UTILIDAD DE LOS MÉTODOS MOLECULARES EN … · EN BACTERIOLOGÍA APLICADA Y SU IMPACTO CLÍNICO ... El diagnóstico de EVR puede darse dentro de las primeras 12 hs con alta sensibilidad

Dra Daniela CentrónLaboratorio de Investigaciones de Mecanismos de Resistencia a Antibióticos

Departamento de Microbiología, Parasitología e Inmunología,

Facultad de Medicina,

Universidad de Buenos Aires.

UTILIDAD DE LOS MÉTODOS MOLECULARES

EN BACTERIOLOGÍA APLICADA Y SU IMPACTO CLÍNICO

EN NUESTRO PAÍS

“1/3 de las infecciones nosocomiales son evitables”

PREVENCIÓN

(Gastmeier P, 2008)

Patógenos frecuentemente reportados

• Staphylococcus aureus• Pseudomonas aeruginosa• Acinetobacter baumannii• Klebsiella pneumoniae• Serratia marcescens• Enterococcus spp.

PREVENCIÓN

Confirmación molecular de bajos niveles de R

Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina (SAMR)Diagnóstico rápido

Enterococcus resistente a la vancomicina (EVR)

Identificación de resistencias ligadas

Plásmidos, transposones e integrones

Identificación de mecanismos epidémicos

Emergencia de brotes por agentes etiológicos inusuales

ANÁLISIS DE BROTES

Complejo Burkholderia cepacia (BCC)

A. baumannii en un centro hospitalario

Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina (SAMR)

Evolución de la resistencia a meticilina en Argentina

Porc

enta

je d

e ba

cter

ias

resist

ente

s

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1975 1980 1985 1990 1995 2000 2002 20082004 2006

1975 a 2008

Transducción

ADNdel fagoCromosoma

bacteriano

Lisis

Bacterialisogénica

Potencial de transmisión

Transferencia in vivo de mecA

1º Aislamiento de SAMS de hemocultivos de neonato.2º Portación nasal de SAMR y cepas de S. epidermidis MR

SAMS y SAMR diferían en 1 banda (40Kb) mecA+

ADN mec S. epidermidis idem SAMR

(Wielders CLC y col. Lancet 2001)

09_Transduction.wmv

Adquisición del gen

Prevenir emergencia de cepas de S. aureus con bajos niveles de R a oxacilina

mecA

Resistencia a TODOS los β-lactámicos

El gen mecA se localiza en el cassettecromosómico SCCmec

SCCmecA

Hay 6 tipos:

I, II, III, IV, V, VI(difieren en tamaño, nº de IS, nº de Tn, determinantes de R, etc)

(Kondo Y et al, 2007)

Prevalencia de los clones mayores de SAMR

Pulsotipo A: clon cordobésPulsotipo B: clon sudamericanoPulsotipo C: clon pediátrico

prev

alen

cia

(%)

(Solá C et al., 2006)

Dinámica de los clones circulantes de SAMR en Argentina

0%

0%

0%

0%

0%

Clon Brasilero

Clon Cordobés

1998 2002

CLON BRASILERO

CLON CORDOBÉS 2004-2008??

HETERORRESISTENCIA??HOMORRESISTENCIA

(Corso A, 1998, 2004; Gardella N, 2005; Jeric P, 2006; Sola C, 2002, 2006, 2008; Tokumoto M, 2007)

Difusión con discos

a OXA y FOX

Identificar bajos niveles de R a oxacilina en cepas de S. aureus

Informar falsa sensibilidad provoca falla de tratamiento

Informar falsa resistencia provoca alto costo y uso de glicopéptidos

(Corso A, 2004)

Asociación y factores de riesgo (CA(CA--MRSA)MRSA)

Reporte de la “clona uruguaya” de SAMR-CA en Uruguay

2003: Brote en centros carcelarios masculinos: >1000infectados, con másde 12 casos mortales .

Caracterización del brote:

CLON PREDOMINANTE: Mayoría PVL +, SCC IV.

Fenotipo sensible a: TMS, Cipro, Rifa, Genta, Vanco

ALTA VIRULENCIA

(Galiana EID, 2003)

Identificación del SCCmec por multiplex PCR

I II III IVa IVb IVc IVd IVe IVg IVh V VI

(Milheirico C, 2007)

Identificar bajos niveles de R a oxacilina en cepas de S. aureus

Multiplex-PCR

SCCmecIdentificación de clones

SCCmec tipo IV Clon pediátricoH4, H5, H6, H7, H8 (Tokumoto M, 2007)

La vigilancia epidemiológica de los

SCCmec permite PREVENIR en la

identificación de bajos niveles

de R a oxacilina en cepas de S. aureus

y la dispersión de clones

ALTAMENTE virulentos

Enterococcus resistente a la vancomicina (EVR)

Generalidades

• Patógeno oportunista

• Endocarditis e ITU

• Infecciones nosocomiales

• E. faecalis/E. faecium

• Multirresistencia

Importancia de la resistencia

• Brotes intrahospitalarios

• Dificultad en su detección por el laboratorio

• Problemas de tratamiento

• Posibilidad de extenderse a otros gram +

Enterococcus spp. multiresistente es declarado patógeno emergente por el CDC 1990

1993

2002

PREVENCIÓN

EVR aislado en

pacientes de

la comunidad

Primer aislamiento de Staphylococcus aureusresistente a la vancomicina portador del determinante

de resistencia de los EVR

EVR

• Fenotipos:EL ALFABETO VAN

VAN A VAN B VAN C VAN EVAN D VAN G VAN F

VAN A VAN B

•Argentina:Se reportan más casos de Enterococcus faecium VanA

(Casellas JM, 1997; Corso A, 2001; Courvalin, 2006; Lopardo HA, 2000; Lopreto C, 2002; Marín, E, 1998; Podestá OS, 1997; Targa L, 1997)

Pacientes infectados con EVR multirresistente

son MUY difíciles de tratar

MÉTODOS FENOTÍPICOS

Limitados para detectar bajos niveles de resistencia a los glicopéptidos

Llevan de 3 a 5 días

LA VIGILANCIA ACTIVA DE COLONIZACION CON EVR

EN AREAS DE RIESGO ES COSTO-EFECTIVA

Pacientes colonizados por EVR

AISLAMIENTO

DIAGNÓSTICO BASADO EN LA PCR

Disminuye días de aislamiento de pacientes “sospechosos” de ser portadores de EVR

Considerado como el método “gold standard” por algunos autores

(Chen Y, 1998; Coombs G, 1999, Peterson RL, 2002; Roger M, 1999)

Diagnóstico rápido de EVR

Incubación Óptima

Extracción del ADN total Mediante Sistema A o B

Hisopado rectal o

Materia Fecal

Mínimo 4 hsn=110 muestras

H1, H2 y H3


EXTRACCIÓN DEL ADN TOTAL

Sistema BSistema AAjuste de DO (2 x 109 celulas) 1mL cultivo

Lisis

Tratamiento con RNasas

Eliminación de proteínas

Transferencia de ADN

Precipitación

Resuspensión

Buffer de Lisis

Tratamiento con Proteinasa K y agregado de buffer del Kit

Precipitación ADN

Pasajes por columna de purificación

Lavados con soluciones comerciales

Elución (soluciones comerciales)

Soluciones del kit

comercial

Duración: 1:40

Soluciones del kit

comercial Duración: 1:30

1hs con solución del kit1hs con H2O destiladaH2O destilada sin incubación


m1m1 MMCC--CMCMm7m7m6m6m5m5m4m4m3m3m2m2

m1m1 MMCC--m7m7 CVCVm6m6m5m5m4m4m3m3m2m2

1000

1000

600

600

300

300

1045

1045

330450

A B

Muestra M 94% 100%

Muestra P 59% 100%

M+P 83% 100%

Tiempo 8hs 12hs

Medio opt. BEA-v/BHI BEA-v/BHI

El diagnóstico de EVR puede darse dentro de las primeras 12 hs con

alta sensibilidad y especificidad.


PORTACIÓN DE EVR POSITIVO

SE PROSIGUE CON EL AISLAMIENTO DEL PACIENTE

PORTACIÓN DE EVR NEGATIVO

SE PASA AL PACIENTE A LA SALA COMÚN

EL DIAGNOSTICO RAPIDO

PERMITE TOMAR MEDIDAS DE CONTROL DE INFECCIONES

PRECOCES Y CERTERAS

Plásmidos, transposones e integrones

Transferencia Horizontal de genes, THG

ADN desnudo

Plásmidos

Bacteriófagos

Transposones

Integrones

Secuencias de inserción

Los actores

Identificación molecular de resistencias ligadas

RESISTENCIAS LIGADAS

QUE SE CO-SELECCIONAN

BAJO PRESIÓN ANTIBIÓTICA

Integrones

IntegrasaCassette de Resistencia

Integrones y Resistencia a carbapenemes

blaVIM-2 aacA7 aadA1

blaVIM-2 aac(6´)-Ib aadA1

blaVIM-2

aac(6´)-Ib blaVIM-2

aacA7 blaVIM-2 dfrA aacCA5

Administración de un aminoglucósido

selecciona cepas Ra carbapenemes

(Yum et al, JAC 2002, Lolans, K 2005)

Transposones

Resistencia a gentamicina

IR tnpA IR aac(3)-IIa IR tnpA IR

IS140 IS140

Integrones y Transposones localizados plásmidos R

PLÁSMIDOS R

Integrones y Transposones localizados en islas genómicas

Acinetobacter baumannii

Integrones y Transposones localizados en islas genómicas

Isla genómica SGI1 movilizable en el cromosoma de Salmonella spp..

(Levings RS, J Bact, 2005)

Pili sexual

TRANSFERENCIA HORIZONTAL DE GENES

VideoConjugacion.wmv

Las BLEE son mucho más frecuentes en Latinoamérica que en otros continentes

Porcentaje de K.pneumoniae productoras de BLEE (1998-2007)

Latinoamérica 45Pacífico Oeste 25Europa 23USA 8Canadá 5

(Arduino SM et al., AAC, 2002, 2003; Di Conza J, et al., 2002; Orman B et al., AAC, 2002)

ISCR1 blaCTX-M-2 orf3aac(6´)-Ib blaOXA-2 orfD

attI1

5CS 3CS CR1 VR2 3CSVR1

intI1 qacE∆1 sul1 orf5

aac(6´)-Ib aac(6´)-Ib blaOXA-2 orfD

1982-1989

2008

Enterobacterias

Selección con Antibióticos

Selección con Antibióticos

Proteína de

Membr

Canal de Porina

Cerrado

Pared Celular

Espacio Periplásmico

Membrana Celular

Proteína de Unión a Penicilina

blaCTX-M-2

Peptidoglicano

Proteína de

Transp

Lipopolisacárido

Canal de

PorinaCerrad

oLipoproteína

β-Lactámico

β-Lactámico

Resistencia al ertapenempor mecanismos combinados

de presenciade blaCTX-M-2 e impermeabilidad

(Lartigue MF, 2007)

Pseudomonas aeruginosa EMERGENCIA DE CARBAPENEMSAS

aac(6´)-Ib blaOXA-2

1982-2004

aac(6´)-Ib orfX qacH

Selección con IMIPENEM

blaVIM-2

blaVIM-2aac(6´)-Ib blaOXA-2

blaVIM-2 aac(6´)-Ib orfX qacH

2004-2006

Identificación molecular de resistencias ligadas

CADA ESPECIE BACTERIANA TIENE RESISTENCIASA ANTIBIÓTICOS LIGADAS CARACTERÍSTICAS

A SU VEZ, ÉSTAS VARÍAN EN CADA REGIÓN GEOGRÁFICA Y A LO LARGO DEL TIEMPO


A. baumanni aislado de brotes de H9

ClonIClonIClonIV

ClonIV

1993 1998 2001 2003n=12 n=8 n=23 n=11

ClonIVClonI ClonIV ClonI

ALODEMIA

blaOXA-231993 1998 2001 2003

(Baquero F, 2002)


Identificación de mecanismos de resistencia

con comportamiento epidémico.



B. cepacia (I)

B. multivorans (II)

B. cenocepacia (III)

B stabilis (IV)

B vietnamiensis (V)

B cepacia genomovar (VI)

B. ambifaria (VII)

B. anthina (VIII)

B. pyrrocinia (IX)

B.vanimarisB. mana


IDENTIFICACIÓN DE CERTEZA POR BIOLOGÍA MOLECULAR

METODOLOGÍA USADA HASTA 2006

Gen RecA

Reacción de amplificación

Tratamiento con enzimas de restricción

Corrida en gel de Agarosa y visualización recA-RFLP

METODOLOGÍA RECOMENDADA DESDE 2007Metodología: PCR de recA (385 pb o 1043pb) con posterior secuenciación

P1 P2 C+ C-1043 pb

(Jordá Vargas L, 2008)

Características genotípicas de las especies indeterminadas del complejo BCC

recA-RFLP Falsa identificacióncon cebadores

específicos

Mayor homologíaAccession number

Pigmento ß-Hemólisis

H B. cenocepacia B AY228543 - -

Indeterminada Indeterminada AY228543 - -

J B. stabilis AF456112 verdoso +

Indeterminada B. cenocepacia B AF456112 verdoso +

J B. stabilis AF143789 - -

H B. cenocepacia B AF456025 - -

(Jordá Vargas L, 2008)

Nueva especie genética del complejo B. cepacia circulandoen cepas intrahospitalarias

B. vanimaris

Curva Epidemiológica del total de los casos estudiadosn=44H10

Distribución de casos

1

45

9

5

0 1

13

4

02

00

2

4

6

8

10

12

14

n°casos

Enero Febrero Marzo Abril Mayo Junio Julio Agosto Sept Octubre Nov Diciembre

(Cornistein W et al., 2008)


B. stabilis (IV) n=3

B. vietnamiensis (V) n=6

Especie indeterminada o B. vanimaris (AF456112) n=2

NO ERA UN BROTE DEBIDO A UNA SOLA ESPECIE GENÉTICA,

SINO A TRES DE ELLAS.

Particularmente en los paísescon altos niveles de multirresistencia,

son necesarios estudios prospectivos de

prevención de las infecionesintrahospitalariasen conjunto con

equipos multidisciplinarios para contribuir con nuevas alternativas

terapéuticasa futuro.

LABORATORIO DE INVESTIGACIONES EN MECANISMOS DE RESISTENCIA AANTIBIÓTICOS,

2008

Dra Cecilia Quiroga Dra Silvia PiñeiroDra M. Soledad Ramírez Dra Sonia Arduino

Bioqca A. Karina Merkier Dra Paola JericLic. Nancy Claudia Castañeda Dra Betina OrmanLic. M. Paula Quiroga Lic. Laura RatierLic. Benjamín A. Ramírez Méd. Marcelo Alegre

Est. Paula Scalzo Bioqca LilianJordá VargasEst. Maria Eugenia Barissio

CONICET, UBA, ISID, IUMS, ASM, FUNDACIÓN A. ROEMMERS y ANPCyT

GRACIAS!!!!!Dra Marta Tokumoto, Dr Horacio Lopardo, Dr Carlos Vay, Dra Angela Famiglietti,

Dr Alejandro Petroni, Dra Ana Di Martino, Dra Sara Kaufman,Dr Jaime Kovensky, Dra Elsa Couto, Dra Mariela Paz, Dra Liliana Clara,

Dra Wanda Cornistein, Dra Claudia Rodríguez, Dr Miguel ValvanoDra Liliana Fernández Caniggia, Dra Mariana Catalano

Detección de la resistencia a glicopéptidos

• Difusión en agar: discos de 30 mg, luz transmitida

– Vancomicina: S ≥ 17, I = 15-16, R ≤ 14

– Teicoplanina: S ≥ 14, I = 11-13, R ≤ 10

• CMI (dilución en agar, microdilución, E-test): S ≤ 4, I = 8-16, R ≥32

• Cribado: agar BHI + 4-6 mg/ml de vancomicina: 105-106 ufc/m

• Identificación de la especie: movilidad, pigmento

• Determinación del tipo molecular

Enterococcus Vancomicina Resistente (EVR)

Hisopar placas de BEAS+8ug/ml de Vanco.

Repicar las posibles colonias (negras) en placa BEAS o sangre

Realizar Gram.

Incubar 35º-37º

Cocos + (catalasa neg) Bacilo +

No EVR

PYR y LAP

- y -

- y +

+ y +

Leuconostoc spp.

Pediococcus spp.

Enterococcus spp.

PYR: Pyroglutamico aminopeptidasaLAP: L-Leucina-Beta- Naftilamina

BEAS: Bilis Esculina Azida Sodica

SAMREn las cepas se estudió la resistencia a OXA, cefoxitina (FOX),

eritromicina (ERI), gentamicina (GEN), trimetoprima sulfametoxazol(TMS), rifampicina (RIF), ciprofloxacina (CIP) por el método de

difusión por discos en Mueller Hinton agar, incubación a 35ºC, 24 hs.

Se seleccionaron como probables portadores del SCCmec-IV a las cepas heterorresistentes a OXA (colonias dentro del halo) y

sensibilidad a tres o más de los siguientes antibióticos: RIF, ERI, GEN, CIP, TMS.

La resistencia a OXA fue confirmada por:

•Screening de OXA: Mueller Hinton agar (MHA) + 4% NaCl, incubación a 35ºC, 24 hs.

•CIM a OXA: se utilizó E-test en MHA + 2% NaCl incubación a 35ºC, 24 hs.

Conirmación de heterorresistencia:

•Eficiencia de plaqueo (EP) (Hartman and Tomsz): Se prepararon placas de ATS con 32µg/ml de OXA y placas sin

antibiótico. Se inocularon con 0,5 ml de un inóculo de aproximadamente 1010 UFC/ml. Se incubaron a 35ºC, 96 hs. La

EP se calculó por la relación UFC OXA/UFC S/OXA-

Definición: se consideró heterorresistencia a cepas que presentaban EP < 1%.

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