Utilidad de las pruebas diagnósticas moleculares en la infección por HPV

Lic. Legarreta Gonzalo

Laboratorio BIONET – La Plata

Historia natural de la Infección por HPVHistoria natural de la Infección por HPV• La infección por Papilomavirus Humano (HPV) es la e nfermedad de trasmisión sexual mas común entre hombres y mujere s

• Se estima que el 70% de las mujeres sexualmente ac tivas, pueden adquirir la infección viral a lo largo de su vida

• Virus del Papiloma Humano (VPH) es responsable del 99 % del cáncer de cuello uterinocuello uterino

•Sin embargo, sólo un bajo% de las infecciones por HPV c ausan cáncer cervical

• Primeras etapas del cáncer de cuello uterino se puede tratar fácilmente (99,7% de éxito)

• La resolución de la infección confiere inmunidad. Una infección posterior por el mismo genotipo debe atribuirse a una reactiv ación de una infección latente

Historia natural de la Infección por HPVHistoria natural de la Infección por HPV•El virus del HPV no puede ser cultivado in Vitro.

•Los genotipos de HPV 16 y 18 suponen más del 70% de los casos de cáncer cervical

• La probabilidad de que un HSIL regrese a LSIL es 3 veces mayor de que suceda lo contrario.

• La carcinogénesis precisa de una infección persiste nte

EL PAPILOMAVIRUS

• Virus de ADN de doble cadena, sin envoltura

• Genoma de entre 7200-8000 pb

• Mas de 100 tipos, >80 completamente secuenciados

• Tipos se basan en su secuencia de ADN:• Tipos se basan en su secuencia de ADN:

> 10% de variación genética = nuevo tipo

2-10% de variación genética = subtipo

< 2% de variación genética = variante

• Los números de los tipos fueron asignados según

fueron siendo descubiertos y no en base a su

relación filogenética

Filogenia

31

1635

4518

39

116

33VP Humanos (mucosa genital)

Beta HPV

Chan et al., J Virology, 69:3074-83 (1995)

VP Animales

VP Humanos (cutaneos)

Alfa HPV

CLASIFICACIÓN EPIDEMIOLÓGICA DE LOS TIPOS DE VIRUS PAPILLOMA HUMANO

GRUPO GENOTIPOS HPV

ALTO RIESGO ESTABLECIDO 16-18-31-33-35-39-45-51-52-

56-58-59

PROBABLE ALTO RIESGO 26-53-66-68-73-82

BAJO RIESGO ESTABLECIDO 6-11-13-40-42-43-44-54-61-70-

72-81-CP6108 (89)

Muñoz N, Castellsague X, de Gonzalez AB, Gissmann L. Chapter 1: HPV in the etiology of human cancer. Vaccine 24(Suppl. 3), S1‐S10 (2006).

EL VIRUS: ORGANIZACIÓN GENÓMICA

• Consta de varios genes u “Open ReadingFrames” (ORF) de dos tipos diferentes:

• Hasta 8 genes de expresión temprana o“early” (E1-E8) cuya expresión se traduce en

proteínas para la regulación y replicación viral

• 2 genes de expresión tardía o “late” (L1, L2)• 2 genes de expresión tardía o “late” (L1, L2)

que generan las proteínas para la unión de la

cápside

• Una región URR ó LCR que controla la

expresión de los genes tempranos E6 y E7

VARIABILIDAD GENÉTICA Y DETECCIÓN

• Los genes de expresión tardía “Late” presentan

secuencias muy semejantes entre los diferentes tipos

de VPH.

- gen L1 principal diana “consenso” de detección.

• Los genes de expresión temprana “Early” presentan

secuencias muy variables por lo que se han utilizado

para la detección específica del tipo.

- genes E6 y E7.

HPV HPV PrevalenciaPrevalencia e e incidenciaincidencia Cancer Cervical Cancer Cervical porpor EdadEdad

HP

V P

reva

lenc

ia (

%)

HPV (HC2)HPV (HC2)

CancerCancer15

20

25

30

15

20

25

30

inci

denc

ia d

e C

ance

r po

r 10

0,00

0

15-19

20-24

25-29

30-34

35-39

40-44

45-49

50-54

55-59

60-65

Edad (Años)

HP

V P

reva

lenc

ia (

%)

CancerCancer

1. Sellors JW, et al. CMAJ, 2000;163:503. Ries , et al. 2000 SEER Cancer Stats NCI, 1973-1997. Sellors JW, et al. CMA J, 2002;167:871.

0

5

10

0

5

10

inci

denc

ia d

e C

ance

r po

r 10

0,00

0

Infección productiva HPVInfección productiva HPV

¿Cómo se transforma una ¿Cómo se transforma una infección HPVinfección HPV en un en un carcinoma? Integración del ADN viral en el ADN carcinoma? Integración del ADN viral en el ADN

huéspedhuésped

LCRE7

E6

E1L1

+

–ADN episomal del VPH

Adaptado de 1. Phelps y Alexander. Ann Intern Med. 1995;123:368–382. 2. Syrjänen y Syrjänen. Papilloma virus infections in human pathology. Wiley & Sons, Chiche ster; 2000. págs.11–46.

L2

E2

E4E5

Punto de rotura e integración

+

LCR E7E6 E1L1L2E2 E4 E5

ADN del VPH integradoAND huéspedADN huésped

E2

La integración aumenta el riesgo de cáncerLa integración aumenta el riesgo de cáncer -- II

Episoma

Efecto

• Expresión del gen E6 controlada por E2

Forma del VPH en la célula

PA

p53E6

Después de laintegración

Asociación de E6 con p53 y PA

• La expresión de E6 deja de estar controlada

• Bloqueo de la actividad de p53 (degradación)

• Resistencia a la apoptosis

• Aumento de la inestabilidad cromosómica

Syrjänen y Syrjänen. Papillomavirus infections in h uman pathology. Wiley & Sons, Chichester; 2000. pág s.11–46.

Episoma

Forma del VPH en la célula Efecto

• Expresión del gen E7 controlada por E2

La integración aumenta el riesgo de cáncerLa integración aumenta el riesgo de cáncer -- IIII

E2F

pRBE7

Después de laintegración

Libre

• La expresión de E7 deja de estar controlada

• Generación de múltiples cromosomas

• Inmortalización celular

• Oncogénesis

+

Syrjänen y Syrjänen. Papillomavirus infections in h uman pathology. Wiley & Sons, Chichester; 2000. pág s.11–46.

Métodos de detección de HPVÁCIDOS NUCLEICOS

Sonda directa:

-Southern BlotSIN PRESERVACION TISULAR MORFOLOGICA

-Son especificos pero poco sensibles

-Hibridación in situ-CON PRESERVACION TISULAR MORFOLOGICA-CON PRESERVACION TISULAR MORFOLOGICA

Inform ®HPV (Ventana): Sistema automático de hibridación in situ, preservando morfología. Distingue ADN integrado y episomal.

• Hibridación ADN/ARN.• Cóctel de sondas:

- Alto riesgo: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68.

- Bajo riesgo: 6, 11, 42, 43 y 44.• Sensibilidad adecuada a procesos

Detección del HPV mediante amplificación de la señal.

Tecnología de captura de híbrido (HC2)

Detección del HPV mediante amplificación de la señal.

Tecnología de captura de híbrido (HC2)

• Sensibilidad adecuada a procesos de cribado de VPH (1 pg/mL)(120.000 particulas de virus)

• Aprobado por la FDA.• Posibilidad de semicuantificar.• Estandarizada y automatizable.• Detecta de forma cruzada otros

genotipos.

(Poljak et al. J Clin Virol 2002; 25: S89-97.)

• LIMITACIONES:

Detección del HPV mediante amplificación de la señal.

Tecnología de captura de híbrido (HC2)

Detección del HPV mediante amplificación de la señal.

Tecnología de captura de híbrido (HC2)

• LIMITACIONES:• Prueba dependiente del estado de conservación del D NA viral• La semicuantificación de la Carga Viral solo indic a el nº de copias• No distingue los diferentes tipos virales• No detecta infecciones múltiples• Se dan reacciones cruzadas entre las sondas de alto riesgo y

ciertos tipos virales de bajo riesgo

MMétodo de captura de híbrido étodo de captura de híbrido (HC2)(HC2)

MMétodo de captura de híbrido étodo de captura de híbrido (HC2)(HC2)

• DESNATURALIZACIÓN

• HIBRIDACIÓN CON SONDAS ARN DE ALTO Y BAJO RIESGO

• CAPTURA DEL HÍBRIDO ADN/ARN MEDIANTE ANTICUERPOS ANTI-ADN/ARN

• FIJACIÓN AL HÍBRIDO DE ANTICUERPOS ANTI-ADN/ARN MARCADOS CON FOSFATASA ALCALINA

• DETECCIÓN DE LA ENZIMA FIJADA MEDIANTE SUSTRATO QUIMIOLUMINISCENTE

• Es la técnica molecular más sensible y flexible.• Puede ser utilizada para la detección, la cuantific ación, la secuenciación y el

análisis mutacional.• La cuantificación del producto resulta compleja (estándares internos).• Exige del laboratorio y del personal una normas y u nas condiciones

especiales.

E6 E2 E5 L1

Detección del HPV por PCRDetección del HPV por PCR

E6E7 E1

E2 E5

E4L2

1 2 3 4 5 6 7 7,9 kb

CGTCCMARRGGAWACTGATC

GCMCAGGGWCATAAYAATGG

primers450 bpMY09/11 PGMY

GP5+/6+ 150 bp

65 bpSPF10165 bpAMPLICOR ROCHE®

GPMY09/11

Baja sensibilidad, laborioso, y el SB no puede utilizar tejido con ADN degradado.

SB es el estándar y el FISH permite ver el HPV asociado con la lesión histológica.

Sonda directa

InconvenientesVentajasMétodo

Características de las técnicas de detección de ácidos nucleícos

Características de las técnicas de detección de ácidos nucleícos

Pendiente de estandarizar.Tecnologías patentadas.Requieren experienciay dotación costosadel laboratorio.

Tecnología flexible(carga viral y genotipo).Sensibilidad muy alta.Análisis múltiple.

Amplificación de la diana

Tecnologías patentadas y costes elevados.Genotipado en grupos.

Comercializaday estandarizada.Semicuantitativa.

Señal amplificada

• El genotipado es importante en tres situaciones:- El potencial oncogénico y el riesgo de progresión a CIN III difieren de forma importante según el genotipo.- Es necesario monitorizar la

VPH-16VPH-18

Genotipado del VPV ¿aporta información útil?

Genotipado del VPV ¿aporta información útil?

- Es necesario monitorizar la eficacia de las vacunas multivalentes.- Estudios epidemiológicos.

• La incidencia acumulativa de CIN III enpacientes seguidas durante diez años einfectadas con HPV-16 y 18 es muy superior(17,2 y 13,6) a la de las infectadas por otrostipos oncogénicos (3%) o sin detección deVPH (0,8%). Estos datos se refuerzan enmujeres con más de 30 años.

(Schiffman et al. Virology 2005; 337: 76-84. Khan et al. JNCI 2005; 97: 1072-9.

Castle et al. J Clin Microbiol 2006; 44: 3915-7)

Estrategia para el genotipado del VPHEstrategia para el genotipado del VPH

PCR

Primers consenso

GP5+/6+ PGMY SPF10 MY09/11

Hibridación reversaRFLP SecuenciaciónArray

PCR en tiempo real

MY09/11

primers específicos

INNO-LiPA HPV Genotyping Extra (Innogenetics)• Amplifica pequeños fragmentos de 65 bp en la región L1

(primers SPF). Controles internos• Detecta 28 tipos de HPV e infecciones múltiples.

Linear Array HPV Genotyping Test (Roche Diagnostics )

Hibridación reversaHibridación reversa

Linear Array HPV Genotyping Test (Roche Diagnostics )• Amplifica la región L1 con mezclas de primers

(PGMY09/PGMY11) y el gen de la β globina humana, ambos biotinilados.

• El producto amplificado se hibrida con sondas de 37 tipos de HPV fijadas a una membrana de nitrocelulosa.

(Kleter et al. J Clin Microbiol 1999; 37: 2508-17.Gravitt et al. J Clin Microbiol 1998; 36: 3020-7.

Kornegay et al . J Clin Microbiol 2003; 41: 1080-6.Van Hamont et al. J Clin Microbiol 2006; 44: 3122-9.)

• Método que permite combinar la

sensibilidad de la PCR con el

poder discriminatorio de las

RFLP RFLP ((patrpatrón de restricción con ón de restricción con endonucleasasendonucleasas))

RFLP RFLP ((patrpatrón de restricción con ón de restricción con endonucleasasendonucleasas))

endonucleasas de restricción.

• Es un sistema poco laborioso

y menos costoso que LIPA

y secuenciación.

• Resulta difícil detectar infecciones

mixtas.Bernard et al. J Infect Dis 1994; 170: 1077-85.

Wang et al. J Med Virol 1999; 59: 536-40. Kay et al. J Virol Meth 2002; 105: 159-70.

• CLART® HPV2 (Genomica) (Biomerieux)• 35 tipos de HPV• Tras una PCR de la región L1, que marca el

producto amplificado, se hibrida con oligonucleótidos dispuestos en microarray .

• Se generan sondas a cada tipo de VPH y se fijan a los pocillos de reacción.

HibridaciHibridación con ón con microarraysmicroarraysHibridaciHibridación con ón con microarraysmicroarrays

fijan a los pocillos de reacción.• Se amplifica la muestra con primers

genéricos marcando con Cy5 el producto amplificado.

• Hibridación y lectura con software especiales.

Ensayos de Real-time PCR HPV

• GenoID assay

• Identifica 14 tipos alto riesgo y 5 bajo riesgo (dos canales)

• Desarrollado para tres diferentes plataformas de real-time:

Roche LightCycler 2,

Applied Biosystems 7900 HT,

Corbett Rotor-Gene 6600

- +

SENSIBILIDAD

Hibridaciónin situ

HC II PCRreal time

PCRin situSouthern blot

PCR

Sonda directa

Señal amplificada

Amplificación de la diana

Propuesta de nuevo algoritmo de cribado Propuesta de nuevo algoritmo de cribado

Mujeres de 25-64 añosHPV Test

NormalControl cada 5 años

CITOLOGÍA

NegativoPositivo

Normal o Borderline5 años

HPV test y Citología cada

6-12 meses

Colposcopía

Normal Control cada 5 años

Cito NegHPV Neg

Colposcopía

=/> LeveBorderline

Cito =/>Leve

HPV y Citologíacada 6-12 meses

HPV+ y Cito NegHPV – y Cito

Borderline

EUROGIN November 2008

Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR)Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR)Captura Híbrida 2 (HCII, Captura Híbrida 2 (HCII, DigeneDigene))

Test HPV Test HPV -- ADNADN

• Valor predictivo negativo– Si test VPH positivo , NO significa que desarrollará cáncer, la

mayoría de mujeres que están infectadas no lo desarrollan– Si test VPH negativo, es muy difícil que se desarrolle el cáncer– Si test VPH negativo, es muy difícil que se desarrolle el cáncer

• El verdadero valor del test está en muestras negativas (Cribado 3 a 5años)

• Sólo detectan infecciones muy prevalentes , de las cuales 70% delas infecciones desaparecen en 1 año, y un 91% en dos años (sinningún tipo de tratamiento)

• Sólo las infecciones persistentes tienen riesgo de desarrollarlesiones precancerosas de alto grado y cáncer ( aprox. 10% demujeres con el virus.)

Por tanto, estos test presentan limitaciones que la s tecnología basada en la determinación de ARNm virales pretende resolver

Test de detección de Test de detección de ARNmARNm

Detección específica de expresión oncogénica E6/E7

Métodos de amplificación de isotérmicosMétodos de amplificación de isotérmicos

NASBA® Real-Time technologiesPreTec HPV-Proofer (Norchip – Biomerieux)- 5 genotipos HR -HPV (16-18-31-33-45)- 5 genotipos HR -HPV (16-18-31-33-45)-Discrimina genotipo

APTIMA GenProbe: 14 Genotipos HR -HPV(16-18-31-33-35-39-45-51-52-56-58-59-66-68)-No Discrimina genotipo

• Amplificación de diana ARN (NASBA)• Utiliza sondas específicas ( molecular beacons )• Determina 5 genotipos: 16, 18, 31, 33 y 45•

DetecciDetección de ón de ARNmARNm de E6/E7 del HPV: de E6/E7 del HPV: NuclisensNuclisens EasyEasy HPV HPV -- BiomerieuxBiomerieuxDetecciDetección de ón de ARNmARNm de E6/E7 del HPV: de E6/E7 del HPV: NuclisensNuclisens EasyEasy HPV HPV -- BiomerieuxBiomerieux

Molden et al., J Virol Meth, 2007,142,204.

Andersson et al., Int J Oncol, 2006,29,705

• La expresión de E6 y E7puede medirse por susniveles de ARNm

• Es un marcador indirecto

DetecciDetección de ón de ARNmARNm de E6/E7 del VPHde E6/E7 del VPHDetecciDetección de ón de ARNmARNm de E6/E7 del VPHde E6/E7 del VPH

• Es un marcador indirectode integración vírica.

• Tiene mayor valorpredictivo positivo queotras técnicas molecularesen lesiones de bajo grado.

(Lie et al. Gynecol Oncol 2005; 97: 908-15.)

• En un estudio con un seguimiento de 2 años, la detección del mRNA deE6/E7 produjo una reducción de 2,5 veces en el número de falsospositivos para lesiones CIN2+, en comparación con las pruebas de ADN.

• Esto conlleva una reducción significativa del número de biopsiasinnecesarias.

• La valoración de E6/E7 mRNA se puede realizar en mujeres de todas lasedades para la detección de lesiones precancerosas

Test de detección de ARNm

• En una evaluación de análisis de rutina (n=491 ASCUS/LSIL), el valorpredictivo positivo (VPP) de la detección de E6/E7 (con PreTect®HPVProofer, NorChip) para la detección de lesiones precancerosas(CIN2+) fue del 50%, incluso en mujeres menores de 30 años.

• De acuerdo con este estudio, una de cada dos mujeres con mRNA deE6/E7 positivo (mayores o menores de 30 años) tienen lesionesprecancerosas subyacentes.

Adaptado de Molden et al. Int J of Cancer: 2005; 114, 973-97610

www.e6e7.com.ar

Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR)

Captura Híbrida 2 (HCII, Digene/Qiagen)

Test VPH Test VPH -- ADN ADN

Significación diagnósticaSignificación diagnóstica

HPV negativoLa mujer no se encuentra

infectada por VPH.

Es muy difícil que se desarrollen lesiones severas o

cáncer

Alto Valor predictivo negativo (VPN)

(cribado 3 a 5 años)

HPV positivoLa mujer esta infectada por

VPH

NO significa que desarrollará cáncer, la mayoría de mujeres

que están infectadas no lo desarrollan

Bajo Valor predictivo positivo (VPP)

Un 90% de las infecciones se aclaran en 2 años

Test HPV Test HPV -- ARNmARNm

Significación diagnósticaSignificación diagnóstica

HPV ARNm E6/E7

Pruebanegativa

No hay expresión de oncoproteínas

Aunque el virus este presente no hay actividad oncogénica

Alto Valor predictivo negativo(VPN)

Pruebapositiva

Presencia de oncoproteínas en el exocervix.

Existe actividad celular anormal, integración viral y

alta probabilidad de progresión.

Alto Valor predictivo positivo(VPP)

Alta correlación con progresión

MUCHAS GRACIASMUCHAS GRACIAS

http://www.bio-net.com.ar