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Protocolo de verificación
(validación secundaria)
para pruebas moleculares
de PCR en tiempo real (RT-qPCR)
para la detección del SARS-CoV-2
Dirección Redes en Salud Pública
Dirección Vigilancia y Análisis del Riesgo
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Protocolo de verificación (validación secundaria) para pruebas moleculares de PCR en tiempo real (RT-qPCR)
para la detección del SARS-CoV-2
ELABORADO POR:
Laboratorio Nacional de Referencia de Virología
Dirección Redes en Salud Pública
• Sergio Yebrail Gómez Rangel. Profesional Coordinador
• Lissethe Carolina Pardo Herrera. Profesional Coordinador
• Angelica María Rico Turca. Profesional
Dirección Vigilancia y Análisis del Riesgo
• Ricardo Andres Caicedo Díaz. Epidemiólogo.
Dirección Redes en Salud Pública
• Esther Cristina Barros Liñán. Profesional especializada.
• Astrid Carolina Flórez Sánchez.
Directora Técnica de Redes en Salud Pública
Introduccion
La Reacción en Cadena de la Polimerasa – Transcripción
Reversa (RT-qPCR) en tiempo real es una técnica
ampliamente utilizada en virología diagnóstica.
Recientemente ante la emergencia en salud pública
ocasionada por el nuevo coronavirus emergente
SARS-CoV-2, el laboratorio del Instituto de Virología
de Charité en Berlín, Alemania estandarizó y validó el
protocolo de diagnóstico bajo la metodología de RT-
qPCR, debido a la naturaleza de la metodología y a su
nivel de confiabilidad en la detección del virus, esta fue
transferida a los Laboratorios Nacionales de Referencia
de Latinoamérica a través de la Organización
Panamericana de la Salud (OPS).
Posteriormente diferentes metodologías de diagnóstico
han sido ensambladas en varios países, algunas
aprobadas por la Food and Drug Administration (FDA)
y comercializadas en nuestro país bajo registro sanitario
INVIMA. Este documento especifica el protocolo de
evaluación o verificación diagnostica de las pruebas de
Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-
qPCR) para la detección viral del SARS-CoV2 disponibles
comercialmente en Colombia en muestras de población
colombiana tomadas a partir de hisopados nasofaríngeos
u orofaríngeos y muestras de aspirado endotraqueal
o lavado broncoalveolar. Algunos sectores utilizan
los conceptos de ‘validación primaria’ y “validación secundaria’, esta última con el sentido de verificación.
En el marco de la emergencia declarada por Covid-19 que actualmente vive el país, se propone el desarrollo de un protocolo de verificación diagnóstica que ayude a los diferentes centros de diagnóstico e investigación del país a generar información que permita evidenciar el desempeño diagnóstico de la RT-qPCR para el SARS-CoV-2.
El acelerado crecimiento de los casos y el apresurado ritmo con el que la pandemia lleva los servicios de diagnóstico e investigación, estimula a que a pesar de las limitaciones en términos de tiempo, recurso tecnológico, recurso económico, talento humano y sumado a esto la premura de los resultados, sea necesario contar en el menor tiempo posible y con el mínimo de recursos con información relevante que permita la aplicación de tecnologías, específicamente de RT-qPCR. Por tal motivo, el presente documento sugiere el uso racional de muestras biológicas y de estuches de diagnóstico sin perder el rigor metodológico del principio de una validación secundaria o verificación diagnostica. El trabajo del laboratorio se orientará en la verificación de los datos de desempeño publicados del fabricante y en demostrar que el método funciona en las instalaciones del usuario final.
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Glosario
Verificacion: confirmación, a través de la aportación de evidencias objetivas, de que se cumplen los requisitos de un método, especificados por el fabricante.
Características operativas: atributos estadísticos que miden el desempeño diagnóstico de una prueba utilizada para el diagnóstico.
Confiabilidad: también llamada reproducibilidad de una prueba implica la cantidad de error que se comete al realizar la medición. Se puede encontrar la confiabilidad intra-analista o inter-analista.
Especificidad: proporción de personas verdaderamente no enfermas que han sido catalogadas como tales mediante una prueba diagnóstica.
Exactitud: proporción de individuos clasificados correctamente.
Rendimiento de pruebas diagnósticas: es la capacidad evidenciada de las pruebas diagnósticas para configurar adecuadamente los pacientes en condiciones locales, frente a condiciones aleatorias
y variables de contexto o paciente. Una técnica con buen rendimiento hace referencia a una prueba que en diferentes condiciones ambientales, analista o muestra pueda detectar la presencia o ausencia de lo que se está investigando.
Sensibilidad: proporción de personas verdaderamente enfermas que han sido catalogadas como tales mediante una prueba diagnóstica.
Validez: capacidad de una prueba diagnóstica para detectar correctamente la presencia o ausencia de la enfermedad en cuestión y si ésta realmente esta cumple la función para la cual fue diseñada, se expresa matemáticamente con índices como sensibilidad y especificidad, entre otras.
Valor predictivo positivo: probabilidad condicional que los individuos con una prueba positiva tengan realmente la enfermedad.
Valor predictivo negativo: probabilidad condicional que los individuos con una prueba negativa no tengan realmente la enfermedad.
Objetivos
Objetivo general
Establecer una metodología de evaluación del rendimiento diagnóstico de las pruebas de Reacción en Cadena de la Polimerasa - Transcripción Reversa (RT-qPCR) en tiempo real para la detección viral del SARS-CoV2 disponibles comercialmente en Colombia, frente a la prueba de referencia, RT-qPCR protocolo Berlín, Alemania, recomendada por la Organización Mundial de la Salud (OMS) y aplicado por el Instituto Nacional de Salud.
Objetivos específicos
• Comparar el desempeño diagnóstico de las pruebas moleculares de RT-qPCR disponibles comercialmente,
mediante concordancia diagnóstica frente al estándar de referencia la RT-qPCR protocolo estandarizado en Berlín-Alemania.
• Estimar la sensibilidad, especificidad, exactitud y valores predictivos de las pruebas de RT-qPCR para la detección viral del SARS-CoV2 disponibles comercialmente, frente a la técnica de RT-qPCR protocolo estandarizado en Berlín- Alemania como estándar de referencia.
• Verificar parámetros de desempeño de los métodos comerciales de RT-qPCR descritos en los insertos y determinar si son adecuadas para su uso previsto en población colombiana.
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Metodología
Tipo y diseño del estudio
Cada evaluación deberá tratarse como un estudio
primario de pruebas diagnósticas donde se estimarán
las características operativas en términos de sensibilidad,
especificidad, exactitud y valores predictivos de
estuches comerciales de RT-qPCR para el diagnóstico
del SARS-CoV2, con muestras provenientes de pacientes
colombianos.
Las muestras deberán organizarse en paneles de
desempeño, las muestras biológicas que se utilizarán
deberán ser seleccionadas por criterios de positividad
(presencia del virus) y negatividad (ausencia del virus)
de la enfermedad de Covid-19. Este criterio deberá ser
asignado siempre por la prueba de referencia, que en
este caso es la RT-qPCR estandarizada en el Protocolo
de Berlin.
Adicionalmente y no como parte del proceso de verificación,
si resulta posible realizar estudio de repetibilidad con
la estimación del coeficiente de variación (%CV) por
el procesamiento de un número de muestras bajo las
mismas condiciones técnicas y ambientales, es decir un
mismo analista analizando consecutivamente muestras
duplicadas, permitiría comprobar la repetibilidad y la
reproducibilidad mediante el procesamiento por parte de
diferentes analistas un número de muestras, utilizando el
mismo sistema de medición.
Estimadores
Para la verificación diagnóstica se calcularán los
siguientes estimadores, junto con sus intervalos de
confianza al 95% (95%IC):
• Sensibilidad (Se)
• Especificidad (Sp)
• Valor predictivo positivo (VPP)
• Valor predictivo negativo (VPN)
• Exactitud (Ex)
• Tasa de falsos positivos y negativos
• Índice Kappa de Cohen
Diseño muestral
El panel de desempeño deberá contener muestras
positivas y negativas para la condición de estudio, en
este caso deberá tener muestras que cuenten con
RNA viral del SARS-CoV-2 y con muestras exentas de
él. Adicionalmente, deberá abarcar todo el espectro
de la enfermedad, pacientes sintomáticos claramente
positivos, pacientes asintomáticos, así como muestras
de pacientes de diferentes grupos etarios.
Muestra
Se utilizarán muestras de hisopados nasofaríngeos u
orofaríngeos y muestras de aspirado endotraqueal o
lavado broncoalveolar que hayan estado en óptimas
condiciones de almacenamiento a -70°C±2°C.
Criterios de selección
Se aplicarán los siguientes criterios de selección a las
muestras:
Criterios de inclusión
Muestras procedentes de pacientes que cumplan con
los siguientes criterios:
• Pacientes sospechosos sintomáticos evaluados en consulta desde las diferentes entidades de salud (instituciones prestadoras de salud) a nivel nacional.
• Pacientes sospechosos sintomáticos procedentes de Unidad de Cuidados Intensivos (UCI)
• Pacientes sospechosos asintomáticos con previo contacto con personas sintomáticas.
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• Pacientes sospechosos procedentes de conglomerados.
• Personas sospechosos procedentes de estudios de tamizaje poblacional.
Criterios de exclusión
Deberán ser excluidas de la evaluación las muestras
que cumplan por lo menos uno de los siguientes
criterios:
• Evidencia de almacenamiento inadecuado o presencia de contaminación microbiana, fúngica, química como solventes o reactivos.
• Menos de 250uL de volumen en el vial.
• Alteraciones o modificaciones en su rotulado.
Cálculo del tamaño de la muestra
El cálculo del tamaño de la muestra se realiza teniendo
en cuenta lo siguiente:
Para un estudio de pruebas diagnósticas con
resultado dicotómico (distribución binomial positivo
y negativo), cuyo objetivo es comparar proporciones
de sensibilidad y especificidad entre dos pruebas, se
realizarán para el tamaño total de la muestra, cálculos
independientes para sensibilidad y especificidad, los
parámetros de sensibilidad esperados determinaran
el número de muestras positivas y los parámetros de
especificidad esperados determinaron el número de
muestras negativas, adicionalmente, se deberá tener
en cuenta el número de pruebas para la evaluación.
Panel de evaluación de Sensibilidad (muestras
positivas): conformar el panel incluyendo muestras
confirmadas positivas para la condición en estudio.
Una manera de calcular la cantidad mínima de
muestras positivas requeridas para el ejercicio es la
siguiente, de acuerdo con Jacobson (1998) Rev. sci.
tech. Off. int. Epiz., 1998,17 (2), 507-526
n= {Se (1-Se)C2} / E2
Donde
• Se= Sensibilidad esperada
(otorgada por el fabricante o la literatura)
• C= Intervalo de confianza estimado
(1.96 para un 95% de confianza)
• E= % de error permitido en la estimación
de sensibilidad expresado en decimal
(habitualmente ± 5-20%).
Ejemplo: Para un ejercicio donde la sensibilidad
esperada sea de 85%, la confianza sea del 95% y el error
máximo del 5%.
Panel de evaluación de Especificidad (muestras
negativas): Conformar el panel incluyendo muestras
confirmadas negativas para la condición en estudio. Se
deben integrar muestras de pacientes aparentemente
sanos y que padezcan otro tipo de condiciones
semejantes a la de estudio pero negativa para ésta.
Una manera de calcular la cantidad mínima de
muestras negativas requeridas para la validación o
verificación de una técnica según Jacobson (1998)
como sigue:
n= {Sp (1-Sp)C2} / E2
Donde:
• Sp= Especificidad esperada (otorgada
por el fabricante o la literatura)
• C= Intervalo de confianza estimado (1.96
para un 95% de confianza)
• E= % de error permitido en la estimación de
Especificidad expresado en decimal
(habitualmente ± 5-20%).
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Ejemplo: Para un ejercicio donde la especificidad
esperada sea de 90%, la confianza sea del 95% y el error
máximo del 5%.
Para la estimación del tamaño de la muestra se deben
considerar factores como: costos operativos, vía de
obtención de los estuches y tiempos de ejecución,
entre los más importantes. Los estuches de RT-qPCR
generalmente tienen una presentación por 100
reacciones, que permitiría estimar un “n muestral”
de al menos 80 muestras, 40 positivas y 40 negativas,
excluyendo los controles internos de la corrida; sin
embargo, en el mercado existen algunas metodologías
cerradas que automatizan e integran la preparación de
las muestras, el proceso de la extracción y amplificación
de ácidos nucleicos, cuya presentación comercial es
menor de 100 o inclusive individual.
En casos en que la disponibilidad de los insumos
puede estar limitada y no sea viable definir el
tamaño de muestras basado en las herramientas
del cálculo de tamaño de muestras definidas, es
posible considerar la información de los estudios
robustos de validación primaria internos y externos
realizados por parte del fabricante, con un tamaño
de muestra superior a 30 muestras procesadas.
Para estos casos se puede optar por un tamaño de
muestra que se establece desde el criterio estadístico
mínimo para poder inferir comportamiento sobre
una población (n≥30), sugiriendo procesar mínimo
33 muestras, distribuyendo equitativamente entre
muestras previamente caracterizadas como positivas
y negativas. Es decir, conformando un panel con un
mínimo de 33 muestras: 17 muestras positivas y 16
muestras negativas. Esto significaría un error máximo
permitido del 15%. Se recomienda adicionalmente en
estos casos, que las características de sensibilidad y
especificidad no sean inferiores al 85%.
Es posible utilizar además otras formas de estimar el
número de muestras necesario para la confirmación
del panel, pero siempre deben tenerse claros los
parámetros a obtener en términos de sensibilidad,
especificada y error tipo I.
Definición del valor por el patrón de referencia
Debe establecerse el criterio de verdad positivo y
negativo basado en los resultados de la prueba molecular
de laboratorio de RT-qPCR protocolo estandarizado en
Berlín, Alemania para SARS-CoV2.
Recomendaciones para el procedimiento
Selección de las muestras y procedimiento: Una
vez seleccionadas las muestras, se deben tratar de la
siguiente manera:
• Generar una base de datos de las muestras seleccio-
nadas para el procedimiento
• Alistar las muestras en una gradilla e iniciar el proce-
dimiento tan pronto estén fuera de congelación y se
encuentren en estado líquido.
• El procesamiento analítico de las muestras se debe
llevar a cabo de acuerdo a las recomendaciones
y procedimientos descritos en el inserto de cada
estuche sin ninguna modificación.
• Las muestras se deberán procesar en condiciones óp-
timas controladas de laboratorio, con un antecedente
de monitoreo de condiciones ambientales que garan-
tice la temperatura y humedad relativa del proceso.
• Los equipos de laboratorio deben contar con inter-
venciones metrológicas periódicas realizadas por
una entidad autorizada para dichos procedimientos.
• Las muestras deberán ser procesadas por un solo
analista con un alto nivel de experticia en técnicas
moleculares.
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• Cuando se incluye el estudio de reproducibilidad
deberá disponerse de más de un analista con un alto
nivel de experticia en técnicas moleculares.
Recolección de la información
Fuente de información
La fuente de información es primaria, las unidades
de análisis serán los resultados de las muestras de
hisopados o aspirados que se procesaron por cada una
de las técnicas moleculares de RT-qPCR evaluadas.
Los resultados de cada corrida analítica serán validados
de acuerdo con los criterios de validación interna de
cada una de las pruebas, incluidos en el manual o
inserto de las técnicas.
Estándar de Referencia
El “estándar de oro” o prueba de referencia corresponde
a la prueba de PCR en tiempo real con transcriptasa
inversa (RT-qPCR) estandarizada por el hospital Charité
Virology en Berlin, Alemania.
Todas las muestras de hisopado o aspirados incluidas
en el panel para el estudio de verificación o validación
secundaria se deberán caracterizar previamente por el
estándar de referencia.
Interpretación de resultados
La interpretación de los resultados de los procesamientos
de las muestras se deberá realizar de acuerdo con lo
manifestado por los fabricantes de las técnicas.
Procesamiento y análisis de los datos
Procesamiento de datos: una vez construidas las
bases de datos se realiza el análisis univariado que
consiste en determinar la frecuencia de resultados
positivos y negativos por la prueba sometida al
proceso de verificación, posteriormente se realiza el
análisis bivariado, tomando en cuenta los resultados
del análisis univariado junto con los resultados del
patrón de referencia.
Se deberán originar tablas de contingencia 2x2, donde
las columnas correspondían al valor establecido por el
estándar de referencia (positivo/negativo) y en las filas
se presentaba el valor de la prueba evaluada (positivo/
negativo).
Prueba de referenciaPrueba a evaluar Positivo Negativo TotalPositivo VP FP VP + FPNegativo FN VN FN + VNTotal VP + FN FP + VN N
Análisis de datos
Estimación de características operativas individuales:
con la información completa, se procede a calcular
sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo,
valor predictivo negativo, exactitud y el intervalo de
confianza al 95%, en el software Epidat 3.0, o cualquier
tipo de software diseñado para éste fin.
Para la interpretación del índice Kappa se utilizará la
tabla de Landis y Koch 1977,
Escala de índice Kappa de Cohen
Coeficiente Kappa
Fuerza de la concordancia
0,00 Pobre
0,01 – 0,20 Leve
0,21 – 0,40 Aceptable
0,41 – 0,60 Moderada
0,61 – 0,80 Considerable
0,81 – 1,00 Casi perfecta
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Bibliografía
• Corman Victor M, Landt Olfert, Kaiser Marco, et all. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV)
by real-time RT-qPCR. Euro Surveill. 2020; 25(3):pii=2000045. https://doi.org/10.2807/1560-7917.
ES.2020.25.3.2000045
· Organización Panamericana de la Salud Directrices de Laboratorio para la Detección y Diagnóstico de
la Infección con el Nuevo Coronavirus 2019 (2019-nCoV). 01 de febrero de 2020
· EURACHEM The Fitness for Purpose of Analytical Methods A Laboratory Guide to Method Validation
and Related Topics. Second edition. 2014
· Jacobson RH. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 1998,17 (2), 507-526
· Landis, J. R., & Koch, G. G. (1977). The Measurement of Observer Agreement for Categorical Data.
Biometrics, 33(1), 159.
