algarrobo) frente a Cándida albicans ATCC 10231 54

Figura 20 Sensibilidad fúngica de Cándida albicans ATCC 10231

frente al extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida


Figura 21 Boxplot Data de la evaluación de la sensibilidad de Cándida

albicans ATCC 10231 a concentraciones de extracto


(Algarrobo). 58

XV

ÍNDICE DE ANEXOS

Anexo 1. Clasificación taxonómica de Prosopis pallida forma armata

(Algarrobo) 73

Anexo 2. Recolección hojas de Prosopis pallida forma armata

(Algarrobo) en distrito de Quequeña – Arequipa 74

Anexo 3. Trituración de Hojas de Prosopis pallida forma armata

(Algarrobo), con posterior colocación en papel filtro 74

Anexo 4. A. Cepa de Staphylococcus aureus ATCC 25923, B. Cepa

de Escherichia coli ATCC 25922, C. Cepa de Cándida

albicans ATCC 10231 75

Anexo 5. Obtención de Extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida


Anexo 6. Sembrado de cepas en placas petry, con depósito de disco

de papel filtro de 5 mm de diámetro, impregnado con

extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata

(Algarrobo). 76

XVI

TABLA DE ABREVIATURAS

OMS : Organización Mundial de la Salud

CDC : Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades

IIH : Infecciones Intrahospitalarias

CMI : Concentración Mínima Inhibitoria

CMB : Concentración Mínima Bactericida

CMA : Concentración Mínima Antimicótica

DMSO : Dimetilsulfóxido

ITU : Infección del tracto urinario

INS : Instituto Nacional de Salud

ITU-IH : Infecciones de tracto urinario Intrahospitalarias

XVII

INTRODUCCIÓN

Nuestro país es considerado dentro de los 12 países de gran diversidad

biológica de la tierra, conocidos como países mega diversos, tanto por el

número de especies y de recursos genéticos, como la variedad de

ecosistemas. La utilización de las plantas medicinales es de gran importancia

en la medicina tradicional (1), puesto que diversos pueblos oriundos del Perú

las utilizan con fines terapéuticos como antioxidantes, antimicrobianos,

antiinflamatorios y antidepresivos (2).

El conocimiento científico de algunas especies es desconocido y es necesario

que aprendamos a investigar los recursos naturales, pero con los

requerimientos técnicos que la ciencia hoy pide. Este conocimiento dejará

saber los principios activos de las plantas medicinales y estudiar su actividad

en el organismo para después aislarlos, obtenerlos y avalar sus usos que la

medicina popular le asigna a distintas especies vegetales. En nuestro medio,

algunas plantas medicinales en el sector de la salud son usadas en distintas

formulaciones en el área de farmacia (3).

En la actualidad el estudio de especies vegetales, tiene como finalidad

incrementar las investigaciones relacionados a los metabolitos secundarios con

posible actividad medicinal, teniendo en cuenta que a nivel mundial se dan

infecciones intrahospitalarias y extrahospitalarias, producidas en general por

Cándida albicans, Staphylococcus aureus y Escherichia coli (4).

Prosopis pallida forma armata, conocida popularmente como algarrobo ha

demostrado tener actividad terapéutica frente a algunos microorganismos

(5,6,7), donde las hojas, semillas secas y resinas frescas, son empleados para

aliviar procesos de tos, dolor de estómago, bronquitis, resfríos y sanacion

heridas, dichos efectos podrían ser atribuidos al contenido de compuestos

fenólicos, teniendo en consideracion que estudios a dicha planta demuestran

presencia de taninos, flavonoides y polifenoles, además de tener un alto

contenido de taninos (8,9).

XVIII

Por otro lado, las especies Prosopis son conocidas por sus múltiples

propiedades antibacteriales, antimicóticas, antiparasitarias, y nutricionales

debido a sus características químicas y bromatológicas. La pulpa de su fruto

tiene alto contenido de fibra rica en sustancias antioxidantes y con alta

capacidad de absorción de agua (10).

La resistencia a los antibióticos se produce cuando los microorganismos, sufren

cambios que hacen que los medicamentos usados para sanar las infecciones

dejen de ser eficaces. El fenómeno es muy alarmante porque las infecciones

por microorganismos resistentes pueden causar la muerte del paciente,

pudiéndose tener una infección generalizada de personas, creando grandes

costos tanto para los pacientes como para la sociedad, donde hoy en día, los

estados y la población consumidora están interesados en la investigación de

plantas medicinales, empezándose a considerar los aspectos de la medicina

natural para integrarlos en la atención de servicios de salud, que tiene como

objetivo promover su uso racional, seguro y eficaz. La aparición de cepas

resistentes a los antibióticos comerciales en los últimos tiempos, está creando

la necesidad de buscar otras alternativas para combatir las infecciones

causadas por los microorganismos (9,11).

La utilización de las plantas para fines curativos se remonta al principio de la

historia de la humanidad. En la actualidad cientos de plantas son usadas en

la medicina, donde la ciencia moderna quiere precisar, comparar y

clasificar las diversas propiedades existentes, para así agrupar las plantas

de efectos similares, conocer los principios activos responsables de la actividad

terapéutica, determinar sus estructuras químicas, procurar su síntesis,

proponer modificaciones estructurales y finalmente, dar a conocer a la

humanidad los resultados de los investigaciones (5).

Las plantas son laboratorios naturales donde se biosintetiza una gran cantidad

de sustancias químicas, considerándose como una gran fuente de compuestos

químicos más importante que existe; dentro de ellos un considerable

número de investigaciones han sido perfilados hacia la evaluación de

XIX

actividades antimicrobianas en extractos y aceites esenciales de plantas

medicinales y aromáticas (5).

Por lo expuesto, el presente estudio busca evaluar el efecto antimicrobiano del

extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente

Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 y Cándida

albicans ATCC 10231.

1

CAPÍTULO I

EL PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN

1.1.- Descripción de la realidad problemática

Recientemente, el Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades

(CDC) de Atlanta indico que en Estados Unidos de América más de 70000

pacientes mueren anualmente por Infecciones Intrahospitalarias (IIH). Estas IIH

tienen origen por un prolongado tiempo de hospitalización, originando una

carga económica de unos 4000 millones de dólares al año. Un porcentaje de

estas muertes y otra aún mayor de los gastos, podrían evitarse con programas

de control de infecciones y con el cumplimiento de normas preventivas (12,13).

Existen factores asociados a las infecciones intrahospitalarias (IIH) en general,

los intrínsecos que incluye las condiciones fisiopatológicas clínicas del paciente

que incrementan riesgo de padecer una IIH, como pueden ser: insuficiencia

renal, neoplasia, diabetes mellitus, enfermedad pulmonar obstructiva crónica,

inmunosupresión, ulcera de decúbito, entre otros (11,14). En el grupo los

factores extrínsecos poseemos los procedimientos invasivos, diagnósticos o

terapéuticos, a los que el paciente es sometido a lo largo de su estancia

hospitalaria, siendo los catéteres vesicales un aspecto asociado de mucha

consideracion (11,14), demostrándose en algunos estudios que estos se

asocian en un 80% a las Infecciones de tracto urinario Intrahospitalarias (ITU-

IH) (15,16).

Estudios realizados en el Perú encontraron que el riesgo de desarrollar ITU-IH

se incrementa 36 veces en pacientes mayores de 60 años en comparación con

pacientes de edades menores (17).

En la última década los gérmenes responsables de las ITU-IH así como la

susceptibilidad antibiótica de los mismos han sufrido cambios importantes (18).

La susceptibilidad antibiótica de los urocultivos es usualmente reportada 48

horas después de la toma de la muestra, lo que implica un inicio empírico de

tratamiento antibiótico (19). Los pacientes suelen presentar infecciones

polimicrobianas. Hongos, como Cándida sp y Bacterias como Staphylococcus

aureus y Escherichia coli (20).

2

1.2.- Formulación del problema

1.2.1.- Problema principal

¿Cuál es el efecto antimicrobiano del extracto de hojas de Prosopis pallida

forma armata (Algarrobo) sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923,

Escherichia coli ATCC 25922 y Cándida albicans ATCC 10231?

1.2.2.- Problemas secundarios

¿Existe presencia de flavonoides y taninos en el extracto de hojas de

Prosopis pallida forma armata (Algarrobo)?

¿Cuál es la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración Mínima

Bactericida (CMB) del extracto de hojas de Prosopis pallida forma armata

(Algarrobo) sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923?


Bactericida (CMB) del extracto de hojas de Prosopis pallida forma armata

(Algarrobo) sobre Escherichia coli ATCC 25922?


Antimicótica (CMA) del extracto de hojas de Prosopis pallida forma armata

(Algarrobo) sobre Cándida albicans ATCC 10231?

¿Cuál es Sensibilidad antimicrobiana del extracto de hojas Prosopis pallida


Escherichia coli ATCC 25922 y Cándida albicans ATCC 10231?

1.3.- Objetivos

1.3.1.- Objetivo general

Determinar el efecto antimicrobiano del extracto de hojas de Prosopis pallida


Escherichia coli ATCC 25922 y Cándida albicans ATCC 10231

1.3.2.- Objetivos específicos

Identificar flavonoides y taninos el extracto de hojas de Prosopis pallida

forma armata (Algarrobo)

Determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración

Mínima Bactericida (CMB) del extracto de hojas de Prosopis pallida forma

armata (Algarrobo) sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923.

3


Mínima Bactericida (CMB) del extracto de hojas de Prosopis pallida forma

armata (Algarrobo) sobre Escherichia coli ATCC 25922.


Mínima Antimicótica (CMA) del extracto de hojas de Prosopis pallida forma

armata (Algarrobo) sobre Cándida albicans ATCC 10231.

Evaluar la Sensibilidad antimicrobiana del extracto de hojas Prosopis pallida


Escherichia coli ATCC 25922 y Cándida albicans ATCC 10231.

1.4.- Justificación

Las infecciones Intrahospitalarias (IIH) constituyen un gran problema de salud

pública, no solo por su alta frecuencia, sino por sus consecuencias que se

indican en términos de morbimortalidad, incremento de costos y estancia

hospitalaria prolongada; variables utilizadas como indicadores de calidad de

atención en los servicios en salud (21). Más del 10% de los pacientes

hospitalizados desarrollan IIH, previniéndose en forma mínima estas IIH con los

programas de supervisión y control epidemiológico (22).

Los esfuerzos desarrollados a lo largo del tiempo para prevenir IIH son

numerosos, pero en 1965 el Centro para el Control y la Prevención de

Enfermedades (CDC) (23), en Atlanta Georgia, EE.UU. recomendó la vigilancia

de IIH con el fin de dictar medidas nacionales de control hospitalario,

desarrollando para 1969 el Estudio Nacional de Infecciones Nosocomiales

(NNIS) (24), siendo ahora el Sistema Nacional de Vigilancia de Infecciones

Nosocomiales, comprobándose en investigaciones posteriores que las bases

de un programa de control de IIH adecuado son: educación y vigilancia

epidemiológica permanente (25,26).

Por investigaciones, se sabe que, se han aislado aproximadamente 12000

compuestos procedentes de los organismos vegetales y se estima que

constituyen tan solo el 10 % de los metabolitos secundarios que podrían existir.

Un porcentaje de dichos metabolitos podrían aportar efectos benéficos para

combatir diversas infecciones por su poder antimicrobiano (19, 27).

4

En el presente estudio, se busca evaluar el efecto antimicrobiano del extracto

de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) sobre Staphylococcus

aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 y Cándida albicans ATCC

10231.

5

CAPÍTULO II

MARCO TEÓRICO

2.1.- Antecedentes de investigación

2.1.1.- A nivel internacional

“Alzate et al. (10), en su investigación Propiedades farmacológicas del

Algarrobo (Hymenaea courbaril L.) de interés para la industria de alimentos en

el año 2008, nos indica que el Hymenaea courbaril L., conocido comúnmente

como algarrobo, guapinol (en español), locust, jatobá o courbaril entre muchos

otros, es un imponente árbol forestal que produce vainas grandes y muy duras

conteniendo una pulpa de un olor penetrante pero comestible. Es conocido por

sus múltiples propiedades antibacteriales, antimicóticas, antiparasitarias, y

nutricionales debido a sus características químicas y bromatológicas. La pulpa

de su fruto tiene alto contenido de fibra rica en sustancias antioxidantes y con

alta capacidad de absorción de agua. La gran cantidad de sustancias químicas

que hay en las diferentes partes de esta planta la constituyen en una fuente

interesante de futuras investigaciones con respecto a la obtención de

conservantes naturales, compuestos con capacidad de retención de agua e

ingredientes con capacidades antioxidantes, que puedan ser usados en

alimentos sin que representen un riesgo potencial para la salud (10)”.

2.1.2.- A nivel nacional

“Vásquez (6), en su tesis titulada efecto antifúngico in vitro del extracto etanólico

de Prosopis pallida (algarrobo) sobre Cándida albicans ATCC 90028, en el

2017 en la Universidad Cesar Vallejo reporta que, se evaluó el efecto

antifúngico in vitro del extracto etanólico de Prosopis pallida (Algarrobo) sobre

Cándida albicans ATCC 90028. Se realizó diversas concentraciones de 2.5, 5,

7.5, 10, 12.5, 15, 17.5, 20, 22.5, 25 mg/mL; se utilizó un control positivo

Nistatina y un control negativo Solución salina fisiológica estéril. El efecto

antifúngico del extracto se evaluó por medio del método de difusión en disco,

que consiste en sembrar por dispersión en superficie con hisopo estéril el

inóculo fúngico de Cándida albicans sobre la superficie de placas de petri con

agar Sabouraud. Inmediatamente después se colocaron discos de sensibilidad

embebidos con cada una de las concentraciones del extracto a evaluar incluido

6

los controles. Cada placa fue incubada a 37°C durante 24 horas en condiciones

de aerobiosis. Los ensayos se realizaron por decuplicado y cuatro repeticiones.

Los resultados indicaron que se presentó mayor inhibición a la concentración

de 22.5 mg/ml y 25 mg/ml obteniéndose halos promedio de inhibición de 12.9 y

11.5 mm respectivamente, y el menor promedio de halos de inhibición se

encontró en las concentraciones de 2.5 mg/ml y 5 mg/ml respectivamente, por

lo que se dedujo que a mayor concentración del extracto existe un mayor

efecto antifúngico. El control positivo presento un halo de inhibición promedio

de 13 mm de diámetro (6)”.

“Cárdenas (9), en su tesis titulada Actividad antimicrobiana y antioxidante del

extracto etanólico de Prosopis pallida “algarrobo” en el 2017 en la Universidad

Mayor de San Marcos evaluó las actividades antimicrobianas y antioxidante del

extracto etanólico de Prosopis pallida. Para la evaluación de dichas actividades

se obtuvo el extracto etanólico de las hojas, vaina (pulpa) y semillas. El

contenido de polifenoles totales fue determinado por el método de Folin-

Ciocalteu. La actividad antimicrobiana se evaluó mediante el método de

difusión en agar frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli

ATCC 8739, Bacillus subtilis ATCC 6633 y Pseudomonas aeruginosa ATCC

27853 y la concentración mínima inhibitoria (CMI) por el método

demicrodilución colorimétrico en microplaca. La actividad antioxidante se

determinó utilizando los métodos del radical libre 1,1-difenil-2-picril-hidrazilo

(DPPH) y el método del radical ácido 2,2”-azinobis (3-etilbenzotiazolin) -

6sulfónico (ABTS●+). Las hojas de P. pallida presentó mayor contenido de

compuestos fenólicos expresado como 8,39 mg/Eq de ácido gálico en un

gramo de extracto seco. El extracto etanólico de las hojas de P. pallida

presentó actividad antimicrobiana frente a S. aureus ATCC 25923 con un CMI

= 1000 µg/mL y frente a S. epidermidis ATCC 12228 con un CMI= 62,5 µg/mL.

Los extractos de las hojas, vaina (pulpa) y semillas en el análisis de DPPH

presentaron una concentración efectiva media (EC50) de 456,75 µg/mL; 392,15

µg/mL y 309,10 µg/mL; para el ensayo de ABTS●+ mostraron un EC50 de 4,7

mg/mL; 10,39 mg/mL y 9,90 mg/mL respectivamente (9)”.

“Zandoval y Zúñiga (5), en su tesis efecto antibacteriano in vitro de los

alcaloides totales extraídos de hojas de Prosopis pallida (Humb. & Bonpl. ex

7

Willd.) Kunth “algarrobo” frente a Staphylococcus aureus y Escherichia coli

publicada el 2016 en la Universidad Nacional de Trujillo evaluó el efecto

antibacteriano in vitro de los alcaloides totales de las hojas de Prosopis pallida

frente a Staphylococcus aureus y Escherichia coli . Para lo cual, las hojas

fueron recolectadas del Bosque y Complejo Arqueológico el Cañoncillo del

distrito de San José provincia de Pacasmayo región La Libertad; ubicado a una

altitud de 104 m.s.n.m., a 07º 15' Latitud Sur y 79º 29' Longitud Oeste. Para la

extracción de alcaloides se utilizó el método de fraccionamiento acido básico

del extracto etanólico. A partir de 5 kg de hojas secas y pulverizadas se

obtuvieron 0.8 g de alcaloides totales, obteniéndose un rendimiento de 0.016%.

El efecto antibacteriano fue desarrollado mediante el método de pozos

modificados de agar; donde se empleó cepas de S. aureus ATCC 13071 y E.

coli ATCC 25992. Donde se trabajó con concentraciones de alcaloides totales

de 2.5 mg/mL, 5 mg/mL y 10 mg/mL disueltos en dimetilsulfóxido (DMSO) y

cloranfenicol como control. Los halos de inhibición en promedio frente a S.

aureus fueron de 13.63 mm de diámetro a la concentración de 2.5 mg/ml, 16

mm de diámetro a 5 mg/ml y 18.38 mm de diámetro a una concentración de 10

mg/ml; para E. coli los halos de inhibición fueron de 12 mm de diámetro a una

concentración de 2.5 mg/ml, 14.13 mm de diámetro a 5 mg/ml y 15.38 mm de

diámetro para la concentración de 10 mg/ml (5)”.

2.1.3.- A nivel local

No se han reportado estudios en relación a Prosopis pallida a nivel local

2.2.- Base Teórica

2.2.1.- Prosopis pallida (Algarrobo)

2.2.1.1.- Generalidades

El algarrobo, “es una especie vegetal oriundo de Perú, Colombia y Ecuador,

crece en las partes más secas de estos países, a lo largo de la costa del

Pacífico, es un árbol longevo, que pertenece a la familia de las leguminosas.

Cuenta con una gran capacidad para sobrevivir en el desierto, debido a su

habilidad para captar nitrógeno y agua por medio de sus largas raíces. Es un

árbol de gran talla, llegando a alcanzar alturas de 8 a 20 m y hasta 80 cm de

8

diámetro en el tronco (en lugares apropiados), sin embargo, en terrenos

infértiles y con escasez de agua, se hace arbustivo. Presenta fuste irregular,

tortuoso y nudoso”. La corteza externa pardo-gris-negruzca; fisurada con

ritidoma leñoso; frecuentemente con espinas. La corteza interna es de color

blanco y rojo, es amarga, con olor a barniz y textura fibrosa. El género Prosopis

son originarias de los territorios áridos y semiáridos de las Américas, con

algunas excepciones en África, el sudeste de Asia y Europa, distribuidas en las

zonas áridas y semiáridas de América del Norte y América del Sur; (Argentina,

Bolivia, Chile, Paraguay y Perú) (28).

En el Perú se conocen solamente tres especies: “Prosopis chilensis, Prosopis

limensis y Prosopis pallida; esta última especie, conocida como “algarrobo” o

“huarango”; y que es usada en la parte norte del país, como alimento para

animales; así como para la elaboración de “algarrobina”; mientras que en

algunas regiones del sur, como Ica y Arequipa, se utiliza únicamente como

combustible (carbón vegetal) y rara vez sus frutos como forraje (28). Desde el

punto de vista botánico, las especies de este género, corresponden a árboles o

arbustos, normalmente xerófilos y espinosos. Sus hojas son generalmente

bipinnadas y con flores pequeñas, pentámeras, actinomorfas y hermafroditas.

El fruto es una legumbre carnosa e indehiscente” (29).

Prosopis pallida es una especie muy rústica, “debido a que puede prosperar sin

ningún inconveniente en toda clase suelos, llegando a tener muy buen

crecimiento y producir notables cantidades de frutos. Crece en suelos

arenosos, arcillosos, calcáreos, pedregosos y hasta en aquellos que son

superficiales y salinos. El enorme desarrollo que adquiere el sistema radicular

le permite la absorción del agua. Se han encontrado pivotes hasta en 50 m de

profundidad. El algarrobo, es una planta que prospera bien en las zonas áridas

y semiáridas, en las cuales en condiciones naturales no se desarrollaría otro

tipo de vegetación arbórea, por tener esta última mucho mayor requerimiento

de calidad de los suelos. Tiene una notable tolerancia a períodos prolongados

de sequías y también a la salinidad, pudiendo irrigarse con agua cuyo

contenido de sal sea equivalente, hasta a la mitad del contenido de sal del

agua de mar” (28).

9

En algunos “distritos del sureste de la Provincia de Arequipa, se distribuyen

poblaciones dispersas de algarrobos en biotopos distintos, localizados en

Quequeña, Mollebaya y Yarabamba (28). En el año 2001 se realizó la

evaluación de las características biométricas, ecológicas y el estado de

conservación de algunos relictos (poblaciones dispersas) de “huarangos”,

localizados en cinco quebradas en Yarabamba (30). Asimismo en el año 2005

se determinó el tipo de relación que existe entre los “huarangos” y las

características del suelo que ocupan en la Quebrada Cachihuasi, localizada en

Yarabamba: mediante la evaluación poblacional de los “huarangos” y también

de las características edafológicas del suelo. Cuatro años después, se realizó

otro trabajo de investigación, referido a la evaluación de la diversidad florística,

estructura poblacional y estatus de conservación de la flora fanerogámica

silvestre, tomando como puntos de referencia, cuatro biotopos distintos

(pertenecientes al matorral desértico)”, en Mollebaya, Quequeña y Yarabamba

(31), planta de algarrobo que se puede apreciar en la Figura 1.

Figura 1. Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) (Sector Belaunde -

Quequeña 2018) (Latitud 16°32'16.96"S – Longitud 71°28'38.04"O) – Octubre

2018.

Fuente: Elaboración propia.

10

2.2.1.2.- Clasificación Taxonómica

En cuanto a la clasificación taxonómica el algarrobo se clasifica como Prosopis

pallida forma armata, según Vásquez y Escurra (32).

Tabla 1. Clasificación Taxonómica.

División Magnoliophyta

Clase Magnolipsidae

Orden Fabales

Familia Fabaceae

Subfamilia Mimosoideae

Género Prosopis

Especie Prosopis pallida

Fuente. Adaptado de Vásquez y Escurra (32).

2.2.1.3.- Descripción botánica de las hojas

“Las hojas son bipinnadas y alternas, además, es habitual ver en los nudos de

las plantas adultas de 1 a 10 hojas que nacen en ramitas muy cortas y juntas,

logran medir de 2 a 8 cm de longitud, falcadas dorsalmente, se destaca por

presentar folíolos lineales, obtusos, mucronados, regularmente pubescentes,

de 7 a 10 mm de longitud por 1 a 3 mm de ancho, con además de poseer

glándulas cupuliformes en la unión de cada par de foliolos (33)”.

2.2.1.4.- Composición Química de las hojas

“Las hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) muestran altos niveles

de proteína cruda (17,8%) y fibra cruda (23,3%). Entre sus minerales presenta

fósforo, potasio, calcio y magnesio, por otro lado, se evidencia presencia de

taninos, flavonoides y polifenoles, donde el contenido de taninos generalmente

alto de 0,8% a 1,9-2,0 % (8,9)”.

2.2.1.5.- Propiedades terapéuticas y usos

“El algarrobo tiene una gran variedad de utilización, dado que es un alimento

vegetal con concentraciones altas de almidón y proteína siendo un alimento

esencial en la alimentación de los pueblos indígenas. Con la pulpa se elabora

harina la cual es incorporada en galletas, sopas y leche de los niños (34)”.

11

“La harina de algarrobo está indicada para tratar problemas de diarreas y

vómitos tanto en niños como en lactantes, se usada para ayudar a mejorar la

digestión. El fruto de la algarroba es un alimento de primera calidad para el

ganado. El tronco produce una resina llamada copal, la cual tiene propiedades

curativas de usos medicinales y también es empleada para la elaboración de

barnices e inciensos. La corteza y las hojas de esta planta contienen

propiedades medicinales (34)”.

2.2.2.- Polifenoles

“En la naturaleza existe una amplia variedad de compuestos que presentan una

estructura molecular caracterizada por la presencia de uno o varios anillos

fenólicos. “Estos compuestos podemos denominarlos polifenoles que se

originan principalmente en las plantas en grandes cantidades como producto

de su metabolismo secundario”. Algunos son indispensables para las funciones

fisiológicas vegetales, otros participan en funciones de defensa ante

situaciones de estrés y diversos estímulos (hídrico, luminoso, etc.) (9)”.

“Existen varias clases y subclases de polifenoles que se definen en función al

número de anillos fenólicos que poseen y de los elementos estructurales que

presentan estos anillos. Los principales grupos de polifenoles son: ácidos

fenólicos (derivados del ácido hidroxibenzoico o del ácido hidroxicinámico),

estilbenos, lignanos, alcoholes fenólicos y flavonoides” (35).

2.2.3.- Flavonoides

Los “flavonoides son pigmentos naturales presentes en los vegetales y que

poseen actividad antioxidante por lo cual, protegen al organismo del daño

producido por especies reactivas de oxigeno (ROS) conocidos como radicales

libres, así como también de los rayos ultravioletas, la polución ambiental,

sustancias químicas presentes en los alimentos” (9).

La estructura de los “principales flavonoides se diferencia entre ellos

principalmente en el grupo –OH y en el grado de saturación que presenta el

anillo C. En la Figura 2 se muestran A) La estructura general de flavonoides, B)

Isoflavonas, C) Flavanos, D) Flavonoles, E) Flavanoles y F) Antocianidinas ”.

12

Los “flavonoides son sustancias sólidas cristalizadas de color blanco o

amarillento. Sus heterósidos son solubles en agua caliente, alcohol y en

disolventes orgánicos polares, siendo insolubles en los apolares. Sin embargo,

cuando están en estado libre, son poco solubles en agua, pero son solubles en

disolventes orgánicos más o menos oxigenados dependiendo de su polaridad,

su carácter fenólico y su intensa absorción en la región ultravioleta y visible del

espectro es debido a la presencia de sistemas aromáticos conjugados” (9).

Figura 2. A) La estructura general de flavonoides, B) Isoflavonas, C) Flavanos,

D) Flavonoles, E) Flavonoles y F) Antocianidinas.

Fuente: Adaptado de Limón S (36).

2.2.4.- Taninos

Los “taninos son compuestos secundarios producidos por las plantas que

pueden formar complejos con proteínas, polisacáridos, ácidos nucleicos,

esteroides y saponinas desempeñando en las plantas una acción ” defensiva (9).

Los taninos son el segundo grupo de fenoles más abundante en la naturaleza y

cumplen diversas e importantes actividades biológicas en la planta que los

produce: actúan como defensa contra enfermedades causadas por hongos,

bacterias y virus además de proteger los tejidos contra el ataque de insectos y

13

herbívoros (37), por otro lado, “tradicionalmente se ha clasificado a los taninos

en dos grandes grupos: los taninos condensados y los taninos hidrolizables. En

la actualidad, la clasificación más aceptada, divide a los taninos en cuatro

grupos: galotaninos, elagitaninos”, taninos condensados y taninos complejos

(38), conforme se puede apreciar en la Figura 3.

Figura 3. Clasificación de taninos Fuente. Adaptado de Khanbabaee y Van Ree (39).

2.2.5.- Propiedades antimicrobianas de metabolitos secundarios

Algunos extractos obtenidos de plantas por diversos métodos de extracción

presentan alto contenido de flavonoides que está relacionado con la actividad

antibacteriana (40).

Por lo expuesto en la Tabla 2 se presentan los principales compuestos

encontrados en plantas indicando la clase, subclase y el mecanismo de acción

que presentan (41).

14

Tabla 2. Mecanismo de acción de compuestos antimicrobianos

Clase Subclase Ejemplo Mecanismo

Compuestos fenólicos

Fenoles simples

Catecol Privación del substrato

Epicatequina Destrucción de la membrana

Ácidos fenólicos

Ácido cinámico

Quinonas Hipericina Enlazar adhesinas formando complejos con la pared, inactivas enzimas

Flavonoides Crisina Enlazar adhesinas

Flavonas Abyssinona Forma complejos con la pared celular, inactivación de enzimas e inhibe la transcriptasa inversa del VIH

Flavonoles Totarol

Taninos Elagitanino Une a proteínas, enlaza adhesinas, inhibición de enzimas, privación del sustrato, formar complejos con la pared celular, destrucción de la membrana y forma complejos con iones metálicos

Cumarinas Warfarina Interacción con el ADN eucariota (actividad antiviral)

Terpenos, aceites esenciales

Capsaicina Destrucción de la membrana

Alcaloides Berberina Intercalarse en la pared celular y/o ADN

Piperina

Lectinas y polipéptidos

Manosa especifica-Aglutina Bloquea la fusión viral o adsorción

Fabatin Forma puentes disulfuros

Poliacetilenos 8S-Heptadeca2(Z),9(Z)-dieno4,6-diino-1,8-diol

Fuente. Adaptado de Murpdhy (42).

2.2.6.- Extractos vegetales

La “extracción es un método por la cual se obtienen los principios activos del

material vegetal, de una manera más concentrada; los componentes solubles

contenidos debidamente preparados, se disuelven en uno o más solventes o

líquidos extractores formando así un extracto crudo o total, el cual va a tener la

15

mayor cantidad de principio activos, pigmentos vegetales y metabolitos

secundarios” (43), clasificándose en:

Infusión: “Consiste en someter la materia vegetal en contacto con el

solvente a una temperatura igual a la de ebullición del agua por cinco

minutos” (43).

Decocción o Cocimiento: “Consiste en llevar la materia vegetal más

menstruo a la temperatura de ebullición del agua, manteniendo esta

temperatura durante un período de 15 a 30 minutos” (43).

Maceración: “Consiste en poner en contacto prolongado durante cierto

tiempo la materia vegetal con el menstruo, en el cual el menstruo actúa

simultáneamente sobre todas las proporciones de la droga, circulando a

través en todas las direcciones y sentidos y disolviendo sus principios

activos hasta producirse una concentración en equilibrio con la del

contenido celular. Este tipo de extracto se protege de la luz, para evitar

posibles reacciones y debe agitarse continuamente, el tiempo de

maceración va entre cuatro y diez días, cuanto mayor sea la relación entre

el líquido extractivo y la droga, más favorable será el rendimiento” (43).

Digestión: “Es un tipo de maceración que se da a una temperatura suave

de 50 o 60° C”. Al aumentar medianamente la temperatura se consigue un

mayor rendimiento de la extracción, haciendo que el solvente pueda

ingresar más rápidamente al interior de las células y así extraer los

principios activos” (43).

Lixiviación o Percolación: “Es el método oficial de extracción, descrito en

la Farmacopea Americana, consiste en que el menstruo atraviese la masa

de materia vegetal pulverizada en un solo sentido, alcanzando

concentraciones crecientes de tal modo que el equilibrio entre el solvente

dentro y fuera del marco nunca se alcanza, por lo que la droga bañada

siempre por nuevas proporciones de menstruo acaba por ceder todos sus

componentes solubles de manera progresiva. Este tipo de extracción se

realiza en recipientes cilíndricos o cónicos (percoladores), que poseen

dispositivos de carga y descarga, lográndose una extracción total de los

principios activos” (43).

16

Soxhlet: “Este método de extracción es una técnica basada en la

separación sólido-líquido, en continuo, empleando un disolvente, con

posterior evaporación de éste y pesada final del residuo. Se usa para la

determinación del contenido graso en muestras de diferente naturaleza ” (43).

2.2.7.- Equipo Soxhlet

“El equipo Soxhlet tiene como función recircular los vapores condensados con

ayuda de un sifón a la fuente de disolvente que se encuentra en evaporación

continua, arrastrando consigo los principios activos de la materia prima

contenido en los cartuchos desechables” (44).

La “capacidad aproximada en un equipo de laboratorio es de 500 mL de

volumen primario con una recirculación de 100 mL cada cinco minutos

aproximadamente en estado estable. La velocidad de reflujo depende

directamente de la eficiencia y el tamaño del condensador” (44).

2.2.8.- Escherichia coli

2.2.8.1.- Generalidades

Escherichia coli “se describió por primera vez en 1885 por el pediatra alemán

Theodore Escherich. Fue nombrada inicialmente como “Bacterium coli

commune”, pero en 1919 fue renombrada con el nombre actual en honor a su

descubridor” (45).

Los “representantes de esta especie son bacilos gramnegativos, oxidasa

negativos, con un tamaño promedio de 1,1-1,5 μm de ancho y 2,0-6,0 μm de

largo. De acuerdo a sus requerimientos de oxígeno son anaerobios facultativos

y pueden ser móviles por la presencia de flagelos peritricos o no móviles” (46).

E. coli “forma parte de la microbiota normal del tracto gastrointestinal (TGI) del

ser humano, otros mamíferos y las aves y constituye una de las especies

bacterianas más abundantes en esta localización” (45,47).

En agar Mac Conkey forma colonias planas, secas, rosadas con un área

circundante de color rosa más oscuro compuesto por sales precipitadas

(46,47).

17

2.2.8.2.- Patogenicidad

Escherichia coli “es el miembro más frecuente e importante del género

Escherichia. Forma parte de la flora intestinal normal en animales y humanos.

Cada gramo de heces humanas contiene hasta 108 microorganismos

Escherichia coli. Este microorganismo se asocia a múltiples enfermedades,

incluida la gastroenteritis e infecciones extraintestinales, como las infecciones

urinarias (ITU), meningitis y sepsis. Multitud de cepas son capaces de producir

enfermedad y algunos serotipos se asocian a una mayor virulencia ” (Ejemplo:

Escherichia coli O157 es la causa más frecuente de colitis hemorrágica) (47).

2.2.9.- Staphylococcus aureus

2.2.9.1.- Morfología

Es un microorganismo Gram (+) “de forma esférica, de aproximadamente 1μm

de diámetro. Tiende a agruparse en forma de racimos. Su pared celular es la

típica de grampositivos, con peptidoglicano asociado a ácidos teicoicos

mediante el aminoácido L-lisina. A diferencia de los estreptococos produce

catalasa, enzima que desdobla el agua oxigenada. En agar pueden formar

colonias de color amarillo dorado y pueden ser betahemolíticas. Su

característica más importante es la fermentación de varios azúcares, entre los

que destaca el manitol, para producir ácido láctico, lo que le diferencia de los

demás estafilococos. Resiste altas concentraciones de sal, por ” lo que el medio

Chapman (agar manitol salado) es útil para su aislamiento e identificación (47).


S. aureus coloniza de forma habitual casi al 30% de las personas,

encontrándose principalmente en la nariz y la zona nasofaríngea, piel y

genitales externos y rara vez en el colon y la vagina. En el medio hospitalario,

tanto en enfermos como en personal sanitario, aumenta de manera importante

el porcentaje de colonización, al igual que en diabéticos, pacientes sometidos a

diálisis crónica y drogodependientes (47).

2.2.10.- Cándida albicans

2.2.10.1.- Morfología

18

Cándida albicans “es un hongo dimórfico, es decir, se desarrolla de forma

distinta en función de la temperatura de crecimiento, como levadura,

normalmente a 37ºC en el huésped, y como hongo de aspecto filamentoso, a

25ºC en la naturaleza. Pertenece al filo Ascomycota” y se reproduce de forma

asexual por gemación (48).

En forma de levadura presenta un “aspecto de células redondas u ovaladas, de

3-8 x 2-7 micras de tamaño, agrupadas en pequeños grupos, mientras que, en

forma de hongo filamentoso, las células se alargan y se diversifican tomando la

apariencia de filamentos, pseudo-hifas o pseudo-micelio” (48).


Candidiasis o moniliasis: “infección superficial que aparece principalmente en

individuos con las defensas bajas, afectando a la piel (intertrigo), a las mucosas

(oral, genitourinaria o digestiva) y a las uñas (paroniquia o perionixis). Los

síntomas son leves como: enrojecimiento, picazón y malestar. En personas con

cáncer, trasplantados o con SIDA la infección puede hacerse sistémica

(candidemia), y puede llegar a ser mortal” (48).

2.2.11.- Método de macrodilución en tubos:

Es utilizado para determinar la Concentración Mínima Bactericida (CMB) y la

Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) (49).

La CMI “es definida como la concentración más baja de sustancia que puede

inhibir el crecimiento visible de un microorganismo después de incubar por 24

horas y la CMB se define como la concentración más baja que puede prevenir

el crecimiento de un organismo después de subcultivar en un medio libre del

compuesto evaluado”

(49).

Es un método “estandarizado de dilución en caldo, que se utiliza para medir

cuantitativamente la actividad "in vitro" de un antimicrobiano frente a un cultivo

bacteriano. Estos métodos se basan en la preparación de una serie de tubos o

placas con caldo o agar, los cuales se les agrega el antibiótico en distintas

concentraciones. Luego se inoculan cada uno de los tubos o placas con una

suspensión estandarizada del microorganismo en estudio”. Las pruebas se

19

examinan después de incubar a 35 ± 2ºC y se determina la (CMI) del

antimicrobiano frente al microorganismo (50).

2.2.12.- Método de difusión:

Este método de difusión en disco o en pozo fue estandarizado por Bauer Kirby

y colaboradores y es actualmente recomendado por el Subcomité de Ensayos

de Susceptibilidad de NCCLS, de Estados Unidos (51). “Se basa en la relación

entre la concentración de la sustancia necesaria para inhibir una cepa

bacteriana y el halo de inhibición de crecimiento en la superficie de una placa

de agar con un medio de cultivo adecuado y sembrado homogéneamente con

la bacteria a ensayar y sobre la cual se ha depositado un disco de papel filtro

de 6 mm de diámetro, o se ha sembrado” en pozo impregnado con una cantidad

conocida de la sustancia (49).

La lectura se interpreta como sensible (S), intermedia (I), resistente (R) según

las categorías establecidas por el NCCLS. La concentración de bacterias usada

para el estudio de susceptibilidad en el laboratorio ha sido estandarizada en 1.5

x 108 unidades formadoras de colonias (ufc)/mL, lo cual equivale a un patrón de

0.5 en la escala de Mac Farland. Es recomendable tomar el inóculo de cultivos

en la fase exponencial de crecimiento y siempre tomar 4 o 5 colonias de un

cultivo puro (51). Los medios de cultivo más utilizados en dichas técnicas son el

agar Müller Hinton y agar tripticasa soya, ya que sus componentes facilitan el

crecimiento de diferentes cepas bacterianas y mayor difusión de las muestras

(49).

2.2.13.- Antibiograma:

El “antibiograma es la prueba microbiológica de susceptibilidad in vitro que se

lleva a cabo para conocer el comportamiento de un microorganismo frente a

determinados antibióticos, cuyos resultados se expresan en términos de

"sensibilidad" y "resistencia". La selección de antimicrobianos en el estudio de

susceptibilidad in vitro tiene como objetivo disponer de un adecuado apoyo en

la elección de las terapias antimicrobianas, al igual que promover su uso

racional”

(52).

La interpretación del antibiograma presenta las siguientes características:

20

Establecer la probabilidad de éxito o fracaso terapéutico que de un

antibacteriano frente a los microorganismos causantes de infección

estudiados en el antibiograma.

Utilizar criterios en función del conocimiento microbiológico, para definir una

correlación entre el antibiograma y el éxito terapéutico.

Realizar un análisis fenotípico de los resultados de sensibilidad según los

mecanismos de resistencia y expresión bacteriana.

Realizar la detección de la resistencia y la predicción del fracaso terapéutico

(52).

2.3.- Hipótesis

2.3.1.- Hipótesis principal

Dado que existen antecedentes del uso de Prosopis pallida forma armata

(Algarrobo) en la medicina tradicional, es probable que el extracto de hojas de

dicha especie presente efecto antimicrobiano sobre cepas de Staphylococcus

aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 y Cándida albicans ATCC

10231.

2.3.2.- Hipótesis secundarias

Es posible que el extracto de hojas de Prosopis pallida forma armata

(Algarrobo) presente flavonoides y taninos.

Es probable determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la

Concentración Mínima Bactericida (CMB) del extracto de hojas de Prosopis

pallida forma armata (Algarrobo) sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923

Es probable determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) la

Concentración Mínima Bactericida (CMB) del extracto de hojas de Prosopis

pallida forma armata (Algarrobo) sobre Escherichia coli ATCC 25922.

Es probable determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la

Concentración Mínima Antimicótica (CMA) del extracto de hojas de Prosopis

pallida forma armata (Algarrobo) sobre Cándida albicans ATCC 10231.

Es probable que Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli

ATCC 25922 y Cándida albicans ATCC 10231 presenten sensibilidad al

extracto de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo).

21

2.4.- Variables

2.4.1.- Identificación de variables

Variable independiente: Extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida

forma armata (Algarrobo).

Variable dependiente: Actividad antimicrobiana sobre Staphylococcus

aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 y Cándida albicans

ATCC 10231.

2.4.2.- Definición conceptual de variables

Variable independiente: Extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida

forma armata (Algarrobo).



ATCC 10231.

2.4.3.- Definición operacional de variables

Variable independiente: Hojas de Prosopis pallida forma armata

(Algarrobo).

Extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo)

obtenido por el método de extracción por Soxhlet, verificando la presencia

de Taninos y Flavonoides.



ATCC 10231.

Actividad antimicrobiana evaluada por la determinación de la Concentración

Mínima Inhibitoria, Concentración Mínima Bactericida, Concentración

Mínima Fungicida y por el método del antibiograma midiendo los halos de

inhibición.

22

2.4.4.- Operacionalización de variables

Tabla 3. Indicadores y subindicadores de las variables de estudio de la presente investigación.

VARIABLES INDICADOR SUB INDICADOR

Variable Independiente

Hojas de Prosopis pallida forma

armata (Algarrobo)

Extracto etanólico de

hojas de Prosopis

pallida forma armata

(Algarrobo)

Taninos

Favonoides

% (Porcentaje)

Variable Dependiente

Actividad antimicrobiana sobre

Staphylococcus aureus ATCC

25923, Escherichia coli ATCC

25922 y Cándida albicans ATCC

10231

Concentración Minina

Inhibitoria

µL/mL

Concentración Mínima

Bactericida

µL/mL

Sensibilidad bacteriana Halo de inhibición

(mm) medidos con

un vernier


23

CAPÍTULO III

METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN

3.1.- Tipo y nivel de investigación

3.1.1.- Nivel de la investigación

Experimental

3.1.2.- Tipo de investigación

Según manipulación de variables: Experimental

Según número de mediciones: Transversal

Según la temporalidad: Prospectivo

Enfoque: Cuantitativo

Por el propósito o finalidad: Aplicada

Paradigma: Positivista

3.1.3.- Diseño de la investigación

Experimental

3.2.- Descripción del ámbito de la investigación

3.2.1.- Ubicación espacial

El presente trabajo se realizó en los laboratorios de la Universidad Privada

Autónoma del Sur, ubicada en la Región, Provincia y Departamento de

Arequipa.

3.2.2.- Ubicación temporal

La presente investigación fue desarrollada en el periodo de Octubre,

Noviembre, Diciembre del 2018 y Enero, Febrero, Marzo, Abril del 2019.

3.3.- Población, muestra y muestreo

Muestreo: No probabilístico

3.4.- Técnicas e instrumentos para la recolección de datos

24

3.4.1.- Material biológico

Cepas de Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC

25922 y Cándida albicans ATCC 10231.

Hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo).

3.4.2.- Materiales

3.4.2.1.- Material de vidrio

Baguetas

Buretas

Fiola de 25 y 50 mL

Matraces de vidrio 100, 500 y 1000 mL.

Placas Petri de vidrio de 60mm x 15mm y 100mm x 15mm

Pera de decantación de 250 mL

Pipetas de 1ml, 2ml, 5ml y 10 mL

Probeta graduada de: 50 y 100 mL

Tubos de ensayo

Vasos de precipitado: 50, 100, 250ml

Asa de Digralsky

Frascos de vidrio ambar de: 150, 250mL

3.4.2.2.- Meterial de Plástico

Placas petry descartable de 100 x 15 mm

Placas petry descartable de 60 x 15 mm

Pipetas cuentagotas

Puntas de pipeta: 70, 50 mm

3.4.2.3.- Equipos y Aparatos

Autoclave

Balanza analítica

Cocina eléctrica

Equipo de Soxhlet

Estufa

Refrigeradora

25

Asa de Kohle

Espátulas

Gasas estériles y Algodón.

Gradilla de metal para tubos de ensayo

Micropipeta graduada

Papel filtro rápido

Papel Kraft

Pinzas

Soporte universal

3.4.2.4.- Reactivos

Agua destilada

Cloruro férrico

Etanol

Suero fisiológico

Tween 80

Ácido clorhídrico

Láminas de Magnesio

Cloruro de Bario

Ácido Sulfúrico

3.4.2.5.- Medios de Cultivo

Agar Manitol salado

Agar Sabouraud

Agar Müller Hinton

Caldo Peptonado

3.4.3.- Recolección, identificación y almacenamiento de hojas de Prosopis

pallida forma armata (Algarrobo)

Las hojas de Prosopis pallida forma armata (algarrobo) fueron recolectadas del

Sector Belaunde del Distrito de Quequeña, Provincia de Arequipa,

Departamento de Arequipa (Latitud 16°32'16.96"S – Longitud 71°28'38.04"O)

26

durante el mes de Octubre 2018, siendo trasladadas al Herbarium Areqvipence

de la Universidad Nacional de San Agustín para su posterior identificación.

Las hojas recolectadas fueron lavadas con abundante agua destilada para

luego hacerlas secar temperatura ambiente; en sombra durante 72 horas. Las

hojas secas se muestran en la Figura 4.

Figura 4. Hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo)

Fuente. Elaboración propia – Laboratorio Universidad Privada Autónoma

del Sur (Octubre - 2018).

3.4.4.- Obtención del extracto seco de Prosopis pallida forma armata

(Algarrobo).

Para la obtención del extracto etanólico se procedió a pulverizar las hojas de

Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) hasta la obtención de partículas

finas, para luego pesar 20 g que se colocaron empaquetados en papel filtro

rápido en la cámara de extracción del equipo Soxhlet acondicionado con

aproximadamente 150 mL de etanol de 96°. El proceso de extracción se

desarrolló hasta el agotamiento de la muestra que fue equivalente a 21 vueltas

del solvente (9), conforme se visualiza en la figura 5.

27

Posteriormente el extracto obtenido fue sometido a Baño María a 70 °C

aproximadamente, con la finalidad de evaporar el solvente hasta sequedad,

luego se llevó a una estufa a la misma temperatura durante 1 hora para luego

enfriar en un desecador para luego calcular el porcentaje de rendimiento del

extracto seco (9).

Figura 5. Proceso de obtención del extracto etanólico de

hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo),

usando el método de extracción por Soxhlet –

Universidad Privada Autónoma del Sur, Noviembre

2018.


3.4.5.- Identificación de Taninos

Los “taninos fueron identificados adicionando al extracto etanólico 1 mL de

cloruro férrico al 5 %, dicha reacción se interpreta por los colores que resultan

luego de la adición de la sal de hierro, es así que para taninos hidrolizables o

gálicos da una coloración azul negruzco y para taninos condesados aparece

coloraciones entre verde a marrón” (44).

3.4.6.- Identificación de Flavonoides

La “identificación de flavonoides fue realizada mediante la prueba de Shinoda

cuyo fundamento radica en la oxidación del magnesio en medio ácido (Ácido

Clorhídrico), donde el hidrógeno liberado se produce por reducción el ion flavilio

y los colores varían de rojo pálido hasta rojo escarlata” (52).

28

Figura 6. Reacción química en la prueba de Shinoda. Fuente: Adaptado de Acosta y Castro (53).

El “procedimiento consistió en adicionar en un tubo una cantidad adecuada de

extracto para luego agregar etanol en presencia de magnesio metálico y dos

gotas ácido clorhídrico concentrado dando una coloración de naranja al rojo

para flavonas, una coloración rojo carmesí, purpura y azul para flavononas, un

color amarillo pálido o incoloro para flavonas y flavonoles, finalmente una

coloración de amarillo rojizo indica presencia de isoflavonas ” (44).

3.4.7.- Escala de Mc Farland

La escala de Mac Farland se preparó mezclando exactamente BaCl2 al 1.175%

y H2SO4 al 1% basándose en el Manual del Instituto Nacional de Salud (INS),

posteriormente se midió la absorbancia a 625 nm (52).

3.4.8.- Evaluación de la Actividad Antimicrobiana

3.4.8.1.- Reactivación de las cepas

Las cepas de Staphylococcus aureus ATCC 25923 fueron adquiridas de

KwikStik y almacenadas para su conservación en un intervalo de

temperaturas entre 2° a 8°C. Para la reactivación se puso en contacto el

hisopo que contenía la cepa con caldo, luego se sembró usando el hisopo

una placa Petri con agar Manitol Salado, finalmente se incubó la placa

sembrada por 24 horas a 37 °C (47).

Las cepas de Escherichia coli ATCC 25922 fueron adquiridas de KwikStik y

almacenadas para su conservación en un intervalo de temperaturas entre 2°

a 8°C. Para la reactivación se puso en contacto el hisopo que contenía la

cepa con caldo, luego se sembró usando el hisopo una placa Petri con agar

29

Müller Hinton, finalmente se incubó la placa sembrada por 24 horas a 37 °C

(47).

Las cepas de Cándida albicans ATCC 10231 fueron adquiridas de KwikStik

y almacenadas para su conservación en un intervalo de temperaturas entre

2° a 8°C. Para la reactivación se puso en contacto el hisopo que contenía la

cepa con caldo, luego se sembró usando el hisopo en una placa Petri con

agar Sabouraud, finalmente se incubó la placa sembrada por 48 horas a 37

°C (47).

3.4.8.2.- Preparación de la solución madre

Se preparó 1g de extracto seco de hojas de Prosopis pallida forma armata con

1mL de etanol, Se tomó una cantidad de extracto etanólico de hojas de

Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) de 500 μL que se emulsifica con 50

μL de tween 80 y se le adicionó 450 μL de agua estéril hasta completar 1000

μL, de este modo se obtuvo una emulsión homogénea cuya concentración fue

de 500 μL/Ml (44).

3.4.8.3.- Determinación de la Concentración Inhibitoria Mínima (CMI).

Para la determinación de la Concentración Inhibitoria Mínima se preparó un

inóculo con una concentración de 108 UFC/mL tomando una cantidad adecuada

de colonias para luego sumergir el asa de kolle en 5 mL del caldo peptonado,

hasta obtener una turbidez del medio similar a la del tubo N° 0.5 de la escala

de Mac Farland, la cual equivale, a una concentración de 108 UFC/mL (52).

Luego se procedió a realizar una dilución de 1:100 del inóculo ya preparado

para obtener una solución de 106 UFC /mL (54), esta última dilución fue

utilizada como el inóculo de estudio.

Finalmente, se estudiaron diluciones de 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.562, 0.781,

0.39, 0.195 mg/mL a partir de una solución madre del extracto etanólico de

hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) de una concentración de

500 mg/mL. Para ello en la Tabla 4 se observa el procedimiento resumido

siendo los primeros 7 tubos las diluciones expuestas, el tubo 9 el control

30

positivo que contiene el inóculo de microorganismos y el tubo 10 el control

negativo donde sólo se presenta el extracto en estudio en ausencia de inóculo

microbiano.

Tabla 4. Determinación de CMI por microdilución en caldo.

DESCRIPCIÓN TUBOS

T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 (+)

T10 (-)

solución madre del extracto etanólico de hojas de P. Pallida forma armata (Algarrobo) (500 mg/mL)

100 500 500 500 500 500 500 500 _ 500

Caldo Peptonado (μL) 900 500 500 500 500 500 500 500 500 _

Concentración Inicial de extracto etanólico de hojas de P. Pallida forma armata (Algarrobo) (500 mg/mL)

50 25 12.50 6.25 3.12 1.56 0.78 0.39

_

Inóculo (μL) 500 500 500 500 500 500 500 500 500 _

Volumen final (mL) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0.5

Concentración final extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida (Algarrobo) (500 mg/mL) (μL/mL)

25 12.50 6.25 3.12 1.56 0.78 0.39 0.19 _ 500


3.4.9.- Determinación de la Concentración Mínima Bactericida (CMB)

De los tubos de ensayo estudiados en la tabla precedente se sembró en placas

petry un volumen de 500 µL en agar manitol salado, Müller Hinton y Sabouraud

para S. aureus, E. coli y C. albicans respectivamente, incubando de 24 a 48

horas para luego evaluar el crecimiento bacteriano, ello a fin de determinar la

cantidad del extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata

(Algarrobo) capaz de destruir el 99,9% de una muestra inoculada en

condiciones estandarizadas (54).

3.4.9.1.- Determinación de la sensibilidad antimicrobiana

El método usado fue por la impregnación de discos con las muestras a

estudiar, el resultado es una zona de inhibición del desarrollo con borde

delineado; los cuales se expresan según el INS como; sensible (S), intermedio

(I), y resistente (R). Siendo entre 30 y 35 mm altamente sensible, de 20 a 30

mm sensibles, de 15 a 20 intermedio y menores a 15 mm resistentes (52).

31

Se elaboraron discos de papel filtro de 5 mm de diámetro, los cuales fueron

esterilizados en la autoclave por 15 minutos a 121°C, posteriormente fueron

almacenados en un frasco previamente esterilizado, posteriormente los discos

fueron impregnados con las diferentes concentraciones del extracto etanólico

de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) (53).

Es así que, se evaluaron concentraciones del extracto etanólico de hojas de

Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) de 100.00, 80.00, 60.00, 40.00,

20.00, 10.00, 5.00, 2.50, 1.25, 0.63, 0.31 % en discos elaborados con papel

filtro, por otro lado, los diámetros se midieron usando un vernier.

3.4.9.2.- Estrategia de recolección de datos

Para el presente trabajo de investigación se utilizaron paquetes de datos como

Microsoft Excel y Minitab 16 para la comparación de grupos haciendo un

análisis de varianza ANOVA y una prueba comparativa de TUKEY.

32

CAPÍTULO IV

RESULTADOS

4.1.- Recolección e identificación

Las hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) recolectadas en el

Sector Belaúnde del Distrito de Quequeña, Provincia – Departamento de

Arequipa fueron identificadas en el Herbarium Areqvipense (HUSA) de la

Universidad Nacional de San Agustín de Arequipa (Anexo 1), como Prosopis

pallida forma armata.

Tabla 5. Identificación y tipificación de hojas de Algarrobo recolectadas.

División Magnoliophyta

Clase Magnoliopsidae

Subclase Rosidae

Orden Fabales

Familia Fabaceae

Género Prosopis

Especie Prosopis pallida forma armata.

Fuente: Herbarium Areqvipense (HUSA) de la Universidad Nacional de San Agustín de

Arequipa.

4.2.- Extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida (Algarrobo)

Los “extractos obtenidos por el método de extracción por Soxhlet usando 20

gramos de hojas pulverizadas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo),

fueron concentrados a Baño María a 70 °C”, hasta peso constante luego los

extractos secos fueron pesados (Figura 7) para calcular el rendimiento (%R)

(44), conforme a fórmula que se indica:

33

Figura 7. Peso de extracto seco obtenido luego de la evaporación

del solvente (etanol) a Baño María.


A continuación, en la Tabla 6 se muestran los resultados obtenidos luego de

calcular el rendimiento de las 3 extracciones realizadas, donde se muestra un

rendimiento promedio de 20.71 ± 0.40 % y una desviación estándar relativa de

1.93 %

Tabla 6. Porcentajes de rendimiento (%R) correspondientes a las extracciones del

extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo).

N Muestra (g) Peso de vaso (g) Peso de vaso con extracto

seco (g) %R

1 20 48.67 52.73 20.27

2 20 46.83 51.00 20.83

3 20 48.93 53.14 21.04

Promedio (%) 20.71

Desviación estándar 0.40

Desviación Estándar Relativa DSR (%) 1.92

Fuente. Elaboración propia

4.3.- Identificación de taninos

En la Figura 8 se observa que el tubo de ensayo N° 1 correspondiente al

Cloruro Férrico al 5 % sin extracto, el tubo de ensayo 2 corresponde al extracto

etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) obtenido, y el

tubo 3 es el tubo que contiene el extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida

forma armata con el Cloruro Férrico al 5 % dando una coloración marrón

correspondientes a taninos condensados.

34

Figura 8. Identificación de taninos condensados en Prosopis pallida forma armata (Algarrobo). Fuente: Elaboración propia.

4.4.- Identificación de flavonoides por la prueba de Shinoda.

En la Figura 9 se observa el tubo de ensayo 3 que corresponde al extracto

etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo), el tubo 2 es el

blanco el cual presenta solo etanol con Mg y HCl y el tubo 1 es el tubo que

contiene el extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata

(Algarrobo) con etanol, Mg y HCl dando una coloración rojo carmesí

característico de flavononas.

Figura 9. Identificación de flavonoides. Presencia de flavononas en Prosopis pallida forma armata (Algarrobo). Fuente: Elaboración propia.

35

4.5.- Evaluación de la actividad antibacteriana del extracto etanólico de

hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente a Escherichia

coli ATCC 25922.

Para la evaluación de la actividad antibacteriana del extracto etanólico de hojas

de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente a Escherichia coli ATCC

25922, se evaluó primero la Concentración Mínima Inhibitoria, posteriormente

la Concentración Bactericida Mínima y finalmente la Sensibilidad usando discos

de inhibición y los resultados se exponen a continuación.

4.5.1.- Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) extracto etanólico de hojas

de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente a E. coli ATCC 25922.

La concentración inhibitoria mínima CIM se determinó por el método de

microdilución en caldo peptonado, evaluando concentraciones finales de 0.19,

0.39, 0.78, 1.56, 3.12, 6.25, 12.50 y 25 µL/mL de extracto etanólico de hojas de

Prosopis pallida (Algarrobo), realizándose el ensayo por triplicado y los

resultados se pueden reflejar en la Figura 10:

Figura 10. Tubos de ensayo de determinación de CMI de extracto etanólico de hojas de P. Pallida forma armata (Algarrobo) frente a E. coli. Fuente. Elaboración propia.

De donde:

Tubo 1: Se llevaron 100 µL de solución madre (Extracto de 500 mg/mL) con

900 µL de caldo peptonado, retirando 500 µL de esta solución al tubo 2 se

adicionaron 500 µL de inóculo bacteriano de 106 UFC /mL lográndose una

36

concentración final de 25 mg/mL (2.5 %) de extracto etanólico de hojas de

Prosopis pallida forma armata (Algarrobo).

Tubo 2: A los 500 µL retirados del tubo 1 antes de adicionar el inóculo, se le

adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Retirando 500 µL de esta solución

al tubo 3, luego se adicionaron 500 µL de inóculo bacteriano de 106 UFC

/mL lográndose una concentración final de 12.5 mg/mL (1.25 %) de extracto

etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo).



al tubo 4, se adicionaron 500 µL de inóculo bacteriano de 106 UFC /mL

lográndose una concentración final de 6.25 mg/mL (0.63 %) de extracto










lográndose una concentración final 1.562 mg/mL (0.16 %) de extracto












37


adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Desechando 500 µL de esta

solución se adicionaron 500 µL de inóculo bacteriano de 106 UFC /mL



El tubo 9 fue el control positivo al cual se le agregó 500 µL de caldo

peptonado con 500 µL de inóculo bacteriano de 106 UFC /mL.

Por otro lado, el tubo 10 se tomó como control negativo en el cual se

agregaron 500 µL de solución madre (500 mg/mL) de extracto etanólico de

hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo).

Finalmente, todos los tubos fueron incubados por 24 horas a 37 °C.

En la Tabla 7 se observan los resultados obtenidos luego de las 24 horas de

incubación, donde se presenta a partir del Tubo 4 se nota crecimiento de

Escherichia coli ATCC 25922 manifestado por la presencia de turbidez, la cual

se interpreta que la Concentración Mínima Inhibitoria del extracto etanólico de

hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) es de 6.25 mg/mL dicha

concentración es capaz de inhibir el crecimiento de Escherichia coli ATCC

25922 es de 6.25 mg/mL por el método de micro dilución en caldo.

Tabla 7. Resultados de la determinación de concentración inhibitoria mínima (CIM) de

extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente a

Escherichia coli ATCC 25922.

DESCRIPCIÓN

TUBOS

T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9

(+)

T10

(-)

Concentración Final (mg/mL) de extracto etanólico de hojas de P. Pallida forma armata (Algarrobo)

25.0 12.5 6.25 3.12 1.56 0.78 0.39 0.19 0.00 500

Concentración Porcentual (%)de extracto etanólico de hojas de P. Pallida forma armata (Algarrobo)

2.50 1.25 0.63 0.31 0.16 0.08 0.04 0.02 0.00 50

E. coli ATCC 25922 ENSAYO 1 - - - + + + + + + -



Donde: + = crecimiento bacteriano positivo; - = crecimiento bacteriano negativo


38

4.5.2.- Concentración Mínima Bactericida (CMB) de extracto etanólico de

hojas de P. Pallida forma armata (Algarrobo) frente a E. coli ATCC 25922.

La Concentración Mínima Bactericida fue realizada por el método de siembra

en placa con agar Müller Hinton de los tubos del 2, 3, 4, 5 y el tubo 9 como

control positivo con el fin evaluar el crecimiento bacteriano.

Figura 11. Siembra en placa (CMB) de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma

armata (Algarrobo) frente a E. coli ATCC 25922.


En la Tabla 8 y Figura 11 se observa que en las placas del tubo 4 y 5 si existe

crecimiento de Escherichia coli ATCC 25922 al observarse el crecimiento de

colonias las cuales fueron contrastadas con el control positivo, por lo cual, la

concentración mínima del extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma

armata (Algarrobo) para inhibir el crecimiento del 99.9 % de Escherichia coli

ATCC 25922 es de 6.25 mg/mL lo cual coincide con el resultado de la CMI.

Tabla 8. Resultados de la determinación de la Concentración Mínima Bactericida

(CMB) de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo)

frente a Escherichia coli ATCC 25922.

DESCRIPCIÓN PLACAS

T2 T3 T4 T5 T9

Concentración Final (μL/ml) de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo)

12.50 6.25 3.12 1.56 0

Concentración Porcentual (%)de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo)

1.25 0.63 0.31 0.16 0

Escherichia coli ENSAYO 1 - - + + +




Fuente: Elaboración propia

4.5.3.- Determinación de la sensibilidad bacteriana de extracto etanólico

de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo), comparada con

Ciprofloxacino frente a Escherichia coli ATCC 25922.

39

La sensibilidad bacteriana evaluada a concentraciones de 0.31, 0.63, 1.25,

2.50, 5, 10, 20, 40, 60, 80 y 100 % de extracto etanólico de hojas de Prosopis

pallida forma armata (Algarrobo) por el método de dilución en discos en placas

con agar Müller Hinton presentó halos de inhibición definidos.

Figura 12. Sensibilidad bacteriana de extracto etanólico de hojas de

P. Pallida forma armata (Algarrobo) frente a E. coli ATCC 25922

Fuente. Elaboración propia

En la Tabla 9 se observan los resultados promedio de los halos de inhibición de

las concentraciones estudiadas de extracto etanólico de hojas de Prosopis

pallida forma armata (Algarrobo) frente a E. coli.

Tabla 9. Sensibilidad de Escherichia coli ATCC 25922 a concentraciones del extracto


Concentración extracto etanólico de hojas

de P. Pallida forma armata (Algarrobo) Halos de inhibición (mm) Evaluación

(%) E1 E2 E3 Promedio

100.00% 39.1 36.0 34.0 36.3 AS

80.00% 33.2 32.2 32.0 32.4 AS

60.00% 29.1 28.5 28.0 28.5 S

40.00% 28.0 27.4 26.0 27.1 S

20.00% 25.0 25.0 22.1 24.0 S

10.00% 22.0 21.5 21.1 21.5 S

5.00% 19.0 18.5 18.4 18.6 I

2.50% 18.0 17.1 16.6 17.2 I

1.25% 16.4 14.5 15.0 15.3 I

0.63% 14.2 14.0 13.8 14.0 R

0.31% 13.5 12.2 12.0 12.5 R

Ciprofloxacino 50.2 48.0 47.6 48.6 AS

Etanol 0 0 0 0.00 NE

Donde: NE = No hay efecto, AS = Altamente sensible, S = Sensible, I = Intermedio, y R =

Resistente.


40

En la Tabla 9 se observa que de las concentraciones del extracto etanólico de

hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) estudiadas frente al

Escherichia coli ATCC 25922, donde es Resistente a concentraciones de 0.31

y 0.63 %, Intermedio a concentraciones de 1.25, 2.50 y 5.00 %, Sensible a

concentraciones de 10.00, 20.00, 40.00 y 60.00 % y Altamente sensible a

concentraciones de 80.00 y 100.00 % de la misma forma Altamente sensible al

ciprofloxacino.

Para la comparación estadística se procedió a realizar un análisis de varianza

ANOVA, obteniendo como resultado que el valor crítico para Fc es menor al

valor de F (Fc: 2.15 < F: 375.46), por lo cual, se concluye que al menos un

grupo es diferente al 95 % de confianza (Tabla 10).

Tabla 10. Análisis de varianza de la determinación de prueba de sensibilidad de

Escherichia coli ATCC 25922 a concentraciones del extracto etanólico de hojas de


Origen de las variaciones

Suma de cuadrados

GL Promedio

de los cuadrados

F Probabilidad Valor crítico

para Fc

Entre grupos 5413.54 12 451.13 375.46 6.09x10-26 2.15

Dentro de los

grupos 31.24 26 1.20

Total 5444.78 38

Donde:

Fc:2.15<F:375.46; p<0.05: (al menos un grupo difiere al 95 % de confianza)

GL = Grado de libertad

Fc = Factor de Corrección

F = Estimación de la varianza

Fuente: Elaboración propia adaptado de ANOVA

Posteriormente, se aplicó un test de Tukey como se observa en la Tabla 11,

con la finalidad de distinguir qué grupos son iguales y diferentes, en dicha tabla

se observa que ninguna concentración del extracto etanólico de hojas de

Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) estudiada se asemeja al efecto

mostrado por el ciprofloxacino por lo cual el efecto antibacteriano frente a E.

coli mostrado por el extracto es menor al ciprofloxacino.

41

Tabla 11. Test de Tukey de comparación de la sensibilidad de Escherichia coli ATCC

25922 a concentraciones del extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma

armata (Algarrobo).

FACTOR N PROMEDIO DE TAMAÑO DE

HALOS EVALUADOS GRUPO

Ciprofloxacino 3 48.60 A

100.00% 3 36.37

B

80.00% 3 32.47

C

60.00% 3 28.53

D

40.00 % 3 27.13

D E

20.00% 3 24.03

E F

10.00% 3 21.53

F G

40.00% 3 18.63

G H

2.50% 3 17.23

H I

0.63% 3 15.30

I J

1.25% 3 14.00

J

0.31% 3 12.57

J

Etanol 3 0.000 K

Donde:

- % = Concentración de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata

(Algarrobo)

- Cada letra indicada en la columna grupo, señala un grupo evaluado, a letras iguales no

hay diferencia significativa entre los grupos.

N = Número de pruebas realizadas de una misma concentración.

Fuente: Elaboración propia adaptado de Minitab 17.

En la Figura 13 se observa el diagrama de cajas y bigotes correspondientes a

los datos obtenidos, luego de realizar los ensayos de sensibilidad bacteriana de

Escherichia coli ATCC 25922, donde los halos de inhibición varían en tamaño

de acuerdo con cada concentración del extracto etanólico de hojas de Prosopis

pallida (Algarrobo).

42

Figura 13. Boxplot Data de la evaluación de la sensibilidad de E. coli ATCC 25922 a

concentraciones del extracto etanólico de hojas de P. Pallida forma armata (Algarrobo)


4.6.- Evaluación de la actividad antimicrobiana de extracto etanólico de


Staphylococcus aureus ATCC 25923

Para la evaluación de la actividad antibacteriana de extracto etanólico de hojas

de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente a Staphylococcus aureus

ATCC 25923 primero se evaluó la Concentración Inhibitoria Mínima,

posteriormente la Concentración Bactericida Mínima y finalmente la

Sensibilidad usando discos de inhibición y los resultados se exponen a

continuación.

4.6.1.- Concentración inhibitoria mínima (CIM) de extracto etanólico de


Staphylococcus aureus ATCC 25923

La concentración inhibitoria mínima CIM se determinó por el método de


43

0.39, 0.78, 1.56, 3.12, 6.25, 12.50 y 25 mg/mL de extracto etanólico de hojas

de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo), donde en el:

Tubo 1: se llevaron 100 µL de solución madre (Extracto etanólico de hojas

de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) de 500 mg/mL) con 900 µL de

caldo peptonado, retirando 500 µL de esta solución al tubo 2 se adicionaron

500 µL de inóculo bacteriano de 106 UFC /mL lográndose una concentración

final de 25 mg/mL (2.5 %) de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida

(Algarrobo).




/mL lográndose una concentración final de 12.50 mg/mL (1.25 %) de

extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida (Algarrobo).





etanólico de hojas de Prosopis pallida (Algarrobo).
















44








solución se adicionaron 500 µL de inóculo bacteriano de 106 UFC/mL



Por otro lado, un tubo 9 fue el control positivo al cual se le agregó 500 µL de

caldo peptonado con 500 µL de inóculo bacteriano de 106 UFC /mL. Por otro

lado, el tubo 10 se tomó como control negativo en el cual se agregaron 500

µL de solución madre (500 mg/mL) de extracto. Se dejó incubar por 24

horas a 37 °C.


El ensayo fue realizado por triplicado y los resultados se pueden reflejar en

la Figura 14.

Figura 14. Tubos de ensayo de determinación de la CMI del extracto etanólico de

hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente a Staphylococcus

aureus ATCC 25923.


45


incubación, encontrándose que no existe turbidez en los tubos 1, 2, 3, 4, 5, 6, y

7 en cambio en el tubo 8 si existe crecimiento los cual se interpreta que la

Concentración Mínima Inhibitoria del extracto etanólico de hojas de Prosopis

pallida forma armata (Algarrobo) es de 6.25 mg/mL dicha concentración es

capaz de inhibir el crecimiento de Staphylococcus aureus ATCC 25923 es de

0.39 mg /mL por el método de microdilución en caldo.

Tabla 12. Resultados de la determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria

(CMI) de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo)

frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923.

DESCRIPCIÓN

TUBOS

T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9

(+)

T10

(-)

Concentración Final (μL/ml) de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo)

25.0 12.5 6.25 3.12 1.56 0.78 0.39 0.19 0.00 500

Concentración porcentual (%)de extracto etanólico de hojas de P. Pallida forma armata (Algarrobo)

2.50 1.25 0.63 0.31 0.16 0.08 0.04 0.02 0.00 50

S aureus ATCC 25923 ENSAYO 1 - - - - - - - + + -

S. aureus ATCC 25923 ENSAYO 2 - - - - - - - + + -

S. aureus ATCC 25923 ENSAYO 3 - - - - - - - + + -



4.6.2.- Concentración Mínima Bactericida (CMB) de extracto etanólico de

hojas de P. Pallida forma armata (Algarrobo) frente a S. aureus ATCC

25923

La determinación de Concentración Mínima Bactericida fue realizada por el

método de siembra en placa con agar Manitol Salado, la concentración de los

tubos de ensayo del 5, 6, 7, 8 y el tubo 9 como control positivo, ello con la

finalidad de evaluar el crecimiento bacteriano

46

Figura 15. Siembra en placa CMB de extracto etanólico de hojas Prosopis pallida forma

armata (Algarrobo) frente a S. aureus ATCC 25923.


En la Tabla 13 y Figura 15 se evidencian que en las placas 5, 6 y 7

correspondientes a los tubos de ensayo 5, 6 y 7 de la prueba de CMI no existe

crecimiento bacteriano, sin embargo en la placa 8 correspondiente al tubo de

ensayo 8 si presenta crecimiento de S. aureus ATCC 25923, por lo que la

Concentración Mínima Bactericida es de 0.39 mg/mL equivalente al 0.04% de

extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo).

Tabla 13. Resultados de la determinación de la Concentración Mínima Bactericida

(CMB) de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo)

frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923.

DESCRIPCIÓN PLACAS

T5 T6 T7 T8 T9 (+)

Concentración final (mg/ml) de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo)

1.56 0.78 0.39 0.19 0

Concentración porcentual (%) de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo)

0.16 0.08 0.04 0.02 0

Staphylococcus aureus ATCC 2592 3ENSAYO 1 - - - + +

Staphylococcus aureus ATCC 25923 ENSAYO 2 - - - + +

Staphylococcus aureus ATCC 25923 ENSAYO 3 - - - + +



4.6.3.- Determinación de la sensibilidad bacteriana de extracto etanólico

de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) comparada con

Ampicilina frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923.




con agar Manitol Salado, presentó halos de inhibición definidos como se

observa a continuación.

47

Figura 16. Sensibilidad bacteriana de S. aureus ATCC 25923 frente al

extracto etanólico de hojas de P.pallida forma armata (Algarrobo).


En la Tabla 14 se observan los resultados de los halos de inhibición de las

concentraciones estudiadas de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida

forma armata (Algarrobo) frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923.

Tabla 14. Resultados de la determinación de la sensibilidad de Staphylococcus aureus

ATCC 25923 a concentraciones de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida

forma armata (Algarrobo)

Concentración extracto etanólico de

hojas de Prosopis pallida forma

armata (Algarrobo)

Halos de inhibición (mm) Evaluación


100% 33.4 31.5 30.0 31.6 AS

80% 29.9 28.3 28.3 28.8 S

60% 27.9 25.2 25.0 26.0 S

40% 24.6 24.4 24.0 24.3 S

20% 23.6 23.0 23.0 23.2 S

10% 21.9 21.8 21.0 21.5 S

5% 20.8 20.5 19.5 20.2 S

2.50% 19.2 18.7 18.3 18.7 I

1.25% 17.8 17.3 17.0 17.3 I

0.63% 16.6 15.3 15.0 15.6 I

0.31% 12.5 12.0 11.6 12.0 R

Ampicilina 24.4 24.6 25.0 24.6 S

Etanol 0 0 0 0 NE

Donde: NE = No hay efecto, AS = Altamente sensible, S = Sensible, I = Intermedio, y

R = Resistente.


48


hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) estudiadas, Staphylococcus

aureus ATCC 25923 es Resistente a concentraciones de 0.31 %, Intermedio a

concentraciones de 0.63, 1.25 y 2.50 %, Sensible a concentraciones de 5.00,

10.00, 20.00, 40.00, 60.00 y 80.00 % y Altamente sensible a concentraciones

de 100.00 % por otro lado, sensible a Ampicilina.



valor de F (Fc:2.15 < F: 269.59), por lo cual, se concluye que al menos un



Staphylococcus aureus ATCC 25923 a concentraciones del extracto etanólico de hojas

de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo).


Suma de cuadrados

GL Promedio

de los cuadrados


para Fc

Entre grupos 2378.21 12 198.18 296.59 1.27 x10-24 2.15

Dentro de los

grupos 17.37 26 0.69

Total 2395.58 38

Donde:

Fc: 2.15 < F:296.59; p<0.05: (al menos un grupo difiere al 95 % de confianza)





Posteriormente, se aplicó un test de Tukey como se observa en la Tabla 16 con

la finalidad de distinguir qué grupos son iguales y diferentes, en dicha tabla se

observa no existe diferencia significativa entre concentraciones de 20, 40 y 60

% de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo)

y Ampicilina en cuanto a la sensibilidad de S. aureus.

49

Tabla 16. Test de Tukey de la determinación de la sensibilidad de Staphylococcus

aureus ATCC 25923 a concentraciones de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo).



100.00 % 3 31.6

A

80.00 % 3 28.8 B

60.00 % 3 26.0 C

Ampicilina 3 24.6 C D

40.00 % 3 24.3 C D

20.00 % 3 23.2 D E

10.00 % 3 21.5 E F

5.00 % 3 20.2 F G

2.50 % 3 18.7 G H

1.25 % 3 17.3 H I

0.63 % 3 15.6 I

0.31 % 3 12.0 J

Etanol 3 0 K

Donde:

- % = Concentración de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata

(Algarrobo)





En la Figura 17 se observa el diagrama de cajas y bigotes correspondientes a

los datos obtenidos luego de realizar los ensayos de sensibilidad bacteriana de

Staphylococcus aureus ATCC 25923, donde a concentraciones de 80 y 100 %

de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo), los

halos de inhibición son superiores al obtenido con Ampicilina.

50

Figura 17. Boxplot Data de la evaluación de la sensibilidad de S. aureus ATCC

25923 a concentraciones de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma

armata (Algarrobo).


4.7.- Evaluación de la actividad antimicótica de extracto etanólico de

hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente a Cepas de

Cándida albicans ATCC 10231

Para la evaluación de la actividad antimicótica de Prosopis pallida forma armata

(Algarrobo) frente a Cándida albicans ATCC 10231, primero se evaluó la

Concentración Mínima Inhibitoria, posteriormente la Concentración Mínima

Antimicótica y finalmente la Sensibilidad usando discos de inhibición y los

resultados se exponen a continuación.

4.7.1.- Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de extracto etanólico de

hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente a cepas de

Cándida albicans ATCC 10231.

La concentración Inhibitoria Mínima se determinó por el método de


0.390, 0.781, 1.562, 3.125, 6.25, 12.5 y 25 µL/mL de extracto etanólico de


51

Tubo 1: se llevaron 100 µL de solución madre (Extracto etanólico de hojas

de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) de 500 mg/mL) con 900 µL de

caldo peptonado, retirando 500 µL de esta solución al tubo 2 se adicionaron

500 µL de inóculo bacteriano de 106 UFC /mL lográndose una concentración

final de 25 mg/mL (2.5 %) de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida

(Algarrobo).




/mL lográndose una concentración final de 12.50 mg/mL (1.25 %) de

extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida (Algarrobo).























52






solución se adicionaron 500 µL de inóculo bacteriano de 106 UFC /mL



Por otro lado, un tubo 9 fue el control positivo al cual se le agregó 500 µL de

caldo peptonado con 500 µL de inóculo bacteriano de 106 UFC /mL. Por otro

lado, el tubo 10 se tomó como control negativo en el cual se agregaron 500

µL de solución madre (500 mg/mL) de extracto etanólico de hojas de

Prosopis pallida (Algarrobo).


El ensayo fue realizado por triplicado y los resultados se pueden reflejar en

la Figura 18.

Figura 18. Método de microdilución en tubos para la determinación de CMI de

P. Pallida forma armata (Algarrobo) frente a cepas de C. albicans ATCC

10231.


53


incubación, visualizándose que no existe turbidez en los tubos 1, 2, 3, 4,5, 6, y

7 en cambio en el tubo 8 si existe crecimiento los cual se interpreta que la

Concentración Mínima Inhibitoria del extracto etanólico de hojas de Prosopis

pallida forma armata (Algarrobo) es de 6.25 mg/mL dicha concentración es

capaz de inhibir el crecimiento de Cepas de Cándida albicans ATCC 10231 es

de 0.39 mg/mL por el método de micro dilución en caldo.

Tabla 17. Resultados de la determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria

(CMI) de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo)

frente a Cándida albicans ATCC 10231.

DESCRIPCIÓN

TUBOS

T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9

(+)

T10

(-)

Concentración final (μL/ml) de extracto etanólico de hojas de P. Pallida forma armata (Algarrobo)

25.0 12.5 6.25 3.12 1.56 0.78 0.39 0.19 0.00 500

Concentración porcentual (%)de extracto etanólico de hojas de P. Pallida forma armata (Algarrobo)

2.50 1.25 0.63 0.31 0.16 0.08 0.04 0.02 0.00 50

C. albicans ATCC 10231 ensayo 1 - - - - - - - + + -





4.7.2.- Concentración Mínima Antimicótica (CMA) de extracto etanólico de

hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente a Cepas de

Cándida albicans ATCC 10231.

La determinación de Concentración Mínima Antimicótica fue realizada por el

método de siembra en placa con agar Sabouraud, realizado con las

concentraciones de los tubos de ensayos del 5, 6,7,8 y el tubo 9 como control

positivo con el fin evaluar el crecimiento micótico, como se observa en la Figura

19.

54

Figura 19. Siembra en placa (CBM) de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente a

Cándida albicans ATCC 10231


En la Tabla 18 se presentan los resultados, los cuales mostraron crecimiento

de Cándida albicans ATCC 10231 positivo en el Tubo 8, observándose

crecimiento del microorganismo por lo que la Concentración Mínima

Antimicótica es de 0.39 mg/mL equivalente al 0.04% de extracto etanólico de


Tabla 18. Resultados de la determinación de la Concentración Mínima Antimicótica (CMA) de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente a Cándida albicans ATCC 10231.

DESCRIPCIÓN PLACAS

T5 T6 T7 T8 T9 (+)

Concentración final (mg/ml) de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo)

1.56 0.78 0.39 0.19 0

Concentración porcentual (%) de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo)

0.16 0.08 0.04 0.02 0

Cándida albicans ATCC 10231 ENSAYO 1 - - - + +





4.7.3.- Determinación de la sensibilidad antimicótica de extracto etanólico

de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) comparada con

Clotrimazol 1% frente a Cándida albicans ATCC 10231.




con agar Sabouraud, presentó halos de inhibición definidos como se observa a

continuación.

55

Figura 20. Sensibilidad fúngica de Cándida albicans ATCC 10231 frente al extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) Fuente: Elaboración propia

En la Tabla 19 se observan los resultados de los halos de inhibición de las

concentraciones estudiadas de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida

forma armata (Algarrobo) frente a Cándida albicans.

Tabla 19. Resultados de determinación de la sensibilidad de Cándida albicans ATCC


armata (Algarrobo).

Concentración extracto etanólico de hojas de P. pallida forma armata

(Algarrobo) Halos de inhibición (mm) Evaluación


100.00 % 24.0 22.6 20.9 22.5 S

80.00 % 20.2 17.8 17.4 18.4 I

60.00 % 16.0 16.0 16.0 16.0 I

40.00 % 15.7 15.6 14.9 15.4 I

20.00 % 14.7 14.6 14.6 14.6 R

10.00 % 14.3 13.6 13.5 13.8 R

5.00 % 13.2 13.0 11.9 12.7 R

2.50% 11.8 11.7 11.4 11.6 R

1.25% 11.0 9.7 8.9 9.8 R

0.63% 8.8 8.6 7.5 8.3 R

0.31% 7.0 6.7 6.5 6.7 NE

Clotrimazol 44.0 36.0 41.0 40.3 AS

Etanol 0 0 0 0 NE

Donde: NE = No hay efecto, AS = Altamente sensible, S = Sensible, I = Intermedio,

R = Resistente.


56


Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) estudiadas, donde Cándida albicans

ATCC 10231 es Resistente a concentraciones de 0.31, 0.63, 1.25, 2.50 5.00,

10.00, 20.00 %, Intermedio a concentraciones, 40.00, 60.00 y 80.00 % y

Sensible a concentraciones de 100.00 %; por otro lado, es Altamente sensible

al Clotrimazol.



valor de F (Fc:2.15 < F: 250.23), por lo cual, se concluye que al menos un



Cándida albicans ATCC 10231 a concentraciones del extracto etanólico de hojas de



Suma de cuadrados

GL Promedio

de los cuadrados


para Fc

Entre grupos 3276.99 12 273.08 250.23 7.77 x10-21 2.15

Dentro de los

grupos 47.26 26 1.818

Total 3324.26 38

Donde:

Fc: 2.15 < F:250.23; p<0.05: (al menos un grupo difiere al 95 % de confianza)





Posteriormente, se aplicó un test de Tukey como se observa en la Tabla 21 con

la finalidad de distinguir que grupos son iguales y diferentes, notamos que

ninguna concentración estudiada se iguala al efecto del clotrimazol.

57

Tabla 21. Test de Tukey de la determinación de la sensibilidad de Cándida albicans

ATCC 10231 a concentraciones extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida

(Algarrobo).



Clotrimazol 3 40.3 A

100.00 % 3 22.5 B

80.00 % 3 18.4 C

60.00 % 3 16.0 D

40.00 % 3 15.4 D

20.00 % 3 14.6 D E

10.00 % 3 13.8 D E F

5.00 % 3 12.7 E F

2.50% 3 11.6 F G

1.25% 3 9.8 G H

0.63% 3 8.3 H I

0.31% 3 6.7 I

Etanol 3 0 J

Donde: - % = Concentración de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata

(Algarrobo)





En la Figura 21 se observa el gráfico de cajas y bigotes, donde se evidencia la

sensibilidad de Cándida albicans ATCC 10231 frente a las concentraciones del

extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo),

sensibilidad que aumenta a medida que se incrementa la concentración.

58

Figura 21. Boxplot Data de la evaluación de la sensibilidad de Cándida albicans ATCC


armata (Algarrobo).


59

CAPÍTULO V

DISCUSIÓN

La presente investigación tuvo por objetivo estudiar el efecto antimicrobiano del

extracto etanólico de las hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo)

sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 y

Cándida albicans ATCC 10231, planta identificada por el biólogo Leoncio

Mariño Herrera de la Universidad Nacional de San Agustín.

Los estudios con extractos de productos naturales van teniendo más

importancia a través de los años debido a los beneficios y propiedades que

presentan para mejorar el estado de salud de la población, como se demostró

en los trabajos de Zandoval E, Zuñiga E. (5); Vásquez L. (6); Cárdenas C, Ruiz

J, Castro A, Ramos N, Rojas J, Ramos D. (7); Cardenas C. (9) y Alvarado S.

(34), encontrándose que las hojas y frutos de Prosopis pallida posee efectos

antibacteriano y antifungicida.

Cárdenas et al. (7), en su estudio fitoquímico de extracto de las hojas

reportaron presencia de fenoles, taninos y flavonoides, asimismo Vásquez L.

(7) indicó también la presencia de alcaloides, esteroides, aminoácidos no

proteicos, fenoles, flavonoides, quinonas, cumarinas, taninos y terpenoides,

estudios que se comparan con la presente investigación, donde también se

evidenció la presencia de Taninos y Flavonoides, significando que la actividad

antimicrobiana del extracto etanólico de las hojas de Prosopis pallida

(Algarrobo) puede atribuirse a la presencia de polifenoles, flavonoides y taninos

que se pudieron observar en los análisis fitoquímicos preliminares. Donde los

flavonoides son pigmentos vegetales que poseen un esqueleto carbonado, este

presenta efecto antimicrobiano ya que puede formar complejos con las

proteínas solubles, extracelulares y el complejo con la pared microbiana, los

taninos tienen una acción de defensa y evitan un medio apropiado para los

microorganismos para que no se desarrollen y la especie vegetal pueda

reproducirse adecuadamente, Los taninos son compuestos fenólicos y su

acción es antimicrobiana la cual se debe a su capacidad para desnaturalizar

60

proteínas, inactivar adhesinas microbianas, enzimas y formar complejos con la

pared celular (9).

De acuerdo a los resultados obtenidos por Cárdenas et al. (7), estos midieron

la actividad antibacteriana del extracto etanólico de las hojas de Prosopis

pallida mediante el método de difusión en agar, evidenciando un halo de

inhibición de 18,1 ± 1,2 mm frente a la cepa de Staphylococcus aureus ATCC

25923. En la presente investigación, usando el método de extracción por

Soxhlet, se obtuvo como CMI y CMB de 0.39 mg/mL del extracto seco frente a

cepas de Staphylococcus aureus ATCC 25923 con halos de inhibición de

12.03mm hasta 31.63mm, en comparación, el presente estudio mostró mayor

efecto que lo obtenidos por Cárdenas et al. La diferencia entre estos resultados

puede deberse a ciertos factores, por ejemplo, a la posible diversidad entre las

especies de las plantas, a la ubicación geográfica, a los disolventes utilizados y

a la presencia de los compuestos activos en cada una de las especies.

Vásquez L. (6), evaluó el efecto antifúngico in vitro del extracto etanólico de

Prosopis pallida (algarrobo) sobre Cándida albicans ATCC 90028 dando como

resultado una mayor inhibición a la concentración de 22.5 mg/mL y 25 mg/mL

obteniéndose halos promedio de inhibición de 12.9mm y 11.5mm

respectivamente. En la presente investigación se obtuvo una Concentración

Mínima Antimicótica (CMA) frente a Cándida albicans ATCC 10231 de 0.39

mg/mL logrando halos de inhibición de 8.30 a 22.50 mm, lo cual indica que los

resultados obtenidos son superiores a los obtenidos por Vásquez los cual

podría deberse a la procedencia y condiciones ambientales en las que creció la

especie vegetal.

Por otro lado, Zandoval E. y Zúñiga E. (5), determinaron el efecto

antibacteriano de las hojas de Prosopis pallida (Algarrobo) mediante el método

modificado de pozos en agar; empleando cepas de Staphylococcus aureus

ATCC 13071 y Escherichia coli ATCC 25992, con concentraciones de

alcaloides totales de 2.5 mg/ml, 5 mg/ml y 10 mg/ml disueltos en

dimetilsulfóxido (DMSO) y cloranfenicol como control. Los halos de inhibición

en promedio para E. coli fueron de 12 mm de diámetro a una concentración de

61

2.5 mg/ml, 14.13 mm de diámetro a 5 mg/ml y 15.38 mm de diámetro para la

concentración de 10 mg/ml. En la presente investigación se obtuvo una

Concentración Mínima Bactericida (CMB) y una Concentracion Minima

Inhibitoria (CMI) frente a Escherichia coli ATCC 25922 de 6.25 mg/mL con

halos de inhibición de 12.57mm a 36.37mm, halos superiores a los encontrados

por Zandoval E. Zuñiga E., diferencia que podría estar marcada por el método

de extracción de principios activos, donde Zandoval E. Zuñiga E, realizaron la

extracción de alcaloides totales mediante la maceración en etanol de hojas de

Prosopis pallida (Algarrobo) y el presente trabajo de investigación se realizó

mediante la extracción etanólica de hojas de Prosopis pallida (Algarrobo)

mediante equipo Soxhlet.

Cárdenas C. (9), nos indica en su investigación que el método de difusión en

agar es ampliamente utilizado para evaluar la actividad de extractos

antimicrobianos, este método es cualitativo y está diseñado específicamente

para bacterias de crecimiento rápido, lo que tener un amplio panorama para

determinar el comportamiento de los extractos frente a los diferentes

microorganismos estudiados. El método de microdilución en placa permitió

determinar los valores de CMI, este método tiene los estándares más

reconocidos proporcionados por el CLSI (Clinical Laboratoty Standars Institute)

y el Comité Europeo de Pruebas de Susceptibilidad Antimicrobiana (EUCAST),

estas directrices proporcionan un procedimiento uniforme para la prueba para

llevar a cabo en la mayoría de los laboratorios de microbiología clínica. Por lo

tanto, la reproducibilidad, la economía de los reactivos y el espacio que se

produce debido a la miniaturización de la prueba son las principales ventajas

de este método de microdilución. No obstante, es conocido que el tamaño del

inóculo, el tipo de medio de crecimiento, el tiempo de incubación y el método

de preparación del inóculo puede influir en los valores de CMI, situación que

respalda nuestros estudios realizados, como determinación de Concentración

Mínima Inhibitoria realizada sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923,

Escherichia coli ATCC 25922 y Cándida albicans ATCC 10231.

Asimismo, Lerida A (55), nos señala que el medio ambiente donde crecen las

plantas, el clima ejerce gran influencia en lo que respecta a los principios

62

activos. La luz, temperatura y precipitaciones principalmente tienen un efecto

marcado sobre su presencia en las plantas; también la velocidad del viento,

aspecto poco estudiado experimentalmente, es determinante en muchos casos,

se conoce que por su acción se aumenta la evaporación de aceite esenciales,

el clima ejerce gran influencia en lo que respecta a los principios activos. La luz

es probablemente el factor de mayor significación, estimula el crecimiento de

los tejidos jóvenes, etapa en la cual se sustenta la teoría ocurre la acumulación

de los principios activos. La temperatura también juega un papel importante en

la producción de metabolitos secundarios, influye grandemente en el desarrollo

acelerado y en la estabilidad entre el desarrollo de fotosíntesis y respiratorio,

por consiguiente en la producción de los principios activos, factores

agroclimáticos que podrían marcar las diferencias que existe entre los halos de

inhibición registrados, entre los de la presente investigación y los estudios

realizados por Zandoval E., Zuñiga E. (5); Vásquez L. (6); Cárdenas C., Ruiz J.,

Castro A., Ramos N., Rojas J., Ramos D. (7); Cardenas C. (9) y Alvarado S.

(34).

63

CONCLUSIONES

1. Se identificaron taninos condensados con cloruro férrico al 5 % y

flavonoides mediante la prueba de Shinoda en el extracto etanólico de hojas

de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo).

2. El extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo)

presenta efecto antibacteriano frente a Escherichia coli ATCC 25922 con

una Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración Mínima

Bactericida (CMB) de 6.25 mg/mL.


presenta efecto antibacteriano frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923

con una Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración Mínima

Bactericida (CMB) de 0.39 mg/mL.


presenta efecto antimicótico frente a Cándida albicans ATCC 10231 con

una Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración Mínima

Antimicótica (CMA) de 0.39 mg/mL.

5. Escherichia coli ATCC 25922 presenta sensibilidad extracto etanólico de

hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) siendo resistente a

concentraciones de 0.31 y 0.63 %, Intermedio a concentraciones de 1.25,

2.50 y 5.00 %, Sensible a concentraciones de 10.00, 20.00, 40.00 y 60.00 %

y Altamente sensible a concentraciones de 80.00 y 100.00 %, por otro lado,

la sensibilidad de ciprofloxacino es superior a las concentraciones

estudiadas. Staphylococcus aureus ATCC 25923 presenta sensibilidad al

extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo)

siendo Resistente a concentraciones de 0.31 %, Intermedio a

concentraciones de 0.63, 1.25 y 2.50 %, Sensible a concentraciones de

5.00, 10.00, 20.00, 40.00, 60.00 y 80.00 % y Altamente sensible a

concentraciones de 100.00 %. por otro lado, los extractos 80 y 100 %

presentan efecto superior a la ampicilina. Cándida albicans ATCC 10231

presenta sensibilidad al extracto de Prosopis pallida forma armata

(Algarrobo) siendo Resistente a concentraciones de 0.31 de 0.63, 1.25, 2.50

64

5.00, 10.00, 20.00 %, Intermedio a concentraciones, 40.00, 60.00 y 80.00 %

y Sensible a concentraciones de 100.00 % por otro lado, la sensibilidad de

clotrimazol es superior a las concentraciones estudiadas.

65

RECOMENDACIONES

1. Fomentar el estudio y la investigación de las plantas medicinales de nuestra

región, elaborando un registro de las acciones terapéuticas que sirvan de

guía para el estudiante.

2. Realizar estudios de aislamiento de cada metabolito presente en el extracto

etanólico de hojas Prosopis pallida forma armata (Algarrobo), ello con la

finalidad de señalar que metabolito es responsable específico de la acción

antimicrobiana y antimicótica.

3. Realizar diversos tipos de método de extracción de principios activos con

hojas de Prosopis pallida (Algarrobo), a fin de evaluar el solvente y método

adecuado que permita evaluar la mayor presencia de principios activos

contenidos en las hojas de Prosopis pallida (Algarrobo).

4. Continuar con la línea de investigación para poder crear un nuevo

antibiótico y/o compuesto plantilla para el diseño de nuevos medicamentos

y antimicóticos.

5. Realizar estudios de toxicidad que pueda presentar el extracto etanólico de

Prosopis pallida (Algarrobo), ello con el propósito de realizar ensayos

clínicos que permitan usar en pacientes.

66

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72

ANEXOS

73

Anexo 1. Clasificación taxonómica de Prosopis pallida (Algarrobo)

74

Anexo 2. Recolección hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) en el Sector Belaunde del distrito de Quequeña – Arequipa.

Anexo 3. Trituración de Hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo), con posterior colocación en papel filtro.

75

Anexo 4. A. Cepa de Staphylococcus aureus ATCC 25923, B. Cepa de Escherichia coli ATCC 25922, C. Cepa de Cándida albicans ATCC 10231

Anexo 5. Obtención de Extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida (Algarrobo).

76

Anexo 6. Sembrado de cepas en placas petry, con depósito de disco de papel filtro de 5 mm de diámetro, impregnado con extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo).

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