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Sección de análisis de imagen-Servicio de apoyo a la investigación
Usar la estereologíacon garantías de que no morirás
en el intento (I)Introducción
Sección de análisis de imagen-Servicio de apoyo a la investigación
Porque la estereología es una herramienta muy útil para relacionar morfología y función:
¿Por qué usar técnicas estereológicas? (I)
Número de nefronas en un riñón
• Volumen de un núcleo cerebral y número de neuronas contenidas en el mismo
Superficie de intercambio gaseoso en pulmón
Longitud de las raíces de una planta
y un largo etcétera....
Sección de análisis de imagen-Servicio de apoyo a la investigación
¿Por qué usar técnicas estereológicas? (II)
Porque la estereología, por definición, evita hacer ciertas asunciones en los estudios morfológicos que nos podrían conducir a errores importantes.
Un caso real:
Al estimar el número de perfiles neuronales por unidad de área, se vio que este índice era mayor en los cerebros jóvenes que en los viejos. Conclusión: el número de neuronas disminuye con la edad.
Verdad verdadera:
En 1984, un estudio sobre la retracción del tejido cerebral demostró que los cerebros jóvenes se retraen más que los de individuos viejos.
Cuando esta diferencia se corrigió, se comprobó que la diferencia entre el número de neuronas entre individuos jóvenes y viejos es mínima.
Sección de análisis de imagen-Servicio de apoyo a la investigación
Otro ejemplo:
Tratamos a ratas recién nacidas con un fármaco para ver como afecta al desarrollo renal en sus etapas tempranas. Para estimar el número de nefronas formadas se cuenta el número de glomérulos. ¿Qué ocurre si estimamos el número de glomérulos por área de corteza renal?
¿Por qué usar técnicas estereológicas? (II)
Es posible que nuestra estimación de número/área nos señale un mayor número de nefronas por área de corteza renal en tratados que en controles...pero, ¿y si a expensas de una reducción del volumen total de la corteza, hubiera mas glomérulos concentrados en un área pero el número final fuera el mismo e incluso menor?
En este caso, la premisa errónea de la que partimos es que el volumen de referencia es el mismo, al igual que en el caso anterior.
SIEMPRE DEBEMOS CONOCER EL VOLUMEN DE REFERENCIA DE LA ESTRUCTURA QUE VAMOS A ESTUDIAR
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Densidad de volumenDensidad de superficieDensidad de longitudDensidad numérica
En estereología, los datos que obtenemos son de tipo ratio:
¿Por qué usar técnicas estereológicas? (II)
Sección de análisis de imagen-Servicio de apoyo a la investigación
Algunos ejemplos de ratios y volúmenes:
¿Por qué usar técnicas estereológicas? (II)
Ratio Número absoluto Significación funcional
Volumen de islotes pancreáticos por
volumen de páncreas
Volumen total de islotes pancreáticos de una
persona
Capacidad de producir insulina
Densidad de superficie de intercambio gaseoso por
unidad de volumen de parénquima pulmonar
Superficie total de intercambio gaseoso
Capacidad de intercambio gaseoso del individuo
Número de nefronas por unidad de volumen de
corteza renal
Número de nefronas en el riñón de un individuo
Capacidad de filtración renal
Unbiased Stereology. Three Dimensional Measurement in MicroscopyC.V. Howard and M.G. Reed. 1998
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¿Por qué usar técnicas estereológicas? (III)Porque nos ayuda a manejar el problema de que la fracción de muestreo aumente de forma no lineal con el aumento de la magnificación lineal
Magnificaciónlineal
Fracción aproximada de un objeto 2D en el
campo de observación
x1
1
x5 x25 x125 x625
1/47 1/1.200 1/30.000 1/730.000
Unbiased Stereology. Three Dimensional Measurement in MicroscopyC.V. Howard and M.G. Reed. 1998
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Variabilidad inter-individual (biológica) 70%Variabilidad entre bloques 20%Variabilidad entre secciones 5%Variabilidad entre campos 3%Variabilidad entre medidas 2%
Variabilidad total observada 100%
Esto quiere decir que una forma de incrementar la precisión es tomar más individuos o más bloques por individuo. No sería aconsejable obtener muchas secciones por bloque o medir muchos campos del mismo porta.Los métodos en estereología son muy eficientes y de hecho, la norma es contar o medir sólo 200 puntos o intersecciones por animal.
¿Por qué usar técnicas estereológicas? (III)
Pese a que nuestro primer impulso al ver el esquema anterior sería pensar en medir muchísimos campos, hemos de tener en cuenta como contribuyen a la variabilidad los diferentes pasos del trabajo del morfólogo.
Unbiased Stereology. Three Dimensional Measurement in MicroscopyC.V. Howard and M.G. Reed. 1998
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Pero...¡¿qué quieres decir con “sólo” 200 intersecciones por animal?!
La estereología implica el uso de plantillas, que dependiendo de su dimensión, nos ayudaran a estimar una magnitud u otra:
- Las plantillas de puntos estiman densidad de volumen- Las plantillas de líneas estiman densidad de superficie- Los planos estiman longitud- Los volúmenes estiman número
Las “intersecciones” son los puntos en los que nuestra estructura de interés “toca” nuestra plantilla. Un ejemplo...vamos a estimar la densidad de volumen de islotes pancreáticos respecto al total del páncreas de una rata.
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Páncreas patatiforme
_ = El volumen desalojado es el volumen de nuestro páncreas patatiforme (1 ml. Si, me lo he inventado)
Un paso muy sencillo, tras la recogida de muestras….
…estimar el volumen por el principio de Arquímedes
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70%
20%
5%
3%
Procesamos nuestro páncreas, recordando la variabilidad que aporta cada uno de los pasos.
Una vez tenemos los portas teñidos y montados, vamos al equipo de estereología de nuestra sección, el newCAST. Podemos ver nuestro porta de ejemplo en este enlace:
http://155.54.216.150/dih/webViewer.php?snapshotId=1316434882
Unbiased Stereology. Three Dimensional Measurement in MicroscopyC.V. Howard and M.G. Reed. 1998
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En newCAST podemos hacer un preescaneo de nuestra sección
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Y posteriormente, delimitar la región de interés donde vamos a llevar a cabo el muestreo
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Nosotros mismos definimos nuestro muestro (en este caso, un 2% aprox.)
Como podemos observar, no usamos un muestreo muy exhaustivo, sino de pocos campos (4, como se ve en el navegador)
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Podemos personalizar nuestras marcas
En cada uno de los campos, marcamos las veces que tocan los puntos el páncreas (P) y las veces que tocan las células de los islotes (I)
Con este botón avanzamos en las posiciones del muestreo
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Para hacer el proceso más eficiente, usamos dos plantillas de puntos. La azul, con mayor área asociada al punto, sirve para estimar páncreas en general; la amarilla, con área asociada al punto menor, la usamos para marcar los islotes pancreáticos
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Repetimos el proceso en todas las posiciones
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La aplicación nos devuelve una hoja de datos con todos los detalles del muestreo
% de ROI muestreada
Área asociada al punto
Puntos de cada plantilla que han tocado la estructura de interés, su sumatorio y por posiciones de muestreo Este proceso lo repetiríamos con
más secciones de otros bloques, aunque vamos a hacer nuestros cálculos con este ejemplo
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Área de páncreas: 123*9122=1122006 µm2
Área de islotes: 51*1282=65382 µm2
Densidad volumen islotes/páncreas=65382/1122006=0,06
SI EL VOLUMEN TOTAL DEL PÁNCREAS ES DE 1 ml, EL VOLUMEN TOTAL DE ISLOTES PANCREÁTICOS SERÁ DE 0,06 ml
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Bibliografía
• Unbiased Stereology. Three Dimensional Measurement in MicroscopyC.V. Howard and M.G. Reed. 1998
• 'If you assume, you can make an ass out of u and me': a decade of the disector for stereological counting of particles in 3D space. T.M. Mayhew and H. J. Gundersen. J. Anat. 1996; 188:1-15.
• How much is there really? Why stereology is essential in lung morphometry. E.R. Weibel, C.C. W. Hsia and M. Ochs. J Appl Physiol. 2007; 102:459-67.
• The Art of Counting . K.M. Madsen. J Am Soc Nephrol. 1999; 10:1124-1125
• Design-based stereology in neuroscience. C. Schmitz and P.R. Hof. Neuroscience. 2005; 130:813-831
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Y colorín colorado, esta presentación se ha terminado
Hasta la próxima…
(LA SECCIÓN DE ANÁLISIS DE IMAGEN PIDE PERDÓN AL PARTIDO ANTI-POWERPOINT)