Uso del Microscopio Óptico y Binocular Fuentes de …pesquerias.iim.csic.es/.../2013/11/microscopia_analisis_imagen1-1.pdf · MICROSCOPIA Y ANALISIS DE IMAGEN Gabinete de formación

MICROSCOPIA Y ANALISIS DE IMAGENGabinete de formación CSIC - 2007

Uso del Microscopio Óptico y Binocular

Fuentes de Luz y Filtros

Por primera vez la biología se ampliaba y extendía gracias a un mecanismo que llevaba el sentido de la vista humana más allá de sus límites naturales.

En las primeras décadas del siglo XVII se iniciaron experiencias con lentes a fin de lograr el mayor aumento posible. Para ello se basaron en otro instrumento con lentes que obtuvo gran éxito, el telescopio, usado por primera vez con fines astronómicos por Galileo, en 1609.

Existían dos tipos de microscopios: el sencillo y el compuesto; el sencillo no era más que una lente montada, el compuesto estaba formado por una combinación de lentes y fue inventado por ZachariasJansen en Holanda.

Microscopía ÓpticaHistoria

El primer avance técnico del microscopio luego de Jansen fue el paso de un sistema de 2 lentes a uno de 3, este sistema es la configuración estándar que se mantiene en los microscopios de hoy.


El naturalista holandés Jan Swammerdam (observó insectos con el microscopio), el botánico inglés Nehemiah Grew (estudió los órganos de reproducción de las Plantas) o el anatomista holandés Reigner de Graaf(folículos de Graaf).

Marcello Malpighi fue uno de los microscopistas más grandes de la historia (capilares).

Otro descubrimiento importante en la época fue el del científico inglés Robert Hooke, en 1665 publicó un libro llamado Micrographia.

Un comerciante holandés, Anton van Leeuwenhoekusaba lentes simples, logró aumentar un objeto hasta 270 veces sin perjuicio de la nitidez.

El microscopista danés Otto Muller (bacilos y espirilos).


Alrededor de 1820 Joseph Jackson Lister, un óptico inglés, diseñó un microscopio acromáticocapaz de eliminar la aberración cromática. El microscopio acromático constituyó un gran avance, iniciando una serie de perfeccionamientos que dieron como resultado el moderno microscopio óptico.

En 1930 el mundo submicroscópico se amplió con la aparición del microscopio electrónico (MET, MEB). La mayoría de los pioneros en la microscopía electrónica en biología siguen vivos y los más importantes son: Albert Claude, Don Fawcett, Earnest Fullam, Charles Leblond, JohnLuft, George Palade, Daniel Pease y Keith Porter.


Microscopía ÓpticaConceptos básicos

La magnificación del objetivo viene determinada por la proporción de las distancias entre el foco anterior (distancia del objetivo al objeto) y posterior(distancia focal), cuanto mayor sea la diferencia entre estas dos distancias mayor es el aumento. Históricamente la distancia del foco posterior era fija (160mm) y se jugaba con el foco anterior.

Los microscopios que disponen de “infinity-space” tienen la posibilidad de añadir diversos accesorios como prismas, polarizadores,…


La Resolución de un microscopio se define como la menor distancia entre dos puntos en una muestra que pueden ser diferenciados como objetos diferentes.La ecuación clásica que describe la relación entre la resolución, longitud de onda ( ) y Apertura Numérica (NA) es la de Rayleigh:

R=1.22*( /2*NA)



La apertura numérica (AN) hace referencia a la capacidad de recoger luz del punto focal. Este valor responde a la fórmula:

Numerical Aperture (NA) = n(sin μ)

donde n es el índice de refracción y m es el ángulo formado por el foco anterior. El índice de refracción podemos variarlo utilizando agua o aceites de inmersión que aumentan su valor (el límite de este valor lo determina el índice de refracción de la lente del objetivo ya que no se debe superar nunca sino se daría un proceso de reflexión total), de este modo se aumenta la apertura numérica. Existe un límite teórico para μ que es 90ºdonde sen μ es igual a 1.



N.A. = Numerical Aperture

0.201.400.211.300.221.25100x

0.290.950.320.850.370.7560x

0.290.950.370.750.420.6540x

0.370.750.550.500.690.4020x

0.610.450.920.301.100.2510x

1.3750.202.120.132.750.104x

Resolution(&microm)N.A.Resolution

(&microm)N.A.Resolution(&microm)N.A.Magnification

Plan ApochromatPlan FluoritePlan Achromat


La Profundidad de campo viene determinada por la distancia desde el punto más cercano en foco al punto más alejado simultáneamente en foco.

80.00.190.95100x

29.80.400.8560x

12.81.00.6540x

3.85.80.4020x

0.808.50.2510x

0.1355.50.104x

Image Depth(mm)

Depth of Field(μm)Numerical ApertureMagnification


El diámetro del campo de visión en el ocular viene expresado como “FieldNumber” (FN,mm) y se calcula con la siguiente fórmula:

Field Size = Field Number (FN) ÷ Objective Magnification (Mo)


La apertura numérica del objetivo define el rango de magnificación útil para una combinación objetivo/ocular dada. El mínimo se sitúa en unas 500 veces el valor de NA y el máximo en unas 1000 x NA

Useful Magnification (total) = 500 to 1000 x NA (Objective)

---------xx100x (1.42)

------xxx60x (0.95)

---xxxx40x (0.70)

xxxxx20x (0.55)

xxxx---10x (0.35)

xxx------4x (0.12)

xx---------2.5x (0.08)

25x20x15x12.5x10x(NA)

EyepiecesObjective

Si se excede el límite del rango de magnificación útil la imagen sufre el fenómeno “empty magnification”, se produce una magnificación de la imagen sin el correspondiente aumento en el detalle de resolución.


Aberraciones ópticassurgen de la interacción de la luz con las lentes.

Geométricas: curvatura del campo y astigmatismo. Para eliminar la curvatura del campo se utilizan objetivos plan. Esta aberración es más importante en microfotografía y es más severa a bajas magnificaciones como pueden ser los estereomicroscopios.

Cromática: surge de las variaciones de los índices de refracción del amplio rango de frecuencias que se encuentra en la luz visible. Cada longitud de onda es refractada acorde con su frecuencia. Existe también la aberración cromática lateral que se suele compensar con oculares correctores (K, C or >Compens).

Esférica: relacionada con la naturaleza esférica de la lente. Cuando las ondas de luz pasan por a través de la periferia de la lente son refractadas en mayor grado que aquellas que pasan por el centro generando diferentes puntos focales a lo largo del eje óptico.



Geometricas: curvatura del campo y astigmatismo. Para eliminar la curvatura del campo se utilizan objetivos plan. Esta aberración es más importante en microfotografía y es más severa a bajas magnificaciones como pueden ser los estereomicroscopios.

















Esférica: relacionada con la naturaleza esférica de la lente. Cuando las ondas de luz pasan por a través de la periferia de la lente son refractadas en mayor grando que aquellas que pasan por el centro generando diferfentes puntos focales a lo largo del eje óptico.




Esférica: relacionada con la naturaleza esférica de la lente. Cuando las ondas de luz pasan por a través de la periferia de la lente son refractadas en mayor grando que aquellas que pasan por el centro generando diferfentes puntos focales a lo largo del eje óptico.


Microscopía ÓpticaMicroscopio - componentes

Human Eye, Photographic Emulsion, Photomultiplier, Photodiode Array, Video CameraDetector

Magnification, Aberrations, Field Size, Eye PointEyepiece

Compensator, Analyzer, Nomarski Prism, Objective Iris, Phase Plate, SSEE Filter, Modulator Plate, Light Transmission, Wavelength Selection, Fluorescence Barrier FilterImage Filter

Magnification, Numerical Aperture, Focal Length, Immersion Media, Aberrations, Light Transmission, OpticalTransfer Function, Working DistanceObjective

Slide Thickness, Cover Glass Thickness, Immersion Media, Absorption, Transmission, Diffraction, Fluorescence, Retardation, BirefringenceSpecimen

Numerical Aperture, Focal Length, Aberrations, Light Transmission, Immersion Media, Working DistanceCondenser

Condenser Iris, Darkfield Stop, Aperture Mask, Phase Annulus, Polarizer, Off-Center Slit Aperture, NomarskiPrism, Fluorescence Excitation Filter

LightConditioner

Light Source, Collector Lens, Field Diaphragm, Heat Filters, Light Balancing Filters, Diffuser, Neutral DensityFiltersIlluminator

AttributesMicroscopeComponent

Human Eye, Photographic Emulsion, Photomultiplier, Photodiode Array, Video CameraDetector

Magnification, Aberrations, Field Size, Eye PointEyepiece

Compensator, Analyzer, Nomarski Prism, Objective Iris, Phase Plate, SSEE Filter, Modulator Plate, Light Transmission, Wavelength Selection, Fluorescence Barrier FilterImage Filter

Magnification, Numerical Aperture, Focal Length, Immersion Media, Aberrations, Light Transmission, OpticalTransfer Function, Working DistanceObjective

Slide Thickness, Cover Glass Thickness, Immersion Media, Absorption, Transmission, Diffraction, Fluorescence, Retardation, BirefringenceSpecimen

Numerical Aperture, Focal Length, Aberrations, Light Transmission, Immersion Media, Working DistanceCondenser

Condenser Iris, Darkfield Stop, Aperture Mask, Phase Annulus, Polarizer, Off-Center Slit Aperture, NomarskiPrism, Fluorescence Excitation Filter

LightConditioner

Light Source, Collector Lens, Field Diaphragm, Heat Filters, Light Balancing Filters, Diffuser, Neutral DensityFiltersIlluminator

AttributesMicroscopeComponent



Objetivos

Achromat: corrige aberración cromática y esférica para dos longitudes de onda, trabaja bien con flitros verdes.Fluorite (semi-apochromats): mayor rango de corrección en el espectro visible. Permite mayores aperturas numéricas y resultando en imágenes más luminosas. Conseguimos mejores imágenes en color con luz blanca.Apochromatic: eliminan las aberraciones cromáticas en los tres colores (RGB), y corrigen las esféricas en 2 colores. Tienen aperturas numéricas superiores a los anteriores. Es la mejor elección para foto micrografía.Plan: incluye corrección para la curvatura del campo. Estas lentes se pueden utilizar en cualquiera de los objetivos anteriores.

Yes4-5 Colors3-4 ColorsPlan Apochromat

Yes2-4 Colors3-4 ColorsPlan Fluorite

No2-3 Colors2-3 ColorsFluorite

Yes2 Colors1 ColorPlan Achromat

No2 Colors1 ColorAchromat

FieldCurvature

ChromaticAberration

SphericalAberration

ObjectiveType


Objetivos

Achromat: corrige aberración cromática y esférica para dos longitudes de onda, trabaja bien con flitros verdes.Fluorite (semi-apochromats): mayor rango de corrección en el espectro visible. Permite mayores aperturas numéricas y resultando en imágenes más luminosas. Conseguimos mejores imágenes en color con luz blanca.Apochromatic: eliminan las aberraciones cromáticas en los tres colores (RGB), y corrigen las esféricas en 2 colores. Tienen aperturas numéricas superiores a los anteriores. Es la mejor elección para foto micrografía.Plan: incluye corrección para la curvatura del campo. Estas lentes se pueden utilizar en cualquiera de los objetivos anteriores.






FieldCurvature

ChromaticAberration

SphericalAberration

ObjectiveType

Parafocalidad (mismo punto focal entre objetivos de diferentes aumentos, igual que entre ocular y cámara) y Paracentricidad (el centro de la imagen coincide entre objetivos).






FieldCurvature

ChromaticAberration

SphericalAberration

ObjectiveType



Oculares: los oculares actuales están totalmente corregidos y no presentan ningún código de color. Es recomendable utilizar el ocular recomendado por el fabricante del objetivo. “High-eyepoint” (H) oculares son muy frecuentes y se recomienda para aquellos usuarios que llevan gafas.


Condensador: para una microfotografía óptima es importante una correcta posición del cono de iluminación y foco en el espécimen. La apertura numérica del condensador debe ser igual o un poco inferior a la apertura numérico del objetivo de mayor magnificación del microscopio. Es importante el grosor del porta, se recomienda el uso de portas de 1+0.05mm.

Microscopía ÓpticaMicroscopio - técnicas

Procedimiento KÖEHLERcorrecta iluminación (uniforme), crítica en microfotografía

1. Enfoque con el objetivo de menor aumento. 2. Centraje de la lámpara (en muchos microscopios ya viene centrada).3. Enfoque del condensador, para conseguir que el plano de iluminación se

conjugue con el plano focal. Para ello se cierra el diafragma de campo oscureciendo la imagen. Después movemos el enfoque del condensador (subir/bajar) hasta que se vea el diafragma de campo nítidamente y después lo centramos y abrimos el diafragma de campo.

4. Centraje AN del condensador. Ahora hay que jugar con la apertura numérica del condensador utilizando el diafragma iris, aproximadamente la imagen del diafragma iris debe ocupar el 80% del campo visual del ocular. Esto último de puede hacer utilizando un telescopio de centraje, a través del ocular o a ojo cerrando el diafragma incrementando el contraste justo antes de que se oscurezca el fondo de la imagen. Este centraje es diferente para cada objetivo.

Microscopía ÓpticaMicroscopio – fuentes de luz

Fuentes de Luz

•Lámparas incandescentes

•Lámparas arco voltaico

•Láser

•Flash Electrónico


Lámparas incandescentes

Las bombillas de tungsteno-halógenas incandescentes son las más comunes en microscopía.Trabaja a 12 voltios y produce alrededor de100 vatios de iluminación.


Tungsten-halogen lamps operate at very high temperatures and may cause serious burn injuries if handled while hot. When replacing these lamps, always allow them to cool for at least 20 minutes before removing them from thelamphouse. Avoid handing the bulb envelope directly because fingerprints left on the envelope will become burnedinto the glass, often initiating premature lamp failure. Manufacturers package tungsten-halogen lamps in protectiveplastic bags to avoid handling problems. Use a pair of scissors to cut the bag near the tungsten pins and insert thelamp into its holder while it still remains in the bag. Remove the bag when the lamp is properly positioned in thelamphouse.

CAUTION!


Lámparas arco voltaico

No son usadas en microscopia óptica de forma habitual; excepto en fluorescencia

Mercury and Xenon arc lamps require caution duringoperation because of the danger of explosion due tovery high internal gas pressures and extreme heatgenerated during use. Never ignite a lamp outside ofits housing or observe the lamp directly when it isburning (this can cause serious eye damage). Neither mercury nor xenon lamps should be handledwith bare fingers in order to avoid inadvertentetching of the quartz envelope. Change bulbs onlyafter the lamp has had sufficient time to cool. Store lamps in their shipping containers to avoidaccidents.

CAUTION!


Láser

Muy útiles en fluorescencia, confocal, campo claro monocromático.

Emisión en una única longitud de onda.

Flash Electrónico

Es un método especializado para la microfotografía de especimenes en movimiento, principalmente en campo oscuro. Este sistema está acompañado de un sistema de iluminación bombillas de tungsteno-halógenas incandescentes para enfocar la muestra previamente al flash.

Microscopía ÓpticaMicroscopio – filtros

Filtros

disponemos de tres clases de filtros

•Neutros

En la marca Nikon vienen con la marcación ND y el valor de transmitanciacorrespondiente que indica cuanto luz deja pasar (1/2, 1/6, …). En otras marcas como Zeiss utilizan la terminología OD (Densidad Óptica).

•Correctores de color

NCB (Neutral Colector Blue), es equivalente al UV de las cámaras fotográficas. Varía el espectro de la luz haciéndola más azulada. Para hacer fotografías siempre debe estar puesto. GIF (Green Interferential Filter), ya no se usa.

•Difusor (D)

Homogeneiza la luz de la lámpara en el campo visual.

Técnicas Especializadas en Microscopía (Contrast Enhancing Techniques )

•Campo Oscuro

•Iluminación Rheinberg

•Contraste de Fases

•Luz Polarizada

•Hoffman Modulation Contrast

•DIC (Differential Interferente Contrast, Nomarski)

• Fluorescencia

Microscopía Óptica en Campo Claro


Campo OscuroBloquea los rayos centrales de luz dejando pasar los oblicuos que se proyectan sobre la muestra y se refractan sobre el objetivo mientras que la aquellos rayos que no inciden sobre la muestras se pierden obteniendo un fondo oscuro y una muestra iluminada. Dispone de condensadores que forman una iluminación sagital que en cuanto cualquier fotón incida en una partícula de la muestra serádesviado y captado por el objetivo. El poder de resolución del objetivo es el mismo en campo claro que en oscuro. El “spider stop” funciona bien con condesadores Abbe.


Campo OscuroBloquea los rayos centrales de luz dejando pasar los oblicuos que se proyectan sobre la muestra y se refractan sobre el objetivo mientras que la aquellos rayos que no inciden sobre la muestras se pierden obteniendo un fondo oscuro y una muestra iluminada. Dispone de condensadores que forman una iluminación sagital que en cuanto cualquier fotón incida en una partícula de la muestra serádesviado y captado por el objetivo. El poder de resolución del objetivo es el mismo en campo claro que en oscuro. El “spider stop” funciona bien con condesadores Abbe.



Iluminación Rheinberg

Utiliza un “stop” (similar a campo oscuro) transparente pero coloreado para darle color al fondo de la imagen.


Contraste de FasesEn muestras no teñidas la luz es difractada cuando pasa por el tejido retrasando la luz aproximadamente ¼ la longitud de onda comparada con la luz no desviada, es decir, que la luz difractada por el espécimen llega 1/4 longitud de onda “fuera de fase”. Podemos encontrar negativo o contraste claro (imagen clara con fondo oscuro) cuando se acelera el paso de la luz no desviada, o positivo o contraste oscuro (imagen oscura y fondo claro) cuando se igualan las velacidades de la difractadas y no difractadas.



Luz Polarizada

Los critales anisotropicos tienen ejes cristalograficamente diferentes que actúan con la luz de forma dependiente de la orientación del entramado cristalino respecto de la luz incidente.


Hoffman Modulation Contrast

Diseñado para incrementar la visibilidad y contraste en muestras sin teñir y vivas detectando gradientes ópticos y convirtiéndolos en variaciones de intensidad de luz.


DIC (Differential Interferente Contrast, Nomarski)

Utiliza un polarizador de la misma manera que luz polarizada pero precisa de un prisma (Wollaston) que separa el rayo de luz polariza en dos rayos que viajan en diferente dirección.

DIC (Differential Interferente Contrast, Nomarski)

Utiliza un polarizador de la misma manera que luz polarizada pero precisa de un prisma (Wollaston) que separa el rayo de luz polariza en dos rayos que viajan en diferente dirección.



Fluorescencia

Hay fluorescencia primaria o autofluorescencia y fluorescencia secundaria (fluorocromo). Solo la luz de emisión alcanza los ojos del observador, con un fondo oscuro donde las áreas fluorescentes brillan con suficiente contraste para ser detectadas. Los filtros de emisión impiden el paso de la luz reflejada dejando pasar solo la luz emitida por la sustancia fluorescente. Es el único modo de microscopía en el cual el espécimen emite su propia luz, tras la respectiva excitación.



En fluorescencia para iniciar a trabajar debemos tener todos los diafragmas abiertos (campo e iris), obturador abierto (utilizado para bloquear la iluminación y no quemar la muestra), filtros abiertos y luz encendida. El diafragma de campo se puede utilizar para delimitar la zona iluminada y no quemar el resto. Con el diafragma iris podemos aumentar un poco el contraste. Los filtros neutros se pueden utilizar para reducir la intensidad y no quemar la muestra, ya que de este modo pierden autofluorescencia.

Microscopía ÓpticaMicroscopio – macroscopio

•Distancia de trabajo

•Apertura Numérica

•Profundidad de campo

•3D (Visión estereoscópica)

•Iluminación (condensador)

Diferencias Microscopio/Macroscopio

MICROSCOPIA Y ANALISIS DE IMAGENGabinete de formación CSIC - 2007

Documents

Uso del Microscopio Óptico y Binocular Fuentes de …pesquerias.iim.csic.es/.../2013/11/microscopia_analisis_imagen1-1.pdf · MICROSCOPIA Y ANALISIS DE IMAGEN Gabinete de formación