VALIDACIÓN DE UNA METODOLOGÍA ANALÍTICA PARA …

VALIDACIÓN DE UNA METODOLOGÍA ANALÍTICA PARA DETERMINAR

TRAZAS DE PANCREATINA POSTERIOR AL PROCESO DE LIMPIEZA DE

EQUIPOS EN PHARMETIQUE S.A.

KEVIN ENRIQUE LÓPEZ ROJAS

Estudiante

UNIVERSIDAD DE CARTAGENA

FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS

Cartagena de Indias, 2019

VALIDACIÓN DE UNA METODOLOGÍA ANALÍTICA PARA DETERMINAR

TRAZAS DE PANCREATINA POSTERIOR AL PROCESO DE LIMPIEZA DE

EQUIPOS EN PHARMETIQUE S.A.

KEVIN ENRIQUE LÓPEZ ROJAS

Estudiante Pasante de Química Farmacéutica

SINDY JIMÉNEZ CONTRERAS, Q.F.

Coordinadora de Control de Calidad de Pharmetique S.A.

Jefe Inmediato

LUCÍA ÁLVAREZ ÁLVAREZ, Q.F., Esp.

Directora

Propuesta de grado presentada en modalidad pasantía como pre-requisito

para optar al título de Químico Farmacéutico

UNIVERSIDAD DE CARTAGENA

FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS

Cartagena de Indias, 2019

Nota De Aprobación Del Jurado

____________________________

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____________________________

Presidente Del Jurado

____________________________

Jurado

____________________________

Jurado

La Universidad de Cartagena ni el jurado examinador, se hacen

responsables de los conceptos emitidos en el presente trabajo.

Contenido

1.Resumen .............................................................................................................. 9

2.Introducción ........................................................................................................ 10

3.Metodología ........................................................................................................ 12

3.1.Revisión Bibliográfica ...................................................................................... 12

3.2.Determinación del límite de aceptación de limpieza ........................................ 12

3.3.Toma de muestras .......................................................................................... 14

3.4. Elaboración del protocolo de validación .......................................................... 16

3.4.1.Parámetros operativos ................................................................................. 16

3.4.2.Materiales, reactivos y soluciones a preparar .............................................. 17

4.Procedimiento de reacción enzimática ............................................................... 19

4.1.Parámetros de validación ................................................................................ 20

5.Resultados ......................................................................................................... 25

5.1.Determinación del límite de aceptación de limpieza ........................................ 25

5.2.Parámetros de validación ................................................................................ 25

5.2.1.Especificidad o selectividad .......................................................................... 25

5.2.2.LOQ Y LOD .................................................................................................. 30

5.2.3.Linealidad ..................................................................................................... 34

5.2.4.Exactitud ....................................................................................................... 37

5.2.5.Precisión ....................................................................................................... 43

5.2.6.Estabilidad de las muestras .......................................................................... 46

6.Conclusiones ...................................................................................................... 51

7.Referencias bibliográficas .................................................................................. 51

Tablas

Tabla 1 Parámetros Operativos ............................................................................. 16

Tabla 2 Procedimiento de reacción enzimática ..................................................... 19

Tabla 3 Disoluciones de amilasa MP .................................................................... 22

Tabla 4 Alicuotas a aplicar para las superficies..................................................... 22

Tabla 5 Estabilidad de las muestras ...................................................................... 24

Tabla 6 Resultados de especificidad o selectividad .............................................. 25

Tabla 7 Datos de curva de bajas concentraciones ................................................ 30

Tabla 8 Consolidado de datos de curva de bajas concentraciones ....................... 31

Tabla 9 Datos de curva de altas concentraciones ................................................. 31

Tabla 10 Datos de absorbancias de muestras de LOQ ......................................... 33

Tabla 11 Datos de absorbancias de muestras de LOD ......................................... 34

Tabla 12 Datos del ensayo de linealidad ............................................................... 35

Tabla 13 Consolidado de datos de ensayo de linealidad ...................................... 35

Tabla 14 Datos de regresión lineal ........................................................................ 36

Tabla 15 Datos de porcentaje de recuperación obtenidos sobre superficie de

pintura epóxica. ..................................................................................................... 37


vidrio. ..................................................................................................................... 38


aluminio. ................................................................................................................ 39

Tabla 18 Datos de porcentaje de recuperación obtenidos sobre superficie de acero

inoxidable .............................................................................................................. 40


acrílico ................................................................................................................... 41


plástico .................................................................................................................. 42

Tabla 21 Datos obtenidos del ensayo de Precisión a concentración de LOQ ....... 44

Tabla 22 Datos obtenidos del ensayo de Precisión a concentración de 100% ..... 45

Tabla 23 Datos obtenidos del ensayo de Precisión a concentración de 120% ..... 45

Tabla 24 Estabilidad de muestra a t0 .................................................................... 46

Tabla 25 Estabilidad de muestras a t6h expuestas a la luz ................................... 46

Tabla 26 Estabilidad de muestras a t6h protegidas de la luz ................................ 47

Tabla 27 Resultados de t6h vs t0 expuestas a la luz ............................................ 47

Tabla 28 Resultados de t6h vs t0 protegidas de la luz .......................................... 47

Tabla 29 Estabilidad de muestras a t12h expuestas a la luz ................................. 48

Tabla 30 Estabilidad de muestras a t12h protegidas de la luz .............................. 48

Tabla 31 Resultados de t12h vs t0 protegido de la luz .......................................... 49

Tabla 32 Resultados de tiempo 12h vs t0 protegido de la luz ............................... 49

Tabla 33 Estabilidad de muestras t24h expuestas a la luz .................................... 49

Tabla 34 Estabilidad de muestras t24h protegidas de la luz ................................. 50



Figuras

Figura 1 Hisopo Clean Tips Swabs ....................................................................... 15

Figura 2 Plantilla para muestreo ............................................................................ 15

Figura 3 Barrido vertical de muestreo ................................................................... 15

Figura 4 Barrido horizontal de muestreo ............................................................... 16

Figura 5 Espectro del blanco/diluente. .................................................................. 26

Figura 6 Espectro de LAL de amilasa ................................................................... 27

Figura 7 Espectro de detergente Aerowash Plus 5% ............................................ 27

Figura 8 Etanol 96 ................................................................................................. 28

Figura 9 Etanol 70% .............................................................................................. 28

Figura 10 Timsen 0,16% ....................................................................................... 29

Figura 11 Timsen 0,1% ......................................................................................... 29

Figura 14 Curva de calibración a bajas concentraciones ...................................... 31

Figura 15 Curva de calibración a altas concentraciones ....................................... 32

Figura 16 Curva de linealidad................................................................................ 36

9

1. Resumen

En el presente trabajo de pasantía se validó una metodología analítica de limpieza

que determinó trazas de pancreatina como apoyo al proceso de limpieza de

equipos, y así se obtuvo la evidencia documentada en conformidad con los

principios de las Buenas Prácticas de Manufactura (BPM) y Buenas Prácticas de

Laboratorio (BPL), de acuerdo a la directriz de la conferencia internacional de

armonización (ICH) vigente. Para esto se aplicaron las normas exigidas para

validaciones por la Organización Mundial de la Salud (OMS) como requisito

importante, siguiendo las normas de BPM.

Se determinó el límite de aceptación de limpieza (LAL) de pancreatina que puede

existir en el equipo de producción y área de trabajo posterior al procedimiento de

limpieza basándose en la dosis mínima, dosis máxima, toxicidad y genotoxicidad

del principio activo.

Se establecieron superficies como puntos críticos específicos en los equipos de

producción y áreas de trabajo, los cuales se simularon dentro del laboratorio de

control de calidad de Pharmetique S.A., para efectos de la validación.

Las muestras fueron tomadas por el método de hisopado y analizadas con el

método analítico de espectrofotometría UV para determinar el consumo de almidon

ocasionado por la enzima amilasa y de esta manera obtener la concentración de

amilasa remanente, los resultados obtenidos de las muestras se compararon con el

LAL, y fueron menores, soporte técnico para que los procedimientos de limpieza

fueran validados, dando conformidad a lo esperado y quedó comprobado que dicha

metodología logra determinar trazas de pancreatina posterior al proceso de limpieza

de equipos y áreas involucradas en la manufactura del medicamento Leprit

enzimático.

10

2. Introducción

Pharmetique S.A, nombrado en adelante bajo las siglas PhQ S.A., es una compañía

farmacéutica del grupo Carval comprometida con la salud de millones de personas

en América Latina, con presencia en 14 países, que desarrolla, manufactura y

comercializa un amplio portafolio de medicamentos que cubren las principales

necesidades de salud de los latinoamericanos. PhQ S.A. Adquirió la trayectoria y

experiencia de más de 30 años de Laboratorios La Santé y se constituye como una

potente organización farmacéutica con una nueva estrategia y arquitectura de

marca que le permitirá entrar al mercado de los medicamentos altamente

especializados y de biotecnología en el área de la oncología y la inmunología. (PhQ

S.A., 2016).

El grupo farmacéutico compuesto por Laboratorios La Santé S.A., Manufacturera

Mundial Farmacéutica S.A. y PhQ S.A. se compromete con sus clientes, autoridades

y accionistas en cumplir con los requerimientos de calidad mediante estándares

locales e internacionales con el fin de brindar a los pacientes productos seguros y

eficaces. Entre directivos y colaboradores, desarrollan, manufacturan, licencian y

comercializan los productos aplicando las normativas regulatorias, las buenas

prácticas de manufactura y las buenas prácticas de laboratorio exigidas en los

mercados de interés. El talento humano, los recursos, los productos y procesos

están asociados a una cultura de calidad, enfocada a la mejora continua e

innovación en la cadena de suministros, buscando impactos positivos en los

elementos económicos, ambientales y sociales de la industria farmacéutica, en el

grupo de clientes y partes interesadas: accionistas, colaboradores, profesionales de

la salud, pacientes, proveedores, gobierno, ambiente y comunidad.1

PhQ S.A. cuenta con cinco unidades de negocio de amplio portafolio que están

dedicadas a la producción de medicamentos de: cuidado primario, cuidado

1 Hernández Hernández, A., Ramírez Angarita, A. J., & Rubiano Rodríguez, A. R. Propuesta de mejora para el proceso de calidad de la gestión de la cadena de suministro para la empresa Pharmetique labs S.A. bajo los lineamientos de la norma NTC iso 9001: 2015.

11

especializado, genéricos de prescripción y de venta libre, y prestación de servicios

de manufactura para compañías multinacionales de investigación. (PhQ S.A.,

2016).

La estrategia de crecimiento de PhQ S.A. se basa en tres pilares: un portafolio de

nuevos productos, un programa de apertura de operación en nuevos países y el

lanzamiento de la línea de medicamentos especializados y de biotecnología. La

visión de PhQ S.A., es ser el laboratorio farmacéutico de mejor desempeño a nivel

de crecimiento y liderazgo de mercado, aportando al desarrollo sostenible a los

países de América Latina donde se tiene presencia. (PhQ S.A., 2016).

La Calidad, además de ser uno de los valores fundamentales que se implementan

PhQ S.A., es también una de las especificaciones más importantes en el producto

terminado, por lo tanto este parámetro debe estar completamente aprobado con el

fin de cumplir con las buenas prácticas de manufactura (BPM), buenas prácticas de

laboratorio (BPL), las expectativas de las autoridades sanitarias y de los clientes a

los que se les realiza maquila de productos. El área de control de calidad (QC) de

PhQ S.A. se encarga de llevar a cabo los análisis pertinentes para satisfacer las

necesidades y exigencias de los clientes, dentro de ellos se encuentran los análisis

para determinación de sustancias remanentes posterior a la fabricación de

productos en los equipos; estas metodologías de análisis deben ser validadas antes

de ser implementados dentro del laboratorio de QC.

Los procedimientos de limpieza adecuados desempeñan un papel importante en la

prevención de contaminación cruzada. (Invima, 2018). Las validaciones de limpieza

son fundamentales en laboratorios multiproducto donde se comparten equipos para

diferentes categorías de productos y debe ser ejecutada, entre otros, para equipos,

áreas y procedimientos de sanitización. La vigencia de la limpieza de los equipos

de fabricación, accesorios, utensilios y todas las tuberías debe establecerse con

base en los resultados de la validación. (Invima, 2018).

12

Palabras clave: Validación de limpieza, Buenas Prácticas De Manufactura (BPM),

Buenas Practicas de Laboratorio (BPL), actividad enzimática de amilasa (A.E.A.),

Limite de Aceptación de Limpieza (LAL).

3. Metodología

3.1. Revisión Bibliográfica

Se llevó a cabo la revisión bibliográfica sobre las características tanto del principio

activo como del producto leprit enzimático. Se revisaron protocolos y documentos

estándares operativos con los cuales se llevan a cabo las limpiezas y sanitización

de los equipos involucrados en la producción y envase del producto leprit

enzimático.

3.2. Determinación del límite de aceptación de limpieza

Se tuvo en cuenta para calcular el límite de aceptación de limpieza, LAL, una matriz

de productos peores casos generada por el área de servicios farmacéuticos de Phq

S.A., en el cual se especificaron variables como: equipos involucrados en la

manufactura de los productos, áreas de los equipos en las cuales hay contacto con

el producto, dosis mínimas diarias de los medicamentos o fármacos y dosis daría

más alta del próximo medicamento o fármaco que se fabricara en el mismo equipo.

Para determinar el LAL, se tomó como referencia la técnica de reporte N°29 de la

Parental Drug Association, PDA por sus siglas en inglés, “Puntos a considerar para

validaciones de limpieza”, en el cual se plantea que se puede determinar el límite

de aceptación de limpieza (LAL), teniendo en cuenta la dosis mínima diaria del

medicamento A en µ/día, el factor de seguridad recomendado por la PDA para

medicamentos de administración por vía oral cuyo valor es de 0,001, el tamaño del

lote del en Kg, la dosis máxima diaria en mg/día del medicamento B, y la sumatoria

de las áreas que comparten los dos productos en cm2. Se planteó la ecuación 1

para ello.

13

LAL = MDDxSFxTLBx1000

LDDxAS

(Parental Drug Association, 2012)

Ecuación 1 Nivel aceptable de residuos.

Donde:

MDD: Dosis diaria mínima del medicamento problema.

SF: Factor de seguridad (0.001).

TLB: Tamaño del lote del medicamento B.

LDD: Dosis diaria más alta del medicamento B que se fabricará en el mismo equipo

AS: Sumatoria de las áreas compartidas en el equipos.

(Parental Drug Association, 2012).

Los valores para el cálculo del ARL son los siguientes:

MDD: 150000 µg/día

TLB: 38,68 Kg

LDD: 1,65g/día

AS: 123148 cm2

Reemplazando los valores en la ecuación 1, se obtiene lo siguiente:

𝐿𝐴𝐿 = 150000

µ𝑔𝑑í𝑎

𝑥0,001𝑥38,68𝐾𝑔𝑥1000𝑔

1,65𝑔

𝑑𝑖𝑎𝑥123148𝑐𝑚2𝑥1𝐾𝑔

= 28,55µ𝑔/𝑐𝑚2

Teniendo en cuenta que el activo a determinar en la validación es una enzima, la

cantidad de la misma debe expresarse en unidades USP, considerando que la

materia prima de pancreatina utilizada en la manufactura del medicamento A posee

una potencia aproximada de 100 UUSP de amilasa/mg de pancreatina, se hace la

conversión planteada en la ecuación 2.

14

𝑈𝑈𝑆𝑃

𝑐𝑚2=

28,55µg

cm2𝑥1𝑚𝑔𝑥100𝑈𝑈𝑆𝑃

1000µgx1mg= 2,86 𝑈𝑈𝑆𝑃/𝑐𝑚2

(Rojas, J., Sierra, N., 2017)

Ecuación 2 Unidades USP/cm2

Rojas, J., en su libro “Como Validar Sus Metodologías Analíticas” sugiere que el

área de muestreo de las superficies por el método de hisopado para determinar

trazas de principios activos sea de 5cm2 por cada 0,4 mL del solvente de muestreo

utilizado en el proceso de recuperación del hisopo. Teniendo en cuenta que en los

ensayos de pre-validación y estandarización de los parámetros y condiciones de la

metodología analítica se determinó que el volumen de solvente de muestreo a

utilizar en la recuperación del activo posterior al proceso de muestreo por hisopado

sobre las superficies fuese de 2mL, debido a que durante el proceso de reacción

enzimática, descrito en la tabla 2, se utiliza 1mL de la solución de recuperación del

hisopo. Por lo cual se determinó que el área mínima de muestreo sobre las

superficies fuese de 25cm2/2mL. Por lo cual se hace la ecuación 3:

𝑈𝑈𝑆𝑃

𝑚𝐿=

2,86𝑈𝑈𝑆𝑃𝑐𝑚2 𝑥25𝑐𝑚2

2𝑚𝐿= 35,7

𝑈𝑈𝑆𝑃

𝑚𝐿


Ecuación 3 Unidades USP/mL

Se obtuvo la concentración de 35,7 UUSP de amilasa/mL de solvente de muestreo,

este valor fue considerado como LAL y concentración de trabajo con la cual fue

llevada a cabo la validación de la metodología analítica.

3.3. Toma de muestras

Las muestras se tomaron realizando un barrido sobre las superficies de pintura

epóxica, vidrio, aluminio, acero inoxidable, acrílico y plástico grado farmacéutico,

15

definidas como críticas en el proceso de limpieza, utilizando el hisopo de referencia

indicada, el cual se detalla en la figura 1.

El muestreo se realizó siguiendo los pasos detallados en las figuras 2 a 4:

Se tomó el hisopo de referencia indicado

(Fisher scientific, 2019)

Figura 1 Hisopo Clean Tips Swabs

Se humedeció el hisopo con el solvente de muestreo (diluente), detallado en

el punto 3.4.2

Se colocó una plantilla de un área conocida para la toma de muestra sobre

el punto a muestrear, como se ejemplifica en la figura 2.

Figura 2 Plantilla para muestreo

Se realizó un barrido vertical sobre la superficie con el hisopo, empezando

en un extremo del área y terminando en el extremo opuesto, tal como se

detalla en la figura 3.

Inicio

Final

Figura 3 Barrido vertical de muestreo

16

Se giró el hisopo 180° y se realizó un nuevo barrido en el mismo sentido, bajo

las mismas condiciones.

Se realizó un barrido horizontal sobre la superficie con el hisopo, empezando

en un extremo del área y terminando en el extremo opuesto, tal como se

detalla en la figura 4

Inicio Final

Figura 4 Barrido horizontal de muestreo

Se giró el hisopo 180° y se realizó un nuevo barrido en el mismo sentido, bajo

las mismas condiciones.

Se introdujo el hisopo en un vial de muestreo y se cortó el mango de este.

3.4. Elaboración del protocolo de validación

Se elaboró un protocolo experimental en el cual quedaron descritos los parámetros

de validación, las condiciones del análisis, las soluciones y reactivos que se

prepararon, en conformidad con los principios de BPM y BPL, con el cual se obtuvo

evidencia documentada la cual garantizó que la metodología analítica fue adecuada

y permitió obtener datos confiables y reproducibles.

3.4.1. Parámetros operativos

Los parámetros operativos se describen en la Tabla 1.

Tabla 1 Parámetros Operativos

Producto Leprit enzimático

Sustancia a Determinar Pancreatina.

Criterio de Análisis Limpieza de equipos

17

3.4.2. Materiales, reactivos y soluciones a preparar

Los reactivos y las soluciones preparadas que se utilizaron para llevar a cabo la

validación de la metodología analítica de limpieza de describen a continuación.

Hisopo para muestreo

Se utilizaron hisopos (MARCA TEXWIPE). Descritos en la figura 1.

Solución diluente

Se pesó 13,6 g de fosfato monobásico de potasio grado reactivo (GR) y se disolvió

en agua para preparar 500 mL de solución. Se pesó 14,2 g de fosfato dibásico de

sodio anhidro GR y se disolvió en agua para preparar 500 mL de solución.

Se mezcló 51 mL de solución de fosfato monobásico de potasio GR con 49 mL de

solución de fosfato dibásico de sodio GR. Se ajustó a un pH de 6,8 mediante la

adición gota a gota de hidróxido de sodio 0,1N o ácido clorhídrico 0,1N.

Solución de cloruro de sodio

Se pesó 11,7 g de cloruro de sodio y se disolvió en agua para preparar 1000 mL de

solución.

Solución de almidón

Se pesó 2,5 g de almidón y se disolvió en 15 mL de agua, se agregó esta mezcla

a 200 mL de agua hirviendo. Se enjuagó el vaso de precipitado con 15 mL de agua,

se agregó a la solución caliente y se calentó hasta ebullición mezclando

Técnica analítica Espectrofotometría UV

Longitud de onda de referencia 590nm

Rango de barrido 550-690 nm

18

continuamente. Se enfrió a temperatura ambiente y se agregó agua para preparar

250 mL.

Solución de yodo/yoduro de potasio

Se pesó aproximadamente 28 mg de yodo y 28 mg de yoduro de potasio en un

balón de 50 mL, se agregó 2 mL de alcohol etílico al 96%, se llevó a vortex hasta

completa disolución y se completó a volumen con agua.

Solución de ácido clorhídrico 6N

Se agregó con precaución 510 mL de ácido clorhídrico al 37% a 300 mL de agua,

se homogenizó y completó hasta 1000 mL con agua desmineralizada.

Soluciones de detergente, inactivante y sanitizante

Detergente AEROWASH Plus 5%, Timsen al 0,16 %, Alcohol (Etanol) al 70%,

Alcohol (Etanol) al 96%.

Estas soluciones se utilizaron para determinar si existe interferencia a la longitud de

onda establecida en el protocolo, ya que estas son utilizadas para la limpieza de los

equipos de producción.

Solución estándar madre de amilasa

Se pesó 20 mg de estándar USP de Amilasa y Proteasa, cuya potencia es de 344

UUSP/mg, en un balón aforado de 50 mL, se solubilizó con diluente previamente

refrigerado (2°C - 8°C), se completó volumen y se agitó en vortex durante 2 minutos,

para obtener una concentración aproximada de 137,6 UUSP/mL de amilasa.

Solución estándar LAL de amilasa

De la solución anterior se tomó una alícuota de 2,6 mL y se pasó a un balón aforado

de 10 mL, se completó a volumen con diluente y se homogenizó en vortex durante

19

2 minutos para obtener uno solución de aproximadamente 35,7 U USP/mL de

amilasa.

Solución madre de amilasa materia prima

Se pesó 142,76 mg de pancreatina MP, cuya potencia es de 100 UUSP/mg, en un

balón aforado de 20 mL, se disolvió con diluente previamente refrigerado (2°C-8°C),

se completó a volumen y se llevó a vortex durante 2 minutos, para obtener una

concentración aproximada de amilasa de 713,8 UUSP/mL.

Solución equivalente al LAL de amilasa materia prima

De la solución anterior se tomó una alícuota de 5 mL y se pasó a un balón aforado

de 10 mL, se completó a volumen con diluente y se homogenizó en vortex durante

2 minutos, para obtener una solución de aproximadamente 356,9 U USP/mL de

amilasa. Esta solución se preparó con el propósito de tener una muestra de la

pancreatina MP utilizada en la fabricación del producto leprit enzimático, la cual fue

utilizada en la determinación de los parámetros exactitud y estabilidad de la

muestra.

4. Procedimiento de reacción enzimática

El procedimiento que se llevó a cabo para ejecutar la reacción enzimática in vitro se

describe en la tabla 2. Cada tubo de ensayo donde se llevó a cabo la reacción se

marcó de la siguiente manera, B para el blanco de la reacción enzimática, S para el

estándar LAL de pancreatina y M# para las muestras, identificándolas con los

números respectivos de los puntos de muestreos.

Tabla 2 Procedimiento de reacción enzimática

Reactivos B(µL) S(µL) M#(µL) M#(µL)

Solución de almidón 1000 1000 1000 1000

Diluente 1000 1000 1000 1000

Solución de NaCl 500 500 500 500

Solución de Yodo/Yoduro 100 100 100 100

20

Incubar a 37°C por 5 minutos

Diluente 1000 -- -- --

Solución de estándar LAL -- 1000 -- --

M# -- -- 1000 --

M# -- -- -- 1000

Reacción por 7 minutos a 37°C cronometrados

Solución de HCL 6N 500 500 500 500

4.1 Parámetros de validación

Los parámetros que se llevaron a cabo en la validación, con la finalidad de cumplir

con lo establecido por la Conferencia Internacional de Armonización (ICH, por sus

siglas en ingles), se describen a continuación.

Especificidad o selectividad

Este parámetro evaluó bajo el procedimiento de reacción enzimática descrito en el

punto 4 y se determinaron las posibles interferencias entre la pancreatina, en

placebo de leprit enzimático, la solución diluente utilizada para el análisis, y las

sustancias utilizadas en la limpieza de las áreas involucradas descritas en el punto

3.4.2.

LOQ Y LOD

Se determinó el LOQ teniendo en cuenta la concentración de menor coeficiente de

variación en la curva de bajas concentraciones y se determinó el LOD teniendo en

cuenta la ecuación 4.

LOD =(3,3 ∗ LOQ)

10⁄

Ecuación 4 Limite de detección


21

Se verificó experimentalmente que el coeficiente de variación entre la respuesta del

equipo fue menor a 10%, haciendo una lectura de 6 muestras preparadas a

concentración de LOQ. Posteriormente, se verificó que existe absorbancia a la

longitud de onda de referencia haciendo una lectura de 6 muestras preparadas a

concentración de LOD calculado según la ecuación 4.

Linealidad

Se evaluó la linealidad con la finalidad de comprobar la existencia de una relación

lineal entre la señal generada por el equipo y la concentración de la sustancia de

interés.

Se prepararon soluciones a concentraciones desde el LOQ, 60%, 80%, 100% y

120% del límite de aceptación de limpieza, con el objetivo de garantizar que exista

una relación desde la concentración mínima cuantificable por la metodología hasta

la concentración máxima a evaluar.

Exactitud

El parámetro de exactitud se evaluó con el objetivo de determinar el porcentaje de

recuperación de amilasa sobre superficies caracterizadas como críticas tales como

pintura epóxica, vidrio, aluminio, acero inoxidable, acrílico y plástico grado

farmacéutico.

Se prepararon diluciones de amilasa MP por triplicado en balones aforados de 10mL

a concentraciones de LOQ, 100% y 120% como sugiere Rojas, J., de la manera en

la que se indica en la tabla 3, a partir de la solución madre de amilasa preparada en

el punto 3.4.2, y se aplicaron alícuotas de estas soluciones sobre las superficies

siguiendo las indicaciones de la tabla 4, se muestrearon por el método de hisopado

las superficies anteriormente mencionadas, a los tres niveles de concentración

establecidos cada uno preparado por triplicado, para un total de 9 datos de

porcentaje de recuperación por superficie, se calculó el promedio de los porcentajes

de recuperación, la desviación estándar y los coeficientes de variación de las

22

muestras, este último dato es críticos para la aceptación del parámetro, por lo tanto

debe ser menor a 15% (Rojas, J., Sierra, N., 2017)

Tabla 3 Disoluciones de amilasa MP

CONCENTRACIÓN DE AMILASA

ALÍCUOTA A TOMAR DE LA SOLUCIÓN

MADRE DE AMILASA (mL)

% U USP/mL

LOQ 14,32 LOQ

100 35,7 5

120 42,84 6

Tabla 4 Alícuotas a aplicar para las superficies

CONCENTRACIÓN DE AMILASA

CONCENTRACIÓN DE AMILASA (U USP/mL)

VOLUMEN DE LA SOLUCIÓN

A VERTER (mL)

40% = LOQ 14,32 0,2

100 % 35,7 0,2

120 % 42,84 0,2

Se prepararon las diluciones a trabajar sobre las superficies tal y como lo muestra

la tabla 3, de tal forma que al adicionar sobre cada superficie el volumen indicado

en la tabla 4 para cada concentración, quedó depositada sobre ella la concentración

de amilasa especificada en la misma tabla. Posterior al muestreo, se procedió a

recuperar con 2mL de diluente, tal como se indica en el punto 3.2.

Se planteó la ecuación 5 con la cual se determinó el porcentaje de recuperación de

pancreatina sobre las superficies críticas en el proceso:

% de recuperacion de amilasa

= {((A. B − A. Mta) ∗ P. Std ∗ Pot. Std ∗ Vol. Std ∗ V. Std. Rx ∗ VF. Mp ∗ VF. Eq ∗ FD)

((A. B − A. Std LAL) ∗ VF. SM ∗ VF. Std ∗ P. Mp ∗ Pot. Mp ∗ Vol. Mp ∗ A. %R ∗ 1mL)}

∗ 100


Ecuación 5 Porcentaje de recuperación de amilasa

23

Donde:

-A.B: señal generada por el blanco.

-A.Mta: señal generada por la muestra.

-A.Std LAL: señal generada por el estándar LAL.

-P.Std: peso en mg del estándar de pancreatina.

-Pot.Std: potencia U USP/mg del estándar utilizado.

-VF.SM: volumen en mL al cual se llevara la solución madre de amilasa

-Vol.Std: volumen en mL utilizado de la solución madre de amilasa para la solución

LAL.

-VF.Std: volumen en mL al cual se llevara la solución LAL de amilasa.

-V.Std.Rx: volumen en mL utilizado de la solución LAL para la reacción enzimática.

-P.Mp: peso en mg de la materia prima de pancreatina utilizado preparar la solución

madre.

-Pot.Mp: potencia en U USP/mg de la materia prima de pancreatina.

-VF.Mp: volumen en mL al cual se llevara la solución madre de materia prima de

pancreatina.

-Vol.Mp: volumen en mL utilizado de la solución de materia prima para la solución

equivalente a LAL de pancreatina.

-VF.Eq: volumen en mL al cual se llevara la solución equivalente a LAL de

pancreatina materia prima.

-A. %R: alícuota en mL tomada de la solución equivalente a LAL para aplicar sobre

la superficie crítica.

-FD: volumen en mL de diluente a adicionar a los hisopos posterior al muestreo

sobre la superficie.

-Vol.Rx: volumen en mL utilizado de la muestra para la reacción enzimática.

Precisión

Se determinó la precisión del método llevando a cabo los parámetros de

repetibilidad y precisión intermedia descritos a continuación:

o Repetibilidad

24

Se tomó los datos de coeficientes de variación (CV) obtenidos en los muestreos de

los materiales que fueron ensayados en el parámetro de exactitud y con ellos se

determinó la repetibilidad de la metodología analítica de limpieza.

Se tuvo en cuenta el número de muestras como única variable para calcular el dato

de CV de los porcentajes de recuperación.

o Precisión intermedia

Para esto se realizó la preparación descrita en el parámetro de exactitud cambiando

de analista y día de ejecución. Se tomó los datos obtenidos en ensayo de exactitud

y comparó con los de este ensayo y así se determinó la precisión intermedia del

método.

Estabilidad de las muestras

Se determinó la estabilidad de las muestras con el fin de establecer la influencia de

condiciones de almacenamiento, como los son el tiempo de almacenamiento

posterior al muestreo y la exposición a la luz de las muestras. Las condiciones con

las que se evaluó la este parámetro se describen en la tabla 5.

Tabla 5 Estabilidad de las muestras

PARÁMETRO

MUESTRAS

M1**

M2** M3** M4**

FRASCO

AMBAR

TUBO DE

ENSAYO

FRASCO

AMBAR

TUBO DE

ENSAYO

FRASCO

AMBAR

TUBO DE

ENSAYO

Tiempo de

almacenamiento*

0

horas 6 horas 12 horas 24 horas

Exposición a la

luz No No Si No Si No Si

*Tiempo comprendido entre el muestreo y el análisis por espectrofotometría uv.

**Todas las muestras deberán ser preparadas por duplicado.

Se determinó el porcentaje de recuperación de la estabilidad de las muestras

utilizando la ecuación 5.

25

5. Resultados

5.1 Determinación del límite de aceptación de limpieza

El LAL determinado durante ensayos de pre-validación y estandarización de los

parámetros de la metodología analítica, fue de 35,7 UUSP/mL, este valor es

indispensable para llevar a cabo una validación de metodología analítica de

limpieza, ya que en este es la concentración de trabajo de la validación de la

metodología analítica y con la cual se compararon las soluciones y muestras

analizadas.

5.2 Parámetros de validación

A continuación se detallan los resultados obtenidos en la validación de cada uno de

los parámetros estudiados.

5.2.1 Especificidad o selectividad

En la tabla 6 se muestran los resultados de las absorbancias producidas por cada

una de las muestras evaluadas en este parámetro. Al realizarse el estudio sobre un

ensayo de reacción enzimática en retroceso por consumo de almidón utilizando una

solución de yodo como indicador de intensidad de color, se debe calcular la

diferencia entre el blanco de reactivo, el cual es referencia de que no hubo consumo

de almidón en la muestra, y la absorbancia emitida por la muestra a longitud de

onda de 590nm.

Tabla 6 Resultados de especificidad o selectividad

Muestra Absorbancia (nm) Diferencia (nm)

Diluente-Blanco 1,28402171 0

Estándar LAL de amilasa 0,92815902 0,35586269

Detergente Aerowash Plus 5% 1,23525385 0,04876786

Etanol 70% 1,22088947 0,06313224

26

Etanol 96% 1,23948802 0,04453369

Timsen 0,16% 0,77144756 0,51257415

Timsen 0,1% 1,06344300 0,22057871

De acuerdo con los resultados obtenidos se confirma que la metodología analítica

es específica y selectiva para determinar trazas de pancreatina posterior al proceso

de limpieza de equipos, debido a que las diferencias de absorbancias entre el blanco

y las muestras críticas evaluadas no interfieren y se encuentran por debajo de la

señal emitida por el estándar de amilasa al LAL, a excepción de la solución de

timsen al 0,16%, por lo cual se prepara y se analiza como muestra una solución de

concentración más diluida simulando el proceso de enjuague de los equipos,

garantizando así que esta sustancia no interfiere con la señal la amilasa, siendo la

diferencia de esta absorbancias inferior a la del LAL .Los espectros obtenidos de las

muestras críticas se ejemplifican desde la figura 5 hasta la figura 11.

Figura 5 Espectro del blanco/diluente.

27

Figura 6 Espectro de LAL de amilasa

Figura 7 Espectro de detergente Aerowash Plus 5%

28

Figura 8 Etanol 96

Figura 9 Etanol 70%

29

Figura 10 Timsen 0,16%

Figura 11 Timsen 0,1%

30

Cabe resaltar que la lectura del blanco en la reacción, como lo indica la tabla 2, por

el método de espectrofotometría UV se realizó una única vez por día, en el caso de

la especificidad/selectividad quedó expresado el resultado de la absorbancia del

blanco de reacción en la tabla 6, este valor no es relacionado con los demás

ensayos de los parámetros ya que estos fueron realizados en días distintos, por lo

tanto el valor del blanco se omite para estos ensayos y únicamente se coloca en las

tablas de resultados las diferencias obtenidas entre el la lectura del blanco del día

de análisis y las muestras analizadas.

5.2.2 LOQ Y LOD

LOQ

Se estableció el límite de cuantificación teniendo en cuenta el método de curvas de

calibración, tanto a bajas concentraciones como a altas concentraciones, los

resultados obtenidos de estas curvas de calibración se muestran en las tablas 7 a

la 9 y figuras 14 y 15.

Tabla 7 Datos de curva de bajas concentraciones

% De

LAL Concentración (uusp/mL) Mta #lectura Señal

Promedio

muestras SD

CV

muestras

10% 3,580

1 1 0,067441873

0,09209 0,03 30,24%* 2 0,068513600

2 1 0,116071938

2 0,116329022

15%

5,370

1 1 0,112428720

0,12079 0,01 6,27%

2 0,116477546

2 1 0,125814932

2 0,128418982

20% 7,160

1 1 0,142335828

0,13950 0,01 4,88% 2 0,147783999

2 1 0,133489312

2 0,134370900

30% 10,740

1 1 0,179905665

0,17569 0,01 3,90% 2 0,182774038

2 1 0,167912757

2 0,172173522

40% 14,320

1 1 0,232410066

0,22807 0,01 2,89% 2 0,234943232

2 1 0,223365025

2 0,221568515

31

*Debido al coeficiente de variación superior a 15%, según Rojas, J., de la

concentración de 3,58 UUSP/mL, se concluye que a dicha concentración no se

puede cuantificar con exactitud y precisión muestras de amilasa, por lo cual este

valor se omite para la determinación de LOD y LOQ.

Tabla 8 Consolidado de datos de curva de bajas concentraciones

X (UUSP/mL) Y(Absorbancia)

3,58 0,09209

5,37 0,12079

7,16 0,13950

10,74 0,17569

14,32 0,22807

Con los datos obtenidos en el consolidado de curva de bajas concentraciones se

realizó la Figura 14, en la cual se detalla la ecuación de la recta, y el coeficiente de

correlación, el cual indica que existe una relación lineal entre X y Y.

Figura 12 Curva de calibración a bajas concentraciones

Tabla 9 Datos de curva de altas concentraciones

% De LAL

Concentración (UUSP/mL)

Muestra #lectura Señal (Abs)

Promedio muestras SD CV

muestras

40 14,32

1 1 0,23241007

0,228071710 0,006595 2,891651 2 0,23494323

2 1 0,22336502

2 0,22156851

y = 0,0122x + 0,0511R² = 0,9935

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Ab

sorb

anci

a

Concentracion (UUSP/mL)

Curva de calibracion (Bajas concentraciones)

32

60 21,487

1 1 0,28129037

0,281685146 0,000484 0,171862 2 0,28126818

2 1 0,28194282

2 0,28223921

80 28,65

1 1 0,42204832

0,396753764 0,029687 7,482482 2 0,42286452

2 1 0,37030276

2 0,37179946

100 35,81

1 1 0,45457904

0,463805230 0,009298 2,004637 2 0,45704492

2 1 0,47119502

2 0,47240194

120 42,97

1 1 0,5482985

0,546978236 0,001242 0,227027 2 0,54776888

2 1 0,54604517

2 0,5458004

Con los datos obtenidos en la curva de altas concentraciones se realizó la Figura

15, en la cual se detalla la ecuación de la recta, y el coeficiente de correlación, el

cual indica que existe una relación lineal entre X y Y.

Figura 13 Curva de calibración a altas concentraciones

y = 0,0114x + 0,0555R² = 0,9905

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Ab

sorb

anci

a

Concentración (UUSP/mL)

Curva de calibracion (Altas concentraciones)

33

Se determinó el LOQ teniendo en cuenta la menor concentración en UUSP/mL a la

cual se obtuvo coeficiente de variación menor a 15% con respecto a la curva de

bajas concentraciones, obteniéndose el valor de 5,37 UUSP/mL. Se realizó la

confirmación de este valor por medio de la lectura de 6 muestras preparadas a

concentración de 5,37 UUSP/mL, los resultados obtenidos se encuentran en las

tabla 10.

Tabla 10 Datos de absorbancias de muestras de LOQ

MUESTRA ABSORBANCIA

#1 0,07780725

# 2 0,07792420

# 3 0,07783238

# 4 0,07781126

# 5 0,07777592

# 6 0,07792800

PROMEDIO 0,07784650

SD 0,0000642

% CV 0,083%

La metodología analítica cuantifica con exactitud y precisión cantidades mayores o

iguales a 5,37 UUSP/mL, que corresponde al 15% de concentración del límite de

aceptación de limpieza. Se tuvo un coeficiente de variación de 0,083% cumpliendo

así con la especificación (<15%), según Rojas, J.

LOD

Se calculó el límite de detección con la ecuación 4, utilizando el LOQ determinado

en el punto 5.2.2 y se obtuvo como resultado para el LOD un valor de 1,772

UUSP/mL, el cual corresponde al 4,95% de la concentración del LAL. Se realizó la

confirmación de este valor por medio de la lectura de 6 muestras preparadas a

concentración de 1,772 UUSP/mL,

34

LOD =(3,3 ∗ 5,37)

10⁄ = 1,772𝑈𝑈𝑆𝑃

𝑚𝐿

Ecuación 4 Limite de detección

Los resultados obtenidos de la lectura de 6 muestras preparadas a concentración

de 1,772 UUSP/mL se encuentran en la Tabla 11.

Tabla 11 Datos de absorbancias de muestras de LOD

MUESTRA

LOD ABSORBANCIA

# 1 0,02358968

# 2 0,02383985

# 3 0,02391265

# 4 0,02405671

# 5 0,02411532

# 6 0,02429615

PROMEDIO 0,02396840

SD 0,000245

% CV 1,022

5.2.3 Linealidad

Se comprobó que existe una relación lineal entre la absorbancia generado por el

equipo y la concentración de amilasa en las muestras analizadas. Los niveles de

concentración ensayados fueron establecidos con base al límite de aceptación de

limpieza, en un rango comprendido desde la concentración de LOQ, 60%, 80%,

100% y 120%, en dicho intervalo se encontró que la metodología de análisis es

lineal para la cuantificación de trazas de amilasa, reportándose los resultados

obtenidos en las tablas 12 a la 15 y la figura 16.

35

Tabla 12 Datos del ensayo de linealidad

(%) (uusp/ml) Mta #Lectura Señal

(Abs) Promedio SD

CV

(%)

LOQ 5,370

1 1 0,1527584

0,1467171 0,009 6,1 2 0,1559273

2 1 0,1386475

2 0,1395352

60% 21,480

1 1 0,3045838

0,3018741 0,005 1,6 2 0,3072473

2 1 0,2987859

2 0,2968796

80% 28,640

1 1 0,3809662

0,38140 0,00 0,15 2 0,3809148

2 1 0,3815917

2 0,3821153

100% 35,800

1 1 0,4598324

0,45449 0,01 1,21 2 0,4512671

2 1 0,4484729

2 0,4583829

120% 42,960

1 1 0,5442328

0,52680 0,02 3,88 2 0,5447284

2 1 0,5089828

2 0,5092642

Tabla 13 Consolidado de datos de ensayo de linealidad

% de LAL X (UUSP/mL) Y (Absorbancia)

LOQ 5,37 0,14672

60 21,48 0,30187

80 28,64 0,38140

100 35,80 0,45449

120 42,96 0,52680

36

Con los datos obtenidos en la curva de linealidad se realizó la Figura 16, en la cual

se detalla la ecuación de la recta y el coeficiente de correlación, el cual indica que

existe una relación lineal entre X y Y.

Figura 14 Curva de linealidad

Los datos de regresión lineal obtenidos de la curva de linealidad (Figura 16), se

detallan en la Tabla12.

Tabla 14 Datos de regresión lineal

R2 0,9995

Pendiente (m) 0,0102

Intercepto (b) 0,0894

El coeficiente de correlación obtenido en el ensayo de linealidad fue de 0,9995,

cumpliendo así con el criterio de aceptación para validaciones de metodologías

analíticas de trazas (R2 >0,9800), recomendado por Rojas, J.

y = 0,0102x + 0,0894R² = 0,9995

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 10 20 30 40 50

Ab

sorb

anci

a

Concentracion (UUSP/mL

Linealidad

37

5.2.4 Exactitud

Se determinó el porcentaje de recuperación de amilasa en superficies de pintura

epóxica, vidrio, aluminio, acero inoxidable, acrílico y plástico grado farmacéutico,

simulando diferentes concentraciones sobre un área de 25 cm2.

Estas superficies fueron muestreadas y analizadas de acuerdo a los parámetros y

condiciones establecidas en el punto 4.3.

Las concentraciones evaluadas en este ensayo fueron de 15%, 100% y 120%, cada

una realizándose por triplicado. Los resultados obtenidos se registran en las tablas

15 a 18 para cada material, respectivamente.


pintura epóxica.

Mtra #lectura % Recuperación Promedio Desviación CV

LOQ 1

1 100,71

100,96 0,35 0,35%

Promedio

2 101,21

101,46

LOQ 2

1 101,48

101,55 0,10 0,10%

Desviación

2 101,63

0,44

LOQ 3

1 101,77

101,85 0,12 0,11%

CV

2 101,93 0,43%

100% 1

1 96,96

97,00 0,05 0,05%

Promedio

2 97,04

103,09

100% 2

1 106,46

106,30 0,22 0,21%

Desviación

2 106,15

4,72

100% 3

1 105,95

105,97 0,04 0,04%

CV

2 106,00

4,58%

38

120% 1

1 89,12

89,15 0,04 0,04%

Promedio

2 89,18

94,75

120% 2

1 103,58

103,64 0,08 0,08%

Desviación

2 103,69

6,96

120% 3

1 91,45

91,48 0,05 0,05%

CV

2 91,51

7,34%

ESTADÍSTICOS CONSOLIDADOS

Promedio 99,77

Desviación 6,07

C.V.* 6,08%

Mínimo 89,12

Máximo 106,46


vidrio.

Mtra #Lectura % Recuperación Promedio Desviación CV

LOQ 1

1 90,57

91,08 0,71 0,78%

Promedio

2 91,58

94,91

LOQ 2

1 96,00

96,25 0,34 0,36%

Desviación

2 96,49

3,04

LOQ 3

1 97,08

97,41 0,46 0,47%

CV

2 97,73 3,20%

100% 1

1 99,42

99,34 0,11 0,11%

Promedio

2 99,26

95,00

100% 2

1 98,16

98,07 0,13 0,14%

Desviación

2 97,97

5,76

100% 3

1 87,65

87,61 0,06 0,07%

CV

2 87,56

6,06%

39

120% 1

1 92,06

92,03 0,04 0,05%

Promedio

2 92,00

96,98

120% 2

1 97,78

97,77 0,02 0,02%

Desviación

2 97,75

4,12

120% 3

1 101,13

101,14 0,02 0,02%

CV

2 101,15

4,25%

ESTADÍSTICOS

CONSOLIDADOS

Promedio 95,63

Desviación 4,42

C.V.* 4,62%

Mínimo 87,56

Máximo 101,15


aluminio.


LOQ 1

1 91,88

91,54 0,48 0,53%

Promedio

2 91,20

90,75

LOQ 2

1 89,98

89,73 0,35 0,39%

Desviación

2 89,48

0,88

LOQ 3

1 90,76

90,98 0,31 0,34%

CV

2 91,20 0,97%

100% 1

1 106,45

106,46 0,02 0,02%

Promedio

2 106,47

113,45

100% 2

1 112,06

112,02 0,05 0,05%

Desviación

2 111,98

6,98

100% 3 1 121,95 121,87 0,11 0,09%

CV

40

2 121,79

6,15%

120% 1

1 92,09

92,16 0,09 0,10%

Promedio

2 92,22

99,71

120% 2

1 104,69

104,70 0,02 0,02%

Desviación

2 104,72

5,95

120% 3

1 102,19

102,28 0,12 0,12%

CV

2 102,37

5,97%


Promedio 101,30

Desviación 11,16

C.V.* 11,02%

Mínimo 89,48

Máximo 121,95

Tabla 18 Datos de porcentaje de recuperación obtenidos sobre superficie de acero

inoxidable

Mtra #lectura % Recuperación Promedio Desviación CV

LOQ 1

1 91,55

90,98 0,82 0,90%

Promedio

2 90,40

89,26

LOQ 2

1 88,35

88,34 0,01 0,01%

Desviación

2 88,33

1,38

LOQ 3

1 88,45

88,47 0,03 0,04%

CV

2 88,50 1,54%

100% 1

1 99,10

98,99 0,16 0,16%

Promedio

2 98,88

109,43

100% 2

1 112,39

112,36 0,04 0,03%

Desviación

2 112,34

8,35

100% 3 1 116,96 116,95 0,01 0,01%

CV

41

2 116,94

7,63%

120% 1

1 94,59

94,63 0,05 0,05%

Promedio

2 94,66

98,74

120% 2

1 101,60

101,60 0,00 0,00%

Desviación

2 101,61

3,26

120% 3

1 99,96

99,98 0,03 0,03%

CV

2 100,00

3,31%


Promedio 99,15

Desviación 10,10

C.V.* 10,19%

Mínimo 88,33

Máximo 116,96


acrílico


LOQ 1

1 101,84

101,89 0,07 0,07%

Promedio

2 101,94

102,50

LOQ 2

1 102,19

102,23 0,05 0,05%

Desviación

2 102,27

0,75

LOQ 3

1 102,90

103,37 0,65 0,63%

CV

2 103,83 0,73%

100% 1

1 103,44

102,87 0,81 0,79%

Promedio

2 102,30

102,47

100% 2

1 102,16

102,15 0,00 0,00%

Desviación

2 102,15

0,49

100% 3 1 102,34 102,39 0,07 0,07%

CV

42

2 102,44

0,48%

120% 1

1 108,01

108,02 0,02 0,02%

Promedio

2 108,04

108,18

120% 2

1 108,18

108,22 0,05 0,05%

Desviación

2 108,25

0,13

120% 3

1 108,29

108,30 0,00 0,00%

CV

2 108,30

0,12%


Promedio 104,38

Desviación 2,88

C.V.* 2,76%

Mínimo 101,84

Máximo 108,30


plástico


LOQ 1

1 84,85

86,15 1,84 2,13%

Promedio

2 87,44

91,10

LOQ 2

1 93,38

93,40 0,03 0,03%

Desviación

2 93,42

3,93

LOQ 3

1 93,71

93,75 0,06 0,07%

CV

2 93,79 4,31%

100% 1

1 91,56

91,69 0,18 0,20%

Promedio

2 91,82

92,02

100% 2

1 92,02

92,07 0,08 0,09%

Desviación

2 92,13

0,30

43

100% 3

1 92,25

92,31 0,08 0,08%

CV

2 92,36

0,32%

120% 1

1 96,16

96,32 0,22 0,23%

Promedio

2 96,47

96,64

120% 2

1 96,59

96,67 0,12 0,12%

Desviación

2 96,76

0,29

120% 3

1 96,88

96,92 0,05 0,06%

CV

2 96,95

0,30%


Promedio 93,25

Desviación 3,35

C.V.* 3,60%

Mínimo 84,85

Máximo 96,95

Los porcentajes de recuperación promedios obtenidos fueron los siguientes:

Pintura epóxica: 99,8%; Vidrio: 95,6%; Aluminio: 101,3%; Acero inoxidable:

99,1%; Acrílico: 104,4%; Plástico: 93,3%. Cumpliendo así con el criterio de

aceptación de porcentaje de recuperación >=50%.

5.2.5 Precisión

Repetibilidad

Se evaluó la repetibilidad del método a partir de los datos obtenidos del ensayo de

exactitud a las concentraciones de LOQ, 100%, 120%, obteniéndose coeficientes

de variación entre muestras de 6,08%, 4,62%, 11,02%, 10,19%, 2,76%, 3,60% para

las superficies de Pintura epóxica, vidrio, aluminio, acero inoxidable, acrílico y

plástico grado farmacéutico respectivamente, cumpliendo así con el criterio de

aceptación de un coeficiente de variación ≤ 15%, valor aceptado para validaciones,

44

según Rojas, J., en su libro como validar sus metodologías analíticas, para

determinación de trazas.

Precisión intermedia

Se evaluó la precisión intermedia en dos días diferentes, con dos analistas

diferentes, verificándose a todas las concentraciones trabajadas en el parámetro de

exactitud, LOQ, 100% y 120%, obteniéndose coeficientes de variación entre las

muestras de los dos días de 1,87%, 3,15%, 2,41% para las superficie plástico, que

obtuvo menor porcentaje de recuperación en exactitud, cumpliéndose con el criterio

de aceptación de un coeficiente de variación ≤15%. Los resultados obtenidos para

promedios de porcentajes de recuperación, desviación estándar, y coeficiente de

variación para concentraciones de LOQ, 100% y 120% se detallan en la Tabla 21 a

la tabla 23 respectivamente.

Tabla 21 Datos obtenidos del ensayo de Precisión a concentración de LOQ


Muestra Día % Recuperación Promedio

LOQ REP1

1 91,08

87,52

2 83,96

LOQ REP2

1 96,25

90,08

2 83,91

LOQ REP3

1 97,41

90,67

2 83,92

Promedio 89,42

Desviación 1,67

CV 1,87%

45

Tabla 22 Datos obtenidos del ensayo de Precisión a concentración de 100%



100% REP1

1 99,34

102,72

2 106,10

100% REP2

1 98,07

102,14

2 106,22

100% REP3

1 87,61

96,97

2 106,3

Promedio 100,61

Desviación 3,17

CV 3,15%

Tabla 23 Datos obtenidos del ensayo de Precisión a concentración de

120%



120% REP1

1 92,03

95,24

2 98,45

120% REP2

1 97,77

98,08

2 98,38

120% REP3

1 101,14

99,92

2 98,71

46

Promedio 97,75%

Desviación 2,36

CV 2,41%

5.2.6 Estabilidad de las muestras

Se determinó el porcentaje de recuperación considerando las variables de tiempo

de almacenamiento, protegidas y expuestas a luz. Se determinó para muestras

recién preparadas, frente a muestras almacenadas en tubos de ensayo durante 6,

12 y 24 horas, tanto expuestas a la luz como protegidas de la luz. Se realizó el

ensayo de estabilidad de las muestras con soluciones de materia prima de

pancreatina equivalentes al límite de aceptación de estándar de amilasa. Los

resultados obtenidos se encuentran en las tablas 24 hasta la 35.

Tabla 24 Estabilidad de muestra a t0

% Recuperación t0 muestras recién preparadas

Tipo Muestra #Lectura % De recuperación Promedio Desviación CV

M1

1 96,97

97,45 0,68 0,69

2 97,92

Tabla 25 Estabilidad de muestras a t6h expuestas a la luz

% Recuperación t6h muestras expuestas a la luz

Tipo Muestra #Lectura % De recuperación Promedio Desviación CV

M2 REP1

1 85,60615

87,02 2,01 2,3%

2 88,44183

M2 REP2

1 85,60451

86,37 10,9 1,26%

2 87,14095

DESVIACION

0,46

CV 0,53%

47

Tabla 26 Estabilidad de muestras a t6h protegidas de la luz

% Recuperación t6h muestras protegidas de la luz

Tipo muestra #Lectura % de recuperación Promedio Desviación CV

M2 REP1

1 88,82147

88,88 0,08 0,10%

2 88,94093

M2 REP2

1 89,18252

89,25 0,09 0,1

2 89,30999

Desviación 0,26

CV 0,29%

Tabla 27 Resultados de t6h vs t0 expuestas a la luz

Estabilidad de la muestras a tiempo 6h VS tiempo 0h/ expuesta a la luz

t= 0 h 97,45 Promedio Desviación CV

t= 6 h 86,70 92,07 7,60 8,26%

Tabla 28 Resultados de t6h vs t0

protegidas de la luz

Estabilidad de la muestras a tiempo 6h VS tiempo 0h / Protegida de la luz


t= 6 h 89,07 93,26 5,93 6,36%

48

Tabla 29 Estabilidad de muestras a t12h expuestas a la luz


Tipo Muestra #Lectura % de recuperación Promedio Desviación CV

M2 REP1

1 78,29

78,82 0,75 0,95%

2 79,35

M2 REP2

1 80,32

80,29 0,05 0,06%

2 80.25

Desviación 1,04

CV 1,30%

Tabla 30 Estabilidad de muestras a t12h protegidas de la luz



M2 REP1

1 83,45

83,51 0,08 0,09%

2 83,56

M2 REP2

1 85,37

85,39 0,02 0,02%

2 85,40

DESVIACIÓN 1,33

CV 1,57%

49

Tabla 31 Resultados de t12h vs t0 protegido de la luz



t= 12 h 79,55 88,50 12,66 14,30%

Tabla 32 Resultados de tiempo 12h

vs t0 protegido de la luz



t= 12 h 84,45 90,95 9,20 10,11

Tabla 33 Estabilidad de muestras t24h expuestas a la luz



M2 REP1

1 231,11

230,97 0,21 0,09%

2 230,82

M2 REP2

1 234,34

234,24 0,15 0,06%

2 234,13

DESVIACION 1,89

CV 0,81%

50

Tabla 34 Estabilidad de muestras t24h protegidas de la luz



M2 REP1

1 234,87

235,44 0,82 0,35%

2 236,02

M2 REP2

1 230,66

230,99 0,47 2 231,33

DESVIACION 2,63

CV 1,13




t= 24 h 233,22 165,33 96,01 58,07




t= 24 h 232,60 165,02 95,57 57,91

Con los resultados obtenidos en el ensayo de estabilidad de las muestras se logró

demostrar que las muestras son estables hasta un tiempo máximo de 12h

almacenadas tanto expuestas como protegidas de la luz, obteniéndose coeficientes

de variación menores a 15%.

51

6. Conclusiones

Se determinó el límite de aceptación de limpieza máximo aceptable de amilasa que

puede estar presente en las áreas involucradas en la manufactura el producto leprit

enzimático después de realizar los procedimientos de limpieza, el cual fue de 35,7

UUSP/mL.

Para en análisis de trazas de pancreatina se establecieron puntos críticos tales

como pintura epóxica, vidrio, aluminio, acero inoxidable, acrílico y plástico grado

farmacéutico.

Se validó la metodología analítica por espectrofotometría UV teniendo un

coeficiente de correlación de linealidad de 0,9995, coeficientes de variación en la

precisión de 1,87%, 3,15%, 2,41% para concentraciones de LOQ, 100% y 120%

del LAL y se obtuvo un porcentaje de recuperación mínimo de 93,3% para la

superficie de plástico, la cual fue catalogada como critica, cumpliendo así con las

especificaciones y los criterios de aceptación establecidos.

La validación de la metodología analítica para determinar trazas de pancreatina

posterior al proceso de limpieza de equipos en PhQ S.A., cumple con los criterios

de aceptación establecidos para la validación (Limite de detección, Limite de

cuantificación, Linealidad, Exactitud, Precisión y estabilidad de la muestra).

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VALIDACIÓN DE UNA METODOLOGÍA ANALÍTICA PARA …