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DETALLA LOS USOS QUE SE LE PUEDE DAR AL SUERO LACTEO
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Biotratamientos Biotratamientos no destructivos no destructivos para la revalorización de suero para la revalorización de suero
lácteo lácteo
TTBBRR
BIOTEC´2004
Laca, A., Moure, F. , García, L.A. y Díaz, M.
Tecnología de Bioprocesos y Reactores
(www.uniovi.es/TBR)Dpto. de Ing. Química y Tecnol. Medio Ambiente
UNIVERSIDAD DE OVIEDO
El suero lácteo El suero lácteo
TTBBRR
El suero lácteo es el subproducto que proviene de la separación de la cuajada de la leche durante la fabricación de quesoPrecipitación enzimática
Suero ácido Suero dulce Pre
cipita
ción á
cida
El suero lácteo El suero lácteo
TTBBRR
Composición SUERO DULCE SUERO ÁCIDOAgua 93-94 94-95 Proteínas 0.8-1.0 0.8-1.0 Lactosa 4.5-5.0 3.8-4.2 Minerales 0.5-0.7 0.7-0.8 Ácido láctico y otros 0.1-0.5 0.1-0.8 pH 6.0-7.0 4.0-5.0
SUERO DULCEβ-Lactoglobulina 3.0 g/L α-Lactoalbúmina 0.7 g/L Inmunoglobulinas 0.6 g/L Seroalbúmina bovina 0.3 g/L
(% en peso)
El suero lácteo El suero lácteo
TTBBRR
1 kgde queso
Ener
o Fe
brer
o M
arzo
A
bril
May
o Ju
nio
Julio
A
gost
oSe
ptie
mbr
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ctub
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ovie
mbr
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mbr
e
0.0
10.0
20.0
30.0
40.0
50.0
60.0
Suer
o lá
cteo
(103 t/
mes
)
1999
1998
≈ 9 Kg de Suero↑ DBO5 (30000-60000 mg/L)
≈≈ 450 000 t/a450 000 t/aññoo
Producción de suero lácteo en AsturiasProducción de suero lácteo en Asturias
BiotratamientosBiotratamientos del suero lácteo del suero lácteo
TTBBRR
RecuperaciónTratamiento
de aguasSuero
(Suero en polvo, concentrados de proteínas, lactosa...)
BIOTRATAMIENTOSBIOTRATAMIENTOS
(Obtención de productos valiosos por fermentación).
Industria Láctea
BiotratamientosBiotratamientos de suero lácteode suero lácteo
TTBBRR
El suero lácteo es un buen sustrato que posee un El suero lácteo es un buen sustrato que posee un pH pH adecuado y adecuado y los nutrientes necesarios para el desarrollo microbiano los nutrientes necesarios para el desarrollo microbiano
Hidrólisis lactosaHidrólisis lactosa
SueroSuero
FERMENTACIÓNFERMENTACIÓN
ProductosProductos
UFUF ProteínasProteínas
PermeadoPermeado
Fuentes de carbono: lactosa y/o proteFuentes de carbono: lactosa y/o proteíínasnasLa lactosa es un azLa lactosa es un azúúcar complejo que no todos los car complejo que no todos los microorganismos son capaces de utilizar microorganismos son capaces de utilizar
BiotratamientosBiotratamientos de suero lácteode suero lácteo
TTBBRR
Tratamientos no destructivosTratamientos no destructivos::Alcoholes y cetonas: etanol, glicerol, butanol, acetona...Ácidos orgánicos: acético, butírico, láctico, cítrico.....
Tratamientos destructivosTratamientos destructivos:: Aerobio / Anaerobio (biogas)
Aminoácidos: ácido glutámico, lisina, triptófano...Vitaminas: cianocobalamina, riboflavina...Enzimas: amilasas, glucoamilasas, proteasas, lipasas...BiomasaFermentos lácticosOtros: grasas y aceites, polisacáridos, antibióticos...
BiotratamientosBiotratamientos de suero lácteode suero lácteo
TTBBRR
TTecnologíaecnología de de BBioprocesosioprocesos y y RReactores:eactores:
Bebida alcohólicaBebida alcohólica
VinagreVinagre
Ácido lácticoÁcido láctico
ProteasasProteasas
1. Bebida alcohólica1. Bebida alcohólica
TTBBRR
Mediante una fermentación alcohólica la lactosa del suero se puede transformar en etanol
11 Hidrólisis de la lactosaHidrólisis de la lactosa
Lactosa Glucosa GalactosaLactasa
GalactosaIsomerasa
Glucosa
A escala industrial la fermentación alcohólica se realiza casi exclusivamente empleando levaduras
1. Bebida alcohólica1. Bebida alcohólica
TTBBRR
22 La glucosa entra en la ruta de La glucosa entra en la ruta de EmbdenEmbden--MeyerhofMeyerhof
Una posibilidad atractiva es la elaboración de una bebida alcohólica a partir del suero lácteo
CH2OH
C HO
C OHH
C HHO
C OHH
C OHH
Glucosa
Piruvato
CH3
C
C
O
O-O
4
4 H+ 4 CO2
4 ADP +2 Pi 4 ATP 4 NAD+ 4 NADH + 4H+
4 H2O
4 NAD+ 4 NADH + H+
Acetaldehído
CH3
C HO
4
Acetaldehído
CH3
C HO
4
Etanol
CH3
C OHO
4
2
CH2OH
C HO
C OHH
C HHO
C OHH
C OHH
Glucosa
Piruvato
CH3
C
C
O
O-O
4
4 H+ 4 CO2
4 ADP +2 Pi 4 ATP 4 NAD+ 4 NADH + 4H+
4 H2O
4 NAD+ 4 NADH + H+
Acetaldehído
CH3
C HO
4
Acetaldehído
CH3
C HO
4
Etanol
CH3
C OHO
4
2
CH2
OH
1. Bebida alcohólica1. Bebida alcohólica
TTBBRR
Tipo de sustratos(suero / suero + suplementos)
Cultivos de alta producción en continuo
Metabolismo secundario
Valoración global
Temas claveTemas clave: :
1. Bebida alcohólica1. Bebida alcohólica
TTBBRR
OperaciónOperación: : • Kluyveromyces fragilis: .
– Metaboliza lactosa sin producir toxinas– Ha sido autorizado su uso en alimentos
• Medio de cultivo: Permeado de UF• Fermentaciones
– Discontinuo– Continuo
• Métodos analíticos– Lactosa: HPLC– Etanol y otros volátiles: GC
Componentes % p/v
Lactosa 4.5
Proteínas totales 0.45
Materia grasa Trazas
Extracto Seco Total 5.5-6
• Temperatura: 30-34ºC.• Inóculo: 10 %.• Variaciones del pH inicial entre 3.4 y 6.7 no afectan al sistema• La agitación incrementa la producción de etanol respecto a la falta de agitación.
1. Bebida alcohólica1. Bebida alcohólica
TTBBRR
Con
cent
raci
ón d
e et
anol
, g/l
0
5
10
15
20
0 12 24 360
5
10
15
20
Tiempo, h0 12 24 36
18 ºC 21 ºC
34 ºC 37 ºC
Con
cent
raci
ón d
e et
anol
, g/l
0
5
10
15
20
0 12 24 360
5
10
15
20
Tiempo, h0 12 24 36
18 ºC 21 ºC
34 ºC 37 ºC
Cultivo discontinuoCultivo discontinuo: Metabolismo primario: Metabolismo primario
Tiempo, h0 6 12 18 24 30
Peso
sec
o, g
/l
0
1
2
3
4
5
5% 10% 15% 20%
Tiempo, h0 6 12 18 24 30
Pes
o se
co, g
/l
0
1
2
3
4
5
6
725 g/l etanol
21 g/l etanol
11 g/l etanol
Tiempo, h0 6 12 18 24 30
Pes
o se
co, g
/l
0
1
2
3
4
5
6
725 g/l etanol
21 g/l etanol
11 g/l etanolSin agitación 100 rpm200 rpm
TemperaturaTemperatura InóculoInóculo
AgitaciónAgitación
• A mayor temperatura menor concentración final de alcoholes secundarios
• La agitación incrementa la formación de alcoholes secundarios
• Los niveles alcanzados de alcoholes secundarios son del mismo orden de magnitud que los registrados en otras bebidas alcohólicas de baja graduación
1. Bebida alcohólica1. Bebida alcohólica
TTBBRR
Cultivo discontinuoCultivo discontinuo: Metabolismo secundario: Metabolismo secundario
050
100150200250
Agitación, rpm0 20 40 60 80 100120140160180200220
Alc
ohol
es s
ecun
dario
s, m
g/l
0
20
40
60
80
100
120
Total
2-metil-1-propanol 2-metil-1-butanol 3-metil-1-butanol 1-propanol
AgitaciónAgitación
0
10
20
30
0 12 24 36 48Tiempo, h
1-pr
opan
ol, m
g/l
TemperaturaTemperatura
37 ºC34 ºC21 ºC18 ºC
1-propanol, 2-metil-1-propanol2-metil-1-butanol, 3-metil-1-butanol
1. Bebida alcohólica1. Bebida alcohólica
TTBBRR
Cultivo continuoCultivo continuo
0
5
10
15
20
25
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3Velocidad de dilución, h-1
Eta
nol,
g/l
0
1
2
3
4
5
Prod
uctiv
idad
, g/lh
Etan
ol, g
/l
Productividad etanolProductividad biomasa x 10
02468
1012
Velocidad de dilución, h-1
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 0.18 0.200.00.51.01.52.02.53.03.54.0
2-metil-1-propanol 2-metil-1-butanol 3-metil-1-butanol 1-propanol
Acetaldehido Acetato de etilo D, h-1
mg/l YP’/X, x 103 mg/l YP’/X, x 103
0.05 38 10.2 8 2.2 0.09 31 10.3 5 1.6 0.11 29 11.2 4 1.5 0.15 24 13.4 3 1.6
• El proceso es viable
• Productividad máxima etanol, biomasa y alcoholes secundarios: D = 0.11 h-1 ( 15 g/l. etanol)
• Los valores de acetaldehído y acetato de etilo son inferiores a otros registrados en la bibliografía en otras bebidas alcohólicas de baja graduación
Velocidad de dilución, h-1Pr
oduc
tivid
ad,
mg/
L h
EtanolEtanol
Alcoholes secundariosAlcoholes secundarios
Prod
uctiv
idad
, g/L
h
Para producir ácido acético con fines alimentarios se realizan dos fermentaciones sucesivas:
2. Vinagre2. Vinagre
TTBBRR
El ácido acético es el principal componente del vinagre, empleado en aderezos y como conservante de alimentos
1.1. AZÚCAR AZÚCAR →→ ETANOLETANOL
En la UE la producción está entre 4.5 y 5 millones de hL, de los cuales 1/3 es de vino
2.2. ETANOL ETANOL →→ ÁÁCIDO ACCIDO ACÉÉTICOTICO
Se plantea la posibilidad de obtener vinagre a partir de suero lácteo
2. Vinagre2. Vinagre
TTBBRR
Método de producción de acético válido para su uso en alimentación
Selección de una bacteria ácido acética
Características del producto
Valoración global
Temas claveTemas clave: :
2. Vinagre2. Vinagre
TTBBRR
OperaciónOperación: : • Medio de cultivo: 78 g/L de suero lácteo en polvo + 100 g/L de lactosa• Fermentación alcohólica: Kluyveromyces fragilis
• Fermentacion ácido acética:– Bacteria ácido acética aislada de vinagre de sidra e identificada
como Acetobacter pasterianus– Condiciones de cultivo: Fuertemente aeróbicas: matraces
Erlenmeyer de 250 ml conteniendo 33 ml de medio; 250 rpm; 30ºC• Métodos analíticos
– Etanol y otros volátiles: GC
Eliminación de las Eliminación de las levaduras por filtraciónlevaduras por filtración
2. Vinagre2. Vinagre
TTBBRR
Tiempo, h0 12 24 36 48 60 72 84 96 108
Con
cent
raci
ones
de
etan
ol y
acé
tico,
%v/
v
0
1
2
3
4
5
6
EtanolEtanol
Ácido acéticoÁcido acético Acetato de etilo
13 mg/L
2-metil-1-propanol
34 mg/L
2-metil-1-butanol
9 mg/L
3-metil-1-butanol
41 mg/L
Concentración de volátiles
• La bacteria aislada realiza perfectamente la fermentación acética en la bebida alcohólica producida por fermentación del suero lácteo (84% eficiencia)
• El vinagre obtenido, apto para consumo humano, tiene un contenido de 5.3 grados acéticos (concentración comercial 5-6 grados acéticos)
• El proceso empleado cumple los requerimientos de la FAO
*Acetaldehído no detectado
3. Ácido láctico3. Ácido láctico
TTBBRR
Aplicaciones industriales: en el sector alimentario como estabilizador (aguas minerales, zumos, cerveza, vinos, industria láctea...)
(suero lácteo / permeado de UF)
Ácido láctico grado alimentario: pureza 80%, color, olor, textura
Lactosa
OH O
OH
OH
CH2OHOH
OH
CH2OH
OHO
O
O
bacterias ácido lácticasÁcido láctico
CH3
H
COOH
C OH
3. Ácido láctico3. Ácido láctico
TTBBRREvolución de la concentración de ácido láctico obtenido por fermentación de suero lácteo
t (h)t (h)
Ácido
lác
tico
(g/
l)Ácido
lác
tico
(g/
l)
L. plantarum
L. helvéticus
L. casei
Condiciones de FermentaciónT = 37-42ºCpH inicial = 5-7Anaerobio/microaerófilo
• Suero lácteo(7% de suerodeshidratado)
• pH inicial = 6• T = 37ºC
3. Ácido láctico3. Ácido láctico
TTBBRR
Desalinización del fermentado de Desalinización del fermentado de lactosuero lactosuero por IIpor II•• El ácido láctico con calidad El ácido láctico con calidad alimentaria alimentaria requiere desalinización requiere desalinización •• Se realizaron ensayos con resinas Se realizaron ensayos con resinas catiónicascatiónicas y aniónicasy aniónicas
Resultados obtenidos con la resina catiónicaEliminación prácticamente total de cationes (Eliminación prácticamente total de cationes (NaNa++, Ca, Ca2+2+ y Ky K++))
Capacidad útil = 1.67 Capacidad útil = 1.67 eqeq/L /L (0.4 m(0.4 m33 de resina por cada mde resina por cada m33 de suero)de suero)
Mejor regeneración con Mejor regeneración con HCl HCl que con Hque con H22SOSO4 4 (0.69 L de (0.69 L de HCl HCl 2M por cada L de suero)2M por cada L de suero)
Pérdida de láctico Pérdida de láctico << 0.1%0.1%
Resina aniónica: Buena eliminación de aniones (Cl- y SO42–) y
pérdidas de láctico<< 0.5%0.5%
4. 4. ProteasasProteasas
TTBBRR
Las proteasas son enzimas que catalizan la ruptura de los enlaces peptídicos de las proteínas
Cuentan con una gran aplicabilidad a nivel industrial constituyendo aproximadamente el 60% del total de enzimas comercializadas (detergentes, alimentación, tratamiento de pieles, industria farmacética...),
La bacteria Serratia marcescens es una gran productora de proteasas cuando se cultiva en medios proteicos como es el lactosuero
4. 4. ProteasasProteasas
TTBBRR
Cultivos de alta producción
Tipo de sustratos(suero / suero + suplementos)
Posibilidad de trabajar en continuo
Grado de eliminación de la carga contaminante
Valoración global
Temas claveTemas clave: :
4. 4. ProteasasProteasas
TTBBRR
• Medio de cultivo: lactosuero dulce fresco• Serratia marcescens:
– Baja capacidad para degradar lactosa– Las proteínas del suero constituyen su fundamental fuente de C y N
• Fermentaciones– Discontinuo – Continuo
• Métodos analíticos– Biomasa: peso seco celular / recuento en placa– Actividad enzimática: método de la azocaseína– Proteína: Lowry /Bradford– Lactosa: Método del ácido dinitrosalicílico
OperaciónOperación: :
tiempo (h)
0 5 10 15 20 25 30
Bio
mas
a,Pr
oteí
nas
(g/l)
0
1
2
3
4
Prot
easa
(UE/
ml)
0
2000
4000
6000
8000
10000a) 5%
tiempo (h)
0 5 10 15 20 25 30
Bio
mas
a,Pr
oteí
na (g
/l)
0
1
2
3
4
Prot
easa
(UE/
ml)
0
2000
4000
6000
8000
10000b) 10%
tiempo (h)
0 5 10 15 20 25 30
Bio
mas
a,Pr
oteí
nas
(g/l)
0
1
2
3
4
Prot
easa
(UE/
ml)
0
2000
4000
6000
8000
10000
tiempo (h)
0 5 10 15 20 25 30
Bio
mas
a, P
rote
ína
(g/l)
0
1
2
3
4
Prot
easa
(UE/
ml)
0
2000
4000
6000
8000
10000c) 30% d) 50%
Condiciones óptimas para máxima producción: 30ºC; Condiciones óptimas para máxima producción: 30ºC; pH pH 7.6; OD 30% 7.6; OD 30%
4. 4. ProteasasProteasas
TTBBRR
Optimización de parámetrosOptimización de parámetrosOxígeno disueltoOxígeno disuelto
Temperatura: 26-37ºC.pH: 7-8Concentración inicial de proteínas: 4-8 g/LOxígeno disuelto: 5-50%
Parámetros ensayados:Parámetros ensayados:
proteasaproteasabiomasabiomasaproteproteíínana
Prot
ease
(EU
/mL)
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
Bio
mas
s/Pr
otei
ns (g
/l)
0
1
2
3
4
5
6
7
time (h)
0 5 10 15 20 25 30 35
Bio
mas
s/Pr
otei
ns (g
/l)
0
1
2
3
4
5
6
7
Prot
ease
(EU
/mL)
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
Bio
mas
s/Pr
otei
ns (g
/L)
0
1
2
3
4
5
6
7
Prot
ease
(EU
/mL)
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000a) Microfiltration
b) Pasteurisation
c) Tindalisation
Bio
ma s
a /P r
o teí
nas (
g /L )
4. 4. ProteasasProteasas
TTBBRR
Optimización del Optimización del pretratamientopretratamientoMicrofiltración Microfiltración (33 (33 µµm)m)
Pasteurización Pasteurización (75ºC, 60 (75ºC, 60 minmin))
Bio
ma s
a /P r
o teí
nas (
g /L )
P rot
eas a
s (U
E /m
L)P r
otea
s as (
UE /
mL)
P rot
eas a
s (U
E /m
L)
Doble pasteurización Doble pasteurización (a las 12 h)(a las 12 h)
Bio
ma s
a /P r
o teí
nas (
g /L )
Tiempo (h)
Los niveles más altos de actividad enzimática se alcanzaron empleando suero pasteurizado o doblemente pasteurizadoSe seleccionó como más adecuada la doble pasteurización porque consigue una mayor reducción en la carga microbiana
Prot
eas a
s (U
E /m
L)
*Se realizaron experimentos en continuo probando laviabilidad del proceso
time (h)
0 10 20 30 40 50
Bio
mas
s/Pr
otei
n (g
/l)
0
2
4
6
8
10
12
Pro
teas
e (E
U/m
l)
02000400060008000100001200014000
Bio
ma s
a /P r
o teí
nas (
g /L )
P rot
eas a
s (U
E /m
L)
Tiempo (h)
Condiciones óptimas + Doble pasteurización Condiciones óptimas + Doble pasteurización
4. 4. ProteasasProteasas
TTBBRR
Fermentaciones con células inmovilizadas en Fermentaciones con células inmovilizadas en alginatoalginato•• Se ha empleado el sistema Se ha empleado el sistema S. S. marcescensmarcescens--suero lácteo como suero lácteo como
modelo para realizar un análisis del comportamiento de modelo para realizar un análisis del comportamiento de sistemas con células inmovilizadas sistemas con células inmovilizadas
t = 0 ht = 0 h t = 7 ht = 7 h t = 25 ht = 25 h
Crecimiento de S. marcescens en zonas próximas a la superficie del soporte
Microscopía ópticaMicroscopía óptica
4. 4. ProteasasProteasas
TTBBRR
Fermentaciones con células inmovilizadas en Fermentaciones con células inmovilizadas en alginatoalginato
MOMO
Crecimiento preferencial en la superficie debido a limitaciones difusionalesEscape celular por rotura de los soportes
TEMTEM
SEMSEM
4. 4. ProteasasProteasas
TTBBRR
Fermentaciones con células inmovilizadas en Fermentaciones con células inmovilizadas en alginatoalginato
0
0.2
0.4
0.6
0.8
0.91
0.93
0.95
0.97
0.99
OU
TSID
E
0
190
20406080
100120140
160
BIO
MA
SS (m
g/m
l)
t (h)
Experimental Results
Bio
mas
a (g
/l)
0
1925
7 13
Resultados experimentales
exteriort (h)
r/Rr/R
0
0.2
0.4
0.6
0.8
0.91
0.93
0.95
0.97
0.99
UTS
IDE
0
190
20406080
100120140
160
BIO
MA
SS (m
g/m
l)t (h)
Theoretical Results
Bio
mas
a (g
/l)
Resultados teóricos
0
1925
7 13 t (h)exteriorr/Rr/R
∂∂
∂∂
∂∂
Ct
r 1r r
r DCr
ii 2
2i
i= ′+⎛⎝⎜
⎞⎠⎟
d Cd t
3R
(1 )D
Cr
bi L
Li
i
r R
= −−
=
εε
∂∂
Modelo homogéneoModelo homogéneo
Dentro del soporte:
En el reactor: + ri´´
4. 4. ProteasasProteasas
TTBBRR
Módulo deMódulo de ThieleThiele para el para el sustrato y la biomasa:sustrato y la biomasa:
φs2
2s
s s
R3
rD C
=⎛⎝⎜
⎞⎠⎟
< − >< >
φx2
2x
x x
R3
rD C
=⎛⎝⎜
⎞⎠⎟
< >< >
4. 4. ProteasasProteasas
TTBBRR
Cultivos combinadosCultivos combinadosEl principal responsable de la alta DQO del suero es su alto contenido en lactosa
S. marcescens presenta escasa capacidad para degradar la lactosa
↑↑ DQO DQO en el caldo final
Opción:Opción:S. S. marcescensmarcescens
++K. K. fragilisfragilis
Prot
eína
(g/l)
01234567
Lact
osa
(g/l)
01020304050607080
Prot
eína
s (g
/l)
01234567
Lact
osa
(g/l)
01020304050607080
tiempo (h)
0 10 20 30 40 50 60 70
Prot
eína
s (g
/l)
01234567
Lact
osa
(g/l)
01020304050607080
S.marcescens
K.fragilis
S.marcescens - K.fragilis
4. 4. ProteasasProteasas
TTBBRR
Bio
mas
a (g
/l)
01234567
Prot
easa
s (U
E/m
l)
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
Bio
mas
a (g
/l)
01234567
Prot
easa
s (U
E/m
l)
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
tiempo (h)
0 10 20 30 40 50 60 70
Bio
mas
a (g
/l)
01234567
Prot
easa
(UE/
ml)
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000c)S.marcescens -K.fragilis
b) K.fragilis
a) S. marcescens
Cultivos combinadosCultivos combinados• La presencia
de la levadura no afecta a la producción enzimática
• La mayor reducción en la DQO se consiguió empleando cultivos combinados (76% de eliminación)
S. S. marcescensmarcescens
K. K. fragilisfragilis
S. S. marcescensmarcescens + K. + K. fragilisfragilis
S. S. marcescensmarcescens
K. K. fragilisfragilis
S. S. marcescensmarcescens + K. + K. fragilisfragilis
Los biotratamientos no destructivos presentan un atractivo indudable frente a los destructivos existiendo distintas propuestas y posibilidades disponibles en la bibliografía
Consideraciones finalesConsideraciones finales
TTBBRR
El esfuerzo por desarrollar técnicas de aprovechamiento vs. técnicas destructivas ejerce un efecto positivo y pedagógico en la sociedad (abre camino hacia la sostenibilidad)
Resulta clave la búsqueda de nuevos productos y mercados para materias primas residuales disponibles en altas cantidades (evitar saturaciones de mercado)
Los nuevos procesos y en particular en el caso alimentario, compiten en un mercado económico complejo, cambiante y de mucha competencia
wwwwww..unioviuniovi.es/TBR.es/TBR